CN105637367A - 胰腺癌相关材料和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰腺癌相关的材料和方法以及施用于胰腺癌的个体化药物。具体地，本发明涉及用于确定显著调节的蛋白质磷酸化和/或表达以及共同提供肿瘤概况的信号转导通路活性的材料和方法，该肿瘤概况能够基于肿瘤复发的可能性或胰腺癌中激活的药物靶标的身份指导选择最合适的治疗方法。

Description

胰腺癌相关材料和方法

技术领域

本发明涉及胰腺癌相关材料和方法以及施用于胰腺癌的个体化药物。具体地，本发明涉及用于确定显著调节的蛋白质磷酸化和/或表达以及共同提供肿瘤概况的信号转导通路活性的材料和方法，该肿瘤概况能够基于肿瘤复发的可能性或胰腺癌组织中激活的药物靶标的身份来指导选择最合适的治疗方法。

发明背景

蛋白质磷酸化是调节致癌和肿瘤抑制蛋白质的活性的常规过程[1-3]。在许多情况中，由于蛋白质折叠、底物亲和性、稳定性和其底物活性的调节，磷酸化导致蛋白质功能的切换状变化，转而影响控制细胞增殖、迁移、分化和凋亡的信号转导通路。因此磷酸化失调可能导致癌症表型[4]并且提供明显无法使用基因组方法测量的新药物靶标、诊断和预后生物标记物的潜在资源。胰腺癌是最有侵略性的恶性肿瘤之一，其诊断后的平均存活是6个月。这部分是由于很大比例的患者在治疗选项非常有限的晚期阶段被诊断出的事实的结果[5]。与其他癌症的情况相同，分子靶向疗法有希望用于治疗晚期或复发胰腺癌[6]。虽然大多数的分子靶向药物在最近十年中已经出现并且预期在未来几年内有许多其他分子靶向药物，在药物作用和药物选择上仍然需要突破。例如，索拉非尼，一种作用于高活性血管内皮生长因子受体、血小板衍生的生长因子受体和Raf的多激酶抑制剂已经在一些晚期肝细胞癌患者中证明功效[7]，但是由于现在没有能够在治疗开始之前预测其在个体患者中的效果的通路活性测试，响应率仍然低得令人沮丧。

人们早已认识到化疗，甚至与高选择性分子靶向药物联用将最终由于获得性耐药而失败。通常这是通过在药物治疗的选择压下从一条致癌通路向另一条致癌通路的切换所驱动的。例如，B-Raf的V600E突变是侵略性黑色素瘤中导致Raf信号转导通路的过度活化的共同特征。基于明显的初始治疗响应，快速开发并批准了V600EB-Raf的高选择性抑制剂。然而，绝大多数患者最终通过多种不同机制复发，尽管B-Raf信号转导被沉默，这些机制包括异常二聚化、Raf同种型切换以及MEK和ERK的替代性活化。针对这种获得性耐药模式所提出的解决方案是给予多种分子靶向药物组合，其各自可能不足以杀死肿瘤，但是一起作用能够封闭发展的耐药性。这种策略已被称为“协同致死”。

发明内容

发明人已经认识到需要可靠并且节约时间和成本的手段来确定用于治疗胰腺癌的最优药物组合，以及预测和监测这类肿瘤中的药物耐药性。

因此，发明人着手建立分析方法以辅助药物选择，其中基于具体分析综合评价多种药物靶标的表达和活性。磷酸化是调节蛋白质活性的关键事件，因此测量蛋白质磷酸化是激活状态的有用指示物。

存在上百个抗癌药物靶标和上千个致癌信号转导蛋白质，并且使用免疫组化(IHC)、现有金标分析测量所有这些的表达和激活状态以指导最优治疗选择是不可行的。反相蛋白质微阵列(RPMA)具有提供比IHC更宽的覆盖率的潜力，但是由于当前磷酸化位点特异性抗体库规模小和弱特异性/交叉反应性而具有限制。由于控制致癌活性的初次调控过程是翻译后修饰，基于基因组的技术不能提供替代解决方案。此前已经开发了基于蛋白质组方法的液相-质谱(LC-MS/MS)来鉴定并定量上千种蛋白质及其磷酸化位点[8，9]并且发明人现在已经成功地将这些方法适用并应用于致癌信号转导通路的分析以鉴定在单个肿瘤内表达的最优药物靶标。

发明人已经开发了一种新的基于LC-MS/MS的蛋白质组学工作流程来克服在具体分析基础上在全局或系统宽的水平上有效鉴定和定量激活的蛋白质、激活的信号转导通路，和激活的药物靶标中涉及的许多技术和生物信息难点。具体而言，发明人使用能够同时分析多个样品的同位素和/或同重元素质量标签标记提供了可应用于实验性癌细胞系、异种移植肿瘤组织和临床组织的高密度磷酸-蛋白质组学工作流程[10，11]。优选地，同时分析2个或更多个样品。最优选地，可一起分析至少10个样品。样品可以是来自个体患者或来自超过一名患者，例如至少2名、至少3名或至少4名患者的成对的来自肿瘤的组织和相邻健康组织。最优选地，在单个10-重实验中一起分析来自5名患者的成对的肿瘤和健康组织。

本发明的一个特定特征在于，考虑到各单个患者生成的大量数据，提供了用于数据储存、修复和分析的系统。具体地，发明人提供了数据库和一套数据分析工具，以从它们的复杂数据集中提取相关的生物学信息。

具体地，发明人已应用它们的总磷酸-蛋白质组学工作流程(SysQuant)来比较癌性和非癌性胰腺组织。磷蛋白组学工作流程使得能够同时测量多个磷蛋白并且提供对样品中信号转导活性的快速测量。这种工作流程已经使发明人能够鉴定在所有胰腺癌病例中间在平均水平上癌性和非癌性组织类型之间表达和活性上显示出显著调节的信号转导通路和药物靶标以确定胰腺癌表型的共同影响因素(driver)。发明人能够询问整个数据库来鉴定对单个病例或亚组而言独特的导致癌症表型的分子事件的不同组合。因此，该工作流程不仅首次提供了诊断胰腺癌的方式，更重要的是首次提供了在具体分析基础上基于这些新确定的靶标的激活状态将患者分级至不同治疗方案的方式。

另外，测量磷酸肽分子概况首次获得胰腺癌的预后工具。磷酸肽丰度的分级聚类基于复发和不复发将患者分组。这导致鉴定到许多预后磷酸肽并且因此鉴定到形成本发明的独立方面的它们的相应磷蛋白标志物。

发明人所采用的方法允许同时检测来自患有胰头腺癌的患者的肿瘤对比背景胰腺组织中超过2000个蛋白质的超过5000个磷酸化位点。这些中的许多被确定为已知影响药物靶标活性的调节磷酸化位点，如FYN、GSK3α/β、HDAC1/2、RAF激酶、MAPK(p38和ERK2)、AKT、PKC、酪蛋白激酶等。

发明人使用各蛋白质独特的非磷酸化肽的log₂T/NT比率作为代替物来计算相应蛋白质的相对丰度以确定与非肿瘤(NT)组织相比，肿瘤(T)中蛋白质的相对丰度。

从该信息中，他们发现可能开一种发预测性算法来将组织样品分配到肿瘤或非肿瘤表型，即，作为诊断辅助。此外，他们发现差异激活的通路蛋白质可用作治疗靶标。即，可开发能够直接或间接地适当调节感兴趣的蛋白质的表达、激活或抑制至正常健康组织中发现的那些水平的药物。

已经在上千个蛋白质之间建立了个体磷酸化位点状态综合数据库，本发明首次提供了进行多个其他分析的手段。例如，预测肿瘤复发的可能性和潜在时间的能力在设计最优治疗策略中提供了主要益处。使用对数据的分级聚类分析，发明人惊讶地发现能够独立于任何其他临床数据来将肿瘤分类成复发和不复发表型。甚至更令人惊讶地，蛋白质磷酸化位点的亚组与复发高度相关，并且这些各自代表胰腺癌中新的治疗靶标或标志物。因此，发明人也提供了新的治疗靶标以能够开发用于治疗胰腺癌的分子靶向药物。

在本发明的另一个方面，与复发胰腺癌表型相关的经调节的蛋白质磷酸化位点中的一个或多个代表了诊断和预后复发胰腺癌的新型标志物。按照本发明的这一方面，提供了检测和/或定量一个或多个位点处的磷酸化的手段。这类方法包括但不限于免疫组化、Western印迹、ELISA和质谱。

为了确认在各情况中与非肿瘤组织相比，肿瘤中激酶、其他酶和其他蛋白质类型的相对激活状态，发明人使用含有已知诱导酶激活或抑制的磷酸化位点的磷酸肽的相对丰度。表15提供了显示log₂T/NT比率≥1或≤-1的所有磷酸肽，在各情况中，这些肽含有已知诱导磷酸化的酶的激活或抑制的磷酸化位点。

除了确定在将所有情况平均化之后，哪些蛋白质和磷酸肽在肿瘤和非肿瘤组织之间的丰度上有显著差异以外，发明人也证明哪些磷酸肽在各个体患者内受到高度调节并且在此提供了用于诊断和预后，包括预测胰腺癌复发和药物耐药性的标志物和靶标。

例如，发明人已经确定糖原合成酶激酶-3α和β、组蛋白去乙酰化酶1和2、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶A-Raf、双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶6、促分裂原-激活的蛋白激酶14(p38MAPK)和超过20种其他酶的相对激活状态(参见，例如，表4和表15)。

发明人还提供了证明它们的LC-MS工作流如何能够同时检测肿瘤组织中1000种信号转导和结构蛋白质相对于非肿瘤组织的丰度和活性，以及如何能够使用这类检测来更好地理解导致癌症的分子事件并因此指导最合适抑制剂的选择以使用经批准或实验性分子靶向药物中的一种组合，在个体基础上治疗患者的示例。关键地，发明人已经证明使用磷酸肽log₂T/NT比率的分级聚类可以鉴定出与不太可能显示出胰腺癌复发的那些患者相比在相同的时间点处更可能显示出胰腺癌复发的那些患者。

因此，就最普遍而言，本发明提供了用于通过鉴定显示癌症和非癌症组织类型之间的表达和活性的显著调节的信号转导通路和药物靶标来进行胰腺癌的诊断、预后和治疗(包括靶向疗法的选择)的材料和方法。本文提供的数据显示在具体分析基础上驱动癌症表型的分子事件，并且首次向临床医师提供了不仅能够预测最有效的靶向治疗，同时能够预测胰腺癌复发的可能性的手段。

在第一个方面中，提供了包括胰腺肿瘤分类设备和信息通讯终端设备的胰腺肿瘤分类系统，所述胰腺肿瘤分类设备包括控制元件和存储元件，所述设备通过网络彼此通讯联接；

(1)其中信息通讯终端设备包括

(1a)将衍生白对象的胰腺肿瘤样品的蛋白质数据传输到胰腺肿瘤分类设备的蛋白质数据传送单元；

(1b)接收从胰腺肿瘤分类设备转送的对象的胰腺肿瘤分类结果的结果接收单元；

(2)其中胰腺肿瘤分类设备包括

(2a)接收从信息通讯终端设备传输的衍生自对象的胰腺肿瘤样品的蛋白质数据的蛋白质数据接收单元；

(2b)将来自数据接收单元的数据和在存储单元中存储的数据做比较的数据比较单元；

(2c)基于数据比较单元的结果确定对象的胰腺肿瘤的类别(例如，分子表型)的分类器单元；和

(2d)将通过分类器单元得到的对象的分类结果传输到信息通讯终端设备的分类结果传送单元；和

其中，存储单元含有选自表2、3、4、11、12、13和/或15的至少一种(优选多种)蛋白质的蛋白质表达水平和/或磷酸化数据。

存储单元可含有选自各表2、3、4、11、12、13和/或15的至少一种或多种蛋白质的蛋白质表达水平和/或磷酸化数据。即，存储单元可含有来自表2的2种或更多蛋白质的数据与来自表3、4、11、12、13和/或15的2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种蛋白质的组合；或其任意组合。来自表2、3、4、11、12、13和/或15的蛋白质的组合可适用于本文所述的本发明的各个方面。

衍生自对象的胰腺肿瘤样品的数据优选是表达水平数据和/或磷酸化状态数据，如从本文所述的方法所得的那些，例如，LC-MS/MS和其他蛋白质组学方法。数据可仅衍生自肿瘤(或疑似肿瘤)样品，但在优选的实施方式中，也可提供衍生自相同对象的非肿瘤(背景)胰腺组织的第二数据集。

数据接收单元所接收的蛋白质数据可以是实际蛋白质或磷蛋白水平，或者其可以是从中计算蛋白质或磷蛋白水平的肽或磷酸肽水平。肽或磷酸肽对于至少一种(优选多种)蛋白质或磷蛋白是独特的。在一些实施方式中，优选使用多重，即，2、3、4或5种肽，其全部对于所述蛋白质是独特的。在使用多重肽的情况中，可整理数据并且任选地在数据比较步骤中使用中值。

存储单元优选包括与代表胰腺肿瘤的蛋白质表达水平和/或磷蛋白水平相关的数据集。在优选的实施方式中，蛋白质表达水平和/或磷蛋白水平衍生自样品中的实际肽或磷酸肽水平。如果已经使用蛋白质组学方法，如本文所述的LC-MS/MS方法得到数据时，尤其如此。数据集可从数据集集合提供胰腺肿瘤中发现的蛋白质表达水平或磷蛋白水平的代表性(例如，平均)水平，如本文中表12所提供。或者，优选数据集包括代表蛋白质表达水平或磷蛋白水平与获自相同来源的背景组织的蛋白质表达水平或磷蛋白水平相比的比率的值。例如，该值在本文中表示为Log2T/NT。

除了确认样品是胰腺肿瘤以外，蛋白质数据存储单元中保留的数据集允许系统将肿瘤分类成复发或不复发类。通过输入代表取自对象的胰腺组织样品的磷蛋白水平的数据，和任选地，代表取自相同对象的背景胰腺组织的磷蛋白水平的数据，数据比较单元可将该数据与至少包括与存储单元中保留的选自表11的多重蛋白质相关的数据的数据集比较。

在一个实施方式中，提供了预测治疗后的对象中胰腺肿瘤复发的可能性的方法，所述方法包括检测获自所述对象的肿瘤样品中选自同源域-相互作用蛋白激酶I(HIPK1)；丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)；和肌球蛋白轻链激酶，平滑肌(MLCK)的至少一种蛋白质的磷酸化水平，与背景(非肿瘤)水平相比升高的磷酸化水平是肿瘤复发可能性的指示。

通过这种方式，系统可比较获自胰腺肿瘤样品的磷蛋白水平与代表相同蛋白质的肿瘤复发表型的磷蛋白水平，并从而将肿瘤分类为可能复发的肿瘤或可能不复发的肿瘤。

在优选的实施方式中，磷蛋白水平的比较也可提供对肿瘤复发时间的预测，例如，在切除肿瘤后8至33个月、10至20个月或15至17个月。

上述的胰腺肿瘤分类系统也可用于基于药物敏感性分类胰腺肿瘤。在该实施方式中，存储单元可含有，至少多种选自表15或表4的蛋白质的磷蛋白数据。

例如，发明人已经确定与正常胰腺组织相比在胰腺肿瘤中上调或下调(和/或具有磷酸化状态差异)的磷蛋白，和已经鉴定含有已知诱导磷酸化的蛋白质(例如酶)的激活或抑制的磷酸化位点的那些磷蛋白。(参见表15和表4)。

因此，通过比较胰腺肿瘤样品的磷蛋白水平与选自表15和/或表4的多种蛋白质的磷蛋白水平，系统可能基于药物敏感性对肿瘤进行分类。药物可选自GSK2141795、GSK2141796、GSK214179、达沙替尼、AEZS-131、伏立诺他和索拉非尼。

在一些情况中，样品的磷蛋白水平与以下蛋白质的1种或多种、2种或多种、3种或多种、或全部的磷蛋白水平比较：糖原合成酶激酶-3α和β、组蛋白去乙酰化酶1和2、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶A-Raf、双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶6、促分裂原-激活的蛋白激酶14(p38MAPK)。

可使用胰腺肿瘤分类系统来确定获自对象的肿瘤或非肿瘤表型，其中存储单元含有与选自表12或表2的多种蛋白质的蛋白质表达水平相关的数据。

结果，系统可比较从样品确定的蛋白质表达水平与代表胰腺肿瘤的存错单元中保存的表达水平。通过这种方式，样品可被鉴定为肿瘤或非肿瘤。

虽然发明人知道该系统可用于进行对表型的独立分类，即肿瘤对非肿瘤、复发表型对不复发表型、药物敏感性概况、和原发肿瘤对次生(转移肿瘤)，系统的存储单元内含有的数据优选将允许样品分类为多重表型，例如，肿瘤，预测的复发和药物敏感性概况。

在优选的实施方式中，系统还包括通过数据传送单元向存储单元中已经保存的存储数据添加数据的数据，使得在由确定单元进行的分析中可包括这一新数据。通过这种方式，持续更新代表胰腺肿瘤分子表型的数据。

在优选的实施方式中，胰腺肿瘤分类系统连接至用于确定胰腺肿瘤样品中蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平并将该数据给予蛋白质数据传送单元的设备。

理想地，如本文所述，该设备可使用LC-MS/MS来处理多份样品。

按照本发明的第一方面，还提供了胰腺肿瘤细胞分类程序，其使包括控制元件和存储元件的信息处理设备执行确定和/或分类对象的胰腺肿瘤的方法，该方法包括：

(i)比较步骤，其比较基于获自对象的选自表2、3、4、11、12、13和/或15的至少一种(优选多种)蛋白质的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平的数据与存储元件中保存的蛋白质表达水平数据和/或蛋白质磷酸化数据；和

(ii)分类步骤，其用于基于比较步骤中的计算比较对所述对象的胰腺肿瘤细胞进行分类；并且其中所述肿瘤分类成包括肿瘤、非肿瘤；肿瘤复发、肿瘤不复发；原发肿瘤、次生(转移)肿瘤和/或药物敏感性的表型。

按照本发明的这一方面，还提供了计算机可读记录介质，包括其上记录的上述胰腺肿瘤分类程序。

代表蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平(即，磷酸化的蛋白质的量)的数据可衍生自样品中的肽水平和/或磷酸肽水平，其中所述肽和/或磷酸肽各自对选自专门表格的特定蛋白质是独特的。表格中提供了各蛋白质的示例性肽和磷酸肽。然而，应理解可设计其他肽和磷酸肽，其也应对于其衍生的蛋白质是独特的，例如，通过蛋白酶消化，如胰蛋白酶、aspN、gluC和本领域熟知的其他这类酶来衍生。

对于本文所述的本发明的所有方面，蛋白质数据所衍生自的样品可获自已经诊断患有胰腺癌的对象，或者其可获自疑似患有胰腺癌的对象。因此，对于后者，癌症的分类也可包括诊断。

在本发明的第二方面，提供了诊断对象中的胰腺癌的方法，该方法包括确定获自所述对象的生物样品中的选自表12和/或表2、表15和/或表3的一种或几种，或多种蛋白质和/或磷酸化位点的调节，其中

(a)所述样品中存在所述一种或几种，或多种蛋白质指示对象患有胰腺癌；

(b)与所述一种或几种，或多种蛋白质的参照量相比的所述一种或几种，或多种蛋白质的量(浓度)指示对象患有胰腺癌；

(c)与所述一种或几种，或多种蛋白质的参照量相比的所述一种或几种，或多种蛋白质的量(浓度)的变化指示对象患有胰腺癌；或

(d)与所述一种或几种，或多种蛋白质的参照状态相比的所述一种或几种，或多种蛋白质的磷酸化状态的变化指示对象患有胰腺癌。

在第三方面，本发明提供了一种将胰腺肿瘤分类成选自下组的分子表型的方法：肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和次生(转移)肿瘤，所述方法包括

(1)确定获自所述对象的生物样品中多种蛋白质的表达水平和/或蛋白质磷酸化水平；

(2)产生所述样品的表达水平和/或磷蛋白概况；

(3)比较所述对象概况与代表胰腺肿瘤分子表型的参照概况；和

(4)基于对象概况与参照概况之间的比较确定胰腺肿瘤的分子表型；

其中多种蛋白质选自由表2、3、4、11、12、13和/或15表示的生物标志物组。

对于本发明的这一和所有其他方面，可从来自相同对象的非肿瘤胰腺组织确定参照蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平概况。通过这种方式，可使用蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平的差异来确定胰腺肿瘤的分子表型。或者，参照水平可以是包含代表选自表2、3、4、11、12、13和15中任意一种或多种的感兴趣蛋白质的表达水平和/或磷酸化水平的数据的数据库。理想地，通过第一方面的胰腺肿瘤分类系统来提供参照水平。代表表达水平和/或蛋白质水平的数据可以获自多重肿瘤样品的数据的集合并且表示为平均值或范围。该数据可与各自对感兴趣的蛋白质独特的特异性肽和/或磷酸肽的水平相关。

在本发明的第四方面，提供了为患有胰腺癌的对象选择治疗方案的方法，所述方法包括

(1)确定获自所述对象的生物样品中一种或几种、或多种蛋白质的表达水平和/或磷酸化水平；

(2)比较所述表达水平和/或磷酸化状态与所述一种或几种、或多种蛋白质的参照表达水平和/或磷酸化水平，所述参照水平代表选自下组的胰腺肿瘤分子表型：肿瘤、非肿瘤；肿瘤复发、肿瘤不复发；原发肿瘤，次生(转移)肿瘤和/或药物敏感性；

(3)基于生物样品中蛋白质的表达水平和/或磷酸化水平与参照表达水平之间的比较确定胰腺肿瘤的分子；并且

(4)基于胰腺肿瘤的分子表型选择治疗方案。

其中多种蛋白质选自由表2、3、4、11、12、13和/或15表示的生物标志物组。

生物样品优选是胰腺肿瘤的样品(例如，活检物)，但是考虑到本发明的这一和其他方面，生物样品可以是能够提供胰腺肿瘤中调节的蛋白质的表现(representation)的对象的任意液体或固体样品。例如，可确定本文鉴定的生物标志物并且从来自对象的血液或尿液样品中定量它们的量或浓度，或磷酸化状态，从而避免活检的需要。

例如，该方法可使得用户能够确定获自对象的胰腺样品是否是肿瘤，是否具有复发的可能性(即，切除肿瘤后8至33个月，10至20个月或15至17个月)和/或肿瘤中存在哪些药物靶标。

例如，通过与参照表达水平的比较，该方法可鉴定选自表12，或更优选选自表2的多种上调的蛋白质。在其他优选的实施方式中，这些上调的蛋白质包括至少同源域-相互作用的蛋白激酶-1和/或粘蛋白1；任选地与选自表12和/或2的任意1种、2种、3种、4种或更多种其他蛋白质组合。这些与参照水平相比，存在上调的蛋白质将指示样品是胰腺肿瘤。

类似地，该方法可确定具有与参照水平相比明显调节的磷酸化位点的那些蛋白质，即，通过比较多种磷酸化的蛋白质的水平与选自表3、11、4、13和/或15的参照水平。这种比较允许将样品分类成具有复发可能性的肿瘤的表型或不可能复发的肿瘤的表型。例如，多种具有调节的磷酸化位点的蛋白质可选自表11，或者更优选地，选自表11A(在复发肿瘤中，磷酸化上调)和表11B(在复发肿瘤中，磷酸化下调)。

事实上，本申请的发明人所得的结果表明，单独双特异性促分裂原活化的蛋白激酶激酶2的磷酸化的上调可能足够预测肿瘤在切除肿瘤之后8至33个月、10至20个月或15至17个月的复发可能性。因此，确定获自对象的生物样品中双特异性促分裂原活化的蛋白激酶激酶2的增加的磷酸化以预测胰腺肿瘤复发的可能性形成本发明的另一个方面。在一些情况中，可在双特异性促分裂原活化的蛋白激酶激酶2的苏氨酸394处确定增加的磷酸化。该方法可包括通过例如免疫组化确定仅在该位点处增加的磷酸化，或者其可包括该位点处与其他磷酸化位点的联合确定。该方法还可包括确定在选自表11的一种或多种其他蛋白质上磷酸化位点的增加或减少。

在本发明的第四方面的其他实施方式中，该方法允许确定对所述测试的肿瘤的药物敏感性。发明人已经从它们对磷酸肽的分析的数据中确定肿瘤可相对于与非肿瘤相比受影响的信号转导通路分类并且因此可基于在肿瘤中最易感的药物靶标设计个性化治疗方案。具体地，表15提供了这些蛋白质(酶)，其含有已知诱导蛋白质(酶)激活或抑制的磷酸化位点。因此，该方法可鉴定多种已经调节(上调或下调)的选自表15的蛋白质并且因此提供肿瘤中受影响的信号转导通路的信息。该信息允许临床医师通过选择已知靶向所述信号转导通路中的特定蛋白质的那些药物来确定所述对象的个性化药物治疗方案。这些药物可选自达沙替尼、索拉非尼、伏立诺他、坦西莫司、AEZS-131和GSK2141795。

在优选的实施方式中，选自表15的多种蛋白质包括酪氨酸蛋白激酶(Fyn)、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶，和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶。

表15和表4提供了含有已知在磷酸化时抑制或激活蛋白质的磷酸化位点的那些肽的详细内容。与背景(正常)组织相比，发明人已经鉴定含有这些位点的蛋白质在肿瘤中上调或下调。结果，这些位点可用作胰腺肿瘤的标志物并且根据哪些蛋白质在特定样品中调节，可使用这些位点来选择用于治疗该对象以抑制肿瘤的生长或复发的药物组合。

在其他优选的实施方式中，多种蛋白质选自整联蛋白β-4；联蛋白α-1，连接粘附分子A(JAM-A)；酪氨酸蛋白激酶Fyn；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)；糖原合成酶激酶-3α。

获自所述对象的生物样品优选是取自疑似患有胰腺肿瘤的个体的活检样品。该方法可在一段时间内获自所述对象的多个活检样品上进行以监测药物治疗的效果。

在优选的实施方式中，可使用按照第一方面的胰腺肿瘤分类系统进行比较表达水平和/或磷酸化水平并且确定肿瘤的分子表型的步骤。

发明人已经使用适合的液相色谱-质谱(LC-MS/MS)方法来对胰腺肿瘤样品进行蛋白质组学分析。虽然这可能是优选的方法，现在发明人已经确定特异性生物标志物，即与非肿瘤相反在肿瘤中显著上调或下调的那些蛋白质，可采用其他标准方法用于确定样品中的这些标志物。事实上，发明人已经确定在肿瘤组织中显著调节的多种标志物，它们可发挥个体标志物的作用，从而避免对多重标志物的分析。

因此，可使用任意合适的方法来实现本发明的这一和其他方面的用于确定生物样品中一种或几种，或多种蛋白质的量的方法。确定可包括对蛋白质质量或浓度的直接定量。确定可包括直接定量，例如，使用提供与蛋白质的量(例如，浓度)相关的测量的试验。在本发明的这一和其他方面的方法的某些情况中，确定一种或几种，或多种蛋白质的量包括：

将所述样品与选择性且独立结合该一种或几种，或多种蛋白质的特异性结合成员接触；并且

检测和/或定量由所述特异性结合成员和一种或几种，或多种蛋白质形成的复合物。

该特异性结合成员可以是选择性结合蛋白质生物标志物的抗体或抗体片段。优选抗体经标记用于检测。例如，用于确定蛋白质浓度的便捷试验形式是ELISA。确定可包括使用已知浓度的标准制备肽浓度的标准曲线，并且将来自对象的样品获得的读数与标准曲线做比较，从而得到来自对象的样品中的蛋白生物标志物浓度的测量。可合适地采用多种方法用于确定蛋白质的量(例如，浓度)，其非限制示例是：Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附试验)、RIA(放射免疫试验)、竞争性EIA(竞争性酶免疫试验)、DAS-ELISA(双抗体夹心-ELISA)、液体免疫试验技术(例如，LuminexxMAP技术或Becton-DickinsonFACS技术)、免疫细胞化学或免疫组化技术、基于包括包含特异性抗体的反相磷蛋白阵列和反相蛋白质微阵列的蛋白质微阵列的技术、“浸染条”试验、亲和色谱技术和配体结合试验。该特异性结合成员可以是选择性结合蛋白质生物标志物的抗体或抗体片段。可以采用任意合适的抗体形式。按照本发明的任意方面考虑的其他类的特异性结合成员包括适体(包括核酸适体和肽适体)。优选地，可使用美国专利号5,475,096和5,270,163中所述的如称为SELEX(通过指数富集对配体进行系统性演化)的技术来提供导向蛋白质生物标志物的适体。

在一些按照本发明的这一和其他方面的方法的情况中，确定选自参照表格的蛋白质生物标志物的量可包括通过质谱测量对所述蛋白质独特的肽水平。适于通过质谱测量肽水平的技术是本领域技术人员可得的并且包括与选择性反应监测(SRM)和多重反应监测(MRM)同种型稀释质谱，包括SILAC、AQUA(如WO03/016861中所公开；其全部内容通过引用具体纳入本文)和TMT校准器(如WO2008/110581中所公开；其全部内容通过引用具体纳入本文)相关的技术。WO2008/110581公开了使用同重元素质量标签来标记参照样品中所有蛋白质的分开的等分样品的方法，在标记之后，其可以定量比率混合以递送标准校准曲线。然后用相同同重元素质量标签组的其他独立成员标记患者样品并与校准曲线混合。该混合物然后经过串联质谱并且可基于在MS/MS谱中从同重元素质量标签上释放的独特质量报告离子的出现来对衍生自特异性蛋白质的肽进行鉴定和定量。

通过参照水平的方式，可使用选自表2、3、4、11、12、13和/或表15的标志物蛋白质。在一些情况中，当采用基于质谱的方式确定蛋白质标志物时，本发明的方法包括提供包含含有标志物肽的至少2种不同的等分样品的校准样品，各等分样品是已知的量并且其中用一种或多种同重元素质量标志物来差异标记所述生物样品和各所述等分样品。优选地，同重元素质量标志物各自包含不同的质谱上相区别的质量标志物组。

因此，在本发明的优选实施方式中，该方法包括通过使用一种或多种对已知蛋白质标志物衍生的肽确定的转化的选择性反应监测来确定选自表2、3、4、11、12、13和/或表15的一种或几种、或多种标志物蛋白质的表达水平或磷酸化水平的变化；将测试的样品中的肽水平与之前确定的肽水平做比较，以基于所述一种或几种、或多种标志物蛋白质表达的变化表示胰腺癌。比较步骤可包括用已知量的相应合成肽确定来自测试的样品的标志物肽的量。合成肽在序列上与获自样品的肽相同，但是可通过标志物，如不同质量或重同位素的标签区分。

这些合成标志物肽(带或不带标志物)中的一种或多种形成本发明的另一方面。可以诊断对象中胰腺癌的目的；或以将来自对象的胰腺样品分类成选自肿瘤、非肿瘤、复发的可能性、不复发的可能性、药物敏感性、原发肿瘤、或次生(转移)肿瘤的分子表型目的；或用于选择所述对象的治疗方案的试剂盒的形式提供这些合成肽。

在本发明的这一和其他方面的优选实施方式中，一种或几种蛋白质，或多种蛋白质包括粘蛋白-1和/或同源域-相互作用蛋白激酶-1；任选地与选自表2、3、4、11、12、13和/或15，优选表12和/或表2的1种、2种、3种或4种其他蛋白质组合。

其他合适的确定蛋白质表达水平的方法包括表面增强激光电离飞行时间(SELDI-TOF)质谱；基体辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱，包括LS/MS/MS；电喷射离子化(ESI)质谱；以及优选的SRM和TMT-SRM。

在本发明的另一个方面中，提供了用于进行上述方法的试剂盒，尤其是根据获自对象的样品将胰腺癌分类成选自肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤的分子表型。

在所有实施方式中，该试剂盒使得用户能够确定测试的样品中多种分析物的蛋白质表达和/或磷酸化状态的存在、水平(上调或下调)，这些分析物选自表2、3、4、11、12、13和/或15中提供的多种标志物蛋白质或其片段以及针对所述标志物蛋白质的抗体；该试剂盒包含

(a)具有多个结合成员的固体支持物，其各自对于其上固定的所述多种分析物之一有独立的特异性；

(b)包含标记物的显影剂；和，任选的

(c)选自洗涤溶液、稀释剂和缓冲剂的一种或多种组分。

结合成员可如上所述。

在一个实施方式中，试剂盒可以试验相容的形式提供分析物。如上所述，本领域已知用于确定样品中蛋白质、抗体或核酸分子的存在或量的各种试验。下文中更详细地描述了各种合适的试验并且各自形成本发明的实施方式。

该试剂盒还提供了标准或参照，其提供定量型检测，从而可比较一种或多种标志物蛋白质的表达水平的确定。该标准可指示作为胰腺癌指标的2种或更多种生物标志物的水平。

试剂盒还可包含实施方法的印刷说明书。

在优选的实施方式中，试剂盒可用于进行质谱试验，并且可包含试验相容形式的一组衍生自表2、3、4、11、12、13和/或15中所列蛋白质的参照肽(例如，SRM肽)，其中组中的各肽是多种标志物蛋白质中各蛋白质的独特代表。优选地，2种、3种、4种或5种或更多种这类独特肽用于试剂盒所针对设计的各蛋白质，并且其中提供已知量的各组独特肽，其反映了这类蛋白质在所述样品的标准制备中的水平。任选地，SRM肽是代表表13、3、11和/或表14中所列的靶蛋白质内差异磷酸化位点的磷酸肽。任选地，该试剂盒也可提供从所述样品分离和提取蛋白质的方案和试剂，蛋白水解酶如胰蛋白酶的纯化制备以及包括待监测的前体质量和具体转变的详细内容的方法的详细方案。肽可以是合成肽并且可包含碳、氮、氧和/或氢的一种或多种同位素。

本文提供的分类方法也包括确定磷酸化导致的蛋白质修饰。发明人已经显示与背景组织相反，多种蛋白质在胰腺癌组织中被诱导或抑制。因此，发明人提供了包括确定在获自疑似患有胰腺癌的对象的样品中选自表13、3、11和/或表14的一种或几种，或多种蛋白质的磷酸化状态的方法。

优选地，所述一种或几种或多种蛋白质选自整联蛋白β-4；联蛋白α-1，连接粘附分子A(JAM-A)；酪氨酸蛋白激酶Fyn；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)；糖原合成酶激酶-3α。

在优选的实施方式中，蛋白质是双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶2。具体地，发明人已经确定与背景(非肿瘤)相比，肿瘤病例中双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶2在磷酸-T394处的磷酸化增加，并且已经显示该位点处的磷酸化与肿瘤在中值16.5个月处的复发正相关(图4)。

表11、15和/或表4提供了蛋白质上其他磷酸化位点的列表，与非肿瘤相比，其在胰腺肿瘤样品中被调节。这些位点各自提供了用于相对于复发可能性和药物敏感性分类胰腺肿瘤的标志物。因此，各磷酸化位点单独或组合形成本发明的一个方面，用于相对于复发的可能性和时间和/或药物敏感性分类胰腺肿瘤。

例如，提供了一种预测胰腺肿瘤对用达沙替尼(BMS-354825-Sprycel^TM)治疗的敏感性的方法，该方法包括确定酪氨酸-蛋白质激酶Fyn上磷酸-S21的水平，其中该蛋白质的上调指示胰腺肿瘤将对于用达沙替尼治疗敏感(表4)。

此外，还提供了预测胰腺肿瘤对用AEZS-131(AZ公司(AeternaZentarisInc))和/或SCH772984(默克公司(Merck))治疗的敏感性的方法，包括确定促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)上磷酸-T185和/或磷酸-Y187的水平；此外或替代地，促分裂原-激活的蛋白激酶3(MAPK3/ERK1)的磷酸-T202和/或磷酸-Y204的水平，其中该蛋白质磷酸化的上调指示胰腺肿瘤将对用AEZS-131和/或SCH772984治疗敏感。对于其他示例，参见表4。

确定蛋白质的磷酸化在本领域中是标准的。例如，对特定磷酸化基序有特异性的抗体可在宿主动物中产生并且用于随后用免疫组化原位检测组织中的相关基序或者用Western印迹或酶联免疫吸附试验(ELISA)从组织或体液中之后提取靶蛋白。其他基于抗体的检测方法是技术人员熟知的并且包括珠-悬浮试验、平面试验、放射性免疫试验和与质谱连接的免疫沉淀。然而，正常情况下需要在两步过程中使用磷蛋白特异性抗体，其中在检测之前首先富集靶蛋白。这是由于特定激酶的多重底物内由这类抗体识别的表位的共性。换而言之，激酶识别其底物内的磷酸化位点的方式与抗体识别表位的方式类似，该方式是4-8个氨基酸的保守序列。

在一些情况中，可通过在生长培养基或实验动物的食品补充剂中提供磷的放射性同位素(一般是P32)来监测蛋白质的磷酸化。在代谢标记一段确定的时间段之后，在特异性蛋白质中纳入P32之后可以使用标准蛋白质分离方法如凝胶电泳和液相色谱来检测放射性信号。

在优选的实施方式中，选自表13、表3和/或表11的多种蛋白质包括整联蛋白β-4；联蛋白α-1，连接粘附分子A(JAM-A)；酪氨酸蛋白激酶Fyn；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)；糖原合成酶激酶-3α。

在本发明的一个其他方面中，提供了用于将胰腺肿瘤样品分类成一种或多种分子表型的方法，该方法包括

(1)确定取自对象的胰腺肿瘤样品和胰腺非肿瘤样品的选自表12和/或表2的一种或几种，或多种蛋白质的蛋白质表达水平

和/或

(2)确定取自对象的胰腺肿瘤样品和胰腺非肿瘤样品的选自表3、表13和/或表11的一种或几种，或多种磷蛋白的上调或下调，

(3)比较肿瘤样品与非肿瘤样品的所述蛋白质表达水平；和/或比较肿瘤样品与非肿瘤样品中磷蛋白的上调或下调

(4)应用预测算法

log₂(_iT/_iNT)

(其中i是对象样品，T＝肿瘤并且NT＝非肿瘤)

以产生所述对象的所述蛋白质表达水平和/或磷蛋白水平的预测值；

(5)通过参考包括所述表型的预测值的数据库将所述胰腺肿瘤样品分类成分子表型，其中所述数据库包括选自表2、3、4、11、12、13和/或15的一种或几种或多种蛋白质的预测值；并且其中该分子表型选自肿瘤、非肿瘤；肿瘤复发；肿瘤不复发；药物敏感性；原发和/或次生肿瘤。

在优选的实施方式中，如果log₂T/NT比率≥1或≤-1，则认为蛋白质标志物经修饰(通过上调或下调表达或磷酸化)。

在优选的实施方式中，通过按照第一方面的胰腺肿瘤分类系统进行分类。

优选地，可使用上述方法来确定患有胰腺癌的对象的预后。在这一方面，预后包括确定手术切除、放疗或化疗治疗之后早复发、晚复发或不复发。例如，该方法可将表达和磷酸化值与选自表11、3和/或13的一种或几种或多种蛋白质的值做比较。

在优选的实施方式中，一种或几种或多种蛋白质包括双特异性促分裂原活化的蛋白激酶激酶2。

在本发明的这一和其他方面，手术切除的肿瘤或肿瘤活检的总蛋白质内容物被提取并经过通过本领域已知和/或本文所述的方法的磷蛋白组学分析。通过这类分析检测的各磷酸肽的相对丰度记录在数据库中(例如，使用按照第一方面的系统)并且使用如集结聚类的方法比较复发和不复发胰腺癌的已知病例的总概况。通过这种“由下而上”的方法：每个观察开始于其自己的聚类，并且当其向分级上部移动时，汇集聚类对。在集结聚类方法结束时，经分析的肿瘤已经被聚类为代表其复发可能性的组。在优选的实施方式中，数据库也带有充足数量的具有具体初步治疗或手术后复发时间的样品以将复发的可能时间赋予具有复发肿瘤概况的个体患者。复发的可能时间是切除肿瘤之后的8至33个月、10至20个月或15至17个月。

在本发明的其他方面，提供了选择患有胰腺癌的对象的治疗方案的方法，所述方法包括

(1)确定选自表15和/或表4的一种或几种或多种蛋白质标志物的磷蛋白水平，

(2)比较所述确定与之前确定的代表药物敏感性的参照，并且

(3)基于所述肿瘤的药物敏感性选择所述对象的药物治疗方法。

在优选的实施方式中，药物靶标是携带差异磷酸化位点的特定蛋白质，或者其是导致这类差异磷酸化的上游激酶或磷酸酶。

在优选的实施方式中，多种选自表15和/或表4的蛋白质包括酪氨酸蛋白激酶Fyn、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶。

优选地，这些药物选自达沙替尼、索拉非尼、伏立诺他、坦西莫司、AEZS-131和GSK2141795。

对于本发明的所有方面，优选通过液相色谱-质谱(LC-MS/MS)来进行确定步骤。

在本发明的其他方面，提供了用于改善分子靶向药物的设计的方法，其中使用本发明的方法和系统来分析新化合物在调节选自表2、3、12、11、13、14和/或15的蛋白质上的致癌通路中的性能。

因此，本发明还提供了测试分子靶向药物的有效性的方法，该方法包括

从对象获取胰腺肿瘤的样品；所述肿瘤已与测试的分子靶向药物接触，例如，通过在获得样品之前给予所述对象来进行所述接触；

从所述样品提取蛋白组学数据，例如蛋白质或磷酸化的蛋白质的相对丰度；

比较所述蛋白组学数据与参照数据，例如在与测试的分子靶向药物接触之前获自相同肿瘤的样品的数据。

其中，在与分子把性药物接触之后获取的样品和在与分子靶向药物接触之前获取的样品之间蛋白组学数据的变化指示分子靶向药物在治疗胰腺肿瘤中的效果；并且

其中，蛋白组学数据包括选自表15和/或表4的多种磷蛋白的相对丰度水平。

可通过测量对多种蛋白质各自独特的磷酸肽的相对丰度(例如，上调或下调)获得蛋白组学数据。优选地，磷酸肽选自表15和/或表4。

例如，人胰腺癌衍生的细胞系接触不同浓度的候选治疗化合物，包括载剂对照，或者持续不同的时间。在接触候选治疗化合物之后，细胞裂解并且提取总蛋白。优选地，使用蛋白水解酶如胰蛋白酶消化蛋白质，并且例如使用同重元素质量标签标记蛋白质。优选地，同重元素质量标签是串联质量标签(热科学公司(ThermoScientific))。在通过LC-MS/MS分析之前，来自几种细胞及的标记的肽可混合在一起。优选地，可包括代表候选药物的已知靶标的一种或几种参照标记的肽(例如，选自表15和/或表4)以提供定量内标。在LC-MS/MS分析之后，各处理样品中一种或多种，并且优选所有磷酸肽的相对丰度在本发明的第一方面的系统中经分析，例如SysQuant数据库，并且经集结分级聚类以获得治疗表型。获得阳性治疗表型的化合物可优选用于进一步开发。

应理解本发明的这一方面的方法可应用于药物开发过程的任意方面，包括取自参与临床试验的人对象的肿瘤和异种移植肿瘤。

还理解本发明的这一方面的方法也可应用于基于从切除的肿瘤制备的原发肿瘤细胞培养，将原发细胞培养接触不同分子靶向药物并使用本文所述的方法，例如，发明人的SysQuant方法分析磷蛋白的相对水平来确定在患有胰腺肿瘤的患者中最有效的分子靶向药物。

优选地，蛋白质(或其独特肽)包括以下的一种或几种、或多种：酪氨酸蛋白激酶Fyn、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶、整联蛋白β4、联蛋白α-1、连接粘附分子A(JAM-A)；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；糖原合成酶激酶-3α；同源域-相互作用蛋白激酶-1(HIPK1)；丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)；肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)。

在本发明的其他方面中，本发明的方法和系统，例如SysQuant数据库，可应用于复发胰腺癌的分析。当在之前已经接受胰腺癌治疗的患者中鉴定到新肿瘤，即所谓的复发肿瘤时，或在之前已经在身体的其他地方治疗肿瘤的患者的胰腺中发现新肿瘤，即所谓转移肿瘤时，在转移肿瘤的复发中鉴定治疗的耐受机制和潜在新靶标是重要的。因此，可在对复发或转移肿瘤的蛋白质和磷酸化位点变化的分子中采用本发明的方法。

本发明还提供了选自表2、3、4、11、12、13和/或15的多种生物标志物在用于确定对象中胰腺肿瘤的分子表型中的用途，其中所述分子表型选自肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤。

优选地，生物标志物选自表2和/或表12并且分子表型选自肿瘤或非肿瘤。

具体地，生物标志物可包括粘蛋白-1、整联蛋白4、和/或同源域-相互作用蛋白激酶1。

在其他实施方式中，生物标志物选自表3、11和/或表13并且分子表型选自肿瘤复发或肿瘤不复发，例如，双特异性促分裂原活化的蛋白激酶激酶2。

在其他实施方式中，生物标志物选自表4和/或15并且分子表型选自药物敏感性。例如，生物标志物可包括以下的一种或几种、或多种：酪氨酸蛋白激酶Fyn、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶、整联蛋白β4、联蛋白α-1、连接粘附分子A(JAM-A)；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；糖原合成酶激酶-3α；和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)。

发明人已经确定多种在肿瘤与非肿瘤患者中一致性差异表达的蛋白激酶。因此，本发明提供了多种胰腺癌的新型治疗靶标。另外，发明人提供了使用激酶抑制剂治疗胰腺癌患者的方法。在一个实施方式中，本发明提供了治疗对象中胰腺癌的方法，所述方法包括给予在抑制选自HIPK1、MRCKα和MLCK的一种或多种蛋白质的激酶活性中有效的化合物。

本发明的某些方面和实施方式将通过示例的方式并参考上述附图和表格说明。本发明包括所述的优选特征和方面的组合，其中这类组合是明显不允许的或者被说成是表达上避免的。该说明书中提及的所有文献通过引用全文纳入本文用于所有目的。

附图和表格简要说明

图1维恩图证明在所有3个TMT8重样品总和(TMT8重-ALL)和单独每个TMT8重(TMT8重1、TMT8重2、TMT8重3)之间以下物质的数量：A.独特磷酸肽，B.独特非磷酸肽，和C.在TiO2、IMAC和/或SysQuant工作流的非富集臂中鉴定到的独特总肽。1.D证明发明人从分析运行1、分析运行2和分析运行3的鉴定中观察的肽的重叠水平(包括从运行1和2的鉴定中编译的时间依赖性排除列表)。

图2A：描述数据中13.6％(PC1)和10.6％(PC2)的总方差的前两个主成分的PC1和PC2分数图。圆圈显示了基于95％置信度的T2霍特林空间。2B：描述数据中10.6％(PC2)和14.4％(PC3)的总方差的下一主成分的PC2和PC3分数图。

图3：在该研究中定量的所有5409个磷酸肽的log₂T/NT值上进行分级聚类分析。磷酸肽聚类在排中并且病例聚类在列中。3A：集中在含有在复发的患者的肿瘤组织中证明较低水平(绿色)但是在不复发的患者的肿瘤中证明较高水平(红色)的磷酸肽的聚类图的区域。红色箭头指示与复发最相关的磷酸肽。3B：集中在含有证明与3A相反的磷酸肽的聚类图的区域。3C：证明在所有病例的肿瘤中较低水平(上图)，和在所有病例的肿瘤中较高水平(下图)的磷酸肽。3D：计算所有病例之间的皮尔森相关系数并且在这些值上进行分级聚类。表格显示在各病例中淋巴结转移和复发的存在与否。

图4.含有双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶2的磷酸-T394的磷酸肽的所有log2T/NT比率总结并显示在表格中并在柱形图上作图。在最后一次检验时复发患者(中值跟踪16.5个月)与不复发患者分组。检验时间、复发时间和-80℃冰箱中组织储存时间以及淋巴结转移的存在示于该表格。

图5.显示IMAC中测量的(A)蛋白质和(B)磷酸肽，(C)TiO₂中测量的磷酸肽和(D)SysQuant工作流的非富集臂中测量的磷酸肽的log₁₀P-值与log₂T/NT比率关系的火山图。红色圆圈指出生物上显著的磷酸肽，因为它们证明log₂T/NT比率≥0.75或≤-0.75并且p-值≤0.05。E：是显示受到显著调节的工作流的三个臂之间635个磷酸肽的分布的维恩图。

图6.A：显示了使用来自所有具有显著调节的磷酸肽的蛋白质的登录号构建的STRING蛋白质相互作用网络。在所示的网络中总共存在来自408个蛋白质的635个显著调节的磷酸肽。B：显示相同的STRING网络但用红色突出显示那些参与KEGG紧密连接信号转导通路的蛋白质。也列出了来自紧密连接蛋白质的磷酸肽。C：用红色突出显示那些与GO生物过程“RAS蛋白质信号转导调节”相关的蛋白质并且这些磷酸肽列于表格中。

图7.在胰腺癌组织中受到调节的信号转导通路。(A)该方案总结了从以下KEGG信号转导通路中鉴定为磷酸化的所有蛋白质；紧密连接、粘着连接和焦点粘连。红星显示在12个病例的任意中鉴定为磷酸化的那些蛋白质。用带颜色圆圈突出显示的蛋白质是已知的药物靶标。(B)证明log₂T/NT比率≥1或≤-1的来自病例1的磷酸肽(图4B)来自通过DAVID生物信息学资源以最大显著性(基于本杰明)与来自KEGG的紧密连接和粘着连接信号转导通路匹配的蛋白质。红星表示来自病例1的产生log₂T/NT比率≥1或≤-1的磷酸肽的蛋白质，并且带颜色的圆圈显示最合适的药物靶标，其在病例1中是FYN。(C)证明log₂T/NT比率≥1或≤-1的来自病例10的磷酸肽来自通过DAVID生物信息学资源以最大显著性(基于本杰明)与来自KEGG的紧密连接和焦点粘连信号转导通路匹配的蛋白质。红星表示来自病例10的产生log₂T/NT比率≥1或≤-1的磷酸肽的蛋白质，并且带颜色的圆圈显示最合适的药物靶标，其在病例10中似乎是AKT1和MAPK1。

图8A：这种MA-图显示整个非标准化的数据集上的对数比率对比对数强度。图8B：该MA-图显示与图8A相同，但是数据通过和量表标准化并因此在零居中方面表现更好。

表1：在各TMT8重中和总共鉴定到的肽谱匹配的数量、独特肽的数量和磷酸化位点的数量。

表2：在平均总共12个病例中，与背景组织相比，在肿瘤中显著上调的前12种蛋白质。来自各蛋白质的非磷酸化的肽的Log₂T/NT比率用作替代来计算相应蛋白质的相对丰度。非磷酸化的肽的Log2T/NT比率在工作流的三个臂上平均(IMAC、TiO2、非富集)。

表3：在平均总共12个病例中，与背景组织相比，在肿瘤中显著调节的磷酸肽。所有的磷酸肽来自参与KEGG信号转导通路、紧密连接、焦点粘连、血管平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架重排的蛋白质。在此我们展示了蛋白质和磷酸肽的p值和Log₂T/NT比率。

表4：显示了含有已知是抗癌药物靶标的蛋白质上的激活剂和抑制剂磷酸化位点的肽的示例。各肽序列中的磷酸化残基带下划线。log₂T/NT比率是从工作流的所有三个臂计算的中值，并且所有≥1或≤-1的比率都用粗体突出显示。红色的肽含有激活剂磷酸化位点，而蓝色的肽含有抑制剂磷酸化位点。黑色的肽含有未知功能的磷酸化位点。

表5：14个胰头导管腺癌病例的特征选自肝脏研究院生物资料库用于该研究。

表6：研究下的各病例的肿瘤阶段和复发。黄色病例显示切除肿瘤后8和33个月(中值跟踪时间16.5个月)之间复发。IIA期和IIB期之间的差异在于淋巴结转移的存在(IIB)或缺失(IIA)。

表7：测试的各病例的临床信息(例如，复发时间)。

表8：该研究中用于SysQuant工作流的各样品的蛋白质的量。

表9：用不同的串联质量标签(TMT)标记肽。表9显示使用TMT8重标签来标记在该研究中分析的3个TMT8重样品各自内的样品。

表10：TMT8重样品的所有3个样品被分成3个等分试样。全部9个TMT标记的肽的等分试样然后通过SCX-HPLC各自分成12个组分。对于这3个TMT8重样品中个每一个，使用IMAC对12个组分富集磷酸肽，使用TiO₂对12个组分富集磷酸肽，并且并不对12个组分富集磷酸肽而是直接通过LC-MS/MS分析以确定相对蛋白质丰度用于标准化的目的。

表11：图3D中聚类在一起的来自复发病例的肿瘤对比非肿瘤中显示高(Log2T/NT≥0.7)和低(log2T/NT≤-0.7)水平的磷酸肽。

表12：肿瘤对比非肿瘤中显著调节的蛋白质(150种蛋白质)。提供了12个病例中的T检验p-值和平均log2T/NT比率以及各病例的Log2T/NT比率。

表13：也产生证明各病例中log2T/NT比率≥1或≤-1(超过2倍上调/下调)的磷酸肽的参与信号转导通路(Kegg通路，示于标题是“术语”的列)的蛋白质的登录号。也显示了诸如p值和本杰明概率的信息。

表14：病例1-来自显示log₂T/NT比率≥1或≤-1的病例1，来自参与以下KEGG信号转导通路的蛋白质的磷酸肽：紧密连接、粘着连接和焦点粘连。

表15：具体病例-在已知诱导磷酸化的酶的激活或抑制的位点处显示log₂T/NT比率≥1或≤-1的磷酸肽。

缩写和定义

HPLC＝高压液相色谱

SCX＝强阳离子交换

TiO₂＝二氧化钛

IMAC＝固定金属亲和色谱

T＝肿瘤

NT＝非肿瘤

LC-MS＝液相色谱-质谱

STRING＝相互作用的基因/蛋白质的修复的检索工具

GO＝基因本体

KEGG＝京都基因与基因组百科全书

TMT＝串联质量标签

本发明上下文中的表型“肿瘤”应表示由于胰腺癌症，尤其是胰头腺癌而导致异常增值(恶性生长)的肿瘤性细胞。

本发明上下文中的表型“非肿瘤”应表示正常、非肿瘤性或良性肿瘤性胰腺细胞。将理解这类细胞可获自异常生长，但是这种生长不是恶性的，例如囊肿。

表型“复发可能性”应该表示肿瘤在通过例如手术切除之后8至30个月再次出现的可能性。

表型“不复发可能性”应该表示肿瘤在通过例如手术切除之后不再出现的可能性。

本发明上下文中的表型“药物敏感性”应表示呈现指示调节细胞信号转导通路，包括一种或多种分子药物靶标的分子概况的胰腺肿瘤。药物靶标可选自FYN、GSK3α/β、HDAC1/2、RAF激酶、MAPK(p38和ERK2)、AKT、PKC、酪蛋白激酶。

表型“原发肿瘤”应该表示源自胰腺的肿瘤。

表型“次生肿瘤”或“转移肿瘤”应该表示由源自位于对象的其他位置处的肿瘤的癌细胞形成的胰腺肿瘤。

术语“多种”可表示选自一个或多个参照表格的超过1种、超过2种、超过3种、超过4种、超过5种、超过10种、超过15种、超过20种、超过25种、超过30种蛋白质、肽、磷蛋白或磷酸肽。

术语“多种”也可表示超过1种以参照表格的百分比表示的蛋白质、肽、磷蛋白、磷酸肽。例如，多种可包括参照表格中提供的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％的蛋白质、肽、磷蛋白或磷酸肽。

在两种情况中，在多种选自参照表格的情况中，考虑蛋白质、肽、磷蛋白或磷酸肽的任意组合将形成本发明的实施方式。例如，相对于列出12种蛋白质的表2，考虑多种蛋白质可包括同源域-相互作用蛋白激酶1与一种或多种、两种或多种、三种或多种等表2所列的其余蛋白质。这对于各独立蛋白质也是如此，即粘蛋白-1可与一种或多种、两种或多种、三种或多种等表2所列的其余蛋白质组合。

例如，这类组合可在数学上表示为符号“组合”：

$\left(\begin{array}{c}n\\ k\end{array}\right)=\frac{n!}{k!(n-k)!}$

这可表示为ⁿC_k(即，“n选k”)的形式。

在表12的情况中，n＝12(表的总数)并且k是所选亚组中的数量。

本文中具体考虑了来自表2、3、4、11、12、13、14和/或15的2种或更多种标志物的所有组合，即，对于表2，全部66种可能的对(¹²C₂)，全部220种3标志物的可能组合(¹²C₃)，全部495种4标志物的可能组合(¹²C₄)，全部792种5标志物的可能组合(¹²C₅)，全部924种6标志物的可能组合(¹²C₆)等。

术语“蛋白质”应解释为包括全长蛋白质或蛋白质的任意形式，例如，翻译剪接变体、同种型、糖基化形式、磷酸化形式或者包括其他翻译后修饰。对于表格中的参照蛋白质，提供了允许获得包括其序列的蛋白质的完整细节的Uniprot-ID。本领域理解，各Uniprot-ID具有历史记录，其允许可以易于确定在任意给定的日期，如本发明的日期上与所述Uniprot-ID相关的特性序列，不管后续的修饰或修正。该信息和数据通过引用纳入本文。

因此，蛋白质表达水平的变化可表示其所有形式的蛋白质的表达的上调或下调，或者其可表示特定形式的蛋白质的上调或下调，例如，同种型、剪接变体等。

术语“相对丰度”应表示与参照水平，即，来自数据库或来自获自不同/背景样品的水平相比的蛋白质的水平、量或浓度。可从测量对蛋白质独特的1种或多种，优选2种、3种、4种或5种肽的水平、量或浓度并且与参照样品中相同肽的水平、量或浓度比较来获得所述蛋白质的相对丰度。这提供了各肽的相对丰度水平。可取中值平均以显示蛋白质本身的水平、量或浓度。

术语“肽”应表示衍生自全长蛋白质的氨基酸序列。该肽将包含足够的氨基酸使得其序列对于其衍生的蛋白质而言是独特的。这可能是少至至少4，5，6，7，8，9或10个氨基酸长，更优选4至50，40，35，30，25或20个氨基酸，或5至50，45，40，35，30，25或20个氨基酸或者5至50，45，40，35，30，25或20个氨基酸。该肽可以通过合成制成，或者其可以是蛋白水解酶消化产物，例如，全长蛋白质的胰蛋白酶。

术语“磷蛋白”应该表示在磷酸化位点，例如丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸处已经磷酸化的任意蛋白质。在本文中，这类位点表示为“磷酸-Xyyy”其中X表示单字母或三字母氨基酸代码并且y表示限定相关磷蛋白的Uniprot-ID内的残基位置的整数。

术语“磷酸肽”应表示包含一个或多个，优选一个磷酸化位点，例如丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸的肽序列。

衍生自磷蛋白的磷蛋白或磷酸肽的磷酸化状态的水平的变化并不必然表示蛋白质本身的量(浓度)的变化，而是所述蛋白质的可能在特定位点处的磷酸化形式的变化。

材料与方法

选择12个胰头导管腺癌病例(表5)。病例选择描述于下面的补充方法中。简言之，使用SysQuant工作流分析12个肿瘤(T)对比12个非肿瘤(NT)胰腺组织试样。组织样品取自胰腺肿瘤肿块，而NT样品取自相同胰腺的远离肿瘤肿块的位点处。所有的组织样品在手术切除30分钟内冷冻，并且在-80℃下储存直至用SysQuant分析(中值储存时间18.5个月(范围是4-28个月))。实验的细节描述于下面的补充方法中。总之，这需要从组织试样中提取蛋白质、使蛋白质经胰蛋白酶消化成肽、对肽进行TMT8-重标记(每次TMT8-重来自4个病例的肿瘤和非肿瘤组织)之后混合以形成单个8-重样品混合物(参见表9)。各TMT8-重样品然后被分为3个独立等分试样，各自还通过强阳离子交换(SCX)色谱分成12个组分(表10)。然后，通过纳米流HPLC-MS/MS，利用重复数据依赖性采集运行，之后是采用运行1和2中鉴定到的所有特征的时间依赖性排斥的第三运行，来直接分析第一组12SCX组分。首先使用IMAC或TiO₂来对剩余的2组12个组分富集磷酸肽。所得的24个磷酸肽富集的组分经过相同的纳米流HPLC-MS/MS分析。对各TMT8-重样品进行总共108次分开的纳米流HPLC-MS/MS运行。使用Mascot和Sequest(通过ProteomeDiscoverer)针对人UniProtKB/Swiss-Prot数据库检索原始MS数据。如果肽谱匹配(PSM)仅以低置信度(≥5％FDR)被鉴定到，显示≤75％磷酸-RS概率分数，并且有缺失的定量通道(例如，并非所有的同重元素标签在谱中是可见的)，则排除肽谱匹配。来自通过过滤器的PSM的同重元素标签的原始强度值可用于定量，并且使用和量表对这些值进行标准化以减少潜在的实验/系统乖离。作为第一步，从同重元素标签强度计算log₂比率，显示对于所有和各病例T与NT之间的调节。磷酸肽T/NTlog₂比率是来自所有对于特异性肽序列独特的PSM的中值T/NTlog₂比率。蛋白质T/NTlog₂比率是来自所有对于特异性蛋白质独特的独特非磷酸化肽的中值T/NTlog₂比率。对于数据分析，使用一侧t-检验(单一样品位置检验)来计算p-值。将P-值针对火山图上的log₂T/NT比率作图以检测所有病例上的任何明显调节。在蛋白质水平，加入使用GO-术语(http：//www.geneontology.org/)、KEGG-通路(http：//www.genome.jp/kegg/)和Drugbank(http：//www.drugbank.ca/)信号的编号，并且也使用如DAVID(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)和STRING(http：//string-db.org/)的资源映射到通路。在磷酸化位点水平上，加入使用PhosphoSitePlus(www.phosphosite.org)的编号，包括磷酸化位点的已知功能和生物/病理作用。使用主成分分析(PCA)和隐结构投影(PLS)从来自工作流的所有臂(IMAC、TiO₂和非富集)的所有肽比率(磷酸和非磷酸肽)来对多变量数据集进行建模/研究并且鉴定异常值和组/聚类。最后进行分级聚类以在T和NT组织样品之间与磷酸肽相对丰度相关，并且也与蛋白质相对丰度相关的病理/试样水平上构建聚类分级。使用SysQuant工作流、合并磷酸蛋白组学样品制备、LC-MS/MS分析和生物信息学分析来鉴定发明人认为导致在此处分析的病例中的胰腺癌的重要分子事件。

补充方法

冷冻临床组织。伦理方面和研究方案得到了国王学院医院，肝脏研究院生物资料库委员会的批准。在肝脏研究院的生物资料库的数据库中选择12个胰头导管腺癌病例(表5)。最初选择了病例2和3，但是之后发现从该工作流中提取的蛋白质太少。因此，选择2个额外的病例(病例13和14)来使数量增加回到12。小片组织从Whipple试样速冻并且储存在生物资料库的冰箱中(至少2年)。在30分钟内完成这一组织取样过程。各病例使用癌症(肿瘤)和背景(非肿瘤)的配对样品。表6描述了肿瘤分级以及在中值跟踪16.5个月时受否存在复发(8至33个月的范围)。

组织细胞裂解。冷冻的临床组织样品经粉碎，然后在液氮存在下用研杵和研钵研磨成细粉。然后将粉末转移至含1.3mL的冰冷裂解缓冲液(8M尿素，75mMNaCl，50mMTris-pH8.2，一片蛋白酶抑制剂混合物(completemini，罗氏公司(Roche)/10mL裂解缓冲液，和一片磷酸酶抑制剂混合物(罗氏公司)/10mL裂解缓冲液)的eppendorf管中。然后样品在冰上(4℃)以20％幅度下超声20x1秒(脉冲开关)。在4℃下12,500g离心10分钟后，然后使用Bradford蛋白试验和微孔板光度计来测定各样品的蛋白质浓度。该工作流中各TMT8-重的蛋白质的量示于表7。

溶液中酪蛋白消化。

按照Villén和Gygi，NatureProtocol，方法[Villén，J.，GygiS.TheSCX/IMACenrichmentapproachforglobalphosphorylationanalysisbymassspectrometry(通过质谱的全磷酸化分析的SCX/IMAC富集方法).NatureProtocols.3，1630(2008)]对裂解物进行半胱氨酸的还原、烷基化和消化。经消化的样品在2,500g下旋转10分钟，并且在100mgSepPaktC18芯(美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters))上脱盐。肽用50％ACN/0.1％TFA稀释并冻干。

TMT标记。来自所有样品的经消化的肽在200mMTEAB/10％CAN中分开重悬，与它们相应的TMT8重试剂(15mM终浓度)混合，如下文中的标记设计所示，并且在室温下孵育1小时。然后用0.25％羟胺接触15分钟来终止TMT反应。样品收集到3个TMT8重(下面所示的标记设计)并另外孵育15分钟。各TMT8重样品经酸化，并且乙腈的浓度稀释至低于5％，然后分为3个等分试样，其各自在200mgSepPaktC18芯上脱盐，稀释，然后冻干。标记设计示于表8。

SCX-HPLC。

冻干肽的所有9个等分试样(表9)在SCX缓冲液C中重悬，然后通过SCX-HPLC分成12个组分。按照Villén和Gygi，NatureProtocol26，方法使用polySULFOETHYL-A柱(PolyLC)和我们的SCXHPLC系统(WatersAlliance2695)来进行分离。

缓冲液A：水中0.1％TFA。

缓冲液C：7mMKH₂PO₄，pH2.65，30％CAN(体积/体积)。

缓冲液D：7mMKH₂PO₄，350mMKCl，pH2.65，30％CAN(体积/体积)。

固定金属亲和色谱(IMAC)和TiO₂。按照生产商的说明书用IMAC(赛默飞世尔皮尔斯公司(ThermoScientificPierce)产品编号88300)或TiO₂(赛默飞世尔皮尔斯公司产品编号88301)富集磷酸肽。

石墨离心柱。在磷酸肽富集之后，按照生产商的说明书使用石墨离心柱来纯化肽(赛默飞世尔皮尔斯公司产品编号88302)。

液相色谱质谱(LC-MS)。来自全部108个组分的肽在35μl的2％CAN，0.1％FA中重悬，然后8μL的各样品使用赛默飞世尔ProxeonEASY-nLCII系统注射到0.1×20mm用ReproSilC18，5μm(Maisch博士)自填充的前置柱上。然后使用在乙腈中0.1％甲酸的升高梯度(90分钟内10至25％)以300nL/的流速通过0.075×150mm用ReproSilC18，3μm(Maisch博士)自填充的柱来解析肽。在色谱运行期间(115分钟)在赛默飞世尔LTQOrbitrapVelos上获取质谱，在各FTMS扫描(在30000解析功率400m/z下的2xμ扫描)之后，使用在15000解析功率400m/z下的10次更高碰撞诱导的解离(HCD)FTMS扫描。HCD在来自各FTMS扫描的10个强度最高的离子上进行，然后放在动态排除列表中持续30秒(10ppmm/z窗)。各FTMS1扫描的AGC离子注射靶标是1000000(500ms最大注射时间)。各HCDFTMS2扫描的AGC离子注射靶标是50000(500ms最大注射时间)。通过三次LC-MSMS分析重复来分析各样品，其中第三次分析重复使用时间依赖排除列表，在前2次分析重复之一中用1％FDR排除鉴定为肽的所有肽离子。

肽鉴定和定量。

ProteomeDiscoverer

总共有324个原始数据概况(3xTMT8重X3等分试样X12组分X3分析重复)，其中有108个原始数据概况属于各TMT8重。使用ProteomeDiscoverer将所有来自第一TMT8重样品的108原始数据概况合并用于Mudpit检索，如下所述。这也对第二和第三TMT8重样品进行。

原始数据使用谱文件节点经过赛默飞世尔ProteomeDiscoverer1.3软件。谱选择子设定为其默认值，而Mascot节点设定为针对uniprot_sprot数据库，智人分类检索数据。该节点经编程以检索带脲基甲基(C)、TMT6重(K)和TMT6重(N-Term)的静态修饰的胰蛋白酶水解肽(2个错误切割)。动态修饰设定为STY的脱酰胺(N/Q)、氧化(M)和磷酸化。前体质量公差设为20ppm并且片段(b和y离子)质量公差设为20mmu。也使用与Mascot节点相同的数据库、修饰和公差针对SEQUEST检索谱。也使用PhosphoRS2.0(20mmu的片段质量公差，考虑CID和HCD的中性丢失峰)和Percolator节点检索谱。

报告离子定量节点设定为在确定质心之后使用20ppm的容差测量126.12773m/z(126)、127.12476m/z(127e)、127.13108m/z(127)、128.13444m/z(128)、129.13147m/z(129e)、129.13779m/z(129)、130.14115m/z(130)、131.13818m/z(131)下来自所有鉴定的PSM的TMT8重单同位素离子的原始强度值。在使用ProteomeDiscoverer的该阶段不应用过滤器，因此将所有的原始强度值输出至excel用于后续的处理和使用内部软件进行过滤。

生物信息学

进行统计学分析来研究相对于来自12名患者的T(胰腺肿瘤组织)和NT(非肿瘤组织)疾病组的相关调节。

质谱定量方法的准度和精度可能受到以下问题的影响，如实验偏差、系统性错误、随机错误(方差不齐)和缺失的定量值。为了改善准度和精度，发明人评估它们数据的质量，然后过滤并如下所述标准化。

MS质量-数据过滤和标准化：

删除了所有不包括全部TMT-8重报告强度的谱。为了标准化，进行和量表。由于样品之间的差异，在进一步处理之前标准化数据是可取的。可通过以下的maplots(http：//en.wikipedia.org/wiki/MA_plot)来观察标准化的效果。

统计

在第一步骤中，计算log2比率，其显示了所有和各患者的T(胰腺肿瘤组织)对NT(非肿瘤组织)的调节。对于蛋白质比率，所有未磷酸化的肽使用并与中值合并。

计算比率：

log₂(_iT/_iNT)

其中，i＝患者1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14

对于数据分析，将使用单侧t-检验(或单一样品位置检验)[http：//en.wikipedia.org/wiki/T_test]。单侧t-检验能够检测受研究的对象中的明显调节。

可在所附的感兴趣列表中观察到P-值和log2比率(表5)。显著的p-值用红色突出显示。在蛋白质水平上添加GO-项、KEGG-通路和Drugbankinfo的注释，并且在磷酸化位点水平上添加来自磷酸位点的注释。

对于磷酸肽比率，使用在任意磷酸化位置上在ProteomeDiscoverer中具有超过75％的磷酸-RS应用概率的所有肽。

结果和讨论

总之，发明人已经从2101个蛋白质组中鉴定到了6543个独特磷酸肽(6284个独特磷酸化位点)(表1)。图1显示了各TMT8-重的SysQuant工作流的所有三个臂(非富集、TiO₂、IMAC)上鉴定到的肽(磷酸化和非磷酸化)分布。图1也显示了每个样品的三个分析重复中各自检测到的肽的数量。当比较来自各平行组分(TiO₂、IMAC、非富集)的结果时，组合方法的益处是显而易见的。使用IMAC富集看到磷酸肽的最大总数，其占所有鉴定到的独特磷酸肽的79％。然而，TiO₂组分独特地鉴定到接近19％的总数，其将在使用单一磷酸肽富集策略时丢失(图1：TMT8重-ALL：a)。这对于在各样品上进行的三次分析运行也是如此。如果进行单一数据依赖运行，仅看到20318个独特肽(图1：TMT8重-ALL：d)。第二数据依赖运行增加了5868个肽，同时使用运行3中的时间依赖排除允许总共鉴定到另外3257个肽。总体上(运行2和3)，这表示在单独运行1之上增加45％并且独特肽总数增加31％。重要的是，在第三运行中鉴定到的肽通常是较低丰度的。

PLS/PCA

PLS证明在该数据集中没有异常。PLSPC1和PC2显示有三个聚类IMAC、TiO₂和总蛋白(即，工作流的非富集臂)，如图2A所示。描述数据中13.6％(PC1)和10.6％(PC2)的总方差的前两个主成分的PC1和PC2分数图。圆圈显示了基于95％置信度的T2霍特林空间。所有样品都在模型的边界上。PC1指代富集，PC2指代患者。总蛋白(非富集肽)具有与工作流的富集臂IMAC和TiO₂不同的聚类(图2A)。描述数据中10.6％(PC2)和14.4％(PC3)的总方差的下一主成分的PC2和PC3分数图(图2B)。在PC3中，PLS可将T和NT分成2个聚类。总蛋白(非富集肽)具有其自身的聚类，但是其也可分成类别T和NT。仅在患者12中没有观察到T与NT相比的差别。PLS/PCA证实实验是成功的，并且T和NT之间存在显著差异。TiO₂、IMAC和总蛋白(非富集)之间的差异存在，但是TiO₂和IMAC具有接近等同的相关性。

分级聚类分析

使用分级聚类分析来聚类证明这5409个磷酸肽在T相对于NT中的相对丰度中有类似概况的病例(图3A-3C显示具体的感兴趣区域)。使用全部5409个独特磷酸肽，可将12名患者聚类成3个独立组。一个聚类含有病例5、9、1和14，第二聚类含有病例7、6、4和13，而病例8、10和11分至第三聚类并且与其他2个聚类的成员相比互相之间的关系更远。有趣的是，当揭示12名患者的临床病史时，发明人发现病例5、9、1和14是在切除该研究中分析的肿瘤之后8至33个月(中值跟踪期16.5个月)之间肿瘤复发的患者，而病例7、6、12、4和13是在相同时间段内没有复发的患者。对于患者病史的更多详情，参见图6和7。这3个异常中2个来自随后复发的患者(病例10和11)，并且1个来自非复发患者(病例8)。有趣的是，与复发(4/4IIB期，pT3N1M0)和非复发(4/5IIB期，pT3N1M0)聚类相比，3个异常中的2个具有次晚的IIA期(pT3N0M0)。通过在皮尔森相关系数上聚类来进行聚类分析的进一步细化。通过在所有病例中比较所有的磷酸肽log2T/NT值来得到皮尔森相关系数(图3D)。聚类分析的这种细化更好地分开复发和非复发病例。

分级聚类分析根据复发和不复发清楚地对患者分组，因此发明人特别感兴趣的是鉴定其丰度与复发正相关或负相关的磷酸肽，因为这些磷酸肽可能证明是有用的预后标志物并且在分析切除的T和NT组织之后辅助预测其在新患者中复发的可能性。可在表11中看到这些磷酸肽。表11展示了在来自图3D中聚类在一起的复发病例的肿瘤对比非肿瘤中显示高(log2T/NT≥0.7)和低(log2T/NT≤-0.7)水平的所有磷酸肽。表11中磷酸肽的合并列表提供了辅助临床医师预测将在手术后31个月之前继续存在复发的患者的有用预后标志物。

除了T和NT之间总概况的差异以外，存在许多特别感兴趣的个体磷酸化位点变化。例如，如图2B(用红色箭头突出显示)和图4所见的含双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶2的磷酸-T394的磷酸肽的相对丰度概况与在中值16.5个月时肿瘤复发的患者正相关。在所有显示复发的病例中，相对于NT，它们在T中显著增加，并且在所有不显示复发的病例中，相对于NT，它们在T中下调或仅稍稍增加(图4)。该激酶是已知在RAS和RAF下游但在ERK1/2上游的RAS/RAF/MEK/ERK信号转导通路的一部分。在大多数胰腺肿瘤中，K-RAS基因被突变成致癌形式，最常见是K-RAS^G12D的形式[12]。不幸的是，在该研究中没有检测到K-RAS肽。然而，测量在K-RAS下游的双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶2的磷酸-T394可证明是辅助预测复发时间的重要预后标志物。发明人用于检索肽的UniProtKB/Swiss-Prot数据库并不含有K-RAS点突变，这解释了在该研究中缺少检测到的K-RAS肽。这强调了对含有已知致癌点突变的数据库的需要。鉴定其他RAS信号转导蛋白质以显示STRING图中看到的显著调节的磷酸肽(参见下文)。

发明人也进行了分级聚类分析以聚类证明相对于NT在T中蛋白质相对丰度的相似概况的病例，然而，聚类与复发/不复发之间的相关性不是明显的，这表明蛋白质表达的总体水平变化不如磷酸化剧烈，并且表明我们的磷酸肽分析作为预后工具的重要性。

显著调节的蛋白质表达

发明人使用各蛋白质独特的非磷酸化肽的log₂T/NT比率作为代替物来计算相应蛋白质的相对丰度以确定与非肿瘤组织相比，肿瘤中蛋白质的相对丰度。使用单侧t-检验来计算p-值并且这些针对log₂T/NT比率在火山图上作图以检测所有病例中的明显(Log₂T/NT≥0.3或≤-0.3且p≤0.05)调节(图5A)。总之，基于Log₂T/NT≥0.3或≤-0.3且p≤0.05，有150种蛋白质受到显著的调节(图12)。表2显示了与非肿瘤组织相比，肿瘤中12种最显著上调的蛋白质，并且也提供了与癌症相关或各单蛋白质的任何已知功能的表述[13-31]。粘蛋白-1的过表达通常与癌症相关并且发明人也发现粘蛋白-1在胰腺肿瘤组织中显著上调。有趣的是，发明人发现比粘蛋白-1更显著上调的蛋白质，其中的一些可证明是胰腺癌的更特异性标志物，甚至可能是新的治疗靶标，例如，同源域-相互作用蛋白激酶1。

发明人选择所有显著调节的蛋白质的登录号并将这些上传到DAVID生物信息学资源以鉴定最显著调节的那些KEGG信号转导通路。鉴于1.0E-3的本杰明分数，焦点粘连KEGG信号转导通路受到最显著的调节。显著调节的焦点粘连蛋白质包括：踝蛋白-1、细丝蛋白-A、细丝蛋白-C、联结蛋白、细丝蛋白B、纤连蛋白、焦点粘连激酶1、斑联蛋白、踝蛋白-2、蛋白磷酸酶1调节亚基12A、和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(表12)。在固定或稳定的细胞中，焦点粘连在正常条件下是特别稳定的，而在游动细胞中是较不稳定的，其中焦点粘连随着细胞在其前缘建立新的接触，在其后边缘打破旧的接触经持续组装和拆卸。

肝细胞癌衍生的生长因子也在大多数肿瘤试样中上调并且这基于p-值是显著的(p≤0.05)。

发明人特别感兴趣的是，确定了与非肿瘤组织相比，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在肿瘤中显著过表达(中值log2T/NT＝0.5且p-值＝2.95E-02)。MLCK是Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶，其调节多种细胞功能，如通过肌球蛋白轻链蛋白质的磷酸化的肌肉收缩和细胞迁移。由于肿瘤细胞迁移是肿瘤扩散的关键步骤，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)可以被认为是防止肿瘤扩散的治疗性靶标。事实上，MLCK激活和表达已经发现与转移倾向正相关。

显著调节的磷酸肽

使用磷酸化的肽的Log₂T/NT比率来计算特异性独特磷酸化位点处的磷酸化相对水平。发明人使用t-检验来计算p-值并且这些在火山图上针对工作流的IMAC、TiO₂和非富集臂的log₂T/NT比率作图以检测在所有病例中的显著(Log₂T/NT≥0.75或≤-0.75且p≤0.05)调节，如图5B-5D所示。在该研究中鉴定到的6543个磷酸肽中，5409个是可定量的(数据未显示)。在可定量的肽中，635个显示显著的调节(图5B-5D)。

发明人选择了产生具有肿瘤与非肿瘤组织相比显著差异丰度的磷酸肽(635)的蛋白质的全部408个独特登录号并将这些登录号上传到STRING(相互作用的基因/蛋白质的修复的检索工具)。在将408种蛋白质中的14个与通路匹配之后，STRING以2.50E-5的p-值的最大显著性将这些蛋白质与紧密连接KEGG信号转导通路匹配。发明人也使用STRING来鉴定这408种蛋白质与哪些GO项(生物过程、分子功能和细胞组分)有最强的结合。基于肌动蛋白丝的过程(n＝29；p-值＝4.47E-8)、肌动蛋白结合(n＝40；p-值＝2.59E-18)、和细胞骨架(n＝77；p-值＝2.66E-13)是以最大显著性匹配的GO项。发明人也使用STRING来鉴定408个蛋白质中那些与GO生物过程“RAS蛋白质信号转导调节”相关，因为RAS已知是胰腺癌中的重要肿瘤性蛋白质。这408种蛋白质中的16种以1.06E-2的p-值与该GO生物过程匹配，而这16种中的10种可映射至STRING网络(如6C)。

蛋白激酶的磷酸化

发明人特别感兴趣的是与非肿瘤相比，来自丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(参见表11a)的磷酸肽在肿瘤中显著上升。这对于含有磷酸化位点S1629的那些而言也是如此。MRCKα是RhoGTP酶，CDC42的重要下游效应物，并且在细胞骨架重组调节、细胞凸起的形成中起到关键作用，并且促进细胞迁移。可在Britton等，PLOSONE，2014年3月；第9卷，第3期，e90948中发现其他信息，其内容通过引用全文纳入本文。

因此，MRCKα作为胰腺癌的重要治疗靶标提供，并且MRCKα的激酶抑制剂作为潜在治疗剂提供。

具体病例

除了在所有病例之间平均化时确定哪些蛋白质和磷酸肽在肿瘤和非肿瘤组织之间显示出丰度的显著差异以外，发明人也想要在具体病例的基础上确定哪些磷酸肽受到高度调节。从病例1中选择产生证明log₂T/NT比率≥1或≤-1(超过2倍上调/下调)的磷酸肽的蛋白质的登录号。这些登录号然后上传到DAVID生物信息学资源上，其鉴定病例1中最受调节的KEGG信号转导通路。发明人对于各病例重复该方法，然后在具体病例的基础上基于p值和本杰明分数选择证明显著性的KEGG信号转导通路(表13)。表12中本杰明分数≤0.05的所有哪些KEGG信号通路用黄色突出显示。基于来自DAVID生物信息学输出的p值，经肿瘤与非肿瘤相比，确定紧密连接信号转导通路在所有病例(12/12病例)中受到调节，其次是粘着连接信号转导(10/12病例)和焦点粘连信号转导(10/12)。图7显示了3条信号转导通路并且用红星标记的矩形表示发明人在全部12个病例中鉴定为磷酸化的那些蛋白质。表3显示了属于参与紧密连接和焦点粘连信号转导通路以及被发现受到显著调节的其他信号转导通路(肌动蛋白细胞骨架和血管平滑肌收缩的调节)的蛋白质的所有显示显著调节的磷酸肽。

表14显示了来自病例1的所有证明log₂T/NT比率≥1或≤-1的磷酸肽，其属于参与紧密连接、粘着连接和焦点粘连KEGG信号转导通路的蛋白质。这些也映射到图7B。

整联蛋白β-4-与病例1的非肿瘤组织相比，含有整联蛋白β-4磷酸化位点S1483和S1486的双磷酸化肽在肿瘤组织中升高超过2倍。事实上，通常在所有测量的病例中，发现与非肿瘤相比，这种磷酸肽在肿瘤组织中显著升高(数据未显示)。整联蛋白β-4磷酸化已经与细胞锚定连接的分解相关，如迁移的细胞的后边缘处的半桥粒[32，33]。这类磷酸化时间已经显示由Fyn(主要在酪氨酸残基处)、PKC(主要在丝氨酸残基处)和其他激酶诱导[32]。

联蛋白α-1-在病例1中，与非肿瘤相比，含有联蛋白α-1磷酸化位点S655的肽在肿瘤组织中升高超过2倍。事实上，平均在所有病例中，含磷酸-S655的单一磷酸化的肽在肿瘤组织中显著升高(数据未显示)。S641、S655和S658处的磷酸化在除了3个病例以外的所有病例的肿瘤组织中升高，这3个病例中的2个在IIA期。有趣的是，联蛋白α-1在S641处的磷酸化已经显示导致联蛋白α-1和联蛋白β-1(β联蛋白)之间的结合，导致β联蛋白的转录激活增加和肿瘤细胞侵入[34]。

连接粘附分子A(JAM-A)-在病例1中，与非肿瘤相比，含有JAM-A磷酸化位点S284的肽在肿瘤组织中减少超过2倍，并且发现在所有病例中，与非肿瘤相比，在肿瘤中显著减少(数据未显示)。发现JAM-A在S284处的磷酸化是紧密连接的形成和成熟中的关键步骤[35]。在此，发明人观察到这种磷酸化事件在肿瘤组织中显著减少，这一事件有利于细胞的上皮至间充质的转变(EMT)以及最终的转移扩散。

磷酸化事件以表示药物靶标和其他酶的活性状态

为了确认在各情况中与非肿瘤组织相比，肿瘤中的酶的相对激活状态，发明人使用含有已知诱导酶激活或抑制的磷酸化位点的磷酸肽的相对丰度。表4和表15简短地列出了显示log₂T/NT比率≥1或≤-1的所有磷酸肽，在各情况中，这些肽含有已知诱导磷酸化的酶的激活或抑制的磷酸化位点。

酪氨酸-蛋白激酶Fyn-与病例1的非肿瘤组织相比，含酪氨酸-蛋白激酶Fyn的磷酸-S21的肽的相对丰度在肿瘤组织中升高超过2倍(表4)。Fyn在丝氨酸21处的磷酸化被报道激活Fyn激酶[36]。因此，这表明与病例1的非肿瘤组织相比，Fyn在肿瘤组织中更有活性。有趣的是，在全部12个病例中检测到Fyn的磷酸-丝氨酸21，但是仅在病例1中，发明人观察到这种与非肿瘤相比肿瘤中的较高水平。相反，病例7的肿瘤组织显示与非肿瘤组织相比，这种磷酸肽的低2倍的丰度。由于Fyn是批准的激酶抑制剂达沙替尼的靶标，这种新的数据表明使用本文所述的工作流方法测量含磷酸-S21的肽可能是达沙替尼的有吸引力的预测标志物。

促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)-与病例5、8和10的非肿瘤组织相比，含MAPK1的磷酸-T185和磷酸-Y187的肽的相对丰度在肿瘤组织中升高超过2倍(表4)。MAPK1在T185和/或Y187处的磷酸化被报道激活MAPK1[37]。因此，这表明与病例5、8和10的非肿瘤组织相比，MAPK1在肿瘤组织中更有活性。相反，病例4和11的肿瘤组织显示与非肿瘤组织相比，这种含磷酸-T185和磷酸-Y187的磷酸肽减少超过2倍。MAPK1是抗癌药物靶标(AEZS-131和SCH772984)并且也是许多其他抗癌药物靶标(抗-HERTKI，抗-MEKKI)的下游，因此这种新的数据表明使用我们的工作流测量含磷酸-T185和磷酸-Y187的肽可以是这些靶向抗癌疗法的预测性标志物。发明人也已测量了含磷酸-T185或磷酸-Y187的单一磷酸化的肽，以及含磷酸-T202和磷酸-Y204的MAPK2双重和单一磷酸化的肽。本文所述的工作流方法可易于确定MAPK2是否在T202和/或Y204上磷酸化和/或MAPK1是否在T185和/或Y187上磷酸化，产生关键的信号转导通路激活状态信息。

RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)-与病例4、7、10和13的非肿瘤组织相比，含磷酸-S124的单一磷酸化的肽以及含AKT1的磷酸-S124和磷酸-S129的双重磷酸化的肽的相对丰度在肿瘤组织中升高超过2倍(表4)。AKT1在S124和/或S129处的磷酸化被报道激活AKT1[38，39]。这表明与病例4、7、10和13的非肿瘤组织相比，AKT1在肿瘤组织中更有活性。因此，抗-AKT激酶抑制剂可在这些患者中有效。有趣的是，病例10也证明升高的MAPK1活性，表明该患者可能是AKT1和MAPK1双抑制剂治疗的候选物，因为这种组合策略在胰腺癌细胞系和异种移植模型中有证明的功效[12]。相反，含有这些激活剂磷酸化位点的磷酸肽的较低丰度表明与病例1、6、8、9、11和14的非肿瘤组织相比，AKT1在肿瘤组织中活性较低。AKT1是抗癌药物靶标，因此，发明人的数据表明使用本文所述的工作流方法测量含磷酸-S124和磷酸-S129的肽可能是这些靶向抗癌疗法的有吸引力的预测性标志物。

糖原合成酶激酶-3α-与病例1、6、13和14的非肿瘤组织相比，含糖原合成酶激酶-3α磷酸化位点Y279的肽在肿瘤组织中增加超过2倍(表15)。Y279的磷酸化导致GSK3a的激活，其然后诱导细胞存活并减少糖原产生[40]。在12个病例中的8个中测得GSK3a表达并且显示平均在肿瘤中显著过表达。

使用测量含有激活剂或抑制剂磷酸化位点的磷酸肽的相对丰度的方法，发明人能够确定糖原合成酶激酶-3α和β、组蛋白去乙酰化酶1和2、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶A-Raf、双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶6、促分裂原-激活的蛋白激酶14和超过20种其他酶的相对激活状态(表4和表15)。

值得注意的是，最显著富集的信号转导通路主要属于细胞骨架动态和细胞粘附，通常在细胞运动和转移扩散期间不受调节的通路，突出了这些蛋白质在高度转移性疾病，如胰腺癌中的重要性并且证明发明人方法的有效性。在该实验中也观察到与所述的KEGG信号转导通路无关的许多其他有趣的分子事件，包括在所有肿瘤组织中诱导微管相关蛋白τ的磷酸化位点的一致且显著的减少(数据未显示)，与其相反的情况已知导致阿尔茨海默病相关的病变。同时，激活剂磷酸化位点，酪蛋白激酶I同种型ε上的S389平均在肿瘤组织上显著升高。

最后，发明人提供了证明它们的LC-MS工作流如何能够同时测量肿瘤组织中1000种信号转导和结构蛋白质相对于非肿瘤组织的丰度和活性，并且显示如何能够使用这类测量来更好地理解导致癌症的分子事件并因此使用最合适的抑制剂在具体病例的基础上治疗患者。关键地，发明人已经证明使用磷酸肽log₂T/NT比率的分级聚类可鉴定出与在16.5个月的中值跟踪时间处显示复发的那些患者相比在相同的时间点处更可能显示出胰腺癌复发的那些患者。

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Claims (74)

1.选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种生物标志物在确定对象中胰腺肿瘤的分子表型中的用途，其中所述分子表型选自肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤；并且所述多种生物标志物至少包括选自下组的生物标志物：同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多种生物标志物至少包括选自下组的2种生物标志物：同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多种生物标志物至少包括同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。

4.一种胰腺肿瘤分类系统，所述系统包括胰腺肿瘤分类设备和信息通讯终端设备，所述胰腺肿瘤分类设备包括控制元件和存储元件，所述设备通过网络彼此通讯联接；

(1)其中所述信息通讯终端设备包括

(1a)将衍生自对象的胰腺肿瘤样品的蛋白质数据传输到胰腺肿瘤分类设备的蛋白质数据传送单元；

(1b)接收从所述胰腺肿瘤分类设备传输的对象的胰腺肿瘤分类结果的结果接收单元；

(2)其中所述胰腺肿瘤分类设备包括

(2a)接收从所述信息通讯终端设备传输的衍生自对象的胰腺肿瘤样品的蛋白质数据的蛋白质数据接收单元；

(2b)将来自数据接收单元的数据和在存储单元中存储的数据做比较的数据比较单元；

(2c)基于数据比较单元的结果确定对象的胰腺肿瘤的分子表型的确定单元；和

(2d)将通过所述确定单元得到的所述对象的分类结果传输到所述信息通讯终端设备的分类结果传送单元；

其中，所述存储单元含有选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种蛋白质的蛋白质表达水平数据和/或蛋白质磷酸化水平数据。

5.如权利要求4所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述确定单元将所述对象的胰腺肿瘤分类成包括以下的分子表型：肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、原发肿瘤、次生(转移)肿瘤和/或药物敏感性。

6.如权利要求3或权利要求5所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述存储单元的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平数据代表衍生自胰腺肿瘤样品的多个数据集。

7.如权利要求6所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述多个数据集包括代表相对于来自相同对象的相应胰腺非肿瘤样品的蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平的蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平的值。

8.如前述权利要求中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述存储单元含有选自表11A和11B的多种蛋白质的蛋白质磷酸化数据，并且其中所述分类预测所述样品的肿瘤复发或肿瘤不复发。

9.如权利要求4-7中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述存储单元含有选自表15和/或表4的多种蛋白质的蛋白质磷酸化数据，并且其中所述分类预测所述胰腺肿瘤的药物敏感性。

10.如前述权利要求4-7中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述存储单元含有选自表12和/或表2的多种蛋白质的蛋白质表达水平数据，并且其中所述分类预测所述样品的肿瘤或非肿瘤表型。

11.如前述权利要求中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述胰腺肿瘤分类系统连接至用于确定胰腺肿瘤样品中蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平的设备。

12.如权利要求11所述的胰腺肿瘤分类系统，其特征在于，所述设备可使用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)来处理多份样品。

13.一种胰腺肿瘤分类程序，所述程序使包括控制元件和存储元件的信息处理设备执行确定和/或分类对象的胰腺肿瘤的方法，所述方法包括

将基于获自患有或疑似患有胰腺癌的对象的组织样品的选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种蛋白质的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平的数据与所述存储元件中保存的蛋白质数据做比较的比较步骤；和

基于在所述比较步骤中的计算比较，对所述对象的胰腺肿瘤进行分类的分类步骤；

其中所述肿瘤分类成包括以下的表型：肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、原发肿瘤、次生(转移)肿瘤、和/或药物敏感性。

14.一种计算机可读记录介质，所述记录介质包含记录于其上的如权利要求13所述的胰腺肿瘤细胞分类程序。

15.一种诊断对象中胰腺癌的方法，所述方法包括确定获自所述对象的生物样品中选自表12、表2和/或表3的多种蛋白质的调节，其中

(a)所述样品中，所述多种蛋白质的存在指示对象患有胰腺癌；

(b)与所述多种蛋白质的参照量相比，所述多种蛋白质的量(浓度)指示对象患有胰腺癌；

(c)与所述多种蛋白质的参照量相比，所述多种蛋白质的量(浓度)的变化指示对象患有胰腺癌；或

(d)与所述多种蛋白质的参照状态相比，所述多种蛋白质的磷酸化状态的变化指示对象患有胰腺癌。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述多种蛋白质包括表2和/或表3中提供的蛋白质。

17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其特征在于，使用如权利要求3-7中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统获得与参照量或参照状态的比较。

18.一种用于将胰腺肿瘤分类成分子表型的方法，所述方法包括

(1)确定获自所述对象的生物样品中多种蛋白质的表达水平和/或蛋白质磷酸化水平，以产生所述样品的蛋白质表达和/或蛋白质磷酸化概况；

(2)将所述概况与所述多种蛋白质的参照蛋白质表达和/或蛋白质磷酸化概况做比较，所述参照概况代表选自以下的胰腺肿瘤表型：肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、药物敏感性、原发/次生肿瘤；

(3)基于样品概况与参照概况之间的比较，将所述胰腺肿瘤分类为表型；

其中所述多种蛋白质选自由表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15表示的生物标志物组。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述参照概况获自获自相同对象的非肿瘤胰腺样品的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述参照概况衍生自之前获得的胰腺肿瘤样品的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，使用如权利要求3-7中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统来进行比较所述概况与参照概况的步骤。

22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述胰腺肿瘤分类用于预测肿瘤复发或肿瘤不复发并且所述多种蛋白质选自表11；其中在选自表11A的多种蛋白质相对于正常显示增加的磷酸化并且选自表11B的多种蛋白质相对于正常显示减少的磷酸化的情况下预报肿瘤复发。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述多种蛋白质包括双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶2。

24.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其特征在于，所述胰腺肿瘤分类区分肿瘤与非肿瘤，并且所述多种蛋白质选自表12和/或表2。

25.如权利要求18或权利要求19所述的方法，其特征在于，所述胰腺肿瘤分类是药物敏感性并且所述多种蛋白质选自表15和/或表4。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述药物选自达沙替尼、索拉非尼、伏立诺他、坦西莫司、AEZS-131和GSK2141795。

27.一种为患有胰腺癌的患者选择治疗方案的方法，所述方法包括

(1)获得所述对象的胰腺肿瘤中多种蛋白质的蛋白质表达水平和/或蛋白质磷酸化水平以产生所述肿瘤的表达水平和/或蛋白质磷酸化概况；

(2)比较所述概况与参照概况，所述参照概况代表选自以下的胰腺肿瘤表型：肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤；

(3)基于肿瘤概况与参照概况之间的比较将所述对象的胰腺肿瘤分类为表型；并且

(4)按照所述对象的胰腺肿瘤的表型选择治疗方案；

其中所述多种蛋白质选自由表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15表示的生物标记物组。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述多种蛋白质选自表15和/或表4并且在确定药物敏感性表型之后选择所述治疗方案，所述药物敏感性表型的特征在于酪氨酸蛋白激酶Fyn；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；促分裂原-激活的蛋白激酶3(MAPK3)；RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)和/或糖原合成酶激酶-3α的磷酸化水平的增加或减少。

29.一种将胰腺肿瘤样品分类成一种或多种分子表型的方法，所述方法包括

(1)确定取自对象的胰腺肿瘤样品和胰腺非肿瘤样品的选自表12和/或表2的一种或多种蛋白质的蛋白质表达水平

和/或

(2)确定取自对象的胰腺肿瘤样品和胰腺非肿瘤样品的选自表3、表13和/或表11A和/或表11B的一种或多种蛋白质的磷酸化的增加或减少，

(3)将肿瘤样品与非肿瘤样品的所述蛋白质表达水平做比较；和/或将肿瘤样品与非肿瘤样品中磷酸化的增加或减少做比较

(4)应用预测算法以产生所述对象的所述蛋白质表达水平和/或磷酸化水平的预测值；

log₂(_iT/_iNT)

(其中i是对象样品，T＝肿瘤并且NT＝非肿瘤)

(5)通过参考包含分子表型的预测值的数据库将所述胰腺肿瘤样品分类成所述表型；

其中所述数据库包括选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的一种或多种蛋白质的预测值；并且

其中所述分子表型选自肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、药物敏感性、原发和/或次生肿瘤。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，如果log₂T/NT比率≥1或≤-1，则认为所述蛋白质增加或减少。

31.如权利要求29或权利要求30所述的方法，其特征在于，通过如权利要求3-7中任一项所述的胰腺肿瘤分类系统来进行所述分类。

32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过质谱进行确定所述样品中一种或几种，或多种蛋白质的蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平的步骤。

33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，通过选择性反应监测来进行所述确定一种或几种或多种蛋白质的蛋白质表达水平或蛋白质磷酸化水平的步骤，所述选择性反应监测利用一种或多种蛋白质衍生肽或磷酸肽转换；并且将测试的样品中的肽或磷酸肽水平与之前确定以代表分子表型的肽或磷酸肽做比较。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述肽水平的比较包括用已知量的相应合成肽来确定来自胰腺样品的蛋白质衍生的肽的量，其中除标记物以外，所述合成肽在序列上与获自所述样品的肽相同。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述标记物是不同质量或重同位素的标签。

36.选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种生物标志物用于确定对象中胰腺肿瘤的分子表型中的用途，其中所述分子表型选自肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤。

37.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述生物标志物选自表2和/或表12并且所述表型选自肿瘤或非肿瘤。

38.如权利要求37所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包括粘蛋白-1、整联蛋白4，和/或同源域-相互作用蛋白激酶1。

39.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述生物标志物选自表3、11A、11B和/或表13，并且所述表型选自肿瘤复发或肿瘤不复发。

40.如权利要求39所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包括双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶2。

41.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述生物标志物选自表4和/或表15，并且所述表型选自药物敏感性。

42.如权利要求41所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包括以下的一种或多种：酪氨酸蛋白激酶Fyn、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶、整联蛋白β4、联蛋白α-1、连接粘附分子A(JAM-A)；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；糖原合成酶激酶-3α；和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)。

43.一种通过确定一种或几种，或多种标志物蛋白质的量来将胰腺组织样品分类成选自以下的表型的方法：肿瘤、非肿瘤、复发、不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤，所述方法包括：

将所述样品与选择性且独立地结合所述一种或多种蛋白质的特异性结合成员接触；并且

检测和/或定量由所述特异性结合成员与所述一种或多种蛋白质形成的复合物；

基于对所述复合物的检测或定量来分类所述胰腺组织样品；

其中所述一种或多种蛋白质选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述特异性结合成员是对所述蛋白质标志物有特异性的抗体或抗体片段。

45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述特异性结合成员是适体。

46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述结合成员固定在固体支持物上。

47.一种包含多个结合成员的固体支持物，所述结合成员各自能够特异性并选择性结合所述多种蛋白质或编码所述蛋白质的核酸序列之一，其中所述蛋白质选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15。

48.一种合成肽或多种合成肽，所述合成肽各自具有与选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种标志物蛋白质之一的片段相同的序列，所述片段产生自通过胰蛋白酶、ArgC、AspN或Lys-C消化对所述蛋白质进行的消化。

49.如权利要求48所述的一种合成肽或多种合成肽，其特征在于，所述多种标志物蛋白质包括选自下组的至少1种标记物蛋白质：同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。

50.如权利要求48或权利要求49所述的合成肽，所述合成肽还包含标记物。

51.如权利要求50所述的合成肽，其特征在于，所述标记物是重同位素。

52.如权利要求50或权利要求51所述的合成肽，所述合成肽用于选择性反应监测。

53.一种用于将胰腺组织样品分类成选自肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤的分子表型的试剂盒，所述试剂盒使得使用者能够确定测试的样品中选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的蛋白质的一种或多种分析物、针对所述蛋白质的一种或多种抗体和编码所述蛋白质或其片段的一种或多种核酸分子的上调或下调，所述试剂盒包含：

(a)具有多个结合成员的固体支持物，各自能够结合其上固定的分析物之一；

(b)包含标记物的显影剂；和，任选的

(c)选自洗涤溶液、稀释剂和缓冲剂的一种或多种组分。

54.如权利要求53所述的试剂盒，其特征在于，所述表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的蛋白质包括选自下组的至少一种蛋白质：同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。

55.一种用于将胰腺组织样品分类成选自肿瘤、非肿瘤、肿瘤复发、肿瘤不复发、药物敏感性、原发肿瘤和/或次生(转移)肿瘤的分子表型的试剂盒，所述试剂盒使得使用者能够确定测试的样品中选自表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15的多种标志物蛋白质的表达水平和/或磷酸化水平的增加或减少，所述试剂盒包含

(a)一组试验相容形式的参照肽和/或参照磷酸肽，其中所述组中的各肽和/或磷酸肽独特地代表表2、3、4、11A、11B、12、13和/或15中任一所提供的多种标志物蛋白质之一；和

任选地

(b)选自洗涤溶液、稀释剂和缓冲剂的一种或多种组分。

56.如权利要求55所述的试剂盒，其特征在于，使用代表表3、4、11A、11B、13和/或15中所列标志物蛋白质内差异磷酸化位点的参照磷酸肽来确定蛋白质磷酸化的水平。

57.如权利要求56所述的试剂盒，其特征在于，所述参照磷酸肽对下组中的一种或多种是独特的：酪氨酸蛋白激酶Fyn、酪氨酸蛋白激酶CSK(Src)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶1、组蛋白去乙酰化酶2、mTOR的雷帕霉素-不敏感伴侣(RICTOR)；ERK1促分裂原-激活的蛋白激酶、ERK2促分裂原-激活的蛋白激酶、整联蛋白β4、联蛋白α-1、连接粘附分子A(JAM-A)；促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)；糖原合成酶激酶-3α；双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶2；和/或RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)。

58.一种预测治疗后对象中胰腺肿瘤复发可能性的方法，所述方法包括检测所述对象的肿瘤样品中双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶2的磷酸T-394处的磷酸化水平，其中与背景(非肿瘤)水平相比，T-394处的磷酸化水平升高指示肿瘤复发的可能性。

59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，复发在手术后2个月至33个月之间。

60.如权利要求58或权利要求59所述的方法，其特征在于，使用免疫组化确定双特异性促分裂原-激活的蛋白激酶激酶2的磷酸T-394处的磷酸化水平。

61.一种预测治疗后对象中胰腺肿瘤复发的可能性的方法，所述方法包括检测获自所述对象的肿瘤样品中选自同源域-相互作用蛋白激酶I(HIPK1)；丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)；和肌球蛋白轻链激酶，平滑肌(MLCK)的至少一种蛋白质的磷酸化水平，与背景(非肿瘤)水平相比升高的磷酸化水平指示肿瘤复发可能性。

62.一种预测胰腺肿瘤对用达沙替尼(BMS-354825-Sprycel^TM)治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定酪氨酸-蛋白质激酶Fyn上磷酸-S21的水平，其中该蛋白质的上调指示胰腺肿瘤将对于用达沙替尼治疗敏感。

63.一种预测胰腺肿瘤对用AEZS-131(AZ公司)和/或SCH772984(默克公司)治疗的敏感性的方法，所述方法包括确定促分裂原-激活的蛋白激酶1(MAPK1)上的磷酸-T185和/或Y187的水平，其中，该蛋白质的上调指示胰腺肿瘤将对用AEZS-131和/或SCH772984敏感。

64.如权利要求62或权利要求63所述的方法，其特征在于，所述确定磷酸化水平的步骤通过免疫组化进行。

65.一种诊断对象中胰腺肿瘤的方法，所述方法包括

(a)确定MLCK的表达水平；

(b)确定MRCKα的磷酸化水平；或

(c)确定HIPK1的磷酸化水平；其中，与正常组织相比MLCK的表达水平增加指示对象患有胰腺肿瘤，并且其中与正常组织中磷酸化水平相比，MRCKα和HIPK1的磷酸化增加指示对象患有胰腺肿瘤。

66.一种诊断对象中胰腺肿瘤的方法，所述方法包括确定获自所述对象的生物样品中联蛋白α-1的磷酸-S655处的磷酸化水平，其中磷酸化水平增加指示对象患有胰腺肿瘤。

67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述方法还包括确定联蛋白α-1的磷酸-S641、S655和/或S658的水平。

68.一种诊断对象中胰腺肿瘤的方法，所述方法包括确定获自所述对象的生物样品中整联蛋白β-4的磷酸-S1483处的磷酸化水平，其中磷酸化水平增加指示对象患有胰腺肿瘤。

69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述方法还包括确定整联蛋白β-4的磷酸-S1486的水平。

70.一种诊断对象中胰腺肿瘤的方法，所述方法包括确定获自所述对象的生物样品中的连接粘附分子A(JAM-A)的磷酸-S284处的磷酸化水平，其中磷酸化水平增加指示对象患有胰腺肿瘤。

71.如权利要求65-70中任一项所述的方法，其特征在于，使用免疫组化确定磷酸化水平。

72.一种用于进行如权利要求65-71中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性结合所述蛋白质上的磷酸化位点的抗体或抗体片段。

73.如权利要求72所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体或抗体片段经标记以辅助检测和定量。

74.一种治疗患有胰腺癌的对象的方法，所述方法包括给予能够抑制选自下组的蛋白激酶活性的激酶抑制剂：同源域-相互作用蛋白激酶1(HIPK1)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶MRCKα(MRCKα)，和肌球蛋白轻链激酶、平滑肌(MLCK)。