JP5442185B2 - 感作性物質評価方法 - Google Patents
感作性物質評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5442185B2 JP5442185B2 JP2007114312A JP2007114312A JP5442185B2 JP 5442185 B2 JP5442185 B2 JP 5442185B2 JP 2007114312 A JP2007114312 A JP 2007114312A JP 2007114312 A JP2007114312 A JP 2007114312A JP 5442185 B2 JP5442185 B2 JP 5442185B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sensitizing
- cells
- substance
- antigen
- sensitization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 60
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 title description 46
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims description 20
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 claims 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 10
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N Dinitrochlorobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(Cl)C([N+]([O-])=O)=C1 VYZAHLCBVHPDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 231100000489 sensitizer Toxicity 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- -1 CD86 Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 2
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 2
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 2
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- RRAFCDWBNXTKKO-UHFFFAOYSA-N eugenol Chemical compound COC1=CC(CC=C)=CC=C1O RRAFCDWBNXTKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101710085496 C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- NPBVQXIMTZKSBA-UHFFFAOYSA-N Chavibetol Natural products COC1=CC=C(CC=C)C=C1O NPBVQXIMTZKSBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 1
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 239000005770 Eugenol Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- UVMRYBDEERADNV-UHFFFAOYSA-N Pseudoeugenol Natural products COC1=CC(C(C)=C)=CC=C1O UVMRYBDEERADNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100038138 WD repeat-containing protein 26 Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002217 eugenol Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 231100000943 strong sensitizer Toxicity 0.000 description 1
- 231100000942 weak sensitizer Toxicity 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、感作性物質の評価方法及び感作性物質に対する被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用を評価する方法に関する。
生体において、アレルギーを誘発する物質（感作性物質）を正当に評価及び検出することは、極めて重要である。これまでに、感作性物質を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、その皮膚等に生じる反応を観察する方法が知られている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、これらの方法は、被験物質を評価する試験期間が長く、また、動物愛護等の見地からも動物を用いない感作性物質評価方法の開発が望まれている。
Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９６９，５２，２６８−２７６
Ｓａｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，１９８１，７，２５５−２５７
Ｂｕｅｈｌｅｒ Ｅ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １９６５，９１，１７１−１７７
化学物質等によりアレルギーが成立する過程は、複数の段階からなる（非特許文献４、５）。まず、最初の段階では、感作性物質が生体内のタンパク質と結合し、本来生体内に存在しない物質へと修飾される。次に、抗原提示細胞は、このような物質を抗原として認識すると、細胞内で様々なシグナルが伝達され、細胞膜表面タンパク質の発現変化等を経て、活性化する。活性化した抗原提示細胞は、所属リンパ節へと移動し、その細胞表面に抗原を結合したＭＨＣＩＩタンパク質を発現し、共刺激分子と呼ばれるタンパク質を介してＴ細胞と結合し、抗原提示を行う。また、この際、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γなどの多くのサイトカインやケモカインを産生する。このような抗原提示細胞としては、血液中の樹状細胞及び単球、皮膚中のランゲルハンス細胞等が知られている。活性化した抗原提示細胞により、抗原提示を受けたＴ細胞は、記憶Ｔ細胞となり、アレルギーが成立する。さらに、皮膚におけるケラチノサイトのように、抗原提示に直接関わっていないが、感作性物質に反応して様々なサイトカインを分泌することで、アレルギーの成立を促進する細胞も存在する。したがって、アレルギーの成立過程は、複数の細胞が関与し、さらに多くのサイトカインが様々な効果を発揮することで成り立っており、極めて複雑な生体反応である。
多田富雄，免疫学イラストレイテッド 原書第５版，南江堂
Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２，２４５−２５２
アレルギーの成立過程は複雑であるが、この過程に関わる様々な因子が明らかとなりつつある。抗原により活性化された抗原提示細胞は、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫなどのリン酸化酵素が活性化され（非特許文献６）、細胞膜表面上にＣＤ５４、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１−ａ、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｅ−カドヘリン、ＣＣＲ７などのレセプターを発現し（非特許文献７）、さらに、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βなどのサイトカインを分泌すると報告されている（非特許文献４、８）。しかし、アレルギーに関わる因子が非常に多く、多岐にわたっており、それらの相互関係には不明な点が多く、現在のところ、そのメカニズムは解明されていない。
Ａｉｂａ Ｓ．，ＡＡＴＥＸ，２００５，１１，４９−５８
Ｓｔａｑｕｅｔ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，２００４，１８，４９３−５００
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１３９８−１４０２
このように、幾つかのアレルギーに関わる因子が同定されてはいるものの、アレルギー反応の複雑さから、動物を用いない感作性物質の評価方法の開発は困難であった。そのため、現在のところ、有用なｉｎ ｖｉｔｒｏ感作性物質評価方法は確立されていない。
これまでに、動物を用いない感作性物質の評価方法に関しては、細胞を感作性物質と培養し、特定の遺伝子又はタンパク質の発現増加を指標とした方法が一般的であった。例えば、株化された培養細胞であるＴＨＰ−１において、ＣＤ８６及びＣＤ５４について（特許文献１）、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βについて（特許文献２）、ＣＣＲ７、ＩＬ−２３、及びＡＴＦ−３（特許文献３）について、それぞれ発現増加を指標としているものがある。その他には、ケラチン細胞とランゲルハンス細胞の共培養系において、感作性物質によるＭＨＣＩＩ、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ２、ＴＮＦ−α、インターフェロン誘発タンパク質１０（ＩＰ１０）、及びＩＮＦ−γの発現増加を指標とした方法も報告されている（特許文献４）。しかし、いずれの方法においても、感作性の指標となるマーカー（感作性マーカー）遺伝子及びタンパク質の発現が低いことや、感度又は精度が低いことが知られていた。
さらに、感作性物質には、感作性が強い物質と、感作性が弱い物質があるため、それらの性質を見極め、より詳細な感作性物質の情報を得ることが出来る動物を用いない感作性物質の評価方法に関しては皆無であった。
以上より、動物を用いない感作性物質の評価方法の開発において、感作性物質を正確に評価するために、複雑なアレルギーの成立過程を再現するとともに、感度及び精度を向上させ、さらに、感作性物質における感作性の強弱をも検出できる新たな感作性マーカーの発見が望まれていた。
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物細胞を用い、高い感作性物質の検出感度及び精度を備え、さらに、感作性の強弱についても検出可能な、新たな感作性マーカーを探索し、より感度の高い感作性物質評価方法を提供することにある。
このような事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、感作性物質に対するヒト細胞の反応を詳細に解析し、高い感作性物質の検出感度及び精度を備え、さらに、感作性の強弱についても検出可能な優れた感作性マーカーを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）哺乳動物の抗原提示細胞と被験物質とをインキュベートし、当該細胞のＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を測定することを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法。
（２）哺乳動物の抗原提示細胞が、血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚由来であることを特徴とする、（１）に記載の被験物質の感作性を評価する方法。
（３）哺乳動物の抗原提示細胞が、培養細胞（ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ）から１種以上選択される培養細胞であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被験物質の感作性を評価する方法。
以下に、本発明において見出された感作性マーカーについて説明する。
ＩＬ−２Ｒ
ＩＬ−２Ｒは、ヒト脳内皮細胞において、ＩＬ−２のシグナルを伝え、Ｔ細胞増殖活性に関わる（非特許文献９）。
ＩＬ−２Ｒは、ヒト脳内皮細胞において、ＩＬ−２のシグナルを伝え、Ｔ細胞増殖活性に関わる（非特許文献９）。
Ｐｒａｔ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０００，５９，１２９−１３６
したがって、本発明は、ヒト又は哺乳動物の抗原提示細胞において、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現を測定することを特徴とする、感作性物質の評価方法、及び感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤の評価方法を提供する。
本発明で用いる哺乳動物の抗原提示細胞は、本発明の目的に沿うものであれば、哺乳動物から採取した血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚組織の細胞を用いることができる。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物から得られた血液、骨髄、リンパ節、及び／又は皮膚組織の抗原提示細胞を用いることができる。
この場合、上記哺乳動物細胞の中でも、血液、骨髄細胞を用いることが好ましい。
この場合、上記哺乳動物細胞の中でも、血液、骨髄細胞を用いることが好ましい。
また、本発明で用いる哺乳動物の抗原提示細胞が、培養細胞である場合、本発明の目的に沿うものであれば、細胞バンクから入手可能な培養細胞や市販されている培養細胞を入手して用いることができる。例えば、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ等の培養細胞から１種以上選択し、用いることができる。
この場合、上記培養細胞の中でも、ＴＨＰ−１及び／又はＵ−９３７を用いることが好ましい。
この場合、上記培養細胞の中でも、ＴＨＰ−１及び／又はＵ−９３７を用いることが好ましい。
これらの哺乳動物の抗原提示細胞を用いて、以下の培養方法及び解析方法により、被験物質の感作性を評価することができる。
本発明の哺乳動物の抗原提示細胞を培養するための培地としてはこれらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を用いることができるが、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ等が挙げられる。これらの培地には、５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することが好ましい。
感作性物質の評価においては、培地中の哺乳動物の抗原提示細胞に被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下にて、０．５〜７２時間、好ましくは２〜２４時間培養する。
培養終了後、感作性マーカー遺伝子の発現量を測定する方法として、マイクロアレイ法、セルアレイ法、組織アレイ法、定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法等を用いることができる。また、感作性マーカータンパク質の発現量を測定する方法としては、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、セルアレイ法、組織アレイ法等が挙げられる。
本発明は、哺乳動物の抗原提示細胞を用いて、被験物質の感作性を評価する方法であり、従来の方法に比べて感度及び／又は精度を向上させ、評価することが可能である。
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
哺乳動物の抗原提示細胞として、ＴＨＰ−１（ヒト単核球由来細胞株：ＡＴＣＣから購入）を用いて、感作性物質による遺伝子の発現変化について、マイクロアレイ解析を行った。
培地液の調製
ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）に１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペンシリン（Ｓｉｇｍａ社製）と１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ベーリンガー社製）を加えて調整した。
ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）に１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペンシリン（Ｓｉｇｍａ社製）と１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ベーリンガー社製）を加えて調整した。
強い感作性物質の調製
強い感作性を示す物質として、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ，Ｓｉｇｍａ社製）とｐ−ベンゾキノン（ＢＱ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解し用いた。
強い感作性を示す物質として、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ，Ｓｉｇｍａ社製）とｐ−ベンゾキノン（ＢＱ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解し用いた。
弱い感作性物質の調製
弱い感作性を示す物質としては、硫酸ニッケル（Ｎｉ，Ｓｉｇｍａ社製）とオイゲノール（ＥＵ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解し用いた。
弱い感作性を示す物質としては、硫酸ニッケル（Ｎｉ，Ｓｉｇｍａ社製）とオイゲノール（ＥＵ，Ｓｉｇｍａ社製）を用い、それぞれ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解し用いた。
細胞と被験物質の培養
培地中のＴＨＰ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから分譲）に、それぞれの終濃度が、ＤＮＣＢは５．０μｇ／ｍＬ、ＢＱは６．０μｇ／ｍＬ、Ｎｉは２００μｇ／ｍＬ、ＥＵは１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて８時間培養した。また、コントロールとして、被験物質を添加しない未適用対照を設けた。
培地中のＴＨＰ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから分譲）に、それぞれの終濃度が、ＤＮＣＢは５．０μｇ／ｍＬ、ＢＱは６．０μｇ／ｍＬ、Ｎｉは２００μｇ／ｍＬ、ＥＵは１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて８時間培養した。また、コントロールとして、被験物質を添加しない未適用対照を設けた。
マイクロアレイ解析
培養終了後、細胞よりＴＯＲＩＺＯＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて細胞を溶解することによって総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡラベル化キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて、ＲＮＡから蛍光ラベル化されたｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＩｎｔｅｌｉｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｈｉｐ Ｖｅｒ３．１（Ｔａｋａｒａ社製）に、６０℃にて、１６時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ終了後、蛍光スキャナ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｇｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて各遺伝子の発現量を測定し、コントロールと各被験物質間の発現差を解析ソフト（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒ３．０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により解析した。
培養終了後、細胞よりＴＯＲＩＺＯＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて細胞を溶解することによって総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡラベル化キット（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法にて、ＲＮＡから蛍光ラベル化されたｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをＩｎｔｅｌｉｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｃｈｉｐ Ｖｅｒ３．１（Ｔａｋａｒａ社製）に、６０℃にて、１６時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ終了後、蛍光スキャナ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｇｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて各遺伝子の発現量を測定し、コントロールと各被験物質間の発現差を解析ソフト（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖｅｒ３．０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により解析した。
解析ソフトより得られた遺伝子の発現量を用い、コントロールと比較した各遺伝子の相対発現量を、以下の式（１）を用いて算出した。
式（１）
各被験物質を添加した細胞における遺伝子発現量／コントロールの遺伝子発現量＝相対発現量
各被験物質を添加した細胞における遺伝子発現量／コントロールの遺伝子発現量＝相対発現量
（比較例１）
比較例として、非感作性物質としてラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ，Ｓｉｇｍａ社製）を５．０ｍｇ／ｍＬにて生理食塩水に溶解し、５０μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加し、実施例１と同様の実験を行った。
比較例として、非感作性物質としてラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ，Ｓｉｇｍａ社製）を５．０ｍｇ／ｍＬにて生理食塩水に溶解し、５０μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加し、実施例１と同様の実験を行った。
解析方法
実施例１及び比較例１により評価した遺伝子の中から、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）、弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）及び非感作性物質（ＳＬＳ）に対して、コントロールと比較して発現が変化したものを解析した。
遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して２．０倍以上であった場合を「＋＋＋」、１．５倍以上２．０倍未満であった場合を「＋＋」、１．２倍以上１．５倍未満であった場合を「＋」、１．２倍未満であった場合を「−」とし、表１に示した。
実施例１及び比較例１により評価した遺伝子の中から、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）、弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）及び非感作性物質（ＳＬＳ）に対して、コントロールと比較して発現が変化したものを解析した。
遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して２．０倍以上であった場合を「＋＋＋」、１．５倍以上２．０倍未満であった場合を「＋＋」、１．２倍以上１．５倍未満であった場合を「＋」、１．２倍未満であった場合を「−」とし、表１に示した。
（解析結果）
その結果、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、２種類（遺伝子Ｎｏ．１〜２）を見出した。弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、１種（遺伝子Ｎｏ．３）を見出した。その他の変化しなかった遺伝子４種類（遺伝子Ｎｏ．４〜７）に関しては、反応なし群として表１に示した。
その結果、強い感作性物質（ＤＮＣＢ、ＢＱ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、２種類（遺伝子Ｎｏ．１〜２）を見出した。弱い感作性物質（Ｎｉ、ＥＵ）のみに対して、遺伝子の変化（発現量）が、コントロールと比較して１．５倍以上（「＋＋」、「＋＋＋」の変化）であった遺伝子について、１種（遺伝子Ｎｏ．３）を見出した。その他の変化しなかった遺伝子４種類（遺伝子Ｎｏ．４〜７）に関しては、反応なし群として表１に示した。
以上の結果より、ＩＬ−２Ｒは、弱い感作性物質に対して、特異的に増加する優れた感作性マーカー群であることを確認した。
以上の結果から、感作性マーカーＩＬ−２Ｒは、弱い感作性物質を検出するのに優れていることを確認した。また、より多くの感作性マーカーを評価することで、未知の感作性物質の検出が可能となる。この場合、ＩＬ−２Ｒと他の感作性マーカーを組み合わせて検出することで、強い感作性物質と弱い感作性物質を同時に検出することができる。したがって、本発明において発見した感作性マーカーは、個々で感作性物質を検出し、その感作性の強弱を判断することが可能であり、さらに、感作性マーカーを組み合わせることにより、今まで以上に、検出感度及び精度が向上し、さらに広い範囲で感作性物質を検出することができる優れた感作性マーカーであると言える。
本発明の活用例として、化学物質等の安全性評価への応用が期待される。哺乳類の血液、骨髄及び培養細胞を用いることで、感作性マーカーの発現を指標に、動物を用いずに感作性の有無及び強弱の評価が可能になる。
Claims (1)
- 哺乳動物のＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＫＧ−１、ＭＵＴＺ−１、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔから１種以上選択される培養細胞と被験物質とをインキュベートし、当該細胞のインターロイキン−８（ＩＬ−８）及びＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現量を測定し、当該発現量を対照の発現量と比較することを特徴とする、被験物質の感作性を評価する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007114312A JP5442185B2 (ja) | 2007-04-24 | 2007-04-24 | 感作性物質評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007114312A JP5442185B2 (ja) | 2007-04-24 | 2007-04-24 | 感作性物質評価方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012177991A Division JP5654531B2 (ja) | 2012-08-10 | 2012-08-10 | 感作性物質評価方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008263917A JP2008263917A (ja) | 2008-11-06 |
| JP5442185B2 true JP5442185B2 (ja) | 2014-03-12 |
Family
ID=40044328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007114312A Active JP5442185B2 (ja) | 2007-04-24 | 2007-04-24 | 感作性物質評価方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5442185B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011078778A1 (en) * | 2009-12-22 | 2011-06-30 | Biovator Technologies Ab | Method for assessing the sensitisation capability of a compound |
| WO2012002507A1 (ja) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | 国立大学法人東北大学 | 多色発光細胞を用いた免疫毒性評価システム |
| US20150038511A1 (en) | 2012-08-09 | 2015-02-05 | Celgene Corporation | Treatment of immune-related and inflammatory diseases |
| PL2882441T3 (pl) | 2012-08-09 | 2020-09-21 | Celgene Corporation | Leczenie chorób immunologicznych i zapalnych |
| JP2017522270A (ja) | 2014-05-19 | 2017-08-10 | セルジーン コーポレイション | 全身性エリテマトーデスの治療のための３−（４−（（４−（モルホリノメチル−ベンジル）オキシ）−１−オキソイソインドリン−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオン |
| CA3017270A1 (en) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Senzagen Ab | Method for determining the skin sensitizing potency of an agent and arrays for use in the same |
| GB201700138D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-02-22 | Senzagen Ab | Analytical methods and arrays for use in the same |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE506533C2 (sv) * | 1995-07-03 | 1998-01-12 | Birger Andersson | En process för in vitro analys av substansers toxiska och allergena egenskaper samt användning av neopterin för att skilja mellan allergiska immunreaktioner |
| AU782044B2 (en) * | 1999-10-15 | 2005-06-30 | Novozymes A/S | A method for the assessment of allergenicity |
| JP4270702B2 (ja) * | 2000-02-07 | 2009-06-03 | 株式会社資生堂 | 感作性物質のインビトロ評価法 |
| JP2004222582A (ja) * | 2003-01-22 | 2004-08-12 | Kao Corp | 感作性評価方法 |
| JP2006311858A (ja) * | 2005-04-05 | 2006-11-16 | Shiseido Co Ltd | 感作性物質のｉｎｖｉｔｒｏ評価方法及びそれに用いる遺伝子工学的に作製された細胞 |
-
2007
- 2007-04-24 JP JP2007114312A patent/JP5442185B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2008263917A (ja) | 2008-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5442185B2 (ja) | 感作性物質評価方法 | |
| Python et al. | Assessment of the U937 cell line for the detection of contact allergens | |
| US9410208B2 (en) | Marker and reagent for detection of human IL-17-producing helper T cells, and method for detection of human IL-17-producing helper T cells | |
| CN108624675A (zh) | 用于鉴定诱使人皮肤致敏的试剂的分析方法和阵列 | |
| JP6031221B2 (ja) | 皮膚感作性物質の評価方法 | |
| Python et al. | Comparative DNA microarray analysis of human monocyte derived dendritic cells and MUTZ-3 cells exposed to the moderate skin sensitizer cinnamaldehyde | |
| US10073084B2 (en) | Predicting allergic reactions | |
| JP6490010B2 (ja) | ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法および該方法に用いられる合成ペプチド | |
| Hirota et al. | MIP-1β, a novel biomarker for in vitro sensitization test using human monocytic cell line | |
| Guo et al. | Immune subset-committed proliferating cells populate the human foetal intestine throughout the second trimester of gestation | |
| Tan et al. | Genomic analysis of invasion-metastasis-related factors in pancreatic cancer cells | |
| JP6983398B2 (ja) | 皮膚感作性物質評価方法 | |
| JP5654531B2 (ja) | 感作性物質評価方法 | |
| JP2006311858A (ja) | 感作性物質のｉｎｖｉｔｒｏ評価方法及びそれに用いる遺伝子工学的に作製された細胞 | |
| JP2018068177A (ja) | アジュバント作用の評価法 | |
| JP7224584B2 (ja) | 皮膚感作性評価方法 | |
| JP2004222582A (ja) | 感作性評価方法 | |
| Pollak et al. | Mechanism driven early stage identification and avoidance of antisense oligonucleotides causing TRL9 mediated inflammatory responses in bjab cells | |
| Mold et al. | Clonally distinct differentiation trajectories shape CD8+ memory T cell heterogeneity after acute viral infections in humans | |
| JP4498054B2 (ja) | 感作性物質のインビトロ評価法 | |
| KR101737450B1 (ko) | 단일 세포 내 마이크로 rna의 고해상도 시각화 방법 | |
| Mraz et al. | The junctional adhesion molecule‐like protein (JAML) is important for the inflammatory response during contact hypersensitivity | |
| WO2018197438A1 (en) | Analytical methods and arrays for use in the same | |
| WO2011078778A1 (en) | Method for assessing the sensitisation capability of a compound | |
| Meloni et al. | NEW APPROACH FOR CHEMICAL SENSITIZING POTENTIAL ASSESSMENT USING |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100225 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120612 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120810 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130402 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130529 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131217 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131218 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5442185 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |