TW201805430A - 分析方法及用於該分析方法的陣列 - Google Patents

Abstract

本發明係有關用於鑑定測試劑之皮膚致敏劑效價之方法，及用於此類方法之陣列與分析套組。

Description

分析方法及用於該分析方法的陣列

本發明係有關用於鑑定測試劑之皮膚致敏劑效價之方法，以及用於此類方法之陣列與分析套組。

過敏性接觸性皮膚炎(ACD)係一種發炎性皮膚病，影響相當大比例之人口。其通常由對化學半抗原之免疫反應引起，導致社會巨大之經濟負擔。目前致敏化學品之檢測係依賴動物實驗。於例如製藥與化妝品工業中，化學品註冊及使用上之法規，已激發有關用於預測致敏性之替代人類細胞系分析法顯著之研究成果。其目的在於以展示較高預測能力之活體外測試取代動物實驗。

ACD之特徵為濕疹及反復發作之瘙癢[Akhavan,A.and S.R.Cohen,The relationship between atopic dermatitis and contact dermatitis.Clin Dermatol,2003.21(2)：p.158-62]。該等疾病影響相當大比例之人口，於歐洲之盛行率為7.2%至18.6%[Mortz,C.G.,et al.,Prevalence of atopic dermatitis,asthma,allergic rhinitis,and hand and contact dermatitis in adolescents.The Odense Adolescence Cohort Study on Atopic Diseases and Dermatitis.Br J Dermatol,2001.144(3)：p.523-32；與Nielsen,N.H.,et al.,Allergic contact sensitization in an adult Danish population：two cross-sectional surveys eight years apart(the Copenhagen Allergy Study)。Acta Derm Venereol,2001.81(1)：p.31-4]，以及由於重複地暴露於致敏化學品，發生率不斷增加。ACD係第四型延遲型過敏反應，主要於先前曾暴露之免疫致敏個體中，與小化學半抗原接觸部位處，由反應性T輔助細胞(Th1)與產生干擾素(IFN)γ之CD8⁺ T細胞所引起[Fonacier,L.S.,S.C.Dreskin,and D.Y.Leung,Allergic skin diseases.J Allergy Clin Immunol.125(2 Suppl 2)：p.S138-49]。表皮中之樹突狀細胞(DC)經由回應於結合自體分子之半抗原及活化T細胞媒介之免疫性，啟動免疫反應。

REACH(化學品之註冊、評估、與授權)規章要求，歐洲聯盟內包括約3萬個化學品之所有新穎與現有化學品都應進行危害效應之測試[EC 1907/2006,in Regulation(EC)No 1907/2006]。由於目前潛在致敏劑之鑑定需要進行動物試驗，該REACH法規將對測試所需動物之數量產生巨大衝擊。再者，於2013年，化妝品指令之第七次修正案[7th Amendment to the Cosmetics Directive (76/768/EEC)]提出禁止針對供人類使用之大多數化妝品成分進行動物試驗。因此，迫切需要開發可靠之替代實驗動物之活體外方案，用以供評估化學品致敏能力。

申請人等已開發一種用於預測致敏化學品 之人類細胞系分析法，稱為基因體過敏原快速測定法[Genomic Allergen Rapid Detection，GARD(第8圖)]。關於其詳細說明，參見WO 2012/056236與Johansson H et al.The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.Toxicology in vitro 2013，其等併入本文以資參考。經由分析類樹突狀細胞(例如MUTZ-3細胞株)之轉錄體，申請人等已鑑定出具強烈鑑別能力之基因體生物標記識別特徵[Johansson H et al.A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests.BMC Genomics.2011；Johansson H et al.The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.Toxicology in vitro 2013；與Johansson H et al.GARD in-house validation-A proof of concept.Toxicological Sciences 2014]。再者，由不同化學反應性基團接合傳訊途徑之方式似與致敏效價有關[Albrekt et al.Skin sensitizers differentially regulate signaling pathways in MUTZ-3 cells有關their individual potency.BMC Pharmacology and Toxicology 2014]。

然而，迄今，仍需要非動物替代物來鑑定皮膚致敏化學品之效價，而較佳之測定法為小鼠局部淋巴結測定法(LLNA)[Basketter,D.A.,et al.,Local lymph node assay-validation,conduct and use in practice.Food Chem Toxicol,2002.40(5)：p.593-8]，其次為天竺鼠最大化試驗(GPMT)[Magnusson,B.and A.M.Kligman,The identification of contact allergens by animal assay.The guinea pig maximization test.J Invest Dermatol,1969.52(3)：p.268-76]。

此等動物模式之活體外替代方案最好能展現增進之可信賴性、效價預測準確性，及重要的為與人類反應性相關。

基於先前之研究，已證明GARD測定法對於皮膚致敏劑之鑑定具有價值。使用多變量模型的人類轉錄體之更廣泛評估頃令人驚奇地顯示，增進之活體外效價模型亦屬可能。

於是，本發明之第一態樣提供用於測定製劑之皮膚致敏效價之方法，該方法包含或只包含下述步驟：(a)提供樹突狀細胞之族群或類樹突狀細胞之族群；(b)使步驟(a)提供之細胞暴露於測試劑；及(c)於步驟(b)之細胞中，測量選自表A中所界定組群之二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現，表示步驟(b)測試劑之皮膚致敏效價。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)所測量之一或多個生物標記係選自表A(i)及/或表A(ii)所界定之組群。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表A(i)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(i)中列舉之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、或20個生物標記之表現。舉例而言，步驟(c)可包含或只包含測量表A(i)中列舉之所有生物標記之表現。

該方法可包括或排除測量HIST1H2BM之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H4B之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H1D之表現。該方法可包括或排除測量PAICS之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H4D之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AL///HIST1H2BN之表現。該方法可包括或排除測量PLK1之表現。該方法可包括或排除測量PHGDH之表現。該方法可包括或排除測量MCM2之表現。該方法可包括或排除測量MCM7之表現。該方法可包括或排除測量CD53之表現。該方法可包括或排除測量KIFC1之表現。該方法可包括或排除測量WEE1之表現。該方法可包括或排除測量TMPO之表現。該方法可包括或排除測量MCM4之表現。該方法可包括或排除測量PSRC1之表現。該方法可包括或排除測量RNF149之表現。該方法可包括或排除測量MCM6之表現。該方法可包括或排除測量MCM5之表現。該方法可包括或排除測量FANCA之表現。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表A(ii)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(ii)中列舉之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個生物標記之表現。舉例而言，步驟(c)可包含或只包含測量 表A(ii)中列舉之所有生物標記之表現。

該方法可包括或排除測量CAD之表現。該方法可包括或排除測量MRTO4之表現。該方法可包括或排除測量TOE1之表現。該方法可包括或排除測量CDC20之表現。該方法可包括或排除測量PM20D2之表現。該方法可包括或排除測量LOC344887之表現。該方法可包括或排除測量UNG之表現。該方法可包括或排除測量CDKN1A之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2BF之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H1B之表現。該方法可包括或排除測量轉錄本ID 7896697之表現。該方法可包括或排除測量JADE1之表現。該方法可包括或排除測量KIAA0125之表現。該方法可包括或排除測量CHRNA5之表現。該方法可包括或排除測量CHAF1B///MORC3之表現。該方法可包括或排除測量SEL1L3之表現。該方法可包括或排除測量SSRP1之表現。該方法可包括或排除測量FOXM1之表現。該方法可包括或排除測量LMNB1之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AK.該方法可包括或排除測量CENPA之表現。該方法可包括或排除測量NCAPH之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2BB之表現。該方法可包括或排除測量ATP6V1B2之表現。該方法可包括或排除測量TRAP1之表現。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)可包含或只包含測量表A(iii)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(iii)中列舉之1、2、3、4、5、6、或7個生物標記之 表現。舉例而言，步驟(c)包含或只包含測量表A(iii)中列舉之所有生物標記之表現。

該方法可包括或排除測量PFAS之表現。該方法可包括或排除測量TMEM97之表現。該方法可包括或排除測量DHCR24之表現。該方法可包括或排除測量FTH1之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AE之表現。該方法可包括或排除測量NQO1之表現。該方法可包括或排除測量CD44之表現。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表A中列舉之三個或更多個生物標記，例如，表A中列舉之4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、或52個生物標記之表現。舉例而言，步驟(c)可包含或只包含測量表A中列舉之所有生物標記之表現。

該方法可包括或排除測量HIST1H2BM之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H4B之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H1D之表現。該方法可包括或排除測量PAICS之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H4D之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AL///HIST1H2BN之表現。該方法可包括或排除測量PLK1之表現。該方法可包括或排除測量PHGDH之表現。該方法可包括或排除測量MCM2之表現。該方法可包括或排除測量 MCM7之表現。該方法可包括或排除測量CD53之表現。該方法可包括或排除測量KIFC1之表現。該方法可包括或排除測量WEE1之表現。該方法可包括或排除測量TMPO之表現。該方法可包括或排除測量MCM4之表現。該方法可包括或排除測量PSRC1之表現。該方法可包括或排除測量RNF149之表現。該方法可包括或排除測量MCM6之表現。該方法可包括或排除測量MCM5之表現。該方法可包括或排除測量FANCA之表現。

該方法可包括或排除測量CAD之表現。該方法可包括或排除測量MRTO4之表現。該方法可包括或排除測量TOE1之表現。該方法可包括或排除測量CDC20之表現。該方法可包括或排除測量PM20D2之表現。該方法可包括或排除測量LOC344887之表現。該方法可包括或排除測量UNG之表現。該方法可包括或排除測量CDKN1A之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2BF之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H1B之表現。該方法可包括或排除測量轉錄本ID 7896697之表現。該方法可包括或排除測量JADE1之表現。該方法可包括或排除測量KIAA0125之表現。該方法可包括或排除測量CHRNA5之表現。該方法可包括或排除測量CHAF1B///MORC3之表現。該方法可包括或排除測量SEL1L3之表現。該方法可包括或排除測量SSRP1之表現。該方法可包括或排除測量FOXM1之表現。該方法可包括或排除測量LMNB1之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AK之表現。該方法可包括或排 除測量CENPA之表現。該方法可包括或排除測量NCAPH之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2BB之表現。該方法可包括或排除測量ATP6V1B2之表現。該方法可包括或排除測量TRAP1之表現。

該方法可包括或排除測量PFAS之表現。該方法可包括或排除測量TMEM97之表現。該方法可包括或排除測量DHCR24之表現。該方法可包括或排除測量FTH1之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AE之表現。該方法可包括或排除測量NQO1之表現。該方法可包括或排除測量CD44之表現。

該方法可包括或排除測量MCM7、PFAS、HIST1H2AE之一或多者之表現。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)可包含或只包含測量表B中列舉之一或多個生物標記之表現。舉例而言，步驟(c)可包含或只包含測量表B中列舉之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個生物標記之表現。舉例而言，步驟(c)可包含或只包含測量表B中列舉之所有生物標記之表現。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表B中列舉之至少2個生物標記，例如，表B中列舉之

3、

4、

5、

6、

7、

8、

9、

10、

11、

12、

13、

14、

15、

16、

17、或18個生物標記之表現。

於替代或更多具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表B(i)中列舉之一或多個生物標記，例如，表 B(i)中列舉之

2、

3、

4、

5、

6、

7、

8、

9、

10、

11、

12、

13、

14、

15、或16個生物標記之表現。

於替代或更多具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量表B(ii)中列舉之一或多個生物標記，例如，表B(ii)中列舉之2個生物標記之表現。

該方法可包括或排除測量CCNA2之表現。該方法可包括或排除測量轉錄本ID 8151252之表現。該方法可包括或排除測量PIGW之表現。該方法可包括或排除測量SNRPD1之表現。該方法可包括或排除測量ARHGAP19///ARHGAP19-SLIT1之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AB之表現。該方法可包括或排除測量LRCH2之表現。該方法可包括或排除測量PKP4///PKP4之表現。該方法可包括或排除測量RAVER2///RAVER2之表現。該方法可包括或排除測量DUT///DUT之表現。該方法可包括或排除測量AURKA之表現。該方法可包括或排除測量轉錄本ID 8055309之表現。該方法可包括或排除測量NDC1之表現。該方法可包括或排除測量KIF22///KIF22之表現。該方法可包括或排除測量OK/SW-CL.58之表現。該方法可包括或排除測量轉錄本ID 7994343之表現。該方法可包括或排除測量HIST1H2AB///HIST1H2AE之表現。該方法可包括或排除測量HMGB3之表現。

"表現"意指生物標記之存在、程度(level)及/或量。

"生物標記"意指包含任何生物分子、或其成 分或其片段，其測量可提供有助於測定致敏劑效價之信息。因此，於表A之場合中，生物標記可為核酸分子，例如mRNA或cDNA。替代地，生物標記可為由核酸分子編碼之蛋白質或碳水化合物部分、或抗原成分或其片段。

於更多或替代具體實例中，該測試劑係已知，或被懷疑，能誘發皮膚致敏。

舉例而言，測試劑可能已知經由使用此項技藝中已知之方法，例如WO 2012/056236及/或Johansson H et al.The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.Toxicology in vitro 2013中敘述之方法，能誘發皮膚致敏；該等文獻併入本文以資參考。

於替代或更多具體實例中，該方法係用於鑑定測試劑之皮膚致敏劑效價及皮膚致敏劑/非致敏劑狀態(即，鑑定測試劑是否為致敏劑及鑑定其作為皮膚致敏劑之效價)。於替代或更多具體實例中，該方法包括使用WO 2012/056236中及/或Johansson H et al.敘述之方法鑑定測試劑是否為致敏劑。

"皮膚致敏效價"包括或意指製劑之皮膚致敏能力之強度。舉例而言，製劑之致敏能力之相對效價或強度可能導使一組測試劑從最高效力至最低效力之排序或反之亦然，及/或可能導使其根據一或多個已知規章或系統之分類。

於更多或替代具體實例中，經由該方法所測定之皮膚致敏效價係根據歐盟分類、標示與包裝(CLP) 規章(EC)1272/2008(http：//echa.europa.eu/clp-2015)進行分類。此系統係以聯合國全球統一系統(GHS)為基礎，且從2015年6月起，係適用於物質以及混合物二者之分類與標示之唯一法規。其要求公司將產品投入市場之前，對其產品進行合適地分類、標示與包裝。其提供類別：1A(強)、1B(弱)、或無類別(非致敏劑)。

舉例而言，該方法可提供：(i)效價類別1A的一或多個製劑；(ii)效價類別1B的一或多個製劑；及/或(iii)無效價類別的一或多個製劑。

於更多或替代具體實例中，經由該方法測定之皮膚致敏效價係根據見述於Basketter et al.,2014,‘Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency,’Dermatitis,25(1)：11-21中之系統進行分類，即類別1(最強致敏劑)、2、3、4、5、或6(真正非致敏劑)(例如表4，第4圖)。

舉例而言，該方法可提供：(i)效價類別1的一或多個製劑；(ii)效價類別2的一或多個製劑；(iii)效價類別3的一或多個製劑；(iv)效價類別4的一或多個製劑；(v)效價類別5的一或多個製劑；及/或(vi)效價類別6的一或多個製劑(例如，參見本發明表8及/或Basketter et al.,2014同上)。

於更多或替代具體實例中，皮膚致敏效價係根據局部淋巴結測定法(LLNA)、天竺鼠極大化試驗(GPMT)或無觀察到之效應程度(NOEL)分類。

關於LLNA之詳細說明參見Basketter,D.A.,et al.,Local lymph node assay-validation,conduct and use in practice.Food Chem Toxicol,2002.40(5)：p.593-8；將其併入本文以資參考。關於天竺鼠極大化試驗之詳細說明參見Magnusson,B.and A.M.Kligman,The identification of contact allergens by animal assay.The guinea pig maximization test.J Invest Dermatol,1969.52(3)：p.268-76；將其併入本文以資參考。至於有關皮膚致敏劑效價之無觀察到之效應程度(NOEL)檢測之詳細說明參見Basketter et al.,2005,‘Evaluation of the skin sensitizing potency of chemicals by using the existing methods and considerations of relevance for elicitation’ Contact Dermatitis,52(1)：39-43；與Griem,P.,et al.,2003,‘Proposal for a risk assessment methodology for skin sensitization based on sensitization potency data.’Regul.Toxicol.Pharmacol.,38：269-290；均併入本文以資參考。關於與NOEL與效價程度間之相關性，亦參見WHO Library Cataloguing-in-Publication Data.Skin sensitization in chemical risk assessment.(IPCS harmonization project document：no.5),ISBN 978 92 4 156360 4(特別是第26至28頁之表1)；將其併入本文以資參考。關於CLP之詳細說明，參見(http：//echa.europa.eu/clp-2015)； 將其併入本文以資參考。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)所測量之一或多個生物標記之表現係在暴露於預定(predetermined)效價之皮膚致敏劑之前與之後，於步驟(a)提供之細胞中測量，及其中該一或多個生物標記在暴露於測試劑前後表現之差異表示步驟(b)之皮膚致敏劑之效價。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)所測量之一或多個生物標記之表現係在暴露於預定效價之皮膚致敏劑之前與之後，於步驟(a)提供之細胞中測量，及其中該一或多個生物標記於步驟(c)前後表現之差異表示步驟(b)之皮膚致敏劑之效價。

「表現之差異」包括，於第一個試樣(例如，測試劑試樣)中之存在及/或量與第二個試樣(例如，對照製劑試樣)不同。較佳為該存在及/或量不超過比較試樣之40%，例如，不超過39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%。

於更多或替代具體實例中，該一或多個生物標記係在暴露於測試劑之前與之後，於步驟(a)提供之細胞中測量，及其中該一或多個生物標記在暴露於測試劑前後表現之差異表示步驟(b)之測試劑之皮膚致敏效價。因此，步驟(a)提供之細胞可提供陰性對照以及測試結果。

於更多或替代具體實例中，該一或多個生物標記係在暴露於測試劑之前與之後，於步驟(a)提供之細胞中測量，及其中該一或多個生物標記於步驟(c)前後表現之差異表示步驟(b)之測試劑之皮膚致敏效價。因此，步驟(a)提供之細胞可提供陰性對照以及測試結果。

於更多或替代具體實例中，該方法進一步包括以下步驟：(d)提供另外的樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群；(e)使步驟(d)提供之細胞暴露於：i.不會敏化人類皮膚之一或多個陰性對照劑；及/或ii.敏化人類皮膚之一或多個陽性對照劑；及/或iii.一或多個載體對照(vehicle control)；(f)除了暴露於該一或多個製劑或一或多個對照製劑之外，於如步驟(a)所提供細胞之相同時間與相同條件下進行培育；(g)於步驟(e)之細胞中，測量步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)中測量之該二或更多個生物標記與步驟(g)中測量之該二或更多個生物標記之間表現之差異表示該測試劑之皮膚致敏效價。

於更多或替代具體實例中，該方法進一步包括以下步驟：(d)提供另外的樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群； (e)使步驟(d)提供之細胞暴露於：i.不會敏化人類皮膚之陰性對照劑；ii.載體對照；或iii.除了暴露於預定皮膚致敏效價之製劑外，於如步驟(a)所提供細胞之相同時間與相同條件下進行培育；(f)於步驟(e)之細胞中，測量步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)中測量之該二或更多個生物標記與步驟(f)中測量之該二或更多個生物標記之間表現之差異表示該測試劑之皮膚致敏效價。

於更多或替代具體實例中，載體對照包含DMSO。

「表現之差異」包括，於第一個試樣(例如，測試劑試樣)中之存在及/或量與第二個試樣(例如，對照製劑試樣)不同。較佳為該存在及/或量不超過比較試樣之40%，例如，不超過39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%。

於更多或替代具體實例中，該方法進一步包括以下步驟：(h)提供另外的樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群； (i)使步驟(h)提供之細胞暴露於預定效價之皮膚致敏劑；(j)於步驟(i)之細胞中，測量步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)中測量之該二或更多個生物標記與步驟(j)中測量之該二或更多個生物標記之間表現之對應表示該測試劑之皮膚致敏效價。

「表現之對應」包括，於第一個試樣(例如，測試劑試樣)中之存在及/或量與於第二個試樣(例如，對照試樣)中之存在及/或量類似或相同。較佳為該存在及/或量為對照試樣之至少60%，例如，至少65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

於更多或替代具體實例中，該方法進一步包括以下步驟：(k)鑑定該測試劑之皮膚致敏效價。

該鑑定可使用此項技藝中已知之任何適當之統計方法或機器學習演算法進行，例如隨機森林法(Random Forest，RF)、支持向量機(Support Vector Machine，SVM)、主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)、一般最小平方(OLS)、部分最小平方迴歸(PLS)、正交部分最小平方迴歸(O-PLS)及其他多變量統計分析(例如，向後 逐步邏輯迴歸模型)。多變量統計分析之評論回顧參見，例如，Schervish,Mark J.(November 1987)。"A Review of Multivariate Analysis".Statistical Science 2(4)：396-413；將其併入本文以資參考。較佳為使用隨機森林模型(例如實施例A所詳述)。

於本發明方法之更多或替代具體實例中，致敏效價係以至少0.45之ROC AUC測定，例如以至少0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99之ROC AUC或以1.00之ROC AUC測定。較佳地，皮膚致敏效價係以至少0.80，更佳為至少0.85，又更佳為至少0.88之ROC AUC測定。

較佳地，本發明方法具有至少60%，例如，61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之準確度。

較佳地，本發明方法具有至少60%，例如，61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之靈敏度。

較佳地，本發明方法具有至少60%，例如，61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之特異性。

「準確度」意指方法正確結果之比例；「靈敏度」意指正確分類為陽性的所有陽性化學品之比例；「特異性」意指正確分類為陰性的所有陰性化學品之比例。

於更多或替代具體實例中，該方法進一步包括以下步驟：(l)步驟(h)至(j)(與存在時之步驟(k))之一或多個重複。

於更多或替代具體實例中，步驟(a)至(c)(與存在時之步驟(d)至(f/g))之各個重複(即，與原始步驟(a)至(c)(與存在時之步驟(d)至(f/g)))係同時進行。於更多或替代具體實例中，步驟(a)至(c)(與存在時之步驟(d)至(f/g))之各個重複係連續進行。

於更多或替代具體實例中，步驟(j)包含或只包含一或多個重複，其中：(I)與步驟(i)提供之預定皮膚致敏效價之相同製劑之一或多個另一重複；或(II)與步驟(i)提供之預定皮膚致敏效價之不同製劑之一或多個另一重複。

於更多或替代具體實例中，步驟(i)提供之 預定皮膚致敏效價之不同製劑係選自下列所成群組：(I)與步驟(i)提供之預定皮膚致敏效價之不同製劑具有相同致敏效價之製劑；或(II)與步驟(i)提供之預定皮膚致敏效價之不同製劑具有不同致敏效價之製劑之組群。

於更多或替代具體實例中，步驟(a)至(c)(與存在時之步驟(f/g))係重複至少一次，例如，

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1000重複。

於更多或替代具體實例中，為了實驗誤差各步驟或步驟之重複可與對照同樣地重複，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10重複。

於更多或替代具體實例中，所測量之二或更多個生物標記之表現係針對預定皮膚致敏效價之製劑進行全範圍皮膚致敏效價之測量。

「全範圍皮膚致敏效價」包括評估所用分類系統中最高及最低程度皮膚致敏劑類別之致敏劑。較佳地，評估所用分類系統中每一致敏劑類別之致敏劑。

於更多或替代具體實例中，預定效價之皮膚致敏劑包含或只包含選自由表2所界定組群所成群組之一或多個製劑。舉例而言，該方法可包括測量於表2所界 定之

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10、或11個製劑。

於更多或替代具體實例中，預定效價之皮膚致敏劑包含或只包含選自由表8、表9及/或表8例如僅表8、僅表9、僅表10、表8與9、表8與10、表9與10或表8、9與10所界定組群所成群組之製劑。舉例而言，該方法可包括測量於表8、9與10所界定之

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121或122個對照製劑。

於更多或替代具體實例中，預定效價之皮膚致敏劑包含或只包含選自由1-丁醇、4-胺基苯甲酸、苯甲醛、氯苯、鄰苯二甲酸二乙酯、二甲基甲醯胺、乙基香草醛、甘油、異丙醇、乳酸、水楊酸甲酯、辛酸、丙二醇、 苯酚、對羥苯甲酸、過錳酸鉀、水楊酸、十二基硫酸鈉、Tween 80、硫酸鋅、2,4-二硝基氯苯、

唑啉酮、重鉻酸鉀、Kathon CG(MC/MCI)、甲醛、2-胺基苯酚、2-硝基-1,4-苯二胺、對苯二胺、己基桂皮醛、丙烯酸2-羥乙酯、2-統基苯并噻唑、乙二醛、桂皮醛、異丁香酚、乙二胺、間苯二酚、桂皮醇、丁香酚、青黴素G、香葉醇與DMSO所成群組之製劑。

於較佳具體實例中，步驟(c)包含或只包含測量一或多個生物標記之核酸分子之表現。該核酸分子可為cDNA分子或mRNA分子。較佳地，該核酸分子係mRNA分子。然而，該核酸分子可為cDNA分子。

於一具體實例中，步驟(c)中一或多個生物標記表現之測量係使用選自下列所成群組之方法進行：南方雜交、北方雜交、聚合酶連鎖反應(PCR)、反轉錄酶PCR(RT-PCR)、定量即時PCR(qRT-PCR)、奈米陣列、微陣列、巨陣列、自動放射攝影術與原位雜交。較佳地，一或多個生物標記之表現係使用DNA微陣列測量。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)中所測量之該一或多個生物標記係使用陣列(例如，DNA陣列)測量。於更多或替代具體實例中，步驟(c)中所測量之該一或多個生物標記係使用全基因體陣列(例如，Affymetrix Human Gene 1.0 ST陣列或Affymetrix Human Gene 2.0 ST陣列)測量。於替代或更多具體實例中，係使用Nanostring nCounter系統[例如，以選自全基因體陣列(例如，Affymetrix Human Gene 1.0 ST陣列或Affymetrix Human Gene 2.0 ST陣列)為基礎之定製Nanostring nCounter碼集]。

該方法可包括使用一或多個結合部分測量步驟(c)中一或多個生物標記之表現，其中各個結合部分能選擇性地結合編碼表A中所鑑定之一種生物標記之核酸分子。

於一具體實例中，該一或多個結合部分各自包含或只包含核酸分子。於進一步之具體實例中，該一或多個結合部分各自包含或只包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO。較佳地，該一或多個結合部分各自包含或只包含DNA。於一具體實例中，該一或多個結合部分為5至100個核苷酸長度。然而，於替代具體實例中，其為15至35個核苷酸長度。

該一或多個結合部分可包含或只包含得自Human Gene 1.0 ST Array(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)之一或多個探針。本文表A中提供探針鑑定編號，於其中被稱為「轉錄本簇ID」。

如下文所討論，適當之結合劑(亦稱為結合分子或結合部分)可根據其結合既定核酸、蛋白質或胺基酸模體之能力，從資料庫中選擇或篩選。

於較佳具體實例中，該結合部分包含可檢測部分。

「可檢測部分」意指包括容許其存在及/或相對量及/或位置(舉例而言，於陣列上之位置)被直接或者 間接測定之部分。

適當之可檢測部分為此項技藝中悉知。

舉例而言，該可檢測部分可為螢光及/或發光及/或化學發光部分，其暴露於特定條件時，可被檢測。此類螢光部分可能需要於特定波長及強度暴露於輻射(即光)，引起螢光部分的激發，從而使其於可被檢測之特定波長發射可檢測之螢光。

替代地，該可檢測部分可為能轉化基質(較佳為不可檢測)成為可被視覺化及/或檢測之可檢測產物之酵素。適當酵素之實例於下文有關例如ELISA測定法中更詳細討論。

因此，該可檢測部分可選自下列所成群組：螢光部分；發光部分；化學發光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酵素部分之組群。較佳地，該可檢測部分包含或只包含放射性原子。放射性原子可選自下列所成群組：鎝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、錸-186、錸-188與釔-90。

顯然，欲檢測之製劑(舉例而言，如，測試試樣及/或本文所述之對照試樣中之一或多個生物標記及/或用於檢測所選擇蛋白質之抗體分子)必須具有足夠之適當原子同位素，俾使可檢測部分可易於檢測。

於一替代之較佳具體實例中，該結合部分之可檢測部分為螢光部分。

放射性或其他標誌可以已知方式併入存在本發明方法之試樣及/或本發明結合部分之生物標記中。舉例而言，若結合劑為多肽，則其可被生合成或可經由使用涉及，例如，以氟-19代替氫之適當胺基酸前體之化學胺基酸合成法合成。舉例而言^99mTc、¹²³I、¹⁸⁶Rh、¹⁸⁸Rh與¹¹¹In等標誌，例如，可經由結合部分中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用IODOGEN方法(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)併入1¹²³I。參考文獻("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy",J-F Chatal,CRC Press,1989)詳細敘述其他方法。用於接合其他可檢測部分(例如酵素、螢光、發光、化學發光或放射性部分)於蛋白質之方法為此項技藝中悉知。

熟習此項技藝人士將察知，待測試試樣中之生物標記可用間接幫助測定該蛋白質的存在、量及/或位置之部分予以標識。因此，該部分可構成多成分可檢測部分之一組分。。舉例而言，待測試試樣中之生物標記可用生物素標識，其容許隨後使用融合或以其他方式連結於可檢測標誌之鏈黴抗生物素蛋白進行檢測。

於本發明第一態樣中提供之方法可包含或只包含於步驟(c)中測定表A所界定一或多個生物標記之蛋白質之表現。該方法可包含使用各個結合部分能選擇性地結合編碼表A中所鑑定之一種生物標記之一或多個結合部分測量步驟(c)中一或多個生物標記之表現。該一或多個 結合部分可包含或只包含抗體或其抗原結合片段如單株抗體或其片段。

"抗體"一詞包括任何合成抗體、重組抗體或抗體雜交體，如惟不限於，由免疫球蛋白輕鏈及/或重鏈可變區及/或恒定區之噬菌體顯示所產生之單鏈抗體分子、或熟習此項技藝者已知於免疫分析格式中能結合於抗原之其他免疫活性分子。

本發明亦包括使用類抗體結合劑，例如親和體與適配體。

涉及保留其特異性結合位點之抗體片段之合成技術之評論回顧可於Winter & Milstein(1991)Nature 349,293-299中找到。

此外，或替代地，該第一個結合分子之一或多者可為適配體(參見Collett et al.,2005,Methods 37：4-15)。

分子庫例如抗體庫(Clackson et al,1991,Nature 352,624-628；Marks et al,1991,J Mol Biol 222(3)：581-97)、肽庫(Smith,1985,Science 228(4705)：1315-7)、經表現之cDNA庫(Santi et al(2000)J Mol Biol 296(2)：497-508)、抗體框架以外之其他架構例如親和體庫(Gunneriusson et al,1999,Appl Environ Microbiol 65(9)：4134-40)或基於適配體的庫(Kenan et al,1999,Methods Mol Biol 118,217-31)，可使用作為本發明方法中用於選擇對既定模體具特異性之結合分子之來源。

該等分子庫可於原核細胞(Clackson et al,1991,op.cit.；Marks et al,1991,op.cit.)或真核細胞(Kieke et al,1999,Proc Natl Acad Sci USA,96(10)：5651-6)中活體表現或可不涉及細胞於活體外表現(Hanes & Pluckthun,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94(10)：4937-42；He & Taussig,1997,Nucleic Acids Res 25(24)：5132-4；Nemoto et al,1997,FEBS Lett,414(2)：405-8)。

於使用基於蛋白質的庫之情形下，編碼該等潛在結合分子庫之基因常包裝於病毒中，潛在結合分子顯示於病毒表面(C1ackson et al,1991，同上；Marks et al,1991，同上；Smith,1985，同上)。

或許最常使用之顯示系統是於其表面顯示抗體片段之絲狀噬菌體，該等抗體片段表現為噬菌體次要外殼蛋白之融合物(Clackson et al,1991，同上；Marks et al,1991，同上)。然而，其他適當顯示系統包括使用其他病毒(EP 39578)、細菌(Gunneriusson et al,1999，同上；Daugherty et al,1998,Protein Eng 11(9)：825-32；Daugherty et al,1999,Protein Eng 12(7)：613-21)、及酵母(Shusta et al,1999,J Mol Biol 292(5)：949-56)。

另外，已開發出於所謂核糖體顯示系統中利用連接多肽產物於其編碼mRNA(Hanes & Pluckthun,1997，同上；He & Taussig,1997，同上；Nemoto et al,1997，同上)，或替代地連接多肽產物於編碼DNA(參見US Patent No.5,856,090與WO 98/37186)之顯示系統。

抗體之可變重鏈(V_H)與可變輕鏈(V_L)功能區涉及抗原識別，此為由早期蛋白酶消化實驗首先採認之事實。由囓齒動物抗體之"人源化"發現進一步之確認。源自囓齒動物之可變功能區可融合於源自人類之恒定功能區，俾使所得抗體保留囓齒動物親源抗體之抗原特異性(Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851-6855)。

抗原特異性由可變功能區賦予，且無關恒定功能區係由涉及抗體片段細菌表現之實驗得知，該等抗體片段全部含有一或多個可變功能區。此等分子包括類Fab分子(Better et al(1988)Science 240,1041)；Fv分子(Skerra et al(1988)Science 240,1038)；其中V_H與V_L搭檔功能區經由可撓性寡肽(Bird et al(1988)Science 242,423；Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879)與包含單離之V功能區之單一功能區抗體(dAbs)(Ward et al(1989)Nature 341,544)連接之單鏈Fv(ScFv)分子。涉及保留其特異性結合位點之抗體片段之合成等技術之評論回顧可於Winter & Milstein(1991)Nature 349,293-299中找到。

該抗體或抗原結合片段可選自由完整抗體、Fv抗體片段(例如單鏈Fv與雙硫鍵結之Fv)、類Fab片段(例如Fab抗體片段、Fab’片段與F(ab)₂片段)、單變異功能區(例如V_H and V_L功能區)與功能區抗體(dAbs，包括單與雙格式[即Ab-連接子-dAb])所成組群。較佳地，該抗體或抗原結合片段係單鏈Fv(scFv)。

該一或多個結合部分可替代地包含或只包含類抗體結合劑例如親和體或適配體。

"scFv分子"意指其中V_H與V_L搭檔功能區經由可撓性寡肽連接之分子。

使用抗體片段而非全抗體之優勢有幾部分。尺寸較小之片段可導致增進之藥理性質，例如較佳之固體組織穿透。全抗體之效應物功能，例如補體結合，被移除。Fab、Fv、ScFv與dAb抗體片段全可於大腸桿菌中表現及分泌，因此容許容易地產生大量該等片段。

全抗體與F(ab')₂片段為"二價"。"二價"意指該等抗體及F(ab')₂片段具有兩個抗原結合部位。對照之下，Fab、Fv、ScFv與dAb片段為單價，只具有一個抗原結合部位。

該等抗體可為單株或多株抗體。適當之單株抗體可利用例如揭示於"Monoclonal Antibodies：A manual of techniques",H Zola(CRC Press,1988)與"Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and applications",J G R Hurrell(CRC Press,1982)之已知技術製備，此二文獻均併入本文以資參考。

當潛在結合分子係選自庫時，通常使用具有確定模體之一或多個選擇肽。提供結構、減少於肽中之可撓性、或容許與結合分子相互作用之帶電、極性或疏水側鏈之胺基酸殘基可用於設計選擇肽模體。舉例而言：(i)脯胺酸可穩定肽結構，因為其側鏈與α碳以及氮 結合；(ii)苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸具有芳族側鏈且具高度疏水性，而亮胺酸與異亮胺酸具有脂族側鏈且亦為疏水性；(iii)離胺酸、精胺酸與組胺酸具有鹼性側鏈且於中性pH帶正電，而天冬胺酸與麩胺酸具有酸性側鏈且於中性pH將帶負電；(iv)天冬醯胺與麩醯胺於中性pH為中性，惟含有可能參與氫鍵之醯胺基；(v)絲胺酸、蘇胺酸與酪胺酸側鏈含有可能參與氫鍵之羥基。

通常，結合分子之選擇可涉及使用陣列技術及系統以分析對應於結合分子類型的點之結合。

一或多個蛋白質結合部分可包含可檢測部分。可檢測部分可為選自由螢光部分、發光部分、化學發光部分、放射性部分與酵素部分所成組群。

於本發明方法之進一步具體實例中，步驟(c)可使用包含能結合於該一或多個蛋白質之第二結合劑之測定法進行，該第二結合劑亦包含可檢測部分。適當之第二結合劑詳述於上文有關第一結合劑中。

因此，待測試試樣中所關注蛋白質可使用第一結合劑先行單離及/或固定，然後可使用第二結合劑測定該生物標記之存在及/或相對量。

於一具體實例中，第二結合劑係抗體或其抗原結合片段；通常為重組抗體或其片段。方便地，該抗 體或其片段係選自由：scFv；Fab；免疫球蛋白分子之結合功能區所成組群。適當之抗體與片段，及其製造方法詳述於上文。

替代地，第二結合劑可為類抗體結合劑，例如親和體或適配體。

替代地，其中待測試試樣中蛋白質之可檢測部分包含或只包含特異性結合對之成員(例如生物素)，第二結合劑可包含或只包含該特異性結合對之互補成員(例如鏈黴抗生物素蛋白)。

使用檢測測定法時，較佳為可檢測部分係選自由螢光部分；發光部分；化學發光部分；放射性部分；與酵素部分所成組群。用於本發明方法之適當可檢測部分之實例敘述於上文。

用於檢測血清或血漿蛋白質之較佳測定法包括酵素連接免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、免疫放射測定法(IRMA)與免疫酵素測定法(IEMA)，包括使用單株及/或多株抗體之夾心式測定法。David等人於美國專利案4,376,110與4,486,530中敘述例示性夾心式測定法，將其併入本文以資參考。於載玻片上之細胞的抗體染色可於細胞學實驗診斷試驗中悉知之方法中使用，為熟習此項技藝者所悉知。

因此，於一具體實例中，該測定法為ELISA(酵素連接免疫吸附法)，其一般涉及使用通常於固相測定法中得到呈色反應產物之酵素。例如辣根過氧化酶與磷酸 酶等酵素已被廣泛使用。擴增磷酸酶反應之方法係使用NADP作為基質以產生NAD，其現在作為第二酵素系之輔酶。得自大腸桿菌之焦磷酸酶提供良好之接合物，因為該酵素不存在於組織中，其穩定且得到良好之反應顏色。亦可使用基於酵素例如螢光素酶之化學發光系。

經常使用與維生素生物素之接合，因為利用其與和其結合之連接酵素之抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之反應具有極大之特異性與親和性而可容易地予以檢測。

於替代具體實例中，用於蛋白質檢測之測定法方便地為螢光測定法。因此，第二結合劑之可檢測部分可為螢光部分，例如Alexa螢光團(例如Alexa-647)。

較佳地，使用陣列進行第一態樣中所述方法之步驟(c)、(g)、(f)及/或(j)。該陣列可為珠粒式陣列(bead-based array)或表面式陣列(surface-based array)。陣列可選自由巨陣列；微陣列；奈米陣列所成組群。

陣列本身為此項技藝中悉知。一般而言，其係由具有隔開(即離散)區域("點")之線性或二維結構形成，各區域具有於固體支撐體表面形成之有限面積。陣列亦可為珠粒結構，其中各珠粒可利用分子代碼或顏色代碼識別，或於連續流中識別。分析亦可於試樣通過一系列點時依序進行，其中各點從溶液吸附諸分子類別。固體支撐體通常為玻璃或聚合物，最常使用之聚合物為纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支 撐體呈管、珠粒、盤、矽晶片、小板塊、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝化纖維素膜、尼龍膜、其他多孔膜、無孔膜(例如塑膠、聚合物、有機玻璃、矽等等)、多個聚合針、或多個微力價孔、或適用於固定蛋白質、多核苷酸及其他適當分子及/或進行免疫分析之任何其他表面。結合方法為此項技藝中悉知，通常由交聯共價結合或物理性吸附蛋白質分子、多核苷酸等至固體支撐體所組成。替代地，可利用經由親和標籤或類似建構親和偶聯該等探針。經由使用悉知技術，例如接觸或非接觸印刷、光罩法或光刻技術，可界定各點之位置。關於評論回顧參見Jenkins,R.E.,Pennington,S.R.(2001,Proteomics,2,13-29)與Lal et al(2002,Drug Discov Today 15；7(18 Suppl)：S143-9)。

一般而言，陣列係微陣列。"微陣列"包括意指具有離散區域密度為至少約100/cm²，較佳為至少約1000/cm²之區域之陣列。微陣列中之區域具有典型之尺寸，例如直徑在約10至250μm之範圍內，且與陣列中之其他區域分開約相同距離。該陣列可替代地為巨陣列或奈米陣列。

一旦已經鑑定及單離適當之結合分子(上文所討論)，熟習技藝人士可使用此項技藝中悉知之分子生物學方法製造陣列。

於更多或替代具體實例中，步驟(c)所測量之一或多個生物標記包含或只包含由人類細胞表現之一或多個同源基因產物。於更多或替代具體實例中，步驟(c)所 測量之一或多個生物標記為蛋白質或多肽。於更多或替代具體實例中，步驟(c)所測量之一或多個生物標記為核酸(例如，DNA、mRNA或cDNA等)。

於更多或替代具體實例中，該方法係於活體外、活體內、離體或電腦模擬中進行。舉例而言，該方法特別可於活體外進行。

於更多或替代具體實例中，該皮膚致敏係過敏反應(例如，細胞介導性過敏反應)。於更多或替代具體實例中，該過敏反應係第四型過敏反應。於更多或替代具體實例中，該過敏反應係過敏性接觸性皮膚炎(ACD)。

'測試劑'意指包括待測定致敏效價及/或敏化狀態之任何化學品實體(或化學品實體混合物)。

"敏化狀態"包括或意指化學品實體(或化學品實體混合物)是否為致敏劑(例如，皮膚致敏劑及/或呼吸道致敏劑)。

"皮膚致敏劑"意指能誘導及觸發哺乳動物第四型延遲性過敏反應之任何製劑。較佳地，該第四型延遲性過敏反應由樹突狀細胞介導。

於一具體實例中，一或多個"皮膚致敏劑"係能於哺乳動物表皮接觸部位誘導及觸發第四型延遲性過敏反應之製劑。

哺乳動物可為任何馴養或農場動物。較佳地，哺乳動物為大鼠、小鼠、天竺鼠、貓、狗、馬或靈長類。最佳地，哺乳動物為人類。如上文所討論，測定致敏 之活體內方法為此項技藝中已知。較佳方法為局部淋巴結測定法(細節參見Basketter,D.A.,et al.,Local lymph node assay-validation,conduct and use in practice.Food Chem Toxicol,2002.40(5)：p.593-8)。另外適當惟較不為所喜之方法為天竺鼠極大化試驗(細節參見Magnusson,B.and A.M.Kligman,The identification of contact allergens by animal assay.The guinea pig maximization test.J Invest Dermatol,1969.52(3)：p.268-76)。

於更多或替代具體實例中，樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群係類樹突狀細胞之族群。於更多或替代具體實例中，該類樹突狀細胞係類骨髓性類樹突狀細胞。於更多或替代具體實例中，該類骨髓性類樹突狀細胞係衍生自類骨髓性樹突狀細胞。於更多或替代具體實例中，衍生自類骨髓性樹突狀細胞之細胞係類骨髓性白血病衍生之細胞。於更多或替代具體實例中，該類骨髓性白血病衍生之細胞係選自由KG-1、THP-1、U-937、HL-60、Monomac-6、AML-193與MUTZ-3所成組群。於更多或替代具體實例中，該類樹突狀細胞為MUTZ-3細胞。MUTZ-3細胞為人類急性骨髓單細胞白血病細胞，其可得自Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),Braunschweig,Germany(www.dsmz.de；DMSZ No.ACC 295)。

"類樹突狀細胞"意指展現對樹突狀細胞具特異性之功能性及表現型特徵例如形態特徵、共刺激分子 與MHC類II分子之表現、內吞巨分子及活化靜止T細胞的能力之非樹突狀細胞。

於一具體實例中，類樹突狀細胞，以細胞介素刺激後，經由CD1d、MHC類I與II呈現抗原及/或誘導特異性T細胞增殖。

於一具體實例中，類樹突狀細胞係CD34⁺樹突狀細胞先驅細胞(progenitors)。視需要地，該等CD34⁺樹突狀細胞先驅細胞，經細胞介素刺激後，可獲得經由CD1d、MHC類I與II呈現抗原之表現型，誘導特異性T細胞增殖，及/或以發炎性介質刺激後，顯示成熟之轉錄及表現型概況(profile)(即與未成熟樹突狀細胞或類Langerhans樹突狀細胞類似之表現型)。

於一具體實例中，樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群係樹突狀細胞之族群。較佳地，該樹突狀細胞為初級樹突狀細胞。較佳地，該樹突狀細胞為類骨髓性樹突狀細胞。

樹突狀細胞可以功能，以表現型及/或以基因表現模式，特別是以細胞表面表現型予以識別。此等細胞之特徵在於其獨特之形態、高量之表面MHC類II表現及呈現抗原於CD4+及/或CD8+T細胞，特別是初始(naïve)T細胞之能力(Steinman et al.(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271)。

樹突狀細胞之細胞表面很獨特，具特徵性之面紗樣突起，其特徵為細胞表面標記CD11c與MHC類 1I之表現。多數樹突狀細胞就包括T細胞、B細胞、單核細胞/巨噬細胞、與顆粒細胞之其他白血球譜系標記而言為陰性。樹突狀細胞之亞族群亦可表現額外的標記包括33D1、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CD1a-d、CD4、CD5、CD8 α、CD9、CD11b、CD24、CD40、CD48、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86、CD91、CD117、CD123(IL3Ra)、CD134、CD137、CD150、CD153、CD162、CXCR1、CXCR2、CXCR4、DCIR、DC-LAMP、DC-SIGN、DEC205、E-鈣黏蛋白、蘭格素(Langerin)、甘露糖受體、MARCO、TLR2、TLR3 TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、與數個凝集素。

此等細胞表面標記之表現模式可隨著樹突狀細胞成熟度、其組織起源、及/或其物種起源而變化。未成熟之樹突狀細胞表現低量之MHC類II，惟能內吞抗原性蛋白質並將其處理以於與MHC類II分子之複合物中呈現。活化之樹突狀細胞表現高量之MHC類II、ICAM-1與CD86，並能刺激素樸同種異體(naïve allogeneic)T細胞之增殖，例如，於混合之白血球反應(MLR)中。

功能上而言，樹突狀細胞或類樹突狀細胞可利用測定抗原呈現之任何方便測定法予以鑑定。此類測定法可包括利用呈現測試抗原，隨後測定T細胞增殖、IL-2之釋放等，測試刺激抗原引發及/或素樸T細胞之能力。

檢測及/或測量蛋白質及/或核酸之濃度之方法為熟習此項技藝者悉知，參見例如Sambrook and Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press。

檢測及/或測量蛋白質之較佳方法包括西方墨點法、西北方墨點法、免疫吸附測定法(ELISA)、抗體微陣列、組織微陣列(TMA)、免疫沉澱法、原位雜交及其他免疫組織化學技術、放射性免疫測定法(RIA)、免疫放射測定法(IRMA)與免疫酵素測定法(IEMA)，包括使用單株及/或多株抗體之夾心式測定法。David等人於美國專利案4,376,110與4,486,530中敘述例示性夾心式測定法，將其併入本文以資參考。於載玻片上之細胞的抗體染色可於細胞學實驗診斷試驗中悉知之方法中使用，為熟習此項技藝者所悉知。

一般而言，ELISA涉及使用通常於固相測定法中得到呈色反應產物之酵素。例如辣根過氧化酶與磷酸酶等酵素已被廣泛使用。擴增磷酸酶反應之方法係使用NADP作為基質以產生NAD其現在作為第二酵素系之輔酶。得自大腸桿菌之焦磷酸酶提供良好之接合物，因為該酵素不存在於組織中，其穩定且得到良好之反應顏色。亦可使用基於酵素例如螢光素酶之化學發光系。

經常使用與維生素生物素之接合，因為利用其與和其結合之連接酵素之抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之反應具有極大特異性與親和性而可容易地予以檢測。

本發明之第二態樣提供根據本發明第一態樣之方法中使用之陣列，該陣列包含如本發明第一態樣所界定之一或多個結合部分。

於更多或替代具體實例中，該陣列包含用於如本發明第一態樣所界定之各個生物標記之一或多個結合部分。

於更多或替代具體實例中，該一或多個結合部分被固定。

於更多或替代具體實例中，該陣列為珠粒陣列。於更多或替代具體實例中，該陣列為表面陣列。

於更多或替代具體實例中，該陣列係選自由巨陣列；微陣列；奈米陣列所成組群。

本發明之第二態樣之陣列可包含一或多個，較佳為二或更多個結合部分，其中該結合部分各自能選擇性地結合於如第一態樣所界定之生物標記。因此，該陣列可包含或只包含與如第一態樣所界定之生物標記之任何特定選擇互相關聯之生物標記特異性結合部分之特定選擇。

本發明之第三態樣提供使用如本發明第一態樣所界定之二或更多個生物標記測定製劑之皮膚致敏效價之用途。

於更多或替代具體實例中，提供使用選自表A所界定組群之生物標記測定製劑之皮膚致敏效價之用途；較佳為其中該生物標記係選自表A(i)或表A(ii)所界定之組群。

於更多或替代具體實例中，提供使用對選自表A所界定組群之生物標記具特異性之結合部分測定製劑之皮膚致敏效價之用途；較佳為其中該結合部分對選自 表A(i)及/或表A(ii)所界定組群之生物標記具特異性。

本發明之第四態樣提供用於根據本發明第一態樣之方法之分析套組，其包含：(a)根據本發明第二態樣之陣列；及(b)進行如本發明第一態樣所界定方法之操作指南(視需要)。

於更多或替代具體實例中，該分析套組進一步包含如本發明第一態樣所界定之一或多個對照劑。

本發明之第五態樣提供治療或預防病患之第一型過敏反應(例如ACD)之方法，該方法包括下述步驟：(a)提供病患接觸或接觸過(exposed)之一或多個測試劑；(b)使用本發明方法測定步驟(a)所提供之一或多個測試劑是否為皮膚致敏劑及/或其致敏劑效價；及(c)於該一或多個測試劑被鑑定為皮膚致敏劑及/或具特定效價之皮膚致敏劑時，減少或防止病患與該一或多個測試劑接觸及/或針對該過敏症狀提供適當之治療。

較佳地，病患接觸或接觸過之該一或多個測試劑係該病患目前一個月接觸至少一次，例如，每兩週至少一次，每週至少一次、或每天至少一次之製劑。

該等過敏症狀之治療可包括，例如，局部類固醇。

較佳地，該治療方法與本發明第一態樣，及本文所述一或多個具體實例中所述之方法一致。

本發明之第六態樣提供用於操作本發明方 法之電腦程式，例如，用於說明步驟(c)(及隨後之表現測量步驟)之表現數據，從而確定一或多個測試劑是否為呼吸道致敏劑及/或該一或多個測試劑之致敏劑效價。該電腦程式可為程序化之SVM。其可錄製於熟習此項技藝人士已知之適當電腦可讀載體。適當之電腦可讀載體可包括光碟(包括CD-ROMs、DVDs、Blue Rays等)、軟磁碟、閃存驅動器、ROM或硬碟驅動器。該電腦程式可安裝於適用於執行該電腦程式之電腦上。

熟習技藝人士將察知，所有不相衝突之具體實例可組合使用。因此，得自本發明一態樣之具體實例可同樣應用於本發明之第二態樣。

茲將參照下述圖式敘述體現本發明特定態樣之較佳非限制性實施例：第1圖係使用GARD測定法之二元預測圖。(A)基準化學品(實線)與37個新化學品(虛線)之ROC評估。(B)GARD SVM決策值(DV)與CLP效價相關(37個化學品，11個1A、19個1B、7個無類別)。增加效價與增加DV相關。

第2圖係使用52個變數將用以開發隨機森林模型的訓練數據集視覺化圖。(A)根據化學品之CLP分類著色之具不同生物複製本訓練集之PCA圖。(B)分層簇集試樣複製本訓練集之熱點圖，其中灰度表示相對之基因表現強度。

第3圖係使用52個變數將測試數據集視覺化圖。(A)根據CLP分類著色之具不同生物複製本測試集之PCA圖。 該PCA建立於不影響PCA繪製之訓練集與測試集上。(B)分層簇集試樣測試集之熱點圖，其中灰度表示相對之基因表現強度。

第4圖係CLP效價模型含有與人類效價有關之資訊圖。(A)根據人類效價著色之以可用之人類效價分類之複製本訓練集與測試集試樣之PCA圖。PCA係根據該52個隨機森林變數作為輸入資料及建立於訓練集上。(B)只將測試集視覺化之PCA圖。

第5圖係根據得自三個CLP類別之多群組比較之883個最顯著基因輸入之途徑分析圖。

第6圖係利用途徑分析鑑定之各個蛋白質反應性群組之獨特途徑圖。

第7圖係三個不同蛋白質反應性類別之共同基因(A)與生物途徑(B)之文氏(Venn)圖[82]。MA=麥可接受體(Michael acceptors)；SB=希夫鹼(Schiff base)形成；SN=雙分子親核置換/芳香族親核置換。

第8圖係基因體過敏原快速檢測(GARD)-工作流程圖。SVM模型根據代表GARD預測識別特徵之200個基因之基因表現數據，計算衍生自經化學處理細胞之各個RNA試樣之決策值。然後將該等決策值用於化學品之二元分類[3]。

第9圖係GARD決策值與人類效價類別間之關係圖。化學品已根據人類效價類別進行分類，並可於Y軸上找到衍生自三重複之各個平均SVM決策值。x軸上之數字係指該化學品於表8中之編號。

第10圖係根據197個試樣之O-PLS模型之散佈圖(Y=人類效價與致敏劑/非致敏劑)。人類效價類別如Basketter et al.(2014)中所述，類別1表示最高效價，類別6表示非致敏劑。

第11圖係O-PLS模型之排列圖。原始模型擬合度與預測和數個模型之比較，其中Y-觀測值之順序已被隨機排列。此圖強烈地指示該模型非偶然獲得。

第12圖係觀測Y值對預測Y值作圖。RMSEE(估計值之均方根誤差)表示觀測值對模型之擬合誤差。RMSEcv為類似措施，惟係使用交叉驗證進行估計。

第13圖係PCA圖與熱點圖。根據輸入利用隨機森林模型鑑定之18個變數之訓練集(A)、訓練集與測試集(B)及單僅測試集(C)之PCA。各個球體代表根據CLP分類著色之化學品(黃色=1A、粉紅色=1B、藍色=無類別)。根據該18個經鑑定生物標記的表現之訓練集熱點圖(D)與測試集熱點圖(E)。

實施例A 引言

皮膚過敏與相關疾病，例如接觸性過敏，影響一般人口之大部分，估計在工業化國家之盛行率為15-20%[1]。過敏性接觸性皮膚炎(ACD)，一種第四型之過敏反應，常見於特定職業團體中，例如經常暴露於化學品或涉及潮濕工 作者[2]。然而，化妝品與家庭用品也會含有許多皮膚致敏化學品。經由不同之法律架構，歐洲聯盟已禁止化妝品及其成分之動物試驗[3]，並於REACH之範圍內強制要求測試>6萬個化學品[4]。必須提供化學品皮膚致敏能力以及效價兩者之資訊，以符合分類與次分類之法規要求。業界急迫需要符合此等要求之無動物替代試驗。

導致皮膚過敏並因此引致ACD之分子事件之特徵可能在於由化學品觸發之一些連續關鍵事件(KE)，並已摘述於如OECD[5]所述之不良結果途徑(AOP)中。肇始事件(KE1)係界定為皮膚致敏化學品在獲得進入更深皮膚層後之共價蛋白質修飾。接著KE2表示活化角質細胞時之發炎性反應。KE3相當於樹突狀細胞之活化，其又導致T細胞(KE4)之活化與增殖。當再暴露於致敏劑時，可能觸發ACD之形成，其為不良結果之特徵在於由特異性Th1與CD8+ T細胞所誘發之皮膚病變。雖然在AOP中之KE已被充分敘述，惟仍缺乏對個別關鍵事件基礎生物學詳細機轉之了解[5]。

鼠類局部淋巴結測定法(LLNA)[6]多年來一直是皮膚致敏測試之優先替代方案，因其能提供包括皮膚致敏劑效價資訊之危害鑑定以及特性分析兩項數據。然而，其特徵在於具有特定限制，例如對載體效應之易感性以及偽陽性結果問題[7]。如新近之評論回顧，已開發數種非動物預測方法，以減少用於化學品測試之動物實驗，包括整合得自不同危害鑑定測試平台數據之計算方法[8]。 OECD已認可皮膚過敏之三種測試方法作為測試規範：ARE-NRF2螢光素酶法(KeratinoSens^TM)分析[9、10]、直接胜肽反應性分析(DPRA)[11]與人類細胞株活化測試(h-ClAT)[12]。除了危害鑑定之外，皮膚致敏劑效價之資訊為強制的，俾使得以定量風險評估及界定暴露限制。關於預測皮膚致敏劑效價有幾個方法已發表，最近並於[8]中評論回顧，例如靶向KE2之分析(表皮等效物致敏劑效價分析[13]、SENS-IS[14])及模仿KE3之U-SENS分析[15]。再者，於電腦模擬模式中，已見敘述經常結合得自數種活體外方法之資訊；例如QSAR[16]、類神經網路(artificial neural network)[17]、機率模式及包括貝氏模式(Bayesian model)之整合測試策略(ITS)法[18至21]。

用於評估化學品皮膚致敏能力之基因體過敏原迅速檢測(GARD)替代分析係根據相較於非致敏對照劑，於人類類骨髓性細胞株中，由致敏化學品所誘發差異表現之整體轉錄體分析。將所產生由200個轉錄本組成之生物標記識別特徵(signature)，GARD預測識別特徵(GPS)，輸入已以一組參考化學品訓練過之支持向量機(SVM)模型[22]。轉錄上之變化可能與致敏期間樹突狀細胞之成熟與活化(KE3)相關聯。於根據26種未標示(blinded)化學品之內部研究中，分析之準確度估計為89%[23]。先前之觀察指出，GARD分析能提供亦用於效價評估之相關資訊。首先，傳訊途徑視化學反應性基團子集之效價而進行差異性調控[24]。其次，申請人等觀察到，相較於較弱之致敏劑， 較強效之致敏劑通常被賦予更高之GARD SVM決策值(decision values)，表示識別特徵內具有貢獻效價資訊之基因(未經發表之觀察)。然而，GARD預測識別特徵中之資訊仍不足以將化學品如分類、標示和包裝(CLP)規章[25]所述，完全分層為明確界定之效價群組。

該CLP規章係根據Globally Harmonised System[25]，並使用三種類別之化學品分類：非致敏劑之無類別、弱致敏劑之類別1B與強致敏劑之類別1A。鑑於上述觀察，以該等CLP類別為目標，據推測GARD可進一步開發成為用於預測化學皮膚致敏劑效價之方法。由於已建立之GARD Support Vector Machine模型無法應用於多類問題，申請人等乃使用根據隨機森林模型之另一方法[26]。隨機森林係基於決策樹之方法，相當適合微陣列數據[27]。其經由隨機分階抽樣(靴拔重複抽樣)將數據集內部地及重複地分成訓練集與測試集。於測試集中之試樣稱為袋外(out-of-bag)試樣，佔全部數據集之約三分之一，係用以估計袋外(OOB)誤差，即分類誤差。

於此，申請人等根據使用隨機森林模型之監督式機器學習，提出根據CLP類別之預測皮膚致敏劑效價之新穎方法。首先，將得自包含68個獨特化學品與2個載體對照試樣之訓練集之整體基因表現數據輸入隨機森林模型中。該隨機森林模型隨後與反向變數消除演算法結合。該演算法首先將得自微陣列各個基因之變數重要性排序，然後重複地擬合新的隨機森林，同時從先前重複中移 除最不重要之變數。使用此策略，申請人等能在預測得自訓練集之袋外試樣時，鑑定出具有最小OOB誤差率之一組52個基因。以含有先前未見於該模型之18個化學品之獨立測試集挑戰此52個基因之預測性能。此測試集中之化學品可以78%之整體準確度被預測。除了該預測模型之外，申請人等亦經由途徑分析展示分析細胞全部轉錄體之通用性，以進一步增進在細胞層次上對皮膚致敏效價機轉之了解，證實不同化學反應性類別誘發不同傳訊途徑之假說。

材料與方法 細胞與流式細胞測量術

本研究中所使用之類骨髓性細胞株係得自MUTZ-3(DSMZ，Braunschweig，Germany)且如[22,28]中所述方式維持。於每個實驗之前，利用流式細胞測量術進行細胞之表現型對照分析，以確認細胞之未成熟狀態。使用下述單株抗體：全部接合FITC之CD1a(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)、CD34、CD86、HLA-DR(BD Biosciences,San Jose,USA)；全部接合PE之CD14(DakoCytomation)、CD54、CD80(BD Biosciences)。以接合FITC與PE之小鼠IgG1(BD Biosciences)作為同型對照，並以碘化丙啶作為非活細胞之標記(BD Biosciences)。於獨立實驗中，使三批細胞暴露24小時，然後利用流式細胞測量術評估存活率與CD86表現。在配備FACS Diva軟體之FACSCanto II儀器上分析所有FACS試樣以取得數據。取得10,000個事件並於FCS Express V4(De Novo Software,Los Angeles,CA)中進行進一步分析。使萃取RNA用細胞溶解於TRIzol®(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)中，並貯存於-20℃中直到進一步使用時。

化學品與刺激作用

所有化學品均以高純度品質購自Sigma Aldrich(Saint Louis,USA)或由歐盟化妝品協會(Cosmetics Europe)提供，並根據供應商之建議貯存。如先前所述進行細胞之化學刺激[28]。簡言之，GARD輸入濃度係由該等化學品之溶解度與細胞毒性特徵界定。500μM為非細胞毒性與可溶解性化學品之靶定終止濃度，且為具有限溶解度(於培養液中低於500μM)化學品之最高可能濃度。細胞毒性化學品係以靶定細胞相對存活率為90%之濃度使用。大部分化學品係於二甲亞碸(DMSO)或高壓滅菌MilliQ水中，從1000x預稀釋使用。作為載體之DMSO濃度不超過0.1%。本研究中包含作為載體對照劑之DMSO與MilliQ試樣，因此屬於非致敏劑試樣組。

RNA萃取、cDNA與陣列雜交

根據廠商指示從溶解於TRIzol®中之細胞單離RNA。使用建議套組與對照，按照Affymetrix(Affymetrix,Cleveland,USA)實驗流程合成經標識之有意義DNA。使cDNA與Human Gene 1.0 ST陣列(Affymetrix)雜交，並依供應商之建 議進一步處理及掃描。

二元分類

使用得自GPS之SCAN常態化[29、30]表現數據作為變數輸入學習演算法[22]中，以先前根據SVM建立之模型進行表1中概述之37個化學品成為致敏劑類或非致敏劑類之二元分類。模型建構之前，經由測試化學品對訓練集陣列表現值之定標(scaling)，排除訓練集與測試化學品間潛在之批次效應。經由計算訓練集之DMSO載體對照試樣中各個基因之平均表現值與測試化學品起源批次之DMSO試樣中相同基因平均表現值之比率，產生定標係數。然後將各個基因之定標係數乘以測試化學品中對應基因之基因表現值。如先前[22、31]所述進行SVM預測。簡言之，根據線性核函數(linear kernel)之SVM模型係於鑑定GPS期間，針對得自所用原始訓練集之參考化學品刺激進行訓練[22]。隨後應用該經訓練之模型，以賦予各個測試化學品SVM決策值(SVM DV)。使用所有測試化學品得到之SVM DV建構接收者操作特徵(ROC)曲線，並將所得曲線下面積(AUC)作為分類測量[32]。於R統計環境中，使用附加之套裝軟體e1071[33]與ROCR[34]進行SVM模擬與ROC曲線形象化。於評估該模型之最終預測性能之前，如[31]中所述，針對表2中基準試樣分類期間所得最大預測性能之截止值(cut-off)，校準測試化學品每一個別重複之SVM DV。接著使用經校準之SVM DV進行最終分類，若該等重複之中間輸出值大 於0，則測試化學品被歸類於致敏劑。使用庫珀(Cooper)統計學估計準確度、靈敏度與特異性[35]。進行非參數雙試樣魏克森氏檢定(Two Sample Wilcoxon test)，以確定CLP類別1A、1B與無類別間之SVM DV分佈是否顯著不同。

數據處理與統計分析

為了建立隨機森林模型，乃界定68個化學品與2個載體對照試樣為訓練集，於獨立測試集中包含18個化學品，各CLP類別6個。測試集中之化學品不包含於該模型之建構中。其目的在於得到代表所有三個CLP類別(表3)與不同化學反應性基團之平衡訓練集(表4)。測試集之大部分化學品(18個中之14個)源自最新之實驗活動(表1)，其包括先前未使用GARD分析研究之37個化學品。於訓練集，大約三分之一試樣(68個中之23個)係得自此最新數據集。載體試樣為所有項目之一部分，因此呈現較高之重複數。

將新的微陣列數據與歷史數據[22、23]合併並進行品質調控。四個陣列由於品質不良被移除；然而，無化學品呈少於生物二重複(biological duplicates)存在。將陣列數據輸入R統計環境中，並使用SCANfast演算法予以常態化[29、30]。由於需要組合數個實驗活動，乃使用ComBat法[36、37]常態化此數據集，以移除試樣間之批次效應。此時，訓練集的試樣係自測試集分離。為了避免過度擬合，於鑑定預測性生物標記識別特徵以用於擬合分類器參數期間，僅使用所選定訓練集之試樣，並擱置測試集 之試樣，以驗證所鑑定識別特徵與所指定分類器之性能。經由饋送得自訓練集之個別試樣之常態化及經批次校準之轉錄本強度至與R/Bioconductor 3.1.2版本varSelRF套裝軟體[38]之反向消除程序結合之隨機森林模型[26]，鑑定預測性生物標記識別特徵。使用於排列變數重要性之初始森林生長至2000棵，所有其他參數則維持於系統預設值。重複擬合該套裝軟體，於每一重複下降最不重要變數之20%下，評估隨機森林模型。根據OOB誤差率從所有擬合之隨機森林挑選諸變數之最佳執行集，作為得自最小誤差解決方案之一標準誤差範圍內之最小基因數目(即1標準誤原則(1.s.e. rule)。經由使用100個靴拔重複抽樣試樣，利用varSelRF套裝軟體之.632+靴拔重複抽樣法估計預測誤差率，以驗證變數挑選程序，並經由在靴拔重複抽樣試樣中之出現頻率[稱為驗證呼叫頻率(Validation Call Frequencies,VCF)]驗證生物標記識別特徵中個別轉錄本之重要性。根據先前之參數，僅使用訓練集之試樣與生物標記識別特徵中所挑選之轉錄本作為變數輸入，利用在隨機森林之套裝軟體[39]中建造新森林，驗證所鑑定生物標記識別特徵之預測性能。將該模型應用於賦予測試集中每一個別重複試樣之CLP類別，並接受各個化學品之跨越生物複製本刺激之多數決作為預測類別。於Qlucore Omics Explorer(Qlucore AB,Lund,Sweden)中建構熱點圖與主成分分析圖。

途徑分析

使用提供途徑分析工作流程以調查例如基因表現數據之Key Pathway Advisor(KPA)方法[40]版本16.6進行途徑分析。其使差異表現基因與上下游程序二者相關聯，俾使容許生物解析。首先對由測試集與訓練集之SCANfast-與ComBat-常態化之表現值組成，總數308個試樣之經調查之數據集進行變異數過濾，俾使移除具一致性低變異數之變數，直至大約剩下三分之一(10009個變數，σ/σ max=0.1478)。然後施用屬於CLP無類別、1B、與1A試樣之多群組比較(ANOVA)，俾使鑑定經差異性調控之轉錄本。將最顯著之883個基因(偽發現率FDR=10^-9；p=8.53x10^-11)作為輸入資料輸入KPA中(Affymetrix Exon IDs及各自之p值，過度連接性分析)。為了鑑定與蛋白質反應性相關之途徑，乃根據兩群組比較過濾經相同變異數過濾之數據集[t檢定；Toxtree結合類"未結合"非致敏劑(81個試樣)對"Michael接受體"致敏劑(MA，63個試樣)；"未結合"對"希夫鹼形成"(SB，29個試樣)；"未結合"對組合之"雙分子親核性置換/親核性芳香族置換"(SN，25個試樣)]。將得自各個比較之500個最顯著調控變數以及p值與倍數變化(因果推理分析)列表，然後輸入針對各個蛋白質反應性群組之KPA方法中。於比較MA試樣對"未結合"(FDR=3.65x10^-7)時，達到最低之p值，隨後為SB(FDR=2.3x10^-5)與SN(FDR=2.44x10^-5)。

指令檔

下文編列用於常態化及效價預測之指令檔：

指令檔1：建構模型之前用於對抗不同項目間之批次效應：

指令檔2：用於初始效價模型之建構：

結果 37個化學品之二元分類

挑選包含37個悉知特徵化學品(表1)之新數據集，以補充51個化學品之歷史GARD數據，代表化學品之相關選擇、化學反應性類別之平衡、及於消費品上之使用。該等新化學品係根據歐盟化學品管理署(European Chemical Agency)CLP資料庫與文獻[15、41]挑選，並與歐盟化妝品協會(CE)之皮膚耐受性工作小組(Skin Tolerance Task Force)合作，其善意地提供27個化學品。使用GPS與先前根據SVM分類所建立之實驗流程，預測該37個新化學品係致 敏劑類或非致敏劑類。應用SVM模型以賦予每一個別重複試樣SVM DV。於最終分類之前，首先將37個試樣之SVM DV針對為測試化學品之包含於相同試樣批次中之11個基準試樣(表2)進行校準。為了評估二元預測之目的，申請人們於此處決定優先考慮處理可用之人類數據[41]為類別1至4相當於致敏劑及5與6相當於非致敏劑，以代替CLP分類。總結37個化學品之模型預測性能為0.88之AUC ROC，表示良好之判別力，如第1A圖所示(實線為基準化學品；虛線為37個化學品)。根據庫珀統計學估計之靈敏度、特異性與準確度分別為73%、80%與76%。結合先前發表之數據[23]，根據包含總數74個化學品之數據集，估計該等皮膚致敏劑二元分類GARD之最新預測準確度為84%。根據CLP分類，將表1中之化學品分組以及將37個化學品於分類期間所得各個SVM DV值總結如呈現於第1B圖之盒形圖中時，出現效價梯度，因為相較於類別1B中之較弱致敏劑及無類別中之非致敏劑，較強之致敏劑被賦予較高之SVM DV。根據比較SVM DV試樣分佈之非參數雙試樣魏克森氏檢定，此等群組顯著不同(無類別vs 1B，p=2.8^-5；1B vs 1A，p=2.8^-6；無類別vs 1A，p=3.5^-12)。雖然群組間之差異顯著，惟個別化學品間存在若干重疊，表示該資訊不足以將試樣完全分層為明確界定之效價群組。

用於預測CLP類別之隨機森林模型

為了建立用於預測CLP類別之生物標記識別特徵，乃 將包含37個新化學品之數據集與包含51個化學品之歷史數據集合併。總計，該數據集由86個獨特化學品(表4)與兩個載體對照劑組成，與如CLP所述之類別1A與1B及非致敏劑(無類別)(表3)平衡。關於化學品四個CLP分類，根據表4所示資料，基於下述三個原因之一，1B被更改為無類別/非致敏劑：i)與先前GARD項目(苯甲醛、二甲苯)保持一致，ii)於非致敏濃度(DMSO)中被作為載體使用，及iii)於LLNA(十二烷基硫酸鈉)中為被詳述之偽陽性。

根據由包含兩個載體對照劑之70個獨特試樣組成之訓練集，開發用於預測三個CLP類別之隨機森林模型。52個預測變數(表5)被鑑定為適用於CLP分類。由靴拔重複抽樣法衍生之該模型之預測誤差率被估計為0.225，其提供模型性能之指示。為了視覺化用以開發模型之數據集，乃進行主成分分析(PCA)。使用根據全基因體陣列分析經由隨機森林所鑑定之52個變數作為輸入資料，並於訓練集上建立PCA(第2A圖)。第2A圖係基於具有根據CLP類別著色之生物複製本之化學品，且沿著第一主要成分可觀察到從無類別至強致敏劑(1A)之明顯梯度。第2B圖中具階層式叢集變數的訓練集之熱圖說明與各個化學品及CLP類別有關之基因調控。

獨立測試集之預測

經由預測包含18個先前未被模型察覺之化學品之獨立測試集之CLP類別，進一步評估模型性能。根據CLP類 別著色之測試集於PCA作圖(第3A圖)中被視覺化，而不影響根據該52個已鑑定變數之PCA成分。第3B圖以熱圖形式，將常態化測試集中52個基因之調控視覺化。於個別預測複製本並使用多數決進行各個化學品之分類時，18個化學品中有14個被賦予正確之CLP類別(表6，補充表1)，結果整體準確度為78%(表7)。四個錯誤分類之化學品為順丁烯二酸二乙酯、丁基環氧丙基醚、新鈴蘭醛與三聚氯化氰。唯一之偽陰性預測為三聚氯化氰，其於CLP中被分類為1A且於本發明之模型中為無類別，而其餘三個化學品被分類為CLP 1B，惟被預測為1A。於隨後之步驟中，為了證實本發明之挑選訓練集與測試集是公正的且預測模型不完全依賴訓練集之組成，本發明乃建構18個替代隨機森林模型，其中訓練集與測試集中化學品之組成係隨機混洗。針對各個新模型，本發明如上所述重複變數挑選之完整過程。根據可用於各個化學品刺激之重複試樣之數量，各個訓練集與測試集中試樣總數不同，惟各集之化學品數量及其CLP分佈維持不變。替代模型都很重要，且由靴拔重複抽樣程序所得之平均預測誤差率與初始模型同樣為0.22，支撐了所提出模型並非由於訓練集與測試集之偏差選擇而獲得之說法。

CLP效價模型含有與人類效價預測相關之資訊

接著，利用PCA俾使調查該52個變數(表5)如何使用與人類效價類別相關之資訊進行[41]。根據人類效價，將 70個訓練集與18個測試集試樣著色(類別1至6，6=真正非致敏劑，1=最強致敏劑)，並移除無人類效價類別可用之試樣(參見表4)。雖然該模型已被開發以預測CLP效價類別，惟其亦含有如第4A、4B圖所闡明之有關人類效價之資訊。

隨機森林模型變數之識別(Identity)

由隨機森林所鑑定之52個變數(表5)代表屬於不同细胞隔室與不同功能角色之轉錄本。其中五個與GARD預測識別特徵重疊。於靴拔重複抽樣過程中最常選擇並具有最高驗證呼叫頻率之前10個標記中之5個(表5)係組織蛋白簇1之成員，例如HIST1H2AB[42]。組織蛋白高度保守，而且不僅於維持染色質結構，且於基因調控上扮演重要角色[43]。PFAS與PAICS涉及嘌呤生合成[44、45]，TMEM97為膽固醇量之調節劑[46]，根據RNA干擾實驗進一步被敘述涉及於神經膠質瘤細胞模型中之細胞週期調控、細胞移動與侵入[47]。DHCR24係位於內質網(ER)之多功能酵素且催化膽固醇合成中之最終步驟[48]，惟例如在ER壓力下亦擁有神經元細胞所顯現之抗細胞凋亡活性[49]。PLK1，一種激酶，已被證實於反應TLR活化及RNA干擾之結果被磷酸化，表明PLK1傳訊涉及TLR所誘發之炎性反應[50]。PLK1進一步被報導經由抑制TNF誘發週期蛋白(cyclin)D1表現而涉及細胞週期調控，並可降低TNF誘發之NF-κ B活化[51]。許多剩餘之轉錄本為核蛋白質，因此很可能涉 及DNA依賴性過程例如複製、轉錄、剪接與細胞週期調控。於識別特徵中又有數個轉錄本用於編碼已知用於參與免疫反應及/或敏化之蛋白質，例如NQO1，其於對皮膚致敏劑之細胞反應中之角色已被詳細敘述[52]。CD53屬於四旋蛋白(tetraspanin)家族，於例如細胞黏附、移動與傳訊中具有多重功能，已被證實相較於各個健康對照組，與得自異位性濕疹病患之衍生自末梢血液之單核細胞上類似地[54]，於得自異位性皮膚炎病患個體之FcεRI陽性皮膚DC上升高[53]之跨膜蛋白。CD44係由許多細胞類型表現之細胞表面醣蛋白、黏附與玻尿酸受體[55]，並例如經由傳介白血球遷移至發炎組織而涉及炎性反應[56]，此已於過敏性皮膚炎小鼠模型中證實[57]。

由其蛋白質反應性不同之致敏劑誘發之共同與獨特調控途徑

於KPA分析(第5圖)中，經CLP類別間之多群組比較(FDR=10^-9)後，以輸入883個最重要調控基因鑑定之33個關鍵途徑反映出由隨機森林所界定之52個變數之數個功能性群組，例如基因調控、細胞週期調控及代謝。免疫反應相關之途徑，例如"細胞生長、存活、分化與代謝之IL-4誘發之調控劑"及"經由JAK/STAT、p38、JNK與NF-κ B之免疫反應_IL-3傳訊"係50%最顯著被調控者之一。

所述之分析接著聚焦於本數據集之三個最大之化學反應性基團；親核置換(SN)、麥可加成反應 (Michael addition，MA)與希夫鹼(SB)形成。於所包含之化學品中，被標識為"無類別"之大多數化學品未具蛋白質結合性質；然而，出現少數SB形成與SN化學品。於類別1B中，幾乎代表所有蛋白質反應性類型，至於類別1A中，MA化學品則具明顯優勢。

針對各個相關之蛋白質反應性，可鑑定屬於各自蛋白質反應性群組之致敏化學品之獨特途徑，如第6圖所示。該等結果結合得自具有能調控輸入基因表現量之分子，所謂關鍵樞紐之輸入數據之差異性調控基因。彼等不必然需經由基因表現實驗鑑定自身，因其調控可見於其他生物學層次，例如活性變化(例如激酶)或可能是很短暫或低幅度之變化。總共，所有三個反應性群組有173個共同基因(第7A圖)，六個途徑出現在所有三個反應性群組(第7B圖)中："細胞週期：APC於細胞週期調控中之角色"、"細胞週期：SCF複合物在細胞週期調控中之角色"、"發育：顆粒細胞發育之轉錄調控"、"細胞週期：細胞週期(泛用架構)"、"DNA損傷：G1/S檢查點之ATM/ATR調控"、與"雌二醇/ESR1(核)於乳癌中之促有絲分裂作用"。再次，細胞週期途徑具高度代表性。氧化逆境反應被鑑定為僅是針對MA與SB化學品類之關鍵途徑結果之一部分(第6圖)。於MA致敏劑化學品群組中，發現KEAP1與NRF2以及其標靶基因NQO1與HMOX1[52、58]與AHR[59、60]為關鍵樞紐。關於MA化學品類，標靶基因NQO1、HMOX1與CES1[61]甚至出現於該輸入基因層次。於輸入層次上，CES1也出現 於SN化學品類，惟僅NQO1、NRF2與AHR被鑑定為關鍵樞紐。KEAP1未被發現為SB與SN KPA分析中之關鍵樞紐，AHR為所有三個蛋白質反應性群組中所鑑定之唯一關鍵樞紐。除了MA化學品類外之所有反應性群組中，NF-κ B次單元(RelB或p52)被預測為關鍵樞紐。

總之，化學品暴露本身似乎存在共同機轉反應，例如細胞週期與相關之DNA損傷，惟途徑分析結果亦支持如申請人等[24]及其他實驗系中[14,21,62,63]早先觀察到之不同化學品反應性類別誘發不同傳訊途徑之假說。數種途徑與已知和皮膚致敏有關之過程相關聯。

討論

誘發過敏之單位面積皮膚暴露(per exposed skin area)之化學品量顯著不同[41]；因此，皮膚致敏劑效價資訊對於準確風險評估極為重要。替代測試方法之開發人員依賴人類臨床數據俾使達到對人類過敏之高預測性，然而，此類型數據相當缺乏且大多數可用數據係得自LLNA[64]。儘管動物模式反映出全身性疾病例如皮膚過敏之複雜性，惟迄今活體外數據已顯示出良好之相關性，其表現甚至優於動物模式，特別是在與ITS結合時[65]。再者，替代之測試系統可能提供使用全動物測試無法提供之機轉洞察力[66]。

於此，使用根據樹突狀細胞(DC)模型與轉錄剖析之CLP系統呈現預測皮膚致敏劑效價之方法。CLP類 別係憑經驗確定及隨意界定之類別，其不代表不同化學品之歧異度、其分子特徵與負責其致敏特性或其欠缺等機制。然而，其為分類與標識化學品之目前法規所需。因此，申請人等調查先前未以標準GARD分析法測試之37種附加之化學品，俾使此等新數據與歷史數據集結合。於根據所建立GARD模型之此等新化學品之二元分類中，4個被錯誤分類致敏化學品，即苯胺、苯佐卡因、檸檬烯與丁基環氧丙基醚，接近由基準試樣所界定之截止值。其中3個屬於人類效價類別4，顯示為了轉換常與效價相關之SVM值為準確之分類，模型截止值至為關鍵。連同歷史預測，GARD仍顯示二元分類84%之高整體準確度。

申請人等接著使用新數據與歷史數據以為各個CLP類別開發隨機森林模型，其展示無類別96%、類別1A 79%及類別1B 75%之平衡準確度[67](根據多數決，以複製本為基礎之性能參見表7)。丁基環氧丙基醚、順丁烯二酸二乙酯、三聚氯化氰與新鈴蘭醛錯誤分類；唯一偽陰性預測係無類別，而非三聚氯化氰之1A。然而，三聚氯化氰與水放熱反應形成氯化氫與可能之其他反應產物。由於此水解反應，可能已於DMSO(含水)中發生，測定中存在之三聚氯化氰與反應產物量未知。此化學品可能落在GARD系平台測定之適用性範圍外。然而，於品質管制或其他預建模分析中並無移除此等試樣之動機。順丁烯二酸二乙酯與新鈴蘭醛被CLP分類為1B，惟以本發明之模型則為1A，如Basketter et al.[41]所述，似乎更擬合其人類效價 類別之類別2。第四個被錯誤分類之化學品丁基環氧丙基醚為人類效價類別3。顯然，預測1B，即弱致敏劑，似為最具挑戰性之部分。又於LLNA中，弱致敏劑之效價預測較強致敏劑具更多變化[8、68、69]。再者，慮及LLNA EC3濃度之範圍與摘述於類別1B中化學品相關聯之人類效價類別二者，1B係相當異質之群組。

U-SENS^TM測定法，從前之MUSST，使用另一類骨髓性細胞株，U937，與CD86測量，以區別致敏劑與非致敏劑。當其作者等將CD86與細胞毒性數據及特定截止值量結合以預測CLP類別時，據報導為82% Cat.1A(41/50)與73% Cat.1B/無類別(85/116)[15]等正確預測。然而，目前仍不清楚無類別與1B間更具挑戰性之區別將會如何。Cottrez et al.[70]最近發表研究報告，其中報導其替代分析SENS-IS，3D重建表皮系模型，用於預測皮膚致敏劑效價表現非常好；然而，彼等並非針對CLP類別。從第4圖判斷，僅根據為了預測CLP類別而界定之52個可變輸入，本發明之模型似亦含有與人類效價分類相關之資訊。一旦更多化學品接受人類效價分類，應可能順利地開發根據GARD平台之人類效價模型。

KPA途徑分析鑑定所呈現數據集之生物相關事件，因為經調控之數個途徑於皮膚過敏中具已知角色，例如細胞介素傳訊與氧化逆境反應(第5至6圖)。雖然DC並非活體內蛋白質修飾之主要標靶，但申請人等假設，不同蛋白質反應性類別有差別地影響DC轉錄體。蛋 白質反應性為以特定限制界定其皮膚致敏能力與效價之化學品最重要特徵之一[63]。經由比較由反應性群組MA、SB、與SN誘發之最顯著調控基因，可如揭示檢測出蛋白質反應性之特異性模式。有趣的是，除了MA化學品類之外，NF-κ B次單元為所有反應性群組之預測關鍵樞紐，可能反映此類型化學品於NF-κ B傳訊上所述之抑制效應[71]。雖然若干途徑似不適合本場合，例如“雌二醇/ESR1(核)於乳癌中之促有絲分裂作用”，仔細觀察調控分子顯示，彼等途徑必定亦與其他途徑相關。於此情形下，涉及例如p21、c-myc、E2F1、SGOL2(守護蛋白2)、與CAD(胺甲醯膦酸合成酶)，其中最前面者為已知之細胞週期調控因子/轉錄因子[72]，於染色體分離發揮作用(SGOL2)[73]。另一方面，CAD，於嘧啶核苷酸生合成中之速率限制酵素，最近亦涉及與細胞傳訊途徑合作[74]，似抑制人類腸上皮細胞中之細菌感測器NOD2(核苷酸結合寡聚化功能區2)之抗細菌功能[75]。此等例子可說明，本發明之轉錄體數據值得進一步注意及更詳細分析，使用不同生物資訊學工具及最終，功能性分析，之此分析類型可能有助於闡明潛在生物過程與疾病之機制。

如上所述，賦予弱或中間效價化學品正確之效價類別似是更為普遍之問題。Benigni et al.[76]提出數據顯示，即使實驗性之活體內系統通常與人類數據有良好相關，惟對中間效價之致敏劑則表現較差。彼等進一步爭論，蛋白質修飾步驟為整個致敏過程之速率限制步驟且靶 向其他AOP事件之活體外測試不增加大量資訊。另一方面，以模型胜肽利用動力學剖析測定之MA致敏劑之速率常數與於LLNA中之其效價間只存在微弱關係[71]。此被敘述為經由抑制隨反應性增加之NF-κ B傳訊而與MA化學品之抗發炎效應相關。然而，慮及皮膚致敏AOP中之關鍵事件，致敏過程就其本身而論可被理解為連續體，因而其特徵不僅在於孤立事件。當然，實際上該過程必須從穿透皮膚之化學品開始。於此場合應注意的是，化學品有效穿透角質層之能力對於其皮膚致敏能力與效價極為重要之概念最近已被證明錯誤[77]。再者，利用由於例如潮濕工作與小傷口之皮膚屏障功能受損，實際上可大幅促進接近下皮層。有趣的是，許多強致敏劑具有刺激性質，其與細胞毒性相互關聯，細胞毒性反而似有助於致敏劑效價[18]，其亦反映於本發明之數據集(數據未顯示)。細胞毒性亦與化學品之蛋白質反應性有關連：具有強烈半胱胺酸反應性之化學品通常具有細胞毒性，因而可能干擾極其重要之酵素功能[18、78]。同時，刺激效應會產生危險訊息，例如胞外ATP或玻尿酸降解產物[79、80]，其可用於活化DC，因此引發初始T細胞。此外，於過敏性致敏上確實發揮作用之例如已存在之發炎及與其他物質共同暴露等其他因素，可能難以於任何測試系統中施行。由於活體外分析尚需要面對成本效益及容易實行之要求，活體外可實現的有明顯之局限性，惟迄今為止測試之表現非常令人鼓舞[76]。儘管蛋白質反應性可能非常重要，惟細胞系系統應 能在胜肽反應性之上重複特定附加事件。由於皮膚致敏之更多機轉細節被揭露，替代分析性能最有可能進一步增進，將得以更容易識別適用性範圍以及陷阱。

總之，本發明已鑑定包含52個轉錄本之預測性生物標記識別特徵，用於如現行法規所要求，將皮膚致敏化合物分類為CLP群組。於以18個獨立測試化合物進行挑戰時，該分析提供效價預測值78%之準確結果。進一步正確鑑定11/12致敏劑，指示其相當保守，即避免偽陰性預測。由於所提出之生物標記識別特徵係針對效價預測最適化，且不僅用於二元危害分類，本發明建議針對其模型在用於準確效價預測之整合測試策略中之可能應用，類似[18]所提示。此外，該等結果有效地說明該GARD配置之靈活性與通用性。測量細胞之完整轉錄體提供進行基於作用方式之研究以鑑定致敏途徑之機會，惟亦鑑定預測生物標記識別特徵，申請人等先前亦已將其顯示於二元皮膚致敏預測及呼吸性致敏。因此，申請人等在此提出靶向CLP群組之效價模型概念之初始證據，其隨著更多試樣被分析及更準確人類參考數據之出現而可被修飾及增進。

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實施例1 引言

根據先前之研究，申請人等推測GARD分析能預測皮膚致敏劑效價。為了開發效價預測模型，採取兩種並行方法。一種利用申請人等所建立之支持向量機(SVM)進行訓練以提供二元分類[1至3]。另一種方法係根據對潛在結構(O-PLS)線性迴歸模型(Simca,Umetrics,Sweden)之正交部分最小平方投影。O-PLS[5]係有關主成分分析之投影法，因此非常適用於如全基因體RNA微陣列數據(>29,000個轉錄本)情形下之具有比觀察值(或試樣)更多變數之矩陣。其為PLS法之修飾(Wold,1975)，經設計將矩陣X中之結構化變異性分為預測性(與Y相關)與正交資訊(與Y無關)，加上殘差變異。如此可增進潛在變數(原始變數之線性組合)之可解讀性。

結果

第9圖說明一組34個化學品與對照組之GARD SVM決策值與人類效價類別間之關係。該SVM模型已開發用於二元分類(致敏劑對非致敏劑)。

申請人等使用Simca軟體調查了多變量方法中之數個模型。人類效價[6]係根據將部分化學上非常不同之物質結合成一種效價類別之可利用人類數據之化學品分類，其中類別1表示最高效價及類別6表示真正非致敏劑。

於此，申請人等提出O-PLS模型，其經設計以預測兩種Y，即人類效價與致敏劑/非致敏劑。第10圖中之散佈圖說明致敏劑與非致敏劑之分離，及沿著第二軸將致敏劑分組成為高效價簇與低效價簇。

於交叉驗證(Q2cum)後，模型可解釋之總變異分率為0.478，被視為係可接受/良好之數值。各個原始模型之擬合度與預測值與具有經排列(permutated)之Y觀察值之數個模型之擬合間之比較，強力地指示該原始模型有效。Y_觀察值對Y_預測值繪製於第12圖。

討論

於本發明之分析中，看到其微陣列數據與人類效價間之清晰關係。進一步之模式開發正在進行中，其性能被預期將隨著測試化學品之數量與類型而增進。申請人等亦將研究多變量分析法作為特徵篩選工具，其最終可導致與致 敏劑效價相關機制之新見解，並提供具高準確度以增進化學品人類效價之預測方法。

實施例1參考文獻

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實施例2 引言

根據先前之研究，申請人等推測GARD分析能預測皮膚致敏劑之效價。為了開發效價預測模型，採取兩種並行方法。一種利用申請人等建立之支持向量機(SVM)訓練以 提供二元分類[1至3]，並如第9圖中所說明，顯示一組34個化學品與對照組之GARD SVM決策值與人類效價類別間之相關性。該SVM模型已被開發用於二元分類(致敏劑對非致敏劑)。

另一種方法係根據隨機森林(RF)建模，一種基於決策樹之方法，非常適於具有比觀察值更多變數之數據集。即使於變數吵雜(noisy)(不需預篩選)且恢復變數重要性時，亦能產生良好之預測性能[5]。

結果

關於化學品之致敏效價，歐盟化學品管理署(ECHA)根據有關化學品物質與混合物之分類、標示和包裝(CLP)之規章(EC)No 1272/2008提出分類建議，只包括：1A(強致敏劑)、1B(弱致敏劑)與無類別(非致敏劑)[7]。於此，申請人等提出一種RF模型，建立在得自使用R/Bioconductor版本3.1.2中之隨機森林varSelRF套裝軟體[6]之訓練數據中複製本之轉錄本強度之算術平均值，以所提供之.632+靴拔重複抽樣法估計錯誤率。其亦可直接從複製本之轉錄本強度建立。該模型係使用見述於表9中之訓練集訓練(70個物質)，然後以表10中之測試集挑戰(18個物質)。模型性能之總結呈現於表11。第13圖包含所述隨機森林模型之主成分分析與熱點圖結果。經鑑定之效價生物標記之列表呈現於表12。

討論

申請人等於本發明分析中，觀察到本發明微陣列數據與包含人類效價與CLP二者之效價資訊間之清晰關係。使用多變量分析法作為特徵篩選工具，獲得與致敏劑效價相關機制之新見解。再者，其賦予以高準確度預測化學品致敏劑效價之能力。

實施例2參考文獻

7.Johansson H et al. A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics. 2011.

8.Johansson H et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro 2013.

9.Johansson H et al. GARD in-house validation-A proof of concept. Toxicological Sciences 2014.

10.Basketter et al. Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency. Dermatitis 2014

11.Díaz-Uriarte R, Alvarez de Andrés S. Gene selection and classification of microarray data using random forest. BMC Bioinformatics. 2006.

12.Diaz-Uriarte R. GeneSrF and varSelRF: a web-based tool and R package for gene selection and classification using random forest. BMC Bioinformatics 2007

13.https://echa.europa.eu/documents/10162/13562/clp_en.pdf.

表

由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (64)

1. 一種用於測定製劑之皮膚致敏效價之方法，該方法包含或由下述步驟組成：(a)提供樹突狀細胞之族群或類樹突狀細胞之族群；(b)使步驟(a)提供之細胞暴露於測試劑；(c)於步驟(b)之細胞中，測量選自表A中所界定組群之二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)所測量之二或更多個生物標記之表現，表示步驟(b)之該測試劑之皮膚致敏效價。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(c)所測量之一或多個生物標記係選自表A(i)及/或表A(ii)所界定之組群。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(i)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(i)中列舉之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個生物標記之表現。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(i)中列舉之所有生物標記之表現。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(ii)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(ii)中列舉之2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個生物標記之表現。
6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(ii)中列舉之所有生物標記之表現。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(iii)中列舉之一或多個生物標記，例如，表A(iii)中列舉之1、2、3、4、5、6、或7個生物標記之表現。
8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A(iii)中列舉之所有生物標記之表現。
9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A中列舉之三個或三個以上生物標記，例如，表A中列舉之4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、或52個生物標記之表現。
10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表A中列舉之所有生物標記之表現。
11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含或只包含測量表B中列舉之一或多個生 物標記之表現。
12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之方法，其中該測試劑係已知，或被懷疑，能誘發皮膚敏化。
13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述之方法，其中經由該方法所測定之皮膚致敏效價係根據歐盟分類、標示與包裝(CLP)規章進行分類，即類別1A(強)、1B(弱)、或無類別(非致敏劑)。
14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法，其中經由該方法測定之皮膚致敏效價係根據見述於B asketter et al.,2014,‘Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency,’Dermatitis,25(1)：11-21中之系統進行分類，即類別1(最強致敏劑)、2、3、4、5、或6(真正非致敏劑)。
15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之方法，其中該皮膚致敏係過敏反應。
16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該過敏反應係細胞介導性過敏反應。
17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該過敏反應係第四型過敏反應。
18. 如申請專利範圍第15至17項中任一項所述之方法，其中該過敏反應係過敏性接觸性皮膚炎(ACD)。
19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之方法，其中步驟(c)包含測量一或多個生物標記之核酸分子之表 現。
20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該核酸分子係cDNA分子或mRNA分子。
21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該核酸分子係mRNA分子。
22. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該核酸分子係cDNA分子。
23. 如申請專利範圍第19至22項中任一項所述之方法，其中步驟(c)中之一或多個生物標記表現之測量係使用選自由南方雜交、北方雜交、聚合酶連鎖反應(PCR)、反轉錄酶PCR(RT-PCR)、定量即時PCR(qRT-PCR)、奈米陣列、微陣列、巨陣列、自動放射攝影術與原位雜交所成組群之方法進行。
24. 如申請專利範圍第19至24項中任一項所述之方法，其中步驟(c)中之一或多個生物標記之表現係使用DNA微陣列測量。
25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之方法，其中測量步驟(c)中之一或多個生物標記表現，係使用一或多個結合部分進行，各個結合部分能選擇性地結合編碼表A中鑑定之一種生物標記之核酸分子。
26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該一或多個結合部分各自包含或只包含核酸分子。
27. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該一或多個結合部分各自包含或只包含DNA、RNA、PNA、LNA、 GNA、TNA或PMO。
28. 如申請專利範圍第26或27項所述之方法，其中該一或多個結合部分各自包含或只包含DNA。
29. 如申請專利範圍第25至28項中任一項所述之方法，其中該一或多個結合部分之長度為5至100個核苷酸。
30. 如申請專利範圍第25至28項中任一項所述之方法，其中該一或多個結合部分之長度為15至35個核苷酸。
31. 如申請專利範圍第25至30項中任一項所述之方法，其中該結合部分包含可檢測部分。
32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中該可檢測部分係選自由螢光部分、發光部分、化學發光部分、放射性部分(例如放射性原子)、或酵素部分所成組群。
33. 如申請專利範圍第32項所述之方法，其中該可檢測部分包含或只包含放射性原子組成。
34. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該放射性原子係選自由鎝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、錸-186、錸-188與釔-90所成組群。
35. 如申請專利範圍第32項所述之方法，其中該結合部分之可檢測部分為螢光部分。
36. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述之方法，其中步驟(b)包含或只包含測量步驟(c)中所界定一或多個生物標記之蛋白質之表現。
37. 如申請專利範圍第36項所述之方法，其中步驟(c)中之 一或多個生物標記表現之測量，係使用一或多個結合部分進行，各個結合部分能選擇性地結合一種表A中所鑑定之生物標記。
38. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該一或多個結合部分包含或只包含抗體或其抗原結合片段。
39. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該抗體或其片段係單株抗體或其片段。
40. 如申請專利範圍第38或39項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段係選自由完整抗體、Fv片段(例如，單鏈Fv與雙硫鍵結之Fv)、類Fab片段[例如，Fab片段、Fab’片段與F(ab)₂片段]、單變異功能區(例如V_H與V_L功能區)與功能區抗體[dAbs，包括單與雙格式(即dAb-連接子-dAb)]所成組群。
41. 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中該抗體或抗原結合片段係單鏈Fv(scFv)。
42. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該一或多個結合部分包含或只包含類抗體結合劑例如親和體或適配體。
43. 如申請專利範圍第37至42項中任一項所述之方法，其中該一或多個結合部分包含可檢測部分。
44. 如申請專利範圍第43項所述之方法，其中該可檢測部分係選自由螢光部分、發光部分、化學發光部分、放射性部分與酵素部分所成組群。
45. 如申請專利範圍第1至44項中任一項所述之方法，其 中步驟(c)係使用陣列進行。
46. 如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該陣列係珠粒陣列。
47. 如申請專利範圍第46項所述之方法，其中該陣列係表面陣列。
48. 如申請專利範圍第46至47項中任一項所述之方法，其中該陣列係選自由巨陣列、微陣列、奈米陣列所成組群。
49. 如申請專利範圍第1至48項中任一項所述之方法，其中該方法係於活體外、活體內、離體或電腦模擬中進行。
50. 如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該方法係於活體外進行。
51. 如申請專利範圍第1至50項中任一項所述之方法，其中該二或更多個生物標記之表現係在暴露於測試劑之前與之後，於步驟(a)提供之細胞中測量，及其中該二或更多個生物標記在暴露於測試劑前後表現之差異表示步驟(b)測試劑之皮膚致敏效價。
52. 如申請專利範圍第1至51項中任一項所述之方法，其進一步包含以下步驟：(d)提供另外的樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群；(e)使步驟(d)提供之細胞暴露於：i.不會使人類皮膚敏化之一或多個陰性對照劑；及/或ii.使人類皮膚敏化之一或多個陽性對照劑； 及/或iii.一或多個載體對照劑；(f)除了暴露於該一或多個對照劑製劑之外，於如步驟(a)所提供細胞之相同時間與相同條件下進行培育；(g)於步驟(e)之細胞中，測量步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)中測量之該二或更多個生物標記與步驟(g)中測量之該二或更多個生物標記之間表現之差異表示該測試劑之皮膚致敏效價。
53. 如申請專利範圍第1至52項中任一項所述之方法，其進一步包含以下步驟：(h)提供另外的樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群；(i)將步驟(h)提供之細胞暴露於預定效價(predetermined)之皮膚致敏劑；(j)於步驟(h)細胞中，測量步驟(c)所測量之該二或更多個生物標記之表現；其中步驟(c)中測量之該二或更多個生物標記與步驟(j)中測量之該二或更多個生物標記之間表現上之對應表示該測試劑之皮膚致敏效價。
54. 如申請專利範圍第1至53項中任一項所述之方法，其進一步包含以下步驟：(k)鑑定該測試劑之皮膚致敏效價。
55. 如申請專利範圍第1至54項中任一項所述之方法，其中該樹突狀細胞族群或類樹突狀細胞族群係類樹突狀細胞之族群。
56. 如申請專利範圍第55項所述之方法，其中該類樹突狀細胞係例如選自由KG-1、THP-1、U-937、HL-60、Monomac-6、AML-193與MUTZ-3所成組群者之類骨髓性白血病衍生細胞。
57. 如申請專利範圍第1至56項中任一項所述之方法，其中該方法之預測準確度，以ROC AUC值測定時，為至少0.50，舉例而言至少0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98或至少0.99。
58. 如申請專利範圍第57項所述之方法，其中該方法之預測準確度，以ROC AUC值測定時，為至少0.80，較佳為至少0.85。
59. 一種用於如申請專利範圍第1至58項中任一項所述方法中之陣列，該陣列包含如申請專利範圍第25至35項與第37至48項中任一項所界定之一或多個結合部分。
60. 如申請專利範圍第59項所述之陣列，其中該陣列包含用於申請專利範圍第1至59項中任一項中所界定之各個生物標記之一或多個結合部分。
61. 一種選自表A所界定組群之生物標記的用途，其係用於測定製劑之皮膚致敏效價；較佳為其中該生物標記係選自表A(i)或表A(ii)所界定之組群。
62. 一種對選自表A所界定組群之生物標記具特異性之結合部分的用途，其係用於測定製劑之皮膚致敏效價；較佳為其中該結合部分對選自表A(i)或表A(ii)所界定組群之生物標記具特異性。
63. 一種分析套組，其係用於如申請專利範圍第1至58項中任一項所述之方法，該分析套組包含：(a)如申請專利範圍第59至60項中任一項所述之陣列；(b)(視需要之)一或多個對照劑；及(c)(視需要之)進行如申請專利範圍第1至58項中任一項所界定方法之操作指南。
64. 一種實質上如本文所述之方法、用途、陣列或套組。