IT202000016807A1 - Peptidi associati a tumore e loro impiego - Google Patents

Description

Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?Peptidi associati a tumore e loro impiego?

DESCRIZIONE

La presente invenzione rientra nel campo dell'immunoterapia, in particolare nel campo dell'immunoterapia per patologie neoplastiche.

L'immunoterapia e, in particolare, gli inibitori dei checkpoint immunitari (ICB), hanno drasticamente migliorato la sopravvivenza globale dei pazienti affetti da tumori solidi altamente immunogenici come il melanoma metastatico e il cancro polmonare (Vanpouille-box et al. 2017). Tuttavia, una grande percentuale di pazienti non risponde alla terapia (Wolchok et al. 2013). Il fallimento dell'efficacia dell'ICB ? principalmente dovuto all'assenza di una risposta antitumorale preesistente che possa essere potenziata o rivitalizzata dagli inibitori dei checkpoint immunitari (Gros et al. 2014) e/o dall'incapacit? delle cellule tumorali di presentare peptidi derivati da tumori (Gao et al. 2016; Zaretsky et al.

2016). L'opinione attuale ? che approcci combinatori volti sia ad attivare la risposta immunitaria sia a proteggerla dalle strategie di evasione del tumore possano rappresentare una valida alternativa per il trattamento di pazienti non rispondenti (Sharma and Allison 2015). Coerentemente, due studi clinici hanno mostrato che una vaccinazione terapeutica basata su neoantigeni paziente-specifici pu? suscitare una risposta antitumorale nel melanoma metastatico avanzato e che essa pu? essere potenziata utilizzando una combinazione con l'ICB anti-PD1 (Ott et al. 2017; Sahin et al. 2017). Tuttavia, lo stesso sembra non essere vero quando si analizza la combinazione di ICB con un solo peptide antigenico noto per il melanoma (come la glicoproteina gp100, Hodi et al. 2010), suggerendo che la natura dell'antigene sia fondamentale per ottenere un'immunit? antitumorale efficace. Infatti, le cellule tumorali con un elevato carico mutazionale generano una serie di nuovi antigeni che portano mutazioni somatiche che, dopo la via di processamento e presentazione dell'antigene, vengono poi presentate dalla HLA di classe I (HLA-I) e suscitano una risposta di cellule T citotossiche CD8+ (CTL). In genere, tali nuovi antigeni derivanti da proteine mutate, anche denominati neoantigeni, sono unici per un particolare paziente (Palmieri et al., 2017; Snyder et al., 2014.).

Nonostante sia molto attraente, una strategia vaccinale personalizzata basata sull'identificazione di neoantigeni specifici del paziente richiede tempo, ? costosa e difficile da trasferire in tutti i centri oncologici e nei singoli pazienti.

Le ricerche descritte in Saccheri F. et al, ?Bacteria-induced gap junctions in tumors favor antigen cross-presentation and antitumor immunity?, (2010), Sci Transl Med. 11;2(44):44ra57, hanno rivelato che l'infezione di cellule tumorali murine e umane con il ceppo vaccinale attenuato di Salmonella typhi porta alla sovra-espressione di Cx43, il componente pi? abbondante e ubiquitario degli emi-canali della membrana plasmatica che formano le giunzioni comunicanti (GJ). Le cellule tumorali trattate con batteri stabiliscono giunzioni comunicanti con le cellule dendritiche (DC) mediante l'aggancio di due emi-canali di membrana plasmatica, consentendo il trasferimento di antigeni preprocessati dalle cellule tumorali alle DC, e questo porta alla creazione di una forte risposta antitumorale mediata da DC. Questa strategia ? tuttavia abbastanza laboriosa da tradurre in applicazione clinica poich? richiede la generazione simultanea di una linea cellulare tumorale, la differenziazione delle DC dai monociti del sangue periferico (PBMC) e l'associazione di cellule tumorali con DC derivanti da biomateriale del paziente.

WO 2017/081286 Al descrive che il supernatante di colture cellulari di cellule tumorali umane, canine e murine infettate da Salmonella presenta un potenziale immunogenico. Esso descrive anche alcuni peptidi murini isolati dal supernatante di cellule tumorali murine infettate da Salmonella.

Alla luce di quanto sopra, vi ? la necessit? di un approccio immunoterapeutico nuovo ed efficace nel trattamento del cancro. Pi? in particolare, vi ? la necessit? di un approccio immunoterapeutico mirato al cancro che sia adatto all'applicazione clinica in un'ampia popolazione di pazienti e che allo stesso tempo riduca gli effetti collaterali negativi, pi? specificamente le reazioni di autoimmunit?.

Queste e altre necessit? sono soddisfatte dai peptidi isolati associati al tumore, dalla cellula presentante l'antigene (APC) isolata, dalla composizione immunogenica e dal loro utilizzo terapeutico come definiti nelle annesse rivendicazioni , che formano parte integrante della descrizione.

I presenti inventori sono riusciti per la prima volta a ottenere nuovi peptidi rilasciati da cellule tumorali, che sono sorprendentemente capaci di attivare, da soli o in combinazione, i linfociti T citotossici (CTL) tumore-specifici per l'uccisione delle cellule tumorali (Figure 2). Come verr? illustrato in dettaglio nella sezione Sperimentale di seguito, i nuovi peptidi dell'invenzione sono stati isolati dalle proteine secrete da cellule tumorali infettate da batteri, in particolare da cellule di melanoma umano infettate da Salmonella, e sono condivisi tra cellule tumorali di pazienti differenti affetti dalla stessa patologia, cos? come tra cellule differenti della stessa lesione tumorale (Figura 1).

Inoltre, gli studi condotti dai presenti inventori hanno rivelato sorprendentemente che CTL stimolati con i peptidi dell'invenzione non vengono attivati da melanociti primari, dimostrando in tal modo che questi peptidi non vengono n? prodotti n? presentati da cellule normali sane (Figura 4).

I presenti inventori hanno infatti scoperto che i peptidi dell'invenzione vengono processati dall?apparato del proteasoma tumorale attraverso la risposta alle proteine non ripiegate (UPR), che ? un meccanismo adattativo intrinseco e unico delle cellule cancerose. Tipicamente, la via UPR viene attivata nelle cellule cancerose in risposta agli stimoli di stress che queste cellule altamente proliferanti devono sostenere a livello di reticolo endoplasmatico. Senza voler essere vincolati da alcuna teoria, i presenti inventori ritengono che l'infezione batterica possa esacerbare l'attivazione dell'UPR in cellule tumorali stressate a livello dell?ER, agendo come ulteriore stimolo di stress.

Pertanto, i nuovi peptidi ottenuti dai presenti inventori rappresentano una firma antigenica unica capace di esercitare un effetto immunogenico altamente specifico contro un tumore, in particolare un melanoma, in una vasta gamma di pazienti, senza colpire le cellule sane dei pazienti. Tali propriet? uniche rendono i peptidi dell'invenzione particolarmente adatti per ampie applicazioni in approcci di immunoterapia destinati ad essere rivolti efficientemente verso pazienti differenti con rischio molto piccolo o nullo di reazioni di autoimmunit? non specifiche, superando cos? i limiti e i principali ostacoli di approcci di immunoterapia personalizzati della tecnica anteriore che devono essere su misura per ogni paziente.

Un primo aspetto della presente invenzione ? quindi un peptide isolato associato a tumore comprendente o consistente di o consistente essenzialmente di una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo consistente di SEQ ID NO. 1 ? 13 e di frammenti di dette sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1 ? 13 di lunghezza di almeno 3 amminoacidi.

In una forma di realizzazione preferita, il peptide isolato dell'invenzione ? un peptide associato a melanoma, preferibilmente un peptide associato al melanoma umano.

Come qui utilizzato, il termine "frammento" si riferisce a una sequenza continua di residui amminoacidici, la cui sequenza forma un sottoinsieme di una sequenza pi? ampia.

Secondo l'invenzione, il peptide comprende o consiste di o consiste essenzialmente di una sequenza amminoacidica scelta da frammenti di sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1 - 13 che hanno una lunghezza di almeno 3 amminoacidi. In una forma di realizzazione, detti frammenti delle sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1-13 hanno una lunghezza di almeno 4, almeno 5, almeno 6, almeno 7, almeno 8, almeno 9, almeno 10, almeno 11, almeno 12, almeno 13, almeno 14, almeno 15, almeno 16, almeno 17, almeno 18, almeno 19, almeno 20 o almeno 21 amminoacidi.

In un?altra forma di realizzazione, detti frammenti delle sequenze amminoacidiche SEQ ID NO.

1-13 hanno una lunghezza di 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 amminoacidi.

In una forma di realizzazione preferita, detti frammenti delle sequenze amminoacidiche SEQ ID NO.

1-13 hanno una lunghezza di 8 amminoacidi.

In una forma di realizzazione pi? preferita, detti frammenti sono in grado di innescare una risposta immunitaria, pi? preferibilmente una risposta immunitaria mediata da cellule, ancor pi? preferibilmente una risposta immunitaria mediata da cellule T contro cellule tumorali, tra cui ad esempio cellule di melanoma.

Un secondo aspetto dell'invenzione ? una sequenza di acido nucleico isolata codificante un peptide associato a tumore come definito sopra.

Gli acidi nucleici della presente invenzione possono essere a filamento singolo o doppio. Gli acidi nucleici codificanti un peptide associato a tumore dell'invenzione possono essere prodotti con metodi ben noti nella tecnica, quali per esempio metodi del DNA ricombinante.

In alternativa, l'acido nucleico codificante un peptide associato a tumore dell'invenzione pu? essere un acido nucleico sintetico in cui i codoni sono stati ottimizzati per una maggiore espressione nella cellula ospite in cui viene prodotto. La degenerazione del codice genetico consente variazioni della sequenza nucleotidica, pur producendo un peptide avente la stessa sequenza amminoacidica del peptide codificato dalla sequenza di DNA nativa. Sequenze di acido nucleico che possiedono un utilizzo di codoni sostanzialmente differente pur codificando un peptide dell'invenzione avente la stessa sequenza amminoacidica sono comprese dalla presente invenzione.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione ? un vettore di espressione, comprendente una sequenza di acido nucleico codificante il peptide associato a tumore secondo l?annessa rivendicazione 1, ed opzionalmente comprendente inoltre una sequenza promotrice e una sequenza segnale di poliadenilazione, nonch? una cellula ospite comprendente il vettore di espressione di cui sopra.

Vettori di espressione ricombinanti per utilizzo nella preparazione di peptidi o proteine sono noti e descritti nello stato della tecnica, pertanto la scelta e l'utilizzo degli stessi rientrano nelle competenze dei normali tecnici del settore. Tali vettori possono essere vettori procariotici o eucariotici. A titolo di esempio non limitativo, si citano vettori per l?espressione in cellule procariotiche, come il vettore pQE e il vettore pBAD.

In alternativa, il vettore secondo l'invenzione pu? essere adatto per l'espressione nelle cellule eucariotiche, ad esempio un sistema di trasduzione basato sull'utilizzo di un vettore lentivirale, un vettore adenovirale, un vettore retrovirale, un baculovirus.

Preferibilmente, il sistema cellulare utilizzato per l'espressione del vettore di espressione dell'invenzione ? scelto tra sistemi procariotici, ad esempio cellule batteriche di E. coli, o tra sistemi eucariotici, ad esempio cellule di insetto.

Un altro aspetto ancora della presente invenzione ? un metodo per produrre un peptide secondo l'invenzione, in cui la cellula ospite trasformata viene coltivata in condizioni adatte e per un tempo sufficiente per l'espressione del peptide dell'invenzione.

Tipicamente, condizioni di crescita adeguate dipendono dal sistema cellulare utilizzato e possono riguardare, ad esempio, la composizione del terreno di coltura, il pH, l'umidit? relativa, la componente gassosa, nonch? la temperatura. La scelta delle condizioni di coltura cellulare pi? adatte da impiegare nel metodo secondo l'invenzione rientra nelle capacit? del tecnico del settore.

In una forma di realizzazione preferita, il metodo secondo l'invenzione comprende inoltre il passaggio di recupero del peptide prodotto dalla coltura cellulare. Il passaggio di recupero pu? essere effettuato utilizzando tecniche di purificazione proteica note nell?arte, ad esempio mediante denaturazione, solubilizzazione e/o rinaturazione proteica, oppure mediante uno o pi? passaggi cromatografici e/o di dissalazione o, in alternativa, mediante ultrafiltrazione, dialisi e/o liofilizzazione.

In alternativa, il peptide associato a tumore secondo l'invenzione pu? essere prodotto per mezzo di tecniche di sintesi, ad esempio mediante sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) o sintesi in fase di soluzione (SPS). L'esperto sar? a conoscenza di tecniche e metodi per la sintesi di peptidi; e pu? essere utilizzato qualsiasi di tali metodi adatti.

Come ? noto nell?arte, la presentazione dell'antigene descrive un processo immunitario vitale che ? essenziale per l'innesco della risposta immunitaria delle cellule T. Poich? le cellule T riconoscono solo antigeni frammentati esposti sulla superficie cellulare, il processamento dell'antigene viene tipicamente condotto da cellule presentanti l'antigene (APC) che dividono un antigene proteico in peptidi e lo presentano in congiunzione con molecole MHC di classe II sulla superficie cellulare dove pu? essere riconosciuto da un recettore delle cellule T. Tuttavia, le APC esprimono costitutivamente un diverso tipo di proteasoma rispetto alle cellule tumorali e i peptidi processati presenti sulle molecole HLA sulle APC potrebbero non corrispondere necessariamente ai peptidi presentati dalle cellule tumorali, non riuscendo cos? a indurre una risposta antitumorale efficace (Vigneron & Van den Eynde; ?Proteasome subtypes and the processing of tumor antigens: increasing antigenic diversity? (2012) Curr Opin Immunol. 2012 Feb; 24(1):84-91).

Vantaggiosamente, i peptidi associati a tumore dell'invenzione vengono pre-processati dal proteasoma del tumore e non ? necessario un ulteriore taglio di questi peptidi quando essi vengono assorbiti dalle APC per essere presentati per il riconoscimento da parte dei linfociti T. Questo requisito consente alle APC caricate con peptidi di innescare risposte efficienti delle cellule T contro cellule tumorali che esprimono gli stessi antigeni.

Di conseguenza, un ulteriore aspetto della presente invenzione ? una cellula isolata presentante l'antigene (APC), che porta sulla superficie cellulare almeno un peptide associato a tumore come definito sopra.

In una forma di realizzazione, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente una sequenza amminoacidica di qualsiasi tra SEQ ID NO. 1, 2, 3 o 4, e qualsiasi loro combinazione.

Secondo questa forma di realizzazione, la cellula presentante l'antigene (APC) porta preferibilmente sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4.

In un?altra forma di realizzazione, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente una sequenza amminoacidica di qualsiasi tra SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, o 9, e qualsiasi loro combinazione.

Secondo questa forma di realizzazione, la cellula presentante l'antigene (APC) porta preferibilmente sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

Pi? preferibilmente, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione preferita, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione pi? preferita, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione ancora pi? preferita, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

In una forma di realizzazione ancora pi? preferita, la cellula presentante l'antigene (APC) porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

Preferibilmente, la cellula presentante l'antigene (APC) secondo l?invenzione ? una cellula dendritica (DC).

Le cellule dendritiche possono essere ottenute da qualsiasi fonte e possono essere autologhe o allogeniche. Come qui utilizzata, una cellula che ? "autologa" di un soggetto significa che la cellula ? stata isolata dal soggetto o deriva da una cellula che ? stata isolata dal soggetto.

Al fine di generare una cellula presentante l'antigene, preferibilmente una cellula dendritica, che porta sulla superficie cellulare almeno un peptide associato a tumore dell'invenzione, cellule presentanti l'antigene autologhe o allogeniche possono essere trasfettate con un vettore di espressione che produce detto peptide associato a tumore.

Secondo una strategia alternativa di caricamento dell'antigene, una cellula presentante l'antigene, preferibilmente una cellula dendritica, pu? essere pulsata con almeno un peptide associato a tumore dell'invenzione.

L'esperto sar? a conoscenza di tecniche e metodi per generare una cellula presentante l?antigene, preferibilmente una cellula dendritica, che porta sulla superficie cellulare almeno un peptide associato a tumore dell?invenzione, e pu? essere utilizzato qualsiasi di tali metodi adatti.

Un altro aspetto ancora della presente invenzione ? una composizione immunogenica comprendente almeno un peptide associato a tumore come definito sopra e/o una cellula presentante l'antigene (APC) come definita sopra, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

Come qui utilizzato, il termine "immunogenico/a" si riferisce alla capacit? di stimolare il sistema immunitario e suscita una risposta immunitaria in un ospite o in un soggetto. L?espressione "suscitare una risposta immunitaria" si riferisce alla stimolazione di cellule immunitarie in vivo in risposta a uno stimolo, quale un antigene. La risposta immunitaria consiste sia di una risposta immunitaria cellulare, p.es. stimolazione di cellule T e macrofagi, che di una risposta immunitaria umorale, p.es. stimolazione di cellule B e complemento e produzione di anticorpi. La risposta immunitaria pu? essere misurata utilizzando tecniche ben note nell?arte, che includono, ma non sono limitate a, saggi immunologici anticorpali, saggi di proliferazione e altri.

Secondo l'invenzione, nella composizione immunogenica dell'invenzione pu? essere compresa qualsiasi combinazione dei peptidi associati a tumore come definiti sopra.

In una forma di realizzazione, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente una sequenza amminoacidica di qualsiasi tra SEQ ID NO. 1, 2, 3 o 4, e qualsiasi loro combinazione.

Secondo questa forma di realizzazione, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende preferibilmente un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

4.

In un?altra forma di realizzazione, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente una sequenza amminoacidica di qualsiasi tra SEQ ID NO.

5, 6, 7, 8, o 9, e qualsiasi loro combinazione.

Secondo questa forma di realizzazione, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende preferibilmente un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

9.

Pi? preferibilmente, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione preferita, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione pi? preferita, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9.

In una forma di realizzazione ancora pi? preferita, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

In una forma di realizzazione ancora pi? preferita, la composizione immunogenica dell?invenzione comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

Secondo l'invenzione, ? previsto che il peptide associato a tumore e la cellula APC come definiti sopra possano essere presenti nella composizione immunogenica dell'invenzione in qualsiasi possibile combinazione.

Secondo le forme di realizzazione descritte sopra, l'invenzione fornisce una composizione immunogenica comprendente pi? antigeni tumorespecifici condivisi da diverse cellule tumorali, che ha il vantaggio di poter prendere di mira l'eterogeneit? del tumore, in particolare l'eterogeneit? del melanoma, che pu? verificarsi sia come variabilit? inter-paziente che come variabilit? intra-paziente che insorge all'interno della stessa lesione o in diverse lesioni dello stesso paziente.

Oltre ai/alle suddetti/e peptidi associati a tumore e/o cellule presentanti l'antigene (APC), la composizione immunogenica secondo l'invenzione comprende un veicolo farmaceuticamente accettabile.

L?espressione "farmaceuticamente accettabile" si riferisce a composti che possono essere somministrati a mammiferi senza eccessiva tossicit? a concentrazioni coerenti con l'attivit? efficace del principio attivo. Preferibilmente, il veicolo farmaceuticamente accettabile adatto per l'uso nella composizione immunogenica dell'invenzione ? un veicolo acquoso, come ad esempio una soluzione acquosa, una soluzione salina, una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e Ringer lattato.

La composizione immunogenica secondo l'invenzione pu? essere preparata sotto forma di sospensione liquida, congelata o in forma liofilizzata. A tale scopo, la composizione immunogenica preparata secondo la presente descrizione contiene inoltre un vettoree e/o diluente farmaceuticamente accettabile. I vettori includono, ma non sono limitati a, stabilizzanti, conservanti e tamponi. Stabilizzanti adatti sono, ad esempio, SPGA, composizioni di Tween, carboidrati (come sorbitolo, mannitolo, amido, saccarosio, destrano, glutammato o glucosio), proteine (come siero di latte essiccato, albumina o caseina) o prodotti di degradazione degli stessi. Esempi di tamponi adatti includono fosfati di metalli alcalini. Conservanti adatti includono timerosal, mertiolato e gentamicina. I diluenti includono acqua, tampone acquoso (come soluzione salina tamponata), alcoli e polioli (come glicerolo).

La scelta di un veicolo, vettore e/o diluente farmaceuticamente accettabile adatto per la composizione immunogenica dell'invenzione pu? essere determinata da un normale tecnico del settore che utilizzi le sue normali conoscenze.

Grazie alle propriet? sopra illustrate dei peptidi associati a tumore dell'invenzione, la composizione immunogenica secondo la presente invenzione ? particolarmente adatta per l'uso come vaccino, in particolare nella prevenzione e/o nel trattamento terapeutico di un tumore, in particolare di un tumore solido, pi? in particolare di un melanoma.

Il termine "vaccino", come qui utilizzato, si riferisce a una composizione comprendente almeno un peptide associato a tumore e/o una cellula presentante l'antigene (APC) come qui descritto/a, che ? utile per stabilire in un soggetto una risposta immunitaria protettiva contro un tumore, in particolare contro un melanoma.

Secondo l'invenzione, ? previsto che alla composizione immunogenica per l'uso come vaccino possa essere aggiunto un adiuvante, per indurre in modo efficiente risposte immunitarie umorali e un'immunit? cellulo-mediata.

Esempi illustrativi e non limitativi di adiuvanti adatti per l'uso nella composizione immunogenica dell'invenzione sono l'adiuvante completo di Freund, l'adiuvante incompleto di Freund, gel minerali come l'idrossido di alluminio, sostanze attive in superficie come lisolecitina, polioli pluronici, polianioni, peptidi, emulsioni di oli o di idrocarburi, emocianine della patella e adiuvanti umani potenzialmente utili, come N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutammina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alartil-D-isoglutammina, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1?-2?-dipalmitoil-sn-glicero-3-idrossifosforilossi)-etilammina, BCG (bacillo di Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

A titolo di ulteriore esempio, adiuvanti immunologici adatti per l'uso nella composizione immunogenica dell'invenzione sono agonisti dei recettori Toll-simili (TLR) come TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 o TLR10, ad esempio Hiltonol, SD101, Imiquimod, G100.

Secondo l'invenzione, ? previsto che l'utilizzo della composizione immunogenica dell'invenzione come vaccino sia profilattico e/o terapeutico.

La composizione immunogenica della presente invenzione pu? essere utilizzata come vaccino per il trattamento di una patologia tumorale esistente o profilatticamente per prevenire l'insorgenza di questa malattia, in particolare per la prevenzione e/o il trattamento terapeutico di un tumore, in particolare di un tumore solido, pi? in particolare di un melanoma e/o di una patologia residua del melanoma.

Un trattamento "profilattico" ? un trattamento somministrato a un soggetto che non presenta segni di una malattia, o che presenta solo segni precoci, allo scopo di ridurre il rischio che sviluppi la malattia. La composizione immunogenica qui descritta come vaccino pu? essere somministrata come trattamento profilattico per ridurre la probabilit? di sviluppare una malattia tumorale, in particolare un tumore solido, pi? in particolare un melanoma, o per ridurre al minimo la gravit? della malattia tumorale, se sviluppata.

Un trattamento "terapeutico" ? un trattamento somministrato a un soggetto che presenta segni o sintomi di una malattia, allo scopo di ridurre o eliminare tali segni o sintomi. Nel contesto del trattamento, la somministrazione della composizione immunogenica per l'uso secondo l'invenzione pu? ritardare la progressione e la crescita di una malattia tumorale, in particolare di un tumore solido, pi? in particolare di un melanoma, riducendo il numero di cellule cancerose e le dimensioni del tumore primario, oltre che inibendo l'infiltrazione delle cellule cancerose negli organi periferici e le metastasi tumorali.

Lo stato immunitario dell'individuo pu? essere uno dei seguenti: l'individuo pu? essere immunologicamente ?vergine? per quanto attiene alcuni peptidi associati a tumore presenti nella composizione, nel qual caso le composizioni possono essere somministrate per avviare o promuovere la maturazione di una risposta antitumorale. L'individuo potrebbe non esprimere un'immunit? antitumorale in quel momento, ma potrebbe avere una memoria immunologica, in particolare una memoria delle cellule T relativa a un peptide associato a tumore compreso nel vaccino, nel qual caso le composizioni possono essere somministrate per stimolare una risposta di memoria. L'individuo potrebbe anche avere un'immunit? attiva (immunit? umorale o cellulare, o entrambe) contro un peptide associato a tumore compreso nel vaccino, nel qual caso le composizioni possono essere somministrate per mantenere, richiamare o far maturare la risposta.

Nel contesto terapeutico e/o preventivo, la composizione immunogenica per l'uso secondo l'invenzione pu? essere applicata a un tumore, ad esempio un melanoma, che ? una malattia residua del tumore.

L?espressione "malattia residua del tumore" ? qui utilizzata per descrivere uno stadio di una malattia tumorale in cui i sintomi clinici sono scomparsi o sono in gran parte scomparsi (come durante il trattamento o dopo l'intervento chirurgico), ma in cui una frazione delle cellule originate dalle cellule malate trattate ? sopravvissuta al trattamento o all'intervento chirurgico e/o ha sviluppato una tolleranza al/i farmaco/i utilizzato/i nel trattamento, e rimane vitale. Queste cellule vitali possono dare origine a una ricaduta.

La composizione immunogenica dell'invenzione ? adatta per essere somministrata come vaccino per la terapia contro il cancro a qualsiasi mammifero, compresi gli esseri umani.

Per i suddetti scopi terapeutici e preventivi, la composizione immunogenica per l'uso secondo l'invenzione pu? essere somministrata da sola o in combinazione con una o pi? altre terapie contro il tumore. Tali altre terapie includono, ad esempio, una terapia con un inibitore dei checkpoint immunitari, un agente chemioterapico, un agente biologico, come p.es. una terapia con acidi nucleici, e anticorpi che neutralizzano le molecole immunomodulanti, una terapia di targeting come p.es. una terapia anticorpale mirata al tumore e una terapia virale oncolitica, e qualsiasi combinazione di qualsiasi delle precedenti terapie di combinazione.

La composizione immunogenica dell'invenzione pu? essere somministrata come vaccino, ad esempio per via endovenosa, intradermica, intraperitoneale, sottocutanea o intramuscolare.

In alternativa, la composizione immunogenica per l'uso secondo la presente invenzione pu? essere formulata e somministrata in modo da evocare una risposta immunitaria a livello delle superfici della mucosa. Pertanto, la composizione immunogenica pu? essere somministrata alle superfici della mucosa, ad esempio, per via nasale, orale, oculare, bronchiolare o intrarettale.

La dose di somministrazione viene scelta come quantit? che induce una risposta immunoprotettiva senza significativi effetti collaterali negativi, e viene determinata in base a vari fattori, come la morfologia, l'istotipo, le dimensioni e la classificazione del tumore da trattare, e pu? essere determinata da un normale tecnico del settore che utilizzi le sue normali conoscenze.

Un altro aspetto ancora della presente invenzione riguarda un metodo per ottenere uno o pi? peptidi associati a tumore come definiti sopra, in cui detto metodo comprende i passaggi di:

a) esporre una coltura cellulare di melanoma ad almeno un(a) agente infettivo e/o agonista dei Recettori di Riconoscimento di Pattern (PRR) e/o citochina infiammatoria;

b) raccogliere il supernatante della coltura cellulare; e

c) isolare da esso uno o pi? peptidi associati a tumore,

in cui detti uno o pi? peptidi associati a tumore comprendono una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo consistente di SEQ ID NO. 1 ? 13 e frammenti di dette sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1 ? 13 di lunghezza di almeno 3 amminoacidi.

Come gi? detto, gli inventori hanno osservato che l'infezione di cellule di melanoma con un batterio, come p.es. Salmonella, induce sovraregolazione e apertura di emi-canali di membrana e rilascio di peptidi generati da proteasomi nell'ambiente extracellulare attraverso l'esacerbazione della via della risposta alle proteine non ripiegate (UPR).

Nel contesto della presente descrizione, il termine "agente infettivo" indica qualsiasi materiale biologico che possa causare un'infezione e portare a una malattia, ivi inclusi ad esempio batteri, virus, funghi e parassiti.

Preferibilmente, l'agente infettivo ? un batterio, pi? preferibilmente un batterio Gramnegativo, ancora pi? preferibilmente un batterio appartenente al genere Salmonella, ancor pi? preferibilmente un ceppo non virulento del genere Salmonella.

L'infezione da parte di microbi patogeni d? inizio a una serie di interazioni complesse tra il patogeno e l'ospite mediate da recettori di riconoscimento di pattern. I recettori di riconoscimento di pattern (PRR) si riferiscono a recettori codificati dalla linea germinale che sono capaci di riconoscere molecole che si trovano frequentemente nei patogeni (i cosiddetti Pattern Molecolari Associati a Patogeni - PAMP), (PAMPs, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity 2011; 34:637-50). I PRR attivano vie di segnalazione a valle che portano alla secrezione di citochine e all'attivazione di altri programmi di difesa dell'ospite necessari per le risposte immunitarie sia innate che adattive.

Un agonista di PPR si riferisce a un composto (naturale o sintetico) che si lega al PRR e innesca una risposta, mimando in tal modo gli agenti infettivi.

Le citochine sono dei regolatori chiave della risposta immunitaria alle infezioni. Come ? noto nell?arte, il rilascio di citochine infiammatorie innescato dall'infezione porta all'apertura di emicanali di membrana in diversi tipi di cellule (Saccheri F., et al; Bacteria Induced Gap Junctions in Tumor Favor Ag cross presentation and Antitumor Immunity. (2010). Sci Transl Med. 11 Agosto 2010; 2(44): 44ra57).

In una forma di realizzazione preferita del metodo dell'invenzione, la citochina infiammatoria ? IFN gamma.

Preferibilmente, la cellula di melanoma utilizzata nel metodo dell'invenzione ? una linea cellulare di melanoma stabilizzata, o una cellula di melanoma isolata da un soggetto affetto da melanoma.

Nel contesto della presente descrizione, l'espressione "una linea cellulare" ? volta a indicare una coltura di un particolare tipo di cellula che pu? essere riprodotto indefinitamente, mentre l'espressione "coltura cellulare primaria" ? volta a indicare una coltura derivante da una cellula prelevata direttamente da un organismo vivente, che non ? immortalizzata.

In una forma di realizzazione preferita, il metodo dell'invenzione ? condotto su una pluralit? di colture cellulari di cellule di melanoma differenti. Laddove si utilizzi una pluralit? di colture cellulari di melanoma, le cellule cancerose in coltura possono derivare da diversi pazienti affetti da melanoma o da lesioni cancerose presenti nella stessa parte o in parti differenti del corpo di un paziente affetto da melanoma.

Sulla base di questa forma di realizzazione, attraverso il metodo dell'invenzione, si ottengono peptidi associati a tumore che sono condivisi tra pazienti affetti da melanoma e/o tipi tumorali di melanoma.

Preferibilmente, nel passaggio c) del metodo dell'invenzione, il supernatante di coltura cellulare raccolto viene sottoposto a centrifugazione e filtrazione per separare la componente liquida.

La caratterizzazione dei peptidi nella componente liquida pu? essere eseguita mediante qualsiasi numero di metodi accettabili ben noti agli esperti del settore. In un metodo preferito, la caratterizzazione dei peptidi associati a tumore si ottiene mediante analisi di spettrometria di massa.

Nell'invenzione ? anche incluso un metodo per produrre una risposta immunitaria contro un tumore, in particolare un melanoma, in un soggetto, che comprende l'immunizzazione del soggetto con una quantit? efficace di uno/a o pi? peptidi associati a tumore e/o molecole di acido nucleico codificanti i peptidi associati a tumore dell'invenzione e/o composizioni immunogeniche comprendenti gli stessi.

La seguente sezione sperimentale ? fornita a puro titolo di illustrazione e non intende limitare l'ambito dell'invenzione come definito nelle rivendicazioni allegate. Nella seguente sezione sperimentale si fa riferimento ai disegni allegati, in cui:

La Figura 1 mostra che linee cellulari di melanoma umano, dopo infezione con Salmonella, rilasciano peptidi immunogenici capaci di innescare monociti di sangue periferico (PBMC) di donatori sani. (A) Schema dell'esperimento. Il supernatante derivato da cellule di melanoma 634-38 infettate con Salmonella ? stato raccolto e utilizzato per stimolare HLA-A2<+>-PBMC di donatori sani per generare linfociti T citotossici (CTL, denominati CTL-Vax). Come controllo positivo, i PBMC sono stati stimolati con il peptide Mart-126-35 (denominato CTL-Mart1). I CTL sono stati testati per la loro capacit? di riconoscere e uccidere cellule tumorali con HLA-A2 corrispondente. (B,D) Grafici che mostrano l'attivazione delle cellule tramite valutazione della produzione di IFN-gamma e dell'espressione di CD107a mediante citometria a flusso. CTL-Vax (B) o CTL-Mart1 (D) sono stati sottoposti a co-coltura per 5 ore in un rapporto di 1:1 con cellule di melanoma 624-38 HLA-A2<+>, con cellule di melanoma 624-38 negative per HLA-A2, con cellule di melanoma SkMel24 HLA-A2<+ >e cellule di adenocarcinoma HT-29 HLA-A2+, in presenza dell'inibitore del Golgi Brefeldina e dell'anticorpo CD107a. Per controllare la specificit? dell'attivazione delle cellule, al sistema ? stato aggiunto un anticorpo bloccante HLA. (C,E) Grafici che mostrano i risultati di un saggio Delfia condotto per valutare la citotossicit? di CTL-Vax (C) o di CTL-Mart1 (E). Cellule di melanoma sia 624-38 che 624-28 sono state caricate con colorante Europio e co-coltivate con cellule effettrici CTL-Vax o CTL-Mart1 a un rapporto bersaglio:effettore differente. L'effetto citotossico mediato da CTL-Vax ? mostrato come percentuale di rilascio specifico di Europio. Per l?analisi statistica, ? stato utilizzato il t-test di Student *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, (n>4).

La Figura 2 mostra che le cellule di melanoma umano rilasciano peptidi immunogenici dopo infezione con Salmonella. (A) Illustrazione schematica della strategia sperimentale perseguita per identificare gli antigeni candidati responsabili dell'effetto immunogenico di supernatanti di colture cellulari di melanoma. (B) Tabella che elenca i peptidi associati a tumore dell'invenzione identificati secondo la procedura di cui sopra, insieme alle loro sequenze amminoacidiche, al nome della proteina e all'IC50 del legame ad HLA. (C) I grafici mostrano l'attivit? immunogenica del peptide associato a tumore dell'invenzione rappresentando l'IFN-gamma rilasciato da CTL-Vax dopo stimolazione con ogni singolo peptide. I peptidi dell'invenzione sono stati sintetizzati, caricati su Thp1 a diverse concentrazioni (20uM-1,25uM) e utilizzati per stimolare CTL-Vax (rapporto 1:1).

La Figura 3 mostra che l'infezione con Salmonella induce un rilascio guidato da UPR di peptidi scissi dal proteasoma da parte di cellule tumorali umane. (A) Grafico a barre che mostra l'intensit? della fluorescenza media (MFI) di HLA-A*02:01 misurata sulle superfici di cellule T2 che sono state caricate per 2 ore con supernatanti derivati da cellule di melanoma 624-38 infettate con Salmonella, in combinazione con l?inibitore di UPR 4?8c o con l?inibitore di UPR MG132 o Epoxomicina (Epo). (B) Grafico a barre che mostra il rilascio di IFN-gamma da parte della linea cellulare monocitica umana Thp1 utilizzata come linea di cellule presentanti l'antigene e caricata con supernatanti derivati da cellule di melanoma 624-38 infettate con Salmonella, in combinazione con l?inibitore di UPR 4?8c o con l?inibitore di UPR MG132 o Epoxomicina (Epo). Le cellule Thp1 sono state co-coltivate con CTL Vax a un rapporto di 1:1. Il rilascio di IFN-gamma ? stato misurato dopo 72 ore tramite ELISA.

La Figura 4 mostra che CTL espansi con una composizione comprendente i peptidi associati a tumore dell'invenzione vengono attivati solo da cellule tumorali e non da melanociti primari. L'attivazione dei CTL ? stata valutata misurando la produzione di IFN-gamma mediante citometria a flusso. (A) Schema che mostra che CTL-Vax ? andato incontro a due cicli di stimolazione con la composizione immunogenica dell'invenzione al fine di aumentare la frequenza di CTL peptide-specifici, denominati CTL-Vax-MIX. (B) L'attivazione dei CTL ? stata valutata misurando la produzione di IFN-gamma mediante citometria a flusso. I grafici a barre mostrano i risultati dell'attivazione dei CTL, tramite valutazione della capacit? sia di CTL-Vax (a sinistra) che di CTL-Vax-MIX (a destra) di riconoscere le cellule bersaglio e rilasciare IFN-gamma. CTL-Vax e CTL-Vax-MIX sono stati entrambi cocoltivati per 5 ore (rapporto 1:1) con cellule di melanoma 624-38 HLA-A2<+>, con cellule di melanoma 624-28 negative per HLA-A2, con melanociti mel23 HLA-A2<+ >e melanociti mel41 HLA-A2-negativi, in presenza dell'inibitore del Golgi Brefeldina e dell'anticorpo CD107a. Come controllo della specificit? dell'attivazione delle cellule, al sistema ? stato aggiunto un anticorpo bloccante HLA.

1. MATERIALI E METODI

Esempio 1.1: Linee cellulari e ceppi batterici Cellule T2 (linea cellulare umana ibrida HLA-A0201 priva di TAP-2 (Hosken, Nancy A; Bevan, Michael J ?Defective Presentation of Endogenous Antigen by a Cell Line Expressing Class I Molecules?. Science; Apr 20, 1990; 248, 4953; Social Science Premium Collection pag. 367) sono state coltivate in terreno RPMI 1640 integrato con 10% siero bovino fetale (FBS-South American), 2 mM glutammina, penicillina (100 U/ml), streptomicina (100 mg/ml) e 50 mM ?mercaptoetanolo (RPMI completo). Le linee cellulari di melanoma umano 624-38 (HLA-A2-competente, (Sabatino et al., ?Conservation of Genetic Alterations in Recurrent Melanoma Supports the Melanoma Stem Cell Hypothesis?. (2008) Cancer Research (1). https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07-1939), 624-28 (HLA-A2-deficiente), SkMel24 e la linea cellulare di cancro del colon umano HT29 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 integrato con 10% FBS (North American), 2 mM glutammina, 100 U/ml penicillina, 100 mg/mL Streptomicinc, 1% amminoacidi non essenziali (NeAA), 1% Piruvato di Sodio (NaPy). Monociti di sangue periferico (PBMC) e linfociti T citotossici (CTL) sono stati coltivati in RPMI integrato con 5% siero umano, 2mM L-Glutammina, 100 U/ml penicillina, 100 mg/mL Streptomicina, 1% NeAA, 1% NaPy. Melanociti primari (mel23, mel41) sono stati coltivati in terreno 5A di McCoy integrato con 2mM glutammina, 2% FBS, 100 U/ml penicillina, 100 mg/mL Streptomicina, Tossina del Colera 20 pM, Insulina 5ug/ml (Roche), Idrocortisone 0,5 ug/ml (SIGMA), Transferrina 5ug/ml (Sigma), SCF 10ng/ml (PEPROTECH), bFGF 1ng/ml (PEPROTECH), Endotelina-1 10nM (SIGMA).

Al fine di delucidare il meccanismo d'azione di Salmonella, i presenti inventori hanno impiegato diversi inibitori nei loro esperimenti in vitro, tra cui: eptanolo (Sigma, 1mM), bloccante degli emicanali; inibitori del proteasoma: MG132 (Sigma, 20?M) ed Epoxomicina (Sigma, 500nM); l?inibitore di UPR 4?8c (10?M).

Vivofit? (vaccino vivo orale tifoide Ty21a) ? un vaccino contenente il ceppo attenuato di Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a e viene coltivato a 37?C nel brodo di Luria.

Esempio 1.2: Infezione in vitro con batteri.

Singole colonie batteriche sono state coltivate per una notte e sono state riavviate il giorno successivo per raggiungere un'assorbanza a 600 nm di 0,6 corrispondente a 0,6 ? 10<9 >unit? formanti colonie (CFU)/ml. Le cellule di melanoma murino e umano sono state incubate con batteri per 90 minuti, a un rapporto cellule-batteri di 1:50, nel terreno appropriato addizionato di L-glutammina senza antibiotici. Le cellule sono state lavate con terreno e incubate in terreno integrato con gentamicina (50 mg/ml) per 18 ore per uccidere i batteri extracellulari. Alla fine dell'incubazione, le cellule sono state raccolte e poi lisate per l'analisi delle proteine mentre il supernatante ? stato raccolto e filtrato attraverso un filtro da 0,22 ?m per eliminare i batteri potenzialmente ancora vivi.

Esempio 1.3: Saggio di legame HLA-A*02:01-peptide Per valutare l'arricchimento dei peptidi nel supernatante di colture di cellule tumorali dopo il trattamento con Salmonella, le cellule T2 sono state incubate per una notte a 37?C a 2x10<5 >cellule/pozzetto in terreno RPMI privo di siero, con 100 ?L di supernatante o con il peptide Mart-126-35 (1 ?M e 10 ?M) come controllo positivo. Dopo 2 o 18 ore, le cellule sono state saturate con ?FcR block? di topo (BD), colorate con BB7.2, un anticorpo di topo specifico per conformazione di HLA-A2 (BD). Esempio 1.4: Saggio di IFN-gamma per il riconoscimento dei peptidi da parte dei CTL

La linea cellulare Thp1 di leucemia monocitica acuta umana ? stata caricata con antigeni a diversa concentrazione (20uM-1,25uM) o con terreno condizionato e utilizzata per stimolare CTL-Vax (rapporto 1:1). Il supernatante cellulare ? stato raccolto dopo 72 ore e la produzione di IFN-gamma ? stata misurata mediante ELISA (R&D). L'IFN-gamma rilasciato dai CTL co-coltivati con Thp1 non caricate (rilascio di IFN-gamma spontaneo) ? stato sottratto dall'IFN misurato dopo la stimolazione con Ag. La specificit? dell'attivazione ? stata ulteriormente valutata utilizzando un pan-bloccante di HLA-I come controllo (10ug/ml, Clone W6/32).

Esempio 1.5: Espansione di cellule T CD8<+ >antigenespecifiche derivanti da PBMC di donatori sani PBMC totali isolate da donatore HLA-A2<+ >sano sono state caricate con supernatante derivato da 2x10<6 >cellule 624-38 trattate con Salmonella o con 20?M Mart-126-35 in provetta su un rotatore a 37?C per 90 minuti, poi piastrate in piastre da 24 pozzetti (2x10<6 >cellule per pozzetto) in un volume finale di 2 ml. A partire dal giorno 3 ? stata aggiunta IL-2 ricombinante (proleukin, Novartis) alla concentrazione finale di 20 U/mL. Le cellule sono state nutrite ogni 2-3 giorni con 20 U/mL di IL-2 e re-stimolate ogni 10 giorni. Ad ogni restimolazione, i linfociti espansi sono stati arricchiti di cellule T CD8<+ >mediante separazione magnetica su colonna (Miltenyi). Un totale di 4x10<5 >delle cellule T CD8<+ >isolate sono state piastrate con 2x10<6 >PBMC HLA-A2<+ >irradiate (10 Gy) che sono state pulsate con Mart-1 o con il supernatante di cellule 624-38 infettate con Salmonella. Per pulsare le PBMC, queste cellule sono state incubate per 90 minuti a 37?C in RPMI integrato con lo stimolo scelto (Mart-1/supernatante delle cellule). Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate due volte e irradiate (10 Gy) prima della miscelazione con le cellule T CD8<+>.

Esempio 1.6: Saggio di mobilizzazione con CD107a Le cellule effettrici incluse nel test erano cellule T CD8<+ >espanse ex vivo derivanti da PBMC di donatore umano sano. Le cellule bersaglio erano linee cellulari di melanoma umano (624-38, 624-28, SkMel24) e una linea cellulare di adenocarcinoma umano (HT-29)). Le cellule effettrici e le cellule bersaglio sono state incubate in una provetta in terreno completo a un rapporto di 1:1 e 2:1. Alle colture cellulari sono stati aggiunti un anticorpo monoclonale anti-CD107a coniugato con APC (BD), brefeldina A 10 ?g/ml (BD), GolgiStop contenente monensina (BD), il pan-bloccante di HLA-I come controllo (10ug/ml, Clone W6/32) in un volume finale di 200 ?l e il tutto ? stato incubato per 5 ore a 37?C. Le cellule sono state poi colorate con anti-CD3a, anti CD8 anti CD4 (BD) e poi fissate in 4% PFA. E? stata anche effettuata una colorazione intracellulare per la produzione di IFN-gamma (BD) al fine di valutare ulteriormente l?attivazione delle cellule T.

Esempio 1.7: Test di citotossicit? Delfia

Le cellule bersaglio (linee cellulari tumorali) sono state raccolte, lavate una volta e solvatate a concentrazione di 1x10<6 >cellule/ml. Un totale di 2 ml di cellule sono state caricate con 3 ?l di reagente Delfia-BATDA (DELFIA, Perkin Elmer), a 37?C per 30 min. Dopo 4 lavaggi con PBS e 1 lavaggio con terreno senza siero, 5x10<3 >cellule sono state seminate in una piastra con fondo a V e incubate con PBMC effettrici per 90 minuti in atmosfera di CO2 umidificata al 5% a 37?C. I controlli inclusi nell'esperimento erano: fondo (terreno senza cellule), rilascio spontaneo (cellule bersaglio senza cellule effettrici) e rilascio massimo (cellule bersaglio lisate). Dopo l'incubazione, le cellule sono state centrifugate per 5 minuti a 500 g e 20 ?l del supernatante sono stati trasferiti in una piastra a fondo piatto e sono stati aggiunti 180 ?l di soluzione di Europio. Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, la fluorescenza ? stata misurata nel fluorimetro a risoluzione temporale.

Esempio 1.8: Analisi di spettrometria di massa Preparazione dei campioni. I componenti dei supernatanti sono stati concentrati mediante l'uso di dispositivi chromabond SPE C18 (Macherey-Nagel). Una volta eluiti con 80% CH3CN in 0,1% soluzione di Acido Formico (FA), i campioni sono stati essiccati, sottoponendoli al vuoto in velocit?, e solvatati in acqua. Le proteine derivate da 4x10<6 >cellule sono state sonicate con Bioruptor 30?? ON 30?? OFF (2 cicli) e poi caricate su AMICON Ultra 0,5ml 10K (Millipore). I peptidi a basso peso molecolare sono stati analizzati attraverso n-LC-ESI-MS2 Q-Exactive HF.

Spettrometria di massa. Un totale di 4 ?l di ciascun campione ? stato caricato a una pressione massima di 900 bar su uno spettrometro di massa Orbitrap QExactive-HF a filtro quadrupolare LC?ESI? MS-MS (Thermo Fisher Scientific). La separazione dei peptidi ? stata ottenuta su un gradiente lineare dal 95% di solvente A (2% ACN, 0,1% acido formico) al 50% di solvente B (80% acetonitrile, 0,1% acido formico) per 33 minuti e dal 50 al 100% di solvente B in 2 min. a una portata costante di 0,25 ?l/min. su UHPLC Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific) in cui il sistema LC ? stato collegato a un emettitore di silice fusa da 23 cm e diametro interno di 75 ?m (New Objective, Inc. Woburn, MA, USA), impaccato in casa con microsfere da 1,9 ?m di ReproSil-Pur C18-AQ (Dr Maisch Gmbh, Ammerbuch, Germania) utilizzando un caricatore di bombe ad alta pressione (Proxeon, Odense, Danimarca).

I dati MS sono stati acquisiti utilizzando un metodo dei top 15 dipendente dai dati per la frammentazione HCD. Gli spettri MS a scansione completa dello studio (300?1650 Th) sono stati acquisiti nell'Orbitrap con una risoluzione di 60000, AGC target 3e6, IT20ms. Per gli spettri HCD, la risoluzione ? stata impostata a 15000 con m/z 200, AGC target 1e5, IT 80 ms; Energia di collisione normalizzata 28% e isolamento con 1,2 m/z. Sulla parte LC?MS-MS dell'analisi sono state condotte repliche tecniche.

Ricerca nel database. L'acquisizione dei dati ? stata controllata per mezzo di Xcalibur 3.1. Gli spettri di massa dei secretomi delle linee cellulari di melanoma umano e dei pazienti con melanoma umano sono stati analizzati utilizzando il motore di ricerca Mascot. La tolleranza del precursore ? stata impostata a 10 ppm e la tolleranza di MS/MS ? stata impostata a 20 ppm. Gli spettri sono stati esaminati senza specificit? enzimatica rispetto al database Uniprot del proteoma umano includente isoforme (versione 2016), e l?ossidazione della metionina, la deammidazione (NQ), l?acetilazione N-terminale e la fosforilazione (STY) sono stati impostati come modificazioni variabili. I risultati sono stati filtrati per l?FDR all?1% in base alle corrispondenze peptide-spettro (PSM) utilizzando un approccio di esca bersaglio con un database di esche randomizzate.

Predizione del legame ad HLA. E? stato utilizzato il Server NetMHCpan 4.0 per predire la capacit? di legame ad HLA dei peptidi identificati, espressa come IC50 di legame ad HLA.

2. RISULTATI

Esempio 2.1: Le linee cellulari di melanoma umano, dopo infezione con Salmonella, rilasciano peptidi immunogenici che sono in grado di innescare PBMC di donatori sani

Al fine di verificare se le proteine secrete (secretoma) da cellule infettate con Salmonella derivanti dalla linea cellulare di melanoma umano 624-38 siano immunogene, i presenti inventori simulano quello che si verifica in un protocollo generale di vaccinazione profilattica per le malattie infettive, dove il sistema immunitario di pazienti sani viene stimolato con specifici epitopi batterici. In breve, cellule T CD8<+ >sono state espanse da cellule mononucleate di sangue periferico di donatore sano, come illustrato nella Figura 1A. Queste cellule sono state arricchite per mezzo di un dispositivo di separazione magnetica e stimolate ogni due settimane con il secretoma per un totale di 4 cicli di stimolazione.

Al fine di determinare se le cellule T CD8<+ >espanse (denominate CTL Vax) siano in grado di riconoscere le cellule tumorali, queste cellule sono state co-coltivate con cellule di melanoma 624-38, cio? le cellule da cui ? derivato il secretoma. I presenti inventori hanno osservato che CTL-Vax produceva sia IFN-gamma che la molecola CD107a, indicando non solo che CTL-Vax era in grado di riconoscere cellule tumorali 634-38, ma anche che queste cellule si degranulavano in risposta alle cellule tumorali (Figura 1B). Inoltre, l'espressione dei suddetti marcatori di attivazione era correlata alla capacit? di uccisione di CTL-Vax (Figura 1C). ? importante sottolineare che CTL-Vax riconosceva non solo cellule 624-38, ma anche SkMel24, un'altra linea cellulare di melanoma (HLA-A2-competente). Al contrario, CTL-Vax non riconosceva le cellule di adenocarcinoma HT-29 (HLA-A2-competenti). Questi risultati mostrano chiaramente che CTL-Vax bersaglia antigeni tumorali che sono condivisi tra cellule dello stesso tipo di tumore, mentre allo stesso tempo CTL-Vax non riconosce cellule di melanoma 624-28 che sono HLA-deficienti, convalidando cos? che l'attivazione di CTL-Vax veniva specificamente indotta dal riconoscimento di un complesso HLA-peptide. Come ulteriore controllo della specificit? dell'attivazione di CTL-Vax, gli inventori hanno aggiunto un anticorpo bloccante HLA e hanno osservato costantemente che l'attivazione di CTL-Vax era totalmente compromessa.

Per convalidare ulteriormente la loro analisi, gli inventori hanno utilizzato Mart-125-36, un noto antigene di melanoma umano, per espandere i CTL Mart-1-specifici da PBMC di donatori sani. Sono stati condotti esperimenti di co-coltura come descritto sopra. Come mostrato in Figura 1C-D, CTL-Mart1 ? stato attivato e ha ucciso la linea cellulare 624-38 che esprime fortemente l'antigene Mart1. Da notare che CTL-Mart1 non ha ucciso le cellule SkMel24 che esprimono l'antigene a un livello inferiore.

Pertanto, i risultati illustrati sopra dimostrano che CTL-Vax garantisce il riconoscimento di diversi antigeni tumorali condivisi, dando un vantaggio in termini di risposta antitumorale e del fatto che i pazienti sani da cui sono state espanse le cellule T antitumorali avevano linfociti circolanti che li riconoscevano. Questo ? un aspetto importante che garantisce l'approccio fornito dalla presente invenzione e infine supporta la sua traduzione clinica.

Esempio 2.2: Cellule di melanoma umano rilasciano peptidi immunogenici dopo infezione con Salmonella Al fine di determinare la natura dei peptidi rilasciati dalle cellule tumorali a seguito dell'infezione con Salmonella, gli inventori hanno analizzato il secretoma della linea cellulare di melanoma 624-38 seguendo la pipeline illustrata nella Figura 2A. In breve, il supernatante derivato da cellule di melanoma 624-38 ? stato filtrato (cutoff 0,22um), i peptidi a basso peso molecolare (<10kDa) sono stati separati e analizzati tramite nLC-MS/MS. I criteri di selezione impostati per i segnali ms erano: tolleranza di MS/MS 20mmu, lunghezza del peptide>7aa, tolleranza del peptide 10ppm. Applicando una ricerca nel database prendendo in considerazione peptidi con modificazioni posttraduzionali (PTM), ? stato osservato che nella prima condizione erano sovra-rappresentati 135 peptidi. Per un'ulteriore selezione, i peptidi identificati sono stati confrontati con quelli rilasciati da tre diverse cellule di melanoma derivate da pazienti. Sono stati selezionati tredici peptidi, che sono condivisi da almeno una linea cellulare derivata dal paziente. ? importante sottolineare che la predizione del legame ad HLA (Server NetMHCpan 4.0) classificava tutti i peptidi selezionati come leganti HLA con una IC50 di legame ad HLA predetta inferiore a 1000, specificamente nell'intervallo di (150<IC50<840). Due peptidi aggiuntivi rilasciati in modo univoco da cellule 624-38 sono stati selezionati per la loro capacit? di legame ad HLA, per un totale di 13 candidati (Figura 2C).

I peptidi selezionati sono stati sintetizzati e caricati a diverse concentrazioni su cellule Thp1, una linea cellulare monocitica scelta come cellule presentanti l'antigene. Tutti e tredici i peptidi candidati erano in grado di indurre la produzione di IFN-gamma da parte di CTL-VAX, confermando la loro presenza all'interno del Vax (supernatante derivato da cellule tumorali 624-38 infettate con Salmonella utilizzate per espandere i CTL) nonch? il loro potenziale immunogenico (Figura 2B). ? importante sottolineare che nel secretoma delle cellule 624-38 ? stato anche identificato l'antigene Mart123-34 noto del melanoma. Come mostrato nella Figura 2B, questo antigene di melanoma induceva nel saggio una produzione di IFN-gamma inferiore da parte di CTL-VAX rispetto ai nuovi peptidi identificati.

Da un punto di vista traduzionale, l'identificazione da parte dei presenti inventori di una pluralit? di peptidi associati a tumore che sono in grado, da soli o in combinazione, di attivare CTL anti-tumore ha un grande impatto clinico, in particolare considerando che pu? essere presa di mira in modo efficiente l'eterogeneit? intratumorale. Inoltre, poich? i peptidi associati a tumore dell'invenzione sono stati selezionati in quanto condivisi tra cellule di melanoma differenti (Figura 2A), e CTL-VAX bersaglia cellule di melanoma differenti (Figura 1B), gli inventori hanno dimostrato che i peptidi associati a tumore dell'invenzione selezionati possono essere sfruttati in modo efficiente per bersagliare antigeni condivisi da tumori.

Esempio 2.3: Salmonella induce un rilascio guidato da UPR di peptidi scissi dal proteasoma da parte di cellule tumorali umane

I presenti inventori hanno studiato se l'infezione con Salmonella delle cellule tumorali potesse esacerbare la risposta UPR in queste cellule. Le cellule tumorali devono affrontare molti stimoli stressanti a livello del reticolo endoplasmatico (ER) a causa di una proliferazione prolungata, di una carenza di glucosio, ma anche di instabilit? genomica; per questi motivi le cellule tumorali sono caratterizzate da un alto livello basale di risposta alle proteine non ripiegate (UPR), che ora ? considerato una sorta di segno distintivo di tali tumori maligni (Cerezo M. et al; (2016). ?Compounds Triggering ER Stress Exert Anti-Melanoma Effects and Overcome BRAF Inhibitor Compounds Triggering ER Stress Exert BRAF Inhibitor Resistance?, Cancer Cell, 805?8192016; Corazzari M. et al., (2017) ?Endoplasmic Reticulum Stress, Unfolded Protein Response, and Cancer Cell Fate, 7(Aprile), 1?11). Con i loro studi, gli inventori hanno scoperto che l'infezione con Salmonella delle cellule tumorali esacerbava la risposta UPR nelle cellule di melanoma umano, rivelabile sia a livello genico che a livello proteico come aumento dell?espressione di XBP1, CHOP e ATF4 (dati non mostrati), senza portare a un aumento della morte cellulare. Inoltre, gli inventori hanno osservato che l'inibizione nelle cellule 624-38 dell?endoribonucleasi IRE1a e del successivo splicing di XBP1, ottenuta mediante l'uso del composto 4?8c, comprometteva significativamente il rilascio peptidico solitamente provocato dall'infezione con Salmonella (Figura 3A) e che CTL-Vax mostrava costantemente un'attivazione pi? bassa dopo stimolazione con il supernatante (Figura 3B).

Nello stesso ambito di esperimenti, i presenti inventori hanno inoltre osservato che l'inibizione delle subunit? proteasomiche 20S con due diversi composti, vale a dire MG132 (MG) ed Epoxomicina (Epo), influenzava sia il rilascio dei peptidi dell'invenzione (Figura 3A) che l'attivazione di CTL-Vax (Figura 3B). In sintesi, sebbene l'infezione con Salmonella non alteri la funzione del proteasoma, il rilascio dei peptidi dell'invenzione dipende in parte dall'attivit? del proteasoma.

Esempio 2.4: I CTL espansi con una pluralit? dei peptidi dell'invenzione vengono attivati solo dalle cellule tumorali e non dai melanociti primari

I presenti inventori hanno inoltre valutato se i peptidi associati a tumore dell'invenzione fossero specificamente presentati dalle cellule tumorali, poich? esse producono normalmente una risposta UPR, e non da controparti melanocitiche sane. Al fine di aumentare la frequenza delle cellule T CD8<+ >specifiche per i peptidi dell'invenzione, i CTL-VAX sono stati sottoposti a due cicli di stimolazione con PBMC HLA-A2 irradiate e pulsate con una composizione comprendente i tredici peptidi dell'invenzione e sono stati denominati CTL-Vax-MIX (Figura 4A). Successivamente, sia CTL-Vax che CTLVax-MIX sono stati co-coltivati con 624-38 (HLA-A2-competenti), 624-28 (HLA-deficienti), melanociti primari mel23 (HLA-A2-competenti) e melanociti primari mel41 (HLA-A2-deficienti). Gli inventori hanno osservato che i CTL-Vax esprimevano IFN-gamma in presenza di mel23 HLA-A2-competente mentre, cosa importante, i CTL-Vax-MIX non lo facevano (Figura 4B).

Questi risultati indicano chiaramente che i peptidi associati a tumore dell'invenzione che espandevano i CTL-Vax-MIX sono presentati efficacemente solo dalle cellule tumorali e non dai melanociti normali, garantendo cos? ulteriormente la sicurezza della loro applicazione clinica.

Claims (22)

RIVENDICAZIONI

1. Peptide isolato associato a tumore comprendente una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo consistente di SEQ ID NO. 1 ? 13 e di frammenti di dette sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1 ? 13 di lunghezza di almeno 3 amminoacidi.

2. Sequenza di acido nucleico isolata codificante un peptide associato a tumore secondo la rivendicazione 1.

3. Vettore di espressione comprendente una sequenza di acido nucleico secondo la rivendicazione 2.

4. Cellula ospite contenente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 3.

5. Cellula presentante l?antigene (APC) isolata, che porta sulla superficie cellulare almeno un peptide associato a tumore secondo la rivendicazione 1.

6. Cellula presentante l?antigene (APC) isolata secondo la rivendicazione 5, che porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

4.

7. Cellula presentante l?antigene (APC) isolata secondo la rivendicazione 5, che porta sulla superficie cellulare un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

8. Cellula presentante l?antigene (APC) isolata secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 7, che ? una cellula dendritica.

9. Composizione immunogenica comprendente almeno un peptide associato a tumore secondo la rivendicazione 1 e/o una cellula presentante l'antigene (APC) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 8, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

10. Composizione immunogenica secondo la rivendicazione 9, che comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

3 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4.

11. Composizione immunogenica secondo la rivendicazione 9, che comprende un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 1, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 2, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

3, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 4, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 5, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 6, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 7, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 8, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO.

9, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 10, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 11, un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 12 e un peptide associato a tumore comprendente SEQ ID NO. 13.

12. Composizione immunogenica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 11, contenente opzionalmente anche un adiuvante, per l?uso come vaccino.

13. Composizione immunogenica per l?uso come vaccino secondo la rivendicazione 12, in una terapia di combinazione con un inibitore dei checkpoint immunitari, un agente chemioterapico, un agente biologico, una terapia di targeting e/o un virus oncolitico.

14. Composizione immunogenica per l?uso come vaccino secondo la rivendicazione 12 o 13 nella prevenzione e/o nel trattamento terapeutico di un melanoma.

15. Composizione immunogenica per l?uso secondo la rivendicazione 14, in cui il melanoma ? una malattia residua del tumore.

16. Metodo per ottenere uno o pi? peptidi associati a tumore, in cui detto metodo comprende i passaggi di:

a) esporre una coltura cellulare di melanoma ad almeno un(a) agente infettivo e/o agonista dei Recettori di Riconoscimento di Pattern (PRR) e/o citochina infiammatoria;

b) raccogliere il supernatante della coltura cellulare; e

c) isolare da esso uno o pi? peptidi associati a tumore,

in cui detti uno o pi? peptidi associati a tumore comprendono una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo consistente di SEQ ID NO. 1 ? 13 e frammenti di dette sequenze amminoacidiche SEQ ID NO. 1 ? 13 di lunghezza di almeno 3 amminoacidi.

17. Metodo secondo la rivendicazione 16, in cui il passaggio c) prevede di sottoporre il supernatante di coltura cellulare raccolto a centrifugazione e filtrazione per separare la componente liquida di detto supernatante di coltura cellulare.

18. Metodo secondo la rivendicazione 17, in cui il passaggio c) prevede inoltre di sottoporre detta componente liquida ad analisi di spettrometria di massa per caratterizzare i peptidi contenuti in detta componente liquida.

19. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16 a 18, in cui i passaggi a), b) e c) vengono condotti su una pluralit? di colture cellulari di cellule di melanoma differenti.

20. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 17 a 20, in cui l?agente infettivo ? un batterio, preferibilmente un batterio del genere Salmonella.

21. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 17 a 21, in cui la cellula di melanoma ? una linea cellulare di melanoma stabilizzata, o una cellula di melanoma isolata da un soggetto affetto da melanoma.

22. Metodo per produrre un peptide secondo la rivendicazione 1, detto metodo comprendendo il passaggio di coltivazione di una cellula ospite secondo la rivendicazione 4 in condizioni adatte e per un tempo sufficiente per l'espressione del peptide ed, opzionalmente, il passaggio di recupero del peptide dalla coltura.