JP2018068177A

JP2018068177A - アジュバント作用の評価法

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Publication number: JP2018068177A
Application number: JP2016210271A
Authority: JP
Inventors: 泰生溝田; Yasuo Mizota; 克利大野; Katsutoshi Ono
Original assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Current assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2018-05-10

Abstract

【課題】本発明は、株化細胞においてアレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用、特にTh2細胞の誘導作用を高感度に評価することを主な課題とする。【解決手段】斯かる課題を解決する発明として、マクロファージ由来の株化細胞とTリンパ球由来の株化細胞を共培養することにより、Th2細胞の分化誘導に関わる代表的な遺伝子の発現変化を高感度に検出できることを見出した。すなわち、本発明は単一の株化細胞を用いる場合と比べて、アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用、特にTh2細胞の誘導作用を高感度に評価する方法を提供するものである。【選択図】図３

Description

本発明は、株化細胞を用いて、アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用、特にTh2細胞の誘導作用を評価する方法に関する。

感作性物質のアレルギー誘発作用を増強する化学物質をアジュバントと呼び、生活環境中にはアジュバント作用を有する化学物質が数多く存在している。アジュバントの作用としては、アレルギー成立過程において抗原提示細胞に関与するものや、Th2細胞の誘導に関与するものなどが知られている。

近年、環境中に存在するアジュバントはアレルギー疾患の発症要因の一つと考えられており、公衆衛生上の観点からどのような化学物質がアジュバント作用を有するかを評価することが極めて重要になっている。

生体において被験物質のアジュバント作用を評価する方法としては、従来、実験動物に感作性物質と被験物質とを供与し、皮膚等に生じる反応や、生体内におけるサイトカイン、抗体の産生量などを指標として評価する手法が知られている。しかしながら、実験動物を用いる方法は結果を得るまでの試験期間が長く、動物愛護の観点からも動物実験を代替可能な方法の開発が望まれている。

アレルギー成立過程においては、まず抗原提示細胞が感作性物質を抗原として認識し、活性化される。細胞を用いて抗原提示細胞の活性化を評価する方法としては、例えばヒト単核球細胞における感作性マーカーの発現変化を指標とした方法が報告されている（特許文献１、２）。これらによれば、アジュバント活性は感作性物質による感作性マーカーの発現を増強するかどうかを指標に検出することが可能である。

アレルギー成立過程において、抗原提示細胞の活性化に続いて、ナイーブT細胞よりTh2細胞が誘導される。Th2細胞はヘルパーT細胞サブセットの一つであり、Th2細胞の誘導とアレルギー疾患発症は密接に関連している。Th2細胞への誘導を評価する方法としては、Th2型のサイトカイン（IL-4，IL-5，IL-13）の産生、転写因子GATA3の発現の上昇を指標とした方法が報告されている（非特許文献１）。これらによれば、抗原提示細胞の活性化とは別に、Th2細胞を誘導する作用もアジュバント活性と考えられる。

Th2細胞の誘導作用を指標とした被験物質のアジュバント活性評価には、上述の通りナイーブT細胞を用いた方法が一般的であるが、試験に必要な量のナイーブT細胞を得るためには、多数の実験動物が必要となるだけでなく、実験動物の個体差による再現性の問題がある。

一方、株化細胞を用いてTh2細胞の誘導作用を検出することができれば、細胞の入手が容易であり、かつ再現性の高い試験法の構築が可能となる。しかしながら株化細胞を用いて当該作用を感度良く検出できる方法は確立されていないのが現状である。

特許第4270702号特許第5654531号

手島玲子「環境物質と免疫毒性」, Bull. Natl Inst. Health Sci., 132,47-56（2014）

そこで本発明は、株化細胞においてアレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用、特にTh2細胞の誘導作用を高感度に評価することを主な課題とする。

本発明者らは、上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、マクロファージ由来の株化細胞とTリンパ球由来の株化細胞を共培養することにより、感作成立に関わる代表的な遺伝子の発現変化を高感度に検出できることを見出した。本発明は、斯かる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

すなわち、本発明は下記の発明を包含する：
項１、アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用を評価する方法であって、アレルゲンタンパク質と被験物質の存在下でマクロファージ由来の株化細胞とTリンパ球由来の株化細胞を共培養し、Tリンパ球由来の株化細胞のIL-4又はGATA-3の発現を測定する方法。

項２、前記マクロファージ由来の株化細胞が、マウス由来のRAW264.7細胞である、項１に記載の方法。

項３、前記Tリンパ球由来の株化細胞が、マウス由来のEL-4細胞である、項１又は２に記載の方法。

項４、前記アレルゲンタンパク質が、卵白アルブミンである、項１〜３のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、マクロファージ及びTリンパ球由来の株化細胞を利用して、アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用を高感度に評価することができる。従って、本発明により、アレルギー症状を増悪しうる化合物を高感度に検出することが可能となる。

図中の略号は、Cont；DMSO（ジメチルスルホキシド、陰性対照）、1% OVA；卵白アルブミン処理、DEHP；Bis(2-ethylhexyl)phthalate）処理、1% OVA＋DEHP；1% OVAとDEHPの同時処理、である。
終濃度1% OVA、終濃度30μg/mL DEHPをそれぞれ単独、あるいはすべて含む培地で培養する方法により誘導されるGATA-3遺伝子の発現量を、陰性対照に対する相対値により示す。終濃度1% OVA、終濃度30μg/mL DEHPをそれぞれ単独、あるいはすべて含む培地で培養する方法により誘導されるIL-4遺伝子の発現量を、陰性対照に対する相対値により示す。 EL-4細胞とRAW264.7細胞との共培養が、終濃度1% OVA、終濃度30μg/mL DEHPのGATA-3遺伝子の発現誘導に対して与える影響を示す。 EL-4細胞とRAW264.7細胞との共培養が、終濃度1% OVA、終濃度30μg/mL DEHPのIL-4遺伝子の発現誘導に対して与える影響を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるマクロファージ由来細胞とTリンパ球由来細胞は、本発明の目的に沿うものであれば特に限定されないが、具体例としてマウスマクロファージ由来のRAW264.7細胞、及びマウスTリンパ球由来のEL-4細胞が挙げられる。これらの細胞は細胞バンクから容易に入手することができる。

細胞を共培養する方法は、本発明の目的に沿うものであれば特に限定されないが、具体例としてセルカルチャーインサートを用い、インサート内でマクロファージ細胞を、インサート外でTリンパ球細胞を培養することにより同一ウェル内で2種の細胞を維持することができる。

培養細胞を維持するための培地としては常用の任意の培地を使用することができるが、具体例としてRPMI1640、DMEMなどが挙げられる。また、これらの培地には非働化したウシ胎児血清を最終濃度10%となるよう添加しておくことが好ましい。

アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用の評価においては、上記マクロファージ細胞とTリンパ球細胞とを共培養し、アレルゲンタンパク質と被験物質を含む培地中で12〜48時間、好ましくは16〜24時間程度CO₂インキュベーター内で培養を行う。対照として、アレルゲンタンパク質のみ、あるいは被験物質のみ、あるいは培地のみを添加して共培養を行う。

培養終了後、Tリンパ球のGATA-3又はIL-4発現量を測定する。発現量測定の方法は本発明の目的に沿う限り特に限定されないが、GATA-3 mRNA又はIL-4 mRNAをRT-PCRにより定量する方法、GATA-3タンパク質又はIL-4タンパク質を特異的抗体により免疫測定する方法などが挙げられる。尚、IL-4及びGATAの両方の発現量を測定する方が好ましい。

GATA-3又はIL-4発現量測定の結果、アレルゲンタンパク質のみ、あるいは被験物質のみを添加した場合と比較して、アレルゲンタンパク質と被験物質とを同時に添加することによってGATA-3又はIL-4発現量の増加が認められる場合、被験物質はTh2細胞の誘導作用を有すると判定できる。

以下、本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。

［実施例１］DEHPのアジュバント作用の検出
─卵白アルブミン（以下、OVA）＋DEHP処理─
EL-4細胞（JCRBから購入）、及びRAW264.7細胞（ATCCから購入）をアレルゲンタンパク質として終濃度1％OVAを含むRPMI1640培地（含10%FBS）で2.5×10⁵cells/mLに調製した。次いで、24穴プレートにEL-4細胞を1mL／穴ずつ播種した後、セルカルチャーインサート（グライナー製、Cat.#662641）を各ウェルに装着し、インサート内にRAW264.7細胞を0.2mLずつ播種した。

アジュバント作用が知られているBis(2-ethylhexyl)phthalate）（以下、DEHP）をセルカルチャーインサート内のRAW264.7細胞、及びセルカルチャーインサート外のEL-4細胞に終濃度30μg/mLとなるよう添加し、CO₂インキュベーター内で18hr培養した。

培養後のEL-4細胞からRNeasy mini kit（キアゲン製）を用いて総 RNAを抽出し、High Capacity RNA-to-cDNA Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてcDNAを調製した。得られたcDNAを鋳型として、Viia7 リアルタイムPCRシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）によりGATA-3、IL-4、及びGAPDH遺伝子の発現量を測定した。

［比較例１］
─OVA単独処理─
被験物質の代わりにDMSOを終濃度0.1%となるよう添加すること以外、実施例１と同様の操作を行った。

［比較例２］
─DEHP単独処理─
OVAを含まないRPMI1640（含10%FBS）を用いること以外、実施例１と同様の操作を行った。

［比較例３］
─未処理コントロール─
被験物質の代わりにDMSOを終濃度0.1%となるよう添加すること以外、比較例２と同様の操作を行った。
［発現解析］

上記処理を行った細胞におけるGATA-3、及びIL-4遺伝子の発現量をGAPDH遺伝子の発現量で補正した後、未処理コントロールに対する相対発現量を算出した。

［結果］
図１にGATA-3遺伝子の発現解析の結果を示す。GATA-3遺伝子の発現量はOVA単独処理と比較して、OVA＋DEHP処理において顕著に増加することが確認できる。
図２にIL-4遺伝子の発現解析の結果を示す。IL-4遺伝子の発現量はOVA単独処理と比較して、OVA＋DEHP処理において顕著に増加することが確認できる。

［実施例２］共培養の影響解析
RAW264.7細胞を播種せずに、実施例１、及び比較例３と同様の操作を行った。

［発現解析］
GATA-3、及びIL-4遺伝子の発現量をGAPDH遺伝子の発現量で補正した後、比較例３に対する相対発現量を算出した。

［結果］
図３にGATA-3遺伝子の発現解析の結果を示す。OVA＋DEHP処理におけるGATA-3遺伝子の発現増加は、EL-4細胞単独で試験した場合（-RAW264.7）と比較して、RAW264.7細胞と共培養した場合（+RAW264.7）の方が高感度に検出できることが確認できる。
図４にIL-4遺伝子の発現解析の結果を示す。OVA＋DEHP処理におけるIL-4遺伝子の発現増加は、EL-4細胞単独で試験した場合（-RAW264.7）と比較して、RAW264.7細胞と共培養した場合（+RAW264.7）の方が高感度に検出できることが確認できる。

Claims

アレルゲンタンパク質に対する被験物質のアジュバント作用を評価する方法であって、
アレルゲンタンパク質と被験物質の存在下でマクロファージ由来の株化細胞とTリンパ球由来の株化細胞を共培養し、Tリンパ球由来の株化細胞のIL-4又はGATA-3の発現を測定する方法。
前記マクロファージ由来の株化細胞が、マウス由来のRAW264.7細胞である、請求１に記載の方法。
前記Tリンパ球由来の株化細胞が、マウス由来のEL-4細胞である、請求１又は２に記載の方法。
前記アレルゲンタンパク質が、卵白アルブミンである、請求１〜３のいずれかに記載の方法。