ES2913755T3

ES2913755T3 - Métodos analíticos y matrices para uso en los mismos

Info

Publication number: ES2913755T3
Application number: ES18719856T
Authority: ES
Inventors: Malin Marie Lindstedt; Henrik Johansson; Walther Kathrin Zeller
Original assignee: SenzaGen AB
Current assignee: SenzaGen AB
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2022-06-06
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CA3059659A1; DK3615689T3; EP3615689A1; EP3615689B1; WO2018197438A1; GB201706464D0; US20200115741A1

Abstract

Un método para identificar proteínas que son alergénicas en mamíferos que comprende o consiste en las etapas de: (a) proporcionar una población de células dendríticas o una población de células similares a dendríticas; (b) exponer las células proporcionadas en la etapa (a) a una proteína de prueba; y (c) medir en las células de la etapa (b) la expresión de 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A; en donde la expresión de los 23 o más biomarcadores medida en la etapa (c) es indicativa de la alergenicidad de la proteína de prueba de la etapa (b); y en donde los 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A incluyen los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjuntos de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos analíticos y matrices para uso en los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para identificar proteínas que son alergénicas en un mamífero, y matrices y kits analíticos para uso en tales métodos.

Antecedentes

La alergia es una enfermedad crónica con prevalencia creciente y es de la mayor importancia para la industria y las autoridades identificar potenciales alergenos tan pronto como sea posible para limitar la exposición de trabajadores y las poblaciones generales. Se sabe que varios cientos de sustancias químicas son capaces de producir dermatitis de contacto alérgica [1, 2], una reacción de hipersensibilidad retrasada de tipo IV, mientras se conocen menos sustancias químicas que sensibilizan el aparato respiratorio e inducen respuestas alérgicas de tipo I [3]. La mayoría de las sustancias que producen alergia respiratoria son proteínas de origen medioambiental, por ejemplo, alergenos de las heces de los ácaros del polvo domésticos, polen, u hongos, mientras otras están presentes en un marco ocupacional tal como enzimas usadas en la producción de aromas, fragancias, detergentes y fármacos [4, 5]. El riesgo de desarrollar reacciones adversas después de exposición ocupacional existe; por tanto, un foco estricto en la seguridad ocupacional es obligatorio. Se ha observado sensibilización para trabajadores expuestos a ciertas enzimas industriales tal como a-amilasa, proteasas, pancreatinina, y tripsina [6, 7]. Se desarrollan nuevas enzimas continuamente para aplicaciones existentes, así como para nuevas, tal como enzimas genéticamente modificadas usadas en el procesamiento de alimentos y producción de aromas y también pueden producir riesgos de salud ocupacional [5, 7].

Hasta la fecha, no hay disponible ningún ensayo validado específicamente para predecir la alergenicidad de nuevas proteínas, haciendo que un enfoque de peso de evidencia sea el medio más aceptable de evaluación de seguridad de alergia. Sin embargo, hay un consenso creciente de que el potencial alergénico de compuestos, incluyendo proteínas, se debería evaluar con respecto a sus características bioquímicas y el potencial de la proteína para inducir una respuesta inmunitaria específica (Proyecto europeo COST impARAS [8]). Una combinación de rasgos físicos de proteínas, la interacción molecular entre células humanas y proteínas, así como su impacto en interacciones célulacélula desempeñan un papel en entender y eventualmente predecir la alergenicidad de proteínas [9, 10].

El ensayo de Detección Rápida de Alergenos Genómico (GARD) se desarrolló inicialmente para proporcionar información sobre la capacidad de sustancias químicas para inducir sensibilización en la piel (precisión: 89% [13, 17]). Este ensayo in vitro utiliza una línea celular mieloide que se parece a células dendríticas (CD) como un sistema modelo. Las CD son células presentadoras de antígenos y centrales para la inducción y regulación de respuestas inmunitarias adaptativas [14]. Este ensayo fue reconocido tanto por el Laboratorio de Referencia Europeo - Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (EURL-ECVAM) como la OCDE como un método valioso para abordar el suceso clave 3 (activación y maduración de células dendríticas) de la AOP para sensibilización de la piel [15]. Forreryd et al., [16] demostraron con éxito que un protocolo modificado del ensayo es capaz de predecir sensibilizadores químicos respiratorios con una precisión del 84% basado en una firma de biomarcadores que consiste en 389 transcritos.

Por tanto, un ensayo in vitro específicamente optimizado para predecir la alergenicidad de nuevas proteínas permanece deseable.

Divulgación de la invención

Los inventores han mostrado ahora que se puede desarrollar un perfil de biomarcadores genómicos usando la plataforma GARD para la evaluación alergénica específicamente de proteínas.

Según esto, un primer aspecto de la invención proporciona un método para identificar proteína que son alergénicas en un mamífero que comprende o consiste en las etapas de:

a) proporcionar una población de células dendríticas o una población de células similares a dendríticas;

b) exponer las células proporcionadas en la etapa (a) a una proteína de prueba; y

c) medir en las células de la etapa (b) la expresión de 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A;

en donde la expresión de los 23 o más marcadores medidos en la etapa (c) es indicativa de la alergenicidad de la proteína de prueba de la etapa (b); y

en donde los 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A incluyen los biomarcadores definidos por siguientes números ID de conjunto de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

En una forma de realización adicional o alternativa tres o más marcadores medidos en la etapa (c) se seleccionan del grupo definido en la tabla A(i).

En una forma de realización adicional o alternativa la etapa (c) comprende medir la expresión de tres o más biomarcadores enumerados en la tabla A(i), por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 de los biomarcadores enumerados en la tabla A(i). Por ejemplo, la etapa (c) puede comprender medir la expresión de todos los biomarcadores enumerados en la Tabla A(i).

El método incluye medir la expresión de TRIML2. El método incluye medir la expresión de CYP1A2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MAP9. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100131971.

El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000048751 /// ENST00000354794.

El método puede incluir o excluir medir la expresión de GRP. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000015233 /// ENST00000358162. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MOBKL1B. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411383 /// ENST00000386420. El método puede incluir o excluir medir la expresión de BNC2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SFTPA1 /// SFTPA1B /// SFTPA2 /// SFTPA2B (Conjunto de sondas ID 7934708). El método puede incluir o excluir medir la expresión de C21orf118. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000365169.

En una forma de realización adicional o alternativa la etapa (c) comprende medir la expresión de 22 o más biomarcadores enumerados en la tabla A(ii), por ejemplo, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

4, 215, , 238, , 261,

, 284,

377, o 378 de los biomarcadores enumerados en la tabla A(ii). Por ejemplo, la etapa (c) puede comprender medir la expresión de todos los biomarcadores enumerados en la tabla A(ii).

El método puede incluir o excluir medir la expresión de SFTPA1 /// SFTPA1B /// SFTPA2 /// SFTPA2B (conjunto de sondas ID 7934698). El método puede incluir o excluir medir la expresión de RPE65. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FAM 167A. El método incluye medir la expresión del transcrito ID ENST00000387309. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ44313. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NTN4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de STAT4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC45A2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100133036 /// FAM95B1 (conjunto de sondas ID 8161381). El método puede incluir o excluir medir la expresión de GLT6D1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID AF119888. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SYCP2L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLK3. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000042517. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RP11-191L9.1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC17A8. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ST8SIA2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000319817. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito iD ENST00000387801 /// ENST00000387652 /// ENST00000387676 /// ENST00000387734 /// ENST00000386042. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000385544. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IRX6. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100133036 /// FAM95B1 (conjunto de sondas ID 8155627). El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000024384 /// ENST00000364863. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000362375. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C12orf36. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RPRM. El método puede incluir o excluir medir la expresión de OR1OAD1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000326734 /// BC118644. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411186. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387641. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LRRC55. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FERMT2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100130815. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RTP2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PLCZ1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ25328. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411400 /// e Ns T00000385589. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000027599 /// ENST00000286193. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000026551 /// ENST00000329491. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CYP2A13 /// CYP2A7 /// CYP2A6. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PRY /// PRY2 (conjunto de sondas ID 8176935). El método puede incluir o excluir medir la expresión de GPR45. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8070930. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID AK095738. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000377462. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CITED1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000385536. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PXK. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000365399. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387878. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MGAT5B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RP11-35F15.2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MAP1LC3B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de Pr Y /// PRY2 (conjunto de sondas ID 8177395). El método incluye medir la expresión de CYP2C19. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC646187. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC158381. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TERF1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de WBP5. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000340456 /// AK128036. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC153328. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RAB10. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DIO3OS. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PDE11A. El método puede incluir o excluir medir la expresión de EGR1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C9orf7. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000365097. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CHAC1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384640. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DAOA. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000356058 /// AK128129. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IFNA7 /// IFNA14. El método puede incluir o excluir medir la expresión de POM121L1 /// DKFZp434K191 /// DKFZP434P211 (conjunto de sondas ID 8071168). El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID AF304443. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000364415. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PSD. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IQCF2. El método incluye medir la expresión de OR52A4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FOS. El método incluye medir la expresión de MSTP9 /// MST1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MAF. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000388431 /// ENST00000388445 (conjunto de sondas ID 7943954). El método puede incluir o excluir medir la expresión de EMID2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MDGA2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID hsa-mir-15a /// hsa-mir-15a. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC93432. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NPC1L1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NR4A2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID BC008359. El método puede incluir o excluir medir la expresión de OPN5. El método incluye medir la expresión del transcrito ID ENST00000385543. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000385921 /// ENST00000410743. El método puede incluir o excluir medir la expresión de AADACL2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C12orf54. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387268. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000364509. El método incluye medir la expresión de PRY /// PRY2 (conjunto de sondas ID 8176806). El método puede incluir o excluir medir la expresión de WBP11P1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SPRED3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MAPT. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8058145. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000410136. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PGR. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC26A5. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC642538 /// LOC642521 (conjunto de sondas ID 7934731). El método puede incluir o excluir medir la expresión de CRP. El método puede incluir o excluir medir la expresión de WDR38. El método incluye medir la expresión de S100A5. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411154 /// ENST00000387157. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CSN1S1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384294. El método incluye medir la expresión de AP3S1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ENPP5. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FXYD7. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CADPS. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RNF38. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000404200 /// ENST00000401594 /// ENST00000366307. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ASB16. El método puede incluir o excluir medir la expresión de AVPR1A. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387477. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CBLL1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C15orf51. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FOSB. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384559. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC642538 /// LOC642521 (conjunto de sondas ID 7934729). El método puede incluir o excluir medir la expresión de C10orf90. El método incluye medir la expresión de BCAN. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PPBPL2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000020848 /// ENST00000409669 /// ENST00000410082 /// ENST00000409686. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IL1F10. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C1D (conjunto de sondas ID 7932964). El método puede incluir o excluir medir la expresión de PRAMEF7 /// PRAMEF8 (conjunto de sondas ID 7912606). El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387283. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FKBP9L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC728264. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HAPLN2.

El método puede incluir o excluir medir la expresión de PRAMEF7 /// PRAMEF8 (conjunto de sondas ID 7912591). El método puede incluir o excluir medir la expresión de UNQ9370. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MAP1LC3C. El método incluye medir la expresión de PRAMEF7 /// PRAMEF8 (conjunto de sondas ID 7897991). El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC15A1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000388545. El método incluye medir la expresión de C10orf110. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID hsa-mir-375 /// hsa-mir-375. El método puede incluir o excluir medir la expresión de GP1BB. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100129581. El método puede incluir o excluir medir la expresión de BRS3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CCDC63. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ONECUT2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387825. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000364793. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TBX18. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DKFZP686I15217. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C9orf98. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MYH1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CASQ1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DUSP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID AK125575. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ZNF781. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000354690. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363355. El método incluye medir la expresión de C1D (conjunto de sondas ID 8052698). El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000388656. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOH3CR2A. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MTNR1A. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000388431 /// e Ns T00000388445 (conjunto de sondas ID 7951701). El método puede incluir o excluir medir la expresión de TMEM38B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ENST00000387816. El método puede incluir o excluir medir la expresión de UROC1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363309. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000316807. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C13orf1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de UGCG. El método puede incluir o excluir medir la expresión de POM121L1 /// DKFZp434K191 /// DKFZP434P211 (conjunto de sondas ID 8074714). El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ38773. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LRRFIP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FCRL6. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ38723. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HSP90AA6P. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CALR3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ST18. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000025928 /// ENST00000312946 /// ENST00000402897. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PTGS2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NICN1 /// AMT. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TTC28. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MCL1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SULT1A1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000386719 /// ENST00000410999. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IGLL3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FAM98B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC26A4. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8180281. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PDE12. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC1A 1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PLSCR4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TPT1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SNRPN /// SNORD116-25. El método incluye medir la expresión del transcrito ID BC068044. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C1orf127. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ11827. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CD2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TMSB10. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PRY /// PRY2 (conjunto de sondas ID 8177323). El método puede incluir o excluir medir la expresión de DPM3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC442132. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NAALAD2. El método incluye medir la expresión de ANO5. El método puede incluir o excluir medir la expresión de GPR160. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SCN2A. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000364421. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TSPYL1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DR1. El método incluye medir la expresión del transcrito ID ENST00000410179. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ELOVL5. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FAM127C. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TNFSF14. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FZD8. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ATPAF1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000388700 /// ENST00000411294. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100132357 (conjunto de sondas ID 8161437). El método puede incluir o excluir medir la expresión de C17orf82. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ACER2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100132357 (conjunto de sondas ID 8161426). El método puede incluir o excluir medir la expresión de C3orf58. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CBLN1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PNPLA7. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ATP7B. El método incluye puede incluir o excluir la expresión de NCCRP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100132357 (conjunto de sondas ID 8155569). El método puede incluir o excluir medir la expresión de ZNF835. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000322493. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384168. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FOXJ3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IKZF3. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000386866. El método puede incluir o excluir medir la expresión de GABRR1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MED31. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LRRC32. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MFSD6L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CYP19A1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ZNF565. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CSNK2A1P /// CSNK2A1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DNAH11. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000365299. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8180232. El método puede incluir o excluir medir la expresión de OSMR. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000391137. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SUMO4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SCGB1D1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RPL39L. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363408. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384108. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MESP2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de EHF. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ERO1L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de EEF1E1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC7A3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SPATA19. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NCR1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLK4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLHDC7B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MBTPS2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PAH. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C4orf27. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HUS1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DNAH9. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ27255. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TMEM33. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SGCZ. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HLA-DQB2. El método incluye medir la expresión de KRT24. El método puede incluir o excluir medir la expresión de GTSF1L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NETO2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TTTY9A /// TTTY9B (conjunto de sondas ID 8177195). El método puede incluir o excluir medir la expresión de MIR21. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TTTY9A /// TTTY9B (conjunto de sondas ID 8176692). El método puede incluir o excluir medir la expresión de EVX2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363948. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TBXAS1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ADAM12. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CD7. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ATXN10. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ZNF826. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC35F2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FGF1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IL8. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000364677. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CLSTN2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ00049. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RCOR1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de VPS37A. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID hsa-mir-221 /// hsa-mir-221. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8091186. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000386767. El método puede incluir o excluir medir la expresión de UBE2K. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MYH15. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DUSP22. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HIAT1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLHL33. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411322. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C7orf29. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387115 /// ENSTO0000408541. El método incluye medir la expresión del transcrito ID ENST00000386002. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID hsa-mir-33a /// hsa-mir-33a. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PTPLB. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TANC1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de DACT1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PTPRD. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CDC26. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TSPYL3. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RXFP3. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000410526 /// ENST00000386460. El método puede incluir o excluir medir la expresión de FLJ13224. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TAF1D /// SNORA40. El método puede incluir o excluir medir la expresión de HPRT1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C10orf10. El método incluye medir la expresión del transcrito ID ENST00000364910. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MGC16121. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8180344. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000387217. El método puede incluir o excluir medir la expresión de GDA. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SNORD63. El método puede incluir o excluir medir la expresión de YWHAG. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SNRPN /// SNORD116-26. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ASNS. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000385636. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000389074. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363891. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLHL11. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KCNK6. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SVIP. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KLRA1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CPSF6. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000384449. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000389758 /// ENST00000396517 /// ENST00000327506. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000041083 /// ENST00000309074. El método puede incluir o excluir medir la expresión de POGK. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TRPM6. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C9orf6. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411285 /// ENST00000388598. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RAB2A. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NAV3. El método puede incluir o excluir medir la expresión del conjunto de sondas ID 8091118. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SLC22A4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NAP1L5. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363618. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TGFBRAP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de RPL27A. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TP53TG3 /// LOC729355. El método puede incluir o excluir medir la expresión de JSRP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000411174 /// ENST00000388411. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CCNA2. El método incluye medir la expresión de AADACL3. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000363794. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TMEM184C. El método puede incluir o excluir medir la expresión de POLR3G. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CLDN9 /// LOC100134406. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LRRC58. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000001581. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID hsa-mir-34b /// hsa-mir-34b. El método puede incluir o excluir medir la expresión de OR10K2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID GENSCAN00000048378 /// ENST00000404638. El método puede incluir o excluir medir la expresión de KRAS. El método puede incluir o excluir medir la expresión de ORC5L. El método puede incluir o excluir medir la expresión de MYO15B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de TNFRSF10D. El método puede incluir o excluir medir la expresión de NIPA2. El método puede incluir o excluir medir la expresión del transcrito ID ENST00000386231 /// ENST00000411190. El método puede incluir o excluir medir la expresión de C17orf88. El método puede incluir o excluir medir la expresión de PPP1R15B. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CSNK2A2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100133036 /// FAM95B1 (conjunto de sondas ID 8155418). El método puede incluir o excluir medir la expresión de MPZL2. El método puede incluir o excluir medir la expresión de LOC100134722 /// LOC100133005. El método puede incluir o excluir medir la expresión de IER3IP1. El método puede incluir o excluir medir la expresión de CCDC117. El método incluye medir la expresión de DDIT4. El método puede incluir o excluir medir la expresión de SEC24A.

En una forma de realización adicional o alternativa la etapa (c) comprende o consiste en medir la expresión de 24 o más de los biomarcadores enumerados en la tabla A, por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, o 391 de los biomarcadores enumerados en la tabla A. por ejemplo, la etapa (c) puede comprender o consistir en medir la expresión de todos los biomarcadores enumerados en la tabla A.

Mediante “expresión” se quiere decir la presencia, nivel y/o cantidad del biomarcador.

En “biomarcador” se incluye cualquier molécula biológica, o componente o fragmento de la misma, cuya medida puede proporcionar información útil en determinar la alergenicidad de una proteína. Por tanto, en el contexto de la tabla A, el biomarcador puede ser una molécula de ácido nucleico, tal como un ARNm o ADNc. Alternativamente, el biomarcador puede ser una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico o fracción de hidrato de carbono, o un componente antigénico o fragmento del mismo.

En una forma de realización adicional o alternativa, el método comprende las etapas adicionales de:

d) exponer una población separada de las células dendríticas o células similares a dendríticas a uno o más agentes de control negativo que no es alergénico en un mamífero; y

e) medir en las células de la etapa (d) la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)

en donde la proteína de prueba se identifica como alergénica en el caso de que la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (d) se diferencia de la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c).

Se puede usar un vehículo control como el agente de control negativo. El vehículo control puede comprender DMSO.

En una forma de realización adicional o alternativa, se pueden usar células sin estimular como el control negativo. En “células sin estimular” se incluyen o quiere decir células que no se han expuesto a una proteína de prueba específica.

En otras palabras, la población separada de células en la etapa (d) no se expone a una proteína de prueba. Sin embargo, la población separada de células se puede exponer al medio celular que contiene suero (por ejemplo, aproximadamente el 20% en volumen) que comprende proteínas de control negativo.

En una forma de realización adicional o alternativa, la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c) se mide en las células proporcionadas en la etapa (a) antes de y después de la exposición a la proteína de prueba, y en donde la diferencia en expresión entre los 23 o más biomarcadores antes de y después de la exposición a la proteína de prueba es indicativa de la alergenicidad de la proteína de prueba de la etapa (b). Por tanto, las células proporcionadas en la etapa (a) pueden proporcionar tanto el control negativo como el resultado de la prueba.

En “se diferencia de la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)” y “diferencia en expresión” se incluye que la presencia y o cantidad en una primera muestra (por ejemplo, una muestra de proteína de prueba) se diferencia de la de una segunda muestra (por ejemplo, una muestra de agente control).

Por ejemplo, la presencia y/o cantidad en la muestra de prueba se pueda diferenciar de la de la una o más muestra de control negativo de una manera estadísticamente significativa. Preferiblemente, la expresión de los 23 o más biomarcadores en la población celular expuesta a la proteína de prueba es:

menor o igual al 80% de la de población celular expuesta al agente de control negativo, por ejemplo, no más del 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0% de la de la población celular expuesta al control negativo o agente de control negativo; o

al menos el 120% de la de población celular expuesta al agente de control negativo, por ejemplo, al menos el 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 130%, 131%, 132%, 133%, 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139%, 140%, 141%, 142%, 143%, 144%, 145%, 146%, 147%, 148%, 149%, 150%, 151%, 152%, 153%, 154%, 155%, 156%, 157%, 158%, 159%, 160%, 161%, 162%, 163%, 164%, 165%, 166%, 167%, 168%, 169%, 170%, 171%, 172%, 173%, 174%, 175%, 176%, 177%, 178%, 179%, 180%, 181%, 182%, 183%, 184%, 185%, 186%, 187%, 188%, 189%, 190%, 191%, 192%, 193%, 194%, 195%, 196%, 197%, 198%, 199%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% o al menos el 500% de la de la población celular expuesta al control negativo o agente de control negativo.

En “se diferencia de la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)” se incluye alternativa o adicionalmente que la muestra de prueba se clasifica como perteneciente a un grupo diferente que la una o más muestra de control negativo. Por ejemplo, donde se usa una SVM, la muestra de prueba está al otro lado del umbral de valor de decisión que la una o más muestra de control negativo (por ejemplo, si el agente de prueba se clasifica como un alergeno proteico si una o más pruebas (o replicados de la misma) tiene un valor de decisión de SVM de < 0, entonces la una o más muestras de control positivo (o la mayoría de las mismas) también debe tener un valor de decisión de SVM < 0).

En una forma de realización adicional o alternativa, el uno o más agente de control negativo proporcionado en la etapa (d) se selecciona del grupo que consiste en: células sin estimular; medio celular; vehículo control; DMSO; LPS.

En una forma de realización adicional o alternativa, el uno o más agente de control negativo proporcionado en la etapa (d) es medio celular. Preferiblemente el medio contiene suero (preferiblemente a aproximadamente el 20% en volumen) que comprende proteínas de control negativo.

En una forma de realización adicional o alternativa, se proporcionan al menos 2 controles negativos y/o agentes no alergénicos control, por ejemplo, al menos 3, 4 o al menos 5 controles negativos y/o agentes no alergénicos control.

f) exponer una población separada de las células dendríticas o células similares a dendríticas a uno o más agentes de control positivo que es alergénico en un mamífero; y

g) medir en las células de la etapa (f) la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)

en donde la proteína de prueba se identifica como alergénica en el caso de que la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (f) se corresponda con la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c).

Mediante “se corresponde con la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)” se quiere decir la expresión de los 23 o más biomarcadores en la población celular a la proteína de prueba es idéntica a, o no se diferencia significativamente de, la de la población celular expuesta a uno o más agente de control positivo. Preferiblemente la expresión de los 23 o más biomarcadores en la población celular expuesta a la proteína de prueba es entre el 81% y el 119% de la de la población celular expuesta al uno o más agente de control positivo, por ejemplo, mayor que o igual al 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, y menor que o igual al 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118% o 119% de la de la población celular expuesta a uno o más agente de control positivo.

En “se corresponde con la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c)” se incluye alternativa o adicionalmente que la muestra de prueba se clasifica como perteneciente al mismo grupo que la una o más muestra de control positivo. Por ejemplo, donde se usa una SVM, la muestra de prueba está en el mismo lado del umbral de valor de decisión que la una o más muestra de control positivo (por ejemplo, si la proteína de prueba se clasifica como alergénica si una o más pruebas (o replicados de la misma) tiene un valor de decisión SVM de > 0, entonces la una o más muestras de control positivo (o la mayoría de las mismas) también debe tener un valor de decisión SVM > 0).

En una forma de realización adicional o alternativa, el uno o más agente de control positivo proporcionado en la etapa (f) comprende o consiste en uno o más agente seleccionado del grupo que consiste en: Der p 1; y Der p 7.

En una forma de realización adicional o alternativa, se proporcionan al menos 2 agentes alergénicos control.

En una forma de realización adicional o alternativa, los agentes alergénicos control son proteínas alergénicas. En una forma de realización adicional o alternativa, los agentes no alergénicos control son proteínas no alergénicas.

En una forma de realización adicional o alternativa, el método es indicativo de la potencia alergénica de la proteína que se va a ensayar. Por ejemplo, el método se puede usar para predecir la potencia alergénica relativa de una proteína de prueba comparada con un control positivo y/o comparada con una o más proteínas de prueba adicionales.

En una forma de realización adicional o alternativa, el método comprende la etapa adicional de:

h) identificar la alergenicidad de la proteína de prueba.

Por ejemplo, la etapa (h) puede identificar que la proteína de prueba es un alergeno o un no alergeno. Alternativa o adicionalmente, la etapa (h) puede identificar la alergenicidad relativa o potencia alergénica de la proteína de prueba comparada con un control positivo y/o una o más proteínas de prueba adicionales.

La identificación se puede realizar usando cualquier método estadístico adecuado o algoritmo de aprendizaje automático conocido en la técnica, tal como bosque aleatorio (RF), máquina de vector soporte (SVM), análisis de componentes principales (PCA), mínimos cuadrados normales (OLS), regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS), regresión de mínimos cuadrados parciales ortogonal (O-PLS) y otros análisis estadísticos multivariable (por ejemplo, modelo de regresión logística escalonada hacia atrás). Para una revisión de análisis estadístico multivariable véase, por ejemplo, Schervish, Mark J. (Noviembre 1987). "A Review of Multivariate Analysis". Statistical Science 2 (4): 396-413. Preferiblemente se usa máquina de vector soporte (SVM).

Típicamente, las proteínas alergénicas se identifican usando una máquina de vector soporte (SVM), tal como las disponibles de http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html (por ejemplo, e1071 1.5-24). Sin embargo, también se puede usar cualquier otro medio adecuado. También se pueden usar SVM para determinar las AUC ROC de firmas de biomarcadores que comprenden o consisten en uno o más biomarcadores de la tabla A como se define en el presente documento.

Las máquinas de vector soporte (SVM) son un conjunto de métodos de aprendizaje supervisados relacionados usados para clasificación y regresión. Dado un conjunto de muestras de entrenamiento, cada una marcada como perteneciente a una de dos categorías, un algoritmo de entrenamiento de SVM construye un modelo que predice si una nueva muestra está en una categoría o la otra. Intuitivamente, un modelo de SVM es una representación de los ejemplos como puntos en el espacio, mapeados de modo que los ejemplos de las categorías separadas estén divididos por un hueco claro que sea tan amplio como sea posible. Los nuevos ejemplos se mapean después en ese mismo espacio y se predice que pertenecen a una categoría basado en qué lado del hueco caen.

Más formalmente, una máquina de vector soporte construye un hiperplano o conjunto de hiperplanos en un espacio dimensional alto o infinito, que se puede usar para clasificación, regresión u otras tareas. Intuitivamente, se alcanza una buena separación por el hiperplano que tiene la mayor distancia a los puntos de datos de entrenamiento más cercanos de cualquier clase (llamado margen funcional), ya que en general cuanto mayor sea el margen, menor el error de generalización del clasificador. Para más información en SVM, véase, por ejemplo, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167.

En una forma de realización de la invención, la SVM se “entrena” antes de realizar los métodos de la invención usando perfiles de biomarcadores de agentes conocidos (es decir, agentes alergénicos o no alergénicos conocidos). Al correr tales muestras de entrenamiento, la SVM es capaz de aprender que perfiles de biomarcadores se asocian con proteínas capaces de inducir alergia. Una vez se completa el proceso de entrenamiento, la SVM es después capaz de predecir si la muestra de biomarcador ensayada es o no de una proteína alergénica o no alergénica.

Los valores de decisión para SVM individuales los puede determinar el experto en la materia en una base de caso a caso. En una forma de realización, la proteína de prueba se clasifica como alergénica si una o más pruebas (o replicados de las mismas) tienen un valor de decisión de SVM de > 0. En una forma de realización, la proteína de prueba se clasifica como no alergénica si una o más pruebas (o replicados de las mismas) tienen un valor de decisión de SVM de < 0. Esto permite que se clasifiquen las proteínas de prueba como alergénicas o no alergénicas.

Sin embargo, este procedimiento de entrenamiento se puede evitar preprogramando la SVM con los parámetros de entrenamiento necesarios. Por ejemplo, las proteínas alergénicas se pueden identificar según los parámetros de SVM conocidos usando el algoritmo de SVM descrito en los ejemplos, basado en la medida de todos los biomarcadores enumerados en la tabla A.

Los expertos en la materia apreciarán que se pueden determinar los parámetros de SVM adecuados para cualquier combinación de los biomarcadores enumerados en la tabla A entrenando una máquina SVM con la selección apropiada de datos (es decir, medidas de biomarcadores de células expuestas a agentes alergénicos y no alergénicos conocidos). Alternativamente, los biomarcadores de la tabla A se pueden usar para identificar proteínas alergénicas según cualquier otro método estadístico adecuado conocido en la técnica.

Alternativamente, los datos de la tabla A se pueden usar para identificar agentes capaces de inducir sensibilización respiratoria según cualquier otro método estadístico adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, ANOVA, ANCOVA, MANOVA, MANCOVA, análisis de regresión multivariable, análisis de componentes principales (PCA), análisis de factor, análisis de correlación canónico, análisis de correlación canónico, análisis de redundancia análisis de correspondencia (CA; promediado recíproco), escalado multidimensional, análisis discriminante, análisis discriminante lineal (LDA), sistemas de agrupación, reparto recursivo y redes neurales artificiales).

Preferiblemente, los métodos de la invención tienen una precisión de al menos el 60%, por ejemplo, el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de precisión. En una forma de realización preferida, los métodos de la invención tienen una precisión de al menos el 93%.

Preferiblemente, los métodos de la invención tienen una sensibilidad de al menos el 60%, por ejemplo, el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de sensibilidad. En una forma de realización preferida, los métodos de la invención tienen una sensibilidad de al menos el 92%.

Preferiblemente, los métodos de la invención tienen una especificidad de al menos el 60%, por ejemplo, el 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de especificidad. En una forma de realización preferida, los métodos de la invención tienen una especificidad del 100%.

Mediante “precisión” se quiere decir la proporción de resultados correctos de un método, mediante “sensibilidad” se quiere decir la proporción de todas las proteínas positivas que se clasifican correctamente como positivas, y mediante “especificidad” se quiere decir la proporción de todas las proteínas negativas que se clasifican correctamente como negativas.

En una forma de realización preferida, la etapa (c) comprende medir la expresión de una molécula de ácido nucleico de uno o más biomarcadores. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o una molécula de ADNc o una molécula de ARNm. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ARNm. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADNc.

En una forma de realización la medida de la expresión de uno o más de los biomarcadores en la etapa (c) se realiza usando un método seleccionado del grupo que consiste en hibridación Southern, hibridación Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa PCR (RT-PCR), PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografía e hibridación in situ. Preferiblemente, la expresión de uno o más biomarcador(es) se mide usando una micromatriz de ADN.

En una forma de realización adicional o alternativa uno o más biomarcadores medidos en la etapa (c) se mide usando una matriz (por ejemplo, matriz de ADN). En una forma de realización adicional o alternativa uno o más biomarcadores medidos en la etapa (c) se mide usando una matriz de genoma completo (por ejemplo, la matriz Affymetrix Human Gene 1.0 TS o la matriz Affymetrix Human Gene 2.0 TS). En una forma de realización alternativa o adicional se usa el sistema Nanostring nCounter (por ejemplo, conjuntos de códigos Nanostring nCounter personalizados basados en selección de una matriz de genoma entero (por ejemplo, la matriz Affymetrix Human Gene 1.0 TS o la matriz Affymetrix Human Gene 2.0 TS).

El método puede comprender medir la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (c) usando una o más fracciones de unión, cada una capaz de unirse selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los biomarcadores identificados en la tabla A. Preferiblemente, el método comprende medir la expresión de dos o más biomarcadores en la etapa (c) usando dos o más fracciones de unión, cada una capaz de unirse selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los biomarcadores identificados en la tabla A. Por ejemplo, la expresión de cualquier combinación particular de biomarcadores descritos anteriormente se puede medir usando una combinación equivalente de fracciones de unión capaces de unirse selectivamente a cada uno de esos biomarcadores.

En una forma de realización la una o más fracciones de unión cada una comprende o consiste en una molécula de ácido nucleico. En una forma de realización adicional la una o más fracciones de unión cada una comprende o consiste en ADN, ARN, APN, ANB, GNA; TNA o PMO. Preferiblemente, la una o más fracciones de unión cada una comprende o consiste en ADN. En una forma de realización la una o más fracciones de unión tienen de 5 a 100 nucleótidos de longitud. Sin embargo, en una forma de realización alternativa, tienen de 15 a 35 nucleótidos de longitud.

La una o más fracciones de unión pueden comprender o consistir en una o más sondas de la matriz Human Gene 1.0 TS (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE UU). Los números de identificación de sondas se proporcionan en la tabla A en el presente documento.

Los agentes de unión adecuados (también denominados moléculas de unión o fracciones de unión) se pueden seleccionar o cribar de una biblioteca basado en su capacidad para unirse a un ácido nucleico, proteína, o motivo de aminoácido determinado, como se discute posteriormente.

En una forma de realización preferida, la fracción de unión comprende una fracción detectable.

En “una fracción detectable” se incluye una fracción que permite que se determine su presencia y/o cantidad relativa y/o localización (por ejemplo, la localización en una matriz), ya se directa o indirectamente.

Las fracciones detectables adecuadas se conocen bien en la técnica.

Por ejemplo, una fracción detectable puede ser una fracción fluorescente y/o luminiscente y/o quimioluminiscente que, cuando se expone a condiciones específicas, se puede detectar. Puede ser necesario exponer tal fracción fluorescente a radiación (es decir, luz) a una longitud de onda e intensidad específicas para producir excitación de la fracción fluorescente, permitiendo de esta manera que emita fluorescencia específica a una longitud de onda específica que se puede detectar.

Alternativamente, la fracción detectable puede ser una enzima que es capaz de convertir un sustrato (preferiblemente indetectable) a un producto detectable que se puede visualizar y/o detectar. Los ejemplos de enzimas adecuadas se discuten en más detalle posteriormente en relación a, por ejemplo, ensayos ELISA.

La fracción detectable puede ser una fracción radiactiva y comprender o consistir en un átomo radioactivo. El átomo radioactivo se puede seleccionar del grupo que consiste en tecnecio-99m, yodo-123, yodo-125, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, fósforo-32, azufre-35, deuterio, tritio, renio-186, renio-188 e itrio-90.

Por tanto, la fracción detectable se puede seleccionar del grupo que consiste en: una fracción fluorescente; una fracción luminiscente; una fracción quimioluminiscente; una fracción radioactiva (por ejemplo, un átomo radioactivo); o una fracción enzimática.

Claramente, el agente que se va a detectar (tal como, por ejemplo, el uno o más biomarcadores en la muestra de prueba y/o muestra control descrita en el presente documento y/o una molécula de anticuerpo para uso en detectar una proteína seleccionada) debe tener suficiente de los isótopos atómicos apropiados con el fin de que la fracción detectable sea fácilmente detectable.

En una forma de realización preferida alternativa, la fracción detectable de la fracción de unión es una fracción fluorescente.

Se pueden incorporar radiomarcadores u otros a los biomarcadores presentes en las muestras de los métodos de la invención y/o las fracciones de unión de la invención de modos conocidos. Por ejemplo, si el agente de unión es un polipéptido se puede biosintetizar o se puede sintetizar por síntesis química de aminoácidos usando los precursores de aminoácidos adecuados que implica, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcadores tales como 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh, y 111In se pueden, por ejemplo, unir a través de residuos de cisteína en la fracción de unión. Itrio-90 se puede unir a través de un residuo de lisina. Se puede usar el método ODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) para incorporar 123I. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros métodos en detalle. Los métodos para conjugar otras fracciones detectables (tal como fracciones enzimáticas, fluorescentes, luminiscentes, quimioluminiscentes o radiactivas) a proteínas se conocen bien en la técnica.

Los expertos en la materia apreciarán que los biomarcadores en la(s) muestra(s) que se va(n) a ensayar se pueden marcar con una fracción que ayude indirectamente con determinar la presencia, cantidad y/o localización de dichas proteínas. Por tanto, la fracción puede constituir un componente de una fracción detectable multicomponente. Por ejemplo, los biomarcadores en la(s) muestra(s) que se va(n) a ensayar se pueden marcar con biotina, que permite su posterior detección usando estreptavidina fusionada o unida de otra manera a un marcador detectable.

El método proporcionado en el primer aspecto de la presente invención puede comprender, en la etapa (c), determinar la expresión de la proteína de uno o más biomarcadores definidos en la tabla A. El método puede comprender medir la expresión de uno o más biomarcadores en la etapa (c) usando una o más fracciones de unión cada una capaz de unirse selectivamente a uno de los biomarcadores identificados en la tabla A. La una o más fracciones de unión pueden comprender o consistir en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.

El término “anticuerpo” incluye cualquier anticuerpo sintético, anticuerpo recombinante o híbrido de anticuerpo, tal como, pero no limitado a, una molécula de anticuerpo monocatenario producida por una presentación en fagos de regiones variables y/o constantes de la cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulinas, u otras moléculas inmunointeractivas capaces de unirse a un antígeno en un formato de inmunoensayo que conocen los expertos en la materia.

También se incluye el uso de agentes similares a anticuerpo, tal como aficuerpos y aptámeros.

Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de unión específicos se puede encontrar en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Además, o alternativamente, una o más de las primeras moléculas de unión puede ser un aptámero (véase, Collett et al., 2005, Methods 37:4-15).

Se pueden usar bibliotecas moleculares tal como bibliotecas de anticuerpos (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624 628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), bibliotecas de péptidos (Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), genotecas de ADNc expresado (Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), bibliotecas en andamiajes diferentes de regiones marco de anticuerpo tal como aficuerpos (Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134 40) o bibliotecas basadas en aptámeros (Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 1l8, 217-31) como fuente de la que moléculas de unión que son específicas para un motivo determinado se seleccionan para uso en los métodos de la invención.

Las bibliotecas moleculares se pueden expresar in vivo en células procariotas (Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op. cit.) o células eucarióticas (Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6) o se pueden expresar in vitro sin implicar células (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).

En casos donde se usan bibliotecas basadas en proteínas, los genes que codifican las bibliotecas de potenciales moléculas de unión con frecuencia se empaquetan en virus y la potencial molécula de unión se presenta en la superficie del virus (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).

Tal vez el sistema de presentación más comúnmente usado es bacteriófagos filamentosos que presentan fragmentos de anticuerpos en sus superficies, los fragmentos de anticuerpos se expresan como una fusión a la proteína de envuelta menor del bacteriófago (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). Sin embargo, otros sistemas adecuados para presentación incluyen usar otros virus (documento EP 39578), bacterias (Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21), y levaduras (Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5): 949-56).

Además, se han desarrollado sistemas de presentación que utilizan unión del producto polipeptídico a su ARNm codificante en los llamados sistemas de presentación en ribosomas (Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), o alternativamente unión del producto polipeptídico al ADN codificante (véase la patente en EE UU No. 5.856.090 y el documento WO 98/37186).

Los dominios pesado variable (V^h) y ligero variable (V^l) del anticuerpo están implicados en reconocimiento de antígeno, un hecho primero reconocido por experimentos de digestión con proteasa tempranos. Se encontró confirmación adicional por “humanización” de anticuerpos roedores. Los dominios variables de origen roedor se pueden fusionar a dominios constantes de origen humano de modo que el anticuerpo resultante retiene la especificidad antigénica del anticuerpo parental roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).

Que la especificidad antigénica está conferida por los dominios variables y es independiente de los dominios constantes se sabe de experimentos que implican la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpos, que contienen todos uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv monocatenarias (ScFv) donde los dominios compañeros V^hy V^lestán unidos a través de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de dominio único (dAbs) que comprenden dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Se puede encontrar una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpo en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en anticuerpos intactos, fragmentos Fv (por ejemplo, Fv monocatenarios y Fv unidos por disulfuro), fragmentos de tipo Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)²), dominios variables únicos (por ejemplo, dominios V^hy V^l) y anticuerpos dominio (dAb, que incluyen formatos individuales y duales [es decir, dAb-enlazador-dAb]). Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un Fv monocatenario (scFv).

La una o más fracciones de unión pueden alternativamente comprender o consistir en un agente de unión similar a anticuerpo, por ejemplo, un aficuerpo o aptámero.

Mediante “moléculas scFv” se quiere decir moléculas donde dominios compañeros V^hy V^lestán unidos a través de un oligopéptido flexible.

Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpo, más que anticuerpos enteros, son varias. El menor tamaño de los fragmentos puede producir propiedades farmacológicas mejoradas, tal como mejor penetración de tejido sólido. Las funciones efectoras de los anticuerpos enteros, tal como unión al complemento, se eliminan. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, scFv y dAb se pueden todos expresar en y secretar de E. coli, permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos enteros, y los fragmentos F(ab)²son “bivalentes”. Mediante “bivalente” se quiere decir que los dichos anticuerpos y fragmentos F(ab)²tienen dos sitios de combinación de antígeno. En contraste, los fragmentos Fab, Fv, scFv y dAb son monovalentes, teniendo solo un sitio de combinación de antígeno.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales adecuados se pueden preparar por técnicas conocidas, por ejemplo, las divulgadas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982).

Cuando se seleccionan potenciales moléculas de unión de bibliotecas, habitualmente se emplean uno o más péptidos selectores que tienen motivos definidos. Se pueden usar residuos de aminoácidos que proporcionan estructura, flexibilidad decreciente en el péptido o cadenas laterales cargadas, polares o hidrofóbicas que permiten interacción con la molécula de unión en el diseño de motivos de péptidos selectores. Por ejemplo:

(i) prolina puede estabilizar una estructura peptídica ya que su cadena lateral está unida tanto al carbono alfa, así como al nitrógeno;

(ii) fenilalanina, tirosina y triptófano tienen cadenas laterales aromáticas y son muy hidrofóbicos, mientras leucina e isoleucina tienen cadenas laterales alifáticas y también son hidrofóbicos;

(iii) lisina, arginina e histidina tienen cadenas laterales básicas y estarán cargadas positivamente a pH neutro, mientras aspartato y glutamato tienen cadenas laterales ácidas y estarán cargados negativamente a pH neutro; (iv) asparragina y glutamina son neutros a pH neutro, pero contienen un grupo amida que puede participar en enlaces de hidrógeno;

(v) las cadenas laterales de serina, treonina y tirosina contienen grupos hidroxilo, que puede participar en enlaces de hidrógeno.

Típicamente, la selección de moléculas de unión puede implicar el uso de tecnologías y sistemas de matriz para analizar unión a manchas correspondientes a tipos de moléculas de unión.

La una o más fracciones de unión a proteína pueden comprender una fracción detectable. La fracción detectable se puede seleccionar del grupo que consiste en una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción quimioluminiscente, una fracción radioactiva y una fracción enzimática.

En una forma de realización adicional de los métodos de la invención, la etapa (c) se puede realizar usando un ensayo que comprende un segundo agente de unión capaz de unirse a la una o más proteínas, el segundo agente de unión también comprende una fracción detectable. Los segundos agentes de unión adecuados se describen en detalle anteriormente en relación con los primeros agentes de unión.

Por tanto, las proteínas de interés en la muestra que se va a ensayar primero se pueden aislar y/o inmovilizar usando el primer agente de unión, después de lo cual se puede determinar la presencia y/o cantidad relativa de dichos biomarcadores usando un segundo agente de unión.

En una forma de realización, el segundo agente de unión es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; típicamente un anticuerpo recombinante o fragmento del mismo. Convenientemente, el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en: scFv; Fab; un dominio de unión de una molécula de inmunoglobulina. Los anticuerpo y fragmentos adecuados, y los métodos para hacer los mismos, se han descrito en detalle anteriormente.

Alternativamente, el segundo agente de unión puede ser un agente de unión similar a anticuerpo, tal como un aficuerpo o un aptámero.

Alternativamente, donde la fracción detectable en la proteína en la muestra que se va a ensayar comprende o consiste en un miembro de un par de unión específico (por ejemplo, biotina), el segundo agente de unión puede comprender o consistir en el miembro complementario del par de unión específico (por ejemplo, estreptavidina).

Donde se usa un ensayo de detección, se prefiere que la fracción detectable se seleccione del grupo que consiste en: una fracción fluorescente, una fracción luminiscente, una fracción quimioluminiscente, una fracción radioactiva; una fracción enzimática. Los ejemplos de fracciones detectables adecuadas para uso en los métodos de la invención se han descrito anteriormente.

Los ensayos preferidos para detectar proteínas de suero o plasma incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos en sándwich usando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Los ensayos en sándwich ejemplares se describen por David et al en las patentes en EE UU No. 4.376.110 y 4.486.530. Se puede usar tinción con anticuerpo de células en portaobjetos en métodos bien conocidos en pruebas diagnósticas de laboratorio de citología, así como bien conocidas para los expertos en la materia.

Por tanto, en una forma de realización el ensayo es un ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción) que típicamente implica el uso de enzimas que dan un producto de reacción coloreado, habitualmente en ensayos en fase sólida. Enzimas tales como peroxidasa de rábano y fosfatasa se han empleado mucho. Una manera de amplificar la reacción de fosfatasa es usar NADP como un sustrato para generar NAD que ahora actúa como una coenzima para un segundo sistema enzimático. La pirofosfatasa de Escherichia coli proporciona un buen conjugado porque la enzima no está presente en tejidos, es estable y da un buen color de reacción. También se pueden usar sistema quimioluminiscentes basados en enzimas tal como luciferasa.

La conjugación con la vitamina biotina se usa con frecuencia ya que esta se puede detectar fácilmente por su reacción con avidina o estreptavidina unida a enzima a la que se une con gran especificidad y afinidad.

En una forma de realización alternativa, el ensayo usado para la detección de proteínas es convenientemente un ensayo fluorométrico. Por tanto, la fracción detectable del segundo agente de unión puede ser una fracción fluorescente, tal como un fluoróforo Alexa (por ejemplo, Alexa-647).

Preferiblemente, las etapas (c), (e) y/o (g) de los métodos descritos en el primer aspecto se realizan usando una matriz. La matriz puede ser una matriz basada en perlas o una matriz basada en superficie. La matriz se puede seleccionar del grupo que consiste en: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.

Las matrices por sí se conocen bien en la técnica. Típicamente, están formadas de una estructura lineal o bidimensional que tiene regiones (“manchas”) separadas (es decir, discretas), cada una tiene un área finita, formada en la superficie de un soporte sólido. Una matriz también puede ser una estructura de perla en donde cada perla se puede identificar por un código molecular o código de color o identificar en un flujo continuo. El análisis también se puede realizar secuencialmente donde la muestra se pasa sobre una serie de manchas cada una adsorbe la clase de moléculas de la solución. El soporte sólido típicamente es vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos, chips de silicio, microplacas, membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), membrana de nitrocelulosa, membrana de nailon, otra membrana porosa, membrana no poroso (por ejemplo, plástico, polímero, plexiglás, silicio, entre otros), una pluralidad de alfileres poliméricos, o una pluralidad de pocillos de microtitulación, o cualquier otra superficie adecuada para inmovilizar proteínas, polinucleótidos y otras moléculas adecuadas y/o llevar a cabo un inmunoensayo. Los procesos de unión se conocen bien en la técnica y en general consisten en entrecruzar uniendo covalentemente o adsorbiendo físicamente una molécula de proteína, polinucleótido o similar al soporte sólido. Alternativamente, se puede emplear acoplamiento de afinidad de las sondas a través de etiquetas de afinidad o construcciones similares. Al usar técnicas bien conocidas, tal como impresión sin contacto, enmascaramiento o fotolitografía, la localización de cada mancha se puede definir. Para revisiones véase Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) y Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(Supl 18):S143-9).

Típicamente la matriz es una micromatriz. En “micromatriz” se incluye el significado de una matriz de regiones que tiene una densidad de regiones discretas de al menos aproximadamente 100/cm2, y preferiblemente al menos 1000/cm2. Las regiones en una micromatriz tienen dimensiones típicas, por ejemplo, diámetro, en el intervalo de entre aproximadamente 10-250 |jm, y están separadas de otras regiones en la matriz por aproximadamente la misma distancia. La matriz puede ser alternativamente una macromatriz o una nanomatriz.

Una vez las moléculas de unión adecuadas (discutido anteriormente) se han identificado y aislado, el experto en la materia puede fabricar una matriz usando métodos bien conocidos en la materia de biología molecular.

En una forma de realización adicional o alternativa uno o más biomarcadores medidos en la etapa (c) comprenden o consisten en uno o más productos génicos homólogos expresados por células humanas. En una forma de realización adicional o alternativa uno o más biomarcadores medidos en la etapa (c) es una proteína o polipéptido. En una forma de realización adicional o alternativa uno o más biomarcadores medidos en la etapa (c) es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARNm o ADNc, etc.).

En una forma de realización adicional o alternativa el método se realiza in vitro, in vivo, ex vivo o in silico. Por ejemplo, el método se puede en particular realizar in vitro.

En “proteína de prueba” se incluye cualquier proteína o entidad proteinacea (o mezcla de proteínas o entidades proteinaceas) para la que se va a determinar un estado alergénico o de sensibilización.

En “alergénico” se incluye o se quiere decir una proteína (o mezcla de proteínas) que es un alergeno, y/o que es capaz de inducir una respuesta alérgica, en un mamífero.

En una forma de realización adicional o alternativa la alergenicidad comprende una respuesta de hipersensibilidad (por ejemplo, respuesta de hipersensibilidad celular). En una forma de realización adicional o alternativa la respuesta de hipersensibilidad es una respuesta de hipersensibilidad de tipo I. En una forma de realización adicional o alternativa la respuesta de hipersensibilidad es alergia respiratoria.

En una forma de realización adicional o alternativa, el método es para identificar el estado de sensibilización de una proteína en un mamífero. Por ejemplo, la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c) puede ser indicativa del estado de sensibilización de la proteína de prueba.

Mediante “sensibilización” se incluye o quiere decir si una proteína de prueba (o mezcla de proteínas de prueba) es un sensibilizador o no (por ejemplo, un sensibilizador de la piel y/o un sensibilizador respiratorio).

En una forma de realización adicional o alternativa, el método es para identificar proteínas que son capaces de inducir sensibilización respiratoria en un mamífero. Por ejemplo, la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c) puede ser indicativa del efecto sensibilizador respiratorio de la proteína de prueba.

En una forma de realización, el método es para identificar proteínas que son capaces de inducir una respuesta de hipersensibilidad respiratoria. Preferiblemente, la respuesta de hipersensibilidad es una respuesta de hipersensibilidad humoral, por ejemplo, una respuesta de hipersensibilidad de tipo I. En una forma de realización, el método es para identificar agentes capaces de inducir alergia respiratoria.

En “indicativo del efecto sensibilizador respiratorio de una proteína de prueba” se incluye determinar si la proteína de prueba es o no un sensibilizador respiratorio y/o determinar la potencia de la proteína de prueba como un sensibilizador respiratorio.

Mediante proteínas “capaces de inducir sensibilización respiratoria” se quiere decir cualquier proteína capaz de inducir y desencadenar una reacción de hipersensibilidad inmediata de tipo I en el aparato respiratorio de un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano. Preferiblemente, la reacción de hipersensibilidad inmediata de tipo I está mediada por CD y/o implica la diferenciación de células T a células Th2. Preferiblemente, la reacción de hipersensibilidad inmediata de tipo I produce inmunidad humoral y/o alergia respiratoria.

La zona conductora del pulmón mamífero contiene la tráquea, los bronquios, los bronquiolos, y los bronquiolos terminales. La zona respiratoria contiene los bronquiolos respiratorios, los conductos alveolares, y los alveolos. La zona conductora está hecha de vías respiratorias, no tiene intercambio de gas con la sangre, y está reforzada con cartílago con el fin de mantener abiertas las vías respiratorias. La zona conductora humidifica el aire inhalado y lo calienta a 37°C (99°F). También limpia el aire al eliminar partículas mediante cilios localizados en las paredes de todos conductos. La zona respiratoria es el sitio de intercambio de gas con la sangre.

En una forma de realización, la proteína “capaz de inducir sensibilización respiratoria” es una proteína capaz de inducir y desencadenar una reacción de hipersensibilidad inmediata de tipo I en un sitio del epitelio pulmonar en un mamífero. Preferiblemente, el sitio del epitelio pulmonar está en la zona respiratoria del pulmón, pero puede alternativa o adicionalmente estar en la zona conductora del pulmón.

En una forma de realización adicional o alternativa, el método es para identificar proteínas alimentarias que son alergénicas en un mamífero. Preferiblemente, la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c) puede ser indicativa de la alergenicidad de la proteína alimentaria. Preferiblemente, la alergenicidad de la proteína alimentaria es debido a una respuesta de hipersensibilidad de tipo 1.

El mamífero puede ser cualquier animal doméstico o de granja. Preferiblemente, el mamífero es una rata, ratón, cobaya, gato, perro, caballo o un primate. Los más preferiblemente, el mamífero es humano.

En una forma de realización adicional o alternativa, la población de células dendríticas o población de células similares a dendríticas comprende o consiste en células inmortales. Mediante “ inmortal” se quiere decir células que no están limitadas por un punto en el que ya no pueden seguir dividiéndose, que podría de otra manera ser debido a daño en el ADN o telómeros acortados.

En una forma de realización adicional o alternativa, la población de células dendríticas o población de células similares a dendríticas comprende o consiste en células no naturales. Mediante células “no naturales” se quiere decir que las células son diferentes de, modificadas a partir de, o variante de, las que se encontrarían en la naturaleza; en otras palabras, no son células que normalmente se producirían en la naturaleza.

En una forma de realización adicional o alternativa, la población de células dendríticas o población de células similares a dendríticas es una población de células similares a dendríticas. En una forma de realización adicional o alternativa, las células similares a dendríticas son células similares a dendríticas mieloides. En una forma de realización adicional o alternativa, las células similares a dendríticas mieloides están derivadas de células dendríticas mieloides. En una forma de realización adicional o alternativa, las células derivadas de células dendríticas mieloides son células derivadas de leucemia mieloide. En una forma de realización adicional o alternativa, las células derivadas de leucemia mieloide se seleccionan del grupo que consiste en KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 y MUTZ-3. En una forma de realización adicional o alternativa, las células dendríticas con células MUTZ-3. Las células MUTZ-3 son células de leucemia mielomonocítica aguda humana que están disponibles de la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Alemania (www.dsmz.de; DMSZ No. ACC 295).

Mediante “células similares a dendríticas” se quiere decir células no dendríticas que muestran características funcionales y fenotípicas específicas a células dendríticas tal como características morfológicas, expresión de moléculas coestimuladoras y moléculas de MHC de clase II, y la capacidad para pinocitar macromoléculas y para activar células T en reposo.

En una forma de realización, las células similares a dendríticas, después de la estimulación con citoquinas, presentan antígenos a través de CD1d, MHC de clase I y II y/o inducen la proliferación de células T específicas.

En una forma de realización, las células similares a dendríticas son progenitores de células dendríticas CD34+. Opcionalmente, los progenitores de células dendríticas CD34+ pueden adquirir, tras estimulación con citoquina, los fenotipos de presentar antígenos a través de CD1d, MHC de clase I y II, inducir proliferación de células T específicas, y/o mostrar un perfil transcripcional y fenotípico maduro tras estimulación con mediadores inflamatorios (es decir, fenotipos similares a células dendríticas inmaduras o células dendríticas de tipo Langerhans).

En una forma de realización, la población de células dendríticas o células similares a dendríticas es una población de células dendríticas. Preferiblemente, las células dendríticas son células dendríticas primarias. Preferiblemente, las células dendríticas son células dendríticas mieloides.

Las células dendríticas se pueden reconocer por función, por fenotipo y/o por patrón de expresión génica, en particular por fenotipo de superficie celular. Estas células se caracterizan por su morfología distintiva, altos niveles de expresión de MHC de clase II en superficie y la capacidad para presentar antígenos a células T CD4+ y/o CD8+, en particular células T indiferenciadas (Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).

La superficie celular de células dendríticas es inusual, con proyecciones de tipo velo características, y se caracteriza por expresión de los marcadores de superficie celular CD11c y MHC de clase II. La mayoría de las c D son negativas para marcadores de otros linajes de leucocitos, incluyendo, células T, células B, monocitos/macrófagos, y granulocitos. Subpoblaciones de células dendríticas también pueden expresar marcadores adicionales incluyendo 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8alfa, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123 (IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-cadherina, langerina, receptor de manosa, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, y varias lectinas.

Los patrones de expresión de estos marcadores de superficie celular pueden variar junto con la madurez de las células dendríticas, su tejido de origen, y/o sus especies de origen. Las células dendríticas inmaduras expresan bajos niveles de MHC de clase II, pero son capaces de endocitar proteínas antigénicas y procesarlas para presentación en un complejo con moléculas de MHC de clase II. Las células dendríticas activadas expresan altos niveles de MHC de clase 11, ICAM-1 y CD86, y son capaces de estimular la proliferación de células T alogénicas indiferenciadas, por ejemplo, en una reacción mixta de leucocitos (MLR).

Funcionalmente, las células dendríticas o células similares a dendríticas se pueden identificar por cualquier ensayo conveniente para la determinación de presentación de antígenos. Tales ensayos pueden incluir ensayar la capacidad para estimular células T sensibilizadas con antígeno y/o indiferenciadas por presentación de un antígeno de prueba, seguido por la determinación de proliferación de células T, liberación de IL-2, y similares.

Los expertos en la materia conocen bien métodos de detectar y/o medir la concentración de proteína y/o ácido nucleico, véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Los métodos preferidos para la detección de proteína incluyen inmunotransferencia, transferencia tipo North-West, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), micromatriz de anticuerpos, micromatriz de tejidos (TMA), inmunoprecipitación, hibridación in situ y otras técnicas inmunohistoquímicas, radioinmunoensayo (RIA), ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA), incluyendo ensayos en sándwich usando anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Los ensayos en sándwich ejemplares se describen por David et al en las patentes en EE UU No. 4.376.110 y 4.486.530. Se puede usar tinción con anticuerpo de células en portaobjetos en métodos bien conocidos en pruebas diagnósticas de laboratorio de citología, así como para los expertos en la materia.

Típicamente, ELISA implica el uso de enzimas que dan un producto de reacción coloreado, habitualmente en ensayos en fase sólida. Enzimas tales como peroxidasa de rábano y fosfatasa se han empleado mucho. Una manera de amplificar la reacción de fosfatasa es usar NADP como un sustrato para generar NAD que ahora actúa como una coenzima para un segundo sistema enzimático. La pirofosfatasa de Escherichia coli proporciona un buen conjugado porque la enzima no está presente en tejidos, es estable y da un buen color de reacción. También se pueden usar sistemas quimioluminiscentes basados en enzimas tal como luciferasa.

En una forma de realización alternativa, el método comprende una o más de las siguientes etapas:

(i) cultivar células dendríticas o similares a dendríticas;

(ii) sembrar las células de (i) en uno o más pocillos, preferiblemente en la fase de crecimiento de estado estacionario, por ejemplo, pocillos de una o más placas de ensayo multipocillo;

(iii) añadir a uno o más pocillo(s) de (ii) la(s) proteína(s) que se va(n) a ensayar;

(iv) añadir a uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) control(es) positivo(s), por ejemplo, Der p 1 y/o Der p 7;

(v) añadir a uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) control(es) negativo(s), por ejemplo, DMSO; y/o dejar uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) sin estimular para obtener un control de medio;

(vi) incubar las células en los pocillos de (iii)-(v), preferiblemente durante aproximadamente 24 horas; y, opcionalmente, recoger las células de los pocillos de (iii)-(v); y además opcionalmente, retirar el sobrenadante y almacenar en reactivo TRIzol;

(vii) aislar ARN total purificado de las células de (vi) y, opcionalmente, convertir el ARNm a ADNc;

(viii) cuantificar los niveles de expresión de trascritos de ARNm individuales de (vii), por ejemplo, usando una matriz, tal como una matriz Affymetrix Human Gene 1.0 ST;

(ix) exportar y normalizar los datos de (viii), por ejemplo, usando algoritmos apropiados;

(x) aislar datos de (ix) que se originan de biomarcadores de la firma de predicción de alergenos proteicos GARD (es decir, los biomarcadores de la tabla A);

(xi) aplicar un modelo de predicción a los datos de (x), por ejemplo, un modelo SVM congelado previamente establecido y entrenado en datos históricos, por ejemplo, datos obtenidos en el ejemplo 1, para predecir la alergenicidad (por ejemplo, clasificar como alergeno/no alergeno), de proteína(s) ensayada(s) y control(es) negativo(s)/positivo(s).

Un segundo aspecto de la invención proporciona una matriz para uso en el método según el primer aspecto de la invención, la matriz comprende 23 o más fracciones de unión como se definen en el primer aspecto de la invención, en donde las 23 o más fracciones de unión incluyen fracciones de unión con especificidad para cada uno de los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjunto de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

En una forma de realización adicional o alternativa la matriz consiste en cada uno de los biomarcadores como se definen en el primer aspecto de la invención.

En una forma de realización adicional o alternativa, la una o más fracciones de unión están inmovilizadas.

En una forma de realización adicional o alternativa, la matriz es una matriz basada en perlas. En una forma de realización adicional o alternativa, la matriz es una matriz basada en superficie.

En una forma de realización adicional o alternativa, la matriz se selecciona del grupo que consiste en: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.

La matriz puede comprender o consistir en una selección particular de fracciones de unión específicas de biomarcadores que se correlacionan con cualquier selección particular de biomarcadores como se define en el primer aspecto.

Un tercer aspecto de la invención proporciona el uso de 23 o más biomarcadores como se define en el primer aspecto de la invención para determinar la alergenicidad de una proteína, en donde los 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A incluyen los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjunto de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

En una forma de realización adicional o alternativa, se proporciona el uso de 23 o más fracciones de unión cada una con especificidad para un biomarcador seleccionado del grupo definido en la tabla A para determinar la alergenicidad de una proteína, preferiblemente en donde tres o más de las fracciones de unión tienen especificidad por un biomarcador seleccionado del grupo definido en la tabla A(i).

Un cuarto aspecto de la invención proporciona un kit analítico para uso en un método según el primer aspecto de la invención que comprende:

(a) una matriz según el segundo aspecto de la invención; e

(b) instrucciones para realizar el método definido en el primer aspecto de la invención (opcional).

En una forma de realización adicional o alternativa, el kit analítico además comprende uno o más agentes de control como se define en el primer aspecto de la invención.

También se divulga en el presente documento, y sin formar parte de la invención reivindicada, un método de tratar o prevenir una reacción alérgica (por ejemplo, reacción de hipersensibilidad de tipo I, tal como asma respiratoria) en un paciente que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una o más proteínas de prueba a las que el paciente está o ha estado expuesto;

(b) determinar si la una o más proteínas de prueba proporcionadas en la etapa (a) es alergénica usando un método de la presente invención; y

(c) donde una o más proteínas de prueba se identifica como alergénica, reducir o prevenir la exposición del paciente a la una o más proteínas de prueba y/o proporcionar tratamiento apropiado para los síntomas de alergenicidad.

Preferiblemente, la una o más proteínas de prueba a las que el paciente está o ha estado expuesto es una proteína a la que el paciente está actualmente expuesto al menos una vez al mes, por ejemplo, al menos una vez cada dos semanas, al menos una vez cada semana, o al menos una vez cada día.

Los tratamientos de los síntomas de alergia pueden incluir, por ejemplo, agonistas de beta-2-adrenoceptor de corta duración (SABA), tal como salbutamol; medicaciones anticolinérgicas, tal como bromuro de ipratropio; otros agonistas adrenérgicos, tal como epinefrina inhalada; corticoesteroides, tal como beclometasona; agonistas de betaadrenoceptor de acción prolongada (LABA) tal como salmeterol y formoterol; antagonistas de leucotrienos tal como montelukast y zafirlikast; los estabilizantes de células cebadas (tal como cromolina sódica) son otra alternativa no preferida a los corticoesteroides; antihistaminas; terapias de desensibilización a través de exposición prolongada de baja concentración; inyecciones de epinefrina (para síntomas de choque anafiláctico agudo); y/o evitar el agente sensibilizante.

Preferiblemente, el método de tratamiento es consistente con el método descrito en el primer aspecto de la invención, y una o más de las formas de realización descritas en el mismo.

También se divulga en el presente documento, y sin formar parte de la invención reivindicada, un programa informático para operar los métodos de la invención, por ejemplo, para interpretar los datos de expresión de la etapa (c) (y posteriores etapas de medida de la expresión) y determinar mediante ello si una o más proteína de prueba es alergénica. El programa informático pude ser una SVM programada. El programa informático se puede registrar en un soporte legible por ordenador adecuado que conocen los expertos en la materia. Los soportes legibles por ordenador adecuados pueden incluir discos compactos (incluyendo CD-ROM, DVD, Blue Ray y similares), disquetes, unidades de memoria flash, unidades ROM o de discos duros. El programa informático se puede instalar en un ordenador adecuado para ejecutar el programa informático.

El experto en la materia apreciará que se pueden usar todas las formas de realización no contradictorias en combinación. Por tanto, las formas de realización de un aspecto de la invención se pueden aplicar igualmente a un segundo aspecto de la invención.

Ahora se describirán ejemplos preferidos, no limitantes que representan ciertos aspectos de la invención, con referencia a las siguientes figuras.

Figura 1. Gráfico del análisis de componentes principales que visualiza diferencias en los niveles de expresión de transcrito basado en al menos muestras biológicas triplicadas tratadas con las sustancias indicadas (ANOVA multigrupo que compara tratamientos; FDR = 0,01, 1037 genes. Sin est = células control “tratadas” solo con medio de cultivo celular (vehículo)).

Figura 2. Gráfico del análisis de componentes principales que visualiza diferencias en los niveles de expresión de transcrito de todas las 33 muestras (al menos triplicados biológicos tratados con las sustancias indicadas) basado en un aporte de los 391 biomarcadores potenciales identificados. Sin est = células control “tratadas” solo con medio de cultivo celular (vehículo)).

Figura 3. Se realizó una serie de validaciones cruzadas dejando uno fuera. Para cada ejercicio de validación cruzada, todos los replicados del tratamiento indicado se retiraron y el procedimiento de eliminación hacia atrás se realizó como se describe en Materiales y Métodos. Las predicciones resultantes para el tratamiento respectivo se presentan como diagramas de cajas que representan valores de decisión de máquina de vector soporte (SVM) para cada replicado. Los DV negativos corresponden a no alergenos, los DV positivos a alergenos.

Figura 4. Resultados del análisis Key Pathway Advisor en 27 rutas significativamente reguladas usando los 391 transcritos como aporte, que se identificaron por una comparación de dos grupos entre seis alergenos proteicos y controles seguido por la aplicación de un algoritmo de eliminación hacia atrás.

Figura 5. Resultados de análisis Key Pathway Advisor basado en un aporte de los 272 transcritos más significativos resultante de una comparación de dos grupos de muestras control sin estimular y muestras tratadas con proteasa. Se presentan las rutas más significativas (Unión valor p < 0,001, correspondiente a un -log valor p de 3).

Figura 6. Cambios en los niveles de expresión en superficie celular de CD86, CD14, CD1a, y HLA-DR en células MUTZ-3 estimuladas con las sustancias indicadas durante 24 horas determinado por citometría de flujo (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar). Los datos se normalizan a la muestra control (sin estimular) respectiva (control = 100%). IFM = Intensidad de fluorescencia media.

Figura 7. Cambios en los niveles de Rantes y MIP-1a en sobrenadantes de MUTZ-3 después de estimulación con las sustancias indicadas durante 24 horas, determinado por tecnología Bio-Plex® (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar).

Figura 8. Cambios en los niveles de las citoquinas indicadas en sobrenadantes de MUTZ-3 después de estimulación con las sustancias indicadas durante 24 horas, determinado por tecnología Bio-Plex® (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar).

Figura 9. Viabilidad evaluada con tinción de yoduro de propidio y citometría de flujo; las células se trataron con las sustancias indicadas durante 24 horas (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar).

Figura 10. Cambios en los niveles de proteína GM-CSF en sobrenadantes de MUTZ-3 después de estimulación con las sustancias indicadas durante 24 horas, determinado por tecnología Bio-Plex® (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar). GM-CSF era parte del medio de cultivo completo (añadido a 40 ng/ml) en todas las muestras, lo que se refleja por valores fuera de rango (oor) de la parte superior de la curva estándar (barra izquierda), las proteasas parecen degradar GM-CSF (barra media y derecha).

Figura 11. Datos de expresión en micromatriz de ARN de las citoquinas indicadas (n = 3, las barras de errores muestran las desviaciones estándar. Los datos de micromatriz se normalizan usando el algoritmo scan [48, 49], y, por tanto, no se debe interpretar de una manera lineal).

Figura 12. Valores de decisión de la firma de predicción de alergenos proteicos (PAPS) GARD para muestras biológicas triplicadas de sustancias de prueba.

Ejemplo 1

Introducción

La alergia es una enfermedad crónica con prevalencia creciente y es de la mayor importancia para la industria y las autoridades identificar potenciales alergenos tan pronto como sea posible para limitar la exposición de trabajadores y las poblaciones generales. Se sabe que varios cientos de sustancias químicas son capaces de producir dermatitis de contacto alérgica [1, 2], un tipo de reacción de hipersensibilidad retrasada de tipo iV, mientras se conocen menos sustancias químicas que sensibilizan el aparato respiratorio e inducen respuestas alérgicas de tipo I [3]. La mayoría de las sustancias que producen alergia respiratoria son proteínas de origen medioambiental, por ejemplo, alergenos de las heces de los ácaros del polvo domésticos, polen, u hongos, mientras otras están presentes en un marco ocupacional tal como enzimas usadas en la producción de aromas, fragancias, detergentes y fármacos [4, 5]. El riesgo de desarrollar reacciones adversas después de exposición ocupacional existe; por tanto, un foco estricto en la seguridad ocupacional es obligatorio. Se ha observado sensibilización para trabajadores expuestos a ciertas enzimas industriales tal como a-amilasa, proteasas, pancreatinina, y tripsina [6, 7]. Se desarrollan nuevas enzimas continuamente para aplicaciones existentes, así como para nuevas, tal como enzimas genéticamente modificadas usadas en el procesamiento de alimentos y producción de aromas y también pueden producir riesgos de salud ocupacional [5, 7].

Hasta la fecha, no hay disponible ningún ensayo validado específicamente para predecir el potencial de sensibilización de nuevas proteínas, haciendo que un enfoque de peso de evidencia sea el medio más aceptable de evaluación de seguridad de alergia. Sin embargo, hay un consenso creciente de que el potencial alergénico de compuestos, incluyendo proteínas, se debería evaluar con respecto a sus características bioquímicas y el potencial de la proteína para inducir una respuesta inmunitaria específica (Proyecto europeo COST impARAS [8]). Una combinación de rasgos físicos de proteínas, la interacción molecular entre células humanas y proteínas, así como su impacto en interacciones célula-célula desempeña un papel en entender y eventualmente predecir la alergenicidad de proteínas [9, 10].

El concepto de ruta de desenlace adverso (AOP) es un marco para recoger y organizar información relevante para un desenlace adverso a diferentes niveles de organización biológica [11]. Estas OAP se basan en información disponible en relaciones sustancia-respuesta y respuesta-respuesta y permiten el desarrollo de métodos de ensayo y enfoques sin animales predictivos relevantes, así como la contextualización de los resultados a través de una gama diversa de mecanismos biológicos y criterios de valoración de toxicidad. Los mecanismos que dirigen la sensibilización respiratoria no están completamente divulgados aún, pero surgen datos que sugieren que los sucesos que dirigen la sensibilización respiratoria y de la piel se pueden estructurar en la misma ruta de desenlace adverso (AOP). En contraste a la sensibilización de la piel, aún no están disponibles métodos de prueba apropiadamente evaluados que abordan los sucesos clave de la inducción de sensibilización respiratoria [12].

El ensayo de Detección Rápida de Alergenos Genómico (GARD) se desarrolló inicialmente para proporcionar información sobre la capacidad de sustancias químicas para inducir sensibilización en la piel (precisión: 89% [13, 17]). Este ensayo in vitro utiliza una línea celular mieloide que se parece a células dendríticas (CD) como un sistema modelo. Las CD son células presentadoras de antígenos y centrales para la inducción y regulación de respuestas inmunitarias adaptativas [14]. Este ensayo fue reconocido tanto por el Laboratorio de Referencia Europeo - Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (EURL-ECVAM) como la OCDE como un método valioso para abordar el suceso clave 3 (activación y maduración de células dendríticas) de la AOP para sensibilización de la piel [15]. Forreryd et al., [16] demostraron con éxito que un protocolo modificado del ensayo es capaz de predecir sensibilizadores químicos respiratorios con una precisión del 84% basado en una firma de biomarcadores que consiste en 389 transcritos.

En este ejemplo, este protocolo se evalúa para su capacidad de proporcionar un entendimiento mecanicista de la sensibilización de proteína a nivel de CD. Se identificó un potencial perfil génico para las clasificaciones de alergenos proteinaceos. Para este fin, se investigó el efecto de ocho alergenos proteicos respiratorios en la expresión génica en la línea celular mieloide usando tecnología de matriz de expresión de ARN Affymetrix. Un panel de potenciales biomarcadores que distinguen los alergenos de muestras control se identificó usando enfoques dirigidos por datos incluyendo aprendizaje automático, y ejercicios de validación cruzada indicó que los transcritos identificados son en efecto útiles para clasificación. Estos biomarcadores se investigaron adicionalmente con respecto a rutas biológicas asociadas.

Materiales y Métodos

Alergenos respiratorios

Todos los alergenos contienen bajos niveles de endotoxina como se resume en la tabla 1. Der p 7 recombinante LoToxTM (#LTR-DP7-1) y Der p 1 natural LoToxTM (#LTN-DP1-1) se obtuvieron de Indoor biotecnologies, Charlottesville, EE UU. Los otros alergenos fueron suministrados por Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca, y se ensayaron para contenido de endotoxina por Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Bakteriologiska laboratoriet, Goteborg.

Tabla 1. Identidad y concentraciones de alérgenos y controles

Cultivo celular y estimulaciones

El mantenimiento de la línea celular se realizó como se describe en [17]. Brevemente, las células derivadas MUTZ-3 se cultivaron en modificación MEM alfa (Nordic Biolabs/GE Healthcare Bio-Sciences, Taby, Suecia) suplementado con suero bovino fetal (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Estocolmo, Suecia) al 20% y g M-CSF humano recombinante (Miltenyi Biotec Norden AB, Lund, Suecia) 40 ng/ml. Se realizó un experimento de encontrar dosis basado en protocolos anteriores optimizados para esta línea celular para identificar la mayor concentración de enzima resultante en una viabilidad celular relativa de > 90% después de 24 horas de incubación. Exposiciones más largas (48 horas) a ciertas enzimas produjeron viabilidad celular sustancialmente disminuida (datos no mostrados). Se llevó a cabo un análisis de control fenotípico de células antes de cada experimento por citometría de flujo (véase posteriormente) con el fin de asegurar un estado inmaduro. Brevemente, tres lotes de células se expusieron a alergenos y sustancias control disueltas en medio de cultivo celular completo durante 24 horas en al menos tres experimentos independientes (Tabla 1). Las proteínas presentes en suero sirvieron como controles de proteínas no alergénicas. Los controles fenotípicos y la viabilidad celular se evaluaron después del periodo de estimulación analizando expresión en superficie celular usando citometría de flujo como se describe a continuación. Las células destinadas a extracción de ARN se lisaron en TRIzol® (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE UU) y se almacenaron hasta uso adicional a menos 20°C.

Citometría de flujo

Como un control de calidad tanto antes de como durante los experimentos, los siguientes anticuerpos monoclonales se usaron durante el análisis fenotípico como se describe previamente [18]: CD1a (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), CD34, CD86, HLA-DR (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), todos conjugados a FITC; CD14 (DakoCytomation), CD54, CD80 (BD Biosciences), todos conjugados a PE. Se usaron IgG1 de ratón conjugada a FITC y PE (BD Biosciences) como controles de isotipo y se incluyó yoduro de propidio como un marcador para células no viables (BD Biosciences). Después de 24 horas de incubación con los alergenos y muestras control, se evaluaron la viabilidad, y la expresión de CD14, CD1a, HLA-DR y CD86. Las muestras de FACS se analizaron en un instrumento FACSCanto II con software FACS Diva para adquisición de datos. Se adquirieron 10000 sucesos y se realizó análisis adicional en FCS Express V4 (De Novo Software, Los Ángeles, CA). Se incluyó una estimulación con endotoxina como un control interno para calidad celular.

Extracción de ARN, ADNc e hibridación en matriz

El aislamiento de ARN de células lisadas en TRIzol® se realizó según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADN sentido marcado según los protocolos de Affymetrix usando los kits y controles recomendados. El ADNc se hibridó con las matrices Human Gene 1.0 ST y se procesó y escaneó adicionalmente como recomienda el suministrador (Affymetrix, Cleveland, EE UU).

Adquisición y análisis de datos

El conjunto de datos, que comprendía 33 muestras en total, se sometió a control de calidad y después se normalizó usando normalización de matriz de canal único [19, 20]. El análisis estadístico se realizó principalmente por análisis de variación (ANOVA). Se realizaron ANOVA y visualización PCA de los resultados con Qlucore 3.2 (Qlucore AB, Lund, Suecia). La significancia se evaluó con el valor p corregido por múltiple hipótesis (valor q, en este artículo denominado como tasa de descubrimientos falsos (FDR) [21]). Una FDR < 0,05 se consideró como estadísticamente significativa. Los valores de decisión se calcularon en un modelo de máquina de vector soporte (SVM) [22], construida en R (R Development Core Team, 2008) y usando el paquete e1071 (paquete R e1071). Se usó el mismo paquete R para programar el algoritmo de eliminación hacia atrás [23]. El algoritmo de eliminación hacia atrás se aplicó a un conjunto de datos que consistía en nueve muestras de no alergenos y 24 de alergenos y los 1052 genes más significativos basado en una comparación de dos grupos entre alergenos y controles (p= 0,007, FDR = 0,19212). Se realizaron validaciones cruzadas de una manera similar basado en una entrada donde un tratamiento cada vez se ha eliminado. Toda computación y manejo estadístico adicional de los datos se realizó en Excel (Microsoft Office 2013) y R (www.R-project.org).

Análisis de citoquinas en Bio-Plex 200

Los sobrenadantes celulares se analizaron usando un sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad, Hercules, EE UU) con el kit Novex® Human Cytokine Magnetic 30-Plex Panel (# LHC6003M, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE UU) según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron triplicados biológicos, basados en tres lotes de células, en duplicados técnicos (CV máxima aceptada fue del 20%) y se aceptaron concentraciones en intervalo según el software Bio-Plex 200 Manager 6.1 (Bio-Rad, Hercules, EE UU) a menos que se indique otra cosa. Los datos se presentan como valores medios; las barras de error representan desviaciones estándar. Debido a un número limitado de muestras (triplicados biológicos, duplicados técnicos) y datos distribuidos no normalmente, no es apropiado proporcionar los valores p como una medida de significancia estadística. Se incluyó una estimulación con endotoxina como un control de ensayo interno.

Análisis de rutas clave

Se usaron las versiones 16.4 16.6 de la herramienta Key Pathway Advisor (KPA) [24] para investigar los 391 genes identificados (mostrados en la tabla A) que comprende la firma de predicción de proteínas en un contexto biológico. KPA asocia, por ejemplo, genes diferencialmente expresados derivados de datos de micromatriz de ARN con procesos tanto anteriores como posteriores con el fin de permitir interpretación biológica. El conjunto de datos investigado consistía en 33 muestras, que comprenden alergenos y muestras control en al menos tres replicados diferentes. Se usaron tanto valores p como veces de cambio como entrada en base a una comparación de dos grupos entre alergenos y no alergenos (Key Hubs Calculation Algorithm: análisis de razonamiento causal; umbral de valor p de Key Hubs = 0,01; umbral de valor p de procesos clave = 0,05; ID no reconocidos: 105). Se realizó un análisis usando los mismos parámetros con 272 genes como entrada, lo que produjo como los genes más significativos de un filtrado de valor p de muestras de proteasa frente a sin estimular (p = 0,001335, FDR = 0,05) basado en un conjunto de datos prefiltrado por varianza que contenía 10054 variables. Se predijeron 254 centros clave y nueve ID no se reconocieron.

Scripts

Se enumeran a continuación los detalles del script, escrito en código R, usados para realizar el método:

# Required files:

# - GARD_PAPS.R

# - raw affymetrix files of test samples in subdir: raw_affy/

# - Annotation of the new data describing the unstimulated samples raw_affy/annotation.rds

# - Historical data stored in trainingset.rds

# Load required dependencies

source('~/GARD_PAPS.R')

# Read Training Data

train = readRDS(1-/trainingset.rds')

# Read new data and annotations

new_data = read_raw_affy('~/raw_affy/*.CEL')

new_data_ref = readRDS(’~/raw_affy/annotation.rds'}

# Normalize the new data

normalized_data = normalize_train_test(train = train, test = new_data, test_reference = new_data_ref)

# Train model on historical data

model = train___svm(normalized_data$train)

# Predict New Samples

predictions = predict_test_samples(model = model, data=normalized_data$test)

Resultados

Análisis estadístico de los datos de matrices de expresión

El conjunto de datos consistía en 33 muestras en total, nueve controles no alérgenos y 24 muestras de alérgenos (Tabla 1). Cuando se comparan estos dos grupos (es decir, controles, “sin estimular” y “DMSO”, frente a alergenos), no se pudieron detectar genes significativamente regulados basado en una tasa de descubrimientos falsos (FDR) de 0,05. Con un valor de corte elegido de p = 0,0001 (FDR = 0,0847), quedaron 31 variables. Esto indica que solo existen diferencias menores entre el grupo de alergenos proteicos y controles no alergenos. Cuando se comparan todos los tratamientos entre si (ANOVA multigrupo, FDR = 0,01), se identificaron 1037 genes significativamente regulados. Todas las muestras se agrupan bastante estrechamente excepto las proteasas como se presenta en un gráfico de análisis de componentes principales (PCA) en la figura 1, lo que indica que los patrones de expresión de ARN inducidos por cada proteasa se diferencian algo de todas las otras muestras.

Identificación de una firma de predicción de alergeno proteico

Con el fin de desarrollar un enfoque de clasificación, se usó un llamado método envolvedor para identificar los genes más relevantes para distinguir alergenos de no alergenos después de filtrado del valor p inicial. El algoritmo de eliminación hacia atrás [23] usado basado en predicciones de máquina de vector soporte (SVM) [25] produce una lista optimizada de genes. Cada gen o característica en esta lista se ha evaluado no solo por su importancia para la clasificación misma, sino también cómo rinde junto con las otras características. Usando una entrada de los 1052 genes más significativos, basado en una comparación de dos grupos (alergeno frente a no alergeno, p = 0,007, FDR = 0,19), los algoritmos identificaron una firma consistente en 391 genes (véase la tabla A). Cuando el conjunto de datos se visualiza por PCA usando estos potenciales biomarcadores como entrada, se puede ver una separación clara entre alergenos y no alergenos (Fig. 2).

Con el fin de estimar la precisión del modelo y para asegurar que los resultados presentados no se alcanzaron por casualidad, se realizó una serie de validaciones cruzadas dejando uno fuera. Para cada ejercicio de validación cruzada, todos los replicados de una estimulación se eliminaron y el procedimiento de eliminación hacia atrás se repitió como se describe anteriormente. La firma génica obtenida se usó después para predecir las muestras dejadas fuera usando un modelo SVM basado en un conjunto de entrenamiento consistente en las muestras restantes en el conjunto de datos. Todas las estimulaciones se eliminaron a la vez excepto “sin estimular”; sin las muestras “sin estimular”, el conjunto de datos estaría demasiado desequilibrado para usarse para entrenamiento del un modelo. Las predicciones de SVM resultantes se visualizan como diagramas de cajas en la figura 3. Todos los alergenos se predijeron correctamente como tal por votación por mayoría, incluso aunque un replicado cada uno para lipasa y Der p 7 se predijo como no alergeno (valor de decisión negativo). Las predicciones de SVM también se realizaron después de un ejercicio similar basado en un conjunto de datos donde las muestras de DMSO y Der p 1 se dejaron fuera y posteriormente se usaron como un conjunto de prueba. También aquí, DMSO se clasificó correctamente como no alérgeno y Der p 1 como alergeno (datos no mostrados).

El análisis de rutas biológicas revela asociación de listas de genes con regulación de ruta inmunológica

La asociación de los 391 biomarcadores identificados con rutas biológicas se investigó usando la herramienta Key Pathway Advisor, y la lista de genes junto con los valores p asociados y veces de cambio basado en una comparación de dos grupos (alergeno sí/no) se usaron como entrada. De en total 27 rutas significativas identificadas (Fig. 4), aproximadamente un tercio se asignó a rutas relacionadas con el sistema inmunitario, por ejemplo, rutas de señalización de IL-3, IL-5, IL-6, IL-15, IL-17 e IL-18. Ejemplos de centros clave sugeridos, todos con actividad aumentada, eran MHC de clase I, variantes de NFKp p50 y p50/p65, IL-10, IL-6R, IL-10R, FcYRIIa, glutarredoxina, e integrinas a6p4 y a2B.

Cuando se investigaron las rutas biológicas basadas en una comparación entre proteasas y muestras sin estimular y los 272 genes más significativos resultantes, se identificaron 59 rutas significativas y más del 40% están relacionadas con respuestas inmunitarias juzgado por su nombre (Fig. 5), por ejemplo, señalización de IL-2, IL-10, IL-33 y CD40. Además, “quimiotaxia inducida por c CR4 de células inmunitarias”, “quimiotaxia de células inmunitarias dependiente de CCR4 en asma y dermatitis atópica” y rutas relacionadas con NFkB están asociadas con respuestas inflamatorias. NFkB también aparecía como un centro clave predicho, junto con otras moléculas tal como MyD88, una proteína adaptadora usada por casi todos los TLR para activar NFkB. El receptor tipo Toll 4 y caja-1 del grupo de alta movilidad (HMGB1), un regulador transcripcional implicado en inflamación y diferenciación celular, eran dos ejemplos más de centros clave predichos.

Los alergenos proteicos afectan tanto la expresión de marcadores de superficie como citoquinas secretadas

Como complemento al análisis transcripcional, se investigaron los efectos en el nivel de proteínas por FACS, enfocándose en un conjunto de marcadores de diferenciación y activación como se describe en la figura 6. Todas las células eran positivas para HLA-DR en el control sin estimular, así como después de exposición a todas las sustancias (datos no mostrados). No hubo alergeno proteico que redujese la presencia de ningún marcador investigado; sin embargo, proteasa 1 parecía aumentar la expresión de, por ejemplo, CD86, un marcador de activación conocido. Notablemente, la viabilidad relativa después de los tratamientos fue > 90% (Fig. 9). Cuando se cribaron 30 citoquinas solubles usando tecnología Bio-Plex®, el tratamiento con Der p 1 y amilasa aumentaron los niveles de MIP-1a y Rantes en sobrenadantes (Fig. 7). Las proteasas redujeron los niveles de varias citoquinas; probablemente al menos para algunas por degradación apoyado por los resultados para GM-CSF. GM-CSF se añade al medio celular a 40 ng/ml, pero después de la incubación con las proteasas, los valores disminuían a unos poco pg/ml (proteasa 2) y a aproximadamente 500 pg/ml (proteasa 1), respectivamente (Fig. 10), mientras los valores de todos los otros alergenos y controles estaban como se esperaba fuera de rango en el límite superior. Sin embargo, las proteasas aumentaron los niveles de, por ejemplo, IL-8 (Fig. 8), y el tratamiento con proteasa 1 indujo mayores niveles de Rantes (Fig. 7A), IL-12, MCP-1 y niveles de IL-1RA (Fig. 8). Los datos en expresión de proteína de citoquinas en parte se correlacionaban con los cambios en el nivel de ARN (Fig. 11).

Discusión

En este ejemplo, se describe el desarrollo de un método in vitro para la predicción de alergenos proteicos usando ocho alergenos respiratorios conocidos como sustancias modelo. Usando enfoques dirigidos por datos basados en aprendizaje automático, se identificó una lista de biomarcadores (Tabla A), que se investigó adicionalmente con respecto a rutas biológicas asociadas.

Comparando el patrón de expresión de ARN de células expuestas a controles y las expuestas a los alergenos proteicos respiratorios, no se pudieron observar transcritos significativamente regulados basado en una FDR de 0,05. Esto podría ser debido a varios factores, por ejemplo, diferencias relativamente pequeñas entre los grupos, pero también a alta variación en los cambios transcripcionales inducidos por las enzimas estructural y funcionalmente diferentes. Inesperadamente, incluso cuando se compraran los controles positivos pretendidos, Der p 1 y Der p 7, por separado a las muestras control sin estimular, no se pudieron identificar genes significativamente regulados. A nivel de proteína, sin embargo, Der p 1 parecía aumentar los niveles de las citoquinas Rantes y MIP-1a (Fig. 7), que sería consistente con una respuesta proinflamatoria inducida por Der p 1 [26, 27]. Como las endotoxinas incluso a bajas concentraciones puede activar células es importante considerar sus efectos ya que pueden eliminar señales de alergenos. Der p 1 y Der p 7 se han obtenido, por tanto, como preparaciones de “baja endotoxina”; no obstante, contienen las mayores cantidades de endotoxina de todas las muestras considerando las concentraciones finales (Tabla 1, 0,75 UE/ml y 0,25 UE/ml, respectivamente). En comparación, los niveles estándar de endotoxina en suero bovino fetal habitualmente ascienden a < 1 ng/ml o < 10 UE/ml, respectivamente, según el estándar industrial [28]. Sin embargo, es probable que las endotoxinas también sean una parte intrínseca de las reacciones alérgicas en la “vida real”, ya que las endotoxinas están más o menos ubicuamente presentes. Además, las preparaciones de Der p 1, incluyendo el producto usado aquí, comúnmente no muestran actividad cisteína proteasa debido al proceso de producción. Para Der p 1, la actividad cisteína proteasa se ha descrito que aumenta la síntesis de IgE específica de Der p 1 y la alergenicidad en un modelo de inhalación de ratón [29, 30]. Por otra parte, los datos presentados por Porter et al. [31] indican que Der p 1 en muestras de polvo doméstico no tienen actividad proteasa medible. En el estudio presentado aquí, la actividad cisteína proteasa de Der p 1 no se restableció por tratamiento de reducción, ya que no se pudo detectar ninguna diferencia en activación de células dendríticas derivadas de monocitos cuando se compran células estimuladas con Der p 1 tratada con DTT con el fin de activar su actividad cisteína con Der p 1 sin tratar (datos no mostrados). No obstante, la firma de biomarcadores identificada consistente en 391 transcritos era capaz de separar el conjunto de datos en dos grupos claramente distintos, es decir, controles y alergenos (Fig. 2). Aunque análisis estadísticos separados no pudieron identificar transcritos significativamente regulados entre estos dos grupos, esto junto con los resultados de validación cruzada (Fig. 3) indica que varios transcritos juntos en una firma todavía pueden ser útiles para la predicción de los alergenos proteicos, por ejemplo, los capaces de sensibilizar el aparato respiratorio.

El análisis de rutas biológicas usando la herramienta KPA y la firma de potenciales biomarcadores como entrada, reveló una sobrerrepresentación de numerosas rutas ligadas a respuestas inmunitarias. Se proporciona evidencia adicional que apoya la relevancia de las rutas identificadas para sensibilización respiratoria por el actual entendimiento de la ruta de señalización de NF-kB, que era un regulador anterior sugerido para los cambios transcripcionales identificados. La activación de NF-kB está relacionada causalmente a liberación aumentada de varias moléculas señal tal como IL-33, IL-25 [32, 33], factores de peligro endógenos (por ejemplo, HMGB-1, ácido úrico y ATP por células epiteliales y CD); además de activación y migración de CD [34], y la inducción de ovoalbúmina [35] y sensibilización de Der p 2 [36]. La liberación de ATP y ácido úrico dirige la activación del complejo inflamasoma NLRP3 produciendo el corte de pro-IL-1p a IL-1p madura mediante caspasa 1 [37]. El ácido úrico puede desempeñar un papel importante en el sesgo a Th2 [38].

Aunque los datos de humanos y animales indican que los alergenos proteicos aquí investigados no se diferencian significativamente en términos de alergenicidad [39], en nuestro sistema in vitro, proteasa 1 y 2 indujeron un patrón de expresión de ARN particular y también influyeron los niveles de proteína de ciertos marcadores de superficie celular y citoquinas. Esto puede no estar necesariamente asociado con su alergenicidad, ya que también podría estar relacionado con propiedades citotóxicas y adyuvantes como se describe para varias cisteína y serina proteasas y ciertas proteasas usadas en detergentes [40-43]. Cuando las células se expusieron a las proteasas durante 48 horas, la viabilidad celular relativa disminuyo (datos no mostrados), sin embargo, la viabilidad relativa nunca cayó por debajo del 90% después de 24 horas (Fig. 10). Aunque se espera que las proteasas sean capaces de degradar ciertas proteínas tal como citoquinas como se muestra para GM-CSF (Fig. 11), basado en las investigaciones presentadas aquí, no es posible establecer conclusiones sobre qué mecanismos están implicados. Parece probable que tanto citoquinas como proteínas de superficie celular puedan ser cortadas y por tanto se puedan ejercer efectos directos e indirectos en, por ejemplo, diferenciación celular y estado de activación. De forma importante, con el fin de poder ensayar estas y otras sustancias similares in vitro, es importante elegir cuidadosamente concentraciones que no superen una cierta citotoxicidad. Las respuestas pueden de otra manera estar dominadas por sucesos que reflejen citotoxicidad; comparable a cómo las propiedades irritantes de ciertos alergenos de contacto pueden enmascarar los efectos ligados a sensibilización [44]. Por otra parte, los efectos irritantes o citotóxicos también pueden permitir o facilitar la sensibilización al crear un entorno proinflamatorio como se muestra para varias sustancias químicas sensibilizadoras de la piel [45-47]. Para proteasas, la alteración de las funciones de barrera y por tanto mayor permeabilidad puede desempeñar un papel también [41, 42].

En conjunto, nuestros resultados indican que los 391 biomarcadores identificados pueden ser útiles con el fin de predecir la alergenicidad de proteínas incluyendo proteasas, y en particular la capacidad de sensibilización de alergenos proteicos respiratorios, incluyendo proteasas. Los resultados de una serie de validaciones cruzadas apoyan un modelo válido (Fig. 3). La firma de biomarcadores también parece reflejar rutas biológicas relevantes.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe predicciones alergénicas de dos muestras de tropomiosina con diferente especie de origen, junto con controles apropiados. Proporciona una prueba de concepto de la aplicabilidad de la Firma de Predicción de Alergenos Proteicos GARD de la tabla A (denominado en el presente documento “GARD PAPS”) para realizar predicciones alergénicas con muestras de proteínas.

La lectura de GARD es un conjunto de factores de predicción genómicos, denominado Firma de predicción GARD (GPS).

En este ejemplo, la funcionalidad de GARD PAPS se demostró adicionalmente evaluando la alergenicidad de dos muestras de tropomiosina, con diferentes especies de origen.

El material genético de las células se aisló de muestras de células estimuladas con las sustancias de prueba. Los niveles transcripcionales de GARD PAPS se cuantifican y comparan a un conjunto de datos de referencia mediante el uso de modelos de predicción estadística multivariable. A cada muestra se asigna un valor de decisión basado en sus niveles transcripcionales de GARD PAPS, medido por tecnología de micromatriz de Affymetrix. Las predicciones finales se basan en el valor medio de muestras triplicadas biológicas.

En este ejemplo, se presentan los resultados de 2 proteínas, un control LPS y células sin estimular. Para un resumen de resultados, véase la tabla 2.

Tabla 2. Resultados resumen

Resultados

Manejo de sustancias de prueba y concentraciones de entrada GARD

Todas las proteínas y sustancias de prueba se almacenaron y prepararon según las instrucciones proporcionadas por el suministrador. Las proteínas se cribaron para efectos citotóxicos y la concentración de entrada GARD se estableció para cada proteína. Los resultados de este cribado y concentraciones de entrada de GARD PAPS resultantes se presentan en la tabla 3.

T l . D ll l n i r

I) La mayor concentración usada en el intervalo de titulación del cribado. La concentración se da en pg/ml.

II) Concentración que da el 90% de viabilidad relativa. La concentración se da en pg/ml.

III) Basado en cribado máx. y Rv90. La concentración se da en pg/ml.

LPS se usa aquí como un control negativo, que asegura que las señales observadas generadas por cualquiera de las dos muestras de tropomiosina no se deben a contaminantes de endotoxina. Los contenidos de endotoxina de las muestras de tropomiosina se cuantificaron usando una prueba LAL. La concentración de LPS usada como un control negativo se ajustó para corresponder a la mayor concentración de endotoxina presente en cualquier muestra de tropomiosina.

Todas las proteínas y sustancias de prueba se ensayaron en triplicados biológicos.

Clasificaciones de GARD PAPS

A todos los replicados de sustancias de prueba se asignaron valores de decisión usando el modelo de predicción GARD PAPS, como se describe (véase materiales y métodos a continuación). Los valores de decisión de las sustancias de prueba se presentan en la figura 12.

Materiales & Métodos

Los materiales y métodos completos para la estrategia de ensayo GARD, usada para generar los datos descritos en este ejemplo, se incluye a continuación.

Desviaciones de protocolos estándar

Los efectos citotóxicos de las proteínas de prueba se siguieron en el intervalo de concentración 1-25 pg/ml. No se pudo detectar citotoxicidad y se usó 25 pg/ml como la concentración de entrada de GARD, basado en hallazgos en la bibliografía científica en métodos in vitro para predicciones de alergenos proteicos.

Cuando se estimula la línea celular mieloide humana con las sustancias de prueba, las proteínas se disolvieron primero en PBS a una concentración de 1000 pg/ml. Se añadieron 50 pl de las proteínas disueltas a 1,95 ml de células sembradas. LPS se diluyó en PBS a una concentración final de 0,1 pg/ml y se añadieron 2 pl a 1,988 ml de suspensión celular.

Las células se estimularon durante 24 h después de lo cual se lisaron en reactivo TRIzol. El ARN se purificó, marcó e hibridó a matrices por la instalación central SCIBLU para tecnología Affymetrix, Lund, Suecia.

Los niveles de transcripción cuantificados se normalizaron por matriz monocatenaria (SCAN) y la GARD PAPS se extrajo del conjunto de datos. Las muestras sin estimular, de las muestras de prueba y las muestras de referencia usadas para construir el modelo de predicción, se usaron para eliminar efectos de lote entre los dos conjuntos de datos.

Las clasificaciones finales se hicieron usando una máquina de vector soporte (SVM) que se había entrenado en las muestras de referencia usadas para establecer la GARD PAPS.

Mantenimiento de la línea celular y siembra de células para estimulación

La línea celular derivada de leucemia mieloide humana se mantuvo en a-MEM (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT) suplementado con suero fetal de ternera (Life Technologies, Carlsbad, CA) al 20% (volumen/volumen) y rhGM-CSF (Bayer HelathCare Pharmaceuticals, Seattle, WA) 40 ng/ml, como se ha descrito (Johansson et al., 2011). Se realiza un cambio de medio durante la expansión cada 3-4 días, o cuando la densidad celular supera 5-600.000 células/ml. Las células progenitoras proliferantes se usan para el ensayo, sin etapas de diferenciación adicionales aplicadas. Durante le intercambio de medio, las células se cuentan y suspenden a 200.000 células/ml. Las soluciones madre de trabajo de cultivos se hacen crecer durante un máximo de 20 pases o dos meses después de descongelarlas. Para la estimulación química de las células, se siembran 1,8 ml en placas de 24 pocillos a una concentración de 222.000 células/ml. El compuesto que se va a usar para estimulación se añade en un volumen de 200 pl, diluyendo la densidad celular a 200.000 células/ml durante la incubación.

Análisis fenotípico

Antes de cualquier estimulación química, se realiza un análisis fenotípico cualitativo para asegurar que las células en proliferación están en una fase inmadura. Todas las etapas de tinción de superficie celular y lavado se realizan en PBS que contiene BSA al 1% (p/v). Las células se incuban con anticuerpo monoclonales de ratón específicos (Acm) durante 15 min a 4°C. Se usan los siguientes Acm para citometría de flujo: CD1a (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), CD34, CD86, y HLA-DR (BD Biosciences, San Diego, CA) conjugados a FITC, CD14 (DakoCytomation), CD54 y CD80 (BD Biosciences) conjugados a PE. Se usa IgG1 de ratón, conjugada a FITC o PE como controles de isotipo (BD Biosciences) y se usa yoduro de propidio (PI) (BD Biosciences) para evaluar la viabilidad celular. Se usa software FACSDiva para adquisición de datos con un instrumento FACSCanto II (BD Biosciences). Se adquieren 10.000 sucesos, se ajustan portales basados en las propiedades de dispersión de la luz para excluir restos y células no viables, y se ajustan cuadrantes según las señales de controles de isotipo. Se realiza análisis adicional de datos usando FCS Express V3 (De Novo Software, Los Ángeles, CA). Para un fenotipo de referencia de células sin estimular, véase Johansson et al., 2011. Los intervalos aceptados de marcadores fenotípicos enumerados se enumeran en la tabla 4.

Tabla 4. Intervalos aceptados de proporción de células positivas para criterios de aceptación I: Análisis fenotípico

Manejo químico y evaluación de citotoxicidad

Todas las sustancias químicas se almacenan según las instrucciones del suministrador, con el fin de asegurar estabilidad de los compuestos. Las sustancias químicas se disuelven en agua cuando es posible o DMSO para compuestos hidrofóbicos. Como muchas sustancias químicas tendrán un efecto tóxico en las células, los efectos citotóxicos de las sustancias de prueba se siguen. Algunas sustancias químicas se disuelven mal en medio celular; por tanto, la concentración máxima soluble se evalúa también. La sustancia química que se va a ensayar se titula a concentraciones que varían desde 1 pM a la concentración soluble máxima en medio celular. Para compuestos libremente solubles, 500 pM se ajusta como el extremo superior del intervalo de titulación. Para estimulaciones celulares, las sustancias químicas se disuelven en su solvente apropiado como soluciones madre 1000x de concentración en el pocillo diana, llamada solución madre A. Se prepara una solución madre 10x, llamada solución madre B, tomando 10 pl de solución madre A a 990 pl de medio celular. Se añaden después 200 pl de la solución madre B a los pocilios que contienen 1,8 ml de células sembradas. Para las muestras disueltas en DMSO, la concentración en los pocillos de DMSO será así el 0,1%. Después de incubación durante 24 h a 37°C y CO2 al 5%, las células recogidas se tiñen con PI y se analizan con un citómetro de flujo. Las células negativas para PI se definen como viables, y la viabilidad relativa de las células estimuladas con cada concentración en el intervalo de titulación se calcula como

fracción de células estimuladas viables

^{Viabilidad re la tiva = —} ----— ;— ^ti—, -- _{fracción de células} s:i-n--:--;- _esti ^:—n — •100 _mul - _{ar viables}

Para compuestos tóxicos, la concentración que da viabilidad relativa del 90% (Rv90) se usa para el ensayo GARD, la razón es que esta concentración demuestra biodisponibilidad del compuesto usado para estimulación, mientras no altera las respuestas inmunológicas. Para compuestos no tóxicos, se usa una concentración de 500 pM si es posible. Para compuestos no tóxicos que son insolubles a 500 pM, se usa la mayor concentración soluble. Cualquiera de estos tres criterios que se cumpla, solo se usará una concentración para el ensayo genómico. La concentración que se va a usar para cualquier sustancia química determinada se denomina la 'concentración de entrada GARD'.

Exposición química de células para GARD

Una vez se establece la concentración de entrada GARD para sustancias químicas que se van a ensayar, las células se estimulan otra vez como se ha descrito anteriormente, esta vez solo usando la concentración de entrada GARD. Todas las evaluaciones de sustancias de prueba se ensayan en triplicados biológicos, realizados en diferentes puntos de tiempo y usando diferentes cultivos celulares. Después de incubación durante 24 h a 37°C y CO2 al 5%, las células de un pocillo se lisan en 0,5 ml de reactivo TRIzol (Life Technologies) y se almacena a -20°C hasta que se extrae el ARN. En paralelo, se toma una pequeña muestra de células estimuladas para tinción con PI y análisis con citometría de flujo, para asegurar que la viabilidad relativa esperada de células estimuladas se alcanza.

Preparación de controles de referencia

Además de cualquier sustancia de prueba que se va a ensayar en una campaña, se realizan un conjunto de controles de referencia, para el fin de calibración del modelo de predicción y estimación del rendimiento de predicción. Para detalles respecto a los controles de referencia usados en cada campaña específica, véase el documento principal al que se adjunta este apéndice.

Aislamiento de ARN y cuantificación GPS usando el sistema Nanostring nCounter

El aislamiento de ARN de células lisadas se realiza usando kits comercialmente disponibles (Direct-Zol RNA MiniPrep, Zymo Research, Irvine, CA). El ARN total se cuantifica y se somete a control de calidad usando equipo BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Un total de 100 ng de ARN se usa como entrada de muestra en un ensayo de hibridación con sonda indicadora especifica de GPS CodeSet (Nanostring, Seattle, WA). La muestra ARN-CodeSet hibridada se prepara en un chip usando nCounter Prepstation y transcritos individuales de la GPS se cuantifican usando Nanostring Digital Analyzer (Nanostring).

Adquisición de datos y normalización

Los datos crudos se exportan del Digital Analyzer y las cuentas de transcritos individuales de la GPS se normalizan por chip único con un algoritmo de cuenta por cuentas totales. Los datos normalizados consisten en una matriz S por V, donde S indica el número de muestras en la campaña GARD y V indica el número de transcritos cuantificados de la GPS.

Análisis de datos - Generación de valores de decisión de máquina de vector soporte calibrada

Todos los análisis posteriores se realizan usando software basado en aplicación, desarrollado en el entorno estadístico de fuente abierta R. Una máquina de vector soporte (SVM) se entrena usando datos históricos usados para establecimiento de GPS (Johansson et al., 2011). Todas las muestras de las sustancias de prueba y controles de referencia de la campaña GARD específica se predicen usando la SVM entrenada, asignando a cada muestra un valor de decisión de la SVM. El rendimiento de predicción se estima por identificación del área bajo la curva de eficacia diagnóstica (ROC AUC) de la clase predicha de controles de referencia. Los detalles completos de esta metodología son los mismos que para el ejemplo 1.

Clasificaciones GARD de la(s) sustancia(s) de prueba

El modelo de predicción GARD se define como sigue:

Si el valor de decisión medio de todos los replicados biológicos de una sustancia de prueba es mayor que cero, la sustancia de prueba se clasifica como un sensibilizador.

Tabla A

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar proteínas que son alergénicas en mamíferos que comprende o consiste en las etapas de:

(a) proporcionar una población de células dendríticas o una población de células similares a dendríticas; (b) exponer las células proporcionadas en la etapa (a) a una proteína de prueba; y

(c) medir en las células de la etapa (b) la expresión de 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A;

en donde la expresión de los 23 o más biomarcadores medida en la etapa (c) es indicativa de la alergenicidad de la proteína de prueba de la etapa (b); y

en donde los 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A incluyen los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjuntos de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

2. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la etapa (c) comprende o consiste en medir la expresión de 24 o más biomarcadores enumerados en la tabla A, por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, o 391 de los biomarcadores enumerados en la tabla A.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la etapa (c) comprende o consiste en medir la expresión de todos los biomarcadores enumerados en la tabla A.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones previas que además comprende:

d) exponer una población separada de las células dendríticas o células similares a dendríticas a uno o más agente(s) de control negativo que no es alergénico en un mamífero; y

en donde la proteína de prueba se identifica como alergénica en el caso de que la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (e) se diferencia de la expresión de los 23 o más biomarcadores medidos en la etapa (c); y/o

que además comprende:

f) exponer una población separada de las células dendríticas o células similares a dendríticas a uno o más agente(s) de control positivo que es alergénico en un mamífero; y

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la etapa (c) comprende medir la expresión de una molécula de ácido nucleico de uno o más biomarcadores; opcionalmente

en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc o una molécula de ARNm; opcionalmente en donde medir la expresión de uno o más de los biomarcadores en la etapa (c) se realiza usando un método seleccionado del grupo que consiste en hibridación Southern, hibridación Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcripción inversa PCR (RT-PCR), PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR), nanomatriz, micromatriz, macromatriz, autorradiografía e hibridación in situ; opcionalmente

en donde medir la expresión de uno o más de los biomarcadores en la etapa (c) se determina usando una micromatriz de ADN.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde medir la expresión de 23 o más de los biomarcadores en la etapa (c) se realiza usando 23 o más fracciones de unión, cada una capaz de unirse selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los biomarcadores identificados en la tabla A; opcionalmente

en donde las fracciones de unión cada una comprende o consiste en ADN, ARN, APN, ANB, GNA, TNA o PMO; opcionalmente

en donde la fracción de unión comprende una fracción detectable; opcionalmente

en donde la fracción detectable se selecciona del grupo que consiste en: una fracción fluorescente; una fracción luminiscente; una fracción quimioluminiscente; una fracción radioactiva (por ejemplo, un átomo radioactivo); o una fracción enzimática.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en done la etapa (c) comprende o consiste en medir la expresión de la proteína de 23 o más de los biomarcadores; opcionalmente

en donde medir la expresión de 23 o más de los biomarcadores en la etapa (c) se realiza usando 23 o más fracciones de unión cada una capaz de unirse selectivamente a uno de los biomarcadores identificados en la tabla A; opcionalmente

en donde las fracciones de unión comprenden o consisten en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la etapa (c) se realiza usando una matriz; opcionalmente

en donde la matriz es una matriz basada en perlas; opcionalmente en donde la matriz es una matriz basada en superficie; y/o en donde la matriz se selecciona del grupo que consiste en: macromatriz; micromatriz; nanomatriz.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la población de células dendríticas o población de células similares a dendríticas comprende o consiste en células inmortales y/o no naturales; y/o en donde la población de células dendríticas o población de células similares a dendríticas es una población de células similares a dendríticas; opcionalmente

en donde las células similares a dendríticas son células similares a dendríticas mieloides; opcionalmente en donde las células similares a dendríticas mieloides derivan de células dendríticas mieloides; opcionalmente en donde las células derivadas de células dendríticas mieloides son células derivadas de leucemia mieloide tal como las seleccionadas del grupo que consiste en KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 y MUTZ-3.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para identificar proteínas capaces de inducir una respuesta de hipersensibilidad de tipo I en un mamífero; y/o

para identificar proteínas capaces de inducir sensibilización respiratoria en un mamífero; y/o

para identificar proteínas capaces de inducir una respuesta de hipersensibilidad respiratoria; y/o

en donde la respuesta de hipersensibilidad es una respuesta de hipersensibilidad humoral; y/o

para identificar proteínas alimentarias alergénicas; y/o

en donde el método es indicativo de la potencia alergénica de la muestra que se va a ensayar.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el método comprende una o más de las siguientes etapas:

(i) cultivar células dendríticas o similares a dendríticas;

(ii) sembrar células de (i) en uno o más pocillo(s), por ejemplo, pocillos de una o más placas de ensayo multipocillo;

(iv) añadir a uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) uno o más control(es) positivo(s), por ejemplo, Der p 1 y/o Der p 7;

(v) añadir a uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) uno o más control(es) negativo(s), por ejemplo, DMSO, y/o dejar uno o más pocillo(s) separado(s) de (ii) sin estimular para obtener un control de medio:

(vi) incubar las células de (iii)-(v), preferiblemente durante aproximadamente 24 horas;

(viii) cuantificar los niveles de expresión de transcritos de ARNm individuales de (vii), por ejemplo, usando una matriz, tal como una matriz Affymetrix Human Gene 1.0 ST;

(ix) exportar y normalizar los datos de expresión de (viii);

(xi) aplicar un modelo de predicción a los datos de (x), por ejemplo, un modelo SVM congelado previamente establecido y entrenado en datos históricos, por ejemplo, datos obtenidos en el ejemplo 1, para predecir la alergenicidad de la(s) proteína(s) ensayada(s) y control(es) negativo(s)/positivo(s).

12. Una matriz para uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, la matriz que consiste en 23 fracciones de unión como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde las 23 fracciones de unión incluyen fracciones de unión con especificidad para cada uno de los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjuntos de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308; opcionalmente

en donde la matriz comprende una o más fracciones de unión para cada uno de los biomarcadores definidos en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Uso de 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A o 23 o más fracciones de unión cada una con especificidad para un biomarcador seleccionado del grupo definido en la tabla A para determinar la alergenicidad de una proteína; en donde los 23 o más biomarcadores seleccionados del grupo definido en la tabla A incluyen los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjuntos de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308, o las 23 o más fracciones de unión cada una con especificidad para un biomarcador seleccionado del grupo definido en la tabla A incluyen fracciones de unión con especificidad para cada uno de los biomarcadores definidos por los siguientes números ID de conjuntos de sondas en la tabla A: 8104107; 7984862; 7914992; 7986229; 7896756; 7929478; 7946021; 7912863; 8143710; 8176806; 7920264; 8107421; 7906205; 7897991; 7925846; 7905077; 7938951; 8110104; 8015060; 7919572; 7953747; 7897960; 7928308.

14. Un kit analítico para uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que comprende:

(a) una matriz según la reivindicación 12; y

(b) (opcionalmente) uno o más agentes de control

(c) (opcionalmente) instrucciones para realizar el método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11.