JP2019045493A - 植物エキスの皮膚感作性インビトロ評価法 - Google Patents
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Abstract
Description
human Cell Line ActivationTest(h-CLAT)は、多くの皮膚感作性物質が樹状細胞を活性化することに着目した試験法であり、2016年7月にOECDのガイドライン化がなされた(OECD TG422E)。ヒト単核球細胞であるTHP-1細胞を用いて、細胞表面上のCD86とCD54を測定することにより皮膚感作性の有無を判定する試験法である(非特許文献1)。
一方で、h-CLATには試験に適用できない物質がある。例えば、香粧品原料の中には植物エキスをはじめとする天然由来の混合物が多く存在し、これら混合物の成分には感作性物質が含まれる可能性がある。しかしながら植物エキス中の感作性物質は非常に微量であるため、OECDのガイドラインに収載されたh-CLATでは検出できない事例が多い。
(1)細胞に感作性物質を含有すると予想される被験物質を添加して曝露し、該細胞の表面に発現された分子を検出する感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法において、前記感作性物質を含有すると予想される被験物質が植物エキスであり、前記添加する植物エキスの濃度が5000μg/ml〜500000μg/mlであり、かつ、曝露時間が1〜30分であることを特徴とする、植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
(2)細胞表面に発現される分子がCD86である、(1)に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
(3)細胞がヒト単核球細胞THP-1細胞である、(1)に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法、
である。
Adjuvantを用いた試験は、白色モルモットを試験動物とし、1群5匹以上の例数を確保した。投与経路は皮内及び経皮とし、第1回目の感作処置では除毛した頸部背部皮膚にフロイント・コンプリート・アジュバント(FCA)、各種植物エキス(いずれも原液)、FCAと植物エキスの乳化物の皮内注射を行った。第2回目の感作処置では第1回感作処置の1週間後、同部位に48時間閉塞貼付を施した。さらに、惹起処置として第2回感作処置の2週間後、除毛した背部又は側腹部に24時間閉塞貼付を行った。皮膚感作性の判定は、貼付除去後24時間及び48時間目に投与部位を肉眼にて観察した。Adjuvantを用いない試験法は、白色モルモットを試験動物とし、1群5匹以上の例数を確保した。投与経路は経皮とし、感作処置は1回/週、合計3回行い、除毛した背部皮膚に植物エキスを6時間閉塞貼付した。惹起処置として、3回目の貼付終了2週間後、側腹部に6時間の閉塞貼付を施した。皮膚感作性の判定は、貼付除去後24時間及び48時間目に投与部位を肉眼にて観察した。
なお、植物エキスは緑茶エキス(市販品の緑茶リキッド)、セージエキス(市販品のファルコレックスセージE)、ボタンピエキス(市販品のファルコレックス ボタンピE)を使用した。
結果を以下表1に示す。
試験例1と同じ植物エキスを使用して評価を行った
THP-1細胞(ATCCより購入)をRPMI1640(含10%FBS)培地を用いて2×106 細胞/mLに調製し、24wellプレートに500μL/wellずつ播種した。被験物質である植物エキスはTG422Eに基づきCV75決定試験を行った。いずれも最高濃度の5000μg/mLでも細胞毒性を示さなかったため、5000μg/mLから公比1.2で7濃度振り、細胞を播種したプレートにそれぞれ500μLずつ加えた。
処理した細胞はCO2インキュベーター中で24時間曝露した。曝露後の細胞をFACS
buffer(0.1%w/v BSA)を用いて洗浄し、Blocking buffer(含1%w/v globulin )でブロッキング後、FITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体を用いて氷上で30分間染色した。染色した細胞をFACS bufferを用いて2度洗浄し,FACS buffer 200μLに再懸濁した。この細胞懸濁液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞1×104 cellsの蛍光強度を測定し、生理食塩水を作用させたコントロールと比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
結果を図1に示す。OECD TG422Eの試験法どおりに試験を行った結果、植物エキス3種すべてで皮膚感作性が認められなかった(RFIの値がCD86≧150を満たさない)。このことから、この試験法では植物エキスの皮膚感作性を予測するには感度が不足しているということが明らかとなった。
試験例1と同じ植物エキスを用いて評価を行った。
THP-1細胞(ATCCより購入)をRPMI1640(含10%FBS)培地を用いて1×106 細胞/mLに調製し、1.5mLチューブに1mLずつ分注後、遠心し培地を除去した。被験物質である植物エキスはCV75決定試験を行い、緑茶:122785μg/mL、セージ:52761μg/mL、ボタンピ:257305μg/mLとなった。それぞれのCV75に従い、生理食塩水を用いて濃度を適宜決定し、500μLずつ培地を除去した細胞に5分間曝露した。曝露後、PBSで2度洗浄し、培地を1mL加え、24wellプレートに播種し、後培養を24時間行った。
後培養後の細胞をFACS buffer(0.1%w/v BSA)を用いて洗浄し、Blocking buffer(含1%w/v globulin )でブロッキング後、FITCで蛍光標識した抗ヒトCD86抗体を用いて氷上で30分間染色した。染色した細胞をFACS bufferを用いて2度洗浄し,FACS buffer 200μLに再懸濁した。この細胞懸濁液を用いてフローサイトメトリーにより生細胞1×104 cellsの蛍光強度を測定し、生理食塩水を作用させたコントロールと比較した。生細胞の検出はPI染色により行った。
結果を図2に示す。短時間曝露法で試験を行った結果、動物(+Adjuvant)で陽性となっているエキス2種(緑茶エキス、セージエキス)については皮膚感作性が認められた(RFIの値がCD86≧150を満たしている)。しかし、動物(+Adjuvant)で陰性と判定がなされているボタンピエキスでは、皮膚感作性が認められなかった。
このことから、本発明の評価法を用いた試験では、植物エキスの皮膚感作性を予測し得ることが明らかとなった。
Claims (3)
- 細胞に感作性物質を含有すると予想される被験物質を添加して曝露し、該細胞の表面に発現された分子を検出する感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法において、前記感作性物質を含有すると予想される被験物質が植物エキスであり、前記添加する植物エキスの濃度が5000μg/ml〜500000μg/mlであり、かつ、曝露時間が1〜30分であることを特徴とする、植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
- 細胞表面に発現される分子がCD86である、請求項1に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
- 細胞がヒト単核球細胞THP-1細胞である、請求項1に記載の植物エキス中の感作性物質のインビトロ評価方法又はスクリーニング方法。
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