JP7261852B2 - 解析方法およびそれに用いるアレイ - Google Patents
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Description
to their individual potency.BMC Pharmacology and Toxicology 2014]。
(a)樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(b)工程(a)で提供された細胞を試験薬剤にさらす工程と;
(c)工程(b)の細胞において、表Aに定義される群から選択される2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程とを含むか、またはこれらの工程からなり、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現が、工程(b)の試験薬剤の皮膚感作効力を示す、方法を提供する。
(i)効力カテゴリー1Aの1つ以上の薬剤;
(ii)効力カテゴリー1Bの1つ以上の薬剤;および/または
(iii)効力カテゴリーのカテゴリーがない1つ以上の薬剤を提供してもよい。
(i)効力カテゴリー1の1つ以上の薬剤;
(ii)効力カテゴリー2の1つ以上の薬剤;
(iii)効力カテゴリー3の1つ以上の薬剤;
(iv)効力カテゴリー4の1つ以上の薬剤;
(v)効力カテゴリー5の1つ以上の薬剤;および/または
(vi)効力カテゴリー6の1つ以上の薬剤を提供してもよい(例えば、本明細書の表8および/またはBasketterら、2014(前出)を参照)。
(d)さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(e)工程(d)で提供された細胞を、
i.ヒト皮膚を感作しない1つ以上のネガティブコントロール剤;および/または
ii.ヒト皮膚を感作する1以上のポジティブコントロール剤;および/または
iii.1つ以上の溶媒対照群にさらす工程と;
(f)1つ以上のコントロール薬剤にさらす以外は、工程(a)で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間インキュベートする工程と;
(g)工程(e)の細胞において、工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーと工程(e)で測定された2つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
(d)さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(e)工程(d)で提供された細胞を、
i.ヒト皮膚を感作しないネガティブコントロール薬剤;
ii.溶媒対照群;または
iii.所定の皮膚感作効力を有する薬剤にさらす以外は、工程(a)で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間でのインキュベートにさらす工程と;
(f)工程(e)の細胞において、工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーと工程(e)で測定された2つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
(h)さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(i)工程(h)で提供された細胞を、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす工程と;
(j)工程(i)の細胞において、工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程とを含み、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーと工程(j)で測定された2つ以上のバイオマーカーとの発現における相似が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
(k)試験薬剤の皮膚感作効力を同定する工程を含む。
(l)工程(h)~(j)(存在する場合には、工程(k))の1回以上の繰り返し工程を含む。
(I)1つ以上の他の繰り返しについて、工程(i)で提供される所定の皮膚感作効力を有する同じ薬剤;または
(II)1つ以上の他の繰り返しについて、工程(i)で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤。
(I)工程(i)で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤と同じ感作効力を有する薬剤;または
(II)工程(i)で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤とは異なる感作効力を有する薬剤。
(i)プロリンは、その側鎖が、アルファ炭素と窒素の両方に結合しているため、ペプチド構造を安定化し得る。
(ii)フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、きわめて疎水性であり、一方、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、これも疎水性である。
(iii)リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性pHで正に帯電し、一方、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、中性pHで負に帯電する。
(iv)アスパラギンおよびグルタミンは、中性pHで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含む。
(v)セリン、トレオニンおよびチロシン側鎖は、ヒドロキシル基を含み、このヒドロキシル基は、水素結合に関与し得る。
(a)本発明の第2の態様に係るアレイと;
(b)本発明の第1の態様で定義した方法を行うための指示書(任意)とを含む解析キットを提供する。
さらなる実施形態または代替の実施形態において、解析キットは、本発明の第1の態様において定義される1つ以上のコントロール薬剤をさらに含む。
(a)患者がさらされるか、または既にさらされた1つ以上の試験薬剤を提供する工程と;
(b)工程(a)で提供された1つ以上の試験薬剤が、皮膚感作剤であるか、および/または本発明の方法を用いて感作剤としての効力があるかどうかを決定する工程とを含み、
(c)1つ以上の試験薬剤が、皮膚感作剤であるか、および/または特定の効力を有する皮膚感作剤であると同定された場合、その1つ以上の試験薬剤に患者がさらされるのを減らすか、または予防し、および/または感作の症状の適切な治療を行う方法を提供する。
序論
皮膚感作と、関連する疾患(例えば、接触性アレルギー)は、一般的な集団のかなりの部分が罹患しており、先進国では、推定有病割合は15~20%である[1]。IV型過敏反応であるアレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、定期的に化学物質にさらされるか、または水仕事に関わる特定の職業集団で一般的である[2]。しかし、化粧品や家庭用製品にも、多くの皮膚感作性の化学物質が含まれている可能性がある。異なる法的枠組みを通じて、欧州連合は、化粧品とその成分に関する動物試験を禁止しており[3]、REACHの観点では、60,000を超える化学物質に試験のための必要条件を課している[4]。分類と副分類の規制要件を満たすために、化学物質の皮膚感作能と効力に関する情報を提供しなければならない。これらの要求を満たす、動物を用いない代替アッセイが緊急に必要とされている。
皮膚感作、その結果、ACDを引き起こす分子事象は、ある化学物質によって引き起こされる多数の連続的な事象(KE)によって特徴付けることができ、OECDによって記載されているように、有害性発現経路(AOP)としてまとめられてきた[5]。開始事象(KE1)は、より深い皮膚層に入り込んだ後の皮膚感作性化学物質による共有結合性のタンパク質修飾であると定義される。その後のKE2は、ケラチノサイト活性化時の炎症反応を表す。KE3は、樹状細胞の活性化に対応しており、次に、T細胞の活性化および増殖が起こる(KE4)。感作剤に再びさらされると、ACDの発生が引き起こされる場合があり、ACDは、特定のTh1およびCD8+T細胞によって誘発される皮膚病変によって特徴付けられる有害な結果である。AOPのKEは十分に記述されているが、個々の重要な事象の基礎となる生物学の詳細な機構的理解はまだない[5]。
細胞およびフローサイトメトリー
この試験で使用した骨髄細胞株は、MUTZ-3(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)に由来し、[22、28]に記載されているように維持された。各実験の前の細胞の表現型制御分析を、細胞の未熟状態を確認するためにフローサイトメトリーによって実施した。モノクローナル抗体は、以下のものを使用した:CD1a(DakoCytomation、グロストルプ、デンマーク)、CD34、CD86、HLA-DR(BD Biosciences、サンノゼ、米国)、全てFITCコンジュゲート化されている;CD14(DakoCytomation)、CD54、CD80(BD Biosciences)、全てPEコンジュゲート化されている。FITCおよびPEコンジュゲート化マウスIgG1(BD Biosciences)は、アイソタイプコントロールとして用いられ、ヨウ化プロピジウムは、非生存細胞のマーカーとして用いられた(BD Biosciences)。3バッチの細胞を独立した実験で24時間さらし、生存率およびCD86の発現をフローサイトメトリーによって評価した。全てのFACSサンプルを、データ収集のためにFACS Divaソフトウェアを用いてFACSCanto II機器で分析した。10,000事象を取得し、さらなる解析をFCS Express V4(De Novo Software、ロサンゼルス、CA)で行った。RNA抽出のための細胞をTRIzol(登録商標)(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、米国)に溶解し、さらに使用するまで-20℃で保存した。
全ての化学物質は、Sigma Aldrich(米国セントルイス)から高純度で購入されたか、またはCosmetics Europeから提供されたものであった。全ての化学物質は、供給業者の推奨に従って保存された。細胞の化学的刺激は、先に記載したように行われた[28]。簡単に言えば、GARD投入濃度は、化学物質の溶解度および細胞毒性特性によって規定された。細胞毒性がなく、可溶性の化学物質では、最終濃度500μMが目標となり、溶解度が制限されている(媒体中、500μM未満)化学物質では、可能な最も高い濃度が目標となった。細胞毒性のある化学物質は、細胞の相対生存率90%を目標とした濃度で使用した。大部分の化学物質は、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはオートクレーブ処理されたMilliQ水で1000倍に予備希釈してから使用された。溶媒としてのDMSO濃度は、決して0.1%を超えなかった。この試験では、DMSOサンプルおよびMilliQサンプルが溶媒対照群として含まれ、したがって、これらは、非感作剤サンプルのグループに属する。
TRIzol(登録商標)に溶解した細胞からのRNA単離を、製造者の指示に従って行った。標識されたセンスDNAは、推奨されるキットとコントロールを用い、Affymetrix(Affymetrix、クリーブランド、米国)のプロトコルに従って合成した。cDNAをHuman Gene 1.0 STアレイ(Affymetrix)にハイブリダイズし、さらに処理し、供給業者の推奨に従ってスキャンした。
学習アルゴリズム[22]への変数入力としてGPSからのSCAN標準化された[29、30]発現データを用い、SVMに基づく既に確立されたモデルを用い、表1にまとめた37の化学物質を感作剤または非感作剤に分類するバイナリ分類を行った。モデル構築の前に、トレーニングセットと試験化学物質との間の潜在的なバッチ効果は、トレーニングセットに対する試験化学物質のアレイ発現値をスケーリングすることによって除外された。トレーニングセットのDMSO溶媒対照群サンプル中の各遺伝子に関する平均発現値と、試験化学物質の由来となるバッチ中のDMSOサンプル中の同じ遺伝子に関する平均発現値の比率を計算することによって、スケーリングファクターを作成した。次いで、各遺伝子に関するスケーリングファクターに、試験化学物質中の対応する遺伝子に関する遺伝子発現値を掛け算した。SVM予測は、既に記載されているように行った[22、31]。簡単に言うと、線形カーネルに基づくSVMモデルは、GPSの同定中に使用された元のトレーニングセットからの参照化学物質についてトレーニングされた[22]。トレーニングされたモデルは、その後、各試験化学物質にSVM決定値(SVM DV)を割り当てるために適用された。全ての試験化学物質について得られたSVM DVを用い、受信者操作特性(ROC)曲線を作成し、得られた曲線下面積(AUC)を分類尺度として使用した[32]。追加のパッケージe1071[33]およびROCR[34]を使用し、R統計的環境でSVMモデリングおよびROC曲線の可視化を行った。モデルの最終的な予測性能を評価する前に、[31]に記載されているように、表2のベンチマークサンプルの分類中に得られた最大予測性能のために、試験化学物質の個々の複製物ごとのSVM DVをカットオフに対して較正した。続いて較正されたSVM DVを最終的な分類に使用し、複製物の出力値の中央値が0より大きければ、その試験化学物質を感作物質として分類した。精度、感度および特異性は、Cooper統計を用いて推定された[35]。ノンパラメトリックTWOSample Wilcoxon検定は、CLPカテゴリー1A、1BとカテゴリーなしのSVM DV分布が有意に異なるかどうかを決定するために実施された。
ランダムフォレストモデルを構築するために、68の化学物質と2の溶媒対照群サンプルをトレーニングセットと定義し、18の化学物質(各CLPカテゴリーから6)が独立した試験セットに含まれていた。試験セット中の化学物質は、モデルの構築には含まれなかった。目標は、3種類全てのCLPカテゴリー(表3)および異なる化学反応性グループ(表4)を表すバランスのとれたトレーニングセットを得ることであった。試験セット中の化学物質の大部分(18のうち14)は、以前にGARDアッセイを用いて調査されなかった37の化学物質を含む、最新の実験キャンペーン(表1)に由来していた。トレーニングセットでは、この最新のデータセットからサンプルの約3分の1(68のうち23)を得た。溶媒サンプルは、全てのプロジェクトの一部であったため、より高い複製数で表される。
経路解析は、例えば遺伝子発現データなどを調べるための経路解析ワークフローを提供する、Key Pathway Advisor(KPA)ツール[40]バージョン16.6を用いて実施された。これは、生物学的解釈を可能にするために、差次的に発現される遺伝子を、上流プロセスおよび下流プロセスの両方に関連付ける。観察したデータセットは、試験セットとトレーニングセットのSCANfastおよびComBatの正規化された発現値からなり、全308サンプル中、約3分の1が残るまで、一貫して低い分散を有する変数を除去するために、最初に分散フィルタリングした(10009変数、σ/σmax=0.1478)。次いで、差次的に制御された転写物を同定するために、CLPのカテゴリーなし、1Bおよび1Aに属するサンプルを比較するマルチグループ比較(ANOVA)を適用した。最も重要な883遺伝子(誤発見率FDR=10-9;p=8.53×10-11)をKPAへの入力として使用した(Affymetrix Exon IDおよびそれぞれのp値、過剰連結性分析)。タンパク質反応性に関連する経路を同定するために、同じ分散フィルタリングしたデータセットを、2群比較に基づいてフィルタリングした(t-検定、Toxtree結合分類の「結合なし」の非感作剤(81サンプル)対「マイケル受容体」の感作剤(MA、63サンプル)、「結合なし」対「シッフ塩基生成」(SB、29サンプル)、「結合なし」対「二分子求核置換/求核芳香族置換の組み合わせ」(SN、25サンプル)。各比較からの500個の最も著しく調節された変数を有するリストを、p値および倍数変化(因果推論分析)とともに、各タンパク質反応性群についてKPAツールに入力した。最小p値は、MAサンプルを「結合なし」と比較したときに達し(FDR=3.65x10-7)、その次は、SB(FDR=2.3x10-5)および(FDR=2.44x10-5)であった。
以下は、正規化と効力予測に使用されるスクリプトである。
スクリプト1:モデル構築前にさまざまなプロジェクト間でバッチ効果に対処するために使用される。
37の化学物質のバイナリ分類
51の化学物質の過去のGARDデータを補完し、化学反応性の分類および消費者製品における使用という観点でバランスをとりつつ、関連する化学物質の選択を表すために、37の十分に特徴付けられた化学物質を含む新規なデータセット(表1)を選択した。この新規な化学物質は、European Chemical Agency CLPデータベースおよび文献[15、41]に基づき、27の化学物質を提供して下さったSkin Tolerance Task Force of Cosmetics Europe (CE)と協力して選択された。この37の新規化学物質は、GPSと、SVM分類に基づく既に確立されたプロトコルを用いて感作剤または非感作剤であると予測された。SVMモデルを適用し、個々の複製物サンプルにSVM DVを割り当てた。最終的な分類の前に、37のサンプルからのSVM DVを、まず、試験化学物質と同じサンプルバッチに含まれる11のベンチマークサンプル(表2)に対して較正した。バイナリ予測を評価する目的で、利用可能な場合には、CLP分類の代わりに、ヒトのデータ[41]を優先することを決定した。この場合、1から4の分類は、感作剤に対応しており、5と6は非感作剤に対応している。37の化学物質を予測するモデルの性能は、AUC ROC 0.88によってまとめられており、図1Aに示されるように(ベンチマーク化学物質-実線;37の化学物質-点線)、良好な識別能力を示している。Cooper統計に基づく感度、特異性および精度は、それぞれ73%、80%および76%と推定された。既に発表されているデータ[23]と組み合わせて、皮膚感作物質のバイナリ分類に対するGARDの更新された予測精度は、合計74の化学物質を含むデータセットに基づき、84%と推定される。表1の化学物質をCLP分類に従ってグループ化し、37の化学物質の分類中に得られたそれぞれのSVM DV値を図1Bに示すようにボックスプロットにまとめると、カテゴリー1Bの弱い感作剤と、カテゴリーなしの非感作剤と比較して、強い感作剤には大きなSVM DVが割り当てられたため、効力の勾配が生じた。SVM DVサンプル分布を比較するノンパラメトリックTWOSample Wilcoxon試験によれば、これらのグループは有意に異なっていた(カテゴリーなし対1B:p=2.8-5;1B対1A p=2.8-6、カテゴリーなし対1A p=3.5-12)。グループ間の差は有意であったが、個々の化学物質間にいくつか重なりが存在し、このことは、この情報が、サンプルを十分に規定された効力グループに完全に層別化するのに十分ではなかったことを示している。
CLPカテゴリーの予測のためのバイオマーカーシグネチャを確立するために、37の新規化学物質を含むデータセットを、51の化学物質を含む過去のデータセットと併合した。合計で、データセットは、CLP(表3)に記載されているように、カテゴリー1Aおよび1Bおよび非感作剤(カテゴリーなし)に関してバランスのとれた、86の固有の化学物質(表4)および2の溶媒参照群からなっていた。4つの化学物質について、CLP分類1Bは、3つの理由のうち1つのために、表4に示されるソースに従ってカテゴリーなし/非感作剤に変更された。(i)以前のGARDプロジェクトとの一貫性を保持するため(ベンズアルデヒド、キシレン)、(ii)非感作性の濃度で溶媒として使用されるため(DMSO)、LLNA中で十分に記載された擬陽性であるため(ドデシル硫酸ナトリウム)。
モデルの性能は、以前はモデルには見られなかった18の化学物質を含む独立した試験セットのCLPカテゴリーを予測することによってさらに評価された。CLPカテゴリーに従って着色した試験セットを、52の同定された変数に基づき、PCA成分に影響を与えずに、PCAプロットで可視化した(図3A)。図3Bは、ヒートマップの形態で、正規化された試験セットにおける52個の遺伝子の制御を可視化する。複製物を別個に予測し、多数の投票を使用してそれぞれの化学物質を分類すると、18の化学物質のうち14が正しいCLPカテゴリーに割り当てられ(表6、表1)、結果全体の精度は78%となった(表7)。4つの誤って分類された化学物質は、マレイン酸ジエチル、ブチルグリシジルエーテル、リラールおよび塩化シアヌルであった。唯一の偽陰性の予測は、塩化シアヌルであり、CLPでは1Aに分類され、本願発明者らのモデルではカテゴリーなしと分類され、一方、残りの3つの化学物質は、CLPで1Bと分類されたが、1Aと予測された。トレーニングセットと試験セットの選択は偏っておらず、予測モデルがトレーニングセットの構成に完全には依存していないことを確認する次の工程では、18の代替となるランダムフォレストモデルを構築し、ここでは、トレーニングセットと試験セットの中の化学物質の組成をランダムにシャッフルした。それぞれの新しいモデルについて、上述の変数選択の完全なプロセスを繰り返した。各化学刺激に対し利用可能な複製物サンプルの数に依存して、トレーニングセットおよび試験セットそれぞれのサンプルの合計数が変動したが、各セットの中の化学物質の数と、CLP分布は一定に保った。この代替モデルは全て有意であり、ブートストラッピング手順から得られた平均予測エラー率は0.22で初期モデルと同一であり、このことは、トレーニングセットと試験セットの偏った選択に起因して、提示されたモデルが得られたのではなかったことを裏付けている。
次に、ヒト効力カテゴリーに関連する情報[41]を用いて52の変数(表5)がどのように機能するかを調べるために、PCAを利用した。ヒト効力(クラス1~6、6=真の非感作剤、1=最も強い感作剤)に従って、70のトレーニングセットと18の試験セットサンプルを着色し、ヒト効能カテゴリーが利用できなかったサンプルを除去した(表4を参照)。このモデルは、CLP効力カテゴリーを予測するために開発されているが、図4A、Bに示すように、ヒト効力に関する情報も含む。
ランダムフォレストによって特定された52の変数(表5)は、異なる細胞区画および異なる機能的役割に属する転写物を表す。これらのうち5つは、GARD予測シグネチャと重なっている。ブートストラッピングプロセスで最も頻繁に選択され、最も高い検証呼び出し頻度(表5)を有する上位10個のマーカーのうちの5つは、HIST1H2AB[42]などのヒストンクラスター1メンバーである。ヒストンは高度に保存されており、クロマチン構造を維持するだけでなく、遺伝子制御にも重要な役割を果たす[43]。PFASおよびPAICSはプリン生合成に関与しており[44、45]、TMEM97はコレステロールレベルの調節因子であり[46]、これは、RNA干渉実験による神経膠腫細胞モデルにおける細胞周期調節、細胞移動および浸潤に関与することがさらに記載されている[47]。DHCR24は、小胞体(ER)に局在化する多機能酵素であり、コレステロール合成の最終段階を触媒する[48]が、例えば、ERストレス下での神経細胞で示されるような抗アポトーシス活性も有する[49]。キナーゼであるPLK1は、TLR活性化に応答してリン酸化されることが示されており、RNA干渉の結果は、PLK1シグナル伝達がTLR誘発性の炎症応答に関与していることを示唆していた[50]。PLK1は、TNF誘発性のサイクリンD1発現を阻害することによって細胞周期制御に関与することがさらに報告されており、TNF誘導NF-κB活性化を低下させる可能性があった[51]。残りの転写産物の多くは核タンパク質であり、従って複製、転写、スプライシングおよび細胞周期制御などのDNA依存性のプロセスに関与している可能性が高い。シグネチャには、免疫応答および/または感作に関与することが知られているタンパク質(NQO1など)をコードするいくつかの転写産物がさらにあり、皮膚感作剤に対する細胞応答の役割について十分に説明されている[52]。CD53は、テトラスパニンファミリーに属し、例えば、細胞接着、遊走およびシグナル伝達において複数の機能を有する膜貫通タンパク質であり、それぞれ健康なコントロールと比較して、アトピー性湿疹患者の末梢血由来の単球[54]と同様に、アトピー性皮膚炎患者個体からのFcεRI陽性皮膚DCについて上昇することが示されている[53]。CD44は、細胞表面の糖タンパク質であり、接着やヒアルロナン受容体[55]は、多くの細胞種によって発現し、例えば、炎症組織への白血球移動を媒介することによって炎症応答に関与し[56]、このことは、アレルギー性皮膚炎のマウスモデルで示されている[57]。
33の主要経路を、KPA分析(図5)におけるCLPカテゴリー間のマルチグループ比較(FDR=10-9)後に、883の最も重要な調節遺伝子の入力によって同定し、52の変数の機能グループのいくつかのミラーを遺伝子制御、細胞周期制御および代謝などのランダムフォレストによって定義した。「細胞増殖、生存、分化および代謝のIL-4誘発性制御因子」および「JAK/STAT、p38、JNKおよびNF-κBを介した免疫応答_IL-3シグナル伝達」などの免疫応答関連経路は、50%の最も大幅に制御されたものであった。
感作を誘発する、さらされた皮膚領域あたりの化学物質の量は、著しく変化する[41]。したがって、正確なリスク評価のためには、皮膚感作剤の効力情報が不可欠である。代替試験法の開発者は、ヒトの感作性の高い予測性を達成するためにヒトの臨床データに依存しているが、この種のデータはむしろ不十分であり、最も有用なデータはLLNAから得られる[64]。動物モデルは皮膚感作などの全身性疾患の複雑さを反映しているという事実にもかかわらず、インビトロデータは、今までに、動物モデルよりも十分に相関関係があり、特にITSと組み合わせた場合には良好である[65]。さらに、代替の試験システムは、全動物を用いた試験が提供できないという機械的な洞察を提供する可能性がある[66]。
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序論
以前の試験に基づき、本願発明者らは、GARDアッセイによって皮膚感作物質の効力を予測することができると仮定した。効力予測モデルを開発するために、2つの手法を並行して行った。バイナリ分類を提供するためにトレーニングされた、本願発明者らの確立されたサポートベクターマシン(SVM)を利用する[1-3]。他の手法は、潜在構造に対する直交部分最小二乗投影法(O-PLS)の線形回帰モデル(Simca、Umetrics、スウェーデン)に基づいている。O-PLS[5]は、主成分分析に関連した投影法であり、したがって、全ゲノムRNAマイクロアレイデータ(29,000を超える転写物)の場合のように、観測値(またはサンプル)よりも多くの変数を有する行列に十分に適している。O-PLSは、マトリックスXの構造化された変動性を予測(Yと相関する)および直交情報(Yと相関しない)に分け、残留変動を加えるように設計された、PLS法(Wold、1975)の変法である。これにより、潜在変数(元の変数の線形結合)の解釈可能性が向上し得る。
34の化学物質のセットとコントロールのGARD SVM決定値とヒト効力分類との関係を図9に示す。SVMモデルは、バイナリ分類(感作剤対非感作剤)のために開発された。
本願発明者らの分析では、本願発明者らのマイクロアレイデータとヒト効力との間に明確な関係があることがわかる。さらなるモデル開発が進行中であり、試験された化学物質の数と種類によって性能が向上することが期待される。また、多変量解析法を機能選択ツールとして検討し、最終的に感作剤の効力に関連する機構についての新たな洞察を導き、精度の高い化学物質のヒト効力の予測を改善する手段を提供する。
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2.Johansson Hら、The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.Toxicology in vitro 2013.
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序論
以前の試験に基づき、本願発明者らは、GARDアッセイによって皮膚感作物質の効力を予測することができると仮定した。効力予測モデルを開発するために、2つの手法を並行して行った。バイナリ分類を提供するためにトレーニングされた、本願発明者らの確立されたサポートベクターマシン(SVM)を利用し[1-3]、図9に示すように、34の化学物質のセットとコントロールのGARD SVM決定値とヒト効力分類[4]との相関関係を示す。SVMモデルは、バイナリ分類(感作剤対非感作剤)のために開発された。
化学物質の感作効力に関し、European Chemical Agency(ECHA)は、1A(強い感作剤)、1B(弱い感作剤)およびカテゴリーなし(非感作剤)からなる、化学物質および混合物の分類、標識および包装に関する規制(EC)No 1272/2008に従うカテゴリー化(CLP)を提案しており、[7]。ここでは、供給された.632+ブートストラップ方法によって推定されたエラー率を有するR/Bioconductorバージョン3.1.2のランダムフォレストvarSelRFパッケージ[6]を使用し、トレーニングデータ中の複製物からの転写強度の算術平均に基づいて作成されたRFモデルを提示する。複製物の転写強度から直接構築することもできる。このモデルを表9に記載したトレーニングセット(70物質)を用いてトレーニングし、次いで、表10に示す試験(18物質)で試験した。モデル性能のまとめを表11に示す。図13は、記述されたランダムフォレストモデルの主成分分析およびヒートマップ結果を含む。同定された効力バイオマーカーのリストを表12に示す。
本願発明者らの分析では、本願発明者らのマイクロアレイデータと効力情報(ヒト効力とCLPを両方とも含む)との間に明確な関係があることがわかる。多変量解析法を特徴選択ツールとして使用し、感作剤の効力に関連する機構に対する新たな洞察が得られる。さらに、化学物質の感作剤の効力を高精度に予測することができる。
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Claims (20)
- 工程(c)で測定されたバイオマーカーのうち1つ以上が、表A(i)および/または表A(ii)に定義される群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)が、表A(i)に列挙された1つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含む、請求項1~2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試験薬剤が、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られているか、またはその可能性がある、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって決定された前記皮膚感作効力が、European Classification,Labelling and Packaging(CLP)Regulationに従って、すなわち、カテゴリー1A(強)、カテゴリー1B(弱)、またはカテゴリーなし(感作剤なし)に分類される;または
前記方法によって決定された前記皮膚感作効力が、Basketterら、2014、「Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency」、Dermatitis、25(1):11-21に記載されるシステムに従って、すなわち、カテゴリー1(最も強い感作剤)、2、3、4、5または6(真の非感作剤)に分類される、
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。 - 皮膚感作がIV型過敏反応である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)が、1つ以上のバイオマーカーの核酸分子の発現を測定することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)において1つ以上のバイオマーカーの発現を測定することが、1つ以上の結合部分を用いて行われ、それぞれが表Aに特定されるバイオマーカーの1つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)が、工程(c)で定義される1つ以上のバイオマーカーのタンパク質の発現を測定することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(c)がアレイを使用して行われる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、インビトロで行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 2個以上のバイオマーカーの発現が、試験薬剤にさらす前および後に、工程(a)で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらす前および後の2つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程(b)の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
(d)さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(e)工程(d)で提供された細胞を、
i.ヒト皮膚を感作しない1つ以上のネガティブコントロール剤;および/または
ii.ヒト皮膚を感作する1以上のポジティブコントロール剤;および/または
iii.1つ以上の溶媒対照群にさらす工程と;
(f)1つ以上のコントロール薬剤にさらす以外は、工程(a)で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間インキュベートする工程と;
(g)工程(e)の細胞において、工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーと工程(g)で測定された2つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、方法。 - 請求項1~13のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
(h)さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と;
(i)工程(h)で提供された細胞を、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす工程と;
(j)工程(h)の細胞において、工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程(c)で測定された2つ以上のバイオマーカーと工程(j)で測定された2つ以上のバイオマーカーとの発現における相似が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、方法。 - 請求項1~14のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
(k)試験薬剤の皮膚感作効力を同定する工程を含む、方法。 - 樹状細胞の集団または樹状様細胞の集団が、樹状様細胞の集団である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項8に記載の1つ以上の結合部分を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法で使用するためのアレイ。
- 請求項1~16のいずれか一項に記載の方法で使用するための解析キットであって、
(a)請求項17に記載のアレイと;
(b)請求項1~16のいずれか一項に記載の方法を行うための指示書と
を含む、解析キット。
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