KR20180128422A - 분석 방법 및 그 방법에 사용하기 위한 어레이 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시험 제제의 피부 감작제 효능을 동정하기 위한 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한 어레이, 및 분석 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 시험 제제의 피부 감작제 효능을 동정하기 위한 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한 어레이 및 분석 키트에 관한 것이다.
알레르기 접촉성 피부염(ACD)은 인구의 상당 부분에 영향을 미치는 염증성 피부 질환이다. 이것은 통상적으로 화학적 합텐에 대한 면역학적 반응에 의해 유발되어 이는 사회적으로 상당한 경제적 부담을 초래한다. 화학물질을 감작화시키기 위한 현재 시험은 동물 실험에 의존한다. 예를 들어, 제약 및 화장품 산업에서 화학물질의 등록 및 사용에 관한 법안은 감작화의 예측을 위한 대안적인 인간 세포-기반 검정을 개발하기 위한 상당한 연구 노력을 자극하였다. 목표는 동물 실험을 보다 높은 예측력을 나타내는 시험관내 시험으로 대체하는 것이다.
ACD는 습진 및 재발성 에피소드의 소양증을 특징으로 한다[Akhavan, A. and S.R. Cohen, The relationship be트윈 atopic dermatitis and contact dermatitis. Clin Dermatol, 2003. 21(2): p. 158-62]. 상기 질환은 유럽에서 유병율이 7.2% 내지 18.6%인 인구의 상당 부분에 영향을 미치고[Mortz, C.G., et al., Prevalence of atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, and hand and contact dermatitis in adolescents. The Odense Adolescence Cohort Study on Atopic Diseases and Dermatitis. Br J Dermatol, 2001. 144(3): p. 523-32; and Nielsen, N.H., et al., Allergic contact sensitization in an adult Danish population: two cross-sectional surveys eight years apart (the Copenhagen Allergy Study). Acta Derm Venereol, 2001. 81(1): p. 31-4], 발생율은 감작화 화학물질로의 반복적인 노출로 인해 증가하고 있다. ACD는 주로 반응성 T 헬퍼 1(Th1), 및 이전에 노출되고, 면역학적으로 감작화된 개체에서 작은 화학적 합텐과의 접촉 부위에서 CD8+ T 세포를 생성하는 인터페론(IFN)γ에 의해 유발되는 IV형 지연형 과민성 반응이다[Fonacier, L.S ., S.C . Dreskin , and D.Y . Leung , Allergic skin diseases . J Allergy Clin Immunol. 125(2 Suppl 2): p. S138-49]. 상피에서 수지상 세포(DC: dendritic cell)는 자가 분자에 결합된 합텐에 응답하여 T 세포-매개된 면역력을 활성화시킴에 의해 면역 반응을 개시한다.
REACH(화학물질의 등록, 평가, 및 허가) 규제는 대략 30000종의 화학물질을 포함하는 유럽 연합 내 모든 신규 및 기존 화학물질이 위험 효과에 대해 시험되어야할 것을 요구한다[EC 1907/2006, in Regulation (EC) No 1907/2006]. 잠재적 감작제의 동정은 현재 동물 시험을 필요로 하기 때문에, REACH 법안은 시험에 필요한 동물의 수에 큰 영향을 미친다. 추가로, 화장품 지침(76/768/EEC)에 대한 7차 개정은 2013년에 인간 사용을 위한 화장품의 대부분의 성분에 대해 동물 시험을 금지시켰다. 따라서, 화학물질의 감작화 능력의 평가를 위한 실험 동물에 대한 신뢰할 수 있는 시험관내 대안의 개발이 시급하다.
본원 발명자들은 게놈 알레르겐 신속 검출, GARD(Genomic Allergen Rapid Detection)로 불리우는, 감작화 화학물질의 예측을 위한 인간 세포-기반 검정을 개발하였다(도 8). 상세한 설명에 대해, 문헌(WO 2012/056236 및 Johansson H et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro 2013)을 참조하고 이는 본원에 참조로 포함된다. 수지상-유사 세포 (dendritic-like cell)(예를 들어, MUTZ-3 세포주)의 전사체를 분석함에 의해, 본원 발명자는 잠재적 식별능을 갖는 게놈 바이오마커 시그니처를 동정하였다 [Johansson H et al. A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell - based in vitro alternative to animal tests . BMC Genomics. 2011; Johansson H et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro 2013; and Johansson H et al. GARD in-house validation - A proof of concept. Toxicological Sciences 2014]. 추가로, 신호 전달 경로가 상이한 화학적 반응성 그룹과 연루되는 방식은, 감작화 효능과 관련되어 있는 것으로 보인다[Albrekt et al. Skin sensitizers differentially regulate signaling pathways in MUTZ-3 cells in relation to their individual potency. BMC Pharmacology and Toxicology 2014].
그러나, 지금까지, 비-동물 대체는 피부 감작화 화학물질의 효능을 동정하는데 필요하며, 대신, 바람직한 검정은 마우스 국소 림프절 시험법(LLNA: Local Lymph Node Assay) [Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8]에 이어서, 기니아 피그 최대화 시험(GPMT: Guinea pig maximization test)이다[Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76].
이들 동물 모델에 대한 시험관내 대안은 바람직하게 개선된 신뢰도, 효능 예측의 정확도 및 중요하게는 인간 반응성과의 상호관계를 나타낸다.
이전의 연구에 기반하여, GARD 검정은 피부 감작제 동정을 위해 가치 있는 것으로서 입증되었다. 본 발명에 이르러, 다변량 모델을 사용한 인간 전사체의 광범위한 평가는 놀랍게도 개선된 시험관내 효능 모델이 또한 가능한 것을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(a)
수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단을 제공하는 단계;
(b)
단계 (a)에서 제공된 상기 세포를 시험 제제에 노출시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 상기 세포에서 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 포함하거나 이것으로 이루어지고;
여기서, 단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 제제의 상기 피부 감작화 효능을 나타낸다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커들은 표 A(i) 및/또는 표 A(ⅱ)에 정의된 그룹으로부터 선택된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(i)에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
상기 방법은 HIST1H2BM의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H4B의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H1D의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PAICS의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나 이들이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H4D의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AL///HIST1H2BN의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PLK1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PHGDH의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM7의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CD53의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 KIFC1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 WEE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TMPO의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM4의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PSRC1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 RNF149의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM6의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM5의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FANCA의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 A(ⅱ)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ⅱ)에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A(ⅱ)에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
상기 방법은 CAD의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MRT04의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TOE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CDC20의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PM20D2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 L0C344887의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 UNG의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CDKN1A의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2BF의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H1B의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 전사체 ID 7896697의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 JADE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 KIAA0125의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CHRNA5의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CHAF1B///MORC3의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 SEL1L3의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 SSRP1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FOXM1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 LMNB1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AK의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CENPA의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 NCAPH의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2BB의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 ATP6V1B2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TRAP1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 A(ⅲ)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ⅲ)에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나, 이것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A(ⅲ)에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다.
상기 방법은 PFAS의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TMEM97의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 DHCR24의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FTH1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 H1ST1H2AE의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 NQO1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CD44의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 A에 열거된 3개 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A에 열거된 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 A에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
상기 방법은 HIST1H2BM의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H4B의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H1D의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PAICS의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H4D의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AL///HIST1H2BN의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PLK1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PHGDH의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM7의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CD53의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 KIFC1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 WEE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TMPO의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM4의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PSRC1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 RNF149의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM6의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MCM5의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FANCA의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
상기 방법은 CAD의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 MRT04의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TOE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CDC20의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PM20D2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 L0C344887의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 UNG의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CDKN1A의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2BF의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H1B의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 전사체 ID 7896697의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 JADE1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 KIAA0125의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CHRNA5의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CHAF1B///MORC3의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 SEL1L3의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 SSRP1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FOXM1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 LMNB1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AK의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CENPA의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 NCAPH의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2BB의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 ATP6V1B2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TRAP1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
상기 방법은 PFAS의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 TMEM97의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 DHCR24의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 FTH1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 H1ST1H2AE의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 NQ01의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 CD44의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
상기 방법은 하나 이상의 MCM7, PFAS, HIST1H2AE의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 B에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 B에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단계 (c)는 표 B에 열거된 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)는 표 B에 열거된 적어도 2개의 바이오마커, 예를 들어, 표 B에 열거된 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8, ≥9, ≥10, ≥11, ≥12, ≥13, ≥14, ≥15, ≥16, ≥17, 또는 18개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
대안적인 또는 추가의 구현예에서, 단계 (c)는 표 B(i)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 B(i)에 열거된 ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8, ≥9, ≥10, ≥11, ≥12, ≥13, ≥14, ≥15, 또는 16개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다.
대안적인 또는 추가의 구현예에서, 단계 (c)는 표 B(ⅱ)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 B(ⅱ)에 열거된 2개의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다.
상기 방법은 CCNA2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 전사체 ID 8151252의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PIGW의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 SNRPD1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 ARHGAP19///ARHGAP19-SLIT1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AB의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 LRCH2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 PKP4///PKP4의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 RAVER2///RAVER2의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 DUT///DUT의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 AURKA의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 전사체 ID 8055309의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 NDC1의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 KIF22///KIF22의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 OK/SW-CL.58의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 전사체 ID 7994343의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HIST1H2AB///HIST1H2AE의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다. 상기 방법은 HMGB3의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것이 배제될 수 있다.
"발현"이란, 바이오마커의 존재, 수준 및/또는 양을 의미한다.
바이오마커란, 임의의 생물학적 분자, 또는 이의 성분 또는 단편을 포함하고, 이의 측정은 감작제 효능을 결정하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 표 A와 관련하여, 바이오마커는 핵산 분자, 예를 들어, mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 대안적으로, 바이오마커는 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 또는 탄수화물 모이어티(moiety), 또는 이의 항원성 성분 또는 단편일 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 시험 제제는 이미 피부의 감작화를 유도할 수 있는 것으로 이미 공지되어 있거나, 유도할 수 있을 것으로 의심된다.
예를 들어, 시험 제제는 당업계에 이미 공지된 방법, 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[WO 2012/056236 and/or Johansson H et al. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro 2013]에 기재된 방법을 사용함에 의해 피부의 감작화를 유도할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 시험 제제의 피부 감작제 효능 및 피부 감작제/비-감작제 상태를 동정하기 위한 것이다(즉, 시험 제제가 감작제인지의 여부를 동정하고 피부 감작제로서 이의 효능을 동정하기 위한 것이다). 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 상기 방법은 시험 제제가 문헌 [WO 2012/056236 및/또는 Johansson H et al.]에 기재된 방법을 사용하여 감작제인지 여부를 동정하는 것을 포함한다.
"피부 감작화 효능"이란 제제의 피부 감작화 능력의 강도를 포함하거나 의미한다. 예를 들어, 제제의 감작화 능력의 상대적 효능 또는 강도는 최저 효능에서부터 최고 효능까지, 또는 그 반대로 시험 제제 그룹의 순서를 유도할 수 있고/있거나, 이것은 하나 이상의 공지된 규제 또는 시스템에 따른 이들의 카테고리화를 유도할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법에 의해 결정된 피부 감작화 효능은 유럽 분류, 표지화 및 패키징(CLP) 규정(EC) 1272/2008 (http://echa.europa. eu/clp-2015)에 따라 카테고리화된다. 상기 시스템은 UN의 시스템(United Nations' Globally Harmonised System(GHS)), 및 2015년 6월부터 물질 및 혼합물 둘 다의 분류 및 표지화에 적용하기 위한 법안을 기준으로 한다. 이것은 회사가 이들을 시장에 시판하기 전 이들의 상품을 적절히 분류하고, 표지화시키고 패키징할 것을 요구한다. 이것은 이하의 카테고리를 제공한다: 1A(강한), 1B(약한), 또는 no cat (cat 부재)(감작제 부재).
예를 들어, 상기 방법은 이하의 것들을 제공할 수 있다:
(i) 효능 카테고리 1A의 하나 이상의 제제;
(ⅱ) 효능 카테고리 1B의 하나 이상의 제제; 및/또는
(ⅲ) 효능 카테고리 카테고리 부재의 하나 이상의 제제.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법에 의해 결정된 피부 감작화 효능은 문헌[Basketter et al., 2014, 'Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency,' Dermatitis, 25(1):11-21]에 기재된 시스템에 따라 카테고리화되는데, 즉, 카테고리 1(가장 강한 감작제), 2, 3, 4, 5, 또는 6(진정한 비-감작제)(예를 들어, 표 4, 도 4)이다.
예를 들어, 상기 방법은 이하의 것들을 제공할 수 있다:
(i) 효능 카테고리 1의 하나 이상의 제제;
(ⅱ) 효능 카테고리 2의 하나 이상의 제제;
(ⅲ) 효능 카테고리 3의 하나 이상의 제제;
(ⅳ) 효능 카테고리 4의 하나 이상의 제제;
(v) 효능 카테고리 5의 하나 이상의 제제; 및/또는
(ⅵ) 효능 카테고리 6의 하나 이상의 제제(예를 들어, 현재의 표 8 및/또는 Basketter et al., 2014 등을 참조한다).
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 피부 감작화 효능은 국소 림프절 시험범(LLNA) 분류, 기니아 피그 최대화 시험(GPMT) 또는 어떠한 관찰된 효과 수준 부재(NOEL)에 따라 카테고리화된다.
LLNA의 상세한 기재 사항에 대해, 문헌[Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice. Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 기니아 피그 최대화 시험의 상세한 기재 사항에 대해, 문헌(Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76)을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 피부 감작제 효능과 관련하여 관찰된-효과 수준 부재(NOEL) 시험의 상세한 기재 사항에 대하여, 문헌 (Basketter et al., 2005, 'Evaluation of the skin sensitizing potency of chemicals by using the existing methods and considerations of relevance for elicitation' Contact Dermatitis, 52(1):39-43; and Griem, P., et al., 2003, 'Proposal for a risk assessment methodology for skin sensitization based on sensitization potency data.' Regul. Toxicol. Pharmacol., 38:269-290)을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. NOEL과 효능 수준 간의 상호관계에 대해 또한 문헌(WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Skin sensitization in chemical risk assessment. (IPCS harmonization project document: no. 5), ISBN 978 92 4 156360 4 (특히, 26-28 면의 표 1))을 참조하고 이는 본원에 참조로 포함된다. CLP에 대한 상세한 기재 사항에 대하여, 웹사이트(http://echa.europa.eu/clp-2015)를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작제로의 노출 전 및 후 단계 (a)에 제공된 세포에서 측정되고, 여기서 상기 시험 제제에 대한 노출 전 및 후 하나 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이가 단계 (b)의 피부 감작제의 효능을 나타낸다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커의 발현은 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작제로의 노출 전 및 후 단계 (a)에 제공된 세포에서 측정되고, 여기서, 단계 (c) 전 및 후에 하나 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이가 단계 (b)의 피부 감작제의 효능을 나타낸다.
'발현에서의 차이'란, 제1 샘플(예를 들어, 시험 제제 샘플) 중에서의 존재 및 양이 제2 샘플(예를 들어, 대조군 제제 샘플)과 상이한 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 존재 및/또는 양은 비교 샘플에 대한 것의 40% 이하, 예를 들어, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 또는 0%이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 상기 시험 제제로의 노출 전 및 후 단계 (a)에 제공된 세포에서 측정되고 여기서, 상기 시험 제제에 대한 노출 전 및 후 하나 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이가 단계 (b)의 시험 제제의 피부 감작화의 효능을 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에 제공된 세포는 음성 대조군 및 시험 결과 둘 다를 제공할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커는 상기 시험 제제로의 노출 전 및 후 단계 (a)에 제공된 세포에서 측정되고 여기서, 상기 단계 (c) 전 및 후 하나 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이가 단계 (b)의 시험 제제의 피부 감작화의 효능을 나타낸다. 따라서, 단계 (a)에 제공된 세포는 음성 대조군 및 시험 결과 둘 다를 제공할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(d)
수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 추가의 집단을 제공하는 단계;
(e) 단계 (d)에 제공된 세포를 하기에 노출시키는 단계로서:
i. 인간 피부를 감작화시키지 않는 하나 이상의 음성 대조군 제제; 및/또는
ⅱ.
인간 피부를 감작화시키는 하나 이상의 양성 대조군 제제; 및/또는
ⅲ. 하나 이상의 비히클 대조군에 노출시키는 단계;
(f) 하나 이상의 대조군 제제에 대한 제제로 노출시키는 것 외에 동일한 시간 동안, 단계 (a)에서 제공된 세포와 동일한 조건하에서 항온처리하는 단계;
(g) 단계 (e)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하고;
여기서, 단계 (c)에 측정된 2개 이상의 바이오마커들과 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이는 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타낸다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 하기의 추가의 단계를 포함한다:
(d)
수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 추가의 집단을 제공하는 단계;
(e) 단계 (d)에 제공된 세포를 하기에 노출시키는 단계로서:
i.
인간 피부를 감작화시키지 않는 하나 이상의 음성 대조군 제제;
ⅱ. 비히클 대조군에 노출시키는 단계; 또는
ⅲ. 동일한 시간 및 미리 결정된 피부 감작화 효능을 제제로 노출시키는 것 외에 단계 (a)에서 제공된 세포와 동일한 조건하에서 항온처리하는 단계;
(f) 단계 (e)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하고;
여기서, 단계 (c)에 측정된 2개 이상의 바이오마커들과 단계 (e)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 차이는 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타낸다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 비히클 대조군은 DMSO를 포함한다.
'발현에서의 차이'란, 제1 샘플(예를 들어, 시험 제제 샘플) 중에서의 존재 및 양이 제2 샘플(예를 들어, 대조군 제제 샘플)의 것과 상이한 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 존재 및/또는 양은 비교 샘플에 대한 것의 40% 이하, 예를 들어, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 또는 0%이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(h)
수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 추가의 집단을 제공하는 단계;
(i) 단계 (h)에서 제공된 상기 세포를 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작화 제제에 노출시키는 단계;
(j) 단계 (i)의 세포에서 단계 (c)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함하고;
여기서, 단계 (c)에 측정된 2개 이상의 바이오마커들과 단계 (j)에서 측정된 2개 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 상응성은 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타낸다.
'발현에서의 상응성'이란 제1 샘플(예를 들어, 시험 제제 샘플) 중에서의 존재 및 양이 제2 샘플(예를 들어, 대조군 샘플) 중에서의 존재 및/또는 양과 유사하거나 동일한 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 존재 및/또는 양은 대조군 샘플에 대한 것의 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(k)
시험 제제의 피부 감작화 효능을 동정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 동정은 당업계에 공지된 임의의 적합한 통계학적 방법 또는 기계 학습 알고리즘, 예를 들어 무작위 포레스트(RF), 서포트 벡터 기계(SVM), 원칙적 성분 분석(PCA), 통상의 최소 제곱법(OLS), 부분적 최소 제곱법 회귀(PLS), 직교 부분 최소 제곱법 회귀(O-PLS) 및 다른 다변량 통계학적 분석(예를 들어, 백워드 단계적 논리 회귀 모델)을 사용하여 수행될 수 있다. 다변량 통계학적 분석의 검토를 위해, 문헌 (예를 들어, Schervish, Mark J. (November 1987). "A Review of Multivariate Analysis". Statistical Science 2 (4): 396-413)을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 바람직하게는, (실시예 A에서 상세히 기재된 바와 같이) 무작위 포레스트 모델을 사용한다.
본 발명의 방법의 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 감작화 효능은 적어도 0.45의 ROC AUC로, 예를 들어, 적어도, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99, 또는 1.00의 ROC AUC로 결정된다. 바람직하게, 피부 감작화 효능은 적어도 0.80, 보다 바람직하게 적어도 0.85, 더욱 바람직하게는 적어도 0.88의 ROC AUC로 결정된다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 정확도, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 정확도를 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 민감성, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 민감성을 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 60%의 특이성, 예를 들어, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 특이성을 갖는다.
"정확도"란, 방법의 올바른 결과의 비율을 의미하고, "민감성"이란 양성으로서 정확히 분류되는 모든 양성 화학물질의 비율을 의미하고 "특이성"이란 음성으로서 정확히 분류되는 모든 음성 화학물질의 비율을 의미한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 방법은:
(l) 단계 (h) 내지 (j)(존재하는 경우 단계 (k))의 하나 이상의 반복인 추가의 단계를 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (a) 내지 (c) [및 존재하는 경우, 단계 (d)-(f/g)]의 각각의 반복이 [즉, 본래의 단계 (a) 내지 (c) {및 존재하는 경우, 단계 (d)-(f/g)}]와 동시에 수행된다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (a) 내지 (c) [및 존재하는 경우, 단계 (d)-(f/g)]의 각각의 반복이 연속적으로 수행된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (j)는 이하에 대한 하나 이상의 반복을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서:
(I) 하나 이상의 다른 반복을 위해 단계 (i)에 제공된 바와 같은 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 동일한 제제; 또는
(ⅱ) 하나 이상의 다른 반복을 위해 단계 (i)에 제공된 바와 같은 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 상이한 제제.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (i)에 제공된 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 상이한 제제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
(I) 단계 (i)에 제공된 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 상이한 제제와 동일한 감작화 효능을 갖는 제제; 또는
(ⅱ) 단계 (i)에 제공된 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 상이한 제제와 상이한 감작화 효능을 갖는 제제.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (a) 내지 (c) (및 존재하는 경우, 단계 (f/g))는 적어도 1회, 예를 들어, ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8, ≥9, ≥10, ≥11, ≥12, ≥13, ≥14, ≥15, ≥16, ≥17, ≥18, ≥19, ≥20, ≥21, ≥22, ≥23, ≥24, ≥25, ≥26, ≥27, ≥28, ≥29, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥150, ≥200, ≥250, ≥300, ≥350, ≥400, ≥450, ≥500, ≥600, ≥700, ≥800, ≥900 또는 ≥1000회 반복된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 각각의 단계 또는 반복 단계는 실험적 오류를 제어하기 위해 동일하게 반복, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 측정된 2개 이상의 바이오마커의 발현은 완전한 범위의 피부 감작화 효능에 비교하여 미리 결정된 피부 감작화 효능을 갖는 제제에 대해 측정된다.
'완전한 범위의 피부 감작화 효능'이란, 사용되는 카테고리화 시스템에서 피부 감작제 카테고리의 최고 및 최저 정도의 감작제를 평가하는 것을 포함한다. 바람직하게, 감작제는 사용되는 카테고리화 시스템에서 각각의 감작제 카테고리에서 평가된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작화 제제는 표 2에 정의된 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하거나 이들로 이루어진다. 예를 들어, 상기 방법은 표 2에 정의된 제제 중, ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8, ≥9, ≥10, 또는 11개를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 미리 결정된 효능의 피부 감작화 제제는 표 8, 표 9 및/또는 표 8에 정의된 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 예를 들어, 표 8에서만, 표 9에서만, 표 10에서만, 표 8 및 9, 표 8 및 10, 표 9 및 10, 또는 표 8, 9 및 10에 정의된 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 포함하거나 이들로 이루어진다. 예를 들어, 상기 방법은 표 8, 9 및 10에서 정의된 ≥2, ≥3, ≥4, ≥5, ≥6, ≥7, ≥8, ≥9, ≥10, ≥11, ≥12, ≥13, ≥14, ≥15, ≥16, ≥17, ≥18, ≥19, ≥20, ≥21, ≥22, ≥23, ≥24, ≥25, ≥26, ≥27, ≥28, ≥29, ≥30, ≥31, ≥32, ≥33, ≥34, ≥35, ≥36, ≥37, ≥38, ≥39, ≥40, ≥41, ≥42, ≥43, ≥44, ≥45, ≥46, ≥47, ≥48, ≥49, ≥50, ≥51, ≥52, ≥53, ≥54, ≥55, ≥56, ≥57, ≥58, ≥59, ≥60, ≥61, ≥62, ≥63, ≥64, ≥65, ≥66, ≥67, ≥68, ≥69, ≥70, ≥71, ≥72, ≥73, ≥74, ≥75, ≥76, ≥77, ≥78, ≥79, ≥80, ≥81, ≥82, ≥83, ≥84, ≥85, ≥86, ≥87, ≥88, ≥89, ≥90, ≥91, ≥92, ≥93, ≥94, ≥95, ≥96, ≥97, ≥98, ≥99, ≥100, ≥101, ≥102, ≥103, ≥104, ≥105, ≥106, ≥107, ≥108, ≥109, ≥110, ≥111, ≥112, ≥113, ≥114, ≥115, ≥116, ≥117, ≥118, ≥119, ≥120, ≥121 또는 122개의 대조군 제제를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현에에서, 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작제는 1-부탄올, 4-아미노벤조산, 벤즈알데하이드, 클로로벤젠, 디에틸 프탈레이트, 디메틸 포름아미드, 에틸 바닐린, 글리세롤, 이소프로판올, 락트산, 메틸 살리실레이트, 옥탄산, 프로필렌 글리콜, 페놀, p-하이드록시벤조산, 과망간산칼륨, 살리실산, 소듐 도데실 설페이트, 트윈 80, 황산아연, 2,4-디니트로클로로벤젠, 옥사졸론, 중크롬산칼륨, 카톤 CG(MC/MCI), 포름알데하이드, 2-아미노페놀, 2-니트로-1,4-페닐렌디아민, p-페닐렌디아민, 헥실신남산 알데하이드, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-머캅토벤조티아졸, 글리옥살, 신남알데하이드, 이소유게놀, 에틸렌디아민, 레조르시놀, 신남산 알콜, 유게놀, 페니실린 G, 게라니올 및 DMSO로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어지는다.
바람직한 구현예에서, 단계 (c)는 하나 이상의 바이오마커의 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다. 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자일 수 있다. 바람직하게, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 그러나, 핵산 분자는 cDNA 분자일 수 있다.
하나의 구현예에서, 단계 (c)에서 하나 이상의 바이오마커 발현의 측정은 서던 혼성화, 노던 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자가방사법 및 제자리(in situ) 혼성화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법을 사용하여 수행된다. 바람직하게, 하나 이상의 바이오마커(들)의 발현은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에 측정된 하나 이상의 바이오마커는 어레이(예를 들어, DNA 에레이)를 사용하여 측정된다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커들은 전체 게놈 어레이(예를 들어, 어피메트릭스 인간 유전자 1.0 ST 어레이 또는 어피메트릭스 인간 유전자 2.0 ST 어레이)를 사용하여 측정된다. 대안적인 또는 추가의 구현예에서, 나노스트링 n카운터 시스템이 사용된다 [예를 들어, 완전한 게놈 어레이(예를 들어, 어피메트릭스 인간 유전자 1.0 ST 어레이 또는 어피메트릭스 인간 유전자 2.0 ST 어레이)로부터의 선택을 기준으로 하는 커스텀 나노스트링 n카운터 코드 세트].
상기 방법은 각각 표 A에 동정된 바이오마커 중 하나를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하는 단계 (c)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 핵산 분자를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진다. 바람직하게, 하나 이상의 결합 모이어티 각각은 DNA를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 이들은 15 내지 35개 뉴클레오타이드 길이이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 인간 유전자 1.0 ST 어레이(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)로부터의 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있다. 프로브 동정 번호는 본원에서 표 A에 제공되고, 여기서, 이들은 "전사체 클러스터 ID"로 언급된다.
적합한 결합 제제 (또한 결합 분자 또는 결합 모이어티로도 언급됨)는 이하에서 논의된 바와 같이 소정의 핵산, 단백질 또는 아미노산 모티프에 결합하는 이들의 능력을 기준으로 라이브러리로부터 선택되거나 스크리닝될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함한다.
"검출 가능한 모이어티"란, 이의 존재 및/또는 상대적 양 및/또는 위치(예를 들어, 어레이 상의 위치)가 직간접적으로 결정될 수 있도록 하는 모이어티를 포함한다.
적합한 검출 가능한 모이어티는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 특정 조건에 노출되는 경우 검출될 수 있는 형광성 및/또는 발광성 및/또는 화학발광성 모이어티일 수 있다. 상기 형광성 모이어티는 형광성 모이어티의 여기를 유발하는 특정 파장 및 강도에서 방사선(즉, 빛)에 노출시킴으로써 이것이 검출될 수 있는 특정 파장에서 검출 가능한 형광성을 방출하도록 할 필요가 있을 수 있다.
대안적으로, 검출 가능한 모이어티는 (바람직하게 검출가능하지 않은) 기질을, 가시화될 수 있고/있거나 검출될 수 있는 검출 가능한 산물로 전환시킬 수 있는 효소일 수 있다. 적합한 효소의 예는 예를 들어, ELISA 검정과 관련하여 하기이하에서 보다 상세하게 논의된다.
따라서, 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사능활성 모이어티(예를 들어, 방사능활성 원자); 또는 효소적 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 검출 가능한 모이어티는 방사능활성 원자를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는다. 방사능활성 원자는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
명백하게, (예를 들어, 본원에 기재된 시험 샘플 및/또는 대조군 샘플 중 하나 이상의 바이오마커 및/또는 선택된 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체 분자와 같은) 검출될 제제는 검출 가능한 모이어티가 용이하게 검출될 수 있도록 하기 위해 충분히 적당한 원자 동위원소를 가져야만 한다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티이다.
방사능 또는 다른 표지는 본 발명의 방법의 샘플 중에 존재하는 바이오마커 및/또는 공지된 방식으로 본 발명의 결합 모이어티로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합제가 폴리펩타이드인 경우, 이것은 생합성될 수 있거나, 예를 들어, 수소 대신 플루오르-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh 및 111In와 같은 표지는 예를 들어, 결합 모이어티에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 상기 IODOGEN 방법(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57)을 사용하여 123I을 혼입시킬 수 있다. 문헌("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989)은 상세하게 다른 방법을 기재한다. 다른 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 효소, 형광성, 발광성, 화학발광성 또는 방사능활성 모이어티)를 단백질에 접합시키기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
시험될 샘플(들) 중에 바이오마커들은 상기 단백질의 존재, 양 및/또는 위치를 결정하는 것과 함께 간접적으로 원조하는 모이어티로 표지될 수 있는 것으로 당업자에 의해 인지된다. 따라서, 상기 모이어티는 다중성분 검출 가능한 모이어티의 하나의 성분을 구성할 수 있다. 예를 들어, 시험될 샘플(들) 중 바이오마커들은 비오틴으로 표지될 수 있고, 이는 검출 가능한 표지에 융합되거나 달리 연결된 스트렙타비딘을 사용한 이들의 후속 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 제1 양상에서 제공된 방법은 단계 (c)에서 표 A에 정의된 하나 이상의 바이오마커의 단백질의 발현을 결정하는 것을 포함할 수 있거나, 이것으로 이루어질 수 있다. 상기 방법은 각각 표 A에 동정된 바이오마커 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여, 단계 (c)에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 결합 모이어티는 단일 클론 항체 또는 이의 단편과 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변 및/또는 불변 영역의 파아지-디스플레이에 의해 생성되는 단일쇄 항체 분자, 또는 당업자에게 공지된 면역검정 포맷 중에서 항원과 결합할 수 있는 다른 면역상호작용 분자와 같은, 임의의 합성 항체, 재조합 항체 또는 항체 하이브리드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원 발명은 항체형 결합제, 예를 들어, 어피바디(affibody) 및 압타머 (aptamer)의 사용을 포함한다.
이들의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 포함되는 기술의 일반 검토는 문헌(Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299)에서 찾아야 한다.
추가로, 또는 대안적으로, 제1 결합 분자들 중 하나 이상은 압타머일 수 있다(Collett et al., 2005, Methods 37:4-15).
항체 라이브러리 (Clackson et al, 1991, Nature 352, 624-628; Marks et al, 1991, J Mol Biol 222(3): 581-97), 펩타이드 라이브러리(Smith, 1985, Science 228(4705): 1315-7), 발현된 cDNA 라이브러리(Santi et al (2000) J Mol Biol 296(2): 497-508), 어피바디와 같은 항체 골격과는 다른 스캐폴드에 대한 라이브러리(Gunneriusson et al, 1999, Appl Environ Microbiol 65(9): 4134-40) 또는 압타머를 기반으로 하는 라이브러리(Kenan et al, 1999, Methods Mol Biol 118, 217-31)와 같은 분자 라이브러리가, 소정의 모티프에 특이적인 결합 분자가 본 발명의 방법에 사용하기 위해 선택되는 공급원으로서 사용될 수 있다.
분자 라이브러리는 원핵 세포(Clackson et al, 1991, op. cit.; Marks et al, 1991, op. cit.) 또는 진핵 세포(Kieke et al, 1999, Proc Natl Acad Sci USA, 96(10):5651-6)에서 생체내 발현될 수 있거나, 세포의 관여 없이 시험관내 발현될 수 있다(Hanes & Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94(10):4937-42; He & Taussig, 1997, Nucleic Acids Res 25(24):5132-4; Nemoto et al, 1997, FEBS Lett, 414(2):405-8).
단백질 기반 라이브러리가 사용되는 경우에, 잠재적 결합 분자의 라이브러리를 암호화하는 유전자들은 흔히 바이러스에 패키징되고, 잠재적 결합 분자는 바이러스의 표면에 디스플레이된다(Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra; Smith, 1985, supra).
아마도, 가장 흔하게 사용되는 디스플레이 시스템은 이들의 표면에 항체 단편을 디스플레이하는 필라멘트 박테리오파아지(filamentous bacteriophage)이고, 항체 단편은 박테리오파아지의 소수 코트 단백질에 대한 융합체로부터 발현된다(Clackson et al, 1991, supra; Marks et al, 1991, supra). 그러나, 디스플레이하기 위한 다른 적합한 시스템은 다른 바이러스(EP 39578), 세균(Gunneriusson et al, 1999, supra; Daugherty et al, 1998, Protein Eng 11(9):825-32; Daugherty et al, 1999, Protein Eng 12(7):613-21), 및 효모(Shusta et al, 1999, J Mol Biol 292(5):949-56)를 사용하는 것을 포함한다.
추가로, 폴리펩타이드 산물의 이의 암호화 mRNA로의 연결체(Hanes & Pluckthun, 1997, supra; He & Taussig, 1997, supra; Nemoto et al, 1997, supra), 소위 리보솜 디스플레이 시스템, 또는 폴리펩타이드 산물의 암호화 DNA로의 대안적인 연결체 (문헌참조: 미국 특허 제5,856,090호 및 제WO 98/37186호)를 사용하는 디스플레이 시스템이 개발되었다.
항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 항원 인지에 관여하고, 이는 조기 프로테아제 분해 실험에 의해 처음 인지되는 사실이다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 발견되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은 인간 기원의 불변 도메인에 융합되어, 수득한 항체는 설치류 모 항체의 항원 특이성을 보유할 수 있다 (Morrison et al (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81, 6851-6855).
상기 항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되고 불변 도메인과는 무관하다는 사실이, 하나 이상의 가변 도메인을 모두 함유하는 항체 단편의 세균 발현을 포함하는 실험으로부터 알려져 있다. 이들 분자는 Fab-유사 분자(Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자(Skerra et al (1988) Science 240, 1038); 단일쇄 Fv(ScFv) 분자(여기서 상기 VH 및 VL 파트너 도메인은 유연한 올리고펩타이드를 통해 연결되어 있다)(Bird et al (1988) Science 242 , 423; Huston et al (1988) Proc . Sci . USA 85 , 5879), 및 분리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAbs)(Ward et al (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 이들의 특이적 결합 부위를 보유하는 항체 단편의 합성에 포함되는 기술의 일반 검토는 문헌(Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299)에서 찾아야 한다.
항체 또는 항원-결합 단편은 온전한 항체, Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 및 이황화 결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab’단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 및 이원 포맷을 포함하는 dAbs [즉, dAb-링커-dAb])로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일쇄 Fv(scFv)이다.
하나 이상의 결합 모이어티는 대안적으로 항체-유사 결합제, 예를 들어, 항체 또는 압타머를 대안적으로 포함하거나, 이것으로 이루어질 수 있다.
"scFv 분자"란, VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩타이드를 통해 연결되어 있는 분자를 의미한다.
전체 항체보다는 항체 단편을 사용할 때의 장점은 몇배가 된다. 더 작은 크기의 단편은 고형 조직의 우수한 침투력 향상과 같은 개선된 약리학적 성질을 유도할 수 있다. 보체 결합과 같은, 전체 항체의 이펙터 기능은 제거된다. Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 대장균(E. Coli)에서 발현되고 분비될 수 있어, 대량의 상기 단편이 용이하게 생성될 수 있도록 한다.
전체 항체 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"란, 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 결합 부위를 가짐을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 1가이고 단지 하나의 항원 결합 부위를 갖는다.
항체는 단일 클론 또는 다중 클론일 수 있다. 적합한 단일 클론 항체는 공지된 기술, 예를 들어, 문헌("Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982))에 기재된 것들에 의해 제조될 수 있고, 상기 문헌 둘 다는 본원에 참조로 포함된다.
잠재적 결합 분자가 라이브러리로부터 선택되는 경우, 한정된 모티프를 갖는 하나 이상의 선택자 펩타이드가 일반적으로 사용된다. 펩타이드 또는 결합 분자와의 상호작용을 가능하게 하는, 전하성, 극성 또는 소수성 측쇄에서 유연성을 감소시키는 구조를 제공하는 아미노산 잔기가, 선택자 펩타이드에 대한 모티프의 디자인에 사용될 수 있다. 예를 들어:
(i) 프롤린은 이의 측쇄가 알파 탄소 및 질소 둘 다에 결합함으로서 펩타이드 구조를 안정화시킬 수 있고;
(ⅱ) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판은 방향족 측쇄를 갖고 고도의 소수성인 반면, 류신 및 이소류신은 지방족 측쇄를 가지며 또한 소수성이고;
(ⅲ) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 염기성 측쇄를 갖고 중성 pH에서 양으로 하전될 것인 반면, 아스파르테이트 및 글루타메이트는 산성 측쇄를 갖고 중성 pH에서 음으로 하전될 것이며;
(ⅳ) 아스파라긴 및 글루타민은 중성 pH에서 중성이지만 수소 결합에 관여할 수 있는 아미드 그룹을 함유하고;
(v) 세린, 트레오닌 및 티로신 측쇄는 하이드록실 그룹을 함유하고 이는 수소 결합에 관여할 수 있다.
전형적으로, 결합 분자의 선택은 결합 분자 유형에 상응하는 스팟에 대한 결합을 분석하기 위한 어레이 기술 및 시스템의 사용에 관여할 수 있다.
하나 이상의 단백질-결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티, 발광성 모이어티, 화학발광성 모이어티, 방사능활성 모이어티 및 효소적 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가의 구현예에서, 단계 (c)는 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있는 제2 결합제를 포함하는 검정을 사용하여 수행될 수 있고, 상기 제2 결합제는 또한 검출 가능한 모이어티를 포함한다. 적합한 제2 결합제는 제1 결합제와 관련하여 상기에 상세하게 기재되어 있다.
따라서, 시험될 샘플 중에 목적하는 단백질은 먼저 단리되고/되거나 제1 결합제를 사용하여 고정화될 수 있고, 이후, 상기 바이오마커의 존재 및/또는 상대적 양은 제2 결합제를 사용하여 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 제2 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 전형적으로 재조합 항체 또는 이의 단편이다. 간편하게, 항체 또는 이의 단편은 scFv; Fab; 면역글로불린 분자의 결합 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 적합한 항체 및 단편, 및 이의 제조 방법은 상기에 상세하게 기재되어 있다.
대안적으로, 제2 결합제는 항체-유사 결합제, 예를 들어, 어피바디 또는 압타머일 수 있다.
대안적으로, 샘플 중 단백질 상의 모이어티가 특이적 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 비오틴)을 포함하거나 이들로 이루어진 경우, 제2 결합제는 특이적 결합 쌍의 상보적 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘)을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
검출 검정이 사용되는 경우, 검출 가능한 잔기는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사능활성 모이어티; 효소적 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 검출 가능한 모이어티의 예는 상기되어 있다.
혈청 또는 혈장 단백질을 검출하기 위해 바람직한 검정은 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA), 방사능면역검정(RIA), 면역방사계측 검정(IRMA) 및 면역효소 검정(IEMA)을 포함하고, 단일 클론 및/또는 다중 클론 항체를 사용한 샌드위치 검정을 포함한다. 예시적 샌드위치 검정은 문헌[David et al in US Patent Nos. 4,376,110 and 4,486,530]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 슬라이드 상에서 세포의 항체 염색은 당업자에게 널리 공지된 바와 같은 세포학 연구 진단 시험에 널리 공지된 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 상기 검정은 전형적으로, 일반적으로 고체 상 검정에서 착색된 반응 산물을 제공하는 효소의 사용을 포함하는 ELISA(효소 결합된 면역흡착 검정)이다. 서양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제 및 포스파타제와 같은 효소는 광범위하게 사용되어 왔다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방법은 기질로서 NADP를 사용하여 제2 효소 시스템에 대한 조효소로서 현재 작용하는 NAD를 생성시키는 것이다. 대장균 유래의 피로포스파타제(pyrophosphatase)는 상기 효소가 조직에 존재하지 않고 안정하고 양호한 반응 색상을 제공하기 때문에 양호한 접합체를 제공한다. 루시페라제와 같은 효소를 기반으로 하는 화학발광 시스템이 또한 사용될 수 있다.
비타민 비오틴과의 접합은 흔히 사용되는데 그 이유는 이것이 큰 특이성 및 친화성으로 결합하는 효소-결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응에 의해 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
대안적인 구현예에서, 단백질 검출을 위해 사용되는 검정은 간편하게 형광측정 검정이다. 따라서, 제2 결합제의 검출 가능한 모이어티는 Alexa 형광단(예를 들어, Alexa-647)과 같은 형광성 모이어티일 수 있다.
바람직하게, 제1 양상에 기재된 방법의 단계 (c), (g), (f) 및/또는 (j)는 어레이를 사용하여 수행된다. 상기 어레이는 비드 기반 어레이 또는 표면 기반 어레이일 수 있다. 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
어레이 자체는 당업계에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이들은 선형 또는 공간적으로 분리되어 있는(즉, 별개의) 영역("스팟")으로 구성되고, 각각은 고형 지지체의 표면 상에 형성된 한정된 영역을 갖는 2차원 구조로 형성된다. 어레이는 또한 비드 구조일 수 있고, 여기서, 각각의 비드는 분자 코드 또는 색상 코드에 의해 동정될 수 있거나 연속 흐름으로 동정될 수 있다. 분석은 또한 연속적으로 수행될 수 있고, 여기서, 상기 샘플은 각각 용액으로부터 분자 부류를 흡수하는 일련의 스팟 상으로 통과된다. 고형 지지체는 전형적으로 유리 또는 폴리머이고, 가장 통상적으로 사용되는 폴리머는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고형 지지체는 튜브, 비드, 디스크, 실리콘 칩, 마이크로플레이트, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막, 니트로셀룰로스 막, 나일론 막, 다른 다공성 막, 비-다공성 막(예를 들어, 무엇보다 플라스틱, 폴리머, 퍼스펙스, 실리콘), 다수의 폴리머 핀, 또는 다수의 미세적정 웰, 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 다른 적합한 분자를 고정화시키고/시키거나 면역검정을 수행하기 위해 적합한 임의의 다른 표면 형태일 수 있다. 결합 공정은 당업계에 널리 공지되어 있고 일반적으로 단백질 분자, 폴리뉴클레오타이드 등을 고형 지지체에 가교-결합 공유적으로 결합시키거나 흡착시키는 것으로 이루어진다. 대안적으로, 친화성-태그 또는 유사한 작제물을 통한 프로브의 친화성 커플링이 사용될 수 있다. 접촉 또는 비접촉 프린팅, 마스킹 또는 포토리소그래피와 같은 널리 공지된 기술을 사용함에 의해, 각각의 스팟의 위치가 한정될 수 있다. 검토를 위해 문헌(Jenkins, R.E., Pennington, S.R. (2001, Proteomics, 2,13-29) and Lal et al (2002, Drug Discov Today 15;7(18 Suppl):S143-9)을 참조한다.
전형적으로, 상기 어레이는 마이크로어레이이다. "마이크로어레이"란, 적어도 약 100/cm2, 및 바람직하게 적어도 약 1000/cm2의 별개 영역의 밀도를 갖는 영역의 어레이의 의미를 포함한다. 마이크로어레이 내 영역은 전형적 차원, 예를 들어, 약 10-250 ㎛ 범위의 직경을 갖고, 어레이에서 다른 영역으로부터 대략 동일한 거리를 두고 분리되어 있다. 상기 어레이는 대안적으로 마크로어레이 또는 나노어레이일 수 있다.
일단 (상기 논의된) 적합한 결합 분자가 동정 및 단리되면, 당업자는 분자생물학 분야에서 널리 공지된 방법을 사용하여 어레이를 제조할 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 바이오마커는 인간 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 상동성 유전자 산물을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에 측정된 하나 이상의 바이오마커는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 단계 (c)에 측정된 하나 이상의 바이오마커는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 또는 cDNA 등)이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서 상기 방법은 시험관내, 생체내, 생체외 또는 인 실리코에서 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 특히 시험관내 수행될 수 있다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 피부 감작화는 과민성 반응(예를 들어, 세포-매개된 과민성 반응)이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 과민성 반응은 IV형 과민성 반응이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 과민성 반응은 알레르기 접촉 피부염(ACD)이다.
"시험 제제"란, 감작화 효능 및/또는 감작화 상태가 결정되어야만 하는 임의의 화학적 실체 (또는 화학적 실체의 혼합물)를 포함한다.
"감작화 상태"란, 화학적 물질 (또는 화학적 실체의 혼합물)이 감작제인지 아닌지(예를 들어, 피부 감작제 및/또는 호흡기 감작제)의 여부를 포함하거나 또는 이를 의미한다.
"피부 감작제"란 포유동물에서 IV형 지연형 과민성 반응을 유도하고 유발할 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 바람직하게, IV형 지연형 과민성 반응은 DC-매개된다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 "피부 감작제"는 포유동물에서 상피 접촉 부위에서 IV형 지연형 과민성 반응을 유도하고 유발할 수 있는 제제이다.
포유동물은 임의의 가축 또는 농장 동물일 수 있다. 바람직하게 포유동물은 래트, 마우스, 기니아 피그, 고양이, 개, 말 또는 영장류이다. 가장 바람직하게, 포유동물은 인간이다. 상기 논의된 바와 같이, 감작화를 결정하는 생체내 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 방법은 국소 림프절 시험법이다(세부 사항에 대해, 문헌(Basketter, D.A., et al., Local lymph node assay - validation, conduct and use in practice . Food Chem Toxicol, 2002. 40(5): p. 593-8)을 참조한다. 추가로 적합하지만 덜 바람직한 방법은 기니아 피그 최대화 시험이다(세부 사항에 대해, 문헌(Magnusson, B. and A.M. Kligman, The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol, 1969. 52(3): p. 268-76)을 참조한다).
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단은 수지상-유사 세포 집단이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 수지상-유사 세포는 골수 수지상-유사 세포이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 골수 수지상-유사 세포는 골수 수지상 세포로부터 유래된다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 골수 수지상 세포로부터 유래된 세포는 백혈병 유래된 세포이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 골수성 백혈병 유래된 세포는 KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 및 MUTZ-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 수지상-유사 세포는 MUTZ-3 세포이다. MUTZ-3 세포는 기관(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany (www.dsmz.de; DMSZ No. ACC 295))으로부터 가용한 인간 급성 골수단핵구 백혈병 세포이다.
"수지상-유사 세포"란, 형태학적 특성, 공동자극 분자 및 MHC 부류 Ⅱ 분자의 발현 및 거대분자를 음세포 작용(pinocytosis)하고 휴지 T 세포를 활성화시키는 능력과 같은 수지상 세포에 특이적인 기능적 및 표현형 특성을 나타내는 비-수지상 세포를 의미한다.
하나의 구현예에서, 사이토카인에 의한 자극 후의 수지상-유사 세포는 CD1d, MHC 부류 I 및 Ⅱ를 통해 항원을 제공하고/하거나 특이적 T-세포 증식을 유도한다.
하나의 구현예에서, 수지상-유사 세포는 CD34+ 수지상 세포 전구체이다. 선택적으로, CD34+ 수지상 세포 전구체는 사이토카인 자극 시 CD1d, MHC 부류 I 및 Ⅱ를 통한 항원을 제공하고/하거나, 특이적 T-세포 증식을 유도하고/하거나, 염증 매개체에 의한 자극시 성숙한 전사 및 표현형 프로필을 디스플레이하는 표현형(즉, 미성숙한 수지상 세포 또는 랑게르한스-유사 수지상 세포와 유사한 표현형)을 획득할 수 있다.
하나의 구현예에서, 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단은 수지상 세포 집단이다. 바람직하게, 수지상 세포는 1차 수지상 세포이다. 바람직하게, 수지상 세포는 골수 수지상 세포이다.
수지상 세포는 기능에 의해, 표현형에 의해 및/또는 유전자 발현 패턴에 의해, 특히 세포 표면 표현형에 의해 인지될 수 있다. 이들 세포는 이들의 독특한 형태, 고수준의 표면 MHC-부류 Ⅱ 발현 및 항원을 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포로, 특히 순수 T 세포로 제공하는 능력을 특징으로 한다(문헌참조: Steinman et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271).
수지상 세포의 세포 표면은 특징적 베일형 돌출과 함께 특이하고 세포 표면 마커 CD11c 및 MHC 부류 Ⅱ의 발현을 특징으로 한다. 대부분의 DC는 T 세포, B 세포, 단핵구/대식세포, 및 과립구를 포함하는 다른 백혈구 계통의 마커에 대해 음성이다. 수지상 세포의 준집단은 또한 33D1, CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CD1a-d, CD4, CD5, CD8알파, CD9, CD11b, CD24, CD40, CD48, CD54, CD58, CD80, CD83, CD86, CD91, CD117, CD123 (IL3Ra), CD134, CD137, CD150, CD153, CD162, CXCR1, CXCR2, CXCR4, DCIR, DC-LAMP, DC-SIGN, DEC205, E-캐드헤린, 랑게린, 만노스 수용체, MARCO, TLR2, TLR3 TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, 및 여러 렉틴을 포함하는 추가의 마커를 또한 발현할 수 있다.
이들 세포 표면 마커의 발현 패턴은 수지상 세포, 이들 기원의 조직 및/또는 이들 기원의 종의 성숙도와 함께 다양할 수 있다. 미성숙한 수지상 세포는 저수준의 MHC 부류 Ⅱ를 발현하지만, 항원 단백질을 세포내 도입하고 이들을 MHC 부류 Ⅱ 분자와의 복합체로 제공하기 위해 가공할 수 있다. 활성화된 수지상 세포는 고수준의 MHC 부류 Ⅱ, ICAM-1 및 CD86을 발현하고, 예를 들어, 혼합된 백혈구 반응(MLR)에서 미접촉 동종이계(allogenic) T 세포의 증식을 자극할 수 있다.
기능적으로, 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포는 항원 제공의 결정을 위한 임의의 간편한 검정에 의해 동정될 수 있다. 상기 검정은 시험 항원의 제시 및 이어서 T 세포 증식, IL-2의 방출 등의 결정에 의해 항원-프라이밍되고 및/또는 미접촉 T 세포를 자극하는 능력을 시험하는 것을 포함할 수 있다.
단백질 및/또는 핵산의 농도를 검출하고/하거나 측정하는 방법은, 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다.
단백질의 검출 및/또는 측정을 위해 바람직한 방법은, 웨스턴 블롯, 노쓰-웨스턴 블롯, 면역흡착 검정(ELISA), 항체 마이크로어레이, 조직 마이크로어레이(TMA), 면역침전, 제자리 혼성화 및 다른 면역조직화학 기술, 방사능면역검정(RIA), 면역방사능측정 검정(IRMA) 및 면역효소 검정(IEMA)을 포함하고, 단일 클론 및/또는 다중 클론 항체를 사용하는 샌드위치를 포함한다. 예시적 샌드위치 검정은 문헌[David et al in US Patent Nos. 4,376,110 and 4,486,530]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 슬라이드 상에서 세포의 항체 염색은 당업자에게 널리 공지된 바와 같은 세포학 연구 진단 시험에 널리 공지된 방법에 사용될 수 있다.
전형적으로, ELISA는 일반적으로 고체상 검정에서 착색된 반응 산물을 제공하는 효소의 용도를 포함한다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 및 포스파타제와 같은 효소는 광범위하게 사용되어 왔다. 포스파타제 반응을 증폭시키는 방법은, 기질로서 NADP를 사용하여, 제2 효소 시스템에 대한 조효소로서 현재 작용하는 NAD를 생성시키는 것이다. 대장균 유래의 피로포스파타제는 상기 효소가 조직에 존재하지 않고 안정하고 양호한 반응 색상을 제시하기 때문에 양호한 접합체를 제공한다. 루시페라제와 같은 효소를 기반으로 하는 화학발광 시스템이 또한 사용될 수 있다.
비타민 비오틴과의 접합이 흔히 사용되는데, 그 이유는 이것이 큰 특이성 및 친화성으로 결합하는 효소-결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 반응에 의해 용이하게 검출될 수 있기 때문이다.
본 발명의 제2 양상은 본 발명의 제1 양상에 따른 방법에 사용하기 위한 어레이를 제공하고, 상기 어레이는 본 발명의 제1 양상에서 한정된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티를 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 어레이는 본 발명의 제1 양상에서 정의된 바와 같은 바이오마커 각각에 대해 하나 이상의 결합 모이어티를 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 결합 모이어티는 고정화된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 어레이는 비드 기반 어레이이다. 추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 어레이는 표면 기반 어레이이다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제2 양상의 어레이는 하나 이상, 바람직하게 2개 이상의 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 결합 모이어티는 각각 제1 양상에 정의된 바와 같은 바이오마커에 선택적으로 결합할 수 있다. 따라서, 상기 어레이는 제1 양상에서 정의된 바와 같은 바이오마커의 임의의 특정 선택과 관련된 바이오마커-특이적 결합 모이어티의 특정 선택을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 제3 양상은 본 발명의 제1 양상에 정의된 2개 이상의 바이오마커의, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 용도를 제공한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 용도가 제공되고, 바람직하게, 여기서 상기 바이오마커는 표 A(i) 및/또는 표 A(ⅱ)에 정의된 그룹으로부터 선택된다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티의 용도가 제공되고, 바람직하게, 여기서 상기 결합 모이어티는 표 A(i) 및/또는 표 A(ⅱ)에 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커에 대한 특이성을 갖는다.
본 발명의 제4 양상은 본 발명의 제1 양상에 따른 방법에 사용하기 위한 분석적 키트를 제공하고, 상기 키트는:
(a) 본 발명의 2 양상에 따른 어레이; 및
(b) 본 발명의 제1 양상에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 (선택적인) 지침서를 포함한다.
추가의 또는 대안적인 구현예에서, 분석적 키트는 본 발명의 제1 양상에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조절제를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5 양상은 환자에서 I형 과민성 반응(예컨대, ACD)을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(a) 환자가 노출되거나 노출된 적이 있는 하나 이상의 시험 제제를 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 제공된 하나 이상의 시험 제제가 피부 감작제인지의 여부 및/또는 본 발명의 방법을 사용하여 감작제로서 이의 효능을 결정하는 단계; 및
(c) 하나 이상의 시험 제제가 피부 감작제 및/또는 특정 효능을 갖는 피부 감작제로서 동정된 경우, 상기 하나 이상의 시험 제제에 대한 환자의 노출을 감소시키거나 예방하고/하거나 감작화의 증상에 대한 적당한 치료를 제공하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 환자가 노출되거나 노출된 적이 있는 하나 이상의 시험 제제는 환자가 현재 1개월에 적어도 1회 노출된, 예를 들어, 2주 마다 적어도 1회, 매주 적어도 1회, 또는 매일 적어도 1회 노출되는 제제이다.
감작화 증상의 치료는 예를 들어, 국소 스테로이드를 포함할 수 있다.
바람직하게, 치료 방법은 본 발명의 제1 양상에서 기재된 방법, 및 본원에 기재된 하나 이상의 구현예와 일치한다.
본 발명의 제6 양상은, 본 발명의 방법을 작동시키기 위한 방법, 예를 들어, 단계 (c) (및 후속적 발현 측정 단계)의 발현 데이터를 해석하고 이로 인하여 하나 이상의 시험 제제가 호흡기 감작제인지의 여부 및/또는 하나 이상의 시험 제제의 감작제 효능을 결정하는 방법을 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램은 프로그램화된 SVM일 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 공지된 적합한 컴퓨터 -판독 캐리어 상에 기록될 수 있다. 적합한 컴퓨터-판독-캐리어는 (CD-ROM, DVD, 블루 레이 등을 포함하는) 컴팩트 디스크, 플로피 디스크, 플래시 메모리 드라이브, ROM 또는 하드 디스크 드라이브를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 프로그램을 수행하기 위해 적합한 컴퓨터 상에 설치될 수 있다.
당업자는 모든 비-상충 구현예가 조합적으로 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상으로부터의 구현예는 균등하게 본 발명의 제2 양상에 적용될 수 있다.
본 발명은 특정 양상을 구현하는 바람직한 비제한적인 예는 현재 하기의 도면을 참조로 기재된다:
도 1은 GARD 검정을 사용한 2진법 예측을 나타낸다. 도 1a에서는, 벤치마크 화학물질(실선) 및 37개의 새로운 화학물질(점선)의 2진법 예측을 위한 ROC 평가를 나타낸다. 도 1b에서, GARD SVM 결정값 (DV)은 CLP 효능과 상호 관련된다(37개 화학물질, 11개의 1A, 19개의 1B, 7개의 카테고리 없음). 증가하는 효능은 증가하는 DV와 관련된다.
도 2는 52개 변수를 사용한 무작위 포레스트 모델을 개발하기 위해 사용되는 연습 데이터세트를 가시화한 것이다. 도 2a는 화학물질의 CLP 분류에 따라 채색된 별도의 생물학적 복제물에 의한 연습 세트의 PCA 플롯을 나타낸다. 도 2b는 계층별로 클러스터된 샘플의 복제물에 의한 연습 세트의 히트맵으로서, 여기서 회색 스케일은 상대적 유전자 발현 강도를 나타낸다.
도 3은 52개 변수를 사용한 시험 데이터세트를 가시화한 것이다. 도 3a는 CLP 분류에 따라 채색된 별도의 생물학적 복제물에 의한 시험 세트의 PCA 플롯을 나타낸다. PCA는 PCA에 영향을 주는 것 없이 플롯팅된 연습 세트와 시험 세트 상에 만들어졌다. 도 3b는 계층별로 클러스터된 샘플에 의한 연습 세트의 히트맵으로서, 여기서, 회색 스케일은 상대적 유전자 발현 강도를 나타낸다.
도 4에서, CLP 효능 모델은 인간 효능과 관련된 정보를 포함한다. 도 4a는 인간 효능에 따라 채색된 가용 인간 효능 분류에 의한 복제물 연습 및 시험 세트 샘플의 PCA 플롯을 나타낸다. PCA는 도입량으로서 52개 무작위 포레스트 변수를 기준으로 하고 PCA는 연습 세트 상에 만들어졌다. 도 4b는 시험 세트만을 가시화하는 PCA 플롯을 나타낸다.
도 5는 3개의 CLP 분류의 다중그룹 비교로부터의 883개 가장 유의적 유전자의 도입을 기준으로 하는 경로 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 경로 분석에 의해 동정된 바와 같이, 각각의 단백질 반응성 그룹에 독특한 경로를 나타낸 것이다.
도 7a는 3개의 상이한 단백질 반응성 부류에 대한 통상의 유전자를 나타내고, 도 7b는 생물학적 경로(B)의 벤다이어그램[82]을 나타내었다. MA = 마이클 수용체; SB = 쉬프 염기 형성; SN = 2분자 친핵성 치환/친핵성 방향족 치환.
도 8은 게놈 알레르겐 신속 검출( GARD ) - 작업흐름을 나타낸 것이다. SVM 모델은 GARD 예측 시그니처를 나타내는 200개 유전자의 유전자 발현 데이터에 기초하는, 화학적으로 처리된 세포 유래의 각각의 RNA 샘플에 대한 결정값을 계산한다. 상기 결정값은 이후 화학물질[3]의 2진법 분류를 위해 사용된다.
도 9는 GARD 결정값과 인간 효능 부류 간의 관계를 나타낸 것이다. 화학물질은 인간 효능 부류에 따라 분류되었고, 3회의 결과로부터 유래된 평균 SVM 결정값은 Y 축 상에서 발견될 수 있다. x-축 상의 숫자는 표 8에서의 화학물질의 번호를 말한다.
도 10은 197개 샘플을 기준으로 하는 O- PLS 모델의 스캐터 플롯 (Y=인간 효능 및 감작제 /비- 감작제 )을 나타낸 것이다. 문헌[Basketter et al. (2014)]에 기재된 바와 같은 인간 효능 부류에서, 부류 1은 최고 효능을 나타내고, 부류 6은 비-감작제를 나타낸다.
도 11은 O- PLS 모델의 순열 플롯을 나타낸 것이다. 본래의 모델과 여러 모델의 피트 및 예측의 이로운 부분의 비교(여기서, Y-관찰 순서는 무작위로 순열되었다). 플롯은 모델이 우연히 수득되지 않았음을 강하게 나타낸다.
도 12에서, 관찰된 Y 값은 예측된 Y 값에 대해 플롯팅되었다 . RMSEE (평가의 평균 제곱근 오차)는 모델에 대한 관찰의 보정 오류를 나타낸다. RMSEcv는 유사한 척도이지만, 교차 검증을 사용하여 평가한다.
도 13은 PCA 플롯 및 히트 맵을 나타낸 것이다. 도 13a는 무작위 포레스트 모델링에 의해 동정된 18개 변수의 도입을 기준으로 하는 연습 세트이고, 도 13b는 연습 및 시험 세트이고, 도 13c는 단지 시험 세트만의 PCA를 나타낸다. 각각의 구형은 CLP 분류에 따라 색깔을 달리한 화학물질을 나타낸다(황색 = 1A, 분홍색 = 1B, 청색 = 카테고리 없음). 도 13d는 18개의 동정된 바이오마커의 발현을 기준으로 하는 연습 세트의 히트맵이고, 도 13e는 시험 세트의 히트맵을 나타낸다.
도 1은 GARD 검정을 사용한 2진법 예측을 나타낸다. 도 1a에서는, 벤치마크 화학물질(실선) 및 37개의 새로운 화학물질(점선)의 2진법 예측을 위한 ROC 평가를 나타낸다. 도 1b에서, GARD SVM 결정값 (DV)은 CLP 효능과 상호 관련된다(37개 화학물질, 11개의 1A, 19개의 1B, 7개의 카테고리 없음). 증가하는 효능은 증가하는 DV와 관련된다.
도 2는 52개 변수를 사용한 무작위 포레스트 모델을 개발하기 위해 사용되는 연습 데이터세트를 가시화한 것이다. 도 2a는 화학물질의 CLP 분류에 따라 채색된 별도의 생물학적 복제물에 의한 연습 세트의 PCA 플롯을 나타낸다. 도 2b는 계층별로 클러스터된 샘플의 복제물에 의한 연습 세트의 히트맵으로서, 여기서 회색 스케일은 상대적 유전자 발현 강도를 나타낸다.
도 3은 52개 변수를 사용한 시험 데이터세트를 가시화한 것이다. 도 3a는 CLP 분류에 따라 채색된 별도의 생물학적 복제물에 의한 시험 세트의 PCA 플롯을 나타낸다. PCA는 PCA에 영향을 주는 것 없이 플롯팅된 연습 세트와 시험 세트 상에 만들어졌다. 도 3b는 계층별로 클러스터된 샘플에 의한 연습 세트의 히트맵으로서, 여기서, 회색 스케일은 상대적 유전자 발현 강도를 나타낸다.
도 4에서, CLP 효능 모델은 인간 효능과 관련된 정보를 포함한다. 도 4a는 인간 효능에 따라 채색된 가용 인간 효능 분류에 의한 복제물 연습 및 시험 세트 샘플의 PCA 플롯을 나타낸다. PCA는 도입량으로서 52개 무작위 포레스트 변수를 기준으로 하고 PCA는 연습 세트 상에 만들어졌다. 도 4b는 시험 세트만을 가시화하는 PCA 플롯을 나타낸다.
도 5는 3개의 CLP 분류의 다중그룹 비교로부터의 883개 가장 유의적 유전자의 도입을 기준으로 하는 경로 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 경로 분석에 의해 동정된 바와 같이, 각각의 단백질 반응성 그룹에 독특한 경로를 나타낸 것이다.
도 7a는 3개의 상이한 단백질 반응성 부류에 대한 통상의 유전자를 나타내고, 도 7b는 생물학적 경로(B)의 벤다이어그램[82]을 나타내었다. MA = 마이클 수용체; SB = 쉬프 염기 형성; SN = 2분자 친핵성 치환/친핵성 방향족 치환.
도 8은 게놈 알레르겐 신속 검출( GARD ) - 작업흐름을 나타낸 것이다. SVM 모델은 GARD 예측 시그니처를 나타내는 200개 유전자의 유전자 발현 데이터에 기초하는, 화학적으로 처리된 세포 유래의 각각의 RNA 샘플에 대한 결정값을 계산한다. 상기 결정값은 이후 화학물질[3]의 2진법 분류를 위해 사용된다.
도 9는 GARD 결정값과 인간 효능 부류 간의 관계를 나타낸 것이다. 화학물질은 인간 효능 부류에 따라 분류되었고, 3회의 결과로부터 유래된 평균 SVM 결정값은 Y 축 상에서 발견될 수 있다. x-축 상의 숫자는 표 8에서의 화학물질의 번호를 말한다.
도 10은 197개 샘플을 기준으로 하는 O- PLS 모델의 스캐터 플롯 (Y=인간 효능 및 감작제 /비- 감작제 )을 나타낸 것이다. 문헌[Basketter et al. (2014)]에 기재된 바와 같은 인간 효능 부류에서, 부류 1은 최고 효능을 나타내고, 부류 6은 비-감작제를 나타낸다.
도 11은 O- PLS 모델의 순열 플롯을 나타낸 것이다. 본래의 모델과 여러 모델의 피트 및 예측의 이로운 부분의 비교(여기서, Y-관찰 순서는 무작위로 순열되었다). 플롯은 모델이 우연히 수득되지 않았음을 강하게 나타낸다.
도 12에서, 관찰된 Y 값은 예측된 Y 값에 대해 플롯팅되었다 . RMSEE (평가의 평균 제곱근 오차)는 모델에 대한 관찰의 보정 오류를 나타낸다. RMSEcv는 유사한 척도이지만, 교차 검증을 사용하여 평가한다.
도 13은 PCA 플롯 및 히트 맵을 나타낸 것이다. 도 13a는 무작위 포레스트 모델링에 의해 동정된 18개 변수의 도입을 기준으로 하는 연습 세트이고, 도 13b는 연습 및 시험 세트이고, 도 13c는 단지 시험 세트만의 PCA를 나타낸다. 각각의 구형은 CLP 분류에 따라 색깔을 달리한 화학물질을 나타낸다(황색 = 1A, 분홍색 = 1B, 청색 = 카테고리 없음). 도 13d는 18개의 동정된 바이오마커의 발현을 기준으로 하는 연습 세트의 히트맵이고, 도 13e는 시험 세트의 히트맵을 나타낸다.
실시예 A
도입
피부 감작화 및 접촉 알레르기와 같은 관련 질환은, 선진국에서 15-20%의 추정된 이환율(prevalence)로서, 일반 인구의 상당 부분에 영향을 미친다[1]. 알레르기 접촉 피부염(ACD), IV형 과민성 반응은 화학물질에 정기적으로 노출되거나 습윤 작업에 관여하는 자들과 같이 특정 직업 군 중에서 통상적이다[2]. 그러나, 또한 화장품 및 가정용품은 수많은 피부 감작화 화학물질을 함유할 수 있다. 상이한 법적 체계를 통해, 유럽 연합은 화장품 및 이들의 성분에 대한 동물 시험을 금지시켰고[3], REACH과 관련하여 >60,000개 화학물질을 시험하기 위한 요건을 부과하였다[4]. 분류 및 서브-카테고리화를 위한 규제 요건을 충족시키기 위해서는, 피부 감작화 능력 및 화학물질의 효능의 둘 다에 대한 정보가 제공되어야만 한다. 이들 요건을 충족하는 동물 부재의 대체 시험이 긴급히 요구된다.
피부 감작화 및 결과적으로 ACD를 유도하는 분자 반응은, 화학물질에 의해 유발되는 다수의 연속 주요 반응들(KE)을 특징으로 할 수 있고, OECD에 의해 기재된 부작용 결과 경로(AOP)에서 요약되었다[5]. 개시 반응(KE1)은 더 깊은 피부층으로의 접근을 획득한 후, 피부 감작화 화학물질에 의한 공유 단백질 변형으로 정의된다. 하기의 KE2는 각질세포의 활성화시 염증 반응을 나타낸다. KE3은 수지상 세포의 활성화에 상응하는데, 이는 이후 T 세포의 활성화 및 증식을 유도한다(KE4). 감작제에 재노출될 때, ACD의 발생이 유발될 수 있으며, 이는 부작용 결과로서 특이적 Th1 및 CD8+ T 세포에 의해 유도된 피부 병변을 특징으로 한다. AOP에서 KE는 잘 기재되어 있지만, 개별적인 주요 반응의 바탕이 되는 생물학의 세부적인 대사의 이해는 아직 못하고 있다[5].
뮤린 국부 림프절 검정(LLNA)[6]은 수년동안 피부 감작화 시험에 대해 바람직한 대안이었고, 이것은 피부 감작제 효능 정보를 포함하는, 위험 동정 및 특징 분석 둘 다에 대한 데이터를 제공할 수 있다. 그러나, 이것은 비히클 효과에 대한 민감성 및 가양성(false-positive) 결과에 의한 문제점과 같은 특정 한계를 특징으로 한다[7]. 최근에 검토된 위험 동정을 위해 상이한 시험 플랫폼으로부터 데이터를 통합하기 위한 컴퓨터 접근법을 포함하는, 여러 비-동물 예측 방법은, 화학적 시험을 위해 사용되는 동물 실험을 줄이기 위해 개발되었다[8]. 피부 감작화를 위한 3개의 시험 방법은, OECD에서 시험 가이드라인으로서 수용된다: ARE-NRF2 루시페라제 방법 (KeratinoSens™) 검정[9, 10], 직접적인 펩타이드 반응성 검정(DPRA)[11], 및 인간 세포주 활성화 시험(h-ClAT)[12]. 위험 동정에 추가로, 피부 감작제 효능에 대한 정보는 정량 위험 평가를 가능하게 하고 노출 한계를 정의하기 위해 필수적이다. 피부 감작제 효능의 예측을 위한 근접법은 거의 공개되지 않았고, 최근에 KE2를 표적화하는 검정(상피 균등 감작제 효능 검정[13], SENS-IS[14]), 및 U-SENS 검정 모델링 KE3[15]과 같이 [8]에서 검토되었다. 추가로, 여러 시험관내 방법으로부터의 정보를 흔히 조합하는 실리코 모델, 예를 들어, 베이시안(Bayesian) 모델[18-21]을 포함하는 QSAR[16], 인공 신경망[17], 개연론에 의거한 모델 및 통합 시험 전략(ITS) 근접법이 기재되었다[18-21].
화학물질의 피부 감작화 능력의 평가를 위한 대안적인 검정 게놈 알레르겐 신속 검출(GARD)은 비-감작화 대조군과 비교하여 감작화 화학물질에 의해 유도된, 인간 골수 세포주에서 차등 발현의 범용 전사체 분석을 기준으로 한다. 수득한 바이오마커 시그니처, GARD 예측 시그니처(GPS)는 200개 전사체로 이루어지고, 이는 표준 화학물질 세트에 대해 연습된 지지체 벡터 기계(SVM) 모델에 대한 도입량으로서 사용된다[22]. 전사에서의 변화는 감작화 동안에 수지상 세포(KE3)의 성숙화 및 활성화와 연계될 수 있다. 26개 맹검 화학물질을 기준으로 하는 인-하우스 연구에서, 검정의 정확도는 89%로 평가되었다[23]. 이전의 관찰은 GARD 검정이 또한 효능 평가를 위해 적절한 정보를 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 첫번째로, 감작화 경로는 화학적 반응성 그룹의 서브세트의 효능에 의존하여 차등적으로 조절되었다[24]. 두번째로, 본원 발명자는 보다 강력한 감작제가 보다 약한 감작제와 비교하여 일반적으로 보다 높은 GARD SVM 결정값에 할당됨을 관찰하였고 이는 효능 정보와 함께 기여하는 시그니처 내에 유전자(비공개된 관찰)가 있음을 나타낸다. 그러나, GARD 예측 시스네이쳐에서의 정보는 분류, 표지화 및 패키징(CLP) 규제에 의해 기재된 바와 같은 널리-한정된 효능 그룹으로 화학물질을 완전히 계층화하기 위해 충분하지 않았다[25].
CLP 규정은 범용으로 조화된 시스템[25]을 기준으로 하고, 화학물질 분류를 위해 3개의 카테고리를 사용한다; 비-감작제에 대해 카테고리 부재(no cat), 약한 감작제에 대해 카테고리 1B 및 강한 감작제에 대해 1A. 상기된 관찰의 관점에서, GARD는 CLP 카테고리를 표적화하는 화학물질 피부 감작제 효능의 예측을 위한 도구로 추가로 개발될 수 있는 것으로 추정되었다. 확립된 GARD 지지체 벡터 기계 모델은 다중부류 문제점에 적용될 수 있기 때문에, 본원 발명자는 무작위 포레스트 모델링을 기준으로 하는 또 다른 접근법을 사용하였다[26]. 무작위 포레스트는 결정-트리 기반 방법이고 마이크로어레이 데이터를 위해 매우 적합하다[27]. 이것은 데이터세트를 내부적으로 및 반복적으로 무작위 서브-샘플링(부트스트래핑)을 통한 연습 및 시험 세트로 분류한다. 시험 세트 중 샘플은 아웃-오브-백 샘플(out-of-bag sample)로서 언급되고 전체 데이터세트의 대략 3분의 1을 포함하고, 아웃-오브-백(OOP) 오류, 즉, 분류 오류를 평가하기 위해 사용된다.
여기서, 본원 발명자는 무작위 포레스트 모델을 사용한 지도된 기계 학습에 기반한 CLP 카테고리에 따라 피부 감작제 효능을 예측하기 위한 새로운 접근법을 제공한다. 첫번째로, 68개의 독특한 화학물질 및 2개의 비히클 대조군 샘플을 포함하는 연습 세트로부터의 범용 유전자 발현 데이터는 무작위 포레스트 모델로의 도입으로서 사용되었다. 무작위 포레스트 모델은 후속적으로 퇴보 변수 제거를 위한 알고리즘과 조합하였다. 상기 알고리즘은 처음에 마이크로어레이로부터 각각의 유전자의 변수 중요성을 등급화하고 이어서 새로운 무작위 포레스트를 반복적으로 보정하고, 이전의 반복으로부터 최소로 중요한 변수를 제거한다. 상기 전략을 사용하여, 본원 발명자는 연습 세트로부터 아웃-오브-백 샘플을 예측하는 경우 최소 OOB 오류율로 52개 유전자 세트를 동정할 수 있었다. 52개 유전자의 예측 수행능은 이전에 상기 모델에 대해 보이지 않는 18개 화학물질을 함유하는 독립적 시험 세트로 챌린지하였다. 상기 시험에서 화학물질은 전체 78%의 정확도로 예측될 수 있다. 상기 예측 모델에 추가로, 본원 발명자는 또한 세포 수준에 대한 피부 감작화 효능의 기계론적 이해를 추가로 개선시키기 위한 경로 분석을 수행함에 의해 세포의 전체 전사체를 분석하는 다재다능성을 입증하였고 이는 상이한 화학물질 반응성 부류가 별개의 신호전달 경로를 유도한다는 추정을 확인시켜 준다.
재료 및 방법
세포 및 유동 세포측정
본 연구에 사용된 골수 세포주는 MUTZ-3(DSMZ, Braunschweig, Germany)으로부터 유래하였고 [22,28]에 기재된 대로 유지되었다. 각각의 실험 전에 세포의 표현형 조절 분석은 유동 세포측정에 의해 수행하여 세포의 미성숙한 상태를 확인하였다. 하기의 단일 클론 항체를 사용하였다: CD1a(DakoCytomation, Glostrup, Denmark), CD34, CD86, HLA-DR(BD Biosciences, San Jose, USA), 모두 FITC-접합됨; CD14 (DakoCytomation), CD54, CD80 (BD Biosciences), 모두 PE-접합됨. 이소형 대조군으로 작용하는 FITC- 및 PE-접합된 마우스 IgG1 (BD Biosciences) 및 비-생존 세포에 대한 마커로서 요오드화 프로피듐 (BD Biosciences). 세포의 3개의 배치는 독립적 실험에서 24시간 동안 노출시켰고, 생존능 및 CD86 발현은 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 모든 FACS 샘플은 데이터 획득을 위한 FACS Diva 소프트웨어를 사용하는 FACSCanto Ⅱ 장비 상에서 분석하였다. 10 000개 반응들을 획득하였고, 추가의 분석은 FCS 익스프레스 V4(De Novo Software, Los Angeles, CA)에서 수행하였다. RNA 추출을 위한 세포는 TRIzol® (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)에서 용해시키고, -20℃에서 추가 사용될 때까지 저장하였다.
화학물질 및 자극
모든 화학물질은 고순도 품질로 제조원(Sigma Aldrich (Saint Louis, USA))으로부터 구입하거나, 이들은 기관(Cosmetics Europe)에 의해 제공되었다. 모든 화학물질은 공급자의 추천에 따라 저장하였다. 세포의 화학물질 자극은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다[28]. 요약하면, GARD 유입량 농도는 화학물질의 용해도 및 세포독성 특징에 의해 정의되었다. 500 μM의 최종 농도는 비-세포독성 및 가용성 화학물질 제한된 용해도(매질에서 500 μM 미만)를 갖는 화학물질에 대해 최고 가능한 농도에 대해 표적화되었다. 세포독성 화학물질은 90% 세포의 상대적 생존능을 표적화하는 농도로 사용되었다. 대부분의 화학물질은 디메틸 설폭사이드(DMSO) 또는 오토클레이브된 MilliQ 물 중에서 1000×사전 희석한 것으로 사용하였다. 비히클로서 DMSO 농도는 결코 0.1%를 초과하지 않았다. DMSO 및 MilliQ 샘플은 본 연구에서 비히클 대조군으로서 포함되었고, 따라서 비-감작제 샘플 그룹에 속한다.
RNA 추출, cDNA 및 어레이 혼성화
TRIzol®에 용해된 세포로부터의 RNA 분리는 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 표지된 센스 DNA는 추천된 키트 및 제어를 사용하여, Affymetrix (Affymetrix, Cleveland, USA) 프로토콜에 따라 합성하였다. cDNA는 Human Gene 1.0 ST 어레이(Affymetrix)에 혼성화하였고, 추가로 공급자에 의해 추천된 바와 같이 프로세싱되고 스캐닝하였다.
2진법 분류
표 1에 요약된 37개 화학물질의 감작제 또는 비-감작제로의 2진법 분류는, 학습 알고리즘에 대한 변수 도입으로서 GPS로부터의 SCAN-규정화된[29, 30] 발현 데이터를 사용하는, SVM에 기반한 이전 확립된 모델을 사용하여 수행하였다[22]. 모델 구축 전에, 연습 세트와 시험 화학물질 간의 잠재적 배치 효과는 연습 세트에 대한 시험 화학물질에 대해 스케일링 어레이 발현 값에 의해 제거하였다. 스케일링 인자는 연습 세트의 DMSO 비히클 대조군 샘플 중의 각각의 유전자에 대한 평균 발현 값 및 시험 화학물질이 기원하는 배치에서 DMSO 샘플 중 동일한 유전자에 대한 평균 발현 값의 비율을 계산함에 의해 생성하였다. 각각의 유전자에 대한 스케일링 인자는 이어서 시험 화학물질에서 상응하는 유전자에 대한 유전자 발현 값에 곱하였다. SVM 예측은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다[22, 31]. 간략하게, 선형 케르넬에 기반한 SVM 모델은 GPS의 동정 동안에 사용되는 본래의 연습 세트로부터의 표준 화학물질 자극에 대해 연습하였다[22]. 연습된 모델은 후속적으로 SVM 결정값(SVM DV)과 함께 각각의 시험 화학물질을 할당하기 위해 적용하였다. 모든 시험 화학물질에 대해 수득한 SVM DV를 사용하여 리시버 작동 특징(ROC) 곡선을 작제하였고, 수득한 곡선 이하 면적(AUC)은 분류 척도로서 사용하였다[32]. SVM 모델링 및 ROC 곡선 가시화는 추가의 팩키지 e1071[33] 및 ROCR[34]을 사용하여, R 통계학적 환경에서 수행하였다. 모델의 최종 예측 수행능을 평가하기 전에, 시험 화학물질의 각각의 개별 복제물에 대한 SVM DV는 [31]에 기재된 바와 같이 표 2에서 벤치마크 샘플의 분류 동안에 수득된 최대 예측 수행능에 대한 컷-오프에 대해 보정하였다. 보정된 SVM DV는 후속적으로 최종 분류를 위해 사용하였고 시험 화학물질은 복제물의 메디안 아웃풋 값이 > 0인 경우 감작제로서 분류하였다. 정확도, 민감성 및 특이성은 쿠퍼(cooper) 통계를 사용하여 평가하였다[35]. 비-파라미터 2개 샘플 윌콕손 시험(Wolcoxon test)은 CLP 카테고리 1A, 1B 및 no cat 간에 SVM DV 분포가 상당히 상이한지 여부를 결정하기 위해 수행하였다.
데이터 취급 및 통계학적 분석
무작위 포레스트 모델을 구축하기 위해, 68개 화학물질 및 2개의 비히클 대조군 샘플은 연습 세트로서 정의하였고, 18개 화학물질, 각각의 CLP 카테고리로부터 6개를 독립적 시험 세트에 포함시켰다. 시험 세트 중 화학물질은 모델의 구축에 포함시키지 않았다. 목적은 모든 3개의 CLP 카테고리(표 3) 및 상이한 화학물질 반응성 그룹(표 4)을 나타내는 균형화된 연습 세트를 수득하는 것이었다. 최후 실험 캠페인으로부터 기원하는 시험 세트 중 대부분의 화학물질(18개 중 14개)(표 1)은 GARD 검정을 사용하여 이전에 조사되지 않은 37개 화학물질을 포함한다. 연습 세트에서, 샘플의 대략적으로 3분의 1(68개 중 23개)은 상기 최근 데이터세트로부터 유래하였다. 상기 비히클 샘플은 모든 프로젝트의 일부이고 따라서 보다 높은 복제물의 수로 존재한다.
새로운 마이크로어레이 데이터는 역대 데이터[22, 23]와 병합하였고, 품질 관리에 적용하였다. 4개의 어레이는 나쁜 품질로 인해 제거하였지만, 어떠한 화학물질도 생물학적 듀플리케이트(duplicate) 미만으로 존재하였다. 어레이 데이터는 R 통계학적 환경으로 수입하였고 SCANfast 알고리즘을 사용하여 규정화하였다[29, 30]. 여러 실험 캠페인이 조합될 필요가 있기 때문에, 상기 데이터세트는 샘플 간의 배치 효과를 제거하기 위해 ComBat 방법[36, 37]을 사용하여 규정화하였다. 이 시점에서, 연습 세트에서 샘플은 시험 세트에서 샘플로부터 분리하였다. 과다 보정(overfitting)을 피하기 위해, 지정된 연습 세트에서의 샘플만이 예측 바이오마커 시그니처의 동정 동안에 및 분류자에 대한 파라미터의 보정을 위해 사용되었고, 시험 세트 중 샘플은 동정된 시그니처 및 특정 분류기의 수행능을 입증하기 위해 제외시켰다. 예측 바이오마커 시그니처는 R/Bioconductor 버젼 3.1.2에서 varSelRF 팩키지[38]에서 퇴보 제거 과정과 조합된 무작위 포레스트 모델[26]로의 연습 세트에서 개별 샘플로부터의 규정화되고 배치 보정된 전사체 강도를 공급함에 의해 동정하였다. 변수 중요성의 등급화를 위해 사용되는 초기 포레스트는 2000 트리까지 성장시키고, 모든 다른 파라미터는 디폴트 세팅에 유지시켰다. 상기 팩키지는 반복적으로 최소 중요한 변수의 20%를 저하시키는 각각의 반복에서 무작위 포레스트 모델을 보정하고 평가한다. 변수의 최상의 수행 세트는 최소 오류 용액으로부터 표준 오류 내 최소의 유전자 수로서 모두 보정된 무작위 포레스트로부터의 OOB 오류율을 기준으로 선택하였다(즉 1.s.e 법칙). 상기 변수 선택 과정은 100개 부트스트랩 샘플을 사용한 varSelRF 팩키지의 .632+ 부트스트랩 방법에 의한 예측 오류율을 제거함에 의해 입증하였고, 바이오마커 시그니처에서 개별 전사체의 중요성은 부트스트랩 샘플에서 출현 빈도 [타당성 콜 빈도(VCF: Validation Call Frequencies)로도 언급됨]에 의해 입증되었다. 동정된 바이오마커 시그니처의 예측 수행능은 연습 세트에서 샘플 및 변수 도입으로서 바이오마커 시그니처에서 선택된 전사체만을 사용하는 이전의 파라미터에 기반한 무작위 포레스트 팩키지[39]에서 새로운 포레스트를 구축함에 의해 입증되었다. 모델은 시험 세트 중 각각의 개별 복제물 샘플을 CLP 카테고리에 할당하기 위해 적용하였고, 각각의 화학물질에 대한 생물학적 복제물 자극에 걸친 다수 표는 예측된 카테고리로서 수용하였다. 히트맵과 주성분 분석(PCA) 플롯은 Qlucore Omics Explorer(Qlucore AB, Lund, Sweden)에서 작성하였다.
경로 분석
경로 분석은 주요 경로 어드바이저(KPA: Key Pathway Advisor) 도구[40] 버젼 16.6을 사용하여 수행하였고, 이는 예를 들어 유전자 발현 데이터를 조사하기 위한 경로 분석 작업흐름을 제공한다. 이것은 차등적으로 발현된 유전자를 업스트림 및 다운스트림 프로세스 둘 다와 관련시켜 생물학적 해석을 가능하게 한다. 총 308개 샘플 중 시험 세트와 연습 세트의 SCANfast- 및 ComBat-규정화된 발현 값으로 이루어진 조사된 데이터세트는 제1의 변화-필터링하여 대략적으로 3분의 1이 잔류할 때까지 (10009개 변수, σ/σmax=0.1478) 꾸준히 낮은 변화를 갖는 변수를 제거하였다. 이어서 CLP no cat, 1B, 및 1A에 속하는 샘플을 비교하는 다중그룹 비교(ANOVA)를 적용하여 차등적으로 조절되는 전사체를 동정하였다. 가장 유의적인 883개 유전자(거짓 발견율 FDR=10-9; p=8.53x10-11)는 KPA(Affymetrix Exon IDs 및 각각 p-값, 과연결성 분석)로의 도입으로서 사용하였다. 단백질 반응성과 관련된 경로를 동정하기 위해, 동일한 변화-필터된 데이터세트는 2개-그룹 비교를 기준으로 필터링하였다(t-시험, 톡스트리 결합 부류 "결합 부재" 비-감작제(81개 샘플) 대 "마이클 수용체(Michael acceptor)" 감작제(MA, 63개 샘플), "결합 부재" 대 "쉬프 염기 형성"(SB, 29개 샘플), "결합 부재" 대 조합된 "2분자 친핵성 치환/친핵성 방향족 치환"(SN, 25개 샘플). 이어서 각각의 비교로부터 500개의 가장 유의적으로 조절된 변수를 갖는 목록은 p-값 및 배수 변화(통상적 합리적 분석)와 함께 각각의 단백질 반응성 그룹에 대해 KPA 도구로 진입시켰다. 최저 p-값은 MA 샘플을 "결합 부재" (FDR=3.65x10- 7)에 이어서 SB(FDR=2.3x10-5) 및 (FDR=2.44x10- 5)와 비교할 때 도달하였다.
스크립트
하기 열거된 것은 규정화 및 효능 예측에 사용되는 스크립트이다:
스크립트 1: 모델 구축 전 상이한 프로젝트 간의 배치 효과를 방지하기 위해 사용됨:
스크립트 2는 초기 효능 모델의 구축을 위해 사용됨:
결과
37개 화학물질의 2진법 분류
37개의 잘 특징 분석된 화학물질을 포함하는 신규 데이터 세트(표 1)는, 51개 화학물질에 대한 역대 GARD 데이터를 보충하고, 화학적 반응성 부류 및 소비자 제품에서의 사용 관점에서 균형화된 화학물질의 선택을 제공하기 위해 선택되었다. 신규한 화학물질은 유럽 화학 기관(European Chemical Agency) CLP 데이터베이스 및 문헌[15, 41]에 기반하며, 27개 화학물질을 친절히 제공한 기관(Skin Tolerance Task Force of Cosmetics Europe (CE))과 협력하여 선택되었다. 37개 신규 화학물질은, SVM 분류를 기준으로 GPS 및 이전에 확립된 프로토콜을 사용하여, 감작제 또는 비-감작제로서 예측되었다. SVM 모델은 SVM DV와 함께 각각의 개별 복제물 샘플을 할당하기 위해 적용하였다. 최종 분류 전, 37개 샘플로부터의 SVM DV는, 시험 화학물질과 동일한 샘플 배치에 포함된 11개 벤치마크 샘플(표 2)에 대해 먼저 계산하였다. 2진법 예측을 평가할 목적으로, 본원 발명자는 여기서 가용한 경우 CLP 분류 대신 인간 데이터를 우선화하기로 결정하였는데[41], 여기서, 부류 1 내지 4개는 감작제에 상응하였고, 5개 및 6개는 비-감작제에 상응하였다. 37개 화학물질을 예측하는 모델 수행능은 0.88의 AUC ROC에 의해 요약되었고, 이는 도 1a에 도시한 바와 같이 양호한 식별능을 나타낸다 (벤치마크 화학물질-실선; 37개 화학물질-점선). 민감성, 특이성 및 정확도는 쿠퍼 통계(Cooper statistics)를 기초로 하여, 각각 73%, 80% 및 76%로 평가되었다. 이전에 공개된 데이터와 조합하여[23], 피부 감작제의 2진법 분류를 위한 GARD의 업데이트된 예측 정확도는 총 74개 화학물질을 포함하는 데이터 세트를 기준으로 84%로 평가된다. 표 1에서의 화학물질이 CLP 분류에 따라 분류되고, 37개 화학물질의 분류 동안에 수득된 각각의 SVM DV 값은 도 1b에 제공된 바와 같은 박스 플롯으로 요약되는 경우, 보다 강한 감작제로서 나타나는 효능 기울기는 카테고리 1B에서 보다 약한 감작제 및 no cat에서 비-감작제와 비교하여 보다 높은 SVM DV에 할당되었다. SVM DV 샘플 분포를 비교하는 비-파라미터 2개 샘플 윌콕슨 시험에 따라, 이들 실험은 유의적으로 상이하였다(no cat 대 1B: p=2.8-5; 1B 대 1A p=2.8-6, no cat 대 1A p=3.5-12). 그룹 간의 차이가 유의적이지만, 일부 중첩은 개별 화학물질 간에 존재하고, 이는 상기 정보가 잘-한정된 효능 그룹으로의 샘플을 완전히 계층화하기 위해 충분하지 않았음을 나타낸다.
CLP 카테고리의 예측을 위한 무작위 포레스트 모델
CLP 카테고리의 예측을 위한 바이오마커 시그니처를 확립하기 위해, 37개 신규 화학물질을 포함하는 데이터세트는 51개 화학물질을 포함하는 역대 데이터세트와 병합하였다. 종합적으로, 86개의 독특한 화학물질(표 4) 및 2개의 비히클 대조군으로 이루어진 데이터세트는 CLP에 의해 기재된 바와 같은 카테고리 1A 및 1B 및 비-감작제(no cat)와 관련하여 균형화시켰다. 4개의 화학물질에 대해, CLP 분류 1B는 3개의 이유 중 하나를 위해: i) 이전의 GARD 프로젝트(벤즈알데하이드, 자일렌)와의 일관성을 보유하기 위해, Ⅱ) 비-감작화 농도(DMSO)에서 비히클로서 사용하기 위해, 및 LLNA(소듐 도데실 설페이트)에서 잘 기재된 가양성을 위해, 표 4에 나타난 공급원에 따라 카테고리 부재/비-감작제로 변화시켰다.
3개의 CLP 카테고리의 예측을 위한 무작위 포레스트 모델은 2개의 비히클 대조군을 포함하는, 70개의 독특한 샘플로 이루어진 연습 세트를 기준으로 개발하였다. 52개 예측 변수(표 5)는 CLP 분류를 위해 최적인 것으로서 동정되었다. 부트스트래핑으로부터 유래된 모델의 예측 오류율은 0.225로 평가되었고, 이는 모델 수행능의 지표를 제공한다. 모델을 개발하기 위해 사용되는 데이터세트를 가시화하기 위해, 원칙적 성분 분석(PCA)을 수행하였다. 전체-게놈 어레이 분석을 기준으로 하는 무작위 포레스트에 의해 동정된 52개 변수는 도입량으로 사용되었고, PCA는 연습 세트 상에 만들어졌다(도 2a). 도 2a는 CLP 카테고리에 따라 채색된 생물학적 복제물와 함께 화학물질을 기준으로 하고 no cat로부터 강한 감작제(1A)까지의 명백한 농도 구배는 제1 원칙적 성분을 따라 관찰될 수 있다. 도 2b에서 변수의 계층적 클러스터링과 함께 연습 세트의 히트맵은 각각의 화학물질 및 CLP 카테고리와 관련하여 유전자의 조절을 설명한다.
독립적 시험 세트의 예측
모델 수행능은 상기 모델에 대해 이전에 보이지 않는 18개 화학물질을 포함하는, 독립적 시험 세트의 CLP 카테고리를 예측함에 의해 추가로 평가하였다. CLP 카테고리에 따라 채색된 시험 세트는 52개 동정된 변수에 기반한 PCA 성분에 영향을 주는 것 없이, PCA 플롯(도 3a)에서 가시화되었다. 도 3b는 히트맵 형태로 규정화된 시험 세트에서 52개 유전자의 조절을 가시화한다. 복제물가 별도로 예측되고 다수결이 각각의 화학물질을 분류하기 위해 사용되는 경우, 18개 화학물질 중 14개는 우측 CLP 카테고리로 할당되고(표 6, 보충 표 1), 총 정확도 78%를 유도한다(표 7). 4개의 잘못 분류된 화학물질은 디에틸 말레에이트, 부틸 글리시딜 에테르, 라일랄 및 염화시아누르산이었다. 유일하게 가음성(false-negative) 예측은 염화시아누르산이었고 이는 CLP에서 1A로서 및 본원의 모델에서 no cat으로서 분류된 반면, 3개의 화학물질은 CLP 1B로서 분류되지만 1A로서 예측되었다. 연습 및 시험 세트에 대한 본원의 선택이 편향적이지 않고 예측 모델이 전체적으로 연습 세트의 조성물에 의존하지 않음을 확인하기 위한 후속적 단계에서, 본원 발명자는 18개의 대안적인 무작위 포레스트 모델을 작제하였고, 여기서, 연습 및 시험 세트에서 화학물질의 조성물은 무작위로 셔플링되었다. 각각의 새로운 모델에 대해, 본원 발명자는 상기된 바와 같이 변수 선택의 완전한 프로세스를 반복하였다. 각각의 화학물질 자극에 대해 가용한 복제물 샘플의 수에 의존하여, 각각의 연습 및 시험 세트 내 총 샘플의 수는 다양하였지만 각각의 세트 및 이들의 CLP 분포에서 화학물질의 수는 일정하게 유지되었다. 대안적인 모델은 모두 유의적이었고 부트스트래핑 과정으로부터 수득된 평균 예측 오류율은 0.22에서 초기 모델과 동일하였고 이는 제공된 모델이 연습 및 시험 세트의 평향적 선택으로 인해 수득되지 않았음을 지지한다.
CLP 효능 모델은 인간 효능 예측과 관련된 정보를 함유한다.
이후, PCA는 52개 변수(표 5)가 인간 효능 카테고리와 관련된 정보를 사용하여 어떻게 수행하는지를 조사하기 위해 사용되었다[41]. 70개 연습 및 18개 시험 세트 샘플은 인간 효능에 따라 채색되었고(부류 1-6, 6=진정한 비-감작제, 1=가장 강한 감작제), 어떠한 인간 효능 카테고리도 가용하지 않은 샘플을 제거하였다(표 4 참조). 모델은 CLP 효능 카테고리를 예측하기 위해 개발되었지만, 이것은 또한 도 4a, 4b에 의해 도시된 바와 같은 인간 효능과 관련된 정보를 함유한다.
무작위 포레스트 모델 변수의 동정
무작위 포레스트에 의해 동정된 52개 변수(표 5)는 상이한 세포 격실 및 상이한 기능성 역할에 속하는 전사체를 나타낸다. 이들 중 5개는 GARD 예측 시그니처와 중첩된다. 보트스트래핑 프로세스에서 가장 빈번하게 선택되고 최고 확인 요청 빈도를 갖는 상위 10개의 마커 중 5개(표 5)는 히스톤 클러서트 1 구성원, 예를 들어, HIST1H2AB이다[42]. 히스톤은 고도로 보존되어 있고 염색질 구조를 유지하는 것 뿐만 아니라 유전자 조절에서 중요한 역할을 수행한다[43]. PFAS 및 PAICS는 퓨린 생합성에 관여하고[44, 45], TMEM97은 콜레스테롤 수준의 조절제이고[46], 이것은 추가로 RNA 간섭 실험에 따른 신경교종 세포 모델에서 세포 주기 조절, 세포 이동 및 침입에 관여하는 것으로 기재된다[47]. DHCR24는 소포체(ER)에 국부화된 다기능성 효소이고 콜레스테롤-합성에서 최종 단계를 촉매하지만[48] 또한 예를 들어, ER 스트레스 하에 신경 세포에 대해 나타낸 바와 같이 항-아폽토시스 활성을 소유한다[49]. PLK1, 키나제는 TLR 활성화에 응답하여 인산화되는 것으로 나타났고 RNA 간섭으로부터의 결과는 PLK1 신호전달이 TLR-유도된 염증 반응에 관여하는 것을 시사하였다[50]. PLK1은 추가로 TNF-유도된 사이클린 D1 발현을 억제함에 의해 세포 주기 조절에 관여하는 것으로 보고되었고 이것은 TNF-유도된 NF-κB 활성화를 감소시킬 수 있다[51]. 많은 나머지 전사체는 핵 단백질이고 따라서 복제, 전사, 스플라이싱 및 세포 주기 조절과 같은 DNA-의존성 프로세스에 관여할 가능성이 있다. 면역 반응 및/또는 감작화에서 이들의 관여를 위해 공지된 단백질, 예를 들어, 피부 감작제에 대한 세포 반응에서 이의 역할에 대해 잘 기재된 NQ01를 암호화하는 추가의 여러 전사체가 있다[52]. CD53은 테트라스파틴 계열에 속하고, 예를 들어, 세포 접착, 이동 및 신호전달에서 다중 기능을 갖고 각각의 건강한 대조군과 비교하여 아토피 습진을 갖는 환자들 기원의 말초 혈액 유래된 단핵구상에서와 유사하게 [54] 아토피 피부염 환자 개체로부터의 FcεRI-양성 피부 DC [53] 상에 상승되는 것으로 나타난 막관통 단백질이다. CD44는 수많은 세포 유형에 의해 발현되는 세포 표면 당단백질, 접착 및 하이알루로난 수용체이고[55] 예를 들어, 알레르기 피부염의 마우스 모델에서 나타난 염증 조직으로의 백혈구 이동을 매개함에 의해 [57] 염증 반응에 관여한다[56].
통상적이고 고유하게 조절된 경로는 이들의 단백질 반응성이 상이한 감작제에 의해 유도된다.
KPA 분석에서 CLP 카테고리 간의 다중그룹 비교 (FDR=10-9) 후 883개의 가장 유의적으로 조절된 유전자들의 도입으로 동정된 33개의 주요 경로(도 5)는 유전자 조절, 세포 주기 제어 및 대사와 같은 무작위 포레스트에 의해 정의되는 여러 기능성 그룹의 52개 변수를 반영한다. 면역 반응-관련 경로, 예를 들어 "세포 성장, 생존, 분화 및 대사의 IL-4-유도된 조절제" 및 "JAK/STAT, p38, JNK 및 NF-κB를 통한 면역 반응 IL-3 신호 전달"은 50%의 가장 유의적으로 조절되는 것들 중에 있다.
기재된 분석은 후속적으로 본 데이터세트에서 3개의 가장 큰 화학 반응성 그룹에 집중되어었다; 친핵성 치환(SN), 마이클 부가(MA) 및 쉬프 염기(SB) 형성. 포함된 화학물질 중에서, "no cat"으로서 표지된 대부분의 화학물질은 어떠한 단백질 결합 성질을 갖지 않지만, 수개의 SB 형성 및 SN 화학물질이 존재한다. 카테고리 1B에서, 거의 모든 단백질 반응성 유형이 나타난 반면, 카테고리 1A에서는 MA 화학물질이 명백히 우세하였다.
각각의 관련 단백질 반응성에 대해, 유일한 경로는 도 6에 제공된 바와 같은 각각의 단백질 반응성 그룹에 속하는 화학물질을 감작화시키기 위해 동정될 수 있다. 이들 결과는 도입 데이터로부터 차등적으로 조절된 유전자를, 도입 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있는 분자인 소위 주요 허브와 조합한다. 이들은 필연적으로 이들 자체가 이들의 조절이 활성 변화(예를 들어, 키나제에 대해)와 같은 다른 생물학적 수준에 대해 가시화될 수 있거나 변화가 매우 단기 또는 낮은 정도일 수 있기 때문에 유전자 발현 실험에 의해 동정될 수 없다. 종합적으로, 173개 유전자들은 모든 3개의 반응성 그룹에 대해 통상적이고(도 7a) 6개의 경로는 모든 3개의 반응성 그룹에 존재하였다(도 7b); "세포 주기: 세포 주기 조절에서 APC의 역할", "세포 주기: 세포 주기 조절에서 SCF 복합체의 역할", "발육: 과립구 발육의 전사 조절", "세포 주기: 세포 주기(일반 도식)", "DNA 손상: G1/S 체크포인트의 ATM/ATR 조절", 및 "유방암에서 에스트라디올/ESR1 (핵)의 미토겐 작용". 다시, 세포 주기 경로는 높게 나타났다. 산화 스트레스 반응은 단지 MA 및 SB 화학물질에 대해서만 주요 경로 결과의 일부로서 동정되었다(도 6). NA 감작제 화학물질 그룹에서, KEAP1 및 NRF2는 이들의 표적 유전자 NQO1 및 HMOX1[52, 58] 및 AHR[59, 60] 뿐만 아니라 주요 허브로서 밝혀졌다. MA 화학물질에 대해, 표적 유전자 NQO1, HMOX1 및 CES1[61]은 심지어 도입 유전자 수준으로 존재하였다. 도입 수준에 대해, CES1은 또한 SN 화학물질에 대해 존재하지만 단지 NQO1, NRF2 및 AHR이 주요 허브로서 동정되었다. KEAP1은 SB 및 SN KPA 분석에서 주요 허브로서 밝혀지지 않았고 AHR은 모든 3개의 단백질 반응성 그룹에 대해 동정된 유일한 주요 허브였다. NF-κB 서브유니트(RelB 또는 p52)는 MA 화학물질에서 제외하고는 모든 반응성 그룹에서 예측된 주요 허브였다.
요약하면, 관련 세포 주기 및 DNA 손상과 같이 화학적 노출 자체에 대한 통상의 기계론적 반응인 것으로 보이지만 상기 경로 분석 결과는 또한 상이한 화학물질 반응성 부류가 본원 발명자에 의해 조기에 관찰된 바와 같이[24] 그리고 다른 실험 시스템[14, 21, 62, 63]에서 고유한 신호 전달 경로를 유도한다. 여러 경로는 피부 감작화에서 관련된 것으로 공지된 프로세스에 연결되어 있다.
논의
감작화를 유도하는 노출된 피부 면적 당 화학물질의 양은 상당히 다양하고[41]; 따라서, 피부 감작제 효능 정도는 정확한 위험 평가를 위해 절대적이다. 대안적인 시험 방법의 개발자는 인간 감작화의 높은 예측성을 성취하기 위해 인간 임상 데이터에 의존하지만, 상기 유형의 데이터는 상당히 드물고, 대부분의 가용한 데이터는 LLNA로부터 유래된다[64]. 동물 모델이 피부 감작화와 같은 전신 질환의 복잡성을 반영한다는 사실에도 불구하고, 시험관내 데이터는 지금까지 잘 서로 관련되며, 특히 ITS에서 조합되는 경우 동물 모델보다 훨씬 더 양호한 성능을 나타내는 것으로 나타났다[65]. 추가로, 대안적인 시험 시스템은 전체 동물을 사용한 시험이 제공할 수 없는 기계론적 통찰력을 제공할 수 있다[66].
여기서, 피부 감작제 효능을 예측하기 위한 접근법은 수지상 세포(DC) 모델 및 전사 프로파일링을 기준으로 하는 CLP 시스템을 사용하여 제공된다. CLP 카테고리는 경험적으로 결정되고 선택적으로 정의된 카테고리이며, 이는 이들의 감작화 특징 또는 이의 부재에 관여하는 다양한 상이한 화학물질, 이들의 분자 특성 및 기작은 제공하지 않는다. 그러나, 이들은 입법이 현재 화학물질을 분류하고 표지화하기 위해 요구하는 것이다. 본원 발명자는 따라서 이들 새로운 데이터와 역대 데이터베이스를 조합하기 위해, 표준 GARD 검정에서 이전에 시험되지 않은 추가의 37개 화학물질을 조사하였다. 확립된 GARD 모델에 따른 이들 새로운 화학물질의 2진법 분류에서, 4개의 잘못분류된 감작화 화학물질은 벤치마크 샘플, 즉 아닐린, 벤조카인, 리모넨 및 부틸 글리시딜 에테르에 의해 정의된 바와 같은 컷-오프에 근접하였다. 이들 중 3개는 인간 효능 부류 4에 속하였고, 이는 모델 컷-오프가 흔히 효능과 잘 상호 관련되는 SVM 값을 정확한 분류로 해독하기 위해 매우 중요하다는 것을 보여준다. 역대 예측과 함께, GARD는 여전히 2진법 분류에 대하여 총 84%의 높은 정확도를 보여준다.
이어서 본원 발명자는 각각의 CLP 카테고리에 대한 무작위 포레스트 모델을 개발하기 위해 새로운 데이터 및 역대 데이터를 둘 다 사용하였고, 상기 카테고리는 (복제물 기준에 대한 수행능에 대해, 다수결에 기초하여, 표 7 참고) 카테고리 부재에 대해서는 96%, 카테고리 1A에 대하여 79%, 및 카테고리 1B에 대해서는 75%의 균형화된 정확도를 나타내었다[67]. 부틸 글리시딜 에테르, 디에틸 말레에이트, 염화시아누르산 및 라일랄은 잘못 분류되었고; 유일한 가음성 예측은 염화시아누르산에 대해 1A 대신에 카테고리 부재였다. 그러나, 염화시아누르산은 발열성으로 물과 반응하여 염화수소 및 다른 반응 산물을 형성한다. 아마도 (물을 함유하는) DMSO에 이미 존재하는 상기 가수분해 반응으로 인해, 검정 중에 존재하는 염화시아누르산 및 반응 산물의 양은 알려져 있지 않다. 이것은 화학적으로 GARD 플랫폼 기반 검정의 적용 도메인 외부에 속할 수 있다. 그러나, 품질 관리 또는 다른 예비 모델링 분석에서 어떠한 것도 이들 샘플의 제거를 동기부여하였다. 디에틸 말레에이트 및 라일랄은 CLP에 의해 1B로서 분류되었지만, 본원 발명의 모델에 의해서는 1A로서 분류되었고, 이는 다시 문헌 (Basketter et al.)에 기재된 바와 같이 이들의 인간 효능 카테고리, 카테고리 2에 더욱 맞는 것으로 보인다[41]. 또한 잘못 분류된 화학물질 부틸 글리시딜 에테르는 인간 효능 카테고리 3이다. 명백하게, 1B, 즉 약한 감작제를 예측하는 것은, 가장 힘든 부분으로 보인다. 또한 LLNA에서, 약한 감작제의 효능 예측은 강한 감작제의 효능보다 더욱 다양하다[8, 68, 69]. 추가로, LLNA EC3 농도 및 카테고리 1B에 요약된 화학물질과 관련된 인간 효능 카테고리 둘 다를 고려하면, 1B는 매우 이종성 그룹이다.
U-SENS™ 검정, 이전에 MUSST는 감작제 및 비-감작제를 구분하기 위해 또 다른 골수 세포주, U937 및 CD86 측정을 사용한다. 저자가 CLP 카테고리를 예측하기 위해 CD86을 세포독성 데이터와 특정 컷-오프 수준과 조합하는 경우, 82% (41/50)의 Cat. 1A 및 73% (85/116)의 Cat. 1B/No Cat의 정확한 예측이 보고되었다 [15]. 그러나, no cat과 1B를 어떻게 도전적으로 구분하는지는 명확하지 않다. Cottrez et al.[70]은 최근에 연구를 공개하였고, 여기서, 이들은 이들의 대안적인 검정 SENS-IS, 3D 재구성된 상피 기반 모델이 피부 감작제 효능의 예측을 매우 잘 수행하지만 이들은 CLP 카테고리는 표적화하지 않는 것으로 보고하였다. 도 4로부터 판단하면, 순수하게 CLP 카테고리를 예측하기 위해 정의된 52개 변수 도입을 기준으로 할 때, 또한 본원 발명자의 모델은 인간 효능 분류와 관련된 정보를 포함하는 것으로 보인다. 일단 더 많은 화학물질이 인간 효능 분류를 받는 경우, GARD 플랫폼을 기준으로 인간 효능 모델을 순조롭게 개발할 수 있어야 할 것이다.
KPA 경로 분석은 조절된 여러 경로가 피부 감작화에서 공지된 역할, 예를 들어, 사이토카인 신호 전달 및 산화 스트레스 반응을 함에 따라, 제공된 데이터 세트에서 생물학적 관련 반응을 동정하였다(도 5-6). DC는 생체내 단백질 변형을 위한 1차 표적이 아니지만, 본원 발명자는 상이한 단백질 반응성 부류가 차등적으로 DC 전사체에 영향을 미침을 추정하였다. 단백질 반응성은 특정 한계와 함께 이들의 피부 감작화 능력 및 효능을 한정하는 화학물질의 가장 중요한 특성 중 하나이다[63]. 단백질 반응성-특이적 패턴은 반응성 그룹 MA, SB, 및 SN에 의해 유도된 가장 유의적으로 조절된 유전자들의 비교에 의해 밝혀진 바와 같이 검출가능하였다. 흥미롭게도, NF-κB 서브유니트는 MA 화학물질을 제외한 모든 반응성 그룹에 대해 예측된 주요 허브이고, 이는 상기 유형의 화학물질의 NF-κB 신호전달에 대해 기재된 억제 효과를 반영할 수 있다[71]. 일부 경로가 예를 들어, "유방암에서 에스트라디올/ESR1 (핵)의 유사분열촉진 작용"과 같은 상기 기재 사항에 맞는 것으로 보이지 않지만, 조절된 분자에서 상세한 관찰은 상기 사항이 또한 확실히 다른 경로를 위해 적절한 것을 밝혔다. 이 경우에, 예를 들어, p21, c-myc, E2F1, SGOL2 (슈고신 2), 및 CAD (카바모일 포스페이트 합성효소)가 관여하고 이 중에 첫번째 하나는 공지된 세포 주기 조절인자/전사 인자[72]이고 염색체 분리(SGOL2)에서 역할을 수행한다[73]. 한편 피리미딘 뉴클레오타이드의 생합성에서 율속 효소인 CAD는 보다 최근에 또한 세포 신호전달 경로[74]와 연루되었고 인간 장 상피 세포에서 세균 센서 NOD2(뉴클레오타이드-결합 올리고머화 도메인 12) 항세균 기능을 억제하는 것으로 보인다[75]. 이들 예는 본원의 전사체 데이터가 추가의 주의 및 보다 상세한 분석을 받을 가치가 있다는 것을 설명할 수 있고, 상이한 생물정보 도구를 사용하는 상기 유형의 분석 및 최종적으로 기능 분석은 생물학적 프로세스 및 질환에 바탕이 되는 기작을 해명하는데 기여할 수 있다.
상기 이미 논의된 바와 같이, 올바른 효능 부류를 약하거나 중간 정도의 효능을 갖는 화학물질로 할당하는 것은 보다 일반적인 문제인 것으로 보인다. Benigni et al.[76]은 실험 생체내 시스템도 일반적으로 인간 데이터와 잘 상호관련된 것이라도 중간 효능의 감작제에 대해서는 매우 적게 수행함을 보여주는 데이터를 제공하였다. 이들은 추가로 단백질 변형 단계가 전체 감작화 프로세스의 율속 단계이고 다른 AOP 반응을 표적화하는 시험관내 시험은 많은 정보를 부가하지 않음을 주장한다. 한편, LLNA에서 모델 펩타이드와의 동적 프로파일링에 의해 결정된 바와 같은 MA 감작제의 속도 상수와 이들의 효능 간에 단지 약한 관계가 있다[71]. 이것은 반응성과 함께 증가하는 NF-κB 신호 전달을 억제함에 의해 MA 화학물질의 항-염증 효과와 연계되는 것으로 기재되었다. 그러나, 피부 감작화 AOP에서 주요 반응을 고려하여, 이와 같은 감작화 프로세스는 연속체로서 이해될 수 있고 따라서 단리된 반응만으로는 특징 분석되지 않는다. 물론, 실제로 상기 프로세스는 피부 침투 화학물질로 개시해야만 한다. 이와 관련하여, 각질층을 효율적으로 침투하는 화학물질의 능력이 이의 피부 감작화 능력 및 효능에 중요하다는 개념은 최근에 잘못된 것으로 입증되었음을 주지해야 한다[77]. 추가로, 피부 층을 저하시키기 위한 접근은 실제로 예를 들어, 습윤 작업 및 작은 상처로 인해 손상된 피부 장벽 기능에 의해 큭 촉진될 수 있다. 흥미롭게도, 많은 강한 감작제는 자극 성질을 소유하고 이는 세포독성과 상호관련되고 이어서 세포독성은 감작제 효능에 기여하는 것으로 보이고[18], 이는 또한 본원의 데이터세트에 반영된다(데이터는 나타내지 않음). 세포독성은 또한 화학물질의 단백질 반응성과 관련된다: 강하게 시스테인-반응성인 화학물질은 일반적으로 세포독성이고 따라서 주요 효소 기능을 차단할 수 있다[18, 78]. 동시에, 자극 효과는 세포외 ATP 또는 하이알루론산 분해 산물과 같은 위험 신호를 생성할 수 있고[79, 80], 이는 DC를 활성화시켜 결과적으로 순수 T 세포를 프라이밍하는 작용을 할 수 있다. 추가로, 알레르기 감작화에 확실히 역할을 수행하는 기존의 염증 및 다른 물질로의 동시-노출과 같은 다른 인자는 임의의 시험 시스템에서 수행하기 어려울 수 있다. 시험관내 검정은 추가로 수행하기 저렴하고 용이한 요구에 직면하기 때문에 시험관내에서 성취될 수 있는 것이 명백히 제한적이지만 지금까지의 시험 수행능은 매우 고무적이다[76]. 단백질 반응성이 매우 중요할 수 있지만, 세포 기반 시스템은 펩타이드 반응성에 더하여 특정 추가의 반응을 총괄할 수 있어야 한다. 대안적인 검정 수행능은 피부 감작화의 보다 기계론적 세부사항이 밝혀짐에 따라 추가로 개선될 가능성이 높을 수 있고, 이는 적용성 도메인 및 함정 둘 다를 보다 용이하게 동정할 수 있게 한다.
결론적으로, 본원 발명자는 현재 법안에 의해 요구되는 바와 같이 피부 감작화 화합물의 CLP 그룹으로의 분류를 위한 52개 전사체를 포함하는 예측 바이오마커를 동정하였다. 18개 독립적 시험 화합물로 챌린지하는 경우, 상기 검정은 효능 예측 70%에 대한 정확한 결과를 제공하였다. 추가로 11/12 감작제를 올바르게 동정하였고, 이는 이것이 차라리 보존적이어서, 즉 가음성 예측을 회피함을 나타낸다. 제공된 바이오마커 시그니처는 효능 예측을 위해 최적화되고 또한 2진법 위험 분류를 위해 최적화되기 때문에, 본원 발명자는 [18]에 의해 제안된 바와 유사한 정확한 효능 예측을 위한 통합 시험 전략 내에 본원의 모델에 대한 가능한 적용을 제안한다. 추가로, 상기 결과는 GARD 셋업의 유연성 및 다재다능성을 효과적으로 설명한다. 세포의 완전한 전사체를 측정하는 거슨 감작화의 경로를 동정하기 위한 것 뿐만 아니라 본원 발명자가 이전에 또한 2진법 피부 감작화 예측 및 호흡 감작화를 위해 보여준 예측 바이오마커 시그니처를 동정하기 위한 작용 방식 기반 연구를 수행할 기회를 제공한다. 따라서, 본원 발명자는 보다 많은 샘플이 분석되고 보다 정확한 인간 참조 데이터가 생성됨에 따라 변형되고 개선될 수 있는, CLP 그룹을 표적화하는 효능 모델 개념의 초기 증거를 제공한다.
참조문헌
실시예
1
도입
이전 연구를 기준으로, 본원 발명자는 GARD 검정이 피부 감작제 효능을 예측할 수 있음을 추정하였다. 2개의 접근법이 효능 예측 모델을 개발하기 위해 병행하여 추진되었다. 2진법 분류를 제공하도록 연습된 본원 발명의 확립된 지지체 벡터 기계(Support Vector Machine, SVM)를 사용한다[1-3]. 다른 접근법은 잠복 구조(O-PLS) 선형 회귀 모델로의 직교부분최소제곱 프로젝션(orthogonal partial least square projection)을 기준으로 한다(Simca, Umetrics, Sweden). O-PLS[5]는 원칙적 성분 분석과 관련된 프로젝션 방법이고, 따라서 전체 게놈 RNA 마이크로어레이 데이터(> 29,000개 전사체)의 경우에서와 같이, 관찰된 것 (또는 샘플)보다 더 많은 변수를 갖는 매트릭스에 잘 맞다. 이것은 매트릭스 X에서의 구조화된 가변성을 (Y와 상호 관련된) 예측 정보 및 (Y와 상호 관련되지 않은) 직교 정보로 나누고, 이에 잔여 변동분(variation)을 더해주도록 디자인된 PLS 방법(Wold, 1975)의 변형이다. 이것은 잠복 변수(본래의 변수의 선형 조합)의 해석력을 개선시킬 수 있다.
결과
34개 화학물질 및 대조군 세트에 대한 GARD SVM 결정값과 인간 효능 부류 간의 관계는 도 9에서 설명된다. SVM 모델은 2진법 분류(감작제 대 비-감작제)를 위해 개발되었다.
본원 발명자는 Simca 소프트웨어를 사용하는 다변량 접근법으로 여러 모델을 조사하였다. 인간 효능[6]은 부분적으로 화학적으로 매우 상이한 물질들을 하나의 효능 카테고리로 조합하는 사용가능한 인간 데이터에 기반한 화학물질의 분류 결과로서, 이에 의하면 부류 1은 최고 효능을 나타내고, 부류 6은 진정한 비-감작제를 나타낸다.
여기서, 본원 발명자는 2개의 Y, 즉 인간 효능 및 민감화제/비-민감화제를 예측하도록 디자인된 O-PLS 모델을 제공한다. 도 10에서 산점도(scatter plot)는 감작제와 비-감작제의 분리, 및 제2 축에 따른 감작제를 고-효능 및 저-효능 클러스터로 분류하는 것(grouping)을 설명한다.
교차-검증(Q2cum) 후 상기 모델에 의해 설명될 수 있는 총 변수의 분율은 0.478이었으며, 이는 허용될 수 있고/양호한 것으로 간주되는 값이다. 순열 Y-관측(도 11)에 의한 여러 모델들의 보정에 대한 각각의 본래 모델의 보정(fit) 및 예측의 양호함을 비교한 결과, 본래의 모델이 명확함을 강하게 나타내었다. Y관찰 대 Y예측은 도 12에서 플롯팅되었다.
논의
본원의 분석에서 본원 발명자는 본원의 마이크로어레이 데이터와 인간 효능 간의 명백한 관계를 알았다. 추가의 모델 개발은 계속 진행중이고, 수행능은 시험된 화학물질의 수 및 유형과 함께 개선될 것으로 예상된다. 본원 발명자는 또한 특성 선택 도구로서 다변량 분석 방법을 조사하였는데, 이는 궁극적으로 민감화제 효능과 관련된 기작에 대한 새로운 통찰력을 유도하고, 높은 정확도로 화학물질의 인간 효능의 예측할 수 있는 개선시키는 수단을 제공할 수 있다.
실시예 1 참조문헌
실시예
2
도입
이전 연구를 기준으로, 본원 발명자는 GARD 검정이 피부 감작제 효능을 예측할 수 있음을 추정하였다. 2개의 접근법이 효능 예측 모델을 개발하기 위해 병행하여 추구되었다. 2진법 분류를 제공하도록 연습된 본원의 확립된 지지체 벡터 기계(SVM)를 사용하여[1-3], 도 9에 도시된 바와 같이 34개 화학물질 및 대조군 세트에 대한 GARD SVM 결정값과 인간 효능 부류[4]가 상호관련됨을 보여준다. SVM 모델은 2진법 분류(감작제 대 비-감작제)를 위해 개발되었다.
다른 접근법은 결정-트리-기반 방법인 무작위 포레스트(RF) 모델링을 기반으로 하는데, 이는 관찰된 것보다 더 많은 변수를 갖는 데이터 세트에 대해 잘 맞다. 이것은 변수가 정돈되지 않은(nosy) (요구되는 예비-선택이 없음) 경우에도 양호한 예측 수행능을 산출하고, 변수 중요성을 복귀시킨다[5].
결과
화학물질의 감작화 효능과 관련하여, 유럽 화학물질 기관(European Chemical Agency, ECHA)은 이하의 것들로 이루어진 화학물질 및 혼합물(CLP)의 분류, 표지화 및 패키징에 대한 규정(EC) 번호 1272/2008에 따른 카테고리화를 제안한다: 1A(강한 감작제), 1B(약한 감작제) 및 카테고리 부재(비-감작제)[7]. 여기서, 본원 발명자는 공급된 .632+ 부트스트랩(bootstrap) 방법에 의해 평가된 오류율을 갖는 R/바이오컨덕터 버젼 3.1.2의 무작위 포레스트 varSe1RF 팩키지[6]를 사용하여, 연습 데이터 내의 복제물로부터의 전사 강도의 산술적 평균 상에 구축된 RF 모델을 제공한다. 이것은 또한 직접적으로 복제물의 전사 강도로부터 구축될 수도 있다. 모델은 표 9에 기재된 연습 세트(70개 물질)를 사용하여 연습된 후, 표 10에서 시험 세트(18개 물질)에 대해 시도되었다. 모델 수행능의 요약은 표 11에 제공된다. 도 13은 기재된 무작위 포레스트 모델의 원칙적 성분 분석 및 히트 맵 결과를 포함한다. 동정된 효능 바이오마커들의 목록은 표 12에 제공된다.
논의
본원의 분석에서, 본원 발명자는 인간 효능 및 CLP 둘 다를 포함하는, 본원의 마이크로어레이 데이터 및 효능 정보 간의 명백한 관계를 알았다. 특성 선택 도구로서 다변량 분석 방법을 사용하여, 감작제 효능과 연관된 기작으로의 새로운 통찰력을 얻었다. 추가로, 이것은 높은 정확도로 화학물질의 민감화제 효능의 예측을 가능하게 할 수 있다.
실시예 2 참조문헌
표 A
| 전사체 클러스터 ID | VCF ( % ) | 유전자 명칭 | 유전자 기호 |
유전자
수탁번호 |
| 표 A(i) | ||||
| 8117594 | 93 | 히스톤 클러스터 1, H2bm | HIST1H2BM | NM_003521 |
| 8124385 | 86 | 히스톤 클러스터 1, H4b | HIST1H4B | NM_003544 |
| 8124430 | 81 | 히스톤 클러스터 1, H1d | HIST1H1D | NM_005320 |
| 8095221 | 80 | 포스포리보실아미노이미다졸 카르복실라제, 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카복사미드 합성효소 | PAICS | NM_001079524 |
| 8124413 | 69 | 히스톤 클러스터 1, H4d | HIST1H4D | NM_003539 |
| 8117608 | 56 | 히스톤 클러스터 1, H2al///히스톤 클러스터 1, H2bn | HIST1H2AL/// HIST1H2BN | NM_003511 |
| 7994109 | 51 | 폴로-유사 키나제 1 | PLK1 | NM_005030 |
| 7904433 | 44 | 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 | PHGDH | ENST00000369407 |
| 8082350 | 44 | 미니염색체 유지 복합체 성분 2 | MCM2 | NM_004526 |
| 8141395 | 43 | 미니염색체 유지 복합체 성분 7 | MCM7 | NM_001278595 |
| 7903893 | 41 | CD53 분자 | CD53 | NM_000560 |
| 8118669 | 41 | 키네신 패밀리 구성원 C1 | KIFC1 | NM_002263 |
| 7938348 | 40 | WEE1 G2 체크포인트 키나제 | WEE1 | NM_001143976 |
| 7957737 | 34 | 티모포이에틴 | TMPO | NM_001032283 |
| 8146357 | 34 | 미니염색체 유지 복합체 성분 4 | MCM4 | NM_005914 |
| 7918300 | 33 | 프롤린/세린-풍부 코일드-코일(coiled-coil) 1 | PSRC1 | NM_001005290 |
| 8054329 | 31 | 링 핑거(ring finger) 단백질 149 | RNF149 | NM_173647 |
| 8055426 | 31 | 미니염색체 유지 복합체 성분 6 | MCM6 | NM_005915 |
| 8072687 | 29 | 미니염색체 유지 복합체 성분 5 | MCM5 | NM_006739 |
| 8003503 | 20 | 판코니 빈혈 보충 그룹 A | FANCA | NM_000135 |
| 표 A(ⅱ) | ||||
| 8040843 | 44 | 카바모일-포스페이트 합성효소 2, 아스파르테이트 트랜스카바밀라제, 및 디하이드로오로타제 | CAD | NM_004341 |
| 7898549 | 42 | MRT4 동족체, 리보솜 성숙화 인자 | MRTO4 | NM_016183 |
| 7901091 | 41 | EGR1의 표적, 구성원 1 (핵) | TOE1 | NM_025077 |
| 7900699 | 40 | 세포 분열 주기 20 | CDC20 | NM_001255 |
| 8121087 | 36 | 펩티다제 M20 도메인 함유 2 | PM20D2 | NM_00101085 |
| 8084630 | 35 | NmrA-유사 패밀리 도메인 함유 1 가유전자(pseudogene) | LOC344887 | NR_033752 |
| 7958455 | 30 | 우라실 DNA 글리코실라제 | UNG | NM_003362 |
| 8119088 | 27 | 사이클린-의존성 키나제 저해제 1A (p21, Cip1) | CDKN1A | NM_000389 |
| 8117395 | 26 | 히스톤 클러스터 1, H2bf | HIST1H2BF | NM_003522 |
| 8124527 | 25 | 히스톤 클러스터 1, H1b | HIST1H1B | NM_005322 |
| 7896697 | 21 | 미공지됨 | 미공지됨 | 미공지됨 |
| 8097417 | 20 | 제이드(Jade) 패밀리 PHD 핑거 1 |
JADE1 | NM_001287441 |
| 7977445 | 18 | KIAA0125 | KIAA0125 | NR_026800 |
| 7985213 | 17 | 콜린성 수용체, 니코틴 알파 5 |
CHRNA5 | NM_000745 |
| 8068478 | 17 | 염색질 어셈블리 인자 1, 서브유니트 B (p60)///MORC 패밀리 CW-유사 아연 핑거 3 | CHAF1B /// MORC3 | NM_005441 |
| 8099721 | 16 | lin-12-유사 3 (C. elegance)의 sel-1 억제자 | SEL1L3 | NM_015187 |
| 7948192 | 14 | 구조 특이적 인지 단백질 1 | SSRP1 | NM_003146 |
| 7960340 | 14 | 포크헤드(Forkhead) 박스 M1 | FOXM1 | NM_001243088 |
| 8107706 | 14 | 라민 B1 | LMNB1 | NM_001198557 |
| 8124524 | 14 | 히스톤 클러스터 1, H2ak | HIST1H2AK | NM_003510 |
| 8040712 | 11 | 센트로미어 단백질 A | CENPA | NM_001042426 |
| 8043602 | 10 | 비-SMC 콘덴신 I 복합체 서브유니트 H | NCAPH | NM_001281710 |
| 8124394 | 7 | 히스톤 클러스터 1, H2bb | HIST1H2BB | NM_021062 |
| 8144931 | 7 | ATPase, H+ 수송, 리소좀 56/58kDa, V1 서브유니트 B2 | ATP6V1B2 | NM_001693 |
| 7999025 | 5 | TNF 수용체-연관 단백질 1 | TRAP1 | NM_001272049 |
| 표 A(ⅲ) | ||||
| 8004804 | 83 | 포스포리보실포밀글리신아미딘 합성효소 | PFAS | NM_012393 |
| 8005839 | 63 | 막관통 단백질 97 | TMEM97 | NM_014573 |
| 7916432 | 61 | 24-데하이드로콜레스테롤 환원효소 | DHCR24 | NM_014762 |
| 7948656 | 30 | 페리틴(Ferritin), 중쇄(heavy) 폴리펩타이드 1 | FTH1 | NM_002032 |
| 8117408 | 30 | 히스톤 클러스터 1, H2ae | HIST1H2AE | NM_021052 |
| 8002303 | 17 | NAD(P)H 데하이드로게나제, 퀴논 1 | NQO1 | NM_000903 |
| 7939341 | 8 | CD44 분자 (인도인 혈액 그룹) | CD44 | NM_000610 |
표 1. 기존 GARD 데이터를 보충하기 위해 사용되는 CLP 주석을 포함하는 37개 신규 화학물질. S= 감작제, NS=비-감작제
| 명칭 | CAS# | CLP | 세포 독성 | GARD 유입량 [M] | 2진법 부류 (HP*) | GARD 2진법 예측 |
| 2,4-디니트로플루오로벤젠 | 70-34-8 | 1A | 예 | 0.00001 | S | S |
| 3-메틸카테콜 | 488-17-5 | 1A | 예 | 0.00004 | S | S |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 1675-54-3 | 1A | 예 | 0.00005 | S | S |
| 클로르프로마진 | 50-53-3 | 1A | 예 | 0.0000125 | S | S |
| 염화시아누르산 | 108-77-0 | 1A | 예 | 0.00005 | S | NS |
| 글루타르알데하이드 | 111-30-8 | 1A | 예 | 0.00002 | S | S |
| 헥실 살리실레이트 | 6259-76-3 | 1A | 예 | 0.00007 | S | S |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 55406-53-6 | 1A | 예 | 0.00001 | S | S |
| 메틸 헵틴 카보네이트 | 111-12-6 | 1A | 예 | 0.0001 | S | S |
| p-벤조퀴논 | 106-51-4 | 1A | 예 | 0.00005 | S | S |
| 프로필 갈레이트 | 121-79-9 | 1A | 예 | 0.000125 | S | S |
| 아비에트산 | 514-10-3 | 1B | 아니오 | 0.000125 | S | S |
| 아밀신나밀 알콜 | 101-85-9 | 1B | 예 | 0.0003 | S | S |
| 아네톨 | 104-46-1 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | S |
| 아닐린 | 62-53-3 | 1B | 아니오 | 0.0005 | S | NS |
| 아니실 알콜 | 105-13-5 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 벤조카인 | 94-09-7 | 1B | 아니오 | 0.0005 | S | NS |
| 벤질 벤조에이트 | 120-51-4 | 1B | 예 | 0.0003 | NS | S |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 2426-08-6 | 1B | 예 | 0.0005 | S | NS |
| 시트랄 | 5392-40-5 | 1B | 예 | 0.0000625 | S | S |
| 시트로넬롤 | 106-22-9 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | S |
| 디에탄올아민 | 111-42-2 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 이미다졸리디닐 우레아 | 39236-46-9 | 1B | 예 | 0.00005 | S | S |
| 이소프로필 미리스테이트 | 110-27-0 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 릴리알 | 80-54-6 | 1B | 예 | 0.0001875 | S | S |
| 리모넨 | 5989-27-5 | 1B | 아니오 | 0.0005 | S | NS |
| 리날룰 | 78-70-6 | 1B | 아니오 | 0.0005 | S | NS |
| 라이랄 | 31906-04-4 | 1B | 예 | 0.0001 | S | S |
| 펜타클로로페놀 | 87-86-5 | 1B | 아니오 | 0.0000625 | NS | NS |
| 피리딘 | 110-86-1 | 1B | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 1-브로모부탄 | 109-65-9 | no cat | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 벤조산 | 65-85-0 | no cat | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 벤질 알콜 | 100-51-6 | no cat | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 시트르산 | 77-92-9 | no cat | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
| 덱스트란 | 9004-54-0 | no cat | 아니오 | 0.00003 | NS | NS |
| 카나마이신 A | 25389-94-0 | no cat | 아니오 | 0.000125 | NS | NS |
| 타르타르산 | 87-69-4 | no cat | 아니오 | 0.0005 | NS | NS |
*사용가능한 경우 [41]을 기준으로; HP 1-4=S; 5-6=NS. 다르게는 CLP에 따름. 또한 표 4도 참조한다.
표 2. 11개 벤치마크 화학물질
| 화학물질 | CAS# | CLP | 2진법 부류 | HP | GARD 유입량 [M] |
| 2,4-디니트로클로로벤젠 | 97-00-7 | 1A | 센스 | 1 | 0.000004 |
| p-페닐렌디아민 | 106-50-3 | 1A | 센스 | 1 | 0.000075 |
| 2-하이드록시에틸 아크릴레이트 |
818-61-1 | 1A | 센스 | na | 0.0001 |
| 2-니트로-1,4-페닐렌디아민 | 5307-14-2 | 1A | 센스 | 2 | 0.0003 |
| 2-아미노페놀 | 95-55-6 | 1A | 센스 | 2 | 0.0001 |
| 레조르시놀 | 108-46-3 | 1B | 센스 | 4 | 0.0005 |
| 게라니올 | 106-24-1 | 1B | 센스 | 4 | 0.0005 |
| 헥실신남산 알데하이드 | 101-86-0 | 1B | 센스 | 5 | 0.000032 |
| 벤즈알데하이드* | 100-52-7 | no cat | 비-센스 | 5 | 0.00025 |
| 클로로벤젠 | 108-90-7 | no cat | 비-센스 | 6 | 0.000098 |
| 1-부탄올 | 71-36-3 | no cat | 비-센스 | 6 | 0.0005 |
* [41]에 따라 비-센스
표 3. 연습 및 시험 세트 조성물
| 총 수 | CLP 1A | CLP 1B | CLP no cat | |
| 연습 세트 | 70 | 23 | 25 | 22 |
| 시험 세트 | 18 | 6 | 6 | 6 |
표 4. CLP 카테고리의 예측을 위한 무작위 포레스트 모델을 연습 및 시험하기 위해 사용되는 대조군 및 86개의 고유 화학물질.
| 시뮬레이션 | HP | CLP | 2진법 부류 | 세트 | 톡스트리 단백질 결합 부류 |
| 1-브로모부탄 | na | no cat | 비-센스 | 시험 | SN2 |
| 아네톨 | 5 | 1B | 센스 | 시험 | MA |
| 벤조산 | na | no cat | 비-센스 | 시험 | 결합 무 |
| 벤질 벤조에이트 | 5 | 1B | 센스 | 시험 | AT |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 3 | 1A | 센스 | 시험 | SN2 |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 3 | 1B | 센스 | 시험 | SN2 |
| 시트르산 | na | no cat | 비-센스 | 시험 | 결합 무 |
| 염화시아누르산 | na | 1A | 센스 | 시험 | SNAr |
| 디에틸 말레에이트 | 2 | 1B | 센스 | 시험 | MA |
| 디에틸 프탈레이트 | 6 | no cat | 비-센스 | 시험 | 결합 무 |
| 에틸 바닐린 | nf | no cat | 비-센스 | 시험 | SB |
| 글루타르알데하이드 | 2 | 1A | 센스 | 시험 | SB |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 4 | 1A | 센스 | 시험 | AT |
| 리날룰 | 4 | 1B | 센스 | 시험 | 결합 무 |
| 라일랄 | 2 | 1B | 센스 | 시험 | SB |
| p-벤조퀴논 | na | 1A | 센스 | 시험 | MA |
| 프로필 갈레이트 | 2 | 1A | 센스 | 시험 | MA |
| 자일렌1 | 6 | no cat | 비-센스 | 시험 | 결합 무 |
| 1-부탄올 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 2,4-디니트로클로로벤젠 | 1 | 1A | 센스 | 연습 | SNAr |
| 2,4-디니트로플루오로벤젠 | na | 1A | 센스 | 연습 | SNAr |
| 2-아미노페놀 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 2-하이드록시에틸 아크릴레이트 | 3 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 2-머캅토벤조티아졸 | 3 | 1A | 센스 | 연습 | AT |
| 2-니트로-1,4-페닐렌디아민 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 3-메틸카테콜 | na | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 4-메틸아미노페놀 설페이트 | 3 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 4-니트로벤질브로마이드 | na | 1A | 센스 | 연습 | SN2 |
| 아비에트산 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 아밀신나밀 알콜 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | MA |
| 아닐린 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 아니실 알콜 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | MA/SN2 |
| 벤즈알데하이드2 | 5 | no cat | 비-센스 | 연습 | SB |
| 벤조카인 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 벤질 알콜 | na | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 클로로아닐린 | na | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 클로로벤젠 | na | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 클로르프로마진 | 3 | 1A | 센스 | 연습 | SB |
| 신남알데하이드 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 신나밀 알콜 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | MA |
| 시트랄 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| 시트로넬롤 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 덱스트란 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | SB |
| 디에탄올아민 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 디메틸 포름아미드 | nf | no cat | 비-센스 | 연습 | nf |
| 디메틸 설폭사이드3 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 디페닐사이클로프로페논 | 1 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 에틸렌디아민 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| 유게놀 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | MA |
| 포름알데하이드 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | SB |
| 게라니올 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| 글리세롤 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 글리옥살 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 헥산 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 헥실 살리실레이트 | 4 | 1A | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 헥실신남산 알데하이드 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | MA |
| 하이드로퀴논 | 3 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 하이드록시시트로넬랄 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| 이미다졸리디닐 우레아 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | AT |
| 이소유게놀 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 이소프로판올 | 5 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 이소프로필 미리스테이트 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 카나마이신 A | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 카톤 CG | 1 | 1A | 센스 | 연습 | nf |
| 락트산 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 라우릴 갈레이트 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 릴리알 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| 리모넨 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 메틸 헵틴 카보네이트 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 메틸 살리실레이트 | 5 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 메틸디브로모 글루타로니트릴 | 2 | 1A | 센스 | 연습 | MA/SN2 |
| 옥탄산 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 펜타클로로페놀 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | SNAr |
| 페놀 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 페닐 벤조에이트 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | AT |
| 페닐아세트알데하이드 | na | 1B | 센스 | 연습 | SB |
| p-하이드록시벤조산 | nf | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 중크롬산칼륨 | 1 | 1A | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 과망간산칼륨 | nf | no cat | 비-센스 | 연습 | nf |
| p-페닐렌디아민 | 1 | 1A | 센스 | 연습 | MA |
| 피리딘 | 5 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 레조르시놀 | 4 | 1B | 센스 | 연습 | MA |
| 살리실산 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 소듐 도데실 설페이트4 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | SN2 |
| 타르타르산 | na | no cat | 비-센스 | 연습 | 결합 무 |
| 테트라메틸티루암 디설파이드 | 3 | 1B | 센스 | 연습 | 결합 무 |
| 트윈 80 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | na |
| 비자극 | 6 | no cat | 비-센스 | 연습 | nf |
HP-인간 효능; 1,3,4 비-센스 Basketter et al.; 2 민감성 프로젝트에 따른 비-센스[81]. MA-마이클 수용체; SB-쉬프 염기 형성; AT-아실 전달제; SN2-이분자 친핵성 치환; SNAr-친핵성 방향족 치환; na-가용하지 않음; nf-발견되지 않음.
표 5. CLP 분류를 위해 최적인 것으로서 무작위 포레스트 모델링에 의해 동정된 52개 변수. VCF=변수 콜 빈도
| 전사체 클러스터 ID | VCF ( % ) | 유전자 명칭 | 유전자 기호 |
| 8117594 | 93 | 히스톤 클러스터 1, H2bm | HIST1H2BM |
| 8124385 | 86 | 히스톤 클러스터 1, H4b | HIST1H4B |
| 8004804 | 83 | 포스포리보실포밀글리신아미딘 합성효소 | PFAS |
| 8124430 | 81 | 히스톤 클러스터 1, H1d | HIST1H1D |
| 8095221 | 80 | 포스포리보실아미노이미다졸 카르복실라제, 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카복사미드 합성효소 | PAICS |
| 8124413 | 69 | 히스톤 클러스터 1, H4d | HIST1H4D |
| 8005839 | 63 | 막관통 단백질 97 | TMEM97 |
| 7916432 | 61 | 24-데하이드로콜레스테롤 환원효소 | DHCR24 |
| 8117608 | 56 | 히스톤 클러스터 1, H2al///히스톤 클러스터 1, H2bn | HIST1H2AL/// HIST1H2BN |
| 7994109 | 51 | 폴로-유사 키나제 1 | PLK1 |
| 7904433 | 44 | 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 | PHGDH |
| 8040843 | 44 | 카바모일-포스페이트 합성효소 2, 아스파르테이트 트랜스카바밀라제, 및 디하이드로오로타제 | CAD |
| 8082350 | 44 | 미니염색체 유지 복합체 성분 2 | MCM2 |
| 8141395 | 43 | 미니염색체 유지 복합체 성분 7 | MCM7 |
| 7898549 | 42 | MRT4 동족체, 리보솜 성숙화 인자 | MRTO4 |
| 7901091 | 41 | EGR1의 표적, 구성원 1 (핵) | TOE1 |
| 7903893 | 41 | CD53 분자 | CD53 |
| 8118669 | 41 | 키네신 패밀리 구성원 C1 | KIFC1 |
| 7900699 | 40 | 세포 분열 주기 20 | CDC20 |
| 7938348 | 40 | WEE1 G2 체크포인트 키나제 | WEE1 |
| 8121087 | 36 | 펩티다제 M20 도메인 함유 2 | PM20D2 |
| 8084630 | 35 | NmrA-유사 패밀리 도메인 함유 1 가유전자 | LOC344887 |
| 7957737 | 34 | 티모포이에틴 | TMPO |
| 8146357 | 34 | 미니염색체 유지 복합체 성분 4 | MCM4 |
| 7918300 | 33 | 프롤린/세린-풍부 코일드-코일 1 | PSRC1 |
| 8054329 | 31 | 링 핑거 단백질 149 | RNF149 |
| 8055426 | 31 | 미니염색체 유지 복합체 성분 6 | MCM6 |
| 7948656 | 30 | 페리틴, 중쇄 폴리펩타이드 1 | FTH1 |
| 7958455 | 30 | 우라실 DNA 글리코실라제 | UNG |
| 8117408 | 30 | 히스톤 클러스터 1, H2ae | HIST1H2AE |
| 8072687 | 29 | 미니염색체 유지 복합체 성분 5 | MCM5 |
| 8119088 | 27 | 사이클린-의존성 키나제 저해제 1A (p21, Cip1) | CDKN1A |
| 8117395 | 26 | 히스톤 클러스터 1, H2bf | HIST1H2BF |
| 8124527 | 25 | 히스톤 클러스터 1, H1b | HIST1H1B |
| 7896697 | 21 | --- | --- |
| 8003503 | 20 | 판코니 빈혈 보충 그룹 A | FANCA |
| 8097417 | 20 | 제이드 패밀리 PHD 핑거 1 | JADE1 |
| 7977445 | 18 | KIAA0125 | KIAA0125 |
| 7985213 | 17 | 콜린성 수용체, 니코틴 알파 5 | CHRNA5 |
| 8002303 | 17 | NAD(P)H 데하이드로게나제, 퀴논 1 | NQO1 |
| 8068478 | 17 | 염색질 어셈블리 인자 1, 서브유니트 B (p60)///MORC 패밀리 CW-유사 아연 핑거 3 | CHAF1B /// MORC3 |
| 8099721 | 16 | lin-12-유사 3 (C. elegance)의 sel-1 억제자 | SEL1L3 |
| 7948192 | 14 | 구조 특이적 인지 단백질 1 | SSRP1 |
| 7960340 | 14 | 포크헤드 박스 M1 | FOXM1 |
| 8107706 | 14 | 라민 B1 | LMNB1 |
| 8124524 | 14 | 히스톤 클러스터 1, H2ak | HIST1H2AK |
| 8040712 | 11 | 센트로미어 단백질 A | CENPA |
| 8043602 | 10 | 비-SMC 콘덴신 I 복합체 서브유니트 H | NCAPH |
| 7939341 | 8 | CD44 분자 (인도인 혈액 그룹) | CD44 |
| 8124394 | 7 | 히스톤 클러스터 1, H2bb | HIST1H2BB |
| 8144931 | 7 | ATPase, H+ 수송, 리소좀 56/58kDa, V1 서브유니트 B2 | ATP6V1B2 |
| 7999025 | 5 | TNF 수용체-연관 단백질 1 | TRAP1 |
표 6. 다수결을 사용한 시험 세트 예측.
| 화학물질 | 진정한 CLP | GARD 예측된 CLP |
인간 효능
[41] |
단백질 반응성 |
| 1-브로모부탄 | no cat | no cat | na | SN2 |
| 벤조산 | no cat | no cat | na | 결합 무 |
| 시트르산 | no cat | no cat | na | 결합 무 |
| 디에틸 프탈레이트 | no cat | no cat | 6 | 결합 무 |
| 에틸 바닐린 | no cat | no cat | nf | 쉬프 염기 형성 |
| 자일렌 | no cat | no cat | 6 | 결합 무 |
| 아네톨 | 1B | 1B | 5 | 마이클 수용체 |
| 벤질 벤조에이트 | 1B | 1B | 5 | 아실 전달제 |
| 리날룰 | 1B | 1B | 4 | 결합 무 |
| 라일랄 | 1B | 1A | 2 | 쉬프 염기 형성 |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 1B | 1A | 3 | SN2 |
| 디에틸 말레에이트 | 1B | 1A | 2 | 마이클 수용체 |
| 염화시아누르산 | 1A | no cat | na | SNAr |
| 프로필 갈레이트 | 1A | 1A | 2 | 마이클 수용체 |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 1A | 1A | 3 | SN2 |
| 글루타르알데하이드 | 1A | 1A | 2 | 쉬프 염기 형성 |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 1A | 1A | 4 | 아실 전달제 |
| p-벤조퀴논 | 1A | 1A | na | 마이클 수용체 |
표 7. 시험 세트 예측에서 별도의 복제물에 대한 부류별 통계.
| no cat | 1A | 1B | |
| 민감성 | 0.889 | 0.833 | 0.556 |
| 특이성 | 0.917 | 0.806 | 0.917 |
| 양성 예측 값 | 0.842 | 0.682 | 0.769 |
| 음성 예측 값 | 0.943 | 0.902 | 0.805 |
| 출현율 | 0.333 | 0.333 | 0.333 |
| 검출율 | 0.296 | 0.278 | 0.185 |
| 검출 출현율 | 0.352 | 0.407 | 0.241 |
| 균형잡힌 정확도 | 0.903 | 0.819 | 0.736 |
보충 표 1. 독립적 시험 세트의 예측
| 화학물질 | 진정 CLP | 예측 CLP |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 1A | 1A |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 1A | 1A |
| 비스페놀 A-디글리시딜 에테르 | 1A | 1A |
| 염화시아누르산 | 1A | 1B |
| 염화시아누르산 | 1A | no cat |
| 염화시아누르산 | 1A | no cat |
| 글루타르알데하이드 | 1A | 1A |
| 글루타르알데하이드 | 1A | 1A |
| 글루타르알데하이드 | 1A | 1A |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 1A | 1A |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 1A | 1A |
| 요오드프로피닐 부틸카바메이트 | 1A | 1A |
| p-벤조퀴논 | 1A | 1A |
| p-벤조퀴논 | 1A | 1A |
| p-벤조퀴논 | 1A | 1A |
| 프로필 갈레이트 | 1A | 1A |
| 프로필 갈레이트 | 1A | 1A |
| 프로필 갈레이트 | 1A | 1A |
| 아네톨 | 1B | 1B |
| 아네톨 | 1B | 1B |
| 아네톨 | 1B | 1B |
| 벤질 벤조에이트 | 1B | 1B |
| 벤질 벤조에이트 | 1B | 1B |
| 벤질 벤조에이트 | 1B | 1B |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 1B | 1A |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 1B | 1B |
| 부틸 글리시딜 에테르 | 1B | 1A |
| 디에틸 말레에이트 | 1B | 1A |
| 디에틸 말레에이트 | 1B | 1A |
| 디에틸 말레에이트 | 1B | 1A |
| 리날룰 | 1B | no cat |
| 리날룰 | 1B | 1B |
| 리날룰 | 1B | 1B |
| 라일랄 | 1B | 1A |
| 라일랄 | 1B | 1B |
| 라일랄 | 1B | 1A |
| 1-브로모부탄 | no cat | no cat |
| 1-브로모부탄 | no cat | no cat |
| 1-브로모부탄 | no cat | no cat |
| 벤조산 | no cat | no cat |
| 벤조산 | no cat | no cat |
| 벤조산 | no cat | no cat |
| 시트르산 | no cat | no cat |
| 시트르산 | no cat | 1B |
| 시트르산 | no cat | no cat |
| 디에틸 프탈레이트 | no cat | no cat |
| 디에틸 프탈레이트 | no cat | no cat |
| 디에틸 프탈레이트 | no cat | no cat |
| 에틸 바닐린 | no cat | no cat |
| 에틸 바닐린 | no cat | 1B |
| 에틸 바닐린 | no cat | no cat |
| 자일렌 | no cat | no cat |
| 자일렌 | no cat | no cat |
| 자일렌 | no cat | no cat |
표 B.
| 유전자 명칭 | 유전자 기호 | 전사체 클러스터 ID | 등급 |
| 표 B(i) | |||
| 사이클린 A2 | CCNA2 | 8102643 | 2 |
| 미공지됨 | 미공지됨 | 8151252 | 4 |
| 포스파티딜이노시톨 글리칸 앵커 생합성, 부류 W | PIGW | 8006634 | 5 |
| 소핵 리보핵단백질 D1 폴리펩타이드 16kDa | SNRPD1 | 8020411 | 6 |
| 로(Rho) GTPase 활성화 단백질 19//ARHGAP19-SLIT1 번역 초과 (NMD 후보) | ARHGAP19 /// ARHGAP19-SLIT1 | 7935403 | 7 |
| 히스톤 클러스터 1, H2ab | HIST1H2AB | 8124391 | 8 |
| 류신-풍부 반복체 및 칼포닌 상동성 (CH) 도메인 함유 2 | LRCH2 | 8174610 | 9 |
| 플라코필린 4///플라코필린 4 | PKP4 /// PKP4 | 8045860 | 11 |
| 리보핵단백질, PTB-결합 2///리보핵단백질, PTB-결합 2 | RAVER2 /// RAVER2 | 7902023 | 12 |
| 데옥시우리딘 트리포스파타제///데옥시우리딘 트리포스파타제 | DUT /// DUT | 7983594 | 13 |
| 오로라 키나제 A | AURKA | 8067167 | 14 |
| 미공지됨 | 미공지됨 | 8055309 | 15 |
| NDC1 막관통 뉴클레오포린 | NDC1 | 7916316 | 16 |
| 키네신 패밀리 구성원 2///키네신 패밀리 구성원 2 | KIF22 /// KIF22 | 7994620 | 17 |
| OK/SW-CL.58 | OK/SW-CL.58 | 7970828 | 18 |
| 미공지됨 | 미공지됨 | 7994343 | 19 |
| 표 B(ⅱ) | |||
| 히스톤 클러스터 1, H2ab///히스톤 클러스터 1, H2ae | HIST1H2AB /// HIST1H2AE | 8117408 | 1 |
| 고이동성 그룹 박스 3 | HMGB3 | 8170468 | 10 |
표 8.
표 9.
표 10.
표 11:
표 12
Claims (64)
- 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 수지상(dendritic cell) 세포 집단 또는 수지상-유사(dendritic-like) 세포 집단을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 제공된 상기 세포를 시험 제제에 노출시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 상기 세포에서 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 바이오마커의 발현을 측정하는 단계;를 포함하거나 또는 상기 단계들로 이루어지고;
단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커의 발현은 단계 (b)의 상기 시험 제제의 상기 피부 감작화 효능을 나타내는, 방법. - 청구항 1에 있어서,
단계 (c)에서 측정된 하나 이상의 상기 바이오마커들은 표 A(i) 및/또는 표 A(ⅱ)에 정의된 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(i)에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A(i)에 열거된 모든 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A(ⅱ)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ⅱ)에 열거된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A(ⅱ)에 열거된 상기 모든 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A(ⅲ)에 열거된 하나 이상의 바이오마커, 예를 들어, 표 A(ⅲ)에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A(ⅲ)에 열거된 모든 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A에 열거된 3개 이상의 상기 바이오마커, 예를 들어, 표 A에 열거된 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 52개의 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 A에 열거된 모든 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 표 B에 열거된 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시험 제제는 피부의 감작화를 유도할 수 있는 것으로 이미 공지되어 있거나 유도할 수 있을 것으로 의심되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해 결정된 상기 피부 감작화 효능은 유럽 분류, 표지화 및 패키징(CLP) 규정, 즉, 카테고리 1A(강한), 1B(약한), 또는 no cat(감작제 부재)에 따라 카테고리화되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해 결정된 상기 피부 감작화 효능은 문헌[Basketter et al., 2014, ‘Categorization of chemicals according to their relative human skin sensitizing potency,’ Dermatitis, 25(1):11-21]에 기재된 시스템에 따라 카테고리화되는, 즉, 카테고리 1(가장 강한 감작제), 2, 3, 4, 5, 또는 6(진정한 비-감작제)으로 카테고리화되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피부 감작은 과민성 반응인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 15에 있어서,
상기 과민성 반응은 세포 매개된 과민성 반응인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 16에 있어서,
상기 과민성 반응은 IV형 과민성 반응인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서,
상기 과민성 반응은 알레르기 접촉성 피부염(ACD)인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 하나 이상의 상기 바이오마커의 핵산 분자의 발현을 측정하는 것을 포함하는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 19에 있어서,
상기 핵산 분자는 cDNA 분자 또는 mRNA 분자인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 19에 있어서, 상기 핵산 분자는 mRNA 분자인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법.
- 청구항 19에 있어서,
상기 핵산 분자는 cDNA 분자인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 19 내지 22 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)에서 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현의 측정은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 마크로어레이, 자가방사법 및 제자리 혼성화(in - situ hybridisation)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법을 사용하여 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현의 측정은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 결정되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법.
- 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)에서 하나 이상의 상기 바이오마커의 발현의 측정은 각각 표 A에 동정된 상기 바이오마커 중 하나를 암호화하는 핵산 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 25에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 핵산 분자를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 26에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA, RNA, PNA, LNA, GNA, TNA 또는 PMO를 포함하거나 이들로 이루어진, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 26 또는 27에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 각각 DNA를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 25 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 5 내지 100개 길이의 뉴클레오타이드인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 25 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 15 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 25 내지 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 31에 있어서,
상기 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사능활성 모이어티(예를 들어, 방사능활성 원자); 또는 효소적 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 32에 있어서,
상기 검출 가능한 모이어티는 방사능활성 원자를 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 33에 있어서,
상기 방사능활성 원자는 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 인-32, 황-35, 중수소, 삼중수소, 레늄-186, 레늄-188 및 이트륨-90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 32에 있어서,
상기 결합 모이어티의 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (b)는 단계 (c)에서 정의된 하나 이상의 상기 바이오마커의 단백질의 발현을 측정하는 것을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 36에 있어서,
단계 (c)에서 하나 이상의 상기 바이오마커의 상기 발현의 측정은 각각 표 A에 동정된 상기 바이오마커 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 모이어티를 사용하여 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 37에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 또는 이것으로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 38에 있어서,
상기 항체 또는 이의 단편은 단일 클론 항체 또는 이의 단편인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 38 또는 39에 있어서,
상기 항체 또는 항원-결합 단편은 온전한 항체, Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 및 이황화 결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab’단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어, VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 및 이원 포맷을 포함하는 dAbs[즉, dAb-링커-dAb])로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 40에 있어서,
상기 항체 또는 항원-결합 단편은 단일쇄 Fv(scFv)인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 38에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 항체-유사 결합제, 예를 들어, 어피바디 (affibody) 또는 압타머(aptamer)를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 37 내지 42 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 결합 모이어티는 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 43에 있어서,
상기 검출 가능한 모이어티는 형광성 모이어티; 발광성 모이어티; 화학발광성 모이어티; 방사능활성 모이어티 및 효소적 모이어티로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (c)는 어레이를 사용하여 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 45에 있어서,
상기 어레이는 비드-기반 어레이인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 46에 있어서,
상기 어레이는 표면-기반 어레이인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 46 또는 47에 있어서,
상기 어레이는 마크로어레이; 마이크로어레이; 나노어레이로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 48 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 시험관내(in vitro), 생체내(in vivo), 생체외(ex vivo) 또는 인 실리코(in silico) 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 49에 있어서,
상기 방법은 시험관내 수행되는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 있어서,
상기 2개 이상의 바이오마커의 발현은 상기 시험 제제로의 노출 전 및 후에 단계 (a)에서 제공된 세포에서 측정되고,
상기 시험 제제에 대한 노출 전 및 후의 상기 2개 이상의 바이오마커들 간의 발현의 차이가, 단계 (b)의 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타내는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 51 중 어느 한 항에 있어서,
(d) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 추가의 집단을 제공하는 단계;
(e) 단계 (d)에 제공된 상기 세포를, 하기의 것들에 노출시키는 단계:
i. 인간 피부를 감작화시키지 않는 하나 이상의 음성 대조군 제제; 및/또는
ⅱ. 인간 피부를 감작화시키는 하나 이상의 양성 대조군 제제; 및/또는
ⅲ. 하나 이상의 비히클 대조군;
(f) 동일한 시간 동안, 하나 이상의 대조군 제제로 노출시키는 것이 아닌 단계 (a)에서 제공된 상기 세포와 동일한 조건하에서 항온처리하는 단계;
(g) 단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커의 발현을 단계 (e)의 상기 세포에서 측정하는 단계;를 추가로 포함하고,
단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커와 단계 (g)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커 간의 발현의 차이가, 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타내는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 52 중 어느 한 항에 있어서,
(h) 수지상 세포 또는 수지상-유사 세포의 추가의 집단을 제공하는 단계;
(i) 단계 (h)에서 제공된 상기 세포를, 미리 결정된 효능을 갖는 피부 감작화 제제에 노출시키는 단계;
(j) 단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커의 발현을 단계 (h)의 상기 세포에서 측정하는 단계;를 추가로 포함하고,
단계 (c)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커들과 단계 (j)에서 측정된 상기 2개 이상의 바이오마커들 간의 발현에서의 상응성이, 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 나타내는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
(k) 상기 시험 제제의 피부 감작화 효능을 동정하는 단계를 추가로 포함하는, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 54 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수지상 세포 집단 또는 수지상-유사 세포 집단은 수지상-유사 세포 집단인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 55에 있어서,
상기 수지상-유사 세포는 골수성 백혈병-유래의 세포, 예를 들어, KG-1, THP-1, U-937, HL-60, Monomac-6, AML-193 및 MUTZ-3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것들인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 56 중 어느 한 항에 있어서,
ROC AUC 값에 의해 결정된 상기 방법의 예측 정확도는 적어도 0.50, 예를 들어, 적어도 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 또는 적어도 0.99인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 57에 있어서,
ROC AUC 값에 의해 결정된 상기 방법의 예측 정확도는 적어도 0.80, 바람직하게 적어도 0.85인, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 방법. - 청구항 1 내지 58 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 어레이로서,
상기 어레이는 청구항 25 내지 35 및 37 내지 48 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는, 어레이. - 청구항 59에 있어서,
상기 어레이가 청구항 1 내지 59 중 어느 한 항에 정의된 상기 바이오마커의 각각에 대한 하나 이상의 결합 모이어티를 포함하는, 어레이. - 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 용도로서,
바람직하게는, 상기 바이오마커가 표 A(i) 또는 표 A(ⅱ)에서 정의된 그룹으로부터 선택되는, 용도. - 표 A에 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티의, 제제의 피부 감작화 효능을 결정하기 위한 용도로서,
바람직하게는, 상기 결합 모이어티가 표 A(i) 또는 표 A(ⅱ)에서 정의된 그룹으로부터 선택되는 바이오마커에 대한 특이성을 갖는, 용도. - 청구항 1 내지 58 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 분석 키트로서,
(a) 청구항 59 또는 60에 따른 어레이;
(b) (선택적으로) 하나 이상의 대조군 제제; 및
(c) (선택적으로) 청구항 1 내지 58 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 지침서;를 포함하는, 분석 키트. - 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 방법 용도, 어레이, 또는 키트.
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