KR102115317B1 - 인간 피부의 민감화를 유도하는 물질의 동정에 사용하기 위한 분석 방법 및 어레이 - Google Patents

인간 피부의 민감화를 유도하는 물질의 동정에 사용하기 위한 분석 방법 및 어레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 피부에 민감화(sensitization)를 유도할 수 있는 물질을 식별하기 위한 시험관내 방법, 및 이러한 방법에 사용하기 위한 어레이 및 진단 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 방법은 테스트 물질에 노출된 MUTZ-3 세포에서 표 3A 및/또는 표 3B에 열거된 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함한다.

Description

인간 피부의 민감화를 유도하는 물질의 동정에 사용하기 위한 분석 방법 및 어레이 {ANALYTICAL METHODS AND ARRAYS FOR USE IN THE IDENTIFICATION OF AGENTS INDUCING SENSITIZATION IN HUMAN SKIN}
본 발명은 인간 피부의 민감화를 유도할 수 있는 물질을 식별하는 시험관내 방법, 및 이러한 방법을 적용하기 위한 어레이 및 분석 키트에 관한 것이다.
알레르기성 접촉성 피부염은 인구의 상당히 높은 비율에서 발생하는 염증성 피부 질환이다. 이는 화합물 합텐에 대한 면역학적 반응에 의해 일반적으로 유발되며, 사회에 상당한 경제적인 부담을 부가한다. 현행 화합물 민감성 테스트는 동물 실험에 의존하고 있다. 화학제의 등록에 대한 새로운 입법과, 예를 들어, 약학 및 화장품 산업에서의 이용은, 인간 세포를 기반으로 한 대안적인 민감성 예측 분석법을 개발하는데, 상당한 연구 노력들을 불러일으키고 있다. 그 목적은 동물 실험을 예측력이 높은 시험관내 검사로 대체하고자 하는 것이다.
알레르기성 접촉성 피부염 (ACD)은 부종과 재발되는 소양성 증상을 특징으로 하는 일반적인 염증성 피부 질환이다 [1]. 이 질환은 인구의 상당히 높은 비율에서발생하여, 유럽에서의 유병률이 7.2% - 18.6%에 이르며 [2, 3], 발생 건수도 민감성 화학제에 대한 반복 노출로 인해 증가하고 있다. ACD는, 이전에 노출되어 면역학적으로 감작된 개체에서, 작은 화합물인 합텐과의 접촉 부위에서, 주로 반응성 T 헬퍼 1 (Th1) 및 인터페론 (IFN)γ를 생산하는 CD8+ T 세포에 의해 유발되는, IV형 지연형 과민 반응이다 [4]. 상피의 수지상 세포 (DC)는 자기-분자와 결합한 합텐에 반응하여 T 세포 매개의 면역 반응을 활성화함으로써 면역 반응을 개시한다.
REACH (화합물의 등록, 평가 및 인가) 규칙에 따르면, 대략 30,000종의 화학제에 달하는, 유럽 연합내 모든 신규 및 기존 화학제들을 유해 효과에 대해 검사할 것을 규정하고 있다 [5]. 잠재적인 민감성 물질(sensitizer)을 동정하는데에는 현재 동물 실험이 요구되므로, REACH 법은 실험에 필요한 동물의 마리 수에 엄청난 파장을 주게 될 것이다. 아울러, 화장품 규정에 대한 7차 개정 (76/768/EEC)에서는, 일부 검사가 2013년까지인 것을 제외하고는, 인간에게 사용하기 위한 대부분의 화장품 성분들에 대한 동물 실험 금지를 2009년까지 시행할 것을 담고 있다. 따라서, 화학제의 민감성을 평가하기 위한, 동물 실험을 대체할 수 있는 신뢰성 있는 시험관내 방법의 개발이 시급한 실정이다. 현재까지, 피부 민감성 화합물을 식별하기 위한 비-동물성 대체법은 없는 실정이며, 오히려 바람직한 분석 방법은 마우스 국소 림프절 분석 (LLNA) [6]과, 다음으로 기니아피그 극대화 검사 (GPMT: Guinea pig maximization test)이다 [7]. 이러한 동물 모델에 대한 대안적인 시험관내 방법이, 바람직하게는, 신뢰성과 정확도를 개선시키고, 인간 반응성과상당한 상관 관계를 나타낼 수 있을 것이다.
수지상 세포 (DC)는 선천성 면역과 후천성 면역을 기본적으로 연결하는 브릿지로서 면역 반응에 중추적인 역할을 담당한다. 이 세포는, 촉발되면, 염증 부위로의 다른 세포들의 이동과 활성화에 영향력을 발휘하는 상당량의 매개 인자들을 신속하게 생산하게 되며, 항원-제시를 통해 세포 반응을 미세-조정함으로써, 다양한 병원체와 환경적인 요인들에 대해 선택적으로 반응할 수 있다. 따라서, 민감성 물질에 의한 자극시, DC에 의해 이루어지는 면역학적 결정을 조사하고 이용하는 것을, 민감성을 예측하기 위한 강력한 검사 전략으로서 작용할 수 있다.
그러나, 여러가지 DC 아집단들의 다양한 표현형들과 특수화된 기능 뿐만 아니라 이들의 광범위한 분포 및 드문 분포는 복잡한 요인들로서, 테스트 플랫폼으로서 원시 DC(primary DC)를 사용하는데 방해가 된다. 그래서, DC를 수득함에 있어 가변성 및 곤란성 관련 문제들을 또한 해결하는, 정확하고, 신뢰성 있는 시험관내 분석법이 절실히 요구되고 있다.
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따라서, DC의 기능 예측력을 기반으로 한 분석법의 개발은, 바람직하게는, 생체내 DC에 대한 모방체 또는 대안적인 세포 타입들을 기초로 이루어져야 한다. 이를 위해서는, DC 특징을 구비한 세포주가 안정적인, 재현가능한, 비제한적인 세포 공급원이 되기 때문에, 이러한 세포주가 유익할 것이다. DC 모방체로는, 분화된 골수단구성 MUTZ-3 세포가 지금까지 선호되는 후보 세포이다 [8]. MUTZ-3는 CD34+ DC 선조세포(progenitor)의 무한정 공급원으로서, 사이토카인 자극시 미성숙 DC 또는 랑게르한스-유사 DC와 유사한 표현형을 획득하며 [9], CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하여, 특이적인 T 세포의 증식을 유도할 수 있다 [8]. 또한, MUTZ-3는 염증 매개인자에 의한 자극시 성숙한 전사성, 그리고 표현형 프로파일을 나타낸다 [10].
본 발명자들은 피부 민감성 물질(skin sensitizer)을 예측하는 새로운 검사법을 개발하였다. 놀랍게도, 민감성 화합물, 비-민감성 화합물 및/또는 그외 대조물 (예, DMSO 및/또는 증류수 등의 희석제만을 포함하는, 비히클 대조군)로 구성된 패널로 세포를 자극하는 과정으로, 다른 차별화된 방식없이도, 피부 민감성 물질을 DC 선조세포, 예컨대 MUTZ-3 세포를 이용하여 정확하게 식별/예측할 수 있다는 것이 확인되었다. 이는 상기 과정을 상당히 간소화하고, 재현성을 개선시키는 것으로 입증되었다.
화학적 자극에 대한 전사 반응을 게놈-광범위 프로파일링을 이용하여 평가하였다. 데이타 분석을 통해, 민감성 화합물 대 비-민감성 화합물 및 비히클 대조군에 의해 유발되는 전사 반응에서, 완전히 구분되는 200종의 전사체들로 구성된 바이오마커 시그니처(biomarker signature)를 동정하였다. 아울러, 상기 시그니처의 강력한 예측력을 SVM 및 ROC 곡선 분석을 이용하여 입증하였다. 바이오마커 시그니처는, DC의 성숙화 및 사이토카인 반응 등의 관련된 생물학적 경로에 관여하며, 민감화 프로세스에 관여하는 분자의 상호작용을 조명할 수 있는, 전사체들을 포함한다. 결론적으로, 인간 민감성 화합물을 식별하는데 유용한 시험관내 분석에 있어, 주목할만한 정보를 제공하는 예측력 높은 바이오마커 시그니처를 동정하였다.
이에, 본 발명의 제1 측면은,
a) 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단을 테스트 물질에 노출시키는 단계; 및
b) 상기 세포에서 표 3에 규정된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나, 또는 이들 단계로 구성되며,
상기 단계 (b)에서 측정되는 상기 하나 이상의 바이오마커의 세포내 발현이 상기 테스트 물질의 민감성 효과를 표시하는 것인,
포유류 피부에 민감화를 유도할 수 있는 물질의 시험관내 식별 방법을 제공한다.
"포유류 피부의 민감화를 유도할 수 있는 물질"은, 포유류에서 IV형의 지연형 과민 반응을 유도 및 촉발할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 바람직하게는, IV형의 지연형 과민 반응은 DC-매개로 이루어진다.
일 구현예에서, "포유류 피부에 민감화를 유도할 수 있는 물질"은 포유류의 상피 접촉부에 IV형의 지연형 과민 반응을 유도 및 촉발할 수 있는 물질이다.
포유류는 임의의 가축 또는 농장 동물일 수 있다. 바람직하게는, 포유류는 랫, 마우스, 기니아피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유류는 인간이다. 전술한 바와 같이, 민감화를 측정하는 생체내 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직한 방법은 국소 림프절 분석이다 (상세한 내용은 Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8을 참조함). 다른 적합하나 보다 덜 바람직한 방법은 기니아피그 극대화 검사(maximization test)이다 (상세한 내용은 Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76을 참조함).
"수지상 유사 세포"는, 형태학적 특징, 공동자극성 분자(costimulatory molecule) 및 MHC 클래스 II 분자의 발현, 및 거대 분자를 흡수(pinocytossis)하고 휴지기 T 세포를 활성화하는 능력 등의, 수지상 세포의 특이적인 기능적 특징과 표현형 특징들을 나타내는, 비-수지상 세포이다.
일 구현예에서, 수지상-유사 세포는 CD34+ 수지상 세포의 선조 세포이다. 선택적으로, CD34+ 수지상 세포의 선조 세포는, 사이토카인 자극시, CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하여, 특이적인 T 세포의 증식을 유도하며, 및/또는 염증 매개인자로의 자극시, 성숙한 전사 및 표현형 프로파일 (즉, 미성숙 수지상 세포 또는 랑게르한스-유사 수지상 세포와 비슷한 표현형)을 나타내는, 표현형을 획득할 수 있다.
수지상 세포는 기능에 의해, 표현형에 의해, 및/또는 유전자 발현 패턴에 의해, 특히 세포 표면에서의 표현형에 의해 인지할 수 있다. 이들 세포는 이들의 독특한 형태, 표면 MHC-클래스 II 발현 및 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, 특히 나이브(naive) T 세포에 항원을 제시하는 능력이 특징적이다 (Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).
수지상 세포의 세포 표면은 특별하여, 베일형 돌출부(veil-like projection)를 가지고 있으며, 세포 표면 마커인 CD11c 및 MHC 클래스 II를 발현하는 것이 특징적이다. 대부분의 DC는 T 세포, B 세포, 단핵세포/대식세포 및 과립구를 비롯한 다른 백혈구 계통의 마커에 대해 음성이다. 또한, 수지상 세포의 아집단은, 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8alpha, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123 (IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-카드헤린(cadherin), 랑게린(Langerin), 만노스 수용체, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9 및 수종의 렉틴 등의 마커들이 세포 표면에 발현되는 특징을 나타낸다.
이들 세포 표면 마커의 발현 패턴은 성숙형 수지상 세포, 이의 기원 조직, 및/또는 이의 기원 종들에 따라 달라질 수 있다. 미성숙형 수지상 세포는 MHC 클래스 II를 낮은 수준으로 발현하지만, 항원성 단백질을 세포내로 흡입(endocytosis)하여 MHC 클래스 II 분자와의 복합체로 제시하도록 이들을 처리할 수 있다. 활성화된 수지상 세포는 MHC 클래스 II, ICAM-1 및 CD86를 높은 수준으로 발현하며, 나이브 동종이계 T 세포의 증식, 예컨대 혼성 백혈구 반응 (MLR: mixed leukocyte reaction)을 자극할 수 있다.
기능적으로는, 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포는 항원 제시를 확인하기 위한 임의의 편리한 분석을 통해 동정할 수 있다. 이러한 분석은, 테스트 항원의 제시를 통한 항원-촉발성 및/또는 나이브 T 세포의 자극 능력을 조사하는 단계와, 후속적인 T 세포 증식, IL-2 방출 등의 측정을 포함할 수 있다.
"발현"은 mRNA 또는 단백질 등의 유전자 산물의 수준 또는 양을 의미한다.
단백질 및/또는 핵산의 농도를 검출 및/또는 측정하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예로 Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다.
바람직한 단백질 검출 및/또는 측정 방법으로는, 웨스턴 블롯, 노던-웨스턴 블롯, 면역흡착 분석 (ELISA), 항체 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이 (TMA), 면역침강, 인 시츄 혼성화 및 기타 면역조직화학 기법들, 방사면역분석 (RIA), 면역방사측정 분석 (IRMA) 및 면역효소 분석 (IEMA)을 포함하며, 그 예로는 단일클론 항체 및/또는 다클론 항체를 이용한 샌드위치 분석이 있다. 샌드위치 분석의 예는 데이비드 등의 미국 특허 4,376,110 및 4,486,530에 기술되어 있으며, 이들 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 슬라이드 위에서 세포를 항체로 염색하는 방법을, 세포 실험 진단 검사 뿐만 아니라 당해 기술 분야의 당업자에게도 잘 알려져 있는 방법에서, 이용할 수 있다.
전형적으로, ELISA는 일반적으로 고상 분석에서 유색 반응 산물을 제공하는 효소의 사용을 포함한다. 호르세라디시 퍼옥시다제 및 포스파타제 등의 효소가 널리 사용되고 있다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방식은 기질로서 NADP를 이용하여, 2차 효소 시스템의 조효소로서 현재 작동하는 NAD를 생성시키는 것이다. 에스캐리키아 콜라이 (E. coli) 유래 피로포스파타제는 이 효소가 조직내에 존재하지 않기 때문에 양호한 접합체의 제공이 가능하며, 안정적이고, 양호한 반응성 색 변화가 가능하다. 또한, 루시퍼라제 등의 효소를 이용한 화학발광 시스템도 사용할 수 있다.
비타민 바이오틴과의 접합은 높은 특이성과 친화성으로 결합하는 효소-연결된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응을 통해 쉽게 검출할 수 있어, 이러한 접합이 흔히 사용된다.
바람직한 핵산 (예, mRNA) 검출 및/또는 측정 방법으로는 서던 블롯, 노던 블롯, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), 정량적인 실시간 PCR (qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자동 방사능 측정법 및 인 시츄 혼성화가 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개개 집단을 인간 피부에 민감하지 않는 음성 대조군에 노출시켜, 단계 (b)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 세포에서 측정하는 것을 포함한다. 그래서, 시험 물질의 민감성 효과는, 단계 (b)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 세포 집단에서의 발현이 음성 대조군 샘플에서의 발현과 차별적인 현상으로 표시된다.
일 구현예에서, 음성 대조군 물질은 본 발명의 테스트 또는 대조군 물질과 함께 사용하기 위한 용매이다. 따라서, 음성 대조군은 DMSO 및/또는 증류수일 수 있다.
다른 구현예에서, 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포에서, 테스트 물질에 노출시키기 전, 단계 (b)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 음성 대조군으로서 사용한다.
다른 구현예는, 인간 피부에 민감하게 작용하는 양성 대조군 물질에 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 개별 집단을 노출시키고, 단계 (b)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 상기 세포에서 측정하는 것을 포함한다. 그래서, 시험 물질의 민감성 효과는, 단계 (b)에서 측정되는 하나 이상의 바이오마커(들)의 세포 집단에서의 발현이 양성 대조군 샘플에서의 발현과 유사 또는 동일한 현상으로 표시된다.
바람직하게는, 본 방법은 하기로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 단계 (b)에서 포함한다:
i) 미각 (taste) 수용체, 유형 2, 멤버 5 (TAS2R5),
ii) 케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질(hypothetical protein) FLJ20444 (KGFLP1/2/ FLJ20444),
iii) 막관통 전 후 변환 1(transmembrane anterior posterior transformation 1: TAPT1),
iv) 스프라우티 상동체 2 (SPRY2: sprouty homolog 2),
v) 지방산 신타제 (FASN),
vi) B-세포 CLL/림프종 7A (BCL7A),
vii) 용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32 (SLC25A32),
viii) 페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 (FTHP1: ferritin, heavy polypeptide pseudogene 1),
ix) ATPase, H+ 수송, 리소좀(lysosomal) 50/57kDa, V1 서브유닛 H (ATP6V1H),
x) 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE: squalene epoxidase), 및
xi) 히스톤 클러스터 1, H1e (HIST1H1E).
이에, 일 구현예에서, 미각 수용체, 타입 2, 멤버 5 (TAS2R5)의 발현을 단계 (b)에서 측정한다. 다른 구현예에서, 단계 (b)에서, 케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질 FLJ20444 (KGFLP1/2/ FLJ20444)의 발현을 측정한다. 본 방법은 단계 (b)에서 막관통 전 후 변환 1 (TAPT1)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 방법은 단계 (b)에서 스프라우티 상동체 2 (SPRY2)의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 그러나, 다른 구현예에서, 본 방법은 단계 (b)에서 지방산 신타제 (FASN)의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 본 방법은 단계 (b)에서 B 세포 CLL/림프종 7A (BCL7A)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계 (b)에서 용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32 (SLC25A32)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로, 단계 (b)에서, 페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 (FTHP1)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예는 단계 (b)에서 ATPase, H+ 수송, 리소좀 50/57kDa, V1 서브유닛 H (ATP6V1H)의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 단계 (b)는 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE)의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 히스톤 클러스터 1, H1e (HIST1H1E)의 발현을 단계 (b)에서 측정한다.
본 방법은, 단계 (b)에서, 표 3A 유래의 2 이상의 바이오마커, 예컨대, 표 3A 유래의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 단계 (b)에서 지방산 신타제 (FASN)와 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE)의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성된다.
본 방법은, 부가적으로, 또는 다른 예로서, 단계 (b)에서 표 3B 유래 2종 이상의 바이오마커, 예컨대 표 3B 유래의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188 또는 적어도 189 종 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
따라서, 표 3A에 기재된 모든 바이오마커의 발현 및/또는 표 3B에 기재된 모든 바이오마커의 발현을 단계 (b)에서 측정할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 하나 이상의 바이오마커(들)를 코딩하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이로 구성된다. 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 mRNA 분자이다.
일 구현예에서, 단계 (b)에서 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현은 서던 혼성화, 노던 혼성화, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), 정량적인 실시간 PCR (qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자동 방사능 측정법 및 인 시츄 혼성화로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다.
본 방법은, 표 3에서 확인되는 바이오마커들 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 각각 선택적으로 결합할 수 있는, 하나 이상의 결합 모이어티를 이용하여, 단계 (b)에서 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 이로 구성된다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개의 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 다른 구현예에서, 이는 15 내지 35개의 뉴클레오티드 길이이다.
적정 결합 물질 (또한, 결합 분자로서 언급됨)은, 후술되는 바와 같이, 주어진 핵산, 단백질 또는 아미노산 모티프에 결합하는 능력을 기초로 라이브러리로부터 선택 또는 스크리닝할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티를 포함한다.
"검출가능한 모이어티"는 이의 존재 및/또는 상대적인 함량 및/또는 위치 (예, 어레이 상의 위치)를 직접 또는 간접적으로 확인할 수 있는 모이어티를 포함한다.
적절한 검출가능한 모이어티는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
예컨대, 검출가능한 모이어티는 형광성 및/또는 발광성 및/또는 화학발광성 모이어티일 수 있으며, 이것이 특정 조건에 노출되었을 때, 검출될 수 있다. 이러한 형광성 모이어티는, 형광성 모이어티의 여기를 야기함으로써 검출할 수 있는 특정 파장에서 검출가능한 형광을 방출할 수 있도록, 특정 파장 및 강도의 방사선 (즉, 광)에 노출시켜야 할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 검출가능한 모이어티는 (바람직하게는, 검출불가한) 기질을 가시화 및/또는 검출가능할 수 있는 검출가능한 생성물로 변환할 수 있는 효소일 수 있다. 적정 효소의 예들은 예컨대 ELISA 분석과 관련하여 아래에서 보다 상세하게 논의된다.
그래서, 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티 (예, 방사능 원자); 또는 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 검출가능한 모이어티는 방사능 원자를 포함하거나 이로 구성된다. 방사능 원자는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
명확하게는, 검출할 물질 (예, 시험 샘플내 및/또는 본원에 기술된 대조군 샘플내 하나 이상의 바이오마커및/또는 선택 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체 분자)은 검출가능한 모이어티가 쉽게 검출될 수 있도록 적절한 원자 동위원소를 충분히 가져야 한다.
다른 바람직한 구현예에서, 결합 모이어티의 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티이다.
방사성- 또는 기타 표지 물질은 본 발명의 방법의 샘플에 존재하는 바이오마커 및/또는 공지된 방식으로 본 발명의 결합 모이어티에 병합할 수 있다. 예를 들어, 결합 물질이 폴리펩타이드인 경우, 이는 생합성하거나, 또는 예컨대 수소 대신 F-19를 사용하는 적정 아미노산 전구체를 이용하여 아미노산을 화학 합성함으로써 합성할 수 있다. 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In 등의 표지 물질은, 예컨대 결합 모이어티내 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57)을 이용하여, 123I를 병합시킬 수 있다. 문헌 ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 다른 방법들을 상세하게 기술하고 있다. 다른 검출가능한 모이어티 (효소, 효소, 형광, 발광, 화학발광 또는 방사능 모이어티)를 단백질에 접합하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 테스트할 샘플(들)내 바이오마커를 단백질의 존재, 양 및/또는 위치를 결정하는데 간접적으로 일조하는 모이어티로 표지할 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 모이어티는 다인자 검출성(multicomponent detectable) 모이어티 구성 요소 하나를 구성할 수 있다. 예를 들어, 테스트할 샘플(들)내 바이오마커는, 검출가능한 표지 물질에 연결되거나 또는 융합된 스트렙타비딘을 이용하여 후속적인 검출이 가능한, 바이오틴으로 표지할 수 있다.
본 발명의 제1 측면에 대한 다른 구현예에서, 단계 (b)는 하나 이상의 바이오마커(들) 단백질의 발현을 확인하는 단계를 포함한다. 본 방법은, 각각 표 3에 명시된 바이오마커들 중 한가지에 선택적으로 결합할 수 있는, 하나 이상의 결합 모이어티를 이용하여, 단계 (b)에서 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 결합 모이어티는 단일클론 항체 또는 이의 단편 등의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
용어 "항체"는 임의의 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드, 예컨대, 비제한적인 예로서, 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변부 및/또는 불변부에 대한 파지-디스플레이에 의해 생산되는 단쇄 항체 분자, 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있는 면역분석 포맷에서 항원에 결합할 수 있는 다른 면역상호작용성 분자를 포함한다.
또한, 본 발명자들은 어피바디(affibody) 및 앱타머 등의 항체-유사 결합 물질의 사용을 포괄한다.
그 특이적인 결합부를 가진 항체 단편의 합성에 사용되는 기법들에 대한 포괄적인 리뷰는 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299에서 확인된다.
부가적으로, 또는 대안적으로, 하나 이상의 제1 결합 분자는 앱타머일 수 있다 (Collett et al., 2005, Methods 37:4-15 참조).
항체 라이브러리 등의 분자 라이브러리 (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), 펩타이드 라이브러리 (Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), 발현된 cDNA 라이브러리 (Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), 어피바디 등의 항체 프래임워크 이외의 다른 스캐폴드 상의 라이브러리 (Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) 또는 앱타머에 기초한 라이브러리 (Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31)를, 해당 모티프에 특이적인 결합 분자를 본 발명의 방법에 사용하기 위해 선택하는 소스로서 사용할 수 있다.
분자 라이브러리는 원핵 세포 (Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op. cit.) 또는 진핵 세포 (Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6)에서 발현시키거나, 또는 세포를 사용하지 않고 시험관내에서 발현시킬 수 있다 (Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).
단백질 기반의 라이브러리가 사용되는 경우, 잠재적인 결합 분자 라이브러리를 코딩하는 유전자는 대개 바이러스내에 패킹되며, 잠재적인 결합 분자는 바이러스의 표면에 제시된다 (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).
아마도, 가장 흔히 사용되는 디스플레이 시스템은 그 표면에 항체 단편을 나열하는 필라멘트형 박테리오파지로서, 항체 단편은 박테리어파지의 마이너 막 단백질에 융합체로서 발현된다 (Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). 그러나, 다른 적합한 디스플레이 시스템은, 그외 바이러스 (EP 39578), 박테리아 (Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21), 및 효모 (Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56)의 이용을 포함한다.
아울러, 소위 리소좀 디스플레이 시스템에서 폴리펩타이드 산물과 이의 코딩 mRNA의 연결 (Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), 또는 다른 예로 폴리펩타이드 산물과 이의 코딩 DNA의 연결 (미국 특허 5,856,090 및 WO 98/37186)을 이용하여, 디스플레이 시스템이 개발된 바 있다.
항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인은 초기 프로테아제 분해 실험을 통해 처음으로 인지된 사실인 항원 인지(antigen recognition)에 참여한다. 추가적으로 설치류 항체의 "인간화"를 통해 검증되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은, 제조되는 항체가 설치류 모계 항체의 항원 특이성(antigenic specificity)을 유지하도록, 인간 기원의 불변 도메인에 융합시킬 수 있다 (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).
하나 이상의 가변 도메인을 포함하는, 항체 단편들의 박테리아에서의 발현을 수반하는 실험에서 확인된 바와 같이, 항원 특이성은 가변성 도메인에 의해 부여되며, 불변 도메인과는 무관하다. 이들 분자로는 Fab-유사 분자 (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자 (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); 유연한 올리고펩타이드를 통해 VH 및 VL 파트너 도메인이 연결된, 단쇄 Fv (ScFv) 분자 (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) 및 분리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAb)를 포함한다 (Ward et al (1989) Nature 341, 544). 특이 결합 부위를 가진 항체 단편을 합성에 이용하는 기법들에 대한 전반적인 리뷰는 Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299에서 확인된다.
항체 또는 항원 결합 단편은, 무손상 항체, Fv 단편 (예, 단쇄 Fv 및 이황화 결합된 Fv), Fab-유사 단편 (예, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인 (예, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체들 (dAbs, 단일 및 듀얼 형태 포함 [즉. dAb-링커-dAb])로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv)이다.
하나 이상의 결합 모이어티는, 다른 예로, 항원-유사 결합 물질, 예컨대 아피바디 또는 앱타머를 포함하거나, 또는 이로 구성될 수 있다.
"scFv 분자"는 VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩타이드를 통해 연결된 분자를 의미한다.
항체는 전체가 아닌 단편을 이용하는 것이 몇배 더 유익하다. 작은 크기의 단편이 솔리드 조직으로의 투과성이 더 우수한 등의 개선된 약리학적 특성을 나타낼 수 있다. 보체 결합성 등의 완전 항체(whole antibody)의 작동자 기능이 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편들은 모두 E. coli에서 발현 및 분비시킬 수 있으며, 따라서 이들 단편들의 대량 생산이 용이할 수 있다.
전체 항체 및 F(ab')2 단편은 "2가(bivalent)"이다. "2가"는 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 가지다는 의미이다. 반면, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 항원 조합 부위가 오직 하나인 1가이다.
항체는 단일클론 또는 다클론성일 수 있다. 적합한 단일클론 항체는 공지 기법에 의해, 예컨대 "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
잠재적인 결합 분자를 라이브러리에서 선별하는 경우, 규정된 모티프를 가지는 하나 이상의 선택자 펩타이드가 통상적으로 사용된다. 구조, 펩타이드의 유연성 감소, 또는 결합 분자와의 상호작용을 허용하는 하전된, 극성 또는 소수성 측쇄를 제공하는 아미노산 잔기가, 선택자 펩타이드에 대한 모티프 설계에 사용될 수 있다. 예컨대:
(i) 프롤린은, 측쇄가 알파 탄소 뿐만 아니라 질소 둘다에 결합하므로, 펩타이드 구조를 안정시킬 수 있으며;
(ii) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판은 방향족 측쇄를 가지며, 소수성이 강한 반면, 루신 및 이소루신은 지방족 측쇄를 가지며 또한 소수성이며;
(iii) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 염기성 측쇄를 가지며, 중성 pH에서 양 전하를 띌 것이나, 아스파르테이트 및 글루타메이트는 산성 측쇄를 가지며, 중성 pH에서 음 전하를 띌 것이며;
(iv) 아스파라긴 및 글루타민은 중성 pH에서는 중성이지만, 수소 결합에 참여할 수 있는 아미드기를 함유하며;
(v) 세린, 트레오닌 및 티로신 측쇄는 수소 결합에 참여할 수 있는 하이드록시기를 함유한다.
전형적으로, 결합 분자의 선택에는, 결합 분자의 타입들에 대응되는 스팟에 대한 결합성을 분석하기 위한 어레이 기법 및 시스템의 사용이 적용될 수 있다.
하나 이상의 단백질 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티, 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티 및 효소 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 잇다.
본 발명의 방법에 대한 다른 구현예에서, 단계 (b)는, 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있으며, 또한 검출가능한 모이어티를 포함하는, 제2 결합 물질을 포함하는, 분석을 이용하여 수행될 수 있다. 적합한 제2 결합 물질은 제1 결합 물질과 관련하여 상기에서 상세하게 기술된다.
따라서, 테스트할 샘플내 대상 단백질은 제1 결합 물질을 이용하여 먼저 분리 및 고정할 수 있으며, 이후 상기 바이오마커의 존재 및/또는 상대적인 함량을 제2 결합 물질을 이용하여 결정할 수 있다.
일 구현예에서, 제2 결합 물질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 전형적으로, 재조합 항체 또는 이의 단편이다. 편리하게는, 항체 또는 이의 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 항체 및 단편, 및 이의 제조 방법은 상기에 상세히 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 제2 결합 물질은 어피바디 또는 앱타머 등의 항원-유사 결합 물질일 수 있다.
다른 구현예에서, 테스트할 샘플내 단백질 상의 검출가능한 모이어티가 특이 결합 쌍의 멤버 (예, 바이오틴)를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 제2 결합 물질은 특이 결합 쌍의 상보적인 멤버 (예, 스트렙타비딘)를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
검출 분석을 사용하는 경우, 검출가능한 모이어티는 형광 모이어티; 발광 모이어티; 화학발광 모이어티; 방사성 모이어티; 효소적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 이용하기 위한 적합한 검출가능한 모이어티의 예들은 상기에 기술되어 있다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하는 바람직한 분석은 효소 연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (RIA), 면역방사측정 분석 (IRMA) 및 면역효소 분석 (IEMA), 예컨대 단일클론 및/또는 다클론 항체를 이용한 샌드위치 분석을 포함한다. 샌드위치 분석의 예는 데이비드 등의 미국 특허 4,376,110 및 4,486,530에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 슬라이드 상에서 세포를 염색하는 항체를, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 세포 실험 진단 검사에서 잘 공지된 방법에 이용할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 분석은 전형적으로 통상 고상 분석에서 발색 반응 산물을 제공하는 효소를 사용하는 ELISA (효소 연결된 면역흡착 분석)이다. 호르세라디쉬 퍼옥시다제 및 포스파타제 등의 효소가 널리 사용되고 있다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방식은 제2 효소 시스템에 대한 조효소로서 현재 작용하는 NAD를 만들기 위해 기질로서 NADP를 사용하는 것이다. 에스캐리키아 콜라이 유래 피로포스파타제는, 조직내에 존재하지 않지만, 안정적이고, 양호한 반응 발색을 제공하기 때문에, 양호한 접합체로서 제공된다. 루시퍼라제 등의 효소에 기반한 화학발광도 이용할 수 있다.
비타민 바이오틴과의 접합체는, 높은 특이성과 친화성으로 결합하는 효소-연결된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응을 통해 쉽게 검출할 수 있어, 자주 사용되고 있다.
다른 구현예에서, 단백질을 검출하기 위해 사용되는 분석은 편리하게는 형광측정 분석이다. 따라서, 제2 결합 물질의 검출성 모이어티는 알렉사 플루오로포어 (예, Alexa-647) 등의 형광 모이어티일 수 있다.
바람직하게는, 단계　(b)는 분석을 이용하여 수행된다. 분석은 비드를 이용한 분석 또는 표면에 기반한 분석일 수 있다. 분석은 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 인간 피부에서 과민 반응을 유도할 수 있는 물질을 동정하기 위한 것이다. 바람직하게는, 과민 반응은 세포-매개 과민 반응, 예컨대, IV형 과민 반응이다. 바람직하게는, 방법은 알레르기성 접촉성 피부염 (ACD) (즉, 과민 반응은 ACD임)을 유도할 수 있는 물질을 동정하기 위한 것이다.
일 구현예에서, 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단은 수지상 세포 집단이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 원시(primary) 수지상 세포이다. 바람직하게는, 수지상 세포는 골수성 수지상 세포이다.
수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 집단은 바람직하게는 포유류 기원이다. 바람직하게는, 포유류는 랫, 마우스, 기니아피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
일 구현예에서, 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단은 수지상-유사 세포 집단, 바람직하게는 골수성 수지상-유사 세포이다.
일 구현예에서, 수지상-유사 세포는 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 마커를 발현한다. 다른 구현예에서, 수지상-유사 세포는 마커 CD54, CD86, CD80, HLA-DR, CD14, CD34 및 CD1a를 발현한다.
다른 구현예에서, 수지상-유사 세포는 골수성 수지상 세포로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 수지상-유사 세포는 골수성 백혈병-유래 세포이다. 바람직하게는, 골수성 백혈병-유래 세포는 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 및 MUTZ-3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 수지상-유사 세포는 MUTZ-3 세포이다. MUTZ-3 세포는 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운슈바이크에 위치한 DSMZ(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 인간 급성 골수단구성 백혈병 세포이다 (www.dsmz.de; 기탁번호 ACC 295).
일 구현예에서, 수지상-유사 세포는, 사이토카인으로 자극된 후, CD1d, MHC 클래스 I 및 II를 통해 항원을 제시하거나, 및/또는 특이적인 T 세포 증식을 유도한다.
일 구현예에서, 음성 대조군 물질(들)은 1-부탄올, 4-아미노벤조산, 벤즈알데하이드, 클로로벤젠, 디에틸 프탈레이트, 디메틸 포름아미드, 에틸 바닐린, 글리세롤, 이소프로판올, 락트산, 메틸 살리실레이트, 옥탄산, 프로필렌 글리콜, 페놀, p-하이드록시벤조산, 과망간산 칼륨, 살리실산, 소듐 도데실 설페이트, Tween 80 및 황산아연으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법은, 2 이상의 음성 대조군 물질 (즉, 비-민감성 물질), 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 적어도 20종의 음성 대조군 물질의 사용을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 양성 대조군 물질(들)은 2,4-디니트로클로로벤젠, 옥사졸론, 중크롬산 칼륨, Kathon CH (MC/MCI), 포름알데하이드, 2-아미노페놀, 2-니트로-1,4-페닐렌디아민, p-페닐렌디아민, 헥실신남 알데하이드, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-머캅토벤조티아졸, 글리옥살, 신남알데하이드, 이소유게놀, 에틸렌디아민, 레조르시놀, 신남 알코올, 유게놀, 페니실린 G 또는 제라니올로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 방법은 2 이상의 양성 대조군 (즉, 민감성 물질), 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 적어도 20종의 양성 대조군 물질의 사용을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 테스트 물질이 민감성 물질인지 아닌지를 표시해준다. 다른 또는 추가적인 구현예에서, 본 방법은 테스트할 샘플의 민감성 효과를 표시해준다.
일 구현예에서, 본 방법은 테스트할 샘플의 민감성 효과를 국소 림프절 분석 (LLNA) 분류로 표시해준다. LLNA에 대한 상세할 설명은, Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8을 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 방법은 테스트할 샘플의 민감성 효과를 기니아피그 극대화 검사 분류로 표시해준다. 기니아피그 극대화 검사에 대한 상세한 설명은 Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76을 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
따라서, 일 구현예에서, 본 방법은 비-민감성 물질, 약 민감성 물질, 강 민감성 물질 또는 최강의 민감성 물질 중 한가지이다. PCA에서의 결정 값과 거리는 민감성 물질의 효과와의 상관성을 나타낸다.
일반적으로, 피부 민감성 물질은 ROC AUC 0.55 이상으로, 예컨대, ROC AUC 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99 이상, 또는 ROC AUC 1.00으로 결정된다. 바람직하게는, 피부 민감성 물질은 ROC AUC 0.85 이상, 가장 바람직하게는 ROC AUC 1로 결정된다.
전형적으로, 민감화를 유도할 수 있는 물질은 http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html (예, e1071 1.5-24)에서 이용가능한 바와 같은 서포트 벡터 머신 (SVM)을 이용하여 식별한다. 그러나, 임의의 다른 적절한 수단도 이용가능할 수 있다.
서포트 벡터 머신 (SVM)은 분류 및 회귀(regression)를 위해 사용되는 관련 지도 학습법의 한 세트이다. 각각 2가지 카테고리 중 하나에 속하는 것으로 표시되는 훈련 예들로 구성된 세트를 감안하여, SVM 훈련 알고리즘으로 새로운 사례가 하나의 카테고리나 다른 카테고리에 해당되는지를 예측하는 모델을 구축한다. 직관적으로, SVM 모델은 개별 카테고리들의 사례들이 가능한 넓은 클리어 갭에 의해 분할되도록 맵핑된, 공간내 포인트로서 사례를 표시한다. 그런 후, 새로운 사례들을 동일한 공간으로 맵핑하여, 이것이 속하는 갭 사이드를 근거로 카테고리에 속하는지를 예측한다.
보다 공식적으로는, 서포트 벡터 머신은 고차원 또는 무한 차원 공간에서 초평면(hyperplane) 또는 초평면 세트를 구축하며, 이를 분류, 회귀 또는 기타 목적으로 사용할 수 있다. 직관적으로, 일반적으로 마진(margin)이 클수록 분류기(classifier)의 일반화 오류는 낮아지므로, 양호한 분리는 임의의 클래스의 최근접 학습 데이타포인트들과의 거리가 가장 먼 초평면에 의해 달성된다. SVM에 대한 더 많은 정보는, 예컨대, Burges, 1998, Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-167을 참조한다.
본 발명의 일 구현예에서, SVM은 공지 물질 (즉, 공지 민감성 물질 또는 비-민감성 물질)의 바이오마커 프로파일을 이용하여 본 발명의 방법을 수행하기 전에, "훈련"된다. 이러한 훈련 샘플들을 수행함으로써, 어떤 바이오마커 프로파일이 민감화를 유도할 수 있는 물질과 관련있는지를 SVM으로 학습할 수 있다. 훈련 고정이 완료되면, SVM은 테스트한 바이오마커 샘플이 민감성 물질 또는 비-민감성 물질인지의 여부를 판단할 수 있다.
이로써 민감성 또는 비-민감성으로 시험 물질을 분류할 수 있다. 아울러, 효능이 공지된 민감성 물질 (즉, 비-민감성, 약, 중, 강 또는 최강 민감성 물질)로 SVM을 훈련함으로써, 테스트 물질의 효과도 비교하여 동정할 수 있다.
그러나, 이러한 훈련 과정은 SVM을 필수 훈련 파라미터로 사전-프로그래밍함으로써 우회할 수 있다. 예컨대, 민감화를 유도할 수 있는 물질은, 표 3(A) 및 1(B)에 열거된 모든 바이오마커들에 대한 측정값을 기초로, 표 5에 상세히 기술된 SVM 알고리즘을 이용하여 공지 SVM 파라미터들에 따라 동정한다.
당업자라면, 적절하게 선택된 데이타 (즉, 공지의 민감성 및/또는 비-민감성 물질에 노출된 세포의 바이오마커 측정값)로 SVM 머신을 훈련함으로써, 표 3에 열거된 바이오마커들의 임의 조합에 대해 적합한 SVM 파라미터를 결정할 수 있다는 것을 알게 될 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 73%, 예컨대 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 정확도를 가진다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 73%, 예컨대 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 민감도(sensitivity)를 가진다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 68%, 예컨대 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 특이도(specificity)를 가진다.
"정확도"는 방법의 결과가 참인 비율이고, "민감도"는 모든 양성 화합물 중 양성으로 맞게 분류된 비율이며, "특이도"는 모든 음성 화합물 중에서 음성으로 맞게 분류된 비율이다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면의 방법 (또는 임의 구현예 또는 이들 구현예들의 조함)에 사용하기 위한 어레이를 제공하며, 상기 어레이는 전술한 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 3A에 명시된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 3B에 명시된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 결합 모이어티는 (총체적으로) 표 3A 및 표 3B에 명시된 모든 바이오마커에 결합할 수 있다.
결합 모이어티는 고정될 수 있다.
어레이 자체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 어레이는 고형 지지체의 표면 상에 형성된, 각각 한정된 면적을 가지는, 이격된 (즉, 분리된) 영역 ("스팟들")을 가진 선형 또는 2차원 구조로 형성된다. 또한, 어레이는, 각 비드를 분자 코드나 색상 코드에 의해, 또는 연속적인 흐름에서 동정할 수 있는, 비드 구조일 수 있다. 또한, 분석은, 샘플을 용액으로부터 분자 클래스를 각각 흡착하는 일련의 스팟들 위로 통과시켜, 순차적으로 수행할 수 있다. 고형 지지체는 전형적으로 유리 또는 폴리머이며, 가장 일반적으로 사용되는 폴리머는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고형 지지체는 관, 비드, 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막, 니트로셀룰로스 멤브레인, 나일론 멤브레인, 기타 다공성 멤브레인, 비-다공성 멤브레인 (예, 특히 플라스틱, 폴리머, 퍼스펙스, 실리콘), 복수의 폴리머 핀, 또는 복수의 마이크로타이터 웰, 또는 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 기타 적정 분자를 고정 및/또는 면역분석을 수행하는데 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 프로세스는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 고형 지지체에 대한 단백질 분자, 폴리뉴클레오티드 등의 가교 공유결합 또는 물리적인 흡착으로 이루어진다. 다른 구현예에서, 친화성-텍(tag) 또는 유사 구조체를 통한 프로브들의 친화성 커플링을 적용할 수 있다. 접촉식 또는 비접촉식 프린팅, 마스킹 또는 포토리소그라피 등의 잘 알려져 있는 기법들을 이용함으로써, 각 포인트의 위치를 동정할 수 있다. 리뷰로서, Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) 및 Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)를 참조한다.
전형적으로, 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이"는 개별 구역의 밀도가 적어도 약 100/cm2인, 바람직하게는 적어도 약 1000/cm2인 구역의 어레이를 의미한다. 마이크로어레이내 구역들은 전형적인 크기, 예컨대 약 10 - 250 mm 범위의 직경을 가지며, 거의 동일한 거리로 어레이내 다른 구역들과 이격되어 있다. 어레이는 다른 예로 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
(전술한) 적정 결합 분자가 식별 및 분리되면, 당업자는 분자 생물학의 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 어레이를 제작할 수 있으며; 하기 내용을 참조한다.
본 발명의 제3 측면은, 과민 반응에 대한 민감성 물질의 식별과 조합하여, 표 3A 및/또는 표 3B에 명시된 군으로부터 선택되는 하나 이상 (바람직하게는 2종 이상)의 바이오마커의 사용을 제공한다. 바람직하게는, 표　3A 및 표 3B에 명시된 모든 바이오마커들이 총체적으로 과민 반응에 대한 민감성 물질을 식별하는데 사용된다. 바람직하게는, 사용은 본 발명의 제2 측면에 기술된 방법과 이와 관련되어 기술된 구현예들에 부합된다.
본 발명의 제4 측면은 하기를 포함하거나, 이로 구성되는, 본 발명의 제1 측면에 따른 방법으로 사용하기 위한 분석 키트를 제공한다:
A) 본 발명의 제2 측면에 따른 어레이; 및
B) 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서 (선택사항임).
분석 키트는 하나 이상의 대조군 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분석 키트는, 하나 이상의 음성 대조군 및/또는 하나 이상의 양성 대조군와 더불어, 전술한 구성 요소들을 포함하거나, 이로 구성된다.
본 발명의 특정 측면을 구현하는 바람직한, 비제한적인 예들이 아래 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1. 민감성 화합물 및 비-민감성 화합물로 자극되기 전의 MUTZ-3 세포의 표현형
CD14, CD1a, CD34, CD54, CD80, CD86 및 HLA-DR의 세포 표면 발현 수준을 유세포 측정으로 평가하였다. 게이트는 파편 및 사멸 세포를 배제하는 것으로 설정하였으며, 관련 이소형 대조군들을 비교함으로써 사분면을 확립하였다. 6번 중 대표적인 1회 실험의 결과를 나타낸다.
도 2. 민감성 화합물 및 비-민감성 화합물로 자극된 후 CD86의 발현 변화
화합물로 24시간 자극한 후 CD86의 세포 표면 발현 수준을 모니터링하였다. A). 양성 세포의 발생율 변화 측면에서, CD86의 화합물-유발성 상향조절을, 2-아미노페놀-자극된 세포 (우측 돗플롯(dotplot) 및 비자극된 대조군 (좌측 돗플롯)와의 비교를 통해 예시된 바와 같이, 유세포 측정으로 측정하였다. 3번 중 1번의 대표적인 실험의 결과를 나타낸다. B) 24시간 자극 후 CD86-양성 세포의 발생율 산정. 통계 분석은 페어드 스튜던트 t 검정(paired Student's t test)을 이용하여 수행하였다. *p < 0.05, # p < 0.01. NA, 분석 안 함.
도 3. 화학 자극 후 차별적으로 발현되는 전사체들에 대한 주 성분 분석
20종의 민감성 화합물 및 20종의 비-민감성 화합물로 24시간 자극한 MUTZ-3 세포에서의 mRNA 수준을, 어피메트릭스 인간 유전자 1.0 ST 분석을 이용하여 트랜스크립토믹스로 평가하였다. 유전자 발현 데이타세트에서 구조 및 유사성을 소프트웨어 Qlucore에서 주 성분 분석 (PCA)을 이용하여 조사하였다. A) 비-민감성 (그린) 화합물 대비 민감성 화합물 (레드)로 자극된 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자의 PCA (일원식 ANOVA로 식별된 유전자 1010종). B) 비-민감성 화합물들과 비교하여 민감성 화합물로 자극된 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자들의 PCA(유전자 1010종)로서, 현재 샘플들은 자극에 사용된 화합물에 의해 색을 띤다. C) 2원식 ANOVA로 여러가지 자극들을 비교하였을 때 차별적으로 발현된 유전자들의 PCA (유전자 1137종). 샘플들은 민감성 화합물 (레드) 및 비-민감성 화합물 (그린)에 따라 색을 띤다. D) 2원식 ANOVA로 여러가지 자극들을 비교하였을 때 차별적으로 발현된 유전자들의 PCA (유전자 1137종)로서, 현재 샘플들은 자극을 위해 사용된 화합물에 의해 색을 띤다. P, ANOVA에서 구한 p-값. Q, p-값은 다중 가설 검정을 교정하였다.
도 4. "예측 시그니처"의 동정 및 PCA 분석
A) 비-민감성 화합물 (유전자 1010종)과 비교하여, 민감성 화합물로 자극받은 세포에서 차별적으로 발현되는 유의한 유전자들의 수를 백워드 소거(Backward Elimination)를 이용하여 축소시켰다. 브레이크포인트(Breakpoint)로 지칭되는 분석물 810종의 제외 후, 최소 KLD가 관찰되었다. 나머지 유전자 200종은 데이타 세트에서 상위(top) 예측자로 간주되며, 이들을 "예측 시그니처"로 지칭한다. B) 민감성 물질 (레드) 및 비-민감성 물질 (그린) 간의 완전한 분리가 "예측 시그니처"의 PCA에서 관찰된다. C) B에서와 동일한 PCA, LLNA에서의 효과에 따라 색을 띄는 샘플을 이용함.
도 5. "예측 시그니처"의 선별 프로세스의 검증
"예측 시그니처"를 구축하는 방법은, 랜덤 선별된 데이타 세트의 70%를 대상으로 과정을 반복함으로써 검증하였다. 나머지 데이타 30%는 시그니처 검증의 검정 세트로서 사용하였다. A) PCA는, "시험 유전자 시그니처"는 비-민감성 물질과 민감성 물질을 구분할 수 있음을 보여준다. 밝은 색을 띄는, 70% 훈련 세트의 샘플들만 사용하여, 제1 3종의 주성분들로 구성된 공간을 구축하였다. 진한 색을 띄는 검정 세트 샘플을 "시험 유전자 시그니처"에 대한 분석물의 발현 수준을 기반으로 이 공간에 나타내었다. B) SVM은 70% 훈련 세트에서 훈련하고, 30% 검정 세트로 검증하였다. ROC 커브 1.0 하 면적은, 검정 세트내 모든 샘플들에 대해 이들이 속하는 그룹을 정확하게 예측하는 것으로 입증되며, 이는 "시험 유전자 시그니처"의 효력(strength)도와, 조합에 의해 또한 본 발명자들의 "예측 시그니처"의 효력을 입증해준다.
도 6. "예측 시그니처"의 인터렉톰(interactome)
분자 200종 (오렌지색) 및 IPA의 근거에 따라 이들을 연결하는 분자들의 인터렉톰. 직접 상호작용은 실선으로 나타내고, 점선으로 간접 상호작용을 표시한다.
실시예들
알레르기성 접촉성 피부염은 집단의 상당히 높은 비율에서발생하는 염증성 피부 질환이다. 이는 사회에 상당한 경제적인 부담을 주는 화합물 합텐에 대한 면역학적 반응을 통상적으로 야기한다. 민감성 화합물에 대한 현행 검사는 동물 실험에 의존하고 있다. 화학제의 등록에 대한 새로운 입법과, 예를 들어, 약학 및 화장품 산업에서의 사용은, 민감성을 예측하기 위한 대안적인 인간 세포를 이용한 분석법을 개발하는데 상당한 연구 노력들을 불러일으켰다. 목적은 동물 실험을 예측력이 높은 시험관내 검사로 대체하고자 하는 것이다.
본 발명자들은 민감성 화합물을 예측하기 위한 새로운 세포 기반의 분석을 개발하였다. 여러가지 민감성 화합물 20종, 비-민감성 화합물 20종 및 비히클 대조군으로 24시간 자극한 후, 인간 세포주 MUTZ-3의 트랜스크립톰을 분석함으로써, 강력한 차별력을 지닌 바이오마커 시그니처 유전자 200종을 동정하였다. 지도 분류를 위한 서포트 벡터 머신을 이용하여, 분석의 예측 성능의 정확도가 100%, 민감도가 100% 및 특이성이 100%임을 확인하였다. 아울러, LLNA 분석에 따라 화합물을 분류함으로써, 이들 유전자 시그니처의 효력을 예측할 수 있었다. 동정된 마커들은 인간 민감화 과정을 조명할 수 있는 면역 관련 기능을 구비한 생물학적 경로에 참여한다.
시험관내 인간 세포주를 이용한 민감성 예측용 유전자 시그니처가 개발되었다. 이러한 쉽고, 확고한 세포 기반의 분석은, 실험 동물을 이용하는 현행 검사 시스템을 완전히 대체하거나 급격하게 감소시킬 수 있다. 인간 생물학에 기반한 분석은, 전통적인 동물 기반의 검사 보다, 인간에 대한 민감화를 예측하는데 보다 적합하며, 보다 정확한 것으로 간주된다.
결과
시험관내 세포 배양 시스템의 세포 적합성
선천적인 면역과 후천적인 면역을 연결하는 것으로 작용하는 DC는 면역 시스템의 필수적인 면역조절 세포이다. T 세포 반응을 개시할 목적으로 항원을 인지하는 이의 고유한 특성과 면역 반응을 편향시키는 이의 강력한 조절 기능은, 분석법의 개발에 타겟이 된게 한다. 그러나, 원시 DC는 스크리닝에 적합하지 않은 혼성의(heterogeneous) 소수 세포 집단을 구성한다. 원시 DC와 비슷한 특징들을 갖춘 세포주를 예측 검사의 토대로 이용함에 있어 확실한 이점은, 안정성, 재현성 및 무한정의 세포 공급을 제공한다는 것이다. 지금까지, 명확한 DC-유사 특징들을 가진 백혈병 세포는, 이러한 타입의 세포의 특징들이 세포 분열 후에만 만들어 수 있는 복잡한 말기 분화 프로세스에 의해 결정되기 때문에, 보고된 바 없으며 [11], 따라서, DC-유사 세포주의 생성은 이용가능한 골수성 백혈병 세포주에 의존한다. MUTZ-3는 강력한 DC로의 분화력, 항원 제시력 및 특이 T 세포 증식 유도력을 가지고 있는 인간 급성 골수단핵구성 백혈병 세포주이다. 이용가능한 골수성 인간 세포주들 중에서도, MUTZ-3가 지금까지 바람직한 후보세포이다. 미성숙한 원시 DC와 마찬가지로, MUTZ-3 선조세포는 CD1a, HLA-DR 및 CD54를 발현하며, 아울러 CD80와 CD86도 낮은 수준으로 발현한다 (도 1). 또한, MUTZ-3 집단은, 증식성 CD34+ 선조세포에서 비-증식성 CD14+ DC 전구세포(precurosr)로의 중간 분화 단계들인 것으로 종래에 보고된, CD14+, CD34+ 및 2중 음성 세포로 구성된 3종의 아집단을 포함하고 있다 [19]. 따라서, 본 발명자들은 검사 시스템의 토대로서 분화성 선조세포 MUTZ-3 세포를 구성 요소로 활용하였다.
민감성 물질의 자극에 반응하여 CD86의 표면 발현: CD86은 지금까지 단핵구 유래 수지상 세포 (MoDC) 또는 수지상 세포-유사 인간 세포주 및 이들의 선조세포들, 예컨대 THP-1, U-937 및 KG-1과 같은 세포-시스템에서 가장 널리 연구된 민감성 바이오마커이다. 따라서, 기준 물질로서, CD86의 세포 표면 발현을 민감성 물질 20종과 비-민감성 물질 20종, 그리고 비히클 대조군 (표 1)으로 24시간 자극한 후, 유세포 측정으로 측정하였다. CD86은 2-아미노페놀, Kathon CG, 2-니트로-1,4-페닐렌디아민, 2,4-디니트로클로로벤젠, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 신남 알데하이드, p-페닐렌디아민, 레조르시놀, 및 2-머캅토벤조티아졸로 자극된 세포에서 현저하게 상향-조절되었다. CD86과 같은 단일 바이오마커의 측정 결과를 토대로한 분석은 민감도가 47%이며, 특이도가 100%이었다. 따라서, CD86은 MUTZ-3과 같은 세포 기반 시스템을 이용하여 피부 민감성 물질을 분류할 수 없다.
화학적으로 자극한 MUTZ-3 세포에서의 전사 프로파일 분석: 게놈 발현 어레이를 이용하여 민감성 물질 20종과 비-민감성 물질 20종을 3배수로, 그리고 DMSO 및 증류수 등의 비히클 대조군을 12배수로 검사하였다. 총체적으로, 샘플 144개를 기반으로 데이타 세트를 작성하였다. RMA 표준화(normalization) 및 샘플의 품질 관리(quality control)를 통해, 옥사졸론과 신남 알데하이드 샘플들이 유의한 범주 외 물질(outlier)인 것으로 확인되어, 이들을 제외시키거나, 또는 이들은 데이타 세트에서 우세하여 바이오마커 식별에 방해가 되는 것으로 확인되었다 (데이타 미기재). 아울러, 과망간산 칼륨의 레플리케이트들 중 하나는 어레이 결합으로 인해 제외시켜야 하였다. 이로써, 각각 전사체 33,297종에 대한 데이타를 갖춘, 샘플 137종으로 구성된 데이타 세트가 구축되었다. 민감성 물질 대 비-민감성 물질에 대한 구체적인 정보 데이타 세트를 입수하기 위해, ANOVA p-값 선별을 기초로, 원하는 범주, 예컨대 민감성 물질 및 비-민감성 물질로 입력 유전자를 분류하면서, 실시간 주 성분 분석 (PCA)을 수행할 수 있는 소프트웨어 Qlucore Omics Explorer 2.1을 사용하였다. 도 3A와 3B는 ANOVA 분석에서 p-값이 ≤ 2.0 x 10-6인 전사체 1010종에 대한 PCA 결과를 민감성 화합물 대 비-민감성 화합물로 비교 도시한 것이다. 도 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 2가지 군 간에 명확한 구별이 이루어질 수 있으며, 비-민감성 화합물들이 도의 하단부에서 응축된 군(condensed cloud)을 형성하고 (그린), 민감성 화합물들은 여러 방향으로 위쪽으로 뻗어 있다 (레드). 그러나, 이 유의성 수준에서는 2가지 군에 대한 완전한 분리는 이루어지지 않았다. 자극에 따라 색을 표시한 도 3B에서, 글리옥살, 유게놀, 헥실신남 알데하이드, 이소유게놀, 레조르시놀, 페니실린 G 및 에틸렌디아민의 하나 이상의 레플리케이트(replicate)가, 대조군과 함께 무리를 형성하는 것으로 보인다. 아울러, 비-민감성 화합물 Tween 80, 옥탄산 및 페놀의 하나 이상의 레플리케이트가 민감성 화합물과 무리를 형성하는 경향을 나타낸다. 도 3C 및 3D는, 여러가지 자극제를 비교하였을 때, 모두 p 값이 ≤ 7.0 x 10-21인 유전자 1137종에 대한 PCA 플롯을 나타낸 것이다. 이러한 유의성 수준에서 이렇듯 다수의 유전자 동정은, 데이타 세트의 파워에 대한 확실한 표명을 제공한다. 도 3D에서, 레플리케이트들은 함께 무리지어 있는 것으로 확인되는데, 이는 데이타가 질적으로 우수하다는 것을 의미한다. 중크롬산 칼륨에 대한 트레플리케이트 샘플들은 별도 분리된 프로파일을 가지는데, 이는 비-민감성 물질에 비해 세포에 대한 충격이 상당함을 의미한다. 아울러, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-아미노페놀, Kathon CG, 포름알데하이드, 2-니트로-1,4-페닐렌디아민, 2,4-디니트로클로로벤조산, p-페닐렌디아민, 2-머캅토벤조티아졸, 신남 알코올 및 레조르시놀은, 도 3C 및 3A에서 알 수 있는 바와 같이, 함께 무리를 형성하나 음성 대조군과는 이산된 레플리케이트들을 표시하며, 유전자 시그니처 유전자 1010 및 1137종 어느 것에서도 완전한 분리는 나타나지 않았다.
백워드 소거로 식별력이 가장 우수한 유전자들을 동정한다: 데이타 세트에 p 값이 1 x 10-17 보다 낮은 유전자들이 포함되어 있음에도 불구하고, p 값 컷오프에서는 민감성 물질과 비-민감성 물질을 완전히 분리시키지 못하였다. p 값으로만 선별한 유전자 시그니처는, p 값이 낮은 경우, 유전자가 어떠한 부가적인 정보를 제공한다고 보장되지 않기 때문에, 최상의 잠재적인 예측력을 나타내지 못한다. 예측 바이오마커 시그니처를 위한 전사체의 수를 더욱 줄이기 위해, 본 발명자들은 백워드 소거 알고리즘을 사용하였다 (도 4A). 이 알고리즘은, 유전자들의 충격을 각각 계산할 뿐만 아니라 오직 선정된 유전자 시그니처와 어떤 식으로 집합적으로 수행하는지를 고려하면서, 유전자를 하나씩 제외시킨다. 제외된 각각의 유전자는, 200종의 유전자가 남아있는 포인트에서 브레이크포인트에 도달될 때까지, 쿨백-라이블러 발산(Kullback-Leibler divergence, KLD) 수치는 감소되었다. 이 포인트에서 유전자 제외를 계속 수행하면, KLD는 다시 상승하게 되는데, 이는 정보의 감소를 의미한다 (도 4A). 따라서, KLD 값이 최저인 시점의 유전자 200종을 이후 분석용으로 선별하였다. 이들 200종에 대한 PCA 분석을 통해, 이들 유전자들이 민감성 대 비-민감성 물질을 완벽하게 구분할 수 있는 능력을 구비하고 있는 것으로 확인되었으며, 이는, 이들 전사체들이 미정의 샘플의 민감 특성에 대한 예측인자로서 사용될 수 있음을 의미한다 (도 4B). 중요한 것은, PCA에서 이들의 효과에 따라 LLNA에 준하여 샘플을 유색 표시함으로써, 이들 유전자에 의한 효능 예측도 물론 가능하다는 것이 명확해졌다는 것이다 (도 4C). 이들 유전자 200종을 "예측 시그니처"로 명명하였으며, 그 실체는 표 3에 열거한다.
예측 시그니처 동정에 사용된 분석 방법의 검증: 본 발명의 시그니처의 예측력을 검증하기 위해, 본 발명자들은, 민감성 화합물 및 비-민감성 화합물에 의해 유도되는 유전자의 발현 구분을 극대화하기 위해, 훈련 세트 유래 데이타를 공간으로 맴핑하는, 서포트 벡터 머신 (SVM) [120]으로 불리우는 지도 학습법을 사용하였다. 훈련 세트로서, 데이타 세트의 70%를 랜덤 선별하고, (전술한) 선별 전 과정을 반복하였다. 시그니처는, 전사체 29,141종에서 시작하여, ANOVA 필터링 및 백워드 소거를 이용하여, "시험 유전자 시그니처"로 칭해지는, 전사체 200종으로 축소되었다. 입수한 시그니처는 나머지 30%의 데이타 세트로 테스트하였다. 데이타 세트를 70% 훈련 데이타 세트와 30% 검정 데이트 세트로 분할하는 것은 층화 무작위 방식으로 수행하였으며, 이는 양쪽 서브세트 중 어느 하나에 포함된 샘플들이 랜덤으로 선택되었다 하더라도, 전체 데이타 세트에서의 민감성 물질과 비-민감성 물질의 비율은 양자 서브세트들에서도 유지된다는 의미이다. 그런 후, "시험 유전자 시그니처"를 이용하여 SVM 모델을 훈련 세트로 훈련하였고, 모델의 예측력을 검정 세트로 평가하였다. 도 5A는 "시험 유전자 시그니처" 및 검정 세트의 샘플에 입각한 PCA 플롯을 보여준다. 명백하게도, 민감성 물질 (레드)과 비-민감성 물질 (그린) 간의 분리는 도 4B의 "예측 시그니처"에서 관찰되는 결과와 비슷하다. 도 5A의 PCA에서, 검정 세트의 민감성 화합물 샘플과 비-민감성 화합물 샘플들은 각각 검붉은색과 검녹색으로 표시하였으며, 이들이 플롯의 주 성분에 기여하지 않으며, 주로 선택된 "시험 유전자 시그니처"의 발현 값을 기반을 좌표로 표시하였다는 의미이다. 알 수 있는 바와 같이, 검정 세트의 민감성 물질은 훈련 세트의 민감성 물질과 무리를 형성하는 반면, 검정 세트의 비-민감성 물질은 훈련 세트의 비-민감성 물질들과 무리를 형성한다. 이는, 눈으로 단순히 패턴을 인지함으로써, 검정 세트의 샘플들이 속하는 그룹을 예측하는 매우 직관적인 방식이다. SVM 훈련 및 검증 결과는 도 5B에서 확인할 수 있으며, 여기에서, ROC 곡선 1의 곡선 하 면적은 검정 세트에서 샘플에 속하는 그룹을 예측하는 "시험 유전자 시그니처"의 예측력을 입증해준다. 본 분석의 예측 성능은, 정확도가 96%, 민감도가 100%, 특이도가 92%인 것으로 확인된다. 본 실험은 자체 "예측 시그니처"의 예측력을 검증하진 않지만, 이의 선택 방법의 유효성을 실제 검증하며, "예측 시그니처"가 미정의 샘플의 민감 특성을 정확하게 예측할 수 있다는 청구항의 내용을 뒷받침한다.
"예측 시그니처"의 분자 기능 및 표준 경로(canonical pathway).
정교한 경로 분석(Ingenuity Pathways Analysis) (IPA, Ingenuity Systems Inc.)를 이용하여, 시그니처의 분자 200개 중 184개를 기능과 공지 (표준) 경로로 특정화하였다. 나머지 분자 16종은 임의의 IPA 엔트리로 맵핑할 수 없었다. 동정되는 지배적인 기능은 소분자 생화학 (분자 38종), 세포 사멸 (33종). 지질 대산 (24종), 조혈계 발생 (19종), 세포 생장 및 증식 (16종), 분자 수송 (15), 세포 주기 (15) 및 탄수화물 대사 (15)였으며, 상세 내용은 표 4를 참조한다. 분자 184종 중 67종은 열거한 기능에 관여하였다. 나머지 117종의 분자들 중, 30종은 다양한 인간 질환 및 분자 기능, 예컨대 규명된 바이오마커들 (SCARB2, RFC2, VPS37A 및 BCL7A) 및 약물 타겟 (ABAT)으로 알려져 있었다. 이들 분자 대부분은 대사 마커들이다. 전체 시그니처에는, HMGCR, HMOX1, ABAT, RXRA, CD33, MAP2K1, MAPK13 및 CD86과 같은 몇가지 약물 타겟이 존재하였다. 2종은, 즉, CD86 (건선) 및 RXRA (부종)는 피부 질환에 대해 규명되어 있다. 또한, 시그니처에는 피부 발생 (DHCR24) 및 수지상 세포 마커 (MAP2K1, NLRP12 및 RFC2)도 포함되어 있다.
시그니처의 분자들에 의해 발생될 가능성이 있는 경로들을 IPA를 이용하여 조사하였다. 가장 흔한 경로는 NRF2 매개 산화 반응 (10), 생체이물질 대사(xenobiotic metabolism) 시그널링 (8), LPS/IL-1 매개 RXR 기능 저해 (6), 아릴 하이드로카본 수용체 시그널링 (6) 및 단백질 키나제 A 시그널링 (6)이다. 이들 경로들 중 상위 5위에 드는 경로들은 외래 물질, 생체이물질에 의해 촉발되는 반응에 일부 참여하는 것으로 모두 공지되어 있다. 생체이물질은 인체에 외래적인 천연 또는 합성 화합물이다.
결론
알레르기성 접촉성 피부염 (ACD)은 알레르기원에 대한 조절을 벗어난 후천적인 면역 반응에 의해 초래되는 염증성 피부 질환이다 [13]. 합텐으로 불리우는 소분자량 화합물은 피부에서 자기-단백질에 결합하여, 피부 수지상 세포(DC)에 의해 단백질-결합된 알레르기성 화합물의 내재화를 수행할 수 있다. DC는, 국소 미세환경의 영향 하에, 단백질-합텐 복합체를 가공하여, 국소 림프절로 이동시키고, 나이브 T 세포를 활성화한다. 알레르기원-특이 반응, 주로 작동자 CD8+ T 세포 및 Th1 세포의 개시와 전개, 및 면역조절 단백질의 생성은 ACD에서 관찰되는 면역 활성화의 홀마크이다. 이들 T 세포 매개 IV형 과민 반응은 발진, 물집 및 소양증과 같은 증상들이 특징적이다. ACD는 인간에서 관찰되는 면역독성의 가장 일반적은 증상[13]이며, 수백종의 화합물들이 피부에 민감화를 유발하는 것으로 입증되었다 [14]. 민감화에 관여하는 추진 인자들과 분자 기전들은, 알레르기성 화합물에 대한 면역 반응을 확인하기 위해 집중적인 연구 노력들이 이루어졌음에도 불구하고, 아직 파악되지 않았다. REACH 법은, 매년 1톤 이상 제조되는 모든 화합물들을 독성 및 알레르기성과 같은 유해 특성에 대해 검사할 것을 규정하고 있어 [5], 정확한 예측력 분석법에 대한 수요가 증가하고 있다. 오늘날, 잠재적인 인간 민감성 물질을 동정하는 것은 동물 실험, 특히 뮤라인 국소 림프절 분석 (LLNA)에 의존한다 [6]. LLNA는 화학적 노출 후 마우스의 배액 림프절에서 유발되는 증식 측정 결과를 기초로 한다 [15]. 화합물은, 대조군 대비, 증식의 3배 증가를 유발한다면 민감성 물질로서 규정되며, 증가에 필요한 화합물의 양이 EC3 값이다. 따라서, LLNA를 또한 사용하여 민감화 효과를 기준으로 화합물들을 분류할 수 있다. 그러나, LLNA는 여러 측면에서 선택사항이 아니다. 이는, 명백한 윤리적인 이유 외에도, 시간 소모적이며 비용이 많이 든다. 인간 민감화 데이타는 대개 인간 극대화 시험 (HMT)과 인간 패치 시험 (HPT)으로부터 유래된다 [16]. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Method)의 광범위한 리포트에서, LLNA의 성능 특징들을 다른 이용가능한 동물-기반의 방법들 및 인간 민감화 데이타 (HMT 및 HPT)와 비교하였다 [17]. 인간 데이타 (측정값 74개)와의 비교에서 LLNA 성능은 정확도가 72%, 민감도가 72% 및 특이도가 67%인 것으로 확인되었다. 정확도는 방법의 결과가 참인 비율로 정의되고, 민감도는 모든 양성 화합물 중에서 양성으로 맞게 분류된 비율이고, 특이도는 모든 음성 화합물 중에서 음성으로 맞게 분류된 비율이다. 따라서, 민감화에 대한 보다 신뢰성있는 검사 방법을 개발할 필요성이 명백하게 존재한다. 부가적으로, 화장품 규정에 대한 7차 개정 (76/768/EEC)에서는, 과학적으로 신뢰성있는 방법을 이용할 수 있을 경우, 2013년까지 화장품 성분들을 검사하는데 동물 실험을 이용하는 것을 완전히 금지할 것을 담고 있다. 따라서, 인간 세포를 기반으로 한 신뢰할 수 있는 예측 검사 방법이 산업계에 절실하게 요구되고 있다. 민감화에 관여하는 다양한 인간 세포주들과 원시 세포들, 예컨대 상피 세포, 수지상 세포 및 T 세포들이 예측 검사 시스템으로서 평가된 바 있다. 다양한 단일 바이오마커들이, [18]에서 리뷰된 바와 같이, 예컨대, CD40, CD80, CD54, CXCL8, IL-1 베타, MIP-1베타, p38 MAPK가, 민감성 화합물로 자극하였을 때, 상향조절되지만, 여전히 단독이며, 이들 중 어떤 것도 민감성 화합물과 비-민감성 화합물들을 구분하는 예측력은 없는 것으로 기술되었다. CD86은 가장 널리 연구되는 마커들 중 하나이지만, 본 발명의 분석에서 이 마커의 발현 수준을 측정하는 것도 적절하나, 민감화에 대한 정보(readout)로서는 충분하지 않았다 (도 2). 민감성 화합물 19종 중에서 단지 9종만 CD86의 유의한 상향조절을 유도하였다. 대신, 본 발명자들은 바이오마커 시그니처를 분석하는 것이 임의의 단일 바이오마커 보다 낫다고 확신하였다. 이에, 본 발명자들은 완전-게놈 트랜스크립톰 파워를 활용하여, 잘 규명된 화합물들과 대조군들로 이루어진 대규모 세트에 의해 유도되는 유전자의 조절을 스크리닝하였다. ANOVA로 동정한 바와 같이, 비-민감성 대조군 대비 민감성 화합물로 자극받은 MUTZ-3 세포에서 차별적으로 발현되는 다수의 유전자를 통해, MUTZ-3 세포가 실제 이들 2가지 그룹을 구분할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 따라서, 시험관내 민감화 분석을 위한 세포 시스템으로 적합하다는 것을 확인하였다. CD34+-선조세포-유래 DC 등의 다양한 세포 시스템에서 전체 게놈 분석 결과를 기반으로 한 분석을 확립하기 위한 시도들이 행해지고 있다 [19-21]. 이러한 분석들은 생체내 유사 조건을 제공할진 모르지만, 원시 세포가 이러한 상업적인 관심이 상당한 분석에 매우 적합하지 않다는 주장도 있을 수 있다. 아울러, 이러한 시스템에 대한 윤리적인 측면도 고려할 필요가 있다. 또한, 전체 게놈 분석에 기초한 시험관내 민감화 분석법 개발에 대한 기존의 시도들은 매우 한정된 시험 화합물 세트로 한정되어 있다. 지금까지, 본 연구는 이러한 분야에서 수행된 가장 큰 규모의 연구로서, 양성 훈련 화합물 20종과 음성 훈련 화합물 20종이 사용되었다. 본 발명자들은 이들 훈련 화합물들을 각각 훈련 및 검정용으로 2가지 서브세트로 나누어 시도하였다. 이들 실험에서 성공적인 예측이 확인되었으며 (데이타 미기재), 도 3D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 민감성 화합물들이 이의 유발된 유전자 발현 프로파일에 큰 차이를 나타낸다는 사실을 실증하였다. 이러한 관점에서, 본 발명자들은 본 발명의 "예측 시그니처"를 동정하였을 때, 가능한 많은 수의 훈련 화합물들을 포함시키고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 검증(validation)에 어떠한 화합물들도 배제하지 않았다. 오히려, 본 발명자들은, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 검증에서 살펴보지 않은 데이타를 사용하여, 샘플들을 훈련 세트와 검정 세트로 랜덤 분할함으로써 "예측 시그니처"를 동정하는 방법을, 검증하였다. 광범위한 반응성 기전 뿐만 아니라 민감성 효과를 가진 모든 민감성 화합물들을 포함시킴으로써, 미지 샘플의 민감성 특성을 예측하는데 매우 적합한 예측 시그니처를 동정하였음을 본 발명자들은 주장한다. 주목할만한 중요한 사실은, 본 발명의 "예측 시그니처"로, 도 4C에서 입증된 바와 같이, LLNA로 규명된 화합물과 같은 민감성 화합물의 효과을 예측할 수 있다는 것이다. 그러나, LLNA에 따라 예측된 효과와 본 발명의 분류체계(classifier)에 따른 효과가 모든 샘플들에서 일치하는 것은 아니다. 특히, 중간 수준의 민감성 물질인 2-하이드록시에틸 아크릴레이트는 이의 유전자 발현 프로파일 측면에서는 강 및 최강 민감성 물질에 가장 근접한 것으로 보인다. 마찬가지로, 중간 수준의 민감성 물질인 에틸렌디아민, 헥실신남 알데하이드 및 글리옥살은 약 민감성 물질과 함께 그룹핑된다. 이러한 사실은, 정의된 바와 같은 민감성 효과에 수정이 필요할 수 있다는 엄청난 의미를 시사한다. 본 발명자들은 본 발명의 "예측 시그니처"가 이러한 분류에 사용될 수 있음을 주장한다.
결론적으로, 본 발명자들은 유전자 200종으로 구성된 동정된 "예측 시그니처"를 이용하여, 샘플을 민감성 물질 또는 비-민감성 물질로 정확하게 분류할 수 있는 능력을 구비한, MUTZ-3 세포 기반의 시험관내 분석을 제시한다. 아울러, 본 분석은 화합물의 민감성 효능을 예측할 수 있으며, 그러한 분류를 수정하는데 이용할 수 있다.
재료 및 방법
화합물들
민감성 물질 20종과 비-민감성 물질 20종으로 이루어진 화합물 패널을 세포 자극에 사용하였다. 민감성 물질은 2,4-디니트로클로로벤젠, 신남알데하이드, 레조르시놀, 옥사졸론, 글리옥살, 2-머캅토벤조티아졸, 유게놀, 이소유게놀, 신남 알코올 및 p-페닐렌디아민, 포름알데하이드, 에틸렌디아민, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 헥실신남 알데하이드, 중크롬산 칼륨, 페니실린 G, Katchon CG (MCI/MI), 2-아미노페놀, 제라니올 및 2-니트로-1,4-페닐렌디아민이었다 (표 1). 비-민감성 물질은 소듐 도데실 설페이트, 살리실산, 페놀, 글리세롤, 락트산, 클로로벤젠, p-하이드로벤조 산, 벤즈알데하이드, 디에틸 프탈레이트 및 옥탄산, 황산 아연, 4-아미노벤조 산, 메틸 살리실레이트, 에틸 바닐린, 이소프로판올, 디메틸 포름아미드, 1-부탄올, 과망간산 칼륨, 프로필렌 글리콜 및 Tween 80이었다 (표 1). 화합물들은 모두 미국 미주리주 세인트 루이스에 위치한 시그마-알드리치사에서 구입하였다. 화합물은 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 또는 증류수에 용해하였다. 자극하기 전에, 모든 화합물들의 세포독성을 요오드화 프로피듐 (PI)(BD Biosciences, San Diego, CA)을 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 모니터링하였다. 자극된 세포의 상대적인 생존성은 하기의 식으로 계산하였다.
Figure 112019014287040-pat00001
독성 화합물은 상대적인 생존율 90%(Rv90)를 나타내는 농도로 사용하였다. 무독성 화합물은 가능하다면 500 μM의 농도로 사용하였다. 매질에 500 μM로 용해되지 않는 무독성 화합물은 최대 용해 농도로 사용하였다. DMSO에 용해시킨 화합물은 최종 농도(in-well concentration) 0.1% DMSO로 사용하였다. 각 화합물에 사용된 농도와 비히클은 표 2에 열거한다.
세포에 대한 화합물 노출
인간 골수성 백혈병 유래 세포주 MUTZ-3 (DSMZ, Braunschweig, Germany)는, 공지된 바와 같이, 20% (부피/부피) 소 태아 혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 40 ng/ml rhGM-CSF (Bayer HealthCare Pharmaceuticals, Seattle, WA)가 첨가된 알파-MEM (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT)에서 유지하였다 [10]. 각 실험 수행 전에, 품질 관리로서 유세포 측정을 이용하여 세포의 면역표현형을 분석하였다. 세포를 6웰 플레이트에 200.000 cells/ml로 접종하였다. 각 화합물의 스톡 용액을 DMSO 또는 증류수 중에 준비하였고, 이후 RV90에 맞는 최종 농도 및 DMSO 최종 농도 0.1%로 희석하였다. 세포를 34시간 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 그 후, 세포를 회수하고, 유세포 측정기로 분석하였다. 병행하여, 회수한 세포를 TRIzol 시약 (Invitrogen)으로 용혈시키고, RNA 추출하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 화합물을 이용한 자극은 3회의 독립적인 실험으로 수행하였고, 이로써 트리플리케이트 샘플을 수득하였다.
유세포 측정을 이용한 표현형 분석
모든 세포 표면 염색 및 세척 단계들은 1% BSA (w/v)가 첨가된 PBS에서 수행하였다. 세포를 특이 마우스 mAb와 함께 15분간 4℃에서 인큐베이션하였다. 유세포 측정에 다음과 같은 mAb들을 사용하였다: FITC-접합된 CD1a (DakoCytomation, Glostrup, Denmark), CD34, CD86, 및 HLA-DR (BD Biosciences), PE-접합된 CD14 (DakoCytomation), CD54 및 CD80 (BD Biosciences). FITC 또는 PE를 접합시킨 마우스 IgG1을 이소형 대조군으로 사용하였고, PI를 사용하여 세포 생존성을 평가하였다 (BD Biosciences). FACSCanto II instrument (BD Bioscience)를 이용한 데이타 수집시 FACSDiva 소프트웨어를 사용하였다. 10,000건을 수집하고, 파편 및 비생존 세포를 제외하도록 광 산란 특성을 기초로 게이트를 설정하였다. 추가적인 데이타 분석은 FCS Express V3 (De Novo Software, Los Angeles, CA)로 수행하였다.
cRNA 준비 및 유전자 칩 혼성화
RNA 분리 및 유전자 칩 혼성화는 공지된 바와 같이 수행하였다 [22]. 간략하게는, 무자극 세포 및 화합물 자극된 MUTZ-3 세포로부터 RNA를 트리플리케이트 실험으로 추출하여, 분석하였다. 표지된 센스 DNA의 제조는 권고 키트 및 대조군 (Affymetrix, Santa Clara, CA)을 이용하여 Affymetrix GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay (100 ng Total RNA Labeling Protocol)에 따라 수행하였다. 인간 유전자 1.0 ST 어레이의 혼성화, 세척 및 스크리닝은 제조사의 프로토콜 (Affymetrix)에 따라 수행하였다.
마이크로어레이 데이타 분석 및 통계학적 방법
마이크로어레이 데이타를 표준화하고, Affymetrix Expression Console (Affymetrix)을 이용하여 RMA 알고리즘으로 품질을 체크하였다. 민감성 물질을 비-민감성 물질과 비교하였을 때 유의하게 조절되는 유전자들을 일원식 ANOVA와, 다중 가설 검정을 위한 보정법으로서 위발견율(FDR)로 동정하였다. 동정된 많은 수의 유의한 유전자를 줄이기 위해, 백워드 소거 분석 (Carlsson et al, 미공개)을 위해 사내에서 개발한 알고리즘을 적용하였다. 이 방법을 적용하여, 단일 잔류 교차 검증법(leave-one out cross-validation)으로 서포트 벡터 머신 (SVM) 모델 [12]을 훈련 및 검증하여, 분석물을 하나씩 제외하였다. 이러한 과정은 각 분석물이 하나씩 제외될 때까지 반복하였다. 각 반복에서, 쿨백-라이블러 발산 (Kullback-Leibler divergence, KLD)을 기록하여, N KLD를 구하였으며, 이때 N은 분석물의 수이다. 최소 KLD가 관찰될 때 누락시킨 분석물을 데이타 세트의 최소 정보인 것으로 간주한다. 따라서, 이 분석물을 빼고, 이번에는 N-1 분석물들을 이용하여 반복 수행한다. 이런 방식으로, 민감성 물질과 비-민감성 물질을 식별하는 각 분석물의 식별력을 기초로 선별된 마커 패널이 남을 때까지 분석물을 하나씩 누락시킨다. 백워드 소거에 대한 스크립트는 R [23]과 추가적인 패키지 e1071 [24]에 프로그래밍되어 있다. ANOVA 분석 및 결과의 시각화는 Qlucore Omics Explorer 2.1 (Qlucore, Lund, Sweden)로 수행하였다. 전사체 200종으로 구성된 선별된 바이오마커 프로파일을 "예측 시그니처"로 명명하였다.
"예측 시그니처"의 동정 방법에 대한 검증
외래 검증 데이타 세트의 부재시, 데이타 세트를 샘플 70%로 구성된 훈련 세트와 30%로 구성된 검정 세트로 분할하엿다. 분할은 랜덤으로 수행하나, 전체 데이타 세트에서의 각 서브세트의 비율과 동일하게 민감성 물질과 비-민감성 물질의 비율을 유지시켰다. 바이오마커 시그니처는 전술한 바와 같이 ANOVA 필터링 및 백워드 소거를 이용하여 훈련 세트에서 동정하였다. 이러한 시험 시그니처를 사용하여 훈련 세트로 SVM을 훈련시켰으며, 이후 이를 적용하여 검정 세트의 샘플들을 예측하였다. 리시버 오퍼레이팅 캐릭터리스틱(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선 하 면적 분포 [25]를 모델 성능의 지표로서 사용하였다.
경로 분석을 이용한 "예측 시그니처"의 생물학적 기능 분석
생물학적 기능을 조사하기 위해, 유전자 프로파일을 정교한 경로 분석 소프트웨어 IPA, (Ingenuity Systems, Inc. Mountain View, USA)를 이용하여 분석하였다. 백워드 소거법에 의해 입수한 상위 200개의 유전자들을 '빌드(build)' 및 '패스 익스플로러(Path Explorer)' 기능으로 분석하여, "예측 시그니처" 유래 핵심 유전자들과 IPA에 의해 제안된 커넥팅 분자들의 인터랙톰을 구축하였다. "예측 시그니처"의 분자 200종을 공지된 최단 경로로 연결하였다. 이 과정에서, 오직 원시 세포, 세포주 및 상피 조직 유래 인간 증거만 사용하였다. 내인성 및 화학적 약물을 제외한 모든 분자들이 네트워트에서 허용되었으며, 모든 타입의 커넥션들이 허용되었다. IPA 유래 공지 '기능' 및 '표준 경로'를 맵핑하여, '중첩' 기능을 이용하여 인터랙톰을 확인하였다.
약어
ACD, 아토피성 접촉성 피부염;
AML, 급성 골수성 백혈병 세포;
APC, 항원 제시 세포;
DC, 수지상 세포;
GM-CSF, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자;
GPMT, 기니아피그 극대화 검사;
HMT, 인간 극대화 검사;
HPTA, 인간 패치 테스트 알레르기원;
IL, 인터루킨;
LLNA, 국소 림프절 분석;
PCA, 주 성분 분석
표 1. 세포-기반 분석에서 테스트한, 설치류 LLNA 분류에 따른, 민감성 화합물 및 비-민감성 화합물의 리스트.
화합물 약어 효능 LLNA HMT 1 HPTA 1
민감성 물질
2,4-디니트로클로로벤젠 DNCB 극대 [15] + [15]
옥사졸론 OXA 극대 [15] + [15]
중크롬산 칼륨 PD 극대 [14] + [14] + +
Kathon CH (MC/MCI) KCG 극대 [14, 26] + [14, 26]
포름알데하이드 FA 강 [15] + [15] + +
2-아미노페놀 2AP 강 [27] + [27]
2-니트로-1,4-페닐렌디아민 NPDA 강 [27] + [27]
p-페닐렌디아민 PPD 강 [28] + [28] + +
헥실신남 알데하이드 HCA 중 [15] + [15]
2-하이드록시에틸 아크릴레이트 2HA 중 [27] + [27] +
2-머캅토벤조티아졸 MBT 중 [27] + [27] + +
글리옥살 GO 중 [27] + [27] +
신남알데하이드 CALD 중 [28] + [28] + +
이소유게놀 IEU 중 [28] + [28] +
에틸렌디아민 EDA 중 [14] + [14]
레조르시놀 RC 중 [29] + [29] - +
신남 알코올 CALC 약 [27] + [28]
유게놀 EU 약 [28] + [28] +
페니실린 G PEN G 약 [28] + [28] +
제라니올 GER 약 [14] + [14] - +
비-민감성 물질
1-부탄올 BUT - [30]
4-아미노벤조 산 PABA - [31] - +
벤즈알데하이드 BA - [32]
클로로벤젠 CB - [14]
디에틸 프탈레이트 DP - [28]
디메틸 포름아미드 DF - [26]
에틸 바닐린 EV - [32]
글리세롤 GLY - [28]
이소프로판올 IP - [28]
락트산 LA - [14]
메틸 살리실레이트 MS - [14] -
옥탄산 OA - [33]
프로필렌 글리콜 PG - [31]
페놀 PHE - [33] -
p-하이드록시벤조 산 HBA - [34]
과망간산 칼륨 PP -
살리실산 SA - [14] -
소듐 도데실 설페이트 SDS +2 [14, 33] -
Tween 80 T80 - [35] +
황산 아연 ZS +2 [36]
1 HMT, 인간 극대화 검사; HPTA, 인간 패치 테스트 알레르기원. 정보는 [17]에서 유래됨.
2 LLNA에서 위양성
표 2. 테스트에 사용된 비히클과 농도
화합물 약어 비히클 최고 용해 농도 (μM) Rv90
(μM) 		배양물내 농도 (μM)
민감성 물질
2,4-디니트로클로로벤젠 DNCB DMSO - 4 4
옥사졸론 OXA DMSO 250 - 250
중크롬산 칼륨 PD 물 51.02 1.5 1.5
Kathon CG (MC/MCI)* KCG 물 - 0.0035% 0.0035%
포름알데하이드 FA 물 - 80 80
2-아미노페놀 2AP DMSO - 100 100
2-니트로-1,4-페닐렌디아민 NPDA DMSO - 300 300
p-페닐렌디아민 PPD DMSO 566 75 75
헥실신남 알데하이드 HCA DMSO 32.34 - 32.24
2-하이드록시에틸 아크릴레이트 2HA 물 - 100 100
2-머캅토벤조티아졸 MBT DMSO 250 - 250
글리옥살 GO 물 - 300 300
신남알데하이드 CALD 물 - 120 120
이소유게놀 IEU DMSO 641 300 300
에틸렌디아민 EDA 물 - - 500
레조르시놀 RC 물 - - 500
신남 알코올 CALC DMSO 500 - 500
유게놀 EU DMSO 649 300 300
페니실린 G PEN G 물 - - 500
제라니올 GER DMSO - - 500
비-민감성 물질
1-부탄올 BUT DMSO - - 500
4-아미노벤조 산 PABA DMSO - - 500
벤즈알데하이드 BA DMSO 250 - 250
클로로벤젠 CB DMSO 98 - 98
Di에틸 프탈레이트 DP DMSO 50 - 50
디메틸 포름아미드 DF 물 - - 500
에틸 바닐린 EV DMSO - - 500
글리세롤 GLY 물 - - 500
이소프로판올 IP 물 - - 500
락트산 LA 물 - - 500
메틸 살리실레이트 MS DMSO - - 500
옥탄산 OA DMSO 504 - 500
프로필렌 글리콜 PG 물 - - 500
페놀 PHE 물 - - 500
p-하이드록시벤조 산 HBA DMSO 250 - 250
과망간산 칼륨 PP 물 38 - 38
살리실산 SA DMSO - - 500
소듐 도데실 설페이트 SDS 물 - 200 200
Tween 80 T80 DMSO - - 500
황산 아연 ZS 물 126 - 126
1 Kathon CG는 MC와 MCI의 혼합물임. 이 혼합물의 농도는 %로 제공됨.
표 3. 비-민감성 물질 및 대조군 대비 민감성 화합물로 자극된 MUTZ-3 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자
유전자 명 유전자 기호 NCBI 참조 서열
표 3A
스쿠알렌 에폭시다제 SQLE NM_003129
미각 수용체, 타입 2, 멤버 5 TAS2R5 NM_018980
케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질 FLJ20444 KGFLP1/2/ FLJ20444 AF523265
막관통 전 후 변환 1 TAPT1 NM_153365
스프라우티 상동체 2 SPRY2 NM_005842
B 세포 CLL/림프종 7A BCL7A NM_020993
용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32 SLC25A32 NM_030780
페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 1 FTHP1 GENSCAN00000008165
ATPase, H+ 수송, 리소좀 50/57kDa, V1 서브유닛 H ATP6V1H NM_015941
히스톤 클러스터 1, H1e HIST1H1E NM_005321
표 3B
4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라제 ABAT NM_020686
앱하이드롤라제(abhydrolase) 도메인 함유 5 ABHD5 NM_016006
염기성 세라미다제 2 ACER2 NM_001010887
ATP 사이트레이트 리아제 ACLY NM_001096
액틴 관련 단백질 10 상동체 ACTR10 NM_018477
ADAM 메탈로펩티다제 도메인 20 ADAM20 NM_003814
역전위된 슈도젠 AL391261.2-201 AL391261.2-201 GENSCAN00000063078
알데하이드 데하이드로게나제 18 패밀리, 멤버 A1 ALDH18A1 NM_002860
알데하이드 데하이드로게나제 1 패밀리, 멤버 B1 ALDH1B1 NM_000692
alkB, 알킬화 복구 상동체 6 (E. coli) ALKBH6 NM_032878
후기 촉진 컴플렉스 서브유닛 1 ANAPC1 NM_022662
후기 촉진 컴플렉스 서브유닛 5 ANAPC5 NM_016237
앤크린 수용체, 패밀리 A (RFXANK-like), 2 ANKRA2 NM_023039
ADP-리보실화 인자 GTPase 활성화 단백질 3 ARFGAP3 NM_014570
Rho GTPase 활성화 단백질 9 ARHGAP9 NM_032496
앤크린 리피트 및 SOCS 박스 함유 7 ASB7 NM_198243
ATPase, H+ 수송porting, 리소좀 9kDa, V0 서브유닛 e1 ATP6V0E1 NM_003945
브릿징 인테그레이터 2 BIN2 NM_016293
블레오마이신 하이드롤라제 BLMH NM_000386
브릭스 도메인 함유 1/리보좀 생산 인자 2 상동체 BXDC1 / RPF2 ENST00000368864
염색체 11 오픈 리딩 프래임 61 C11orf61 NM_024631
염색체 11 오픈 리딩 프래임 67 C11orf67 NM_024684
염색체 12 오픈 리딩 프래임 57 C12orf57 NM_138425
염색체 13 오픈 리딩 프래임 18 C13orf18 NM_025113
염색체 15 오픈 리딩 프래임 24 C15orf24 NM_020154
염색체 19 오픈 리딩 프래임 54 C19orf54 NM_198476
염색체 1 오픈 리딩 프래임 174 C1orf174 NM_207356
염색체 1 오픈 리딩 프래임 183 C1orf183 NM_019099
염색체 20 오픈 리딩 프래임 111 C20orf111 NM_016470
염색체 20 오픈 리딩 프래임 24 C20orf24 BC004446
염색체 3 오픈 리딩 프래임 62 / 유비퀴틴 특이 펩티다제 4 (프로토-온코진) C3orf62 / USP4 BC023586
염색체 9 오픈 리딩 프래임 89 C9orf89 BC038856
공동활성자-조합된 아르기닌 메틸트랜스퍼라제 1 CARM1 NM_199141
CD33 분자 CD33 NM_001772
CD86 분자 CD86 NM_175862
CD93 분자 CD93 NM_012072
사이토크롬 C 옥시다제 서브유닛 VIIa 폴리펩타이드 2 유사 COX7A2L NM_004718
코르티코트로핀 방출성 호르몬 결합 단백질 CRHBP NM_001882
콘드로이틴 설페이트 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2 CSGALNACT2 NM_018590
사이토크롬 P450 51A1 CYP51A1 NM_000786.2
DDRGK 도메인 함유 1 DDRGK1 NM_023935
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 박스 폴리펩타이드 21 DDX21 NM_004728
24-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 DHCR24 NM_014762
7-데하이드로콜레스테롤 리덕타제 DHCR7 NM_001360
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) 박스 폴리펩타이드 33 DHX33 NM_020162
DnaJ (Hsp40) 상동체, 서브패밀리 B, 멤버 4 DNAJB4 NM_007034
DnaJ (Hsp40) 상동체, 서브패밀리 B, 멤버 9 DNAJB9 NM_012328
DnaJ (Hsp40) 상동체, 서브패밀리 C, 멤버 5 DNAJC5 NM_025219
DnaJ (Hsp40) 상동체, 서브패밀리 C, 멤버 9 DNAJC9 NM_015190
D-티로실-tRNA 데아실라제 1 상동체 DTD1 NM_080820
ER 분해 인핸서, 만노시다제 알파-유사 2 EDEM2 NM_018217
동종지향성 바이러스 병합 부위 2B EVI2B NM_006495
서열 유사 패밀리 36, 멤버 A FAM36A NM_198076
서열 유사 패밀리 86, 멤버 A FAM86A NM_201400
Fas (TNF 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 6) FAS NM_000043
MGC44478 FDPSL2A NR_003262
페리독신 리덕타제 FDXR NM_024417
포크헤드 박스(forkhead box) O4 FOXO4 NM_005938
FTHL10-001, 전사 가공된 슈도젠 FTHL10-001 NR_002200
푸코시다제, 알파-L- 2, 혈장 FUCA2 NM_032020
생장 중지-특이 2 유사 3 GAS2L3 NM_174942
강글리오사이드 유발성 분화 조합 단백질 2 GDAP2 NM_017686
성장 분화 인자 11 GDF11 NM_005811
글루타리독신 (티올트랜스퍼라제) GLRX NM_002064
구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질-유사 3 GNL3L NM_019067
글루코사민-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 1 GNPNAT1 NM_198066
글루타티온 리덕타제 GSR NM_000637
GTF2I 리피트 도메인 함유성 2B/2/ 2 슈도젠 GTF2IRD2B/2/2P BC067859
제너럴 전사 인자 IIIC, 폴리펩타이드 2 베타 GTF3C2 NM_001521
HMG-박스 전사 인자 1 HBP1 NM_012257
히스톤 클러스터 1, H1c HIST1H1C NM_005319
히스톤 클러스터 1, H2ae HIST1H2AE NM_021052
히스톤 클러스터 1, H2be HIST1H2BE NM_003523
히스톤 클러스터 1, H2bm/2, H3, 슈도젠 2/2, H2b/a HIST1H2BM/ HIST2H3PS2/BF/A NM_001024599
히스톤 클러스터 1, H3g HIST1H3G NM_003534
히스톤 클러스터 1, H3j HIST1H3J NM_003535
히스톤 클러스터 1, H4a HIST1H4A NM_003538
히스톤 클러스터 2, H2aa3 / 2, H2aa4 HIST2H2AA3 /4 NM_003516
고-이동성 그룹 박스 3 HMGB3 NM_005342
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A 리덕타제 HMGCR NM_000859
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A 신타제 1 HMGCS1 NM_001098272
헴 옥시게나제 (탈사이클) 1 HMOX1 NM_002133
이종 핵 리보뉴클레오단백질 L HNRNPL NM_001533
인슐린 수용체 기질 2 IRS2 NM_003749
철-황 클러스터 스캐폴드 상동체 ISCU NM_014301
인터페론 자극된 엑소뉴클레아제 유전자 20kDa-유사 2 ISG20L2 NM_030980
포타슘 전압-게이트형 채널, Isk-관련 패밀리, 멤버 3 KCNE3 NM_005472
추정의 단백질 LOC100132855/ATPase, H+ 수송, 리소좀 38kDa, V0 서브유닛 d1 LOC100132855/ ATP6V0D1 NM_004691
hCG1651476 LOC284417 NM_001085488
골지 자가항원, 골진 서브패밀리 a, 6 슈도젠 / 미토콘드리아 폴리(A) 중합효소 LOC729668/ MTPAP NM_018109
리소포스파티드 산 수용체 1 LPAR1 NM_057159
루신-풍부 PPR-모티프 함유 LRPPRC NM_133259
림프구 항원 96 LY96 NM_015364
미토겐-활성화된 단백질 키나제 1 MAP2K1 NM_002755
미토겐-활성화된 단백질 키나제 13 MAPK13 NM_002754
메틸트랜스퍼라제 유사 2A METTL2A NM_181725
뇌 cDNA 클론: 인간 METTL2와 유사 METTL2B NM_018396.1
메틸트랜스퍼라제 유사 2B METTL2B NM_018396.2
미소좀 글루타티온 S-트랜스퍼라제 3 MGST3 NM_004528
미토콘드리아 리보솜 단백질 L30 MRPL30 NM_145212
미토콘드리아 리보솜 단백질 L4 MRPL4 NM_146388
미토콘드리아 리보솜 단백질 S17 MRPS17 NM_015969
5-메틸테트라하이드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 MTR NM_000254
MYB 결합 단백질 (P160) 1a MYBBP1A NM_014520
BRCA1 유전자의 이웃체 1 NBR1 NM_031858
핵 유입 7 상동체 NIP7 NM_016101
NLR 패밀리, 피린 도메인 함유 12 NLRP12 NM_144687
핵 단백질 패밀리 6 (RNA-조합된 형태) NOL6 NM_022917
NAD(P)H 데하이드로게나제, 퀴논 1 NQO1 NM_000903
핵 수용체 결합 단백질 1 NRBP1 NM_013392
뉴클레오티드 결합 단백질-유사 NUBPL NM_025152
nudix (뉴클레오사이드 디포스페이트 연결된 모이어티 X)-타입 모티프 14 NUDT14 NM_177533
핵 취약성 X 멘탈 리타데이션 단백질 상호작용 단백질 1 NUFIP1 NM_012345
뉴클레오포린 153kDa NUP153 NM_005124
후각 수용체, 패밀리 5, 서브패밀리 B, 멤버 21 OR5B21 NM_001005218
PAS 도메인 함유 세린/트레오닌 키나제 PASK NM_015148
PRKC, 세포자살, WT1, 조절인자 PAWR NM_002583
PDGFA 조합 단백질 1 PDAP1 NM_014891
포스포디에스테라제 1B, 칼모듈린-의존형 PDE1B NM_000924
포스포리보실포르밀글리신아미딘 신타제 PFAS NM_012393
플렉스트린(pleckstrin) 상동체-유사 도메인, 패밀리 A, 멤버 3 PHLDA3 NM_012396
포스포이노시티드-3-키나제 어댑터 단백질 1 PIK3AP1 NM_152309
PTEN 유발성 추정 키나제 1 PINK1 NM_032409
포스포만노뮤타제 2 PMM2 NM_000303
NOB1 상동체의 파트너 PNO1 NM_020143
중합효소 (RNA) II (DNA 지시형) 폴리펩타이드 E, 25kDa POLR2E NM_002695
중합효소 (RNA) III (DNA 지시형) 폴리펩타이드 E (80kD) POLR3E NM_018119
단백질 포스파타제 1D 마그네슘-의존형, 델타 이소형 PPM1D BC042418
포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트-의존형 Rac 교환 인자 1 PREX1 NM_020820
프롤린-세린-트레오닌 포스파타제 상호작용 단백질 1 PSTPIP1 NM_003978
프로티모신(prothymosin), 알파 PTMA NM_016184/ 024809
RAB33B, 멤버 RAS 온코진 패밀리 RAB33B NM_031296
레닌 결합 단백질 RENBP NM_002910
복제 인자 C (활성인자 1) 2, 40kDa RFC2 NM_181471
리보뉴클레아제 H1 RNASEH1 NM_002936
고리 핑거 단백질 146 RNF146 NM_030963
고리 핑거 단백질 24 RNF24 NM_007219
고리 핑거 단백질 26 RNF26 NM_032015
하바나(Havana) 슈도젠 RP1-274L14.2-001 RP1-274L14.2-001 NM_032020
리보솜 단백질 SA / 소형 핵 RNA, H/ACA box 62 RPSA / SNORA62 NM_014570
RNA 슈도우리딜레이트 신타제 도메인 함유 2 RPUSD2 NM_152260
리보솜 RNA 가공 12 상동체 RRP12 NM_015179
레티노이드 X 수용체, 알파 RXRA NM_002957
스캐빈저 수용체 클래스 B, 멤버 2 SCARB2 NM_005506
SERPINE1 mRNA 결합 단백질 1 SERBP1 NM_001018067
스플라이싱 인자 프롤린/글루타민-풍부 SFPQ NM_005066
용질 캐리어 패밀리 35, 멤버 B3 SLC35B3 BX538271
용질 캐리어 패밀리 37, 멤버 4 SLC37A4 NM_001467
용질 캐리어 패밀리 5, 멤버 6 SLC5A6 NM_021095
스핑고마이엘린 포스포다이에스테라제 4, 중성 막 SMPD4 NM_017751
소형 핵(sn)RNA 호스트 유전자 1, 비-코딩/snRNA C/D 박스 26 SNHG1 / SNORD26 NM_002032
소형 핵 RNA 호스트 유전자 12 (비-코딩) SNHG12 NM_207356
소형 핵 RNA, H/ACA 박스 45 SNORA45 NR_002977
SnRNA SnRNA Affymetrix: 7966223
분류성 넥신(nexin) 패밀리 멤버 27 SNX27 NM_030918
스테롤 조절 인자 결합 전사인자 2 SREBF2 NM_004599
RRNA SSU_rRNA_5 SSU_rRNA_5 ENST00000386723
ST3 베타-갈락토사이드 알파-2,3-시알리트랜스퍼라제 6 ST3GAL6 NM_006100
세린/트레오닌 키나제 17b STK17B NM_004226
튜불린 폴딩 조인자 E-유사 TBCEL NM_152715
테크토닉(tectonic) 패밀리 멤버 2 TCTN2 NM_024809
toll-유사 수용체 6 TLR6 NM_006068
toll-유사 수용체 9/트윈필린(twinfilin) 상동체 2 TLR9 /TWF2 NM_007284
막 관통 단백질 55A TMEM55A NM_018710
막 관통 단백질 59 TMEM59 NM_004872
막 관통 단백질 77 TMEM77 BC091509
막 관통 단백질 97 TMEM97 NM_014573
종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 10c TNFRSF10C NM_003841
미토콘드리아 외막의 트랜슬로카제 34 TOMM34 NM_006809
미토콘드리아 외막의 트랜슬로카제 40 상동체 TOMM40 BC001779
미토콘드리아 외막의 트랜슬로카제 5 상동체 /F-박스 단백질 10 TOMM5 / FBXO10 NM_012166
종양 단백질 p53 유도성 단백질 3 TP53I3 NM_004881
종양 단백질 p53 유도성 핵 단백질 1 TP53INP1 NM_033285
티오레독신 리덕타제 1 TXNRD1 NM_003330
유비퀴틴-폴드 개변자 접합성 효소 1 UFC1 NM_016406
유비퀴틴 특이 펩티다제 10 USP10 NM_005153
소포-조합된 막 단백질 3 (셀루브레빈(cellubrevin)) VAMP3 NM_004781
발릴-tRNA 신테타제 VARS NM_006295
액포 단백질 분류 37 상동체 A VPS37A NM_152415
아연 핑거 단백질 211 ZNF211 NM_006385
아연 핑거 단백질 223 ZNF223 NM_013361
아연 핑거 단백질 561 ZNF561 NM_152289
아연 핑거 단백질 79 ZNF79 NM_007135
지방산 신타제 FASN NM_004104
표 3 설명. 표는 t-검정과 백워드 소거에 의해 발견된 유전자 프로파일을 나타낸 것이다. 유전자는 Affymetrix (www.affymetrix.com, Santa Clara USA) 사의 NetAffx 데이타베이스를 이용하여 주석을 기재하였다. 확인되는 경우, Unigene (www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/) ID를 유전자 식별자로서 선택하였다. Unigene ID가 보고된 바 없는 12건은, 최상의 대체 ID를 기재하였다. 유전자 명칭과 ID는 200개 중 189개가 일치되는 IPA 데이타베이스에서 체크하였다. 1건에는 Affymetrix ID만 기재하였다. 6개의 두플리케이트 유전자들은 제외시켰다.
표 4. "예측 시그니처"에서의 주된 기능들. IPA를 이용하여 200개의 분자들 중 184종을 기능적으로 조사하였다. 분자 15종 이상에서 공통되는 기능들만 기재하였다.
기능 시그니처의 유전자 수 분자 명칭 가장 우세적인 서브기능
소형 분자 생화학 38 ABHD5, ACLY, ALDH18A1, BLMH, CD86, CSGALNACT2, CYP51A1, DHCR24, DHCR7, DNAJC5, FAS, FASN, FDXR, GLRX, GNPNAT1, HMGCR, HMOX1, IRS2, LPAR1, LY96, MGST3, MTR, NQO1, PASK, PDE1B, PINK1, PMM2, RENBP, RXRA, SLC25A32, SLC37A4, SLC5A6, SMPD4, SQLE, SREBF2, ST3GAL6, TLR6, TMEM55A 대사 (23), 생합성 (14), 변형 (12), 합성 (10)
세포 사멸 33 CD33, DDX19A, DHCR24, DNAJB9, DNAJC5, FAS, FASN, FDXR, FOXO4, GLRX, GNPNAT1, GSR, HIST1H1C, HMGB3, HMOX1, IRS2, LPAR1, MAP2K1, MAPK13, NQO1, PAWR, PDE1B, PHLDA3, PINK1, PPM1D, RXRA, SERBP1, SPRY2, STK17B, TLR6, TNFRSF10C, TP53INP1, TXNRD1 세포자살 (30), 세포 사멸 (13)
지질 대사 24 ABHD5, ACLY, CYP51A1, DHCR24, DHCR7, FAS, FASN, FDXR, HMGCR, HMOX1, IRS2, LPAR1, LY96, MGST3, PASK, RENBP, RXRA, SLC37A4, SMPD4, SQLE, SREBF2, ST3GAL6, TLR6, TMEM55A 대사 (17), 변형 (11), 합성 (10)
조혈계 발생 19 CARM1, CD33, CD86, FAS, FOXO4, HIST1H1C, HMGB3, HMGCR, HMOX1, IRS2, LY96, NBR1, NQO1, PAWR, PIK3AP1, PPM1D, STK17B, TP53INP1, VAMP3 증식 (10), 세포자살 (5)
세포 성장 및 증식 16 CARM1, CD33, CD86, FAS, FOXO4, HIST1H1C, HMGB3, HMGCR, HMOX1, IRS2, LY96, NBR1, NQO1, PAWR, PIK3AP1, PPM1D, STK17B, TP53INP1, VAMP3 증식 (16), 성장 (4)
분자 이동 15 CARM1, CD33, CD86, FAS, FOXO4, HIST1H1C, HMGB3, HMGCR, HMOX1, IRS2, LY96, NBR1, NQO1, PAWR, PIK3AP1, PPM1D, STK17B, TP53INP1, VAMP3 축적 (8), 양 (5)
세포 주기 15 DNAJB4, DTD1, FAS, FASN, FOXO4, GDF11, HBP1, HMOX1, IRS2, MAP2K1, PAWR, PPM1D, SFPQ, SPRY2, TP53INP1 세포 주기 진행 (13), 세포 분열 (5)
탄수화물 대사 15 DNAJB4, DTD1, FAS, FASN, FOXO4, GDF11, HBP1, HMOX1, IRS2, MAP2K1, PAWR, PPM1D, SFPQ, SPRY2, TP53INP1 대사 (9), 생합성 (5)
표 5. 서포트 벡터 머신 (SVM) 알고리즘filnamnTraining<-"training set.txt"
filnamnTest<-"test set.txt"
lista <- read.delim("biomarker signature.txt",header=FALSE) # EN FIL MED DE ANALYTER
lista <- as.character(lista[[1]])
listaBoolean <- is.element(ProteinNames, lista)
group1<- "pos"
group2<- "neg"
rawfile <- read.delim(filnamnTraining)
samplenames <- as.character(rawfile[,1])
groupsTraining <- rawfile[,2]
dataTraining <- t(rawfile[,-c(1,2)])
ProteinNames <- read.delim(filnamnTraining,header=FALSE)
ProteinNa mes <- as.character(as.matrix(ProteinNames)[1,])
ProteinNames <- ProteinNames[-(1:2)]
listaBoolean <- is.element(ProteinNames, lista)
rownames(dataTraining) <- ProteinNames
colnames(dataTraining) <- samplenames
logdataTraining <- dataTraining
logdataTraining <- logdataTraining[listaBoolean,]
rawfile <- read.delim(filnamnTest)
samplenames <- as.character(rawfile[,1])
groupsTest <- rawfile[,2]
dataTest <- t(rawfile[,-c(1,2)])
ProteinNames <- read.delim(filnamnTest,header=FALSE)
ProteinNames <- as.character(as.matrix(ProteinNames)[1,])
ProteinNames <- ProteinNames[-(1:2)]
rownames(dataTest) <- ProteinNames
colnames(dataTest) <- samplenames
logdataTest<-dataTest
logdataTest <- logdataTest[listaBoolean,]
svmfacTraining<- factor(rep('rest',ncol(logdataTraining)),levels=c(group1, group2, 'rest'))
subset1Training<- is.element(groupsTraining , strsplit(group1,",")[[1]])
subset2Training<- is.element(groupsTraining , strsplit(group2,",")[[1]])
svmfacTraining[subset1Training] <- group1
svmfacTraining[subset2Training] <- group2
facTraining <-factor(as.character(svmfacTraining [subset1Training|subset2Training]),levels=c(group1,group2))
svmfacTest<- factor(rep('rest',ncol(logdataTest)),levels=c(group1, group2, 'rest'))
subset1Test<- is.element(groupsTest , strsplit(group1,",")[[1]])
subset2Test<- is.element(groupsTest , strsplit(group2,",")[[1]])
svmfacTest[subset1Test] <- group1
svmfacTest[subset2Test] <- group2
facTest <-factor(as.character(svmfacTest [subset1Test|subset2Test]),levels=c(group1,group2))
n1 <- sum(facTest ==levels(facTest )[1])
n2 <- sum(facTest ==levels(facTest )[2])
nsamples <- n1+n2
SampleInformation <- paste(levels(facTest )[1]," ",n1," , ",levels(facTest )[2]," ",n2,sep="")
svmtrain <- svm(t(logdataTraining) , facTraining , kernel="linear" )
pred<-predict(svmtrain , t(logdataTest) , decision.values=TRUE)
res<-attr(pred, "decision.values")
names <- colnames(logdataTest, do.NULL=FALSE)
orden <- order(res , decreasing=TRUE)
Samples <- data.frame(names[orden],res[orden],facTest[orden])
ROCdata <- myROC(res,facTest)
SenSpe <- SensitivitySpecificity(res,facTest)
ROCplot(list(SampleInformation=SampleInformation,ROCarea=ROCdata[1],p.value=ROCdata[2],SenSpe <- SenSpe,samples=Samples), sensspecnumber=4)
#rows in blue are needed only for ROC evaluation.
#to assess an unknown sample, print res.
#(vector with prediction values)

Claims (81)

  1. 포유류 피부에 민감화(sensitization)를 유도할 수 있는 물질의 시험관내 식별 방법으로서,
    상기 방법은
    a) 수지상 세포(dendritic cell) 집단 또는 수지상 유사 세포(dendritic-like cell) 집단을 테스트 물질에 노출시키는 단계; 및
    b) 상기 세포에서, 아래의 바이오마커들 중 2종 이상의 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 상기 단계들로 구성되며:
    스쿠알렌 에폭시다제
    미각 수용체, 타입 2, 멤버 5
    케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질 FLJ20444
    막관통 전 후 변환 1
    스프라우티 상동체 2
    B 세포 CLL/림프종 7A
    용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32
    페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 1
    ATPase, H+ 수송, 리소좀 50/57kDa, V1 서브유닛 H
    히스톤 클러스터 1, H1e;
    상기 단계 (b)에서 측정한, 세포에서의 2종 이상의 바이오마커들의 발현이, 상기 테스트 물질의 민감 효과(sensitizing effect)를 표시하는 것인, 시험관내 식별 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    개별 수지상 세포 집단 또는 수지상 유사 세포 집단을, 인간 피부가 민감하게 반응하지 않는 음성 대조군 물질에 노출시키는 단계, 및 상기 세포에서 단계 (b)에서 측정되는 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계; 및/또는
    개별 수지상 세포 집단 또는 수지상 유사 세포 집단을, 인간 피부가 민감하게 반응하는 양성 대조군 물질에 노출시키는 단계, 및 상기 세포에서 단계 (b)에서 측정되는 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계
    를 추가로 포함하는, 시험관내 식별 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는,
    i) 미각 수용체, 타입　2, 멤버 5,
    ii) 케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질 FLJ20444,
    iii) 막관통 전 후 변환 1,
    iv) 스프라우티 상동체 2,
    v) 지방산 신타제,
    vi) B 세포 CLL/림프종 7A,
    vii) 용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32,
    viii) 페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 1,
    ix) ATPase, H+ 수송, 리소좀 50/57kDa, V1 서브유닛 H,
    x) 스쿠알렌 에폭시다제, 및
    xi) 히스톤 클러스터 1, H1e
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하는, 시험관내 식별 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 아래 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 이상의 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 또는 상기 단계로 구성되는, 시험관내 식별 방법:
    스쿠알렌 에폭시다제
    미각 수용체, 타입 2, 멤버 5
    케라티노사이트 성장 인자-유사 단백질 1/2/ 추정 단백질 FLJ20444
    막관통 전 후 변환 1
    스프라우티 상동체 2
    B 세포 CLL/림프종 7A
    용질 캐리어 패밀리 25, 멤버 32
    페리틴, 헤비 폴리펩타이드 슈도젠 1
    ATPase, H+ 수송, 리소좀 50/57kDa, V1 서브유닛 H
    히스톤 클러스터 1, H1e.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 하기 표 3B에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 또는 182종 이상의 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계를 더 포함하는, 시험관내 식별 방법:
    Figure 112019132362012-pat00010

    Figure 112019132362012-pat00011

    Figure 112019132362012-pat00012

    Figure 112019132362012-pat00013

    Figure 112019132362012-pat00014

    Figure 112019132362012-pat00015
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는, 상기 바이오마커들을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 시험관내 식별 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계는, 상기 바이오마커들 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 각각 선택적으로 결합할 수 있는, 2종 이상의 결합 모이어티를 이용하여 수행되는, 시험관내 식별 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는, 상기 바이오마커들의 단백질 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 시험관내 식별 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 바이오마커들의 발현을 측정하는 단계는, 상기 바이오마커들 중 하나에 각각 선택적으로 결합할 수 있는, 2종 이상의 결합 모이어티를 이용하여 수행되는, 시험관내 식별 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)가 어레이를 이용하여 수행되는, 시험관내 식별 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 수지상 세포 집단 또는 수지상 유사 세포 집단이 수지상 유사 세포 집단인 것을 특징으로 하는, 시험관내 식별 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 수지상 유사 세포가 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 및 MUTZ-3로 이루어진 군으로부터 선택되는 골수성 수지상 유사 세포(myeloid dendritic-like cell)인, 시험관내 식별 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 테스트되는 샘플의 민감성 효과(sensitizing potency)를 표시하는 것인, 시험관내 식별 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 어레이로서,
    상기 어레이는, 상기 바이오마커들 중 하나의 단백질 또는 상기 바이오마커들 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 각각 선택적으로 결합할 수 있는, 2종 이상의 결합 모이어티를 포함하고,
    상기 어레이의 결합 모이어티는, 하기 표 3에서 확인되는 2종 내지 194종의 바이오마커들에 대한 결합 모이어티로 구성된, 어레이:
    표 3
    Figure 112019082624107-pat00016

    Figure 112019082624107-pat00017

    Figure 112019082624107-pat00018

    Figure 112019082624107-pat00019

    Figure 112019082624107-pat00020

    Figure 112019082624107-pat00021

    Figure 112019082624107-pat00022
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 분석 키트로서,
    상기 키트는,
    A) 상기 바이오마커들 중 하나의 단백질 또는 상기 바이오마커들 중 하나를 코딩하는 핵산 분자에 각각 선택적으로 결합할 수 있는, 2종 이상의 결합 모이어티를 포함하는 어레이로서, 상기 결합 모이어티는 하기 표 3에서 확인되는 2종 내지 194종의 바이오마커들에 대한 결합 모이어티로 구성된, 어레이; 및
    B) (선택적으로) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 분석 키트:
    표 3
    Figure 112019082624107-pat00023

    Figure 112019082624107-pat00024

    Figure 112019082624107-pat00025

    Figure 112019082624107-pat00026

    Figure 112019082624107-pat00027

    Figure 112019082624107-pat00028

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