BR112013010272B1 - métodos analíticos e arranjos para uso nos mesmos - Google Patents

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Abstract

MÉTODOS ANALÍTICOS E ARRANJOS PARA USO NOS MESMOS. A presente invenção refere-se a um método in vitro para identificar agentes capazes de induzir sensibilização de pele humana e arranjos e kits diagnósticos para uso em tais métodos. Em particular, os métodos incluem a medição de uma expressão dos biomarcadores listados na tabela 3A e / ou 3B em céluias MUTZ-3 expostas a um agente de teste.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a um método in vitro para identificar agentes capazes de induzir sensibilização de pele humana e arranjos e kits analíticos para uso em tais métodos.
ANTECEDENTES
[0002] Dermatite de contato alérgica é uma doença inflamatória da pele que afeta uma proporção significativa da população. Ela é normalmente causada por respostas imunológicas para haptenos químicos levando a um impacto econômico substancial para a sociedade. Os testes atuais para produtos químicos sensibilizantes dependem de experimentação em animais. Novas legislações sobre o registro e uso de produtos químicos dentro de, por exemplo, as indústrias farmacêuticas e de cosméticos, têm estimulado esforços significativos de pesquisa para o desenvolvimento de testes baseados em células humanas alternativas para a previsão de sensibilização. O objetivo é substituir os experimentos com animais com testes in vitro exibindo um maior poder de previsão.
[0003] Dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele comum caracterizada por eczema e episódios recorrentes de prurido [1]. A doença afeta uma proporção significativa da população, com taxas de prevalência de 7,2% a 18,6% na Europa [2, 3], e a incidência está aumentando devido à exposição repetida a produtos químicos sensibilizantes. ACD é uma resposta tipo IV de hipersensibilidade do tipo retardado causada principalmente pelo reativo T helper 1 (Th1) e interferon (IFN)g produzindo células CD8+ T no local de contato com pequenos haptenos químicos em indivíduos previamente expostos e imunologicamente sensibilizados[4]. Células dendríticas (DC) na epiderme iniciam reações imunes respondendo aos haptenos ligados a auto-moléculas e ativando imunidade mediada por células T.
[0004] A regulamentação REACH (para Registro, Avaliação e Autorização de Produtos Químicos) exige que todos os novos e existentes produtos químicos na União Europeia, envolvendo aproximadamente 30 000 produtos químicos, devem ser testados para efeitos perigosos [5]. Como a identificação de sensibilizantes potenciais atualmente requer testes em animais, a legislação REACH terá um enorme impacto sobre o número de animais necessários para teste. Além disso, a sétima Emenda às Diretrizes sobre Cosméticos (76/768/EEC) estabeleceu uma proibição de testes em animais para a maioria dos ingredientes cosméticos para uso humano, de modo a estar em vigor até 2009, com as exceções de alguns testes em 2013. Assim, o desenvolvimento de alternativas in vitro confiáveis para animais experimentais para a avaliação da capacidade de sensibilização de produtos químicos é urgente. Até agora, não há um substituto não animal disponível para a identificação de produtos químicos sensibilizantes da pele, em vez do teste preferido que é o teste de linfonodo local de camundongo (LLNA) [6], seguido pelo teste de maximização de porquinho-da-ínica (GMPT) [7]. Uma alternativa in vitro para estes modelos animais deveria preferivelmente apresentar maior confiabilidade, precisão e, muito importante, correlacionar a reatividade humana.
[0005] Células dendríticas (DCs) desempenham papéis chave na resposta imune ao realizarem as conexões essenciais entre imunidade inata e adaptativa. Elas podem, quando disparadas, produzir rapidamente grandes quantidades de mediadores, os quais influenciam migração e ativação de outras células no local da inflamação e seletivamente respondem a vários patógenos e fatores ambientais, por sintonização fina da resposta celular através da apresentação a antígeno. Assim, explorar e utilizar a tomada de decisões imunológicas por DCs durante a estimulação com sensibilizantes, pode servir como uma estratégia de teste potente para a previsão de sensibilização.
[0006] No entanto, os fenótipos multifacetados e funções especializadas de diferentes sub-populações de DC, bem como a sua distribuição ampla e escassa, são fatores complicadores que impedem o emprego de DCs primárias como uma plataforma de teste. Deste modo, existe uma necessidade real de se estabelecer testes in vitro precisos e confiáveis, que também possam contornar os problemas associados com a variabilidade de a dificuldade na obtenção de DCs.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0007] Assim, o desenvolvimento de testes com base na previsibilidade da função de DC deve preferencialmente depender de tipos celulares alternativos ou miméticos DCs in vivo. Para esta finalidade, uma linhagem celular com características de DC seria vantajosa, uma vez que constitui um suprimento estável, reprodutível e ilimitado de células. Em termos de miméticos de DC, células MUTZ-3 mielomonocíticas diferenciadas são, de longe, o candidato preferido [8]. MUTZ- 3 é como uma fonte ilimitada de progenitores de DC CD34+ e podem adquirir, com estimulação de citocinas, fenótipos semelhantes a DCs imaturas ou DCs tipo Langerhans [9], apresentam antígenos através CD1d, classe I e II MHC de e induzem a proliferação de células T específica [8]. MUTZ-3 também exibe um perfil fenotípico e transcripcional maduro quando de estimulação com mediadores inflamatórios [10].
[0008] Os presentes inventores desenvolveram um novo princípio de teste para a previsão de sensibilizantes da pele. Foi surpreendentemente verificado que os sensibilizantes da pele podem ser precisamente identificados/previstos usando células progenitoras DC, tal como células MUTZ-3, sem posterior diferenciação em um processo pelo qual as células são estimuladas com um painel de produtos químicos sensibilizantes, produtos químicos não- sensibilizantes, e/ou outros controles (por exemplo, controles de veículos compreendendo diluente somente, como DMSO e/ou água destilada). Isto foi verificado como simplificando e melhorando substancialmente a reprodutibilidade do procedimento.
[0009] A resposta transcripcional de estimulação química foi avaliada com um perfil amplo do genoma. A partir da análise dos dados, uma assinatura de biomarcador de 200 transcriptos foi identificada que completamente separou a resposta transcripcional induzida por produtos químicos sensibilizantes versus produtos químicos não-sensibilizantes e controles de veículo. Além disso, a força de previsão potente da assinatura foi ilustrada, usando análise de curva SVM e ROC. A assinatura de biomarcador inclui transcriptos envolvidos em vias biológicas relevantes, tal como maturação de DC e respostas de citocinas, que pode lançar uma luz sobre as interações moleculares envolvidas no processo de sensibilização. Em conclusão, foi identificada uma assinatura de biomarcador com uma força de previsão potente, que representa uma leitura atraente para um teste in vitro, utilizável para a identificação de produtos químicos sensibilizantes em humanos.
[0010] Por isso, um primeiro aspecto da presente invenção provê um método in vitro para identificar agentes capazes de induzir sensibilização de pele de mamífero compreendendo ou consistindo das etapas de: a. expor uma população de células dendríticas ou uma população de células de tipo dendrítico a um agente de teste; e b. medir nas células a expressão de um ou mais biomarcador(es) selecionado(s) dentre o grupo definido na Tabela 3, em que a expressão nas células de um ou mais biomarcadores medidos na etapa (b) é indicativa do efeito sensibilizante do agente de teste.
[0011] Por “agentes capazes de induzir sensibilização de pele de mamífero” significa-se qualquer agente capaz de induzir e disparar uma reação de hipersensibilidade tardia do tipo IV em um mamífero. Preferivelmente, a reação de hipersensibilidade tardia do tipo IV é mediado por DC.
[0012] Em uma forma de realização, os “agentes capazes de induzir sensibilização da pele de mamífero” é um agente capaz de induzir e disparar uma reação de hipersensibilidade tardia do tipo IV em um local de contato epidérmico em um mamífero.
[0013] O mamífero pode ser qualquer animal doméstico ou de criação. Preferivelmente, o mamífero é um rato, camundongo, porquinho da índia, gato, cachorro, cavalo ou um primata. Mais preferencialmente, o mamífero é humano. Como acima discutido, métodos in vivos de determinação de sensibilização são conhecidos na arte. Um método preferido é o teste de linfonodo local (para detalhes, ver Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8). Um outro método apropriado, mas menos preferido, é o teste de maximização do porquinho da índia (para detalhes, ver Magnusson, B. e A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76).
[0014] Por “células de tipo dendrítico” significa-se células não dendríticas que exibem características funcionais e fenotípicas específicas para as células dendríticas tais como características morfológicas, expressão de moléculas co-estimuladoras e moléculas MHC de classe II, e a capacidade para a pinocitose de macromoléculas e para a ativação de células T em repouso.
[0015] Em uma forma de realização, as células de tipo dendrítico são progenitores de células dendríticas CD34+. Opcionalmente, os progenitores de células dendríticas CD34+ pode adquirir, quando da estimulação de citocinas, os fenótipos de apresentação a antígenos através CD1d, MHC de classe I e II, induzir a proliferação de células T específicas, e/ou exibir um perfil transcripcional maduro e fenotípico quando da estimulação com mediadores inflamatórios (isto é, fenótipos similares a células dendríticas imaturas ou células dendríticas de tipo Langerhans).
[0016] Células dendríticas podem ser reconhecidas por função, por fenótipo e/ou por padrão de expressão de genes, particularmente por fenótipo de superfície de célula. Estas células são caracterizadas pela sua morfologia distintiva, elevados níveis de expressão de MHC-classe II de superfície e capacidade para apresentar o antígeno para células T CD4+ e/ou CD8+, particularmente para células T nativas (Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).
[0017] A superfície celular de células dendríticas é incomum, com projeções características semelhantes a véu, e é caracterizada pela expressão dos marcadores de superfície celular CD11c e MHC classe lI. A maioria das DCs são negativas para marcadores de outras linhagens de leucócitos, incluindo células T, células B, monócitos / macrófagos e granulócitos. Subpopulações de células dendríticas também podem expressar marcadores adicionais, incluindo 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8alpha, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123 (IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-caderina, Langerina, receptor de manose, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, e várias lectinas.
[0018] Os padrões de expressão destes marcadores de superfície celular podem variar junto com a maturidade das células dendríticas, seu tecido de origem, e/ou as suas espécies de origem. Células dendríticas imaturas expressam níveis baixos de MHC classe II, mas são capazes de endocitar proteínas antigênicas e processar as mesmas para apresentação em um complexo com moléculas MHC classe II. Células dendríticas ativadas expressam níveis elevados de MHC classe 11, ICAM-1 e CD86, e são capazes de estimular a proliferação de células T alogênicas nativas, por exemplo, em uma reação de leucócitos mista (MLR).
[0019] Funcionalmente, células dendríticas ou células de tipo dendrítico podem ser identificadas por qualquer teste conveniente para a determinação de apresentação a antígeno. Tais testes poderão incluir a capacidade de estimular células T iniciadas por antígeno e/ou nativas mediante a apresentação de um antígeno de teste, seguido por determinação de proliferação das células T, liberação de IL-2, e semelhantes.
[0020] Por “expressão” significa-se o nível ou quantidade de um produto de gene tal como mRNA ou proteína.
[0021] Métodos de detecção e/ou medição da concentração de proteína e/ou ácido nucleico são bem conhecidos dos versados na arte, ver, por exemplo, Sambrook e Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0022] Métodos preferidos para a detecção e/ou medição de proteína inclui Western blot, North-Western blot, testes de imunossorção (ELISA), microarranjo de anticorpo, microarranjo de tecido (TMA), imunoprecipitação, hidridação in situ e outras técnicas de imuno-histoquímica, radioimunoteste (RIA), testes imunorradiométricos (IRMA) e testes imunoenzimáticos (IEMA), incluindo testes de sanduíche usando anticorpos monoclonais e/ou policlonais. Testes de sanduíche exemplares são descritos por David et al., nas patentes US Nos. 4.376.110 e 4.486.530, aqui incorporadas por referência. Coloração de anticorpo de células em lâminas pode ser usada em métodos conhecidos em testes diagnósticos laboratoriais de citologia, como bem conhecido dos versados na arte.
[0023] Tipicamente, ELISA envolve a utilização de enzimas, que dão um produto de reação colorida, geralmente em testes de fase sólida. Enzimas tal como peroxidase de raiz-forte e fosfatase têm sido amplamente empregadas. Um modo de amplificar a reação de fosfatase consiste em usar NADP como um substrato para gerar NAD que agora atua como uma co-enzima para um segundo sistema de enzima. Pirofosfatase de Escherichia coli fornece um bom conjugado porque a enzima não está presente nos tecidos, é estável e dá uma boa cor de reação. Sistemas químico-luminescentes com base em enzimas como luciferase também podem ser usados.
[0024] Conjugação com a vitamina biotina é frequentemente usada uma vez que esta pode ser facilmente detectada por sua reação com avidina ligada a enzima ou estreptavidina à qual se liga com grande afinidade e especificidade.
[0025] Métodos preferidos para a detecção e/ou medição de ácido nucleico (por exemplo, mRNA) incluem southern blot, northern blot, reação de cadeia polimerase (PCR), PCR- transcriptase reversa (RT-PCR), PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR), nanoarranjo, microarranjo, macroarranjo, auto-radiografia e hidridação in situ.
[0026] Em uma forma de realização o método compreende expor uma população separada das células dendríticas ou células de tipo dendrítico a um agente de controle negativo que não sensibiliza a pele humana, e medir nas células a expressão de um ou mais biomarcador(es) medido(s) na etapa (b). Assim, um efeito sensibilizante do agente de teste é indicado no evento em que a expressão na população da célula de um ou mais biomarcador(es) medido(s) na etapa (b) é/são diferente(s) da expressão na amostra de controle negativa.
[0027] Em uma forma de realização, o agente de controle negativo é um solvente para uso com o teste ou agentes de controle da invenção. Assim, o controle negativo pode ser DMSO e/ou água destilada.
[0028] Em outra forma de realização, a expressão de um ou mais biomarcadores medidos na etapa (b) das células dendríticas ou células de tipo dendrítico antes da exposição ao agente de teste é usado com um controle negativo.
[0029] Outra forma de realização compreende expor uma população separada das células dendríticas ou células de tipo dendrítico a um agente de controle positivo que sensibiliza pele humana e medir nas células a expressão de um ou mais biomarcador(es) medido(s) na etapa (b). Assim, um efeito sensibilizante do agente de teste é indicada no evento em que a expressão na população de célula de um ou mais biomarcador(es) medido(s) na etapa (b) é/são similar(ES) ou igual(ais) à expressão na amostra de controle positivo.
[0030] Preferivelmente o método compreende, na etapa (b), medir a expressão de, pelo menos, um biomarcador selecionado dentre o grupo consistindo de: 1. receptor de paladar, tipo 2, membro 5 (TAS2R5), 2. proteína de tipo fator de crescimento de queratinócitos 1/2/proteína hipotética FLJ20444 (KGFLP1/2/ FLJ20444), 3. transformação anterior posterior de transmembrana 1 (TAPT1), 4. homólogo a ‘sprouty’ 2 (SPRY2), 5. ácido graxo sintase (FASN), 6. CLL de célula B/linfoma 7A (BCL7A), 7. família transportadora de solutos 25, membro 32 (SLC25A32), 8. feritina, pseudogene de polipeptídeo pesado1 (FTHP1), 9. ATPase, transportando H+, 50/57kDa lisossômico, subunidade V1 H (ATP6V1H), 10. esqualeno epoxidase (SQLE), e 11. grupo histona 1, H1e (HIST1H1E).
[0031] Assim, em uma forma de realização a expressão de receptor de paladar, tipo 2, membro 5 (TAS2R5) é medida na etapa (b). Em outra forma de realização, na etapa (b), a expressão de proteína de tipo fator de crescimento de queratinócitos 1/2/proteína hipotética FLJ20444 (KGFLP1/2/ FLJ20444) é medida. O método pode compreender medir a expressão de transformação anterior posterior de transmembrana 1 (TAPT1) na etapa (b). Em uma forma de realização, o método compreende medir a expressão de homólogo a ‘sprouty’ 2 (SPRY2) na etapa (b). Contudo, outra forma de realização o método, na etapa (b), compreende medir a expressão de ácido graxo sintase (FASN). O método pode compreender medir a expressão de CLL de célula B/linfoma 7A (BCL7A) na etapa (b). Ele também pode compreender medir a expressão de família transportadora de solutos 25, membro 32 (SLC25A32) na etapa (b). Pode compreender adicionalmente, na etapa (b), medir a expressão de feritina, pseudogene de polipeptídeo pesado1 (FTHP1). Ainda outra forma de realização compreende medir a expressão de ATPase, transportando H+, 50/57kDa lisossômico, subunidade V1 H (ATP6V1H) na etapa (b). Em outra forma de realização etapa (b) compreende medir a expressão de esqualeno epoxidase (SQLE). Ainda em outra forma de realização a expressão de agrupamento histona 1, H1e (HIST1H1E) é medida na etapa (b).
[0032] O método pode compreender ou consistir de medir, na etapa (b), a expressão de, pelo menos, 2 biomarcadores a partir da Tabela 3A, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 biomarcadores a partir da Tabela 3A. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ou consiste de medir a expressão de ácido graxo sintase (FASN) e esqualeno epoxidase (SQLE) na etapa (b).
[0033] O método pode adicionalmente ou alternativamente compreender ou consistir de, medir na etapa (b) a expressão de, pelo menos, 2 biomarcadores a partir da Tabela 3B, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, ou pelo menos 189 biomarcadores a partir da Tabela 3B.
[0034] Portanto, a expressão de todos os biomarcadores na Tabela 3A e/ou todos os biomarcadores na Tabela 3B pode ser medida na etapa (b).
[0035] Em uma forma de realização preferida, etapa (b) compreende ou consiste de medir a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando o um ou mais biomarcador(es). A molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de cDNA ou uma molécula de mRNA. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de mRNA.
[0036] Em uma forma de realização a expressão de um ou mais biomarcador(es) na etapa (b) é realizada usando um método selecionado dentre o grupo consistindo de hibridação Southern, hibridação Northern, reação de cadeia polimerase (PCR), transcriptase reversa PCR (RT-PCR), PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR), nanoarranjo, microarranjo, macroarranjo, auto-radiografia e hidridação in situ. Preferivelmente, a expressão de um ou mais biomarcador(es) é medida usando um microarranjo de DNA.
[0037] O método pode compreender medir a expressão de um ou mais biomarcador(es) na etapa (b) usando uma ou mais porções de ligação, cada uma capaz de ligar seletivamente a uma molécula de ácido nucleico codificando um dos biomarcadores identificados na Tabela 3. Em uma forma de realização a uma ou mais porções de ligação compreendem ou consistem, cada, de uma molécula de ácido nucleico. Em outra forma de realização a uma ou mais porções de ligação compreendem ou consistem, cada, de DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA ou PMO. Preferivelmente, a uma ou mais porções de ligação compreendem ou consistem, cada, de DNA. Em uma forma de realização, a uma ou mais porções de ligação tem 5 a 100 nucleotídeos de comprimento. No entanto, em uma forma de realização alternativa, elas são 15 a 35 nucleotídeos de comprimento.
[0038] Agentes de ligação apropriados (também referidos como moléculas de ligação) podem ser selecionados ou triados a partir de uma biblioteca com base na sua capacidade para ligar um dado ácido nucleico, proteína ou motivo de aminoácido, como discutido abaixo.
[0039] Em uma forma de realização preferida, a porção de ligação compreende uma porção detectável.
[0040] Por uma “porção detectável”, foi incluída pelos requerentes uma porção que permite que a sua presença e/ou quantidade relativa e/ou localização (por exemplo, a localização em um arranjo) seja determinada, tanto diretamente como indiretamente.
[0041] Porções detectáveis apropriadas são bem conhecidas na arte.
[0042] Por exemplo, a porção detectável pode ser uma porção fluorescente e/ou luminescente e/ou quimioluminescente que, quando exposta a condições específicas, pode ser detectada. Tal porção fluorescente pode ter de ser exposta à radiação (isto é, luz) em um comprimento de onda e intensidade específicos para causar excitação da porção fluorescente, permitindo assim emitir fluorescência detectável em um comprimento de onda específico, que pode ser detectado.
[0043] Alternativamente, a porção detectável pode ser uma enzima que é capaz de converter um substrato (preferivelmente não detectável) em um produto detectável, que pode ser visualizado e/ou detectado. Exemplos de enzimas apropriadas são discutidos em mais detalhes abaixo em relação aos testes, por exemplo, ELISA.
[0044] Assim, a porção detectável pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de: uma porção fluorescente; uma porção luminescente; uma porção quimioluminescente; uma porção radioativa (por exemplo, um átomo radioativo); ou uma porção enzimática. Preferivelmente, a porção detectável compreende ou consiste de um átomo radioativo. O átomo radioativo pode ser selecionado dentre o grupo consistindo de tecnécio-99m, iodo-123, iodo-125, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, fósforo- 32, enxofre-35, deutério, trítio, rênio-186, rênio-188 e ítrio-90.
[0045] Claramente, o agente a ser detectado (como, por exemplo, o um ou mais biomarcadores na amostra de teste e/ou amostra de controle aqui descritos e/ou uma molécula de anticorpo para uso em detecção de uma proteína selecionada) deve ter suficiente de isótopos atômicos apropriadas para a porção detectável ser prontamente detectável.
[0046] Em uma forma de realização preferida alternativa, a porção detectável da porção de ligação é uma porção fluorescente.
[0047] Os radio-rótulos ou outros podem ser incorporados nos biomarcadores presentes nas amostras dos métodos da invenção e/ou as porções de ligação da invenção de formas conhecidas. Por exemplo, se o agente de ligação é um polipeptídeo, ele pode ser bio-sintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos apropriados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Rótulos tais como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh e 111In podem, por exemplo, ser fixados via resíduos de cisteína em porção de ligação. Itrio-90 pode ser fixado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) pode ser usado para incorporar 123I. Referência (“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, J-F Chatal, CRC Press, 1989) descreve em detalhes outros métodos. Métodos para conjugar outras porções detectáveis (tais como porções enzimática, fluorescente, luminescente, quimioluminescente ou radioativa) de proteínas são bem conhecidos na arte.
[0048] Será apreciado pelos versados na arte que biomarcadores na(s) amostra(s) a ser(em) testada(s) pode ser rotulado(s) com a porção que indiretamente auxilia a determinação da presença, quantidade e/ou localização das referidas proteínas. Portanto, a porção pode constituir um componente de uma porção detectável multicomponente. Por exemplo, os biomarcadores na(s) amostra(s) a ser(em) testada(s) podem ser rotulados com biotina, o que permite a sua detecção subsequente usando estreptavidina fusionada ou de outra forma unida a um rótulo detectável.
[0049] Em outra forma de realização do primeiro aspecto da presente invenção etapa (b) compreende determinar a expressão da proteína de um ou mais biomarcador(es). O método pode compreender medir a expressão de um ou mais biomarcador(es) na etapa (b) usando uma ou mais porções de ligação cada uma capaz de ligar seletivamente a um dos biomarcadores identificados na Tabela 3. Uma ou mais porções de ligação podem compreender ou consistir de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo tal como um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo.
[0050] O termo “anticorpo” inclui quaisquer anticorpos sintéticos, anticorpos recombinantes ou híbridos de anticorpos, tal como, mas não limitados a, a molécula de anticorpo de cadeia única produzida pela exibição de fagos de regiões variáveis e/ou constantes de cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina, ou outras moléculas imunointerativas capazes de ligar a um antígeno em um formato de imunoteste que é conhecido por versados na arte. a. Também foi incluído pelos requerentes o uso dos agentes de ligação do tipo anticorpo, tal como affibodies e aptâmeros.
[0051] Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que conservam seus sítios de ligação específicos pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
[0052] Adicionalmente, ou alternativamente, uma ou mais das primeiras moléculas de ligação pode ser um aptâmero (ver Collett et al., 2005, Methods 37:4-15).
[0053] Bibliotecas moleculares tal como bibliotecas de anticorpos (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), bibliotecas de peptídeos (Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), bibliotecas de cDNA expressados (Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), bibliotecas em outros andaimes que a armação de anticorpo tal como affibodies (Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) ou bibliotecas baseadas em aptâmeros (Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31) podem ser usadas como uma fonte a partir da qual moléculas de ligação que são específicas para um dado motivo são selecionadas para uso nos métodos da invenção.
[0054] As bibliotecas moleculares podem ser expressadas in vivo em células procarióticas (Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op. cit.) ou células eucarióticas (Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6) ou podem ser expressadas in vitro sem o envolvimento de células (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).
[0055] Nos casos quando bibliotecas baseadas em proteína são usadas, os genes codificando as bibliotecas de moléculas de ligação potenciais são frequentemente empacotadas em vírus e a molécula de ligação potencial exibida na superfície do vírus (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).
[0056] Talvez o sistema de exibição mais comumente usado seja o bacteriófago filamentoso exibindo fragmentos de anticorpos em suas superfícies, os fragmentos de anticorpos sendo expressados como uma fusão com a proteína de capa menor do bacteriófago (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). Contudo, outros sistemas apropriados para a exibição incluem usar outros vírus (EP 39578), bactérias (Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21), e leveduras (Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56).
[0057] Além disso, sistemas de exibição têm sido desenvolvidos utilizando a ligação do produto polipeptídeo para seu mRNA codificante no assim chamado sistemas de exibição de ribossomo (Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), ou alternativamente ligação do produto polipeptídeo para seu DNA codificante (ver Patente US No. 5.856.090 e WO 98/37186).
[0058] Os domínios pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo estão envolvidos em reconhecimento de antígeno, um fato reconhecido pela primeira vez por meio de experimentos de digestão de protease inicial. Outra confirmação foi encontrada por “humanização” de anticorpos de roedores. Domínios variáveis de origem de roedor podem ser fusionados com domínios constantes de origem humana de tal modo que o anticorpo resultante retém a especificidade antigênica do anticorpo parental do roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).
[0059] Essa especificidade antigênica é conferida por domínios variáveis e é independente dos domínios constantes e conhecida a partir de experiências que envolvem a expressão bacteriana dos fragmentos de anticorpos, contendo todos um ou mais domínios variáveis. Essas moléculas incluem moléculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadeia única (ScFv) onde os domínios de parceiros VH e VL estão ligados através de um oligopeptídeos flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAbs) compreendendo domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos que conservam seus sítios de ligação específicos pode ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
[0060] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode ser selecionado dentre o grupo consistindo de anticorpos intactos, fragmentos Fv (por exemplo, Fv de cadeia única e Fv ligado a dissulfeto), fragmentos de tipo Fab (por exemplo fragmentos Fab, fragmentos Fab’ e fragmentos F(ab)2), domínios variáveis únicos (por exemplo de domínios VH e VL) e anticorpos de domínio (dAbs, incluindo formatos simples e duplos [isto é, DAb-ligador-dAb]). Preferivelmente, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é um Fv de cadeia única (scFv).
[0061] Uma ou mais porções de ligação pode alternativamente compreender ou consistir de um agente de ligação de tipo anticorpo, por exemplo, um affibody ou aptâmero.
[0062] Por “moléculas scFv” significam-se moléculas em que os domínios de parceiros VH e VL estão ligados através de um oligopeptídeo flexível.
[0063] As vantagens de usar fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos inteiros, são várias. O menor tamanho dos fragmentos pode conduzir a propriedades farmacológicas melhoradas, tais como uma melhor penetração do tecido sólido. Funções efetoras de anticorpos inteiros, tal como ligação de complemento, são removidas. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser, todos, expressados em e secretados a partir de E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades dos referidos fragmentos.
[0064] Anticorpos inteiros, e fragmentos F(ab')2 são “bivalentes”. Por “bivalente” significa-se que os referidos anticorpos e fragmentos F(ab')2 tem dois sítios de combinação de antígenos. Em contraste, fragmentos Fab, Fv, ScFv e dAb são monovalentes, tendo apenas um sítio de combinação de antígeno.
[0065] Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Anticorpos monoclonais apropriados podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo, as divulgadas em “Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H Zola (CRC Press, 1988) e em “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications”, J G R Hurrell (CRC Press, 1982), ambas são aqui incorporadas por referência.
[0066] Quando moléculas de ligação potenciais são selecionadas a partir de bibliotecas, um ou mais peptídeos seletores tendo motivos definidos são geralmente empregados. Resíduos de aminoácidos que fornecem estrutura, reduzindo a flexibilidade no peptídeo, ou cadeias laterais polares ou hidrofóbicas, carregadas, permitindo a interação com a molécula de ligação podem ser usados na criação de motivos para peptídeos seletores. Por exemplo:
[0067] Prolina pode estabilizar uma estrutura do peptídeo como sua cadeia lateral está ligada tanto ao carbono alfa, como ao nitrogênio;
[0068] Fenilalanina, tirosina e triptofano têm cadeias laterais aromáticas e são altamente hidrofóbicos, enquanto que leucina e isoleucina têm cadeias laterais alifáticas e são também hidrofóbicas;
[0069] Lisina, arginina e histidina têm cadeias laterais básicas e serão carregadas positivamente a pH neutro, enquanto que aspartato e glutamato tem cadeias laterais ácidas e serão carregados negativamente em pH neutro;
[0070] Asparagina e glutamina são neutras no pH neutro mas contêm grupo amida que pode participar em ligações de hidrogênio;
[0071] As cadeias laterais de serina, treonina e tirosina contêm grupos hidroxila, que podem participar nas ligações de hidrogênio.
[0072] Tipicamente, seleção de moléculas de ligação pode envolver o uso de tecnologias e sistemas de arranjo para analisar a ligação a pontos correspondendo aos tipos de moléculas de ligação.
[0073] A uma ou mais porções de ligação a proteína pode compreender uma porção detectável. A porção detectável pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de uma porção fluorescente, uma porção luminescente, uma porção quimioluminescente, uma porção radioativa e uma porção enzimática.
[0074] Em outra forma de realização dos métodos da invenção, etapa (b) pode ser realizada usando um teste compreendendo um segundo agente de ligação capaz de ligar a uma ou mais proteínas, o segundo agente de ligação também compreendendo uma porção detectável. Segundos agentes de ligação apropriados são descritos em detalhes acima em relação aos primeiros agentes de ligação.
[0075] Assim, as proteínas de interesse na amostra a ser testada podem ser primeiro isoladas e/ou imobilizadas usando o primeiro agente de ligação, após o que a presença e/ou quantidade relativa de referidos biomarcadores podem ser determinados usando um segundo agente de ligação.
[0076] Em uma forma de realização, o segundo agente de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; tipicamente um anticorpo recombinante ou fragmento do mesmo. Convenientemente, o anticorpo ou fragmento do mesmo é selecionado dentre o grupo consistindo de: scFv; Fab; um domínio de ligação de uma molécula de imunoglobulina. Anticorpos e fragmentos apropriados, e métodos para fazer os mesmos, são descritos em detalhes acima.
[0077] Alternativamente, o segundo agente de ligação pode ser um agente de ligação de tipo anticorpo, tal como um affybody ou aptâmero.
[0078] Alternativamente, onde a porção detectável na proteína na amostra a ser testada compreende ou consiste de um membro de um par de ligação específico (por exemplo, biotina), o segundo agente de ligação pode compreender ou consistir do membro complementar do par de ligação específico (por exemplo, estreptavidina).
[0079] Quando é usado um teste de detecção, é preferido que a porção detectável seja selecionada dentre o grupo consistindo de: uma porção fluorescente; uma porção luminescente; uma porção quimioluminescente; uma porção radioativa; uma porção enzimática. Exemplos de porções detectáveis apropriadas para uso nos métodos da invenção são descritos acima.
[0080] Testes preferidos para detectar proteínas no soro ou plasma incluem testes imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoteste (RIA), testes imunorradiométricos (IRMA) e testes imunoenzimáticos (IEMA), incluindo testes de sanduíche usando anticorpos monoclonais e/ou policlonais. Testes exemplares de sanduíche são descritos por David et al nas Patentes US Nos. 4.376.110 e 4.486.530, aqui incorporadas por referência. A coloração de anticorpo de células em lâminas pode ser usada em métodos bem conhecidos em testes diagnósticos laboratoriais de citologia, como bem conhecidos dos versados na arte.
[0081] Portanto, em uma forma de realização o teste é um ELISA (teste de imunossorvente ligado a enzima) que tipicamente envolve o uso de enzimas, que dão um produto de reação colorida, geralmente em testes de fase sólida. Enzimas tal como peroxidase de raiz forte e fosfatase têm sido amplamente empregadas. Um modo de amplificar a reação de fosfatase é usar NADP como um substrato para gerar NAD que agora atua como uma co-enzima para um segundo sistema de enzima. Pirofosfatase de Escherichia coli fornece um bom conjugado porque a enzima não está presente nos tecidos, é estável e dá uma boa cor de reação. Sistemas quimioluminescentes baseados em enzimas tal como luciferase também podem ser usados.
[0082] Conjugação com a vitamina biotina é frequentemente usada uma vez que esta pode ser facilmente detectada pela sua reação com avidina ou estreptavidina ligada a enzima, à qual ela se liga com grande especificidade e afinidade.
[0083] Em uma forma de realização alternativa, o teste usado para detectar proteína é convenientemente um teste fluorométrico. Assim, a porção detectável do segundo agente de ligação pode ser uma porção fluorescente, tal como um fluoróforo Alexa (por exemplo, Alexa-647).
[0084] Preferivelmente, etapa (b) é realizada usando um arranjo. O arranjo pode ser um arranjo com base em contas ou um arranjo com base em superfície. O arranjo pode ser selecionado dentre o grupo consistindo de: macroarranjo; microarranjo; nanoarranjo.
[0085] Em forma de realização, o método é para identificar agentes capazes de induzir uma resposta de hipersensibilidade em pele humana. Preferivelmente, a resposta de hipersensibilidade é uma resposta de hipersensibilidade mediada por célula, por exemplo, uma resposta de hipersensibilidade de tipo IV. Preferivelmente, o método é para identificar agentes capazes de induzir dermatite de contato alérgico (ACD) (isto é, a resposta de hipersensibilidade é ACD).
[0086] Em uma forma de realização, a população de células dendríticas ou população de células de tipo dendrítico é uma população de células dendríticas. Preferivelmente, as células dendríticas são células dendríticas primárias. Preferivelmente, as células dendríticas são células dendríticas mielóides.
[0087] A população de células dendríticas ou células de tipo dendrítico é preferencialmente de origem de mamífero. Preferivelmente, o mamífero é um rato, camundongo, porquinho da índia, gato, cachorro, cavalo ou um primata. Mais preferencialmente, o mamífero é humano.
[0088] Em uma forma de realização a população de células dendríticas ou população de células de tipo dendrítico é uma população de células de tipo dendrítico, preferivelmente células de tipo dendrítico mielóides.
[0089] Em uma forma de realização, as células de tipo dendrítico expressam pelo menos um dos marcadores selecionados dentre o grupo consistindo de CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 e CD1a, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos marcadores. Em outra forma de realização, as células de tipo dendrítico expressam os marcadores CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 e CD1a.
[0090] Em outra forma de realização, as células de tipo dendrítico podem ser derivadas de células dendríticas mielóides. Preferivelmente as células de tipo dendrítico são células derivadas de leucemia mielóide. Preferivelmente, as células derivadas de leucemia mieloide são selecionadas dentre o grupo consistindo de KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 e MUTZ-3. Mais preferencialmente, as células de tipo dendrítico são células MUTZ-3. Células MUTZ- 3 são células de leucemia mielomonocítica aguda humana que foram depositadas junto ao Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Inhoffenstraβe 7B, Braunschweig, Alemanha) em 15 de maio de 1995 (www.dsmz.de; número de depósito ACC 295).
[0091] Em uma forma de realização, as células de tipo dendrítico, após estimulação com citocina, apresentam antígenos através CD1d, MHC de classe I e II e/ou induzem a proliferação de células T específicas.
[0092] Em uma forma de realização, o(s) agente(s) de controle negativo(s) é/são selecionado(s) dentre o grupo consistindo de 1-butanol, ácido 4-aminobenzóico, benzaldeído, clorobenzeno, ftalato de dietila, dimetil formamida, etil vanilina, glicerol, isopropanol, ácido láctico, salicilato de metila, ácido octanóico, propileno glicol, fenol, ácido p-hidroxibenzóico, permanganato de potássio, ácido salicílico, dodecil sulfato de sódio, Tween 80 e sulfato de zinco.
[0093] O método pode compreender o uso de, pelo menos, 2 agentes de controle negativo (isto é, agentes não sensibilizantes), por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou pelo menos 20 agentes de controle negativos.
[0094] Em outra forma de realização, o(s) agente(s) de controle positivo(s) é/são selecionado(s) dentre o grupo consistindo de 2,4-dinitroclorobenzeno, oxazolona, dicromato de potássio, Kathon CH (MC/MCI), formaldeído, 2-aminofenol, 2-nitro-1,4-fenileno diamina, p-fenileno diamina, aldeído hexilcinâmico, acrilato de 2-hidroxietila, 2-mercaptobenzotiazol, glioxal, cinamaldeído, Isoeugenol, etileno diamina, resorcinol, álcool cinâmico, eugenol, penicilina G ou geraniol.
[0095] O método pode compreender o uso de, pelo menos, 2 controles positivos (isto é, agentes sensibilizantes) são fornecidos, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou pelo menos 20 agentes de controle positivos.
[0096] Em uma forma de realização, o método é indicativo de se o agente de teste é ou não um agente sensibilizante. Uma forma de realização alternativa ou adicional, o método é indicativo da potência sensibilizante da amostra a ser testada.
[0097] Em uma forma de realização o método é indicativo da classificação do teste de linfonodo local (LLNA) da potência sensibilizante da amostra a ser testada. Para uma descrição detalhada do LLNA ver Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8 que é aqui incorporado por referência.
[0098] Em uma forma de realização alternativa, o método é indicativo do teste de classificação de maximização do porquinho da índia da potência sensibilizante da amostra a ser testada. Para uma descrição detalhada do teste de maximização do porquinho da índia ver Magnusson, B. E A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76, que é aqui incorporado por referência.
[0099] Portanto, em uma forma de realização, o método é indicativo que o agente de teste é tanto um não sensibilizante, um sensibilizante fraco, um sensibilizante moderado, um sensibilizante forte ou um sensibilizante extremo. O valor de decisão e distância em PCA se correlaciona com a potência de sensibilizante. a. Geralmente, agentes sensibilizantes de pele são determinados com um ROC AUC de, pelo menos, 0.55, por exemplo, com um ROC AUC de pelo menos, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99 ou com um ROC AUC de 1,00. Preferivelmente, agentes sensibilizantes de pele são determinados com um ROC AUC de, pelo menos, 0,85, e mais preferencialmente com um ROC AUC de 1.
[0100] Tipicamente, agentes capazes de induzir a sensibilização são identificados usando a máquina de vetor de suporte (SVM), tal como disponível em http://cran.r- project.org/web/packages/e1071/index.html (por exemplo, e1071 1,5-24). No entanto, quaisquer outros meios apropriados podem também ser usados.
[0101] Máquinas de vetor de suporte (SVMs) é um conjunto de métodos de aprendizagem supervisionada relacionada usados para classificação e regressão. Dado um conjunto de exemplos de treinamento, cada marcado como pertencendo a uma de duas categorias, um algoritmo SVM de treinamento SVM constrói um modelo que prevê se um novo exemplo pertence a uma ou outra categoria. Intuitivamente, um modelo SVM é uma representação dos exemplos como pontos no espaço, mapeados de modo que os exemplos das categorias separadas são divididos por um intervalo evidente que é tão amplo quanto possível. Novos exemplos são então mapeados para o mesmo espaço e previstos para pertencer a uma categoria com base em que lado do intervalo eles se encontram.
[0102] Mais formalmente, a máquina de vetor de suporte constrói um hiperplano ou conjunto de hiperplanos em um espaço dimensional alto ou infinito, que pode ser usado para tarefas de classificação, regressão ou outras. Intuitivamente, uma boa separação é conseguida através do hiperplano que tem a maior distância para os pontos de dados de treinamento mais próximos de qualquer classe (assim chamada margem funcional), uma vez que, em geral, quanto maior for a margem, menor será o erro de generalização do classificador. Para mais informação do SVMs, ver, por exemplo, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2 :121-167.
[0103] Em uma forma de realização da invenção, o SVM é “treinado” antes de executar os métodos da invenção usando perfis de biomarcadores de agentes conhecidos (notadamente, agentes sensibilizantes ou agente não sensibilizantes conhecidos). Executando estas amostras de treinamento, o SVM é capaz de aprender que perfis de biomarcadores estão associados com agentes capazes de induzir sensibilização. Uma vez que o processo de treinamento está completo, o SVM é então capaz de dar se ou não a amostra do biomarcador testada é de um agente sensibilizante ou um agente não- sensibilizante.
[0104] Isso permite que os agentes de teste sejam classificados como sensibilizante e não sensibilizante. Além disso, por treinamento o SVM com agentes sensibilizantes de potência conhecida (isto é, agentes não-sensibilizante, agentes sensibilizantes fraco, moderado, forte ou extremo), a potência dos agentes de teste também pode ser identificada comparativamente.
[0105] Contudo, este procedimento de treinamento pode ser contornado através da pré-programação do SVM com os parâmetros de treinamento necessários. Por exemplo, agentes capazes de induzir sensibilização são identificados de acordo com os parâmetros SVM conhecidos usando o algoritmo SVM detalhado na Tabela 5, baseado na medição de todos os biomarcadores listados na Tabela 3(A) e 1(B).
[0106] Será apreciado por versados que parâmetros SVM apropriados podem ser determinados por qualquer combinação dos biomarcadores listados na Tabela 3 por treinamento de uma máquina SVM com a seleção apropriada de dados (isto é, medições de biomarcador a partir de células expostas aos agentes sensibilizantes e/ou agentes não sensibilizantes conhecidos).
[0107] Preferivelmente, o método da invenção tem uma precisão de, pelo menos, 73%, por exemplo, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% precisão.
[0108] Preferivelmente, o método da invenção tem uma sensibilidade de, pelo menos, 73%, por exemplo, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% sensibilidade.
[0109] Preferivelmente, o método da invenção tem uma especificidade de, pelo menos, 68%, por exemplo, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% especificidade.
[0110] Por “precisão” significa-se a proporção de resultados corretos de um método, por “sensibilidade” significa-se a proporção de todos os produtos químicos positivos que são corretamente classificados como positivos, e por “especificidade” significa-se a proporção de todos os produtos químicos negativos que são corretamente classificados como negativos.
[0111] O segundo aspecto da invenção fornece um arranjo para uso no método do primeiro aspecto da invenção (ou qualquer forma de realização ou combinação das formas de realização da mesma), o arranjo compreendendo uma ou mais porções de ligação como definidas acima. Em uma forma de realização, as porções de ligação são (coletivamente) capazes de se ligar a todos os biomarcadores definidos na Tabela 3A. Em outra forma de realização, as porções de ligação são (coletivamente) capazes de se ligar a todos os biomarcadores definidos na Tabela 3B. Preferivelmente, as porções de ligação são (coletivamente) capazes de se ligar a todos os biomarcadores definidos na Tabela 3A e Tabela 3B.
[0112] As porções de ligação podem ser imobilizadas.
[0113] Arranjos per se são bem conhecidos na arte. Tipicamente eles são formados de uma estrutura linear ou bidimensional tendo regiões afastadas (isto é, discretas) (“pontos”), cada tendo uma área finita, formada sobre a superfície de um suporte sólido. Um arranjo também pode ser uma estrutura de conta em que cada conta pode ser identificada por um código molecular ou código de cores ou identificada em um fluxo contínuo. Análises também podem ser realizadas sequencialmente, onde a amostra é passada sobre uma série de pontos, cada adsorvendo a classe de moléculas a partir da solução. O suporte sólido é tipicamente vidro ou um polímero, os polímeros mais comumente usados sendo celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Os suportes sólidos podem estar sob a forma de tubos, contas , discos, chips de silício, microplacas, membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF), membrana de nitrocelulose, membrana de náilon, outras membranas porosas, membrana não porosa (por exemplo plástico, polímero, perspex, silicone, entre outros), uma pluralidade de pinos poliméricos ou uma pluralidade de cavidades de microtitulação, ou qualquer outra superfície apropriada para imobilização de proteínas, polinucleotídeos e outras moléculas apropriadas e/ou conduzindo um imunoteste. Os processos de ligação são bem conhecidos na arte e geralmente consistem de reticulação covalentemente ligando ou adsorvendo fisicamente uma molécula de proteína, polinucleotídeo ou semelhantes ao suporte sólido. Alternativamente, copulação por afinidade das sondas via etiquetas de afinidades ou construções semelhantes pode ser empregada. Utilizando técnicas bem conhecidas, tal como impressão de contato ou não contato, mascaramento ou fotolitografia, a localização de cada ponto pode ser definida. Para comentários ver Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) e Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9).
[0114] Tipicamente o arranjo é um microarranjo. Por “microarranjo” os requerentes incluem o significado de um arranjo das regiões tendo uma densidade de regiões discretas, pelo menos, cerca de 100/cm2, e preferivelmente pelo menos cerca de 1000/cm2. As regiões de um microarranjo têm dimensões típicas de, por exemplo, diâmetro, na faixa de entre cerca de 10-250 μm, e são separadas de outras regiões de arranjo por cerca da mesma distância. O arranjo pode alternativamente ser um macroarranjo ou um nanoarranjo.
[0115] Uma vez que as moléculas de ligação apropriadas (acima discutidas) foram identificadas e isoladas, o versado na arte pode fabricar um arranjo usando métodos bem conhecidos na arte da biologia molecular; ver Exemplos abaixo.
[0116] Um terceiro aspecto da presente invenção fornece o uso de um ou mais (preferivelmente dois ou mais) biomarcadores selecionado(s) dentre o grupo definido na Tabela 3A e/ou Tabela 3B em combinação para identificar agentes sensibilizantes com resposta de hipersensibilidade. Preferivelmente, todos os biomarcadores definidos na Tabela 3A e Tabela 3B são usados coletivamente para identificar agentes sensibilizantes com resposta de hipersensibilidade. Preferivelmente, o uso é consistente com o método descrito no primeiro aspecto da invenção, e as formas de realização aqui descritas.
[0117] Um quarto aspecto da invenção fornece um kit analítico para uso em um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo ou consistindo de:
[0118] um arranjo de acordo com o segundo aspecto da invenção; e
[0119] instruções para realizar o método de acordo com o primeiro aspecto da invenção (opcional).
[0120] O kit analítico pode compreender um ou mais agentes de controle. Preferivelmente, o kit analítico compreende ou consiste das características acima, junto com um ou mais agentes de controle negativos e/ou um ou mais agentes de controle positivos.
[0121] Os exemplos não limitantes preferidos que incorporam certos aspectos da invenção serão agora descritos, com referência às seguintes figuras: Figura 1. Fenótipo de células MUTZ-3 antes da estimulação com produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes
[0122] Níveis de expressão na superfície celular de CD14, CD1a, CD34, CD54, CD80, CD86 e HLA-DR foram avaliados com citometria de fluxo. Portas foram configuradas para excluir detritos e células mortas, e quadrantes foram estabelecidos por meio da comparação com controles de isotipo relevantes. Resultados são apresentados de um experimento representativo dentre seis. Figura 2. Mudanças na expressão de CD86 após estimulação com produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes
[0123] Os níveis de expressão na superfície celular de CD86 foram monitorados após estimulação com produtos químicos durante 24 h. A). Regulação positiva induzida por produto químico de CD86, em termos de mudanças na frequência de células positivas, foi determinada por citometria de fluxo, como exemplificado pela comparação de células estimuladas com 2-aminofenol (gráfico de pontos à direita) e controles não estimulados (gráfico de pontos à esquerda). Resultados são mostrados a partir de uma experiência representativa dentre três. Portas foram configuradas para excluir detritos e células mortas, e quadrantes foram estabelecidos por meio da comparação com controles de isotipo relevantes. B) Compilação de frequências de células positivas para CD86 após 24 h de estimulação. Análise estatística foi realizada usando Teste t de Student pareado. *p < 0,0 5, # p < 0,0 1. NA, não analisado. Figura 3. Análise de componentes principais de transcritos diferencialmente expressados após a estimulação química
[0124] Níveis de mRNA em células Mutz-3 estimuladas por 24 h com 20 produtos químicos sensibilizantes e 20 não sensibilizantes foram avaliados com transcritomics usando arranjos Affymetrix Human Gene 1.0 ST. Estruturas e similaridades no conjunto de dados de expressão de genes foram investigadas usando análise de componentes principais (PCA) no software Qlucore. A) PCA de genes diferencialmente expressados em células estimuladas com produtos químicos sensibilizantes (vermelho) como comparado a não sensibilizantes (verde) (1010 genes identificados com ‘one-way ANOVA’). B) PCA de genes diferencialmente expressados em células estimuladas com produtos químicos sensibilizantes como comparados a não sensibilizantes (1010 genes), mas agora amostras são coloridas pelo composto usado para a estimulação. C) PCA de genes diferencialmente expressados quando comparando com diferentes estimulações ‘2-way ANOVA’ (1137 genes). Amostras são coloridas de acordo com produtos químicos sensibilizantes (vermelho) e não-sensibilizantes (verde). D) PCA de genes diferencialmente expressados quando comparando com diferentes estimulações ‘2-way ANOVA’ (1137 genes), mas agora amostras são coloridas pelo composto usado para a estimulação. P, p-valor de ANOVA. Q, p-valor corrigido para o teste de hipóteses múltiplas. Figura 4. Identificação e análise PCA de “assinatura de previsão”
[0125] O número de genes significativos expressados diferencialmente em células estimuladas com produtos químicos sensibilizantes como comparado com não sensibilizantes (1010 genes) foi reduzido usando eliminação regressiva. O menor KLD é observado após eliminação de 810 análitos, referidos como o ponto de ruptura. Os restantes 200 genes são considerados como sendo os melhores previsores do conjunto de dados, sendo denominado “Assinatura de previsão”. B) Completa separação entre sensibilizantes (vermelho) e não sensibilizantes (verde) é observada com PCA da “Assinatura de previsão”. C) Mesmo PCA como em B, agora com amostras coloridas de acordo a sua potência em LLNA. Figura 5. Validação de procedimento de seleção “Assinatura de previsão”
[0126] O método através da qual a “Assinatura de previsão” foi calculada foi validado pela repetição do processo sobre 70% do conjunto de dados, selecionados aleatoriamente. Os restantes 30% de dados foram usados como um conjunto de teste para a validação da assinatura. A) PCA demonstra que a “Assinatura de gene de teste” pode separar sensibilizantes de não sensibilizantes. Apenas as amostras do conjunto de treinamento 70%, exibidas em cores brilhantes, foram usadas para construir o espaço dos três primeiros componentes principais. As amostras do conjunto de teste, exibidas em cores escuras, foram traçadas em gráfico neste espaço com base em níveis de expressão dos análitos no “Assinatura de gene de teste”. B) Um SVM foi treinado no conjunto de treinamento 70%, e validado com o conjunto de teste 30%. A área sob a curva ROC de 1,0 revela que o grupo pertencendo a todas as amostras no conjunto de teste foi previsto corretamente, demonstrando a força da “Assinatura de gene de teste”, e por associação também a força da “Assinatura de previsão” dos requerentes. Figura 6. O ‘interactoma’ da “Assinatura de previsão”
[0127] ‘Interactoma’ das moléculas 200 (laranja) e moléculas conectando as mesmas de acordo a evidência de IPA. Interações diretas são mostradas como linhas cheias e indiretas como linhas pontilhadas. EXEMPLOS
[0128] Dermatite de contato alérgica é uma doença inflamatória da pele que afeta uma proporção significativa da população. Esta é comumente causada por respostas imunológicas para haptenos químicos levando a substancial carga econômica para a sociedade. Teste correntes sobre produtos químicos sensibilizantes se baseiam em experimentação animal. Nova legislação sobre o registro e uso de produtos químicos em, por exemplo, indústrias farmacêuticas e de cosméticos, têm estimulado esforços significativos de pesquisa para desenvolver testes baseados em células humanas alternativas para a previsão de sensibilização. O objetivo é substituir experiências com animais por testes in vitro exibindo um maior poder de previsão.
[0129] Os requerentes desenvolveram um teste novo baseado em células para a previsão de produtos químicos sensibilizantes. Através da análise do transcriptoma da linhagem celular humana MUTZ-3 após 24 h de estimulação com 20 diferentes produtos químicos sensibilizantes, 20 produtos químicos não sensibilizantes e controles de veículos, os requerentes identificaram uma assinatura de biomarcador de 200 genes com potente capacidade discriminatória. Usando a máquina de vetor de suporte para classificação supervisionada, o desempenho de previsão do teste revelou uma precisão de 100%, sensibilidade de 100% e especificidade de 100%. Além disso, categorizando os produtos químicos de acordo o teste LLNA, esta assinatura de gene também poderia prever potência. Os marcadores identificados são envolvidos em vias biológicas com funções imunológicas relevantes, que podem lançar luz sobre o processo de sensibilização humana.
[0130] A assinatura de gene prevendo sensibilização usando uma linhagem celular humana in vitro foi desenvolvida. Este teste simples e robusto à base de células pode substituir completamente ou reduzir drasticamente os sistemas de teste atuais, usando animais experimentais. Sendo baseado em biologia humana, o teste é considerado mais relevante e mais preciso para prever sensibilização em seres humanos do que os testes tradicionais baseados em animais. Resultados a. O racional celular do sistema de cultura de células in vitro
[0131] Atuando como a ligação entre a imunidade inata e adaptativa, DCs são células imunorregulatórias essenciais do sistema imune. Sua propriedade única de reconhecer antígeno com o objetivo de iniciar resposta de células T, e a sua função regulatório potente em se desviar das respostas imunes, torna os mesmos alvos para o desenvolvimento de teste. Contudo, DCs primários constituem uma população heterogênea e menor de células não apropriadas para triagem. As vantagens óbvias de usar uma linhagem celular com características comparadas com as de DCs primários para a base de um teste de previsão são estabilidade, reprodutibilidade dos resultados e suprimento não limitado de células. Até agora, nenhuma leucemia com propriedades de tipo DC óbvias foi avaliada, provavelmente devido ao fato de que as características deste tipo de célula são determinadas por um processo de diferenciação terminal complexo que pode ocorrer apenas após a divisão celular [11], e, portanto, a geração de linhagens celulares de tipo DC depende de linhagens de células de leucemia mieloide disponíveis. MUTZ- 3 é uma linhagem de células de leucemia mielomonocítica aguda humana com uma potente capacidade de se diferenciar em DCs, apresentam antígenos e induzem a proliferação de células T específicas. Entre as linhagens de células mielóides humanas disponíveis, MUTZ-3 é, de longe, o candidato preferido. Semelhante a DCs primários imaturos , progenitor de MUTZ-3 expressa CD1a, HLA-DR e CD54, bem como níveis baixos de CD80 e CD86 (Figura 1). A população de MUTZ-3 também contém três subpopulações de CD14+, CD34+ e células duplas negativas, previamente relatadas para sendo etapas de diferenciação de transição de um progenitor de CD34+ proliferativo em um precursor de DC CD14+ não proliferativo [9]. Consequentemente, os requerentes utilizaram células MUTZ-3 progenitoras constitutivamente diferenciadas como a base para o sistema de teste.
[0132] Expressão de superfície de CD86 em resposta à estimulação sensibilizante: CD86 é o biomarcador mais extensivamente estudado para sensibilização até a presente data, em sistemas de células tal como células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) ou linhagens de células humanas de tipo de células dendríticas, e suas progenitoras, tal como THP-1, U-937 e KG-1. Portanto, como uma referência, expressão em superfície celular de CD86 foi medida com citometria de fluxo após 24h de estimulação com 20 sensibilizantes e 20 não sensibilizantes, assim como com controles de veículos (Tabela 1). CD86 foi regulado de modo positivo significativamente em células estimuladas com 2- aminofenol, Kathon CG, 2-nitro-1,4-fenileno diamina, 2,4- dinitroclorobenzeno, acrilato de 2-hidroxietila, aldeído cinâmico, p-fenileno diamina, resorcinol, e 2- mercaptobenzotiazol. Assim, um teste baseado na medição de um único biomarcador, tal como CD86, daria uma sensibilidade de 47% e uma especificidade de 100%. Consequentemente, CD86 não pode classificar sensibilizantes de pele, usando um sistema baseado em células tal como MUTZ-3.
[0133] Análise dos perfis transcripcionais em células MUTZ-3 quimicamente estimuladas: Os arranjos de expressão genômica foram usados para testar 20 sensibilizantes e 20 não sensibilizantes, em triplicata, e controles de veículo, como DMSO e água destilada, este último em doze réplicas. No total, um conjunto de dados foi gerado com base em 144 amostras. A normalização de RMA e controles de qualidade das amostras revelaram que as amostras de oxazolona e aldeído cinâmico foram atípicas significantes e precisaram ser removidas, ou eles teriam dominado o conjunto de dados proibindo a identificação de biomarcadores (dados não mostrados). Além disso, uma das réplicas do permanganato de potássio precisou ser removida devido a um arranjo com falha. Isso deixou um conjunto de dados consistindo de 137 amostras, cada uma com os dados de medições de 33.297 transcriptos. A fim de minerar o conjunto de dados para obter informações específicas para sensibilizantes versus não sensibilizantes, o software Qlucore Omics Explorer 2.1 foi usado, que permite análise em tempo real de componentes principais, análise (PCA), enquanto classificando os genes de entrada após critérios desejados, por exemplo, sensibilizantes e não sensibilizantes, com base em seleção de valor p de ANOVA. Figuras 3A e 3B mostram PCAs com base em 1010 transcriptos com um valor-p de < 2,0 x 10—6 a partir da análise ANOVA, comparando produtos químicos sensibilizantes versus não sensibilizantes. Como pode ser visto na figura 3A, pode ser feita uma distinção clara entre os dois grupos, com não sensibilizantes formando uma nuvem condensada na parte inferior da figura (verde), enquanto sensibilizantes se estendem para cima em várias direções (vermelho). No entanto, uma separação completa não é obtida entre os dois grupos neste nível de significância. A partir da figura 3B, agora colorida de acordo com a estimulação, é evidente que uma ou mais réplicas de grupo glioxal, eugenol, aldeído hexilcinâmico, isoeugenol, resorcinol, penicilina G e etileno diamina em conjunto com o grupo de controle. Além disso, uma réplica ou mais dos não sensibilizantes Tween 80, ácido octanóico e fenol tendem a se agrupar com os sensibilizantes. Figuras 3C e 3D mostram gráficos de PCA com base em 1137 genes que têm, todos, um valor p de < 7,0 x 10-21, quando comparando os diferentes estímulos. Identificar este grande número de genes neste nível de significância fornece fortes indicações da força do conjunto de dados. Na figura 3D, é evidente que as réplicas se agrupam juntas, indicando dados de alta qualidade. As amostras em triplicata de dicromato de potássio tem um perfil discreto, que demonstra um impacto substancial das células comparadas com não sensibilizantes. Além disso, acrilato de 2-hidroxietila, 2- aminofenol, Kathon CG, formaldeído, 2-nitro-1,4-fenileno diamina, ácido 2,4-dinitroclorobenzóico, p-fenileno diamina, 2-mercaptobenzotiazol, álcool cinâmico e resorcinol tem réplicas que se agrupam juntas, separadas do grupo negativo. Ainda, como pode ser visto na figura 3C bem como em 3A, uma separação completa não é obtida com nenhuma das assinaturas de genes de 1010 e 1137 genes, respectivamente.
[0134] Eliminação regressiva identifica genes com o maior poder discriminatório: Apesar do conjunto de dados conter genes com valores p de até 1 x 10-17, diminuindo o corte do valor p não alcança uma completa separação entre sensibilizantes e não sensibilizantes. Assinaturas de genes inteiramente selecionados em valores os não fornecem o melhor poder previsor, uma vez que um baixo valor p não é nenhuma garantia de que um gene fornece uma informação adicional. Para ainda reduzir o número de transcriptos para uma assinatura de biomarcador previsora, os requerentes empregaram um algoritmo para eliminação regressiva (Figura 4A). O algoritmo remove genes um por um, levando em conta não apenas o impacto de genes individualmente, mas como eles realizam coletivamente com a assinatura de gene completa selecionada. Para cada gene eliminado, o valor de divergência de Kullback-Leibler (KLD) é diminuído, até um ponto de ruptura ser atingido, em cujo ponto os 200 genes permaneceram. Continuando eliminando genes neste ponto leva o KLD a subir novamente, indicando que a informação está sendo perdida (Figura 4A). Portanto, os 200 genes com menor valor KLD foram selecionados para outras análises. PCA dos 200 análitos revelou que eles têm a capacidade para separar completamente sensibilizantes versus não sensibilizantes, indicando que estas transcriptos podem ser usados como previsores para propriedades sensibilizantes de amostras desconhecidas (Figura 4B). De modo importante, colorindo as amostras no PCA por sua potência, de acordo com LLNA, é evidente que essa potência pode ser prevista por estes genes, também (Figura 4C). Os 200 genes são denominados “Assinatura de previsão” e a sua identidade é listada na Tabela 3.
[0135] Validação dos métodos de análise usados para identificar a assinatura de previsão: Para validar o poder previsor da assinatura dos requerentes, foi usado um método de aprendizagem supervisionada chamado máquina de vetor de suporte (Support Vector Machine - SVM) [12], que mapeia os dados a partir de um conjunto de treinamento em espaço, a fim de maximizar a separação da expressão de genes induzida por produtos químicos sensibilizantes e não-sensibilizantes. Como conjunto de treinamento, 70% do conjunto de dados foram selecionados aleatoriamente e todo o processo de seleção (como descrito acima) foi repetido. Começando com 29.141 transcriptos, a assinatura foi reduzida a 200 transcriptos, denominado “Assinatura de gene de teste”, usando filtro ANOVA e eliminação regressiva. Os restantes 30% do conjunto de dados foram usados para testar a assinatura obtida. A divisão do conjunto de dados em subconjuntos de 70% conjunto de dados de treinamento e 30% conjunto de dados de teste foi feita de uma maneira aleatória estratificada, significando que a proporção dos sensibilizantes e não sensibilizantes no conjunto de dados completo é mantida em ambos os subconjuntos, embora as amostras incluídas em qualquer um dos dois subconjuntos são selecionados aleatoriamente. A seguir, a “Assinatura de gene de teste” foi usada para treinar um modelo SVM com o conjunto de treinamento, e o poder previsor do modelo foi avaliado com o conjunto de teste. Figura 5A mostra um gráfico PCA com base na “Assinatura de gene de teste” e as amostras do conjunto de teste. Claramente, a separação entre sensibilizantes (vermelho) e não sensibilizantes (verde) assemelha-se ao observado para a “Assinatura de previsão” na figura 4B. No PCA de Figura 5A, as amostras dos produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes do conjunto de teste foram coloridas de vermelho escuro e verde escuro respectivamente, indicando que elas não são contribuindo para os componentes principais do gráfico, mas, são apenas traçadas em gráfico com base em seus valores de expressão da selecionada “Assinatura de gene de teste”. Como pode ser visto, sensibilizantes do conjunto de grupo de teste com sensibilizantes do conjunto de treinamento, enquanto não sensibilizantes do conjunto de grupo de teste com não sensibilizantes do conjunto de treinamento. Esta é uma forma muito intuitiva de prever o grupo pertencente das amostras no conjunto de teste, usando apenas o reconhecimento de padrão do olho. O resultado do SVM treinamento e validação podem ser vistos na figura 5B, onde uma área sob a curva ROC de 1 confirma a capacidade da “Assinatura de gene de teste” para prever a qual grupo a amostra pertencia no conjunto de teste. O desempenho de previsão do teste revela uma precisão de 96%, sensibilidade de 100% e especificidade de 92%. Enquanto este experimento não valida o poder de previsão da “Assinatura de previsão” per se, ele realmente valida o método pelo qual foi selecionado, apoiando a reivindicação de que a “Assinatura de previsão” é capaz de prever com precisão propriedades sensibilizantes de amostras desconhecidas.
[0136] Funções moleculares e vias canônicas da “Assinatura de previsão”.
[0137] Usando análise Ingenuity Pathways (IPA, Ingenuity Systems Inc.), 184 das 200 moléculas na assinatura foram caracterizadas com relação às funções e vias conhecidas (canônicas). As restantes 16 moléculas não podem ser mapeadas para quaisquer entradas de IPA. As funções dominantes identificadas eram bioquímica de molécula pequena (38 moléculas), morte celular (33), metabolismo lipídico (24), desenvolvimento do sistema hematológico (19), crescimento e proliferação celular (16), transporte molecular (15), ciclo celular (15) e metabolismo dos carboidratos (15), ver tabela 4 para detalhes. 67 das 184 moléculas foram envolvidas nas funções listadas. Das restantes 117 moléculas, 30 são conhecidas a partir de uma variedade de doenças humanas e funções moleculares, tal como biomarcadores descritos (SCARB2, RFC2, VPS37A e BCL7A) e alvos de fármacos (ABAT). A maioria dessas moléculas são marcadores metabólicos. Na assinatura como um todo, existem vários alvos de fármacos, tal como HMGCR, HMOX1, ABAT, RXRA, CD33, MAP2K1, MAPK13 e CD86. Duas são descritas para distúrbios da pele: CD86 (psoríase) e RXRA (eczema). A assinatura contém também marcadores de desenvolvimento da pele (DHCR24) e de células dendríticas (MAP2K1, NLRP12 e RFC2).
[0138] As vias possivelmente invocadas pelas moléculas na assinatura também foram investigadas usando IPA. As mais populosas foram resposta oxidativa mediada por NRF2 (10), sinalização do metabolismo xenobiótico (8), inibição mediada por LPS/IL-1 de função RXR (6), sinalização do receptor aril hidrocarboneto (6) e sinalização de proteína quinase A (6). As cinco melhores classificações destas vias são todas conhecidas por participar de reações provocadas por substâncias estranhas, xenobióticas. Xenobióticos são compostos químicos naturais ou sintéticos, estranhos ao corpo humano. Conclusões
[0139] Dermatite de contato alérgica (ACD) é uma doença inflamatória da pele causada por respostas imunes adaptativas aos alergênicos [13]. Produtos químicos de peso molecular pequeno, chamados haptenos, podem ligar auto- proteínas na pele, o que permite a internalização do produto químico alergênico ligado à proteína por células dendríticas da pele (DC). DCs, sob a influência do microambiente local, processam o complexo proteína-hapteno, migram para os linfonodos locais e ativam as células T nativas. O início e desenvolvimento de respostas específicas aos alergênicos, principalmente células CD8+ efetoras T e células Th1, e produção de proteínas imunomoduladoras, são características da ativação imune observada em ACD. Esta reação de hipersensibilidade de tipo IV mediada por célula T é caracterizada por sintomas tal como erupção cutânea, bolhas e prurido. ACD é a manifestação mais comum de imunotoxicidade observada em humanos [13] e centenas de produtos químicos demonstraram causar sensibilização na pele [14]. Os fatores determinantes e mecanismos moleculares envolvidos em sensibilização são ainda desconhecidos apesar de intensos esforços de pesquisa terem sido efetuados para identificar as respostas imunológicas para produtos químicos alergênicos. A legislação REACH requer que todos os produtos químicos produzidos com mais de 1 tonelada / ano sejam testados para propriedades perigosas, tais como toxicidade e alergenicidade [5], o que aumenta a demanda por testes precisos para um poder previsor. Hoje em dia, a identificação de sensibilizantes humanos em potencial depende de experimentação animal, em particular, o teste de linfonodo local de murinos (LLNA) [6]. O LLNA é baseado em medições de proliferação induzida em drenagem de nódulos linfáticos de camundongos após exposição a produtos químicos [15]. Produtos químicos são definidos como sensibilizantes se eles provocam um aumento de três vezes na proliferação em relação ao controle, e a quantidade de produto químico necessária para o aumento é o valor EC3. Portanto, o LLNA também pode ser usado para categorizar os produtos químicos com base na potência de sensibilização. No entanto, LLNA é, em muitos aspectos, não ótimo. Além das razões éticas óbvias, o teste é também demorado e caro. Dados de sensibilização humana muitas vezes provém de testes de maximização humana (HMT) [16] e testes com adesivos em humanos (HPT). Em um relatório extenso do Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), as características de desempenho do LLNA foram comparadas com outros métodos disponíveis com base em animais e dados de sensibilização humana (HMT e HPT) [17]. O desempenho de LLNA em comparação com os dados humanos (74 avaliações) revelou uma precisão de 72%, uma sensibilidade de 72% e uma especificidade de 67%. Precisão é definida como uma proporção de resultados corretos de um método, sensibilidade é a proporção de todos os produtos químicos positivos que são corretamente classificados como positivos, e especificidade é a proporção de todos os produtos químicos negativos que são corretamente classificados como negativos. Portanto, existe uma clara necessidade de desenvolver métodos de teste mais confiáveis para sensibilização. Adicionalmente, o documento 7th Amendment to the Cosmetics Directive (76/768/EEC) coloca uma proibição total para usar experimentação animal para testar ingredientes cosméticos para 2013 quando um método confiável científico está disponível. Portanto, existe uma grande necessidade na indústria para métodos confiáveis de testes previsores de que são baseados em células humanas. Várias linhagens de células humanas e células primárias envolvidas em sensibilização foram avaliadas como sistema de teste previsor, tal como células epiteliais, células dendríticas e células T, no entanto nenhum ensaio de teste validado está atualmente disponível. Vários biomarcadores únicos foram sugeridos para serem regulados de modo positivo quando da estimulação com produtos químicos sensibilizantes, tal como CD40, CD80, CD54, CXCL8, IL-1 β, MIP-1β, p38 MAPK como revisto em [18], ainda que sejam práticos, nenhum deles tem o poder previsor para discriminar entre produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes. CD86 está entre os marcadores mais extensivamente estudados; contudo, determinar o nível de expressão deste marcador no teste dos requerentes é relevante, mas não suficiente, como leitura para sensibilização (Figura 2). Apenas 9 dentre 19 produtos químicos sensibilizantes induziram uma regulação positiva significativa de CD86. Em vez disso, os requerentes tem a firme crença de que as análises de assinaturas de biomarcadores são superiores a qualquer biomarcador único. Portanto, os requerentes usaram o poder de transcriptomia do genoma completo e triaram a regulação gênica induzida por um grande conjunto de produtos químicos e controles bem definidos. O grande número de genes diferencialmente expressados nas células MUTZ-3 estimuladas com produtos químicos sensibilizantes, como comparado com controles não sensibilizantes, como identificados com ANOVA (Figura 3), revelou que MUTZ-3 tem, de fato, uma capacidade para diferenciar entre estes dois grupos, sendo, portanto, um sistema de células apropriado para testes in vitro para sensibilização. Esforços foram feitos para criar testes baseados na análise do genoma completo em vários sistemas de células, tal como DCs derivados de células progenitoras CD34+ [19-21]. Embora tais testes possam proporcionar ambientes do tipo in vivo, pode-se argumentar que células primárias não são bem apropriadas para um teste deste grande interesse comercial. Além disso, o aspecto ético precisa ser considerado em tal sistema. Além disso, esforços anteriores dentro do desenvolvimento de testes in vitro para sensibilização que dependem da análise do genoma completo têm usado um conjunto muito limitado de compostos para teste. Até agora, este estudo é o maior estudo realizado dentro desta área, utilizando 20 compostos de treinamento positivos e 20 negativos. Esforços têm sido feitos pelos requerentes para dividir estes compostos de treinamento em dois subconjuntos, para treinamento e para teste, respectivamente. Embora estas experiências tenham resultado em previsões de sucesso (dados não mostrados), a experiência dos requerentes mostra que compostos sensibilizante diferem muito em seu perfil de expressão de genes induzida, como pode ser visto na figura 3D. Nesta perspectiva, os requerentes desejam incluir tantos compostos de treinamento quanto possível quando identificando a sua “Assinatura de previsão”. Portanto, os requerentes não excluem quaisquer compostos para validação. Ao contrário, os requerentes validaram o método através do qual a “Assinatura de previsão” foi identificada, subdividindo as amostras em conjuntos de treinamento e de teste aleatoriamente, usando dados não vistos para validação, como visto na figura 5. Incluindo todos os compostos sensibilizantes, com uma faixa ampla de mecanismos reativos bem como potências sensibilizantes, os requerentes argumentam que eles identificaram uma assinatura de previsão que é bem adaptada para a previsão de propriedades sensibilizantes de amostras desconhecidas. Como é importante notar, a “Assinatura de previsão” dos requerentes é capaz de prever a potência dos compostos sensibilizantes, tal como definido por LLNA, como é demonstrado na figura 4C. Contudo, a potência prevista por LLNA e a do classificador dos requerentes não corresponde para todas as amostras. Notavelmente, o sensibilizante moderado acrilato de 2-hidroxietila mostra forte semelhança com os sensibilizantes fortes e extremos com relação ao seu perfil de expressão de genes. Similarmente, os sensibilizantes moderados etileno diamina, aldeído hexilcinâmico, e glioxal se agrupam juntos com sensibilizantes fracos. Estes resultados proporcionam vastas implicações de que a potência sensibilizante, como definida, pode necessitar de revisão. Os requerentes argumentam que sua “Assinatura de previsão” pode ser usada para tais classificações.
[0140] Em conclusão, apresentamos testes in vitro, baseados em um sistema de células MUTZ-3 com uma “Assinatura de previsão” identificada consistindo de 200 genes, que tem a capacidade de classificar corretamente uma amostra como sensibilizante ou não sensibilizante. Além disso, este teste pode prever a potência dos compostos sensibilizantes, e pode ser usado para rever tais classificações.
Materiais e métodos
[0141] Produtos químicos
[0142] Um painel de produtos químicos consistindo de 20 sensibilizantes e 20 não sensibilizantes foi usado para estímulos celulares. Os sensibilizantes foram 2,4- dinitroclorobenzeno, cinamaldeído, resorcinol, oxazolona, glioxal, 2-mercaptobenzotiazol, eugenol, isoeugenol, álcool cinâmico e p-fenileno diamina, formaldeído, etileno diamina, acrilato de 2-hidroxietila, aldeído hexilcinâmico, dicromato de potássio, penicilina G, Katchon CG (MCI/MI), 2- aminofenol, geraniol e 2-nitro-1,4-fenileno diamina (Tabela 1). Os não sensibilizantes foram dodecil sulfato de sódio, ácido salicílico, fenol, glicerol, ácido láctico, clorobenzeno, ácido p-hidrobenzóico, benzaldeído, dietil ftalato e ácido octanóico, sulfato de zinco, ácido 4- aminobenzóico, salicilato de metila, etil vanilina, isopropanol, formamida de dimetila, 1-butanol, permanganato de potássio, propileno glicol e Tween 80 (Tabela 1). Todos os produtos químicos foram de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Compostos foram dissolvidos em ambos dimetilsulfóxido (DMSO) ou água destilada. Antes da estimulação, a citotoxicidade de todos os compostos foi monitorada, usando iodeto de propídio (PI) (BD Biosciences, San Diego, CA) usando protocolo fornecido pelo fabricante. A viabilidade relativa das células estimuladas foi calculada
Figure img0001
[0143] Para compostos tóxicos, a concentração dando 90% de viabilidade relativa (Rv90) foi usada. Para compostos não tóxicos, uma concentração de 500 μM foi usado quando possível. Para compostos não tóxicos que eram insolúveis em 500 μM em meio, a concentração solúvel mais elevada foi usada. Para compostos dissolvidos em DMSO, a concentração em cavidade foi 0,1% DMSO. O veículo e as concentrações usados para cada composto são listados na Tabela 2.
[0144] Exposição a produtos químicos das células
[0145] A linhagem de células derivadas de leucemia mielóide humana MUTZ-3 (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) foi mantida em α-MEM (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT) suplementado com 20% (volume/volume) soro de bovino fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 40 ng/ml rhGM-CSF (Bayer HealthCare Pharmaceuticals, Seattle, WA), como descrito [10]. Antes de cada experimento, as células foram imunofenotipadas usando citometria de fluxo como um controle de qualidade. Células foram semeadas em placas de 6 cavidades a 200.000 células/ml. Soluções de carga de cada composto foram preparadas tanto em DMSO como água destilada, e foram subsequentemente diluídas para as concentrações em cavidades correspondendo ao valor Rv90, e concentrações em cavidades de DMSO foram 0,1%. Células foram incubadas durante 24h a 37°C e 5% CO2. Depois, as células foram coletadas e analisadas com citometria de fluxo. Em paralelo, células coletadas foram lisadas em reagente TRIzol (Invitrogen) e armazenadas a - 20°C até a extração de RNA. As estimulações com produtos químicos foram realizadas em três experiências individuais, de modo que foram obtidas amostras em triplicatas.
[0146] Análise fenotípica com citometria de fluxo
[0147] Toda as etapas de coloração da superfície celular e de lavagem foram realizadas em PBS contendo 1% BSA (p/v). As células foram incubadas com mAbs de camundongo específico por 15 min a 4°C. Os seguintes mAbs foram usados para citometria de fluxo: CD1a FITC-conjugado (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), CD34, CD86, e HLA-DR (BD Biosciences), CD14 PE-conjugado (DakoCytomation), CD54 e CD80 (BD Biosciences). IgG1 camundongo, conjugado a FITC ou PE foram usados como controles de isotipos e PI foi usado para avaliar a viabilidade celular (BD Biosciences). O software FACSDiva foi usado para a aquisição de dados com instrumento FACSCanto II (BD Bioscience). 10.000 eventos foram adquiridos e as portas foram configuradas com base em propriedades de dispersão de luz para excluir detritos e células não viáveis. Outra análise dos dados foi realizada usando FCS Express V3 (De Novo Software, Los Angeles, CA).
[0148] Preparação de cRNA e hibridização de chip de gene
[0149] Isolamento de RNA e hibridização de chip de genes foram realizados como descrito [22]. Em resumo, RNA de células MUTZ-3 não estimuladas e estimuladas com produtos químicos, a partir de experiências em triplicata, foram extraídas e analisadas. A preparação de DNA sentido-marcado foi realizada de acordo com o teste de rotulação de alvo sentido Affymetrix GeneChip Whole Transcript (WT) (100 ng protocolo de rotulação de RNA Total) usando os kits recomendados e controle (Affymetrix, Santa Clara, CA). Hibridação, lavagem e varredura do gene humano 1.0 ST Arranjos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante (Affymetrix).
[0150] Análise de dados de microarranjo e métodos estatísticos
[0151] Os dados de microarranjo foram normalizados e a qualidade verificada com o algoritmo RMA, usando Affymetrix Expression Console (Affymetrix). Genes que foram significativamente regulados quando comparando sensibilizantes com não sensibilizantes foram identificados usando de one-way ANOVA, com taxa de descoberta falsa (FDR) como uma correção para testes de hipóteses múltiplas. A fim de reduzir o elevado número de gene significantes identificados, foi aplicado pelos requerentes um algoritmo desenvolvido na empresa para eliminação regressiva de análitos (Carlsson et al, não publicado). Com esse método, os requerentes treinaram o modelo ‘Support Vector Machine (SVM) [12] com uma validação cruzada tipo “leave one”, com um analito deixado de fora. Este processo é iterado até que cada analito foi deixado de fora uma vez. Para cada iteração, uma divergência Kullback-Leibler (KLD) é registrada, dando N KLDs, onde N é o número de análitos. O análito que foi deixada de fora quando o menor KLD foi observado é considerado como fornecendo o mínimo de informação no conjunto de dados. Portanto, este análito é eliminado e as interações prosseguem, desta vez com análitos N-1. Desta maneira, os analitos são eliminados um a um até que um painel de marcadores permaneça que foram selecionados com base na capacidade de cada analito para discriminar entre sensibilizantes e não sensibilizantes. O roteiro de eliminações regressivas foi programado para R [23], com o pacote adicional e1071 [24]. As análises ANOVA e visualização dos resultados foram realizadas em Qlucore Omics Explorer 2.1 (Qlucore, Lund, Suécia). O perfil de biomarcadores selecionados de 200 transcriptos foi designado “Assinatura de previsão”.
[0152] Validação do método para a identificação da “Assinatura de previsão”
[0153] Na ausência de um conjunto de dados de teste externo, o conjunto de dados foi dividido em um conjunto de treinamento de 70% e um conjunto de teste de 30% das amostras. A divisão foi realizada aleatoriamente, enquanto mantendo as proporções dos sensibilizantes e não sensibilizantes em cada subconjunto na mesma proporção como no conjunto de dados completo. Uma assinatura de biomarcador foi identificada no conjunto de treinamento usando filtro ANOVA e eliminação regressiva, como descrito acima. Esta assinatura de teste foi usada para treinar um SVM, usando o conjunto de treinamento, que depois disso foi aplicado para prever as amostras do conjunto de teste. A distribuição de uma área sob a curva de característica de operação do receptor (ROC) [25] foi usada como uma medição do desempenho do modelo.
[0154] Avaliação das funções biológicas de “Assinatura de previsão” usando análise de trajeto
[0155] A fim de investigar as funções biológicas, o perfil do gene foi analisado usando o software Ingenuity Pathway Analysis, IPA, (Ingenuity Systems, Inc. Mountain View, USA). Os 200 genes principais resultantes da eliminação regressiva foram analisados usando as funções ’build’ e ‘Path Explorer’ para construir uma interactoma dos genes de núcleo da “Assinatura de previsão” e moléculas de conexão sugeridas por IPA. As 200 moléculas na “Assinatura de previsão” foram conectadas usando os trajetos mais curtos conhecidos. Neste processo apenas evidências humanas de células primárias, linhagens de células e tecido epidérmico foram usadas. Todas as moléculas exceto para fármacos químicos e endógenos foram autorizadas na rede e todos os tipos de conexões foram permitidos. As “Funções” e “Vias canônicas” a partir de IPA foram mapeados para o interactoma usando a função ‘Overlay’. Abreviaturas
[0156] ACD, dermatite de contato atópia;
[0157] AML, célula de leucemia mielóide aguda;
[0158] APC, célula de apresentação a antígeno;
[0159] DC, célula dendrítica;
[0160] GM-CSF, fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos;
[0161] GPMT, teste de maximização de porquinho-da- índia;
[0162] HMT, teste de maximização de humano
[0163] HPTA, alergênio humano de teste com adesivo;
[0164] IL, Interleucina;
[0165] LLNA, teste de linfonodo local;
[0166] PCA, Análise de component principal. Referências 12. Akhavan, A. and S.R. Cohen, The relationship between atopic dermatitis and contact dermatitis. Clin Dermatol, 2003. 21(2): p. 158-62. 13. Mortz, C.G., et al., Prevalence of atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, and hand and contact dermatitis in adolescents. The Odense Adolescence Cohort Study on Atopic Diseases and Dermatitis. Br J Dermatol, 2001. 144(3): p. 523-32. 14. Nielsen, N.H., et al., Allergic contact sensitization in an adult Danish population: two cross-sectional surveys eight years apart (the Copenhagen Allergy Study). Acta Derm Venereol, 2001. 81(1): p. 31-4. 15. Fonacier, L.S., S.C. Dreskin, and D.Y. Leung, Allergic skin diseases. J Allergy Clin Immunol. 125(2 Suppl 2): p. S138-49. 16. 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Figure img0003
Tabela 2. Veículos e concentrações usados no teste.
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Tabela 3. Genes diferencialmente expressados em células mutz-3 estimuladas com produtos químicos sensibilizantes, em comparação com os agentes não sensibilizantes e os controles.
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Tabela 3 legenda. A tabela mostra o perfil de genes encontrados pelo teste t e eliminação regressiva. Os genes foram anotados, usando a base de dados NetAffx de Affymetrix (www.affymetrix.com, Santa Clara USA). Quando encontrada, a ID de Unigene (www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) foi escolhida como o identificador do gene. Nos doze casos em que nenhuma Unigene ID foi relatada, a ID de melhor alternativa foi dada. Nomes de Gene e IDs foram verificados contra o banco de dados de IPA, onde 189 dos 200 poderiam estar em correspondência. Em um exemplo, apenas uma ID Affymetrix foi relatada. 6 genes em duplicata foram removidos. Tabela 4. Funções dominantes na "assinatura de previsão". 184 das 200 moléculas foram investigadas funcionalmente usando IPA. Apenas as funções preenchidas por 15 ou mais moléculas foram relatadas.
Figure img0015
Figure img0016
Tabela 5. Algoritmo ‘Support Vector Machine’ (SVM) filnamnTraining<-"training set.txt" filnamnTest<-"test set.txt" lista <- read.delim("biomarker signature.txt",header=FALSE) # EN FIL MED DE ANALYTER lista <- as.character(lista[[1]]) listaBoolean <- is.element(ProteinNames, lista) group1<- "pos" group2<- "neg" rawfile <- read.delim(filnamnTraining) samplenames <- as.character(rawfile[,1]) groupsTraining <- rawfile[,2] dataTraining <- t(rawfile[,-c(1,2)]) ProteinNames <- read.delim(filnamnTraining,header=FALSE) ProteinNames <- as.character(as.matrix(ProteinNames)[1,]) ProteinNames <- ProteinNames[-(1:2)] listaBoolean <- is.element(ProteinNames, lista) rownames(dataTraining) <- ProteinNames colnames(dataTraining) <- samplenames logdataTraining <- dataTraining logdataTraining <- logdataTraining[listaBoolean,] rawfile <- read.delim(filnamnTest) samplenames <- as.character(rawfile[,1]) groupsTest <- rawfile[,2] dataTest <- t(rawfile[,-c(1,2)]) ProteinNames <- read.delim(filnamnTest,header=FALSE) ProteinNames <- as.character(as.matrix(ProteinNames)[1,]) ProteinNames <- ProteinNames[-(1:2)] rownames(dataTest) <- ProteinNames colnames(dataTest) <- samplenames logdataTest<-dataTest logdataTest <- logdataTest[listaBoolean,] svmfacTraining<- factor(rep('rest',ncol(logdataTraining)),levels=c(group1, group2, 'rest')) subset1Training<- is.element(groupsTraining , strsplit(group1,",")[[1]]) subset2Training<- is.element(groupsTraining , strsplit(group2,",")[[1]]) svmfacTraining[subset1Training] <- group1 svmfacTraining[subset2Training] <- group2 facTraining <-factor(as.character(svmfacTraining [subset1Training|subset2Training]),levels=c(group1,group2)) svmfacTest<- factor(rep('rest',ncol(logdataTest)),levels=c(group1, group2, 'rest')) subset1Test<- is.element(groupsTest , strsplit(group1,",")[[1]]) subset2Test<- is.element(groupsTest , strsplit(group2,",")[[1]]) svmfacTest[subset1Test] <- group1 svmfacTest[subset2Test] <- group2 facTest <-factor(as.character(svmfacTest [subset1Test|subset2Test]),levels=c(group1,group2)) n1 <- sum(facTest ==levels(facTest )[1]) n2 <- sum(facTest ==levels(facTest )[2]) nsamples <- n1+n2 SampleInformation <- paste(levels(facTest )[1]," ",n1," , ",levels(facTest )[2]," ",n2,sep="") svmtrain <- svm(t(logdataTraining) , facTraining , kernel="linear" ) pred<-predict(svmtrain , t(logdataTest) , decision.values=TRUE) res<-attr(pred, "decision.values") names <- colnames(logdataTest, do.NULL=FALSE) orden <- order(res , decreasing=TRUE) Samples <- data.frame(names[orden],res[orden],facTest[orden]) ROCdata <- myROC(res,facTest) SenSpe <- SensitivitySpecificity(res,facTest) ROCplot(list(SampleInformation=SampleInformation,ROCarea=ROCdata[1],p. value=ROCdata[2],SenSpe <- SenSpe,samples=Samples), sensspecnumber=4) #fileiras em azul são apenas necessárias para avaliação ROC. #para avaliar uma amostra desconhecida, imprimir res. #(vetor com valores de previsão)

Claims (15)

1. Método para identificar agentes capazes de induzir sensibilização da pele de humanos, em que os agentes são capazes de induzir e desencadear uma reação de hipersensibilidade tardia do tipo IV em um humano caracterizado pelo fato de compreender ou consistir das etapas de: a) expor uma população de células dendríticas ou uma população de células de tipo dendrítico a um agente de teste; e b) medir nas células a expressão de dois ou mais biomarcadores selecionados dentre o grupo compreendendo as seguintes sequências de nucleotídeos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, em que a expressão nas células dos dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (b) é indicativa do efeito sensibilizante do agente de teste, e em que o método é in vitro.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender expor uma população separada das células dendríticas ou células de tipo dendrítico a um agente de controle negativo que não sensibiliza pele humana e medir nas células a expressão de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (b) e/ou expor uma população separada das células dendríticas ou células de tipo dendrítico a um agente de controle positivo que sensibiliza pele humana e medir nas células a expressão de dois ou mais biomarcadores medidos na etapa (b).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende medir a expressão de pelo menos um biomarcador selecionado dentre o grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 192.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que etapa (b) compreende ou consiste em medir a expressão de, pelo menos, 3 biomarcadores dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 biomarcadores dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende ou consiste em medir a expressão de, pelo menos, 2 biomarcadores dentre SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 e SEQ ID NO: 192, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 180, 181, 182, 183 ou, pelo menos, 184 biomarcadores dentre ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 e SEQ ID NO: 192.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende medir a expressão de uma molécula de ácido nucleico codificando dois ou mais biomarcadores.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que medir a expressão de dois ou mais biomarcadores na etapa (b) é realizado usando duas ou mais porções de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a uma molécula de ácido nucleico codificando um dos biomarcadores identificados pelas seguintes sequências de nucleotídeos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende medir a expressão da proteína de dois ou mais biomarcadores.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que medir a expressão de dois ou mais biomarcadores na etapa (b) é realizado usando duas ou mais porções de ligação, cada uma capaz de se ligar seletivamente a um dos biomarcadores identificados pelas seguintes sequências de nucleotídeos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que etapa (b) é realizada usando um arranjo.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a população de células dendríticas ou população de células de tipo dendrítico é uma população de células de tipo dendrítico.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as células de tipo dendrítico são células mielóides de tipo dendrítico selecionadas dentre o grupo consistindo em KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac- 6, AML-193 e MUTZ-3.
13. Uso de um arranjo caracterizado pelo fato de as porções de ligação do arranjo consistirem em porções de ligação entre 10 e 192 biomarcadores dentre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 e SEQ ID NO: 192, e em que as porções de ligação do arranjo compreendem duas ou mais porções de ligação conforme descritas na reivindicação 7 e/ou 9, em que o uso do arranjo é em um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
14. Uso de dois ou mais biomarcadores selecionados dentre o grupo definido pelas seguintes sequências de nucleotídeos: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou duas ou mais porções de ligação conforme descritas na reivindicação 7 e/ou 9 caracterizado pelo fato de ser para identificar agentes sensibilizantes com resposta de hipersensibilidade tardia do tipo IV em que o uso é, opcionalmente, in vitro.
15. Uso de duas ou mais porções de ligação conforme descritas na reivindicação 7 e/ou 9 caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para identificar agentes sensibilizantes com resposta de hipersensibilidade tardia do tipo IV, em que o uso é, opcionalmente, in vitro.
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