CN101971026A - 检测tiabs的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于评估对象的生理状态的新方法和产品。更具体来说，本发明涉及通过在来自对象的样品中测定针对特定异常蛋白结构域的抗体的水平、或带有对这样的异常蛋白结构域特异性的TCR的免疫细胞的存在或数量，来评估对象中癌症的存在、风险或阶段的方法。本发明也适用于评估对象对治疗的响应性，以及筛选候选药物和设计新疗法。本发明可用于任何哺乳动物对象，特别是用于人类对象。
Description
技术领域
本发明涉及用于评估对象的生理状态的新方法和产品。更具体来说，本发明涉及通过测定来自对象的样品中针对特定的异常蛋白结构域的抗体的水平、或带有对这样的异常蛋白结构域特异性的TCR的免疫细胞的存在或数量，来评估对象中癌症的存在、风险或阶段的方法。本发明也适用于评估对象对治疗的响应性，以及筛选候选药物和设计新疗法。本发明可用于任何哺乳动物对象，特别是用于人类对象。
背景技术
在西方国家，癌症正逐渐变成死亡的主要原因，强有力的治疗益处、即患者的无病长期存活率＞90％主要在早期诊断的个体中获得1。癌症是癌癌基因和肿瘤抑制基因中突变积累的遗传疾病2。遗传检验对于鉴定个体的结肠、肺、乳腺、卵巢和神经内分泌癌的风险来说是有用的3，4。然而，因为对于给定的个体发生癌症的时间缺乏精确性，有遗传风险的患者的临床管理是复杂的5。
癌细胞中的基因表达变化广泛，分析转录模式的差异导致理清了与良好或不良预后相关的分子标签(molecular signature)6。这样的标签可以指导和优化治疗策略，但先决条件仍然是肿瘤的先期鉴定。
通过三个主要方向进行了大量努力，以鉴定在易获得的人类体液中可检测的可靠的早期癌症分子标志物。首先，使用各种不同的分离和鉴定程序，分析在正常和癌症患者之间蛋白浓度和/或同工型的变化7，8。某些这样的方法适合于系统性筛选，但是该技术目前面临着丰富的血浆蛋白浓度(＞＞＞mg/ml)与低水平组织泄漏所释放的蛋白浓度(＜＜pg/ml)的巨大差异。备选的方法由鉴定在癌症中差异表达的几个特定靶的表达情况，以及开发灵敏的分析方法以监测它们在血浆中的浓度所构成9。这两种策略都已成功地实施，但是均还没有提供强得足以用于系统性临床筛选的标志物10，11。研究的第二个中心是基于血浆中循环DNA的鉴定和表征。早期报道表明，血清中循环DNA的简单存在是诊断性的12；但是，这一点现在有疑问，因为健康个体的循环游离DNA浓度与癌症患者在同样的范围内13，14。维持正常的DNA甲基化模式对于适合的细胞功能来说是关键的，它的丧失是癌症发生过程中最早的分子变化之一15，16。几个团队已报道了血清中肿瘤相关甲基化模式的检测，但是在使用同样生物标志物和技术的不同队伍之间成功率变动极大17-20。这是由于肿瘤DNA甲基化模式的多样性和肿瘤DNA的低丰度两方面最多代表正常体细胞单倍体基因组的0.12％21，22。因此，即使是考虑到最近测序技术的进展23，24，但以少量循环癌症DNA检测癌症体细胞突变也是太接近于背景水平而不能提供强有力的评价。第三个中心由通过系统性搜索自身抗体来探测免疫系统对癌症的应答而构成25，26。这些抗体的存在已被确立，但是自体分子变成免疫原性的过程尚未被了解27。筛选从癌细胞mRNA构建的表达文库，导致鉴定到大量低灵敏度的抗体，当使用＞20种的组合时，在前列腺癌患者中获得了高达82％的灵敏度28，29。一种备选方法依赖于通过2D凝胶电泳的免疫印迹来鉴定自身抗体标签30。这导致随后鉴定到主要通过自身抗体鉴定到的不依赖于癌症状态的蛋白，以及有限数量的优先与癌症血清反应的蛋白30。
我们的策略是基于不同的基本原理，该原理直接源自于通过大规模癌症DNA测序项目获得的结果31，32。该重要工作产生的结论是，癌症体细胞突变的发生率比预期的高，但仍然是罕见的事件：估计的比率是每106个碱基中3.1个，导致在给定肿瘤中平均90个氨基酸取代31。事实上，所有生物化学、生物学和临床属性在同样组织学亚型的癌症中是非均质的33。因此，我们搜寻了造成癌细胞异质性的其它机制。最近，我们指出，癌细胞mRNA序列与正常细胞相比，含有更多的碱基取代34。发生癌症mRNA碱基取代的位点比带有体细胞突变的位点被遇到的几率高104倍，并且不与单核苷酸多态性(SNP)相符。因此，从同一患者的正常和癌细胞分离到的mRNA异质性的差异，不能用基因组水平上出现的差异来解释。癌症mRNA中的碱基取代，由对应于活性RNA聚合酶II(Pol II)所解链部分的DNA邻近序列的组成所决定34，35。最常见情况是，被取代碱基与紧邻着事件的之前或之后碱基一致。体外数据证明了Pol II在特定DNA邻近序列中的向前滑动36，37，因此，我们提出，转录失真性(TI)解释了一部分癌症mRNA不是基因组DNA的忠实拷贝。
我们将这种分析扩展到整个基因组和所有可获得的人类转录本，证实了在癌症中mRNA碱基取代显著增加(2.5倍)。最重要的是，我们发现在癌症mRNA中，单个碱基缺失非常急剧地增加(38倍)。mRNA中的缺口导致下游基因组信息的损失，并能够产生可能引发免疫应答的异常蛋白。我们已经在癌症患者中寻找并发现了针对从含有单个碱基缺口的癌症mRNA翻译的预测异常肽(PAP)的特异性IgG。低丰度的多样化IgG的检测，为最常见形式的人类实体肿瘤的诊断提供了新方法。一组IgG有效地将患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者与未患癌症的对象区分开来。
因此，本发明显示了这样的缺口(和插入)在癌症患者中急剧增加并产生了异常但是可以预测的免疫原性蛋白，这些蛋白代表了非常有效的生物标志物。
发明内容
本发明的目的涉及一种用于在对象中检测癌症的存在、风险或发展阶段的方法，所述方法包括将来自对象的样品在体外与包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽接触，其中所述多肽与所述样品中存在的抗体(TIAB)或带有TCR的细胞之间形成复合物，是癌症的存在、风险或发展阶段的指示。
本发明的另一个目的涉及评估对象的生理状态的方法，所述方法包括测定来自对象的样品中特异性针对由转录失真性产生的异常蛋白结构域的抗体(TIAB)或与这种结构域结合的带有TCR的免疫细胞的存在或水平的步骤，其中所述样品中所述TIAB或免疫细胞与参照值相比的水平变化，是生理失调的指示。
本发明的另一个目的是确定癌症治疗的功效的方法，所述方法包括(i)在来自对象的样品中，测定至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽的水平，或TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(ii)将所述水平与治疗之前或治疗较早期阶段从所述对象获取的样品中的所述水平进行比较。
本发明的另一个目的是监测对象中癌症的进展或扩散的方法，所述方法包括(i)将从所述对象获得的样品与至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽接触，(ii)测定所述样品中TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(iii)将所述水平与参照水平进行比较。参照值可以是从未患癌症或疾病的个体测定的平均值或中值、从对照患者获得的参照水平、从癌症发作之前的患者或使用对照多肽获得的参照水平。
本发明的另一个目的涉及确定个体是否正在产生含有选自SEQID NOs：1-3334的序列的多肽的方法，所述方法包括将从所述个体获得的样品与指示所述多肽存在的药剂相接触，以及确定所述药剂是否与所述样品结合。
本发明的另一个目的是选择、表征、筛选或优化生物活性化合物的方法，所述方法包括将测试化合物在体外与基因接触，以及确定所述测试化合物调节从所述基因生产含有转录失真性缺口和插入的RNA分子的能力。
本发明的另一个目的在于生产对转录失真性特异的肽的方法，所述方法包括：
a)鉴定由转录失真性缺口或插入产生的蛋白结构域；
b)合成含有a)的所述蛋白结构域的序列的肽；以及
c)任选在来自哺乳动物对象的生物学样品中证实该肽与抗体结合。
本发明还涉及任何含有由缺口或插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列或其含有表位的片段的多肽，特别是含有选自SEQ IDNOs：1到3334的序列或其含有表位的片段的多肽。
本发明的另一个目的是分离的核酸，所述核酸编码上面描述的多肽、或包含编码选自SEQ ID NOs：1-3334的多肽的第一个核苷酸序列或与其互补的序列以及长度为100个或以下核苷酸的第二个核苷酸序列，其中所述第二个核苷酸序列在天然存在的核酸中与所述第一个核苷酸序列相邻。
本发明的另一个目的是包含上述多核苷酸的克隆或表达载体，以及用该载体转化或转染的宿主细胞。
本发明的另一个目的是分离的抗体或抗体的部分，它们与含有由缺口或插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的任何多肽、特别是与含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段特异性的多肽结合。
本发明的另一个目的是含有TCR的免疫细胞，所述TCR特异性针对含有由缺口或插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的任何多肽，特别是特异性针对含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽。
本发明还涉及固相支持物，它包含至少一种含有由缺口或插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽，特别是至少一种含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段的多肽。
本发明还涉及装置或产品，它们包含固定化在支持物上的至少一种含有由缺口或插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽，特别是至少一种含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段的多肽。
本发明的另一个目的是试剂盒，其至少包含上面定义的装置或产品，以及进行免疫反应的试剂。
本发明还涉及在对象中调节免疫应答的方法，所述方法包括处理对象以贫化表达特异性针对上面定义的多肽的TCR的免疫细胞。这样的免疫细胞典型地包括B细胞、树突状细胞或T细胞。贫化可以通过本技术领域已知的方法、例如使用特异性配体的离体(ex vivo)贫化来完成。
附图说明
图1.位于ORF中的K缺口的图示。
显示了在Y轴的癌症组和X轴的正常组中测量到的ORF中所有统计学显著的K缺口的％偏差。红色菱形表示选择用于生物学评估的45K缺口(表5)。插入的图显示受到位于ORF中指定数量的统计学显著的K缺口影响的转录本数量。
图2.在肺癌患者c-DNA文库中丝切蛋白(Cofilin)基因上预测的缺失的异常mRNA检测。
图2a.所选缺口的生物信息学预测和性质。
图2b.克隆策略。
图2c.对正常和变体进行的qPCR。
图2d.cDNA变体序列。
图2e.基因组DNA序列。
图3.在对照和带有指定形式实体肿瘤的癌症患者的血浆中检测识别15种PAP(表5的肽1-15)的IgG。
图3a.从空白的链亲和素包被的孔中记录到的荧光强度信号中，减去与生物素化PAP温育的每个单独样品记录的荧光强度信号。如果该差值的强度对应于对照中记录到的值的下一半，用浅蓝
显示。深蓝
对应于处于对照值的上一半中的信号。高于对照、但是在阳性信号的下一半，用浅红
表示。深红
表示处于阳性信号的上一半中的患者。由于样品不足，空白细胞显示测试不能进行。对照是26位健康个体，患有指定的各种形式癌症的患者对于每种癌症来说按照阶段从顶(早期)至底(晚期)排序。在图的底部显示了Wilcoxon检验的显著性p-值。
图3b.在对照和带有指定形式实体肿瘤的癌症患者的血浆中检测针对13种预测异常肽的IgG。
从使用PAP 14和15、或当PAP 14的信息不能获得时单独使用PAP15记录到的荧光强度信号平均值中，减去与生物素化PAP温育的每个单独样品记录到的荧光强度信号。原始数据与图3A的相同。计算出的信号强度如果对应于对照中记录到的值的下一半，用浅蓝显示。深蓝对应于处于对照值的上一半中的信号。高于对照、但是在阳性信号的下一半，用浅红表示。深红表示阳性信号的上一半。
图4.在NSCLC相对于未忠癌症的对照的血清中，针对PAP的IgG的检测。
图4A.测量了针对37种PAP的IgG(表5的前37种肽)。产生了具有37种PAP对应氨基酸序列的N-末端生物素化肽，并用作诱饵在链亲和素孔中结合推定的免疫球蛋白。样品以1/100稀释度进行测试，在清洗后，与PAP结合的IgG通过抗人类IgG Fc结构域的第二抗体显示。对照患者包括25位健康个体和12位患有COPD的患者(浅蓝和深蓝组)和49位NSCLC患者(研究II，表4)(红色组)。显示了病例相对于所有对照的Wilcoxon检验的p-值。
图4B.37个对照与49个肺癌之间的统计学分析。对于每个TIAB给出了非参数Wilcoxon检验的p-值。
图5.没有检测到针对规范肽(CP)的IgG
测量了针对基因组的规范阅读所对应的肽、即没有缺口的RefSeq的相应mRNA翻译的相应肽的IgG的荧光强度。规范肽的序列在表6中给出。
图5A.测量了针对PAP 1和在同样基因上选择的规范肽(I64到Q93)的IgG。还测量了针对来自白蛋白的规范肽(Q128到P143之间)的IgG。所有来自图4的患者均包括在内。
图5B.规范的和预测的异常肽序列的示意图。
图5C.显示了11个对照(蓝色组)和16个NSCLC(红色组)的针对PAP 7、24和28及其规范肽的IgG。
图6.在小鼠(Mus musculus)血清中检测针对PAP的IgG
图6A.人类(Homo sapiens)与小鼠序列之间的同源性的生物信息学分析。显示了PAP 7、48和62的mRNA和PAP比对，并显示出这些序列是保守的。阴性对照CP 7的蛋白序列在人类和小鼠之间也是保守的。PAP 2和9在对照和人类NSCLC之间是可区别的，但是在小鼠中不保守。
图6B.对12只正常小鼠(C57B1/6)皮下注射5*105个LLC1细胞。在注射当天和1-2-3周后，测量针对PAP 48、62、7以及相应CP的TIAB滴度。在注射当天和3周后，在4只小鼠中测量针对PAP 2和9的TIAB滴度。显示了平均值+-SEM。
图7.在肺癌与未患癌症的对照的血清中，针对PAP的IgG滴度的组合。
图7A.对照患者包括161位健康个体(蓝色组)和140位肺癌患者(研究III，表4)，肺癌中包括腺癌ADK(红色组)、鳞状癌(橙色组)和其他(黄色组)。支持向量机(Support Vector Machine)可以区分对照与具有6个PAP(7、29、48、66、68、70)的肺癌。显示了与超平面的距离；通过SVM模型显示为负值的患者被分类为无癌。显示出正值的患者被分类为有癌。
图7B.显示了被分类为阳性的肺癌患者根据其年龄的百分率。
图7C.显示了被分类为阳性的肺癌患者根据其疾病的组织病理学的百分率。
图7D.显示了在手术后3年无病的肺癌患者与死亡或活着但癌症复发的患者之间，距SVM超平面的距离的差异。
图8.在肺癌与乳腺癌的血清中，针对PAP的IgG滴度的组合。对照患者包括20位健康个体(蓝色组)、20位肺癌患者(红色组)和20位乳腺癌患者(紫色组)(研究IV，表4)。
图8A.显示了辨别肺癌与未患癌症的对照的PAP组合。
图8B.显示了辨别肺癌与乳腺癌的几种PAP组合。
图8C.显示了辨别乳腺癌与未患癌症的对照的PAP组合。
发明详述
本发明涉及通过测量TIAB水平来评估对象的生理状态的新方法和产品。更具体来说，本发明涉及通过测量来自对象的样品中的TIAB水平，来评估对象中癌症的存在、风险或阶段的方法。本发明也适合于评估对象对治疗的响应性、监测癌症的进展或扩散以及筛选候选药物。
转录失真性是指一种新的机制，通过该机制在细胞中从单一转录本序列产生几种不同的RNA分子。这种新鉴定到的机制可能影响任何基因，是非随机的，并服从特定的规则，正如在本文中引为参考的共同待决申请n°PCT/EP07/057541中公开的。
本申请显示，转录失真性能够在RNA分子中导入缺口或插入，从而从单个基因产生多种可检测的异常蛋白序列(TI多肽序列)。这些TI多肽序列特别引人关注，因为它们的长度足以包含表位，哺乳动物可以产生针对该表位的抗体。结果，这种异常蛋白在对象中的表达，可以通过测量来自对象的样品中相应抗体或带有TCR的细胞的存在来评估。
现在，本发明提供了用于预测和/或鉴定由缺口或插入转录失真性事件从任何基因产生的这种异常蛋白结构域的序列的方法，以及生产含有这样的TI序列的多肽的方法。本发明还公开了超过2000种缺口TI(gTI)多肽和超过1000种插入TI(iTI)多肽，并证明在人类样品中针对这些多肽序列的抗体的存在与对象中癌症的存在之间的显著关联性。更具体来说，在大多数(＞75％)具有常见形式实体肿瘤的患者的血清中，检测到了超过正常对象的针对预测的异常肽(PAP)的特异性IgG水平的增加。所有7种常见形式的实体肿瘤(结肠、肺、乳腺、卵巢、子宫、头颈部和黑素瘤)都引起针对异常蛋白的IgG的产生。在大多数患有早期疾病、即淋巴结阴性并且没有转移的对象中，观察到了特异性IgG水平的增加。
因此，测量这种被称为TIAB(转录失真性抗体)的针对TI多肽的抗体、或带有特异性针对这种异常结构域的TCR受体的相应免疫细胞，代表了用于检测和监测疾病、以及用于药物开发的新途径。
TIAB
在本发明的上下文中，术语TIAB(“转录失真性抗体”)是指与包含在由TI、特别是由gTI或iTI产生的蛋白序列中的表位特异性结合的抗体。更具体来说，TIAB是指由哺乳动物天然产生的、针对包含在由TI、特别是由gTI或iTI(缺口和插入转录失真性)产生的蛋白序列中的表位的抗体。TIAB可以是任何类型，包括IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。当抗体与特定表位或序列的结合能够可靠地与非特异性结合(即与另一个抗原、特别是不包含所述结构域的天然蛋白)区分开时，抗体对于所述表位或序列是“特异的”。
一方面，TIAB或TIAB的部分可以附着到固相支持物上。这种附着将TIAB维持在适合的构象中，允许当与含有特异性gTI或iTI多肽的样品接触时与所述特异性gTI或iTI多肽结合。附着可以是共价或非共价的，直接附着到支持物上或通过间隔基团。在本领域中已经报道了将抗体固定化到支持物(聚合物、陶瓷、塑料、玻璃、氧化硅等)上的各种技术。支持物可以是磁性的，例如磁性珠，以便于例如分离。
带有对这样的TI多肽特异的TCR的免疫细胞，包括免疫系统的任何含有TCR的细胞，例如，T细胞例如CTL、CD4+淋巴细胞、CD8+淋巴细胞和/或Treg细胞，以及抗原呈递细胞：B细胞、树突状细胞或巨噬细胞。具体来说，该术语包括任何产生TIAB的免疫细胞。这样的细胞可以在常规条件下培养，并使用本发明的TI多肽作为(共)刺激因子在体外或离体扩增。
TI多肽及其生产
正如将在下面公开的，现在，本发明公开各种不同的TI多肽的序列，并允许从实际上任何基因预测TI序列。
在第一个实施方案中，本发明涉及含有gTI序列、即由缺口转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的分离多肽。本发明的多肽的具体例子包括选自SEQ ID NOs：1到2206的序列(参见表3a)或其含有表位的片段。
在第二个实施方案中，本发明涉及含有插入TI序列、即由插入转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的分离多肽。本发明的多肽的具体例子包括选自SEQ ID NOs：2207-3334的序列(参见表3b)或其含有表位的片段。
术语“含有表位的片段”是指含有形成抗体或TCR表达细胞的免疫学表位的至少6个、优选至少8个、更优选至少10个、最优选至少12个连续的氨基酸残基的任何片段。这样的表位可以是线性的或构象的，并对B或T细胞特异。
本发明的TI多肽典型地包含8到100个氨基酸，优选8到50个、更优选10到40个氨基酸。本发明的多肽可以通过任何常规技术、例如人工多肽合成或重组技术来产生。
本发明的多肽可以任选地包含附加的残基或功能，例如但不限于附加的氨基酸残基、化学或生物学基团，包括标记物、标签、稳定剂、定向部分、纯化标签、分泌肽、官能化反应性基团等。这样的附加残基或功能可以被化学衍生、作为融合蛋白的氨基酸序列区添加、复合或以其它方式共价或非共价结合。它们也可以包含天然或非天然氨基酸。多肽可以采用溶解形式，或附着于(或复合或包埋于)支持物、例如基质、柱、珠子、板、膜、载玻片、细胞、脂质、孔等。
在具体实施方案中，多肽被生物素化以与链亲和素形成复合物。
本发明的多肽可以作为单体或多体存在。此外，它们可以是线性构象或特别是空间构象。就此而言，多肽可以包含在特定支架中以显示特定构象。
本发明的多肽可以在疫苗组合物中用作免疫原或用于生产特异性抗体。它们也可用于将药物或其他分子(例如标记物)靶向生物体中的特定位点。它们也可用作特异性试剂，检测或定量来自任何样品的特异性抗体或带有TCR的免疫细胞。
就此而言，本发明的一个具体目的在于包含如上定义附着到固相支持物上的多肽的装置或产品。附着优选为末端附着，从而将多肽维持在适合的构象中，以允许当与含有特异性抗体的样品接触时与该抗体结合。附着可以是共价或非共价的，直接附着到支持物上或通过间隔基团。在本领域中已经报道了将肽固定化到支持物(聚合物、陶瓷、塑料、玻璃、氧化硅等)上的各种技术，例如在Hall等，Mechanisms of ageing and development 128(2007)161中公开的。支持物可以是磁性的，例如磁性珠，以便于例如分离。
装置优选包含例如以预定的次序排列的多种本发明的多肽，以便可以使用同一种装置检测或测量几种TIAB。
装置典型地由任何固体或半固体支持物制成，例如滴定板、培养皿、载玻片、孔、膜、珠子、柱等。支持物典型地包含至少两种选自SEQ ID NO：1到3334的多肽或其含有表位的片段，更优选选自表5的45种PAP多肽(包括在SEQ ID NO 1-3334中)。
在最优选实施方案中，本发明的方法或支持物使用含有表5的不同PAP多肽序列的至少2种、优选至少3种多肽的组合。
在具体实施方案中，装置或方法使用选自PAP 1、2、4、6、7、24、25、28、29、44或48(表5)的至少一种、两种或三种多肽。
在另一个具体实施方案中，本发明的方法或支持物使用表5的不同PAP多肽的组合，所述组合选自下列：
-多肽PAP7、PAP66、PAP70、PAP29、PAP68和PAP48；
-多肽PAP7、PAP48、PAP70和PAP29；
-多肽PAP6、PAP29、PAP70和PAP82；
-多肽PAP6、PAP7、PAP29、PAP48、PAP70和PAP82；
-多肽PAP6、PAP29、PAP70和PAP69；
-多肽PAP7、PAP48、PAP70、PAP74和PAP29；或
-多肽PAP7、PAP29和PAP94。
在具体实施方案中，装置包含2到10种多肽。
支持物可以包含附加的物体或生物学元件，例如对照多肽和/或具有不同免疫反应性的多肽。
多肽与TIAB之间的免疫复合物的形成可以通过已知技术进行评估，例如使用特异性针对人类抗体的第二标记抗体，或通过竞争反应等。
本发明的另一方面在于试剂盒，其包含上面公开的装置，以及一种或数种执行免疫反应、即形成和检测免疫复合物的试剂。
TI多核苷酸
本发明的另一个实施方案涉及含有编码上面定义的多肽的核苷酸序列的多核苷酸或其互补链。具体来说，该多核苷酸包含编码选自SEQID NOs：1-3334的多肽的第一种核苷酸序列或与其互补的序列，以及长度为100个或以下核苷酸的第二种核苷酸序列，其中所述第二种核苷酸序列在天然存在的核酸中与所述第一种核苷酸序列相邻。与第一种核苷酸序列相邻的第二种核苷酸序列的长度可以是例如75、50、25、10或0。
本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA，例如互补DNA、合成的DNA、mRNA或它们的类似物，这些类似物含有例如修饰的核苷酸例如3’烷氧基核糖核苷酸、甲基膦酸等和肽核酸(PNA)等。多核苷酸可以被标记。多核苷酸可以使用本申请中包含的序列信息，按照本身在本技术领域中公知的技术来生产，例如通过化学合成方法、体外转录或通过重组DNA方法来生产。具体来说，多核苷酸可以通过化学寡核苷酸合成、文库筛选、扩增、连接、重组技术及其组合来生产。
本发明的具体实施方案在于编码含有选自SEQ ID 2207-3334的序列或其含有表位的片段的多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以包含附加的核苷酸序列，例如调控区，即可用于引起或调控多肽表达的启动子、增强子、沉默子、终止子等。
本发明的多核苷酸可用于产生本发明的重组多肽。它们也可用于设计特异性试剂，例如引物、探针或反义分子(包括反义RNA、iRNA、适配体、核酶等)，所述试剂特异性检测、结合或影响编码如上定义的多肽的多核苷酸的表达。它们也可用作治疗分子(例如作为基因疗法程序中工程化病毒、例如但不限于工程化腺病毒或腺相关病毒载体的一部分)，或用于产生重组细胞或遗传修饰的非人类动物，它们可用于例如在化合物文库中筛选调节如上定义的多肽的活性的药剂。
在本发明的上下文中，核酸“探针”是指具有能够与转录失真性结构域或其互补体选择性杂交、并适合于检测含有所述结构域或互补体的样品的存在(或其量)的多核苷酸序列的核酸或寡核苷酸。探针优选与转录失真性结构域完全互补，但是，可以容忍一定的错配。探针典型包含长度为8到1500个核苷酸、例如10到1000个、更优选10到800个、典型20到700个核苷酸的单链核酸。应该理解，较长的探针也可以使用。本发明的优选探针是长度在8到400个核苷酸之间、能够与转录失真性结构域特异性杂交的单链核酸分子。
术语“引物”是指核酸或寡核苷酸，其所具有的多核苷酸序列能够与转录失真性结构域或其互补体、或与位于转录失真性结构域侧翼的核酸区域选择性杂交，并适合于在含有所述结构域或互补体的样品中扩增全部或一部分所述转录失真性结构域。本发明的典型引物是长度为大约5到60个核苷酸、更优选长度为大约8到大约50个核苷酸、更进一步优选长度为大约10到40、35、30或25个核苷酸的单链核酸分子。优选完全互补性，以确保高特异性。但是，正如上面对于探针所讨论的，可以容忍一定的错配。
本发明的另一方面在于载体，例如包含如上定义的多核苷酸的表达或克隆载体。这样的载体可以选自质粒、重组病毒、噬菌体、附加体(episome)、人工染色体等。许多这样的载体是可商购的，并可以按照本技术领域公知的重组技术来生产，例如在手册例如在此以其全文引为参考的Sambrook等，《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning(2d ed.))(Cold Spring Harbor Press 1989)中提到的方法。
本发明的另一方面在于用如上定义的多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可以是能够被遗传修饰并优选被培养的任何细胞。细胞可以是真核的或原核的，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、真菌、细菌细胞等。典型的例子包括哺乳动物的原代或确立的细胞(3T3、CHO、Vero、Hela等)以及酵母细胞(例如酵母(Saccharomyces)菌种、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)等)和细菌(例如大肠杆菌(E.coli))。应该理解，本发明不限于任何具体细胞类型，并且遵循常用的通用知识，能够适用于任何种类的细胞。
诊断
本发明允许执行检测或诊断分析，所述分析可用于例如检测源自于对象的样品中疾病的存在、不存在、易感性、风险或严重性。在具体实施方案中，疾病是癌症。术语“诊断学”应该被解释为包括了药物基因组学、预后等的方法。
在一个具体方面，本发明涉及在体外或离体检测对象、优选为人类对象中疾病的存在、不存在、易感性、风险或严重性的方法，所述方法包括将来自对象的样品与如上定义的多肽相接触，并确定免疫复合物的形成。最优选，将多肽固定化在支持物上。在优选实施方案中，方法包括将样品与如上公开的装置接触，并测定免疫复合物的形成。优选，多肽选自SEQ ID NO：1-3334或其含有表位的片段，最优选，选自表5的45种PAP(包含在SEQ ID NO 1-3334)。
在另一方面，本发明涉及在体外或离体检测对象、优选为人类对象中疾病的存在、不存在、易感性、风险或严重性的方法，所述方法包括将来自对象的样品与如上定义的TIAB或TIAB的一部分或相应的带有TCR的细胞相接触，并确定免疫复合物的形成。最优选，将TIAB或相应的带有TCR的细胞固定化在支持物上。在优选实施方案中，方法包括将样品与如上公开的装置接触，并测定免疫复合物的形成。在另一个优选实施方案中，TIAB或相应的带有TCR的细胞对选自SEQ IDNO：1-3334或其含有表位的片段、优选为选自表5的45种PAP的多肽具有特异性。
本发明的具体目的在于在对象中检测癌症的存在、不存在、易感性、风险或严重性的方法，所述方法包括在体外或离体将来自对象的样品与如上定义的多肽相接触，并确定免疫复合物的形成。更优选，多肽被固定化在支持物上，并选自SEQ ID NOs：1-3334或其含有表位的片段，最优选选自表5的45种PAP。
本发明的另一个目的在于体外或离体检测生物学样品、优选人类生物学样品中疾病的存在、不存在、易感性、风险或严重性的方法，所述方法包括将所述样品与如上定义的多肽接触，并确定表达对这样的多肽特异性的TCR的免疫细胞的存在。优选，多肽选自SEQ ID NOs：1-3334或其含有表位的片段，最优选选自表5的45种PAP。
本发明的另一方面在于体外或离体评估对象、优选为人类对象中转录失真性水平的方法，所述方法包括将来自对象的样品与如上定义的多肽接触，并确定免疫复合物的形成。最优选，多肽被固定化在支持物上。在优选实施方案中，方法包括将样品与如上定义的装置接触，并确定免疫复合物的形成。
本发明的另一方面在于体外或离体评估对象、优选为人类对象中转录失真性水平的方法，所述方法包括将来自对象的样品与如上定义的多肽相接触，并确定表达对这种多肽特异性的TCR的免疫细胞的存在。
本发明的另一个实施方案涉及测定癌症治疗功效的方法，所述方法包括(i)在来自对象中样品中，测定至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽的水平，或TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(ii)将所述水平与治疗之前或治疗较早期阶段从所述对象获取的样品中的水平进行比较。优选下，多肽选自SEQ ID NOs：1-3334或其含有表位的片段，更优选选自表5的45种PAP。
本发明的另一方面涉及确定个体是否制造下述多肽的方法，所述多肽含有由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列、特别是含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段，所述方法包括将从所述个体获得的样品与指示所述多肽存在的药剂相接触，并确定所述药剂是否与所述样品结合。
在第一个实施方案中，将从对象获得的样品与多肽相接触，所述多肽与下述多肽的抗体结合，所述多肽特异性针对含有由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列、特别是含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段。
在另一种实施方案中，将从对象获得的样品与结合免疫细胞的多肽相接触，所述免疫细胞包含特异性针对下述多肽的TCR，所述多肽含有由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列、特别是含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段。
在另一个实施方案中，将从对象获得的样品与特异性针对下述多肽的抗体或其部分相接触，所述多肽含有由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列，特别是含有选自SEQ ID NOs：1-3334或其含有表位的片段的序列。
在另一个实施方案中，将从对象获得的样品与含有特异性针对下述多肽的TCR的免疫细胞相接触，所述多肽含有由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列，特别是含有选自SEQ ID NOs：1-3334或其含有表位的片段的序列。
本发明还涉及监测对象中癌症的进展或扩散的方法，所述方法包括(i)将从所述对象获得的样品与至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽相接触，(ii)测定所述样品中TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(iii)将所述水平与参照水平进行比较，所述参照水平是来自未患癌症的对象的平均值或中值、或来自癌症发作前对象的对照值。优选多肽包含PAP 12的序列，针对它的抗体滴度在不可手术的患者中与可手术患者相比明显增加，从而提供了与疾病扩散相关的指示。
样品中TIAB或相应的带有TCR的免疫细胞的存在(或增加)，指示了癌症疾病的存在、易感性或发展阶段。因此，本发明允许设计更有效且定制的适当治疗性干预。此外，这种在症状出现之前的水平的测定，允许实行预防性方案。
本发明的诊断方法可以在体外、离体或体内进行，优选在体外或离体进行。样品可以是源自于对象的含有适合的抗体或免疫细胞的任何生物学样品。这样的样品的例子包括体液、组织、细胞样品、器官、活检样品等。最优选的样品是血液、血浆、血清、唾液、精液等。在执行方法之前，可以对样品进行处理，以便赋予或改进抗体的测试可用性。处理可以包括例如下列一种或多种：细胞裂解(例如机械、物理、化学等)、离心、萃取、柱层析等。
在优选实施方案中，测试在血清或血浆上进行。
此外，在最优选实施方案中，样品在测试前按照EP08305293.6中所公开的进行处理。事实上，申请人显示，当样品在-20℃下或-80℃下冷冻保持新鲜时，最适测试条件是不同的。更优选，待测试样品进行了适合于显露出抗体结合位点、改变结合位点的构象或暴露出抗体结合位点的化学或物理处理。更优选，处理包括将样品在至少36℃的温度下加热一段足以活化抗体的时间。优选的温度是36℃到70℃之间，优选在36℃到60℃之间。
确定样品中TIAB或特异性免疫细胞的存在、不存在或相对丰度，可以通过在本技术领域中本身已知的多种技术来进行。这样的技术包括但不限于用于检测免疫复合物的方法，例如但不限于ELISA、放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析、微阵列、微芯片、斑点杂交(dot-blot)、western印迹、EIA、IEMA、IRMA或IFMA(也参见JP Gosling主编的《免疫分析实用方法》(Immunoassays，a practical approach)，Oxford University Press)。在具体实施方案中，方法包括将样品与多肽在允许免疫复合物形成的条件下相接触，以及使用第二标记试剂揭示所述形成。
在典型的实施方案中，方法包括将TIAB或免疫细胞的测量水平与参照水平进行比较，其中差异指示了对象中的功能障碍，例如癌症。与参照值相比，变化典型为变动10％、20％、30％、40％、50％或以上。更具体来说，与参照值相比，水平的变化是增加，这表明存在癌症。
参照值可以是从未患癌症或疾病的个体测定的平均值或中值、从对照患者获得的参照水平、从癌症发作前或具有对照多肽的对象获得的参照水平。
在优选实施方案中，与参照水平相比，所述样品中TIAB或免疫细胞的水平的变化(例如增加)指示了癌症的存在、风险或发展阶段。
接触可以在任何适合的装置中进行，例如板、微量滴定皿、试管、孔、玻璃、柱等。在具体实施方案中，接触在包被有多肽的基质上进行。基质可以是固体或半固体基质，例如任何含有玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等的适合的支持物。基质可以具有各种不同的形式或尺寸，例如载玻片、膜、珠子、柱、凝胶等。接触可以在适合于要在样品的多肽与抗体之间形成可检测的抗体-抗原复合物的任何条件下进行。
在具体实施方案中，方法包括将来自对象的样品与多种如上定义的多肽(包被的支持物)相接触，并确定免疫复合物的存在。
在具体实施方案中，方法包括将样品与多组珠子接触，每组珠子包被有如上定义的不同的多肽。
在另一个具体实施方案中，方法包括将样品与其上排列有几种如上定义的多肽的载玻片或膜相接触。
在另一个具体实施方案中，方法包括将样品与多孔滴定板接触，其中至少部分孔用如上定义的不同多肽包被。
本发明可用于确定对象中任何癌症的存在、风险或阶段。这包括实体肿瘤，例如但不限于结肠、肺、乳腺、卵巢、子宫、肝或头颈部癌症，以及黑素瘤、脑肿瘤等。本发明也可用于液体肿瘤，例如白血病。本发明可用于在具有发生癌症的风险的对象中甚至在其早期阶段进行第一次筛查来检测所述癌症。在第二次筛查中，依赖于用于检测的多肽，本发明可用于更精确地鉴定癌症的类型。就此而言，正如在图3中公开的，包含PAP 1、2、3、4或7(表5)序列、或其含有表位的片段的多肽，允许鉴定具有各种不同类型癌症的患者。
在具体实施方案中，本发明用于确定肺癌的存在、风险或阶段，多肽包含选自PAP 1、2、4、6、7、24、25、28、29、44和48(表5)(图4)的序列或其含有表位的片段。
药物筛选
本发明还允许通过评估候选分子调节TIAB水平或相应免疫细胞的能力，来设计(或筛选)新药物。
本发明的具体目的在于选择、表征、筛选或优化生物活性化合物的方法，所述方法包括确定测试化合物是否调节TIAB水平。TIAB水平的调节可以针对特定蛋白、或针对预定的一组蛋白或全面进行评估。
本发明的另一个实施方案在于选择、表征、筛选或优化生物活性化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与基因相接触，并确定所述测试化合物调节从所述基因生产含有转录失真性缺口和插入的RNA分子的能力。
本发明的另一个实施方案在于选择、表征、筛选或优化生物活性化合物的方法，所述方法包括在体外将测试化合物与表达特异性针对上面定义的多肽的TCR受体的免疫细胞相接触，并确定所述测试化合物调节所述细胞的活性或生长的能力。
上述的筛选分析可以在任何适合的装置中进行，例如板、管、平皿、烧瓶等。典型地，在多孔微量滴定皿中进行分析。使用本发明，可以平行地分析几种测试化合物。此外，测试化合物可以是各种不同来源的，天然和组成的。它可以是任何有机或无机物质，例如脂质、肽、多肽、核酸、小分子，分离的或与其它物质形成混合物。化合物可以是例如化合物组合文库的全部或一部分。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，实验部分应该被当作说明性的，不对本申请的范围构成限制。
实施例
A-材料与方法
血浆样品
从出于与癌症无关的生物学测试的目的在当地大学医院(Nancy University Hospital)看病的正常人类对象(n＝26)抽取血液样品。临床记录由训练有素的医生检查，他们确定这些对象没有急性病、不被怀疑患有活动的癌症、过敏或自体免疫病症。该组包括具有癌症风险因子、例如吸烟和肥胖的患者，一名对照在取血样之前10年通过外科手术除去了子宫癌，一名在取血样时是怀孕的。患有慢性阻塞性肺病的患者(n＝12)被召集到同一个科(n＝6)或召集到同一所医院的核医学科(n＝6)。所有患有COPD的患者在取血样时没有恶化性事件。患有各种形式实体肿瘤的患者(n＝46)在治疗前的PET-CT癌症扩散评估时取样，通过分析病理学样品完成分级(Nancy University Hospital)。患有活动性NSCLC的患者(n＝49)被召集到Strasbourg University Hospital，他们是肺癌纵向研究的一部分。在分级时抽取血样。所有在这些医学研究机构看病的患者通过签署同意书，同意将他们的样品出于研究目的匿名进行测试。这些样品的收集和分析，按照法国法律向法国卫生部(French ministry of Health)和研究部(Ministry of Research)申报。
生物信息学程序
按照以前的描述进行分析，但是做出了下列修改34。使用数据库中可以获得的组织来源，对每个EST进行检索并指派为癌症组或正常组序列。然后使用MegaBlast 2.2.16 38将每个序列对来自NCBI的人类RNA RefSeq进行一次比对。保留单个最好比对分值。每个没有在其长度的70％以上进行比对的EST不纳入考虑。只有当上游10个碱基和下游10个碱基与RefSeq完全匹配时，具有单个碱基序列变异的位置才被纳入考虑。将每个比对末端的最前和最后50个碱基删除。如果需要，缺口和插入位于任何元组(n-uplet)的最后一个核苷酸上。
生物化学分析
N-末端生物素化的、具有将鉴定到的K缺口考虑在内通过RefSeq的计算机翻译而确定的氨基酸序列的肽，以及对应于白蛋白和MRPL12基因的规范序列的肽，从不同制造商购买。将样品稀释100倍，使用可商购试剂并按照制造商的说明书，在ImmunoCAP 100(Phadia，Uppsala，Sweden)上进行IgG检测。除了在图3中由于样品缺少的几个例外之外，所有样品分析双份。癌症和对照以及PAP的次序或测试是随机的。在不存在内标的情况下，结果表示成荧光单位(FU)。
统计学方法
EST碱基组成的统计学显著性的检验和由于多次测试而产生的假阳性的估算，按照以前描述的进行34。使用非参数秩比较Wilcoxon检验来检验IgG滴度的差异。
B-结果
从TI缺口产生的蛋白结构域的鉴定
为了在基因组范围的尺度上分析EST异质性，我们从未过滤过的(noncurated)dbEST 39检索了在2000年1月到2007年7月之间公布的所有序列。根据它们在数据库中标明的正常或癌症起源将这些序列分开。然后将每个EST对来自NCBI的所有人类RefSeq RNA序列(2007年7月)进行一次比对40。首先，我们检验了正常与癌症矩阵之间在任何给定RefSeq位置处发生的差异的统计学显著性，然后估算由多次测试产生的假阳性41。具有统计学显著性的序列差异的位置，如果变异在癌症中过多被称为K，相反，当在正常中过多时被称为N。
从表1的结果中得出的最重要的观察是K缺口的发生甚至比K碱基取代更加常见。定义这些缺口的生物信息学限制是严格的：具有单个碱基缺口的给定EST位置，只有当其侧翼上游和下游存在10个与RefSeq完全匹配的碱基时，才被纳入考虑。对于位于ORF内的2191个K缺口来说，正常和癌症的带缺口EST百分率显示在图1中。引人注目的是，K插入比N插入更常见5倍，K缺口比N缺口更常见～13倍。减去统计学假阳性的估算值，将比率增加到38，这是因为K缺口的p-值比N缺口的低得多。与K不同，N缺口很少并明显包含大比例的假阳性(表1)。因此，我们集中于对位于ORF中的K缺口位置进行进一步分析。
表2概述了我们分析的条目。显然，没有由于癌症或正常组中显示的EST或转录本数量的差异而导致的明显偏差。从表1和2中，人们可以估算出，在癌细胞中mRNA序列的变异、即取代、插入和缺口，以每一千个碱基1-2个的比率发生。这大大超过了体细胞突变的比率：每一百万个碱基1-2个31。
mRNA中的SBG(单碱基缺口)可以由体细胞或生殖细胞突变、或由忽略了读取单个DNA碱基并继续转录的RNAP所引起。我们也考虑到了下述假说，即剪接机制的向前或向后滑动导致SBG位于第一个或最后一个外显子碱基上。但是发现后一种机制是不可能的，因为99.2％鉴定到的SBG不在紧邻外显子-内含子边界内。
丢失的mRNA碱基的组成具有下列次序：U(47％)＞C(39％)＞＞G(10％)＞A(4％)。这种分布主要是由于随机而偏离的(拟合优度卡方检验，双尾，α＝0.05，P＝10-248)。此外，分别有99％、76％、98％和95％的U、C、G和A缺口，出现在一个或多个相同碱基的重复区内。最后，对于97％的U缺口来说，在紧接下游发现了G。因此，基因组DNA的邻近序列部分决定了癌细胞中mRNA缺口的可能出现。DNA邻近序列对发生TI事件的影响的详细分析，将在别处报告。
异常mRNA检测
为了验证这些生物信息学结论，我们从肺癌患者的c-DNA文库克隆了质粒，该质粒在qPCR和测序后显示出在预测的位置出现SBG(图2A-E)。我们分析了从同一个个体的正常组织获得的同样数量的克隆，没有发现任何序列变异(数据未显示)。从同一患者的癌症、邻近和正常组织获得的基因组DNA的直接测序，明确地证明了在该位置缺乏体细胞或生殖细胞突变。我们不能排除鉴定到的mRNA缺口是克隆过程中人工产生的。但是，这种事件与通过生物信息学预测的位置精确一致，是不可能的。因此，可以合理地假设，在癌细胞中，少量但是可检测比例的mRNA不是基因组DNA的忠实拷贝。
材料与方法
质粒制备：
使用了pBAD质粒(Invitrogen)以便在克隆到的序列上游带有诱导型启动子。将从pBS-SK+质粒扩增到的α肽的序列，与pBAD质粒的CCATGG克隆位点中存在的ATG序列异相克隆(cloned out of phase)，产生了pBAD-α质粒。在不存在被克隆序列的情况下，不产生α肽，大肠杆菌菌落为白色。
插入物制备和克隆：
来自从同样个体获得的癌性肺和邻近正常组织的cDNA(Biochain Inc.)，使用与CFL1基因互补的寡核苷酸和高保真性Phusion聚合酶(Finnzyme)，按照制造商的推荐方法通过PCR进行扩增。然后将cDNA在Nucleospin Extract II柱(Macherey Nagel)上进行纯化，在琼脂糖凝胶上可视化，并用NcoI和NheI限制性酶(Biolabs)消化。然后将产物连接到用同样酶消化并被脱磷酸化的pBAD-α质粒中。使用连接混合物转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)细胞，并铺于LB氨苄青霉素(100mg/L)阿拉伯糖(0.5％)X-Gal(80μg/mL)平板上。
菌落筛选：
当克隆没有缺口的CFL1序列时，α肽不与ATG同相：菌落为白色。如果克隆到带有缺口的CFL1序列，产生了α肽，无活性的β-半乳糖苷酶(存在于细菌的基因组上)得到互补，大肠杆菌菌落变为蓝色(图2B)。
将蓝色菌落生长在补充有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，取1μL培养物通过实时PCR、使用CFL1特异性寡核苷酸和Syber-绿I(Sigma)进行筛选(图2C)。第一个寡核苷酸(图中的绿色)对这两个序列均有特异性，显示出2个样品之间质粒拷贝数没有差别。第二个寡核苷酸对CFL1参照序列(Refseq)有特异性，当序列不与Refseq一致时(图中的红色)显示出Ct之间的差异。
提取显示出Ct之间差异的质粒DNA克隆，并使用质粒(GATC biotech)上存在的寡核苷酸进行测序(图2C)。
将序列与CFL1参照序列比对。
TIAB检测
图1显示了在癌症组(Y轴)和正常组(X轴)二者中对每个K位置记录到的偏差的百分率。K缺口分布在为数有限(532或1.4％)的转录本上(图1中的插图)。这些mRNA已经失去了它们的规范阅读框，将被翻译成异常的、可能免疫原性的蛋白。为了检验这种假说，我们选择了代表2206个ORF缺口位置的一组15个K缺口(表5，PAP1到15)，它们分布在8条不同的人类染色体上。这15个位置分别来自8、5和2个U、C和G的缺失。我们证实了预测由具有单个碱基缺口的mRNA翻译产生的氨基酸序列1)编码长于12的氨基酸序列，2)不与任何已知的人类蛋白在超过7个连续的氨基酸上匹配(Swiss-Prot42)，3)彼此之间没有氨基酸序列同源性。我们还确立，所选择的K缺口还未被Sanger研究所体细胞突变目录(Sanger Institute Catalogue Of Somatic Mutations(http://www.sanger.ac.uk/cosmic)43)或被包含了本筛选中涉及的15个基因中的11个基因的两项最近的癌细胞基因组深度测序工作31，32，鉴定为癌症体细胞突变。K缺口不对应于生物学验证的或推导的SNP。最后，并根据dbSNP数据库的最近更新(2007年9月21日)，没有SNP导入的移码与所定义位置上游的单个缺口所产生的移码相同44。
将从人类对象抽取的血样分成两组或多组。所有样品是残余血清。至少一个组包括患有活动癌症的患者。收集与所有组、包括对照和活性癌症组相关的临床数据，并由训练有素的医生进行确认。关于对照的数据可以包括癌症风险因子。关于癌症患者的数据可以包括分级和对治疗的响应。对组进行设计，以评估一组TIAB以及它们对具体诊断指征例如早期癌症检测、癌症类型的鉴定、疾病严重性和进程的预测或对治疗的响应的特异性和灵敏度。
产生了对应于这些预测异常肽(PAP)的合成的N-末端生物素化肽，并各自包被在链亲和素Elia孔(Phadia，Uppsala Sweden)上。将来自46位癌症患者(研究I)和26位对照对象(表4)的血清，与空白(没有肽包被的孔)或肽包被的孔温育。在清洗后，与孔结合的IgG用产生荧光的商购的抗人类IgG不可变结构域第二抗体进行显示。在第一次分析中，将在任何给定对象中使用任何给定PAP测量到的荧光强度，从在同样对象中使用没有用肽包被的链亲和素孔(空白)时测量到的荧光强度中减去。结果显示了在癌症患者中，与对照相比，针对PAP 1、2、4、7的IgG有统计学显著的增加(Wilcoxon检验分别为P＜2E-8；P＜2E-3；P＜5E-2；P＜3E-2)(图3A)。在年轻(＜50岁)对较年老(＞50岁)正常对象中检测到的任何IgG的水平没有统计学显著的差异(Wilcoxon检验＝NS)，并且没有由于对照的性别引起的显著差异(Wilcoxon检验＝NS)。接下来，我们测试了针对PAP的IgG的检测是否在癌症和对照对象之间具有差异。当PAP包被的孔与空白孔之间的荧光强度差异比在对照组中测量到的最高值荧光强度更高时，测试被认为是阳性的(图3浅红和深红)。因此，将特异性任意地设定为100％。在这些条件下，除了一个之外，所有的PAP都在至少一个癌症患者上检测到；15个PAP中的6个在10％以上的患者中鉴定到了超过对照的IgG水平。合在一起考虑，患有7种最常见实体肿瘤形式的46位患者中的35位(76％)，具有高于对照组所限定的阈值的IgG水平。图3显示了结肠、肺和头颈部癌患者具有更多样化的阳性信号组，并分别对11、10和8种PAP阳性。乳腺癌患者的IgG只结合6种PAP。这种多样性在患有卵巢、皮肤和子宫癌的患者中进一步减少(图3)。
因此，使用该第一组15种PAP，覆盖度和特异性对于肺癌来说是最适的。灵敏的早期肺癌化验不存在，因此在该阶段的诊断是稀少的，5年存活率仅为14％(46)。
用于早期肺癌诊断的TIAB检测
本发明的重要暗示是，基于简单的血液化验，有可能使早期肺癌诊断成为可能。数据分析不需要复杂的统计学方法，因此过度拟合的风险降到最低10。此外，我们的试验不是系统性搜索生物标志物，而是根据生物信息学预测驱动的假说，因此由于多次测试导致偏差的风险低10。但是，由于这种发现的临床暗示，我们在独立的研究中寻求重复。
从不同制造商购买了具有选自表5的45种PAP的氨基酸序列的合成的N-末端生物素化肽，构成TIAB诱饵组，并各自包被到Reacti-Bind链亲和素包被的板(Pierce Biotechnology，Rockford，Illinois)上。将样品稀释100倍，分析以双份进行。与肽结合的血清IgG使用商购的结合有酶、特别是磷酸酶的抗人类IgG不可变结构域第二抗体进行显示。使用可商购试剂进行与荧光底物的反应。荧光读取在FLUOstar Galaxy微孔板读板器(BMG Labtech，Offenburg，Germany)上、按照制造商的说明书进行。
如果可以建立阈值来分开至少两组为该指征所设计的人类对象的话，选择组中的TIAB用于具体的诊断指征。对于选择的TIAB来说，在一个组中的绝对荧光强度高于阈值，以同样方式在另一个组中测量到的荧光低于阈值。
选择PAP以监测疾病进展或扩散
我们陈述了在前述实施例的方法(选择用于具体诊断指征的PAP/TIAB)后，在一组代表了疾病的各种进展或扩散阶段的患者的PAP组中选择PAP。
接下来，我们陈述了测试该组PAP在代表非小细胞肺癌(NSCLC)的各种阶段的第一组49位患者中的功效(图4)。
从25位健康对照、12位患有非癌症肺病，以及在诊断时从49位患有不同阶段NSCLC(表4，研究II)的患者获取血样。这些NSCLC患者代表了该疾病在法国的当前状态。由于缺乏可靠的早期检测方法，大多数NSCLC在诊断时已是晚期疾病，只有20％处于早期。每位患者和对照对表5的前37种PAP记录到的荧光强度(FI)结果显示为图4A。组之间的差异的统计学显著性通过Wilcoxon检验确定，结果在每张小图上标出。可以看到，对于37种PAP中的33种来说，在肺癌患者中的FI与对照相比明显增加。对于10种最具辨别力的PAP来说，Wilcoxon检验的p值为10-15到10-10(图4B)。单独的PAP1允许完美地区分对照和NSCLC(特异性＝100％，灵敏度＝100％)。
因此，带有SBG的异常mRNA翻译的副产物有助于调节对NSCLC的体液免疫应答这个假说，似乎是根据的。通过测试与PAP结合的IgG对其氨基酸序列有特异性，我们验证了这一点。因此，我们测量了针对白蛋白肽以及对基因组的基因1和3规范阅读所对应的肽的IgG的水平，所述基因1和3是对那些针对它们相应规范肽(CP)的IgG最具鉴别力的PAP的基因。这些CP由编码PAP(7、24、28)的相同基因和区段编码，但是其氨基酸序列源自于人类基因组的规范阅读，即没有移码。数据显示，在肺癌患者中针对CPs的Ig的滴度比针对PAP的低得多(图5)，并且CP不能辨别病例与对照(Wilcoxon NS)。
在小鼠中检测TIAB
为了将TIAB的概念扩展到其它哺乳动物并证实TIAB检测由癌症引起，我们寻求将该观察结果转换到小鼠模型。首先，我们选择了能够有效辨别NSCLC患者与对照的5种PAP。如图6A中所示，它们中的三种源自于在小鼠和人类之间在基因组水平上高度保守的基因。最重要的是，可能受影响的碱基在两个物种中是相同的，对于上游的4个碱基和下游的2个碱基来说情况也是这样。以前，我们已显示了这种短的DNA邻近序列允许TI事件发生的重要性34。另外2种所选的PAP来自于在小鼠和人类之间不保守的基因。可以产生PAP 9的基因在人类中存在，但是在鼠类基因组中不存在。在小鼠中，产生PAP 2翻译的基因在预定位置处发生SBG，在编码7个氨基酸后引入了终止密码子。还包含了对应于PAP 7的CP的附加阴性对照。将具有免疫活性(C57B16)的小鼠(n＝12)用小鼠Lewis肺癌(LLC1)皮下接种45，46。在LLC1移植之前以及以一周的间隔直到21天，测量与5种PAP和一种CP结合的IgG。这时，平均肿瘤尺寸是3.15+/-0.4cm3。如图6B中所示，在肿瘤植入后2周，针对PAP 7、PAP 48和PAP 62的IgG显著增加。对于PAP 7、PAP 48和PAP 62来说，成对t-检验的p值分别为1*10-4、3*10-4、9*10-4。我们没有观察到针对CP7的IgG水平的显著增加。
材料与方法
细胞培养
鼠类Lewis肺癌细胞系(LLC1)从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))获得。将细胞在含有补充了10％FBS、链霉素(0.1mg/ml)和青霉素(100单位/ml)的RPMI1640培养基(Invitrogen，France)的75cm2摇瓶中培养，维持在37℃下、含有5％CO2的空气的潮湿气氛中。
肿瘤移植
将LLC1肿瘤细胞(5*105个细胞在终体积为0.1ml的RPMI 1640中)皮下(s.c.)注射到7周龄C57bl/6雌性小鼠(Janvier，France)的右后臀腿区域中。在s.c.注射LLC1细胞后21天，通过测量每个肿瘤的二等分直径，并使用公式V＝a2*b*0.5236计算，其中“a”是较大直径，“b”是较小直径，来测量肿瘤体积。在s.c.注射肿瘤细胞之前，在异氟烷麻醉下取100μl血样，作为T0。每周一次在异氟烷麻醉下取100μl血样到EDTA管中，作为T7、14和21天。
临床验证
为了验证本发明的PAP组合能够产生强有力的肺癌诊断这个事实，我们进行了大规模的回顾性病例对照研究，该研究包括161位对照对象，他们是健康的献血者，年龄为18到65岁，没有排除吸烟者。患者是140位患有早期非小细胞肺癌的个体。在诊断时从这些患者收集血液。该组中所有患者都符合外科干预标准，因此对于绝大多数来说是早期阶段。该组中所有患者经历了外科手术，因此对所有患者都获得了手术后分级和病理分类。必须强调，该组中的患者没有接受手术前化疗或放疗。对照和患者的临床特征由表4的研究III显示。测试了患者和对照针对6种PAP的TIAB，测量在特定实验条件下进行。这种标记物组合的诊断值的统计学分析，使用支持向量机进行确定。在分析了可选分类方法的性能后，保留SVM。SVM确定了6维超平面，为对照和患者到该超平面的个体距离提供了度量。因此，数据显示成每个对象到超平面的相对距离。可以看到，癌症患者和对照这两个群体分离良好(图7A)。总体测试性能为灵敏度86％，特异性97％。只有5个对照在超平面的错误一侧。19位患有肺癌的患者在超平面的错误一侧。在反复交叉验证后，灵敏度和特异性分别为82％和95％。在较年轻和较年老患者之间，灵敏度没有差异(图7B)。从数据的检查可以看出，当前测试的灵敏度对于腺癌患者来说较低，它们的诊断灵敏度是76％，相形之下，对于其它类型的非小细胞癌来说，测试性能是灵敏度＞90％。测试性能的这些差异是统计学显著的(图7C)。
外科手术对肺癌的好处已经充分确立。这种好处不仅表现为预期寿命增加，而且表现为确定的治愈，这可以通过诊断数量与死亡数量的分析来确定。在法国，这些数字是≈33000例新诊断和≈28000例死亡。因此，可以可靠地确定5000位患者从肺癌治愈，即15％。所有的肺癌存活者都经历了外科手术程序，但不是经历了外科手术的所有肺癌患者都被治愈。目前，没有方法能够把将会得益于单独的外科手术的个体与不会从中得益的个体区分开。因此，我们寻求就诊断时预测的严重性方面评估该基于6种PAP的测试的性能。为了实现这一点，我们将研究群体细分成2个组。在第一个组中是我们有证据记录到无病存活超过36个月的患者。在第二个组中，患者在外科手术后36个月内发生了死亡或疾病复发。我们没有包括对其跟踪的时间短于36个月的患者，仅仅因为这些个体的跟踪时间太短而不能确定结果。然后，我们比较了这两个规模相似的患者组到超平面的距离。从图7D的数据可以明显看出，强烈得益于外科手术并且3年无病的患者，与从外科手术得益较少的患者相比，具有明显更长的到超平面的距离(P＝0.005)。该发现带来了2个即刻应用。首先，有可能该测试将鉴定患有早期肺癌并将从外科手术获得最有利的益处的患者。其次，对于有阳性测试诊断但到超平面的距离短的患者，应该适当设置合适的替代治疗干预。这样的替代措施可以是常规的放疗或化疗。然而，我们目前对数据的解释是对肺癌的存在具有低免疫应答的患者，不太可能得益于单独的外科手术。就此而言，在外科手术前或之后的短时间内，使用药物增强它们的免疫应答，可能是有用的。因此，我们在这里示例了发现PAP的重要性，作为将来创新性治疗策略的指导。
接下来，我们通过在特定实验条件下测试各种不同的PAP组合，试图发展肺癌特异性的测试。一种新的PAP组合对肺癌与对照相比，获得了100％的特异性和90％的灵敏度。最重要的是，当应用于患有乳腺癌的患者时，在20位患有乳腺癌的患者中只有3位显示出阳性测试。因此，在肺癌对乳腺癌的比较中，分别有10％和15％的患者被错误分类。我们认为，该误差率将导致不必要的和昂贵的下游诊断程序。对肺癌的跟踪诊断是胸部CT扫描，而对乳腺癌是乳房造影术和回声图像术。PET扫描可用于评估疾病的扩散。因此，我们开发了能够更有效区分肺癌与乳腺癌的特异性测试。发现有PAP的4种组合可以实现该目的。这些标志物的组合示例在图8B中。在所有4种情况下，肺癌患者与乳腺癌患者被区分开，其中有一位到三位患者重叠。因为这些标记物组合在疾病严重性方面的预测价值需要进一步评估，因此介绍了它们的临床重要性。我们的确预测到，与对肺所示例的相似，特定的PAP组合将在大规模研究中显示出对乳腺癌的临床结果的预测。在能够实现这一点之前，需要特异性乳腺癌测试。目前我们已经鉴定到3种标志物的组合，所述组合在特定条件下以60％的灵敏度和95％的特异性从对照中鉴定出乳腺癌(图8C)。我们现在的观点是，鉴定到PAP的组合，其能够从简单的血液测试指示在最常见癌症的早期阶段存在，将是可能的。其次，PAP的组合将为疾病的精确定位提供准确的指示，从而允许选择适合的次级诊断程序，例如CT扫描、乳房造影术、超声扫描术、纤维镜检术、内窥镜检查法、活组织检查。PAP测试的第三个方面将为每个个体对外科手术治疗的响应提供预后，从而为需要其它治疗措施提供指示。PAP的第四个方面将为监测疾病的复发和/或其对治疗的有利响应提供工具。
C-讨论
我们已经鉴定了触发虽然弱但是多样化的IgG生产的人类癌细胞蛋白异质性的新的、可预测的来源。这些低滴度的特异性IgG的精确测定为早期癌症诊断提供了有前景的机会，并能够提供与疾病扩散有关的信息。该发现源自于生物信息学预测与针对异常肽的特异性IgG的免疫学检测的趋同(convergence)。含有PAP序列的蛋白不能从正常人类mRNA翻译、而是只能从由于单碱基缺口而失去其规范基因组信息的mRNA翻译。
我们的数据支持了下述结论，即癌细胞中存在预测的带有单个缺口的mRNA，并且它们至少部分翻译。鉴定到的EST缺口的出现太常见而不会是通过癌症体细胞突变产生的31，32。目前对癌症体细胞突变率的估算导致预测了12种缺失，其中有4种是单个缺口。相反，我们观察了2206个统计学显著的事件。此外，没有一个所选的缺口对应于推断的或生物学证实的SNPs44。因此，mRNA缺口不可能在基因组水平产生，因此一定发生在下游，即转录期间或转录后不久。
已经确立，成熟前和成熟mRNA的碱基可以被酶修饰，但是还没有已知的人类mRNA编辑酶显示出能够从单链人类RNA中除去单个碱基47。已经显示，锥虫(Trypanosoma)线粒体mRNA编辑体(editosome)能够进行特异性U缺失48。但是，没有在人类基因组中发现锥虫和利什曼原虫(Leishmania)编辑体蛋白的同源物。此外，这种编辑机制是U特异性的，不能解释观察到的53％的人类癌症非U缺口。我们已经考虑到了剪接机制的向前或向后滑动可能引入将会影响外显子的最后或第一个碱基的单碱基缺口的可能性49。没有被测试的缺口位于这样的位置上。此外，后一种机制被发现是不可能的，因为超过2000个被鉴定的SBG中99.2％不在紧邻外显子-内含子边界内。最后，显然，短的DNA邻近序列对癌症EST缺口的出现施加了强烈影响，这与对EST碱基取代所证明的相似34，36，37。因此，我们目前假设，由Pol II引起的遗漏单个碱基掺入、即TI，导致了有缺口的mRNA的出现。
我们进一步示例了在预定位置处出现具有简单缺口的mRNA，在不存在体细胞或生殖细胞突变情况下在癌细胞中发生。因此，转录失真性的生物信息学概念在人类中得到生物学验证。
本文报道的发现的第二个最重要的结果是人类基因组的规范阅读不足以解释癌细胞的异质性。因此我们提出在癌细胞中转录失真性增加。支持这种提议的证据如下。首先，我们以前已经通过DHPLC显示，癌细胞的mRNA与从正常细胞分离到的相比，更为异质34。癌症与正常mRNA相比序列变异增加，这由依靠SAGE实验的独立研究所证实。其次，对所有可用的人类mRNA衍生序列的分析显示出，相对于正常的文库，在癌症中碱基取代、插入和缺口(SBG)有统计学显著增加。这些事件的发生比癌症体细胞突变的发生更常见103倍。如果出现在DNA水平上，这种突变率很可能是致死性的。因此，可以合理地假定，这些变异发生在转录期间或转录后不久，并只影响成熟前和成熟mRNA，即瞬时分子。第三，目前还不知道TI之外的其它分子机制能够从mRNA除去或添加单个碱基并然后重新组装序列。因此，在DNA水平上不存在突变的情况下直接观察到在人类肺癌中出现的预测的SBG，表明RNAP可以跳过阅读单个DNA碱基并仍然继续前进。最后，来自其他组的研究显示，即使不存在癌症，TI也能在体内发生。具体来说，在Brattleboro大鼠中，在GAGAG序列中发生的GA缺失使血管加压素转录本恢复正常，从而抑制了尿崩症。影响β-淀粉样肽和泛素B的重复A序列的转录移码，产生了可以通过阿兹海默氏病斑的免疫染色检测到的蛋白。
目前，我们倾向于下述假说，即癌症mRNA的异质性增加是癌发生的结果而不是原因。的确，我们正在发生间变性大细胞淋巴瘤并带有间变性淋巴瘤激酶(ALK)易位的儿童的血清中，检测针对我们现在的PAP组的特异性IgG(G Delsol和B Bihain，未发表的结果)50。对啮齿动物的研究已经证实，引起该激酶的组成性表达的易位是最初的致癌事件，其单独就足以引起转化51。因此，检测到反映出编码功能不相关基因——即不是该特异性易位的一部分的基因——的异常mRNA的产生的阳性信号，表明该现象作为这种致癌病变的结果而发生。但是，有可能TI有助于加速癌发生。事实上，参与转录、翻译和DNA修复的调控的几个基因，因为其推断的基因功能不是PAP选择过程的一部分而没有包括在本研究中，它们通过生物信息学被鉴定为具有K缺口。因此，可能我们面临着多样性和强度随着疾病发展的严重性而增加的自身催化过程。
生物信息学表明，mRNA中SBG的出现是癌症的常见特征。但是，在淋巴瘤患者(N＝27)中也发现了IgG分布情况的差异。在NSCLC中通常为阳性的PAP 1和2在滤泡性和间变性淋巴瘤患者中都是阴性的。这与PAP 4和7相反，它们在间变性大细胞淋巴瘤中通常是阳性的，但是在滤泡性淋巴瘤中不是。因此，由于可用的PAP组的多样性(＞2000个候选物)，我们提出了设计肿瘤特异性PAP组。通过证明PAP有效地将肺癌患者与乳腺癌患者分开的能力，我们已经示例了这种概念。
我们的结论是，具有单碱基缺口的mRNA至少部分翻译成异常蛋白，表明在癌细胞中无义介导的mRNA降解可能是有缺陷的52。考虑到当前的蛋白质组学工作，这种高度多样化的异常蛋白组还迄今保持未被检测到，是令人吃惊的。解释有两方面。1)通过质谱进行的蛋白质鉴定依赖于与已知或推断的氨基酸序列所定义的预测谱图所观察到的匹配53。从mRNA缺口产生的异常蛋白的氨基酸序列不在当前的蛋白数据库(Swiss-Prot/TrEMBL42)中，因此不能通过MS/MS分析进行鉴定。2)蛋白酶体快速降解异常蛋白，产生了可能异常的免疫原性肽54
TI在癌症中增加的概念，引起了对目前的癌症生物标志物发现策略的质询，并导致提出了新方法。系统性癌症蛋白质组学方法产生了冲突的结果，分歧被归因于分析前条件的变化。情况可能确实如此，但现在必须考虑可选的解释。如果人们接受癌细胞蛋白的异质性大大超过当前的估计，那么有可能样品量不足以完全探测蛋白变体的高度多样化的所有组成部分。正如前面提到的，目前的蛋白质组学的另一个限制是，质谱数据目前用人类基因组的规范阅读进行解释。因此，具有异常氨基酸序列的蛋白可能逃脱了适合的鉴定。因此，在癌症蛋白质组学成功之前，可能需要不仅是方法上、而且是概念上的改变。通过将本发明的转录失真性考虑在内，可以鉴定更可靠和相关的生物标志物。
我们已经显示，在小鼠癌细胞中有三种异常蛋白由高度保守但功能不相关的基因编码。在LLC1中丰度最高的异常蛋白是源自于Poly(A)结合蛋白胞质1(PABPC1)的异常蛋白(PAP 62)。正常情况下，PABPC1与mRNA poly A结合，并调节无义介导的降解(NMD)途径，该途径降解含有提前终止的mRNA。将PABPC1束缚在提前终止密码子的下游废止了NMD。在LLC1中丰度第二高的异常蛋白由波形蛋白基因(VIM)编码(PAP 48)。波形蛋白是III型中间纤维蛋白，形成同源或异源聚合结构，有助于支持细胞膜、将核和细胞器保持在限定位置、以及与微管结合。丰度第三高的异常蛋白是由IK基因编码的异常蛋白(PAP 7)。IK的正常功能是抑制γ干扰素诱导的II类主要组织相容性复合物的表达的细胞因子的功能。IK也被鉴定为软骨肉瘤相关蛋白2。这些变体在癌细胞中存在的后果目前还不知道。但是，绝不能排除强烈干扰癌细胞生物学的可能性，它们对癌细胞代谢、形态学改变以及mRNA异质性的贡献将需要进一步研究。在目前阶段，我们已经能够确定，大多数PAP调节对人类中的NSCL癌和小鼠中的LLC1的体液免疫应答。我们预计，这些异常蛋白的癌细胞生产可能通过显性阴性或阳性效应明显改变细胞的功能。因此，这三种高度保守的基因可能提供了新的治疗靶。
小鼠肺癌模型分析在LLC1的存在和抗PAP IgG检测之间建立了因果关系。因此，抗PAP IgG似乎是由癌症引发的正常的、适时的免疫应答的一部分。有趣的是，在小鼠中，抗PAP IgG水平比在患有肺癌的人类中测量到的高得多(100倍)。在小鼠中肺部肿瘤的相对尺寸也大得多，并且LLC1被异位植入到皮下组织中，这些事实为这些差异提供了可能的解释。
因此，本发明描述了新的机制，癌症通过该机制调节体液免疫应答。在目前阶段，我们提出，新的机制TI造成了癌细胞mRNA的异质性的急剧增加，这些异常信息的一部分翻译成异常蛋白，一些异常蛋白在癌细胞中积累，大多数异常蛋白调节癌症体液免疫应答。因此，本发明提供的产品和方法允许正确地区分患有癌症的患者与未患活动癌症的患者。因此，有可能为处于风险的个体精心设计系统性生物化学筛查，对具有阳性测试的患者进行全身成像，并增加早期阶段诊断的对象的比例。
表1.统计学检验的结果
| K | LBE | N | LBE | K/N | (K-LBE)/(N-LBE) | |
| 缺口 | 2,761 | 11 | 216 | 144 | 12.78 | 38.19 |
| ORF内的缺口 | 2.191 | 162 | 13.52 | |||
| 取代 | 1,894 | 92 | 928 | 186 | 2.04 | 2.43 |
LBE是指基于假阳性率估算量的位置。
表2.生物信息学分析的结果
分析结果在检索了从2000年1月到2007年7月发布到未过滤公共数据库中的所有可用人类ESTs后得出。表中还显示了匹配第一(有效性＞70)的第二次统计学检验标准的位置的数量。
表3.TI肽和核酸序列
表3a：2206个缺口TI肽的核酸和氨基酸序列。在本文件中指称的SEQ ID NOs 1-2206表示在表3a的第6列中描述的肽序列。
表3b：1128个插入TI肽的核酸和氨基酸序列。在本文件中指称的SEQ ID NOs 2207-3334表示在表3b的第6列中描述的肽序列。
表4.对照个体和癌症对象的临床数据。
●国际抗癌联合会(International Union Against Cancer)(UICC)：《恶性肿瘤的TNM分类》(TNM Classification of malignant tumours)，第四版，Hermanek P，Sobin LH主编，Berlin，Heidelberg，New York：Springer Verlag；1987.1992年修订。
研究III
| n | ％ | 年龄(y) | 最小 | 最大 | |
| 对照 | 161 | 42±14 | 18 | 65 | |
| NSCLC | 140 | 61±11 | 38 | 86 | |
| T1-2-3-4N0M0 | 78 | 56 | 61 | 38 | 86 |
| T+N+M0 | 43 | 31 | 69 | 44 | 86 |
| T+N+M+ | 19 | 13 | 61 | 46 | 77 |
| ADK | 67 | 48 | 60 | 45 | 82 |
| 鳞状 | 40 | 33 | 65 | 48 | 86 |
| 其他 | 33 | 19 | 58 | 38 | 82 |
研究IV
| n | ％ | 年龄(y) | 最小 | 最大 | |
| 对照 | 20 | 47±13 | 20 | 62 | |
| NSCLC | 20 | 61±10 | 48 | 83 | |
| T1N0M0 | 9 | 45 | 60±7 | 49 | 70 |
| T2N0M0 | 11 | 55 | 62±12 | 48 | 83 |
| 乳腺 | 20 | 56±10 | 36 | 68 | |
| 1级水平 | 4 | 20 | 60±6 | 53 | 67 |
| 2级水平 | 9 | 45 | 56±10 | 40 | 68 |
| 3级水平 | 7 | 35 | 54±11 | 36 | 68 |
表5. 45种PAP多肽的特征
“PAP编号”是在本文本中指称的PAP的编号。
“SEQ ID NO”是序列表中的标识符。
“SEQ ID上的PAP坐标”是指PAP多肽的氨基酸残基在引用的SEQ ID中的位置。
表6. 5个阴性对照
| 符号 | 基因名 | 序列 |
| ALB | QHKDDNPNL PRLVRP | |
| 基因1上的CP | MRP L12 | IQQLVQDIASLTLLEISDLNELLKKTLKIQ |
| CP7 | IK | ALLQKVRAEIASKEKEEEE |
| CP28 | CFL1 | FVKMLPDKDCRYALYDATYETKESKKEDLV |
| CP24 | NDUFAB1 | LDQVEIIMAMEDEFGFEIP |
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Claims (37)
1.用于在对象中检测癌症的存在、风险或发展阶段的方法，所述方法包括将来自对象的样品在体外与包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽接触，其中所述多肽与所述样品中存在的抗体(TIAB)或带有TCR的细胞之间的复合物的形成是癌症的存在、风险或发展阶段的指示。
2.权利要求1的方法，其中所述样品中所述TIAB或免疫细胞的水平与参照值进行比较，并且其中与参照值相比的变化是癌症的存在、风险或发展阶段的指示。
3.权利要求2的方法，其中所述与参照值相比的变化是10％、20％、30％、40％、50％或以上。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中多肽包含选自SEQ ID NOs：1至3334的序列或其含有表位的片段。
5.权利要求4的方法，其中多肽包含表5的45种PAP多肽中任一种的序列。
6.权利要求4或5的方法，其中在所述样品中TIAB或免疫细胞的水平与参照水平相比增加，是癌症的存在、风险或发展阶段的指示。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中癌症是实体肿瘤或液体肿瘤，优选为结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、头颈部癌或黑素瘤。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中癌症是肺癌，并且多肽包含选自SEQ ID NO 1、2、4、6、7、1413、581、1457、1769、1270、1276、1396、80、1810、1864、847、2119或1451的序列或其含有表位的片段，特别是包含选自表5中显示的PAP 1、2、4、6、7、24、25、28、29、44、48、66、70、68、69、74、94、82的序列。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中接触步骤包括将样品同时与几种、优选为2到10种含有由转录失真性产生的独特异常蛋白结构域的序列的多肽接触。
10.评估患者的生理状态的方法，所述方法包括在来自对象的样品中测量对由转录失真性产生的异常蛋白结构域特异性的抗体(TIAB)、或与这种结构域结合的带有TCR的免疫细胞的存在或水平的步骤，其中所述样品中所述TIAB或免疫细胞与参照值相比的变化水平，是生理失调的指示。
11.确定癌症治疗功效的方法，所述方法包括(i)在来自对象的样品中，测定至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽的水平、或TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(ii)将所述水平与治疗之前或治疗较早期阶段从所述对象获取的样品中的水平进行比较。
12.监测对象中癌症的进展或扩散的方法，所述方法包括(i)将从所述对象获得的样品与至少一种包含由转录失真性产生的异常蛋白结构域的序列的多肽接触，(ii)测定所述样品中TIAB或相应的带有TCR的细胞的水平，以及(iii)将所述水平与参照值进行比较，变化是癌症的进展或扩散的指示。
13.权利要求11至12任一项的方法，其中多肽包含选自SEQ IDNOs：1至3334的序列或其含有表位的片段。
14.权利要求12的方法，其中多肽包含表5的45种PAP多肽中任一种的序列。
15.权利要求12或13的方法，其中接触步骤包括将样品同时与几种、优选为2至10种所述多肽接触。
16.确定个体是否正在产生含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽的方法，所述方法包括将从所述个体获得的样品与指示所述多肽存在的药剂接触，以及确定所述药剂是否与所述样品结合。
17.权利要求16的方法，其中所述药剂是与抗体结合的多肽，所述抗体与含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽特异性结合。
18.权利要求16的方法，其中所述药剂是与免疫细胞结合的多肽，所述免疫细胞包含对含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽特异性的TCR。
19.权利要求16的方法，其中所述药剂是与含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽特异性结合的抗体或其部分。
20.权利要求16的方法，其中所述药剂是免疫细胞，所述免疫细胞包含对含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列的多肽特异性的TCR。
21.权利要求1至18任一项的方法，其中多肽被固定化在支持物上。
22.选择、表征、筛选或优化生物活性化合物的方法，所述方法包括将测试化合物在体外与基因接触，以及确定所述测试化合物调节从所述基因生产含有转录失真性缺口的RNA分子的能力。
23.生产对转录失真性特异性的肽的方法，所述方法包括：
a)鉴定由转录失真性缺口产生的蛋白结构域；
b)合成含有a)的所述蛋白结构域的序列的肽；以及
c)任选在来自哺乳动物对象的生物学样品中证实肽与抗体结合。
24.含有选自SEQ ID NOs：1-3334的序列或其含有表位的片段的多肽。
25.分离的多核苷酸，其编码权利要求24的多肽。
26.权利要求25的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸被标记。
27.分离的核酸，其包含编码选自SEQ ID NOs：1-3334的多肽的第一个核苷酸序列或与其互补的序列，以及长度为100个或以下核苷酸的第二个核苷酸序列，其中所述第二个核苷酸序列在天然存在的核酸中与所述第一个核苷酸序列相邻。
28.克隆或表达载体，其包含权利要求25或27的多核苷酸。
29.细胞，其用权利要求28的载体转化或转染。
30.分离的抗体或抗体的部分，其与选自SEQ ID NOs：1-3334的多肽特异性结合。
31.分离的细胞，其与选自SEQ ID NOs：1-3334的多肽特异性结合。
32.权利要求31的分离的细胞，其中所述细胞是包含对选自SEQID NOs：1-3334的所述多肽特异性的TCR的免疫细胞。
33.固相支持物，其包含至少一种含有选自SEQ ID NOs：1至3334的序列或其含有表位的片段的多肽。
34.固相支持物，其包含至少一种与选自SEQ ID NOs：1-3334的多肽特异性结合的抗体或抗体部分。
35.装置或产品，其包含固定化在支持物上的至少一种含有由转录失真性缺口产生的异常蛋白结构域的序列的多肽。
36.权利要求35的装置，其包含权利要求23的一种或几种多肽。
37.试剂盒，其至少包含权利要求35或36的装置或产品，以及进行免疫反应的试剂。
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