JP5654531B2 - 感作性物質評価方法 - Google Patents
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Description
(1)感作性マーカー群A:IL−10 受容体(IL−10R)、CD44、NF−κB、IκBα、IκBε、フーリン(furin)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体(uPA−R)、TNFα誘導タンパク質3(A20)、TRAIL受容体2(TRAIL−R2)、インターフェロン制御因子−1(IRF−1)、血小板由来成長因子α(PDGFα)、v−Jun、インシュリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)、ヘムオキシゲナーゼ−1(HO−1)、チオレドキシン還元酵素−1(TR−1)、クラスII主要組織適合抗原(MHCII)、CD86、マクロファージ炎症タンパク質1α(MIP−1α)、MIP1β、ケモカイン受容体7(CCR7)。
(2)感作性マーカー群B:IL−4受容体(IL−4R)、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、マトリックスメタロプロテアーゼ−9(MMP−9)、メタロチオネイン−1(MT−1)、オステオポンチン(OPN)、シトクロームP450還元酵素(P450)、ケモカインリガンド5(CCL5)、CCL23、ティッシュインヒビターオブMMP−3(TIMP3)、TGF−β タイプII受容体(TGFRII)、インターフェロン誘導タンパク質p78(MxA)、アネキシンA5(AxA5)、GROα、GROβ、FosB、アクチビンA受容体(AAR)、シスタチンB(CTB)、インテグリンβ5(ITβ5)、IL−1α、IL−1β、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、TNF−α、IFN−γ、CD54。
(1)感作性マーカー群A:IL−10 受容体(IL−10R)、CD44、NF−κB、IκBα、IκBε、フーリン(furin)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体(uPA−R)、TNFα誘導タンパク質3(A20)、TRAIL受容体2(TRAIL−R2)、インターフェロン制御因子−1(IRF−1)、血小板由来成長因子α(PDGFα)、v−Jun、インシュリン様成長因子結合タンパク質3(IGFBP3)、ヘムオキシゲナーゼ−1(HO−1)、チオレドキシン還元酵素−1(TR−1)、クラスII主要組織適合抗原(MHCII)、CD86、マクロファージ炎症タンパク質1α(MIP−1α)、MIP1β、ケモカイン受容体7(CCR7)。
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IL−10をノックアウトしたマウスにおいて、アレルギー性喘息が緩和されることから、そのレセプターであるIL−10Rのアレルギーへの関与が推測される(非特許文献9)。
ヒト単球において、IL−4はIL−1、TNF−αの産生を抑制することから、IL−4Rは、マクロファージなどの多くの機能に関わっていると考えられている(非特許文献10)。
CD44は、ランゲルハンス細胞や樹状細胞の遊走に関わっていると考えられている(非特許文献11)。
MCP−1は、活性化した抗原提示細胞によって産生され、獲得免疫のエンハンサーとして機能すると推察されている(非特許文献12)。
MMP−9は、樹状細胞の遊走及びケモカインの産生に関わっていると考えられている(非特許文献13)。
MT−1は、感作性物質により、表皮において発現が亢進すると考えられている(非特許文献14)。
NF−κBは、樹状細胞が成熟する際に活性化すると考えられている(非特許文献15)。
furinは、抗原提示細胞がウィルススーパー抗原をT細胞に提示する際に必要であると考えられている(非特許文献16)。
OPNは、CD44のリガンドの1つであり、細胞の遊走に関わっていると考えられている(非特許文献17)。
P450は、炎症により、発現が亢進すると考えられている(非特許文献18)。
uPA−Rは、細胞外マトリックスの分解や細胞の接着に関与し、細胞の遊走に必要であると考えられている(非特許文献19)。
CCL5は、炎症により、細胞外マトリックスの分解を促進し、細胞の遊走に関わると考えられている(非特許文献20)。
CCL23は、ケモカイン受容体1のリガンドであると考えられる。(非特許文献21)
TIMP3は、細胞の遊走に関わっており、ヒト成熟樹状細胞において発現していると考えられている(非特許文献22)。
TGFRIIは、TGF−βのシグナルを細胞内に伝達し、細胞の遊走に関わると考えられている(非特許文献23)。
A20は、NF−κBの活性に伴い発現が亢進し、樹状細胞の成熟に関わると考えられる(非特許文献24)。
TRAIL−R2は、アポトーシスに関わるレセプターであり、樹状細胞に発現していると考えられている(非特許文献25)。
MxAは、即時性喘息患者におけるウィルスの感染時に発現が亢進すると考えられている(非特許文献26)。
AxA5は、INF−γによるシグナル伝達を介した細胞の応答を調節すると考えられている(非特許文献27)。
IRF−1は、MHCIIの発現に関わると考えられている(非特許文献28)。
PDGFαは、IFN−γによって活性化された細胞を遊走させると考えられている(非特許文献29)。
GROαは、ヒト単球において、LPSによって誘導されると考えられている(非特許文献30)。
GROβは、炎症部位における活性化した単球及び好中球において産生されると考えられている(非特許文献31)。
FosやJunは、転写因子Activating Protein−1の構成因子であり、MMPの発現を制御していると考えられている(非特許文献32)。
TGF−βスーパーファミリーに属するActivin Aのレセプターであり、アレルギーにおける炎症過程に関与していると考えられている(非特許文献33)。
シスタチンは、IFN−γによって活性化されたマクロファージにおいて、NOの産生を促進すると考えられている(非特許文献34)。
IGFBP3は、アレルギー患者において発現が亢進すると考えられている(非特許文献35)。
ITβ5は、細胞の移動や接着に関与すると考えられている(非特許文献36)。
HO−1は、マクロファージにおいて、チオレドキシンによって誘導されると考えられている。また、TR−1が阻害されると、このHO−1の誘導が抑制されると考えられている(非特許文献37)。
<感作性マーカー群A>
IL−10R、CD44、NF−κB、IκBα、IκBε、furin、uPA−R、A20、TRAIL−R2、IRF−1、PDGFα、v−Jun、IGFBP3、HO−1、TR−1、MHCII、CD86、MIP−1α、MIP1β、CCR7。
<感作性マーカー群B>
IL−4R、MCP−1、MMP−9、MT−1、OPN、P450、CCL5、CCL23、TIMP3、TGFRII、MxA、AxA5、GROα、GROβ、FosB、AAR、CTB、ITβ5、IL−1α、IL−1β、GM−CSF、TNF−α、IFN−γ、CD54。
この場合、上記哺乳動物細胞の中でも、血液、骨髄細胞を用いることが好ましい。
この場合、上記培養細胞の中でも、THP−1及び/又はU−937を用いることが好ましい。
RPMI1640(GIBCO社製)に10%FBS、100units/mLペンシリン(Sigma社製)と100μg/mLストレプトマイシン(ベーリンガー社製)を加えて調整した。
強い感作性を示す物質として、1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(DNCB,Sigma社製)とp−ベンゾキノンe(BQ,Sigma社製)を用い、それぞれ、2.5mg/mL、3.0mg/mLとなるようにDMSOに溶解し用いた。
弱い感作性を示す物質としては、硫酸ニッケル(Ni,Sigma社製)とオイゲノール(EU,Sigma社製)を用い、それぞれ、20mg/mL、15mg/mLとなるように生理食塩水に溶解し用いた。
培地中のTHP−1(American Type Culture Collectionから分譲)に、それぞれの終濃度が、DNCBは5.0μg/mL、BQは6.0μg/mL、Niは200μg/mL、EUは150μg/mLとなるように添加し、CO2インキュベーター中で、37℃にて8時間培養した。また、コントロールとして、被験物質を添加しない未適用対照を設けた。
培養終了後、細胞よりTORIZOL(invitrogen社製)にて細胞を溶解することによって総RNAを抽出し、cDNAラベル化キット(GEヘルスケア社製)を用いてRT−PCR法にて、RNAから蛍光ラベル化されたcDNAを合成した。合成したcDNAをInteligene Human Cytokinechip Ver3.1(Takara社製)に、60℃にて、16時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ終了後、蛍光スキャナ(ScanArray Gx,PerkinElmer社製)にて各遺伝子の発現量を測定し、コントロールと各被験物質間の発現差を解析ソフト(ScanArray Express Ver3.0,PerkinElmer社製)により解析した。
各被験物質を添加した細胞における遺伝子発現量/コントロールの遺伝子発現量=相対発現量
比較例として、非感作性物質としてラウリル硫酸ナトリウム(SLS,Sigma社製)を5.0mg/mLにて生理食塩水に溶解し、50μg/mLとなるように細胞に添加し、実施例1と同様の実験を行った。
実施例1及び比較例1により評価した遺伝子の中から、強い感作性物質(DNCB、BQ)、弱い感作性物質(Ni、EU)及び非感作性物質(SLS)に対して、コントロールと比較して発現が変化したものを解析した。
遺伝子の変化(発現量)が、コントロールと比較して2.0倍以上であった場合を「+++」、1.5倍以上2.0倍未満であった場合を「++」、1.2倍以上1.5倍未満であった場合を「+」、1.2倍未満であった場合を「−」とし、表1に示した。
その結果、強い感作性物質(DNCB、BQ)のみに対して、遺伝子の変化(発現量)が、コントロールと比較して1.5倍以上(「++」、「+++」の変化)であった遺伝子について、19種類(遺伝子No.1〜19)を見出した。この遺伝子群を、感作性マーカー群Aとし、表1に示した。また、弱い感作性物質(Ni、EU)のみに対して、遺伝子の変化(発現量)が、コントロールと比較して1.5倍以上(「++」、「+++」の変化)であった遺伝子について、25種類(遺伝子No.20〜44)を見出した。この遺伝子群を、感作性マーカー群Bとし、表1に示した。その他の変化しなかった遺伝子4種類(遺伝子No.45〜48)に関しては、反応なし群として表1に示した。
実施例1の解析結果をもとに、感作性マーカー群Aと感作性マーカー群Bから任意に感作性マーカーを選択し、既知の強い感作性物質と弱い感作性物質について感作性の有無、及び、感作性の強弱について判定した。
非感作性物質として塩化ベンズアルコニウム(BAC,Sigma社製)を用い、生理食塩水に溶解させ、3.0μg/mLとなるように調製し、実施例1と同様な方法で解析し、それぞれの感作性マーカーの発現量の変化を解析した。
実施例2及び比較例2の解析結果をもとに、以下の表2に示した判定基準により感作性の有無、及び、感作性の強弱に関して評価した。
以上の判定基準により評価した、感作性マーカー群A及びBから任意に選択した感作性マーカーの相対発現量と評価結果を表3に示した。その結果、感作性物質(PDA及びFA)に対して、任意に選択した感作性マーカー群Aは顕著な増加を示し、任意に選択した感作性マーカー群Bにおいては、いずれも変化しなかった。以上の結果から、PDA及びFAは、本発明の評価基準から強い感作性物質であると判断した。
さらに、感作性マーカー群Aから任意のマーカー1種(遺伝子No.12)を、感作性マーカー群Bから任意のマーカー1種(遺伝子No.26)を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例2と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、1種ずつ選択した場合でも、感作性の有無及びその強弱を評価できることを確認した。
以上より、感作性マーカー群AとBから、それぞれ任意に1種又は2種以上を選択して、評価に用いることで、感作性物質の強弱を特異的に評価できることを確認した。
なお、実施例2と同様な評価を用いて、感作性の不明な物質の評価を行ったところ、感作性の有無及び、その強弱に関しても評価できることを確認した。
感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価方法として、既知の感作性物質と評価したい被験物質を同時にインキュベーションすることで、感作性マーカー(感作性マーカー群A、Bから任意に選択したもの)の発現量を実施例1と同様な方法で解析し、その増減により、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価を行った。
また、その他にも、感作性マーカー群Aから任意のマーカー3種(遺伝子No.1、4、15)を、感作性マーカー群B(遺伝子No.20、29、42)から任意のマーカー3種を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例3と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、3種ずつ選択した場合でも、感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価が可能であることを確認した。
さらに、感作性マーカー群Aから任意のマーカー1種(遺伝子No.12)を、感作性マーカー群Bから任意のマーカー1種(遺伝子No.26)を選択して、同様な評価を行ったところ、実施例3と同様に評価できることを確認した。これにより、それぞれの感作性マーカー群より、1種ずつ選択した場合でも、感作性物質に対する、被験物質の感作性増強作用又は感作性抑制作用の評価が可能であることを確認した。
なお、この他にも感作性の増強作用を示す物質(コンプリートアジュバンド、フナコシ社製)を用いて、同様な評価を行ったところ、感作性増強作用を持つ物質であることを確認できた。
Claims (4)
- 哺乳動物細胞と被験物質とをインキュベートし、該細胞の感作性マーカーの発現量を測定する工程、該発現量を、被験物質を添加していない対照細胞における該感作性マーカーの発現量と比較する工程、及び該比較結果に基づいて被験物質の感作性を評価する工程を含む、被験物質の感作性を評価する方法であって、
該感作性マーカーが、(1)IL−10受容体(IL−10R)、及び(2)単球走化性タンパク質1(MCP−1)、マトリックスメタロプロテアーゼ−9(MMP−9)、オステオポンチン(OPN)、ケモカインリガンド5(CCL5)、CCL23、インターフェロン誘導タンパク質p78(MxA)、およびGROαから選択される1種または2種以上のマーカーの組み合わせであることを特徴とする、上記方法。 - IL−10Rに加えて、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体(uPA−R)、血小板由来成長因子α(PDGFα)、TNFα誘導タンパク質3(A20)、及びインターフェロン制御因子−1(IRF−1)から選択される1種または2種以上のマーカーの発現量を測定する、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、血液、骨髄、リンパ節、及び/又は皮膚由来であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、THP−1、U−937、KG−1、MUTZ−1、HL−60、Jurkatから1種以上選択される培養細胞であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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