PT2102331E - Vacina antitumoral derivada de células cd4+ normais modificadas quimicamente - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "VACINA ANTITUMORAL DERIVADA DE CÉLULAS CD4+ NORMAIS MODIFICADAS QUIMICAMENTE"

Campo da invenção A invenção refere-se principalmente a composições adequadas para induzir respostas imunes contra tumores malignos; por isso, as composições podem ser utilizadas como vacina ou para criar células citotóxicas para uma imunoterapica adoptiva. Mais particularmente, a invenção refere-se à preparação de uma vacina antitumoral celular baseada na utilização apenas de células normais do sistema imune.

Antecedentes da invenção

Os cancros avançados representam uma das causas principais de morte nos seres humanos, mas não foram sugeridos até agora métodos de tratamento totalmente eficazes. As imunoterapicas baseadas em células representam o método não tóxico mais promissor de tratamento do cancro. A imunoterapica do cancro tem como objectivo destruir as células tumorais por mecanismos imunológicos. Pode utilizar-se como um único tratamento, ou como um adjuvante para outros tipos de terapêuticas como, por exemplo, cirurgia, irradiação e quimioterapia. A estratégia baseia-se na manipulação ex vivo e a reintrodução de produtos celulares para evitar imuno-competências com a finalidade de induzir respostas imunes especificas de tumores. Assim sendo, o objectivo final dessas imunoterapicas baseadas em células é a indução de células efectoras especificas de tumores e os avanços recentes centraram-se em linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTL) capazes de reconhecer e destruir células tumorais. É importante que estes CTL sejam capazes 2 de sobreviver durante um tempo prolongado no organismo em forma de células de memória que se possam reactivar e expandir rapidamente após o reaparecimento de células tumorais no organismo. A possibilidade de utilizar o sistema imune para atacar células cancerígenas vem do facto de que as células cancerígenas contêm novas proteínas ou sobre-expressam as proteínas existentes que se podem converter em alvos para o ataque imunológico. Identificou-se um número significativo de antigénios associados a tumores reconhecidos por esses CTL desde a descrição do primeiro antigénio tumoral humano MAGE-1 em 1991 pelo grupo de T. Boon (Novellino et al, 2005). Actualmente existem três grupos principais de antigénios tumorais sob investigação intensiva como possíveis alvos para uma imunoterapia activa: (i) antigénios de diferenciação como MART-1, gplOO e tirosinase para melanomas, e PSA e PSMA para o cancro de próstata; (ii) antigénios sobre-expressos como telomerase e survivina e (iii) antigénios de cancro/testículo (CTA) como MAGE, GAGE, NY-ESO-1 e BORIS. A partir do ponto do direccionamento específico de respostas imunes a células tumorais, os de maior perspectiva são os CTA, uma vez que não se expressam em células normais excepto em células germinativas do testículo que não são reconhecidas pelo sistema imune (as células germinativas carecem de expressão de moléculas de histocompatibilidade) (ver as revisões sobre CTA: (Kirkin et al., 2002; Zendman et al., 2003)). Demonstrou-se que a activação de CTA em células tumorais é devida à desmetilação do promotor em regiões de CpG e é uma consequência de um método de desmetilação de todo o genoma que se produz em muitos cancros, e se correlaciona com progressão tumoral (De Smet et al., 1996) . De facto, 3 demonstrou-se que a expressão de CTA estava associada com progressão tumoral (Brasseur et al., 1995; Eura et al., 1995; Katano et al., 1997; Patard et al ., 1995). Os potenciais terapêuticos deste grupo de antigénios tumorais confirmaram-se por vários estudos. Por exemplo, (a) um paciente com melanoma MZ-2 com metástase que se submeteu a múltiplas vacinações com células tumorais autólogas destruídas conduzindo ao desenvolvimento de respostas de CTL contra vários CTA (MAGE-1, MAGE-3, GAGE e BAGE, ver a revisão (van Pel et al., 1995)) experimentou um período sem doença de longa duração (P. Coulie, comunicação pessoal); (b) a vacinação de pacientes com melanoma com células dendríticas carregadas com péptido de MAGE-A3 induziu a regressão de metástase positiva a antigénio (Thurner et al., 1999a); e (c) a eficácia terapêutica de uma vacina polivalente estava correlacionada com a indução de uma resposta imune contra o antigénio MAGE-3 (Reynolds et al., 2003) . No entanto, devido à elevada heterogeneidade na expressão de elementos de CTA separados, este grupo de antigénios não é popular como alvo imunológico em comparação com antigénios de diferenciação ou sobre-expressos.

Para ultrapassar o problema com a expressão heterogénea de CTA, as vacinas que se dirigem para estes antigénios deveriam ser tão polivalentes como possível. 0 pedido de patente WO 03/045427 descreve uma vacina polivalente que se dirige a CTA deste tipo que está baseada numa linha celular de melanoma humano pré-seleccionada que expressa elevados níveis de CTA e que não expressa antigénios de diferenciação de melanócitos. Todas as outras vacinas baseadas em células tumorais utilizam tumores autólogos, ou linhas celulares convencionais seleccionadas com base no princípio de que "quantos mais antigénios 4 tumorais diferentes melhor". A utilização de células tumorais autólogas numa vacina como fonte de antigénios pode induzir nalguns casos a regressão do tumor, quando se aplica em forma de vacinação baseada em células dendriticas (0'Rourke et al., 2003; Marshall et al., 2006) . A limitação principal da estratégia de vacina polivalente é a dificuldade na produção e normalização da mistura antigénica. A utilização directa de material de biópsia original carece de normalização e além disso também com frequência esse material não está disponível. A utilização de linhas celulares convencionais não demonstrou uma elevada eficácia clinica até agora (Palucka et al., 2006; Salcedo et al., 2005).

Um dos motivos para a baixa eficácia de utilização de material de célula tumoral completa é a baixa eficácia de apresentação cruzada. Para estimular a geração das células T citotóxicas, os antigénios proteicos tumorais exógenos têm de ser captados por células apresentadoras de antigénio através do processo de endocitose e depois ser transferidos das vesículas endocíticas para o citosol (ver a revisão (Cresswell et al., 2005)). Isto é necessário para o processamento de antigénios protéicos e a formação de péptidos antigénicos. Mais adiante, os péptidos apresentam-se na superfície em associação com moléculas de MHC classe I. Só uma pequena porção dos antigénios adicionados exogenamente entra na célula e só uma pequena fracção da proteína captada depois disso é submetida a apresentação cruzada. Para ultrapassar a baixa eficácia de apresentação cruzada, vários autores sugeriram a utilização de ARN isolado de células tumorais para a transfecção de células apresentadoras de antigénios (Gilboa e Vieweg, 2004; Schaft et al., 2005; Kyte et al., 2006). O factor limitador principal da transfecção com ARN é a ausência de formação 5 de complexos de péptidos antigénicos e moléculas de MHC classe II que é necessária para a indução de uma resposta auxiliar T. Sem resposta auxiliar T não tem lugar nenhuma formação de memória imunológica CD8+ (Bevan, 2004; Castellino e Germain, 2006), e sem formação de memória, os CTL CD8+ morrem depois da expansão inicial. Além disso, em condições de crescimento tumoral, a formação de uma resposta de memória de CD8+ pode estar corrompida devido à presença de células reguladoras (Klebanoff et al., 2006) .

Conheceu-se que a 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) induz a expressão de antigénios de cancro/testículo principalmente em células tumorais (Weber et al., 1994). Além disso, demonstrou-se previamente por um grupo (De Smet et al. , 1996) mas não por outro (Weber et al. , 1994) que a 5-Aza-CdR também poderia induzir a expressão de pelo menos um de CTA, MAGE-A1, em linfócitos de sangue periférica activados com PHA.

Esta técnica é utilizada no pedido de patente WO 03/012086 como parte de um método de geração de células apresentadoras de antigénio que compreende recolher células de um sujeito, activar as células com agentes como mitogénicos de erva-dos-cancros (PWM) e fitoaglutinina (PHA), cultivar as células activadas ex vivo, e tratar as células cultivadas com agentes de hipometilação do ADN de modo que as células expressem múltiplos antigénios associados a tumores (CTA). Os CTA produzidos deste modo propõem-se para a sua utilização como vacinas contra o cancro. No entanto, uma questão principal neste método é a utilização de agentes estranhos como mitogénico de erva-dos-cancros (PWM) e fitoaglutinina (PHA) para a activação das células.

Ainda existe um requisito sem cumprir para o desenvolvimento de uma vacina baseada em células eficaz que 6 seja capaz de ultrapassar estes problemas e induzir uma resposta imune antitumoral mediada por CTL produtiva e douradora. 0 objectivo da presente invenção é proporcionar um método para preparar composições de apresentação de antigénios mediante um tratamento químico em que se utilizam só células normais e não se utilizam agentes estranhos para activar as células.

Sumário da invenção 0 âmbito da presente invenção define-se pelas reivindicações e qualquer informação que não estiver incluída nas reivindicações é proporcionada apenas como informação.

No seu aspecto mais amplo, a presente invenção proporciona uma composição para induzir uma resposta imune num mamífero, que compreende células linfóides em que a expressão de antigénios tumorais foi induzido quimicamente após a activação com células dendríticas maturas. A presente invenção utiliza apenas células normais, isto é, células linfóides e células dendríticas não adulteradas segundo se isolem de fluidos corporais, excluindo portanto as células que foram tratadas com qualquer agente estranho como activadores derivados de plantas, por exemplo, PWM e PHA. Além disso, a presente invenção não utiliza preparações de antigénios tumorais, quer sejam sintéticos ou isolados de células tumorais. Como resultado, a preparação e a aprovação regulamentar de uma vacina é muito mais fácil e segura. Preferentemente, utilizam-se as células do próprio paciente.

Os antigénios tumorais são induzidos em células linfóides (normais) em proliferação, especialmente durante a fase logarítmica de proliferação. A proliferação das 7 células linfóides normais é estimulada por células dendríticas maturas (normais).

Mais convenientemente, as células linfóides são linfócitos, especialmente linfócitos de sangue periférico.

Preferentemente, os antigénios tumorais são antigénios de cancro/testiculo (CTA), que se podem induzir quimicamente por desmetilação do ADN, por exemplo, por tratamento com 5-aza-2'-desoxicitidina. Um método alternativo é que os antigénios tumorais são induzidos quimicamente por acetilação de histonas, por exemplo, por tratamento com inibidores da histona desacetilase como tricostatina (TSA).

Os antigénios de cancro/testiculo expressam-se numa ampla variedade de tumores, de modo que a composição da invenção é capaz de gerar uma resposta imune que é eficaz contra uma ampla variedade de tumores, apesar do facto de que se obtém de células normais.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização da composição para estimular uma resposta imune contra os antigénios tumorais, isto é, para a preparação de uma vacina antitumoral. A vacina pode ser utilizada profilacticamente ou para o tratamento directo de tumores existentes. A invenção proporciona a utilização da composição como células apresentadoras de antigénio para a activação in vitro de linfócitos T citotóxicos, por exemplo, em imuno-terapêutica adoptiva de células T.

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de preparação de linfócitos T citotóxicos CD8+ especificos de tumor que compreende a activação de linfócitos T utilizando a composição como células apresentadoras de antigénio. A expansão das células citotóxicas é induzida preferentemente por células dendríticas activas (normais). 0 método pode realizar-se in vivo como método terapêutico ou in vítro, seguido da utilização das células T em imunoterapia adoptiva de células T.

Breve descrição das figuras A Figura 1 representa o fenótipo de células dendriticas maturas. A Figura 2 representa o fenótipo de uma cultura em proliferação de linfócitos obtido após a cultura com células dendriticas maturas autólogas. A Figura 3 representa a expressão de antigénios do grupo de MAGE-A em linfócitos intactos e tratados com 5-Aza-CdR, bem como em células tumorais segundo foi detectado por análise de RT-PCR. A Figura 4 representa a expressão de antigénios NY-ESO-1, GAGE-3-7 e BORIS em linfócitos intactos e tratados com 5-Aza-CdR, bem como em células tumorais segundo foi detectado por análise de RT-PCR. A Figura 5 representa a expressão de proteína do grupo de MAGE em linfócitos intactos e tratados com 5-Aza-CdR, bem como em células tumorais segundo foi detectado por análise de ELISA baseado em células. A Figura 6 representa o fenótipo de linfócitos após a estimulação primária com linfócitos autólogos tratados com 5-Aza-CdR. A Figura 7 representa o fenótipo de células CD8+ isoladas. A Figura 8 representa a produção de IFN-gamma após a incubação de linfócitos CD8+ isolados de culturas primárias com diferentes células alvo tumorais. A Figura 9 representa microscopicamente a destruição detectada de diferentes células alvo por linfócitos CD8+ isolados de cultura primária. 9 A Figura 10 representa a produção de IFN-gamma após a incubação de linfócitos imunes cultivados a longo prazo com diferentes células alvo.

Descrição detalhada da invenção 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não seja incluída dentro das reivindicações será proporcionada apenas como informação. A presente invenção tem como objectivo proporcionar uma resposta imune eficaz por métodos em que as células apresentadoras de antigénio são células normais em que a expressão de antigénios associados a tumores foi induzida quimicamente, e também que estão enriquecidas em células CD4+, e portanto, são capazes de estimular directamente linfócitos T citotóxicos e proporcionar uma ajuda mediada por CD4+ que é vital para a formação da memória imunológica. Estas células apresentadoras de antigénio podem ser utilizadas como vacina baseada em células para a estimulação in vivo de uma resposta imune ou na terapêutica adoptiva de células T, em que se estimulam linfócitos T citotóxicos in vitro. A invenção baseia-se na descoberta de que as células linfóides normais podem induzir-se para que se propaguem por células dendríticas maturas, e que durante a proliferação se podem induzir por tratamento químico para que expressem antigénios tumorais, como antigénios de cancro/testículo, dando como resultado uma composição que contém células CD4+, e portanto, que é capaz de apresentar antigénios tumorais a células T para gerar células CD8+ citotóxicas, algumas das quais incluem marcadores de células de memória CD62L.

As células linfóides normais são mais convenientemente linfócitos, especialmente linfócitos de sangue periférico, que se podem induzir por tratamento com agentes de 10 desmetilação do ADN para que expressem antigénios de cancro/testículo.

Assim, mediante a utilização de aspectos preferidos da invenção é possível propor diferentes rotas de tratamento do cancro, como:

Um método de tratamento de cancro por estimulação de uma resposta imune contra tumores, que compreende: estimular a proliferação de células linfóides por células dendríticas maturas, tratar as células linfóides em proliferação para induzir a expressão de antigénios de cancro/testículo, obtendo desta forma uma composição de apresentação de antigénios que inclui linfócitos enriquecidos em células CD4+, e administrar a composição de apresentação de antigénio a um paciente com cancro para estimular uma resposta imune contra os antigénios de cancro/testículo; ou como alternativa um método de tratamento do cancro por terapêutica adoptiva de células T, que compreende: estimular a proliferação de células linfóides por células dendríticas maturas, tratar as células linfóides em proliferação para induzir a expressão de antigénios de cancro/testículo, obtendo desta forma uma composição de apresentação de antigénio que contém linfócitos normais enriquecidos em células CD4+, utilizar a composição de apresentação de antigénio para activar linfócitos de células T ex vivo que se podem expandir para obter uma composição citotóxica que contém linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumor com marcadores de células de memória CD62L, e administrar a composição citotóxica a um paciente com cancro. 11 A expansão da composição citotóxica também é conseguida convenientemente utilizando células dendriticas maturas normais para estimular a proliferação.

Mais convenientemente, as células linfóides são linfócitos de sangue periférica extraídos de sangue autóloga ou heteróloga.

Na sua aplicação prática preferida, a presente invenção compreende os métodos seguintes:

Quando isolamento de linfócitos de sangue periférico; geração de células dendriticas maturas a partir de monócitos; B estimulação dos linfócitos pelas células dendriticas maturas conduzindo à proliferação preferente de células CD4 +; tratamento dos linfócitos activados com agentes químicos conduzindo à indução da expressão de antigénios de cancro/testículo; e C preparação de uma vacina a partir de linfócitos activados e tratados; utilização de vacinas como tratamento profiláctico ou tratamento directo de tumores; ou D geração de linfócitos citotóxicos por co-cultura de linfócitos com linfócitos activados e tratados; expansão de linfócitos citotóxicos em presença de células dendriticas como células alimentadoras; utilização de linfócitos citotóxicos para o tratamento de tumores por imuno-terapêutica adoptiva.

Embora a invenção se tenha descrito relativamente ao tratamento do cancro em seres humanos, os métodos da invenção também são aplicáveis à medicina veterinária para 12 gerar materiais para o tratamento de tumores em mamíferos não humanos. A invenção entender-se-á mais completamente considerando a metodologia adoptada pelos presentes inventores no desenvolvimento das descobertas anteriores, como de seguida. A diferença principal entre a vacina baseada em células descrita na presente invenção e outras vacinas existentes concebidas para induzir uma imunidade antitumoral é que os métodos da presente invenção não utilizam nenhuma preparação de antigénios tumorais, quer sejam sintéticos ou isolados de células tumorais. Nesta nova vacina, os antigénios tumorais são induzidos endogenamente em células apresentadoras de antigénio em proliferação do sistema imune por tratamento químico. Desta forma, a resposta imune com formação de CTL específicos de antigénio tumoral inicia-se sem a necessidade de captação de antigénio e apresentação cruzada. 0 problema com a indução da resposta auxiliar T resolve-se mediante a utilização de células auxiliares T activadas (linfócitos CD4+) que funcionam tanto como células apresentadoras de antigénio como para proporcionar ajuda às células CD8+ específicas de antigénio. Utilizando esta estratégia é possível induzir a expressão de um amplo espectro de antigénios de cancro/testiculo associados a tumores em células CD4+ em proliferação, e estas células são capazes de estimular a formação de linfócitos T citotóxicos que reconheçam um amplo espectro de células tumorais. As células CTL imunes induzidas deste modo têm algumas características de células de memória. A primeira tarefa abordada pelos presentes inventores era como gerar uma cultura de linfócitos em proliferação enriquecidos em células T CD4+. É bem conhecido que o 13 melhor modo de gerar células auxiliares T especificas de antigénio é utilizar células dendriticas maturas carregadas com o antigénio (Jonuleit et al. , 2001; De Vries et al. , 2003). No entanto, os presentes inventores misturaram células dendriticas maturas não carregadas com antigénio com uma fracção não aderente de linfócitos e descobriram que, após 7-8 dias de incubação, havia uma proliferação intensiva de linfócitos. As culturas em proliferação eram principalmente linfócitos T enriquecidos em linfócitos CD4+.

Tendo desenvolvido um método de geração de culturas de linfócitos em proliferação, os presentes inventores tentaram induzir a expressão de antigénios de cancro/testículo nestas culturas. Conheceu-se que a 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) induz a expressão de antigénios de cancro/testículo principalmente em células tumorais (Weber et al., 1994) . Além disso, demonstrou-se previamente por um grupo (De Smet et al., 1996) mas não por outro (Weber et al., 1994) que a 5-Aza-CdR também poderia induzir a expressão de pelo menos um de CTA, MAGE-A1, em linfócitos de sangue periférico activados com PHA. É aceite em geral que é muito mais difícil induzir a expressão de CTA em células normais em comparação com células cancerosas (De Smet et al. , 1996; Weber et al., 1994), ou que estes antigénios não são induziveis por 5-Aza-CdR em células normais (Karpf et al., 2004). No entanto, depois de optimizar as condições para a cultura de linfócitos e o seu tratamento, os presentes inventores eram capazes de induzir todos os antigénios de cancro/testículo que tinham seleccionado como os expressados mais comummente em tumores, em concreto os CTA: MAGE- Al, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, GAGE-3-7, NY-ESO-1 e BORIS. 14

Tendo obtido a expressão de um amplo espectro de CTA, que se parecia a sua expressão em células de cancro em progressão, foram realizadas experiências sobre a indução de uma resposta de CTL. Todas as experiências foram realizadas utilizando linfócitos de dadores saudáveis HLA-A2+, já que neste caso é possível utilizar células tumorais positivas para HLA-A2 para a detecção de uma resposta antitumoral de CTL. Foram utilizados linfócitos tratados com 5-Aza-CdR como estimuladores sem tratamento com irradiação ou mitomicina C, já que a sua própria capacidade proliferativa estava praticamente ausente no fim do período de tratamento com 5-Aza-CdR. A fracção de linfócitos não aderentes, que se manteve congelada após o isolamento de monócitos, foi misturada com linfócitos tratados com 5-Aza-CdR e foi incubada durante 9 dias. Foi adicionado IL-2 no dia 2. No fim deste período de cultura existia uma proliferação intensiva de linfócitos. A análise de FACS de culturas em proliferação indicou que a proporção de linfócitos CD8+ ultrapassava a proporção de células CD4+ de 2 a 5 vezes, e que a metade das células CD8+ estavam a expressar o marcador CD62L de células de memória centrais.

Também existia um número significativo de células exterminadoras naturais (NK) que não são pouco comuns para culturas celulares após a estimulação primária. Por isso, para detectar a actividade litica apenas dos CTL CD8+ gerados, foram isoladas as células CD8+. Realizaram-se medições da actividade citotóxica utilizando um painel de linhas celulares tumorais tanto positivas como negativas para antigénios HLA-A2. A actividade citotóxica de células no fim do ciclo de estimulação era reduzida, mas aumentava significativamente após a incubação das células em presença de IL-2 durante 24 horas. A lise apresentava restrição a 15 HLA-A2, indicando uma lise mediada por CTL, e não lise mediada por NK.

Por isso, pode concluir-se que os presentes inventores desenvolveram uma nova composição de células apresentadoras de antigénio para a indução de uma resposta de linfócitos T citotóxicos com uma ampla especificidade antitumoral e características de resposta de memória. Esta composição pode utilizar-se para a vacinação directa de pacientes com cancro, ou para a geração e expansão in vitro de linfócitos T citotóxicos para imunoterapia adoptiva.

Para o tratamento químico das células linfóides normais, é preferida a desmetilação do ADN com 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR). Outros reactivos que se podem utilizar para a desmetilação do ADN são 5-azacitidina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina e zebularina, que também é um análogo de citidina. A zebularina pode produzir um efeito semelhante à 5-Aza-CdR (Chong et ai., 2003). Também existem alguns agentes de desmetilação não nucleosídicos mas o seu efeito é mais fraco que o da 5-Aza-CdR para desencadear, por exemplo, a expressão de MAGE-1 em células tumorais (Chong et ai., 2005).

Um tratamento químico alternativo para induzir antigénios é a acetilação de histonas, que se pode conseguir utilizando inibidores da histona desacetilase. A utilizada mais comummente e melhor estudada é a Tricostatina A (TSA). Pode induzir uma fraca expressão de algumas proteínas, incluindo antigénios de cancro/testiculo, mas o espectro destes antigénios pode não coincidir completamente com os expressados mediante 5-Aza-CdR). Se forem utilizados juntos, estes reactivos podem induzir uma forte expressão de genes "silenciados" que podem ultrapassar um efeito aditivo (Wlachnewski et ai., 2006). Outros grupos de inibidores da histona desacetilase 16 são alguns depsipéptidos que se podem utilizar também em combinação com 5-Aza-CdR (Weiser et al., 2001) . O trabalho experimental dos inventores utilizou necessariamente nesta fase sangue de dadores normais. Quando sejam autorizadas para o seu uso com pacientes, as terapêuticas oferecidas por esta invenção utilizarão normalmente sangue de pacientes com cancro. No entanto, o facto de que a invenção implique induzir antigénios em células normais assinala a possibilidade de gerar vacinas a partir de dadores normais para o tratamento de pacientes com cancro. Neste caso será necessária uma selecção muito cuidada de pares de dador-receptor para diminuir a reacção específica de aloantigénio contra linfócitos de dador.

Além disso, o trabalho experimental utilizou células dendríticas obtidas das mesmas amostras de sangue do que os linfócitos. A utilização de células dendríticas que não sejam da mesma pessoa seria muito mais conveniente, mas cria um problema de ensaio de segurança das células dendríticas de dador. Além disso, é possível que resíduos de aloantigénios derivados de células dendríticas possam adquirir-se por linfócitos que, por sua vez, possam estimular uma alo-resposta além da resposta contra antigénios tumorais, conduzindo possivelmente a uma diminuição na resposta específica de tumor.

Na utilização clínica da invenção, as composições podem incluir adjuvantes convencionais segundo pretendido ou necessário. Por exemplo, às vezes são utilizadas composições de apresentação de antigénios juntamente com a injecção separada de IL-2, mas mais frequentemente como uma composição celular sozinha. As composições de linfócitos citotóxicos utilizam-se habitualmente juntamente com a injecção de adjuvantes como IL-2. Além disso, a injecção de uma composição de linfócitos citotóxicos está às vezes 17 precedida por quimioterapia (como uma combinação de ciclofosfamida e fludarabina) conduzindo a uma redução linfocitária. Para a injecção, as células são suspensas habitualmente em solução salina tamponada com fosfato complementada com albumina de soro humano ou plasma autólogo. Pode observar-se informação adicional sobre uma formulação de administração em revisões sobre a terapêutica adoptiva de células T, por exemplo, (Gattinoni et al. , 20 06 ; Yee, 2 0 05) .

Também se podem utilizar interleucinas como IL-2 para aumentar a proliferação de linfócitos. Existem interleucinas opcionais e diferentes que se poderiam utilizar. Por exemplo, poderia utilizar-se IL-7 e IL-15 em lugar de IL-2. A geração de células dendriticas a partir de monócitos requer habitualmente a presença de citocinas, sendo GM-CSF a mais preferida, embora outras possam ser substituídas. A prática da invenção é representada adicionalmente nos exemplos experimentais seguintes.

Exemplo 1

Geração de culturas em proliferação de linfócitos enriquecidos em células CD4+

Para induzir a expressão de CTA em células apresentadoras de antigénios mediante tratamento químico (por exemplo, com Aza-5-CdR), esta cultura deveria estar em proliferação. As células apresentadoras de antigénios profissionais, células dendriticas, não proliferam em condições normais e, portanto, os inventores estavam a pesquisar outro tipo de células apresentadoras de antigénios. Existem vários tipos de células apresentadoras de antigénios que podem estimular a activação especifica de antigénio de linfócitos T CD8+. Em particular, foi demonstrado que as células T auxiliares CD4+ activadas 18 podem utilizar-se como células apresentadoras de antigénios (Naota et al., 2006 ; Kennedy et al. , 2005) . A vantagem adicional de células CD4+, como células apresentadoras de antigénios, é que são capazes de estimular a formação de células CD8+ de memória (Kennedy et al., 2005). Por isso, os presentes inventores decidiram primeiro optimizar a preparação de culturas em proliferação de linfócitos enriquecidos em CD4+. No exemplo descrito de seguida foi utilizada com sucesso a adição de células dendríticas maturas a culturas de linfócitos isolados de sangue periférico. A preparação de células dendríticas maturas foi realizada de acordo com os métodos originais (Romani et al., 1994; Thurner et al., 1999b) em modificações. As componentes da camada leucoplaquetária retiradas de sangue dada obtiveram-se do Banco de Sangue local. Após a sua chegada, as camadas leucoplaquetárias foram transferidas para o balão com 60 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem Ca e sem Mg (DPBS, N° Produto BE17-512F, Cambrex, Bélgica), e depositaram-se em camadas aproximadamente 30 ml sobre 15 ml de Lymphoprep (N° Produto 1053980, AXIS—SHIELD PoC AS, Noruega) em tubos de 50 ml. Após a centrifugação a 460 g, 30 min, 20°C, recolheu-se a camada superior que continha plasma diluído (aproximadamente a 40%) para a sua utilização posterior como aditivo ao meio de cultura e para o congelamento de células. Após a adição de heparina (25 Ul/ml final), o plasma foi centrifugado a 1500 g durante 15 min e manteve-se congelado a -80°C até a sua utilização. Recolheram-se células mononucleares da superfície de contacto do gradiente de Lymphoprep em 25 ml de DPBS-EDTA previamente arrefecido (Cambrex) e foram lavados quatro-cinco vezes com DPBS-EDTA previamente arrefecido por centrifugação primeiro 19 a 250 g, depois a 200 g, e depois a 150 g, cada vez durante 12 min a 4°C. Após a última lavagem, as células foram re-suspensas em meio RPMI 1640 (Cambrex) e foram contadas usando o Coulter Counter, modelo Z2. A concentração de linfócitos e monócitos foi determinada por selecção dos picos de células correspondentes. A suspensão celular foi congelada em alíquotas, cada uma das quais continha aproximadamente 10 7 monócitos e um número variável de linfócitos no meio de congelação, que consistia em 9 0% do plasma diluído e 10% de DMSO. As suspensões celulares colocaram-se em caixas de congelamento (Nalgen) a -80°C e armazenaram-se a esta temperatura durante até 6-9 meses. Todas as culturas estabeleceram-se a partir das células mononucleares congeladas. A geração de células dendríticas foi realizada em balões de cultura de tecido T25 pré-tratados com 5 ml de soro humano a 5% em meio RPMI 1640 durante pelo menos 30 min antes da experiência. Foi descongelada 1 ampola das células mononucleares congeladas num banho de água (37°C), diluiu-se imediatamente 1 ml de suspensão celular em 13 ml de meio AIM-V previamente aquecido (Gibco, Invitrogen). O meio de pré-tratamento foi retirado dos balões e foi substituído imediatamente por 7 ml de suspensão celular. Após 45 min de incubação a 37°C, recolheram-se os linfócitos não aderentes, e os monócitos aderentes foram lavados duas vezes com meio RPMI 1640 previamente aquecido. Após a adição de 5 ml de meio AIM-V que continha plasma a 0,5% os balões colocaram-se numa incubadora de C02 a 37°C. Os linfócitos recolhidos foram centrifugados e foram re-suspensos no meio de congelamento que consistia em AIM-V (70%), soro humano (20%) e DMSO (10%) e foram congelados. Após uma incubação durante uma noite (dia 1), foi adicionado GM-CSF e IL-4 (ambos de Gentaur, Bélgica) às células a concentrações finais de 100 20 ng/ml e 25 ng/ml. No dia 3, adicionou-se 1 ml de AIM-V com 0,5% de plasma juntamente com GM-CSF e IL-4 a concentrações finais de 100 ng/ml e 25 ng/ml. No dia 4, adicionou-se um cóctel de maturação que consistia em IL-lbeta (10 ng/ml), IL-6 (1000 Ul/ml), TNF-alfa (10 ng/ml) (todos de Gentaur) e PGE2 (Sigma) (1 ng/ml) . No dia 5 ou 6, recolheram-se as células não aderentes, contaram-se e utilizaram-se para a experiência, ou foram congeladas em alíquotas de 106 células no meio de congelamento que consistia em AIM-V (70%), soro humano (20%) e DMSO (10%). A pureza das células dendriticas geradas ultrapassava 95%. O fenotipado de células dendriticas realizou-se por tinção com os anticorpos conjugados directos, HLA-DR,DP,DQ-FITC e CD86-PE (BD Biosciences, Dinamarca, N° cat. 555516 e 555558) e CD3-FITC (Beckman Coulter, Suécia, pn. IM1281). Os controlos isotipicos recomendados utilizaram-se para o fenotipado das células. As amostras de células analisaram-se utilizando um Citómetro de Fluxo FC500 MPL (Beckman Coulter) e o software analítico CXP (Beckman Coulter). O grau de maturação, definido pela proporção de células com elevados níveis de expressão da molécula co-estimuladora CD86 e MHC classe II, ultrapassava 95%, como é apresentado na Figura 1.

Para a preparação de uma cultura de linfócitos em proliferação, utilizou-se a propriedade conhecida das células dendriticas maturas de induzir a proliferação de linfócitos autólogos. O meio de linfócitos consistia em meio AIM-V (Gibco, Invitrogen) e 5% de soro humano AB parcialmente deslipidado. A deslipidação realizou-se de acordo com o método seguinte. Descongelou-se soro humano, armazenado a -80°C, durante uma noite no frigorifico e sem misturar foi centrifugado a 3000 x g durante lha 4°C. 0 sobrenadante fraccionou-se a partir da parte inferior em 21 três porções e foi centrifugado novamente, como anteriormente. As fracções, começando pela parte inferior, foram distribuídas em novos tubos, e a camada lipídica flutuante restante foi eliminado. As fracções foram centrifugadas a 29500 x g durante lha 4°C. O líquido foi recolhidos mediante uma seringa, de modo que o sedimento de proteína inactivada e a camada lipídica na parte superior deixaram-se no tubo. As fracções combinadas foram esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 μιη e armazenaram-se congeladas a -80°C em alíquotas. As células dendríticas e os linfócitos não aderentes descongelaram-se, lavaram-se e re-suspenderam-se em meio de linfócitos e dispensou-se 0,1 ml de suspensão celular que continha 104 células dendríticas e 4-8 x 104 linfócitos em poços de uma placa de 96 poços de cultura de tecido de fundo em U. Nos dias 2 e 5, adicionaram-se 0,05 ml de meio de linfócitos que continha interleucina 2 (adicionou-se uma concentração final de IL-2 de 15 Ul/ml a cada um dos poços. No dia 7 ou 8, quando os linfócitos atingiram uma concentração de aproximadamente 106/ml, as células foram recolhidas e usadas nas experiências sobre a indução da expressão de antigénio de cancro/testículo (Exemplo 2). O fenotipado de amostras de células realizou-se por tinção com os anticorpos conjugados directos, CD4-isotiocianato de fluoresceina (FITC), CD8-ficoeritrina (PE), CD56-PE, CD3-FITC (BD Biosciences, Dinamarca, 555346, 555635, 555516 e

Beckman Coulter, Suécia, IM1281). A caracterização fenotipica das células realizada por análise citométrico de fluxo indicou um aumento na proporção de células CD4+ em comparação com a cultura original, como é apresentado na Figura 2.

Exemplo 2 22

Indução da expressão de antigénios de cancro/testículo em linfócitos em proliferação

Em experiências preliminares sobre a cinética e a dependência da concentração de Aza-5-CdR, observou-se uma indução variável da expressão de CTA em culturas de linfócitos. Eram mais facilmente induziveis MAGE-A1, MAGE-A4 e MAGE-A12 (não é apresentado) . Para normalizar as condições de indução, comparou-se a indução de CTA em linfócitos tomados da fase logarítmica de crescimento celular (habitualmente no dia 7 ou 8, quando a concentração celular era de aproximadamente 106/ml) com linfócitos tomados do "plateau" (dia 9 ou 10, quando a concentração de linfócitos ultrapassa 2 x 106/ml). A população de linfócitos expandida a partir de sangue periférica em presença de células dendríticas maturas autólogas recolheu-se, lavou-se, re-suspendeu-se a 0,5 x 106/ml em meio de cultura de linfócitos que continha 10 μΜ de 5-aza-2'-desoxicitidina (Sigma) e 150 Ul/ml de IL-2 e colocou-se nos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços em 2 ml por poço. As células incubaram-se durante 3 dias, após o qual se recolheram e se contaram. Algumas células utilizaram-se em cultura com linfócitos autólogos (Exemplo 3), embora outras foram congeladas em alíquotas como se descreve no Exemplo 1 para linfócitos não aderentes. Aproximadamente 2 x 106 células lavaram-se em DPBS e congelaram-se como sedimento para a análise de RT-PCR. A expressão de antigénios individuais detectou-se utilizando uma análise de RT-PCR que identificava a expressão de ARN que codifica estas proteínas. Centrifugaram-se 2 x 106 células, eliminou-se o sobrenadante e o sedimento solubilizou-se em 0,3 ml de Solução de Lise Celular (kit de isolamento de ARN PurescriptR, Gentra Systems, Minneapolis, MN). O ARN total 23 isolou-se de acordo com as instruções do fabricante, precipitou-se por adição de dois volumes de isopropanol a 100% sobre a solução de lise, lavou-se com etanol a 70% e reidratou-se em 10 μΐ de água destilada sem ARNasa. 0 ARN isolado tratou-se mediante ADNasa usando os reactivos do kit sem ADN™ (Ambion, Austin, TX) . Adicionou-se Ιμΐ de tampão de ADNasa lOx e Ιμΐ de ADNasa (2 unidades) à amostra, a mistura incubou-se durante 30 min a 37°C, e a reacção acabou-se por adição de 2 μΐ de reactivo de inactivação de ADNasa. O ADNc sintetizou-se utilizando hexámeros aleatórios, iniciadores oligo(dT), kit de transcriptase inversa de ARNasa H SuperScript 111 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e 10 μΐ de ARN num volume total de 20 μΐ de acordo com o protocolo do fabricante. A transcrição inversa (RT) realizou-se a 50°C durante 6 0 min, seguida de 70 °C durante 15 min. O ADNc sintetizado dilui-se 2 vezes por adição de um volume igual de DMSO a 10% em água destilada sem ARNasa. O perfil de expressão de MAGE-A1, -A3, -A4, -A6,-A10 e -AI2, bem como a expressão de gliceraldehido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controlo positivo para determinar o rendimento da reacção e para determinar a integridade do ARN, detectou-se por PCR utilizando os iniciadores directo (com sentido) e inverso (anti-sentido) descritos antigamente (De Plaen et al., 1994; thor Straten et al., 1997). Utilizou-se 1/20 de ADNc na amplificação por PCR no meio que continha KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM, cresol 0,2 mM, sacarose a 12%, DMSO a 0,5%, BSA a 0,05%, pH 8,6/25°C, 10 pmol de cada iniciador, e durante o primeiro ciclo no "inicio a quente" adicionou-se 1,25 U de ADN polimerase AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA) e 50 μΜ de concentração final de cada dNTP, volume total de 30 μΐ. Os parâmetros utilizados para a amplificação de MAGE e GAPDH eram: desnaturalização inicial de 95°C durante 2 min, primeiro ciclo de 95°C 30 s, 80°C 1-3 min para "início a quente", 60°C 30 s e 72°C 40 s, seguido de 27-36 ciclos (94°C 30 s, 60°C 30 s e 72°C 1 min) e 10 min a 72°C de extensão final. Para a detecção de NY-ESO-1, amplificou-se um fragmento específico de 272 pb entre BLE73 e BLE71 na estrutura do gen (Lethe et al., 1998), e detectou-se GAGE3^7 por amplificação do fragmento específico VV1-VDE24, 244 pb (De Backer et al., 1999) . Os parâmetros da reacção para NY-ESO-1 e GAGE3_7 após o "inicio a quente" eram: 32-36 ciclos de 95°C 30 s, 60°C 1 min, 72°C 2 min no mesmo meio que para os antigénios MAGE. Para a amplificação do fragmento especifico de 1074 pb em BORIS humano, utilizaram-se os iniciadores seleccionados por (Vatolin et al., 2005). O meio e o primeiro ciclo eram os mesmos que anteriormente excepto por 2 U de Taq polimerase e dNTP 150 μΜ na reacção, e o "início a quente" seguido de 40-45 ciclos (94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 2 min) e a extensão final a 72°C durante 15 min. Todas as reacções realizaram-se no termociclador GeneAmpR PCR System 9700 (Applied Biosystems). Os controlos negativos continham alíquotas de água em lugar de ADNc e, além disso, nalgumas experiências sobre a detecção de NY-ESO-1 também realizou-se uma reacção (sem RT) , em que se utilizou uma amostra de ARN após o tratamento com ADNasa mas antes da etapa de transcrição inversa em lugar de ADNc para excluir as bandas não originadas a partir de ADNc. Os produtos de PCR separaram-se juntamente com o marcador de pesos moleculares de 100 pb, apresentando 100 pb e 800 pb como bandas mais intensas (Amersham Pharmacia Biotech) por electroforese através de um gel de agarose a 2% a 100 V, tingiram-se com brometo de etidio, visualizaram-se sob iluminação com UV e registaram-se mediante um sistema de registo de imagens. 25

As Figuras 3 e 4 apresentam dados sobre a indução da expressão de CTA em linfócitos tratados com 5-Aza-CdR. Por comparação, também se demonstra a expressão de antigénios de cancro em linhas celulares tumorais utilizadas de seguida no Exemplo 3. Nesta experiência comparou-se o tratamento com 5-Aza-CdR de duas culturas de linfócitos em proliferação: uma tomada da fase logarítmica de crescimento (dia 8), e a outro tomada do "plateau" (dia 10), em que a proliferação deteve-se devido à elevada densidade celular. Como podia observar-se, após a diluição e do tratamento mediante 5-Aza-CdR todos os antigénios investigados estão presentes nos linfócitos induzidos, com uma maior expressão em culturas tomadas da fase logarítmica de crescimento em comparação com as células tomadas do "plateau". Isto indica que para obter a maior indução da expressão de CTA, as células deveriam tomar-se durante a fase logarítmica do seu crescimento e a sua elevada taxa de proliferação é significativa na indução da expressão de CTA. O perfil de expressão de CTA resultante nesses linfócitos abarca todos os antigénios ensaiados e é inclusive mais amplo que o perfil nalgumas células tumorais. A expressão nas células tratadas com 5-Aza-CdR de um grupo de antigénios de cancro/testículo, antigénios MAGE-A também a nível de proteína, foi confirmada mediante um ensaio ELISA baseado em células. Modificou-se um método original descrito para a quantificação de gplOO (Erdile et ai., 2001). Todas as células lavaram-se duas vezes em DPBS que continha cálcio e magnésio, e depois da contagem se titularam a 2 vezes e cada diluição colocou-se em 4 poços (dois para a união total e dois para a união inespecífica de Ac) . As células centrifugaram-se a 1400 rpm durante 10 min, e secaram-se, permeabilizaram-se e fixaram-se com metanol como no método original. Para o bloqueio, utilizou- 26 se HS deslipidado que continha azida de sódio a 0,05% após a diluição até 10% mediante DPBS que continha cálcio e magnésio. Após o bloqueio a 4°C durante uma noite, os poços incubaram-se durante lha 37°C e depois durante lha temperatura ambiente com anti-MAGE ou com anticorpos de controlo do mesmo isotipo. Como anticorpo anti-MAGE, utilizou-se sobrenadante de hibridoma do clone 57B especifico de MAGE de amplo espectro (proporcionado por cortesia pelo Dr. Spagnoli, Suiça), que detecta todos os antigénios MAGE enumerados anteriormente excepto o MAGE-A10 (Rimoldi et ai., 2000) . Diluiu-se 10 vezes em HS a 5%/azida-DPBS que continha cálcio e magnésio, e adicionou-se uma concentração de IgG igual de Ac de controlo do mesmo isotipo aos poços de controlo. De seguida, as células incubaram-se durante 1,5 h a temperatura ambiente com anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho biotinilado, seguido de estreptavidina-HRP durante 30 min a temperatura ambiente (ambos de "Dako", diluídos em BSA a 1%-DPBS 500 e 1000 vezes, respectivamente). Os poços lavaram-se com Tween a 0,05%-DPBS entre etapas. Utilzaram-se 100 μΐ de substrato líquido de TMB, supersensível (Sigma) para a reacção enzimática de HRP, e a reacção acabou-se por adição de um volume igual de HC1 1 N. A absorvância do produto solúvel mediu-se a 450 nm com o filtro de referência de 550 nm. A diferença entre as leituras para a união total e inespecífica representou-se como a densidade óptica específica (DO) em dependência do número de células por poço.

Para a normalização da expressão de proteínas MAGE pela quantidade de proteína total em cada amostra das linhas celulares, a proteína foi medida em presença de Triton X-100 a 0,25% nas alíquotas de células lavadas com DPBS utilizando o kit de ensaio de proteína do ácido 27 bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, Illinois) e BSA como padrão, de acordo com o método recomendado pelo fabricante. A Figura 5 representa os resultados da análise de ELISA baseada em células da expressão de MAGE-A em linfócitos não tratados e tratados com 5-Aza-CdR, bem como na linha celular de cancro de mama MDA-MB-231. Como se pode observar, não se detecta expressão de proteína MAGE em linfócitos normais, enquanto os linfócitos tratados com 5-Aza-CdR expressam uma quantidade significativa de proteína, demonstrando a indução da expressão de antigénios MAGE não apenas no ARN, mas também a nível de proteína. A análise comparativa das curvas para células MDA-MB-231 e linfócitos tratados com 5-Aza-CdR apresenta que o número absoluto de proteínas MAGE por célula é aproximadamente 40 vezes maior em células tumorais do que em linfócitos. Por outro lado, as células MDA-MB-231 são significativamente maiores, contendo 3,61 mg de proteína total por 107 células em comparação com 0,81 mg de proteína por 107 linfócitos (medida pelo método de BCA que foi descrito anteriormente). Por isso, a fracção de MAGE na proteína celular total entre a linha celular tumoral de elevada expressão de MAGE em progressão MDA-MB-231 (Figura 3) e os linfócitos tratados com 5-Aza-CdR difere em menos de 10 vezes. É notável que esta quantidade de proteínas MAGE localiza-se intracelularmente (no citosol), e já dentro de células apresentadoras de antigénios, evitando portanto as etapas de baixa eficácia de captação e apresentação cruzada, que se supõe que são criticas para a estimulação de uma resposta de CTL específicos de antigénio tumoral.

Exemplo 3

Indução de resposta de células T citotóxicas contra linfócitos autólogos em proliferação enriquecidos em CD4 tratados com 5-Aza-CdR 28

Após a indução de CTA em linfócitos normais depois do tratamento com 5-Aza-CdR, estes linfócitos utilizaram-se para a geração de uma resposta imune especifica de tumor in vitro. As culturas tratadas com 5-Aza-CdR foram recolhidas, contadas e semeadas numa placa de 96 poços a 20 x 103 por poço juntamente com 20-40 x 103 de linfócitos autólogos não aderentes descongelados em 0,1 ml de meio de linfócitos. Após 2 dias de incubação, adicionaram-se 0,05 ml de meio de linfócitos complementado com 75 Ul/ml de IL-2 a cada poço. A adição de 0,05 ml de meio de linfócitos somente foi repetida nos dias 5 e 7. No dia 9, as culturas recolheram-se, contaram-se e utilizaram-se para a análise da resposta imune. O fenotipado das células realizou-se por tinção com os anticorpos conjugados directos, CD4-isotiocianato de fluoresceina (FITC), CD8-ficoeritrina (PE), CD56-PE, CD3-FITC e CD62L-cianeto de ficoeritrina 5 (PC5) (BD Biosciences, Dinamarca, 555346, 555635, 555516, Beckman Coulter, Suécia, IM1281, IM2655). Utilizaram-se os controlos isotipicos recomendados para o fenotipado das células. As amostras de células analisaram-se utilizando um Citómetro de Fluxo FC500 MPL (Beckman Coulter) e o software analítico CXP (Beckman Coulter). Os resultados da análise de uma dessas culturas apresentam-se na Figura 7. Como se podia observar, a proporção relativa de células CD8+ em comparação com células CD4+ aumentou significativamente como resultado da estimulação, demonstrando que estas condições de estimulação promovem a geração de células CD8+. É especialmente destacável o facto de que uma parte significativa das células CD8+ geradas expressa CD62L, o marcador de células de memória centrais (Sallusto et al. , 2004). Por outro lado, existe um número significativo de células duplamente negativas, dentre elas células NK CD56+. Por isso, para ensaiar a actividade citotóxica de apenas as 29 células CD8+ geradas, isolaram-se utilizando um método convencional de Miltenyi Biotec, Alemanha para a purificação de células T CD8. As células lavaram-se duas vezes por adição de tampão DPBS frio (Cambrex, Dinamarca, BE02-017F) que continha soro fetal de vitela a 0,5% (Cambrex, DE14-801 F) à suspensão celular. Após a eliminação do tampão, as células assinalaram-se magneticamente com micropérolas CD8 (Miltenyi Biotec, 130-045-201) . A suspensão celular carregou-se numa coluna que se colocou no campo magnético de um separador MACS. As células positivas para CD8 assinaladas magneticamente retiveram-se na coluna. As células não assinaladas passaram através e esta fracção celular apresenta um número reduzido de células positivas para CD8. Após a retirada da coluna do campo magnético, as células positivas para CD8 retidas magneticamente eluiram-se como a fracção seleccionada positivamente. A Figura 7 representa o fenotipo das células isoladas positivamente, que representa que a pureza das células CD8+ isoladas é superior a 90%. Após o isolamento, os linfócitos lavaram-se intensamente, foram re-suspensos em meio de cultura complementado com 25 Ul/ml de IL-2 e colocaram-se numa placa de 24 poços. Após a incubação durante uma noite, os linfócitos foram recolhidos, foram lavados uma vez, re-suspensos a 1 x 106/ml, e adicionados a um painel de linhas celulares de cancro de próstata e mama. Utilizaram-se as linhas de células tumorais seguintes: linhas celulares de cancro de próstata: LNCaP (HLA-A2+) e PC3 (HLA-A2-); linhas celulares de cancro de mama: MCF-7 (HLA-A2 + ) , MDA-MB-231 (HLA-A2 + ) e T47D (HLA-A2-) . Semearam-se 25 x 103 células tumorais numa placa de 48 poços em 1 ml de meio RPMI-16 40 com adição de 10% de FCS e incubaram-se 2 dias antes do 30 ensaio. Antes da adição de linfócitos, eliminaram-se 0,5 ml de sobrenadante de cultura e adicionaram-se 0,25 ml da suspensão de linfócitos isolados que continha 0,25 x 106 células às células tumorais. As células cultivaram-se juntas durante 18-20 horas. A actividade citotóxica de linfócitos isolados determinou-se por detecção da produção de IFN-gamma no sobrenadante de cultura, bem como por controlo microscópico do desaparecimento de células tumorais. Para a determinação de IFN-gamma, recolheram-se 0,35 ml de sobrenadante de cultura e manteve-se congelada (-20°C) até a sua análise. A concentração de IFN-g nos sobrenadantes de cultura mediu-se mediante um ELISA (sandwich) utilizando o kit "Ready-Set-Go" (eBioscience, San Diego, CA, Estados Unidos) que incluía Ac de captura, Ac de detecção biotinilados convencionais e HRP-estreptavidina. O método realizou-se essencialmente de acordo com as recomendações do fabricante com as modificações seguintes: (1) após a união durante uma noite de anticorpos de captura às placas de 96 poços Nunc Maxisorp e da lavagem das placas, a etapa de bloqueio prolongou-se até pelo menos 3 h a temperatura ambiente; (2) a curva padrão gerou-se mediante sete diluições seriadas do padrão, começando com 500 ou 1000 pg/ml de IFN-g, e os padrões e as amostras por triplicado incubaram-se a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de incubação a 4°C durante uma noite. As etapas seguintes realizaram-se de acordo com o protocolo dos fabricantes. Utilizou-se uma solução de substrato de tetrametilbencidina (TMB) do mesmo kit na reacção enzimática de HRP, e depois de acabar a reacção, mediu-se a densidade óptica com correcção por comprimento de onda como uma diferença entre as leituras a 450 e 550 nm. 31 A Figura 8 representa a libertação de IFN-gamma por linfócitos após a incubação durante uma noite com diferentes células tumorais. Observa-se claramente que a libertação em presença das linhas celulares positivas para HLA-A2 LNCaP, MCF-7 e MDA-MB-231 é superior que a libertação em presença das linhas celulares negativas para HLA-A2 PC3 e T47D.

Realizou-se um controlo microscópico das culturas mistas utilizando um microscópio invertido equipado com a câmara digital. Observou-se uma diminuição significativa no número de células LNCaP e MDA-MB-231 após o contacto durante uma noite com linfócitos imunes (Figura 9), enquanto o desaparecimento de células MCF-7 requer 2-3 dias de incubação (não se apresenta).

Certa libertação de IFN-gamma após a incubação com linhas celulares negativas para HLA-A2 observada na Figura 8 pode estar mediada por células NK CD56+ que ainda estejam presentes na população de linfócitos enriquecidos em CD8+ (ver a Figura 7) . Para imitar o desenvolvimento posterior no organismo do paciente, num exemplo recuperaram-se linfócitos após o contacto com células tumorais e expandiram-se em presença de células dendriticas e IL-2. Após 3 semanas de expansão, uma dessas culturas, que mostrava uma elevada citotoxicidade contra linhas celulares tumorais HLA-A2+, produzia IFN-gamma só de modo restrito a HLA-A2 (ver a Figura 10; observar que nesta experiência só foram adicionados 0, 062 x 106 linfócitos a cada poço com células tumorais). Estes dados indicam que os linfócitos T citotóxicos específicos de tumor induzidos por linfócitos enriquecidos em CD4 tratados com 5-Aza-CdR não estão danificados como resultado do contacto com células tumorais. Ao contrário, existe uma proliferação selectiva destes linfócitos que conduz ao enriquecimento de 32 linfócitos citotóxicos específicos de tumor, reflectindo o fenotipo de memória de resposta imune CD8+. Esta interpretação concorda com a Figura 6 no Exemplo 2 que demonstrava a presença do marcador de memória central CD62L na metade das células CD8+ activadas, e demonstra que esta estratégia se pode utilizar para a imuno-terapêutica adoptiva.

Exemplo 4. Aumento a escala da produção de linfócitos citotóxicos para imuno-terapêutica adoptiva A utilização de linfócitos citotóxicos específicos de tumor gerados ex vivo para imuno-terapêutica adoptiva requer o estabelecimento de um sistema de cultura capaz de produzir um grande número de células efectoras de uma forma segura. 0 método descrito no Exemplo 3 utiliza placas de 96 poços e de 24 poços que fazem com que todo o método seja muito trabalhoso e esteja submetido a um elevado risco de contaminação. Este exemplo utiliza dois tipos de balões de cultura de tecido grandes: balões de cultura de tecido T225 convencionais (Nunc) para a geração de células dendriticas e balões de superfície alargada de 235 cm2 (Corning, N° cat. 431346) para a activação e a cultura de linfócitos. A ideia de utilizar balões de área alargada de 235 cm2 baseia-se na observação de que o crescimento de linfócitos é em geral melhor se colocados em contacto estreito. Por exemplo, os linfócitos crescem muito melhor em placas de 96 poços de fundo em U do que em placas de fundo plano de 24 poços ou em balões de cultura de tecido T225. Na procura de balões de cultura de tecido que pudessem servir de suporte para a formação dessas estreitas associações celulares, os inventores encontraram os balões de superfície alargada de 235 cm2, nos quais o fundo consiste em inúmeras cavidades em forma de V. Nas primeiras experiências, os inventores compararam o crescimento de linfócitos activados numa placa 33 ~ 2 de 96 poços e num balao de superfície alargada de 235 cm .

Os resultados demonstraram que os linfócitos eram capazes de expandir-se em balões de superfície alargada de 235 cm com a mesma eficácia do que em placas de fundo em U de 96 poços.

Todo o método adapta-se a estes balões de cultura de tecido. Utiliza células mononucleares de sangue periférico isoladas e consiste em 5 etapas: 1) geração das células dendríticas maturas a partir de monócitos, 2) estimulação de linfócitos pelas células dendríticas maturas que conduz a uma proliferação preferente de células CD4+, 3) tratamento dos linfócitos activados com agente de desmetilação que conduz à indução da expressão de antigénios de cancro/testículo, 4) geração de linfócitos citotóxicos por co-cultura dos linfócitos com linfócitos activados e tratados, e 5) expansão de linfócitos citotóxicos em presença de células dendríticas autólogas como células alimentadoras.

Geração das células dendríticas maturas 0 isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) realizou-se como se descreve no exemplo 1. As células isoladas não foram congeladas mas sim utilizadas imediatamente nas experiências. A suspensão celular que continha 50 milhões de monócitos foi incubada num balão de cultura de tecido T225 pré-tratado durante 45 minutos com meio RPMI 1640 complementado com soro humano AB a 5%. Após a recolha de linfócitos não aderentes, os monócitos aderentes lavaram-se uma vez e adicionaram-se 40 ml de meio AIM-V complementado com soro humano AB a 2% em cada poço. Os linfócitos recolhidos congelaram-se no meio que consistia em 70% de meio AIM-V, 20% de soro humano AB e 10 % de DMSO. Adicionou-se GM-CSF (100 ng/ml) e IL-4 (25 ng/ml) após a incubação durante uma noite e dois dias após. 34

No dia 4, adicionou-se mistura de maturação que consistia em IL-lbeta (10 ng/ml), IL-6 (1000 U/ml), TNF-alfa (10 ng/ml) e prostaglandina E2 (0,1 μg/ml) aos balões. Após 2 dias, recolheram-se células não aderentes e parte das mesmas foram utilizadas para o início imediato da activação de linfócitos, enquanto as restantes foram congeladas para a sua utilização posterior na etapa de expansão.

Estimulação de linfócitos pelas células dendriticas maturas

Os linfócitos não aderentes congelados ao inicio da cultura descongelaram-se, contaram-se e misturaram-se 40 x 106 células com 4 x 106 células dendriticas. Após a centrifugação, esta mistura foi suspensa em 40 ml de meio de cultura de linfócitos que consistia em meio AIM-V complementado com soro humano AB a 5%, colocou-se num balão de superfície alargada de 235 cm2 e cultivou-se durante 8 dias. Nos dias 2 e 5, adicionaram-se 20 ml de meio recém preparado complementado com interleucina 2 (concentração final de 15 U/ml) ao balão.

Indução da expressão de antigénios de cancro/testículo.

No dia 8, os linfócitos activados recolheram-se, contaram-se e centrifugaram-se 20 x 106 células, suspenderam-se em 40 ml de meio de cultura de linfócitos complementado com 10 μΜ de 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) e colocaram-se num balão de superfície alargada de 235 cm2. Após 3 dias, as células recolheram-se, contaram-se e utilizaram-se como estimuladores para a geração de linfócitos citotóxicos.

Geração de linfócitos citotóxicos

Os linfócitos não aderentes congelados ao inicio da cultura descongelaram-se, contaram-se e misturaram-se 20 x 106 células com 20 x 106 células tratadas com 5-Aza-CdR. 35

Após a centrifugação, esta mistura foi suspensa em 40 ml de meio de cultura de linfócitos que consistia em meio AIM-V complementado com soro humano AB a 5%, colocou-se num balão de superfície alargada de 235 cm2 e cultivou-se durante 11 dias. Nos dias 2, 5 e 8 adicionaram-se 20 ml de meio recém preparado complementado com interleucina 2 (concentração final de 25 U/ml) ao balão.

Expansão de linfócitos citotóxicos

Actualmente utilizam-se diferentes protocolos para a expansão de linfócitos activados, e muitos deles utilizam células alimentadoras. Para bloquear a proliferação de células alimentadoras, irradiam-se. Isto faz com que todo o método seja trabalhoso e esteja submetido ao risco de extensão de variantes mutadas. Para evitar estes problemas, os inventores decidiram utilizar células dendríticas como células alimentadoras, já que as células dendríticas maturas não proliferam. Além disso foi demonstrado que as células dendríticas autólogas são capazes de servir de suporte ao crescimento de linfócitos activados (Langhoff e Steinman, 1989). Por isso, os inventores utilizaram células dendríticas geradas no dia 6 da reacção e congeladas em aliquotas para a estimulação do crescimento de linfócitos citotóxicos. No dia 11 de co-incubação de linfócitos intactos com linfócitos activados tratados com 5-Aza-CdR, retiraram-se 60 ml do meio de cultura, e adicionaram-se à cultura 4 x 106 células dendríticas descongeladas suspensas em 40 ml do meio de cultura. Nos dias 13 e 15, a cultura dividiu-se 1:1 com adição de 40 ml de meio de cultura recém preparado e IL-2. Nos dias 17 ou 18, as culturas recolheram-se e caracterizaram-se por análise de citometria de fluxo.

Os inventores realizaram a preparação de linfócitos citotóxicos mediante este método a partir de linfócitos 36 isolados de sangue de seis dadores (Tabela 2) . A caracterização do fenotipo celular dos linfócitos gerados pelo método de citometria de fluxo demonstra que têm um fenotipo semelhante ao descrito no Exemplo 3. Estavam presentes três populações principais: linfócitos CD8+, linfócitos CD4+ e células NK CD3- CD56+. A população de células CD8+ é habitualmente dominante, variando de 17% a 57% (média de 40,8%), enquanto a proporção de células CD4+ varia de 2 a 15% excepto num dador em que a sua proporção estava próxima a 30%. A proporção de células NK varia de 3% a 54% (média de 25,59) . O número total de células geradas após 35 dias desde o início da reacção variava entre 3 x 108 e 7 x 108.

Tabela 2. Percentagem de populações de linfócitos principais nas culturas de MLC geradas em balões de área alargada T235.

Cultura CD4+ CD8- CD8+ CD4+ CD56+ CD3- 51/07-1 14, 7 17,2 54, 2 52/07-1 12,8 57, 4 15,3 54/07-1 28,8 31,2 10,5 59/07-1 3,7 51,5 34 60/07-1 1,9 54,9 3,3 61/07-1 6, 6 32,8 35,6 Média 11, 42 40,83 25, 48

Em resumo, o método descrito permite a geração de um grande número de linfócitos citotóxicos utilizando somente balões de cultura de tecido que permitem realizar toda a reacção de um modo seguro e relativamente não trabalhoso.

Este método pode adaptar-se facilmente à produção de linfócitos citotóxicos específicos de tumores em condições GMP. 37

Lista de referências

Bevan, M.J. (2004). Helping the CD8+ T-cell response. Nat. Rev. Immunol. 4, 595-602.

Brasseur, F., Rimoldi, D., Lienard, D., Lethe, B., Carrel, S., Arienti, F., Suter, L., Vanwijck, R., Bourlond, A., Humblet, Y., Vacca, A., Conese, M., Lahaye, T., Degiovanni, G., Deraemaecker, R., Beauduin, M., Sastre, X., Salamon, E. , Dreno, B., Jager, E ., Knuth, A. , Chevreau, C. , Suciu, s., Lachapelle, J.M., Pouillart, P., Parmiani, G., Lejeune, F., Cerottini, J.C., Boon, T., e Marchand, M. (1995) .

Expression of MAGE genes in primary and metastatic cutaneous melanoma. Int. J. Câncer 63, 375-380.

Castellino, F. e Germain, R.N. (2006). Cooperation between CD4+ and CD8 + T cells: when, where, and how. Annu. Rev. Immunol. 24, 519-540. Chong J.C., Matsen, C.W, Gonzales, F.A., Ye, W., Greer, S. Marquez, V.E., Jones, P, A e Selker, E.U. (2003). Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine. I. Natl. Câncer Inst. 95, 399-409,

Chuang, J.C., Yoo, C.B., Kwan, J.M., Li, T.W, Liang, G.. Yang, A.S. e Jones, P.A. (2005) . Comparison of biological effects of non-nucleoside DNA methylation inhibitors versus 5-Aza-2'-desoxicitidina. Mol. Câncer Ther. 4, 1515-1520. Cresswell, P., Ackerman, A.L., Giodini, A., Peaper, D.R. e Wearsch, P.A. (2005). Mechanisms of MHC class I-restricted antigen Processing and cross-presentation. Immunol. Rev. 207, 145-157.

De Backer, 0., Arden, K.C., Boretti, M., Vantomme, V., De Smet, C., Czekay, S., Viars, C.S., De Plaen, E., Brasseur, F., Chomez, P., Van den Eynde, B.J., Boon, T. e van der Bruggen, P. (1999). Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normal testis. Câncer Res. 59, 3157-3165. 38

De Plaen, E., Arden, IC., Traversari, C, , Gaforlo, J. J., Szikora, J. P., De Smet, C., Brasseur, F., van der Bruggen, P., Lethe, B e Lurquin. C. Structure, chromosomal localization, and expression of 12 genes of the MAGE family. Immunogenetics, 4, 360-369.

De Smet, C., De Backer, O., Faraoni, I. , Lurquin, C., Brasseur, F. e Boon, T. (1996). The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylat ion. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93, 7149-7153 .

De Vries, I.J., Lesterhuis, W.J., Scharenborg, N.M., Engelen, L.P., Ruiter, D.J., Gerritsen, M.J., Croockewit, S., Britten, C.M., Torensma, R., Aderna, G.J., Figdor, C.G. e Punt, C.J. (2003). Maturation of dendritic cells is a prerequisite for inducing immune responses in advanced melanoma patients. Clin. Câncer Res. 9, 5091-5100.

Dupont, J, , Latouche, JB, Ma, C. e Sadelain, M. (2005). Artificial antigen-presenting cells transduced with telomerase efficiently expand epitope-specific human leukocyte antigen restricted cytoxic T cells. Câncer Res 65, 5417-5427.

Erdile, L.F., Smith, D. e Berd. D. (2001). Whole cell ELISA for detection of tumor antigen expression In tumor samples. J Immunol Methods, 258, 47-53. Eura, M. , Ogi, K., Chikamatsu, K., Lee, K.D., Nakano, K., Masuyama, K., Itoh, K. y Ishikawa, T. (1995) Expression of the MAGE gene family in human head-and-neck squamous-cell carcinomas.

Int. J. Câncer 64, 304-308.

Gilboa, E. e Vieweg, J. (2004). Câncer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol. Rev. 199, 251- 263.

Kandemir

Jonuleit, H., Giesecke-Tuettenberg, A., Tuting, T., Thurner-Schuler, B., Stuge, T.B., Paragnik, L., 39 A., Lee, P.P., Schuler, G., Knop, J. e Enk, A.H. (2001). A comparison of two types of dendritic cell as adjuvants for the induction of melanoma-specific T-cell responses in humans following intranodal injection. Int J Câncer 93, 243-251.

Karpf, A.R., Lasek, A.W., Ririe, T.O., Hanks, A.N.,

Grossman, D. e Jones, D.A. (2004). Limited gene activation in tumor and normal epithelial cells treated with the DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine. Mol. Pharmacol. 65, 18-27.

Katano, M., Nakamura, M., Morisaki, T. e Fujimoto, K. (1997). Melanoma antigen-encoding gene-1 expression in invasive gastric carcinoma: correlation with stage of disease. J. Surg. Oncol. 64, 195-201.

Kennedy, R., Undale, A.H., Kieper, W.C., Block, M.S., Pease, L.R. e Celis, E. (2005). Direct cross-priming by Th lymphocytes generates memory cytotoxic T cell responses. J. Immunol. 174, 3967-3977.

Kirkin, A:F., Dzhandzhugazyan, K.N. e Zeuthen, J. (2002). Câncer/testis antigens: structural and immunobiological properties. Câncer Invest 20, 222-236. Klebanoff, C.A.,

Gattinoni, L. y Restifo, N.P. (2006). CD8 T-cell memory in tumor immunology and immunotherapy. Immunol. Rev. 211, 214-224.

Kyte, J.A., Mu, L., Aamdal, S., Kvalheim, G., Dueland, S., Hauser, M., Gullestad, H.P., Ryder, T., Lislerud, K., Ham-merstad, H. e Gaudernack, G. (2006). Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA. Câncer Gene Ther. 13, 905-918. Langhoff e Steinman, 1989, Clonal expansion of human T lymphocytes initiated by dendritic cells. J. Exp. Med. 169, 315-320. 40

Lethé, B., Lucas, S., Michaux, L., De Smet, C., Godelaine, D., Serrano, A., De Plaen, E. e Boon, T. (1998). LAGE-1, a new gene with tumor specificity. Int. J. Câncer 76, 903-908 .

Liang, G., Gonzales.F.A. , Jones, P, A., Orntoft.TP. e Thykjaer, T. (2002). Analysis of gene induction in human fibroblasts and bladder câncer cells exposed to the methylation Inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine. Câncer Res. 62, 961-966. Marshall, J.A., Forster, T.H., Purdie, D.M., Lanagan, C.M., 0'Connor, L.E., 0'Rourke, M.G., Johnson, M.K., See, J.L., Ellem, K.A., Martinez, N.R., Lopez, J.A. e Schmidt, C.W. (2006). Immunological characteristics correlating with clinicai response to immunotherapy in patients with advanced metastatic melanoma. Immunol. Cell Biol. 84, 295-302.

Naota, H., Miyahara, Y., Okumura, S., Kuzushima, K., Akatsuka, Y., Hiasa, A., Kitano, S., Takahashi, T., Yuta, A., Majima, Y. e Shiku, H. (2006). Generation of peptide-specific CD8(+) T cells by phytohemagglutinin-stimulated antigen-mRNA-transduced CD4(+) T cells. J. Immunol. Methods. 314, 54-66.

Novellino, L., Castelli, C. e Parmiani, G. (2005). A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Câncer Immunol. Immunother. 54, 187-207. 0'Rourke, M.G., Johnson, M., Lanagan, C., See, J., Yang, J., Bell, J.R., Slater, G.J., Kerr, B.M., Crowe, B., Purdie, D.M., Elliott, S.L., Ellem, K.A. e Schmidt, C.W. (2003). Durable complete clinicai responses in a phase I/II trial using an autologous melanoma cell/dendritic cell vaccine. Câncer Immunol. Immunother. 52, 387-395. Palucka, A.K., Ueno, H., Connolly, J., Kerneis-Norvell, F., Blanck, J.P., Johnston, D.A., Fay, J. e Banchereau, J. (2006). Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma 41 cells can induce objective clinicai responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J. Immunother. 29, 545-557. Patard, J.J., Brasseur, F., Gil-Diez, S., Radvanyi, F., Marchand, M., Francois, P., Abi-Aad, A., Van Cangh, P., Ab-bou, C.C., Chopin, D. e Boon, T. (1995). Expression of MAGE genes in transitional-cell carcinomas of the urinary bladder. Int. J. Câncer 64, 60-64.

Reynolds, S.R., Zeleniuch-Jacquotte, A., Shapiro, R.L., Roses, D.F., Harris, M.N., Johnston, D. e Bystryn, J.C. (2003). Vaccine-induced CD8+ T-cell responses to MAGE-3 correlate with clinicai outcome in patients with melanoma. Clin. Câncer Res. 9, 657-662.

Rimoldi, D., Salvi, S., Schultz-Thater, E., Spagnoli, G.C. y Cerottini, J.C. (2000). Anti-MAGE-3. antibody 57b and anti-MAGE-1 antibody 6C1 can be used to study different proteins of the MAGE-A family. Int. J. Câncer 86, 749-751. Romani, N., Gruner, S., Brang, D., Kampgen, E., Lenz, A., Trockenbacher, B., Konwalinka, G., Fritsch, P.O., Steinman, R.M. e Schuler, G. (1994). Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J. Exp. Med. 180, 83-93.

Salcedo, M., Bercovici, N., Taylor, R., Vereecken, P., Massicard, S., Duriau, D., Vernel-Pauillac, F., Boyer, A., Bar- on-Bodo, V., Mallard, E., Bartholeyns, J., Goxe, B., Latour, N., Leroy, S., Prigent, D., Martiat, P., Sales, F., Laporte, M., Bruyns, C., Romet-Lemonne, J.L., Abastado, J.P., Lehmann, F. e Velu, T. (2005). Vaccination of melanoma patients using dendritic cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. Câncer Immunol. Immunother. 55, 819-829.

Sallusto, F., Geginat, J. e Lanzavecchia, A. (2004). Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 22, 745-763. 42

Schaft, N., Dorrie, J., Thumann, P., Beck, V.E., Muller, I. , Schultz, E.S., Kampgen, E., Dieckmann, D. e Schuler, G. (2005). Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfecting defined RNAs after rather than before maturation. J. Immunol. 174, 3087-3097.

Thurner, B., Haendle, 1., Roder, C., Dieckmann, D., Keikavoussi, P., Jonuleit, H., Bender, A., Maczek, C., Schreiner, D., von den Driesch, P., Brocker, E.B., Steinman, R.M., Enk, A., Kampgen, E. e Schuler, G. (1999). Vaccination with Mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J. Exp. Med. 190, 1669-1678. thor Straten, P., Kirkin, A. F., Seremet, T. e Zeuthen, J. Expression of transporter associated with antigen Processing 1 and 2 (TAPI/2) in malignant melanoma cell lines. Int. J. Câncer, 70: 582-556, 1997.

Thurner, B., Roder, C., Dieckmann, D., Heuer, M., Kruse, M., Glaser, A., Keikavoussi, P., Kampgen, E., Bender, A. e Schuler, G. (1999b). Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis Products for clinicai application. J. Immunol. Methods 223, 1-15 . van Pel, A., van der Bruggen, P., Coulie, P.G., Brichard, V.G., Lethé, B., Van den Eynde, B.J., Uyttenhove, C., Renauld, J.C. e Boon, T. (1995) . Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes. Immunol. Rev. 145, 229-250.

Vatolin, S., Abdullaev, Z., Pack, S.D., Flanagan, P.T., Custer, M., Loukinov, D.I., Pugacheva, E., Hong, J.A., Morse, Η., III, Schrump, D.S., Risinger, J.I., Barrett, J. C. e Lobanenkov, V.V. (2005). Conditional expression of 43 the CTCF-paralogous transcriptional factor BORIS in normal cells results in demethylation and derepression of MAGE-Al and reactivation of other cancer-testis genes. Câncer Res. 65, 7751-7762.

Weber, J., Salgaller, M., Samid, D., Johnson, B., Herlyn, M., Lassam, N., Treisman, J. e Rosenberg, S.A. (1994). Expression of the MAGE-1 tumor antigen is up-regulated by the demethylating agent 5-Aza-2'-deoxycytidine. Câncer Res. 54, 1766-1771. Weiser, T.S,. Ohnmachi, G.A., Guo, Z.S,

Fischette.M R. Chen, G.A., Hong, J.A.. Nguyen, D.M. e Schrump, D.S. (2001). Induction of MAGE-3 expression in lung and esophageal câncer cells. Ann. Thorac. Surg. 71, 295-301.

Wischnewski, F., Pantel, K e Schwarzenbach, H (2006). Promoter demethylation and histone acetylation mediate gene expression of MAGE-Al, -A2, -A3, and -A12 in human câncer cells. Mol, Câncer Res. 4, 339-49.

Yee, C. (2005). Adoptive T cell therapy: Addressing challenges in câncer Immunotherapy. J. Transi. Med. 3, 17. Zendman, A.J., Ruiter, D.J. e van Muijen, G.N.P. (2003). Cancer/testis-associated genes: Identification, expression profile, and putative function. J. Cell Physiol 194, 272- 288 . 44

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 03045427 A [0005] • WO 03012086 A [0008] • DK 555516 [0045] [0046] [0053] • DK 555558 [0045] • DK 555346 [0046] [0053] • DK 555635 [0046] [0053]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Bevan,M.J. Helping the CD8+ T-cell response. Nat. Rev. Immunol., 2004, vol. 4, 595-602 [0071] • Brasseur,F.; Rimoldi,D.; Liénard,D.; Lethé,B.;

Carrel,S.; Arienti,F.; Suter,L., Vanwijck,R;

Bourlond,A.; Humblet,Y.; Vacca,A. Expression of MAGE genes in primary and metastatic cutaneous melanoma. Int. J. Câncer, 1995, vol. 63, 375-380 [0072] • Castellino,F.; Germain,R.N. Cooperation between CD4+ and CD8+ T cells: when, where, and how. An-nu. Rev. Immunol., 2006, vol. 24, 519-540 [0073] • Chong J.C.; Matsen,C.W; Gonzales,F.A.; Ye,W.; Greer,S.;

Marquez,V.E.; Jones,P,A; Selker, E.U. Inhibltion of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine. I. Natl. Câncer Inst., 2003, vol. 95, 399- 409 [0073] • Chuang.J.C.; Yoo,C.B.; Kwan.J.M.; Li, T.W; Liang,G..; Yang, A.S.; Jones,P.A. Comparison of biological effects 45 of non-nucleoside DNA methylation inhibitors versus 5-Aza-2'-deoxycytidine. Mol. Câncer Ther., 2005, vol. 4, 1515-1520 [0074] • Cresswell,P.; Ackerman,A.L.; Giodini,A.; Peaper,D.R.; Wearsch,P.A. Mechanisms of MHC class I-restricted antigen processing and cross-presentation. Immunol. Rev., 2005, vol. 207, 145-157 [0074] • De Backer,0.; Arden,K.C.; Boretti,M.; Vantomme,V.; De

Smet,C.; Czekay,S.; Viars,C.S.; De Plaen,E.; Brasseur,F.; Chomez,P. Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normal testis. Câncer Res., 1999, vol. 59, 3157-3165 [0075] • De Plaen, E; Arden, IC.; Traversari, C; Gaforlo, J. J.; Szikora, J. P.; De Smet, C.; Brasseur, F.; van der Bruggen, P.; Lethe, B; Lurquin. C. Structure, chromosomal localization, and expression of 12 genes of the MAGE family. Immunogenetics, vol. 4, 360-369 [0076] • De Smet,C.; De Backer,0.; Faraoni,I.; Lurquin,C.;

Brasseur,F.; Boon, T. The activation of human gene MAGE-1 in tumor cells is correlated with genome-wide demethylat ion. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1996, vol. 93, 7149-7153 [0077] • De Vries,I.J.; Lesterhuis,W.J; Scharenborg,N.M.;

Engelen,L.P.; Ruiter,D.J.; Gerritsen,M.J.;

Croockewit,S.; Britten,C.M.; Torensma,R.; Adema,G.J.

Maturation of dendritic cells is a prerequisite for inducing immune responses in advanced melanoma patients. Clín. Câncer Res., 2003, vol. 9, 5091-5100 [0078] • Dupont,J; Latouche,JB; Ma,C.; Sadelain,M. Artificial antlgen-presenting cells transduced with tel-omerase efficiently expand epitope-specific human leukocyte antigen restricted cytoxic T cells. Câncer Res, 2005, vol. 65, 5417-5427 [0079] 46 • Erdile, L.F.; Smith, D.; Berd. D. Whole cell ELISA for detection of tumor antigen expression In tumor samples. J Immunol Methods, 2001, vol. 258, 47-53 [0080] • Eura,M.; Ogi,K.; Chikamatsu,K.; Lee,K.D.; Nakano,K.;

Masuyama,K.; Itoh,K.; Ishikawa, T. Expression of the MAGE gene family in human head-and-neck squamous-cell carcinomas. Int. J. Câncer, 1995, vol. 64, 304-308 [0080] • Gilboa,E.; Vieweg,J. Câncer immunotherapy with mRNA- transfected dendritic cells. Immunol. Rev., 2004, vol. 199, 251-263 [0081] • Jonuleit,H.; Giesecke-Tuettenberg,A; Tuting, T.;

Thurner-Schuler,B.; Stuge, T.B.; Paragnik,L.;

Kandemir,A.; Lee,P.P.; Schuler,G.; Knop,J. A comparison of two types of dendritic cell as adjuvants for the induction of melanoma-specific T-cell responses in humans following in-tranodal injection. Int J Câncer, 2001, vol. 93, 243-251 [0082] • Karpf,A.R.; Lasek,A.W.; Ririe, T.O.; Hanks,A.N.;

Grossman,D.; Jones,D.A. Limited gene activation in tumor and normal epithelial cells treated with the DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine. Mol. Pharmacol., 2004, vol. 65, 18-27 [0083] • Katano,M.; Nakamura,M.; Morisaki, T.; Fujimo-to,K.

Melanoma antigen-encoding gene-1 expression in invasive gastric carcinoma: correlation with stage of disease. J. Surg. Oncol., 1997, vol. 64, 195-201 [0084] • Kennedy,R.; Undale,A.H; Kieper,W.C.; Block,M.S.;

Pease,L.R.; Cells,E. Direct cross-priming by Th lymphocytes generates memory cytotoxic T cell responses. J. Immunol., 2005, vol. 174, 3967-3977 [0085] • Kirkin,A:F.; Dzhandzhugazyan,K.N.; Zeuthen,J. Câncer/testis antigens: structural and immunobio-logical properties. Câncer Invest, 2002, vol. 20, 222-236 [0086] 47 • Klebanoff, C.A.; Gattinoni,L.; Restifo,N.P. CD8 T-cell memory in tumor immunology and immuno-therapy. Immunol. Rev., 2006, vol. 211, 214-224 [0086] • Kyte,J.A.; Mu,L.; Aamdal,S.; Kvalheim,G; Dueland,S.;

Hauser,M.; Gullestad,Η.P.; Ryder, T.; Lislerud,K;

Hammerstad,H. Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells trans-fected with autologous tumor-mRNA. Câncer Gene Ther., 2006, vol. 13, 905-918 [0087] • Langhoff; Steinman. Clonal expansion of human T lymphocytes initiated by dendritic cells. J. Exp. Med., 1989, vol. 169, 315-320 [0088] • Lethé, B.; Lucas,S.; Michaux,L.; De Smet,C; Godelaine,D. ; Serrano,A.; De Plaen,E.; Boon, T. LAGE-1, a new gene with tumor specificity. Int. J. Câncer, 1998, vol. 76, 903-908 [0089] • Liang,G.; Gonzales.F.A.; Jones,P,A.; Orntoft.TP.; Thykjaer, T. Analysis of gene induction in human fibroblasts and bladder câncer cells exposed to the methylation Inhibitor 5-Aza-2'-deoxycy-tidine. Câncer Res., 2002, vol. 62, 961-966 [0090] • Marshall,J.A.; Forster, T.H.; Purdie,D.M.; Lanagan,C.M.; 0'Connor,L.E.; 0'Rourke,M.G.; Johnson,Μ.K.; See,J.L;

Ellem,K.A.; Martin—ez,N.R. Immunological characteristics correlating with clinicai response to immunotherapy in patients with advanced metastatic melanoma. Immunol. Cell Biol., 2006, vol. 84, 295-302 [0090] • Naota,H.; Miyahara,Y.; Okumura,S.; Kuzushima,K.;

Akatsuka,Y.; Hiasa,A.; Kitano,S; Takahashi, T.; Yuta,A.; Majima,Y. Generation of peptide-specific CD8(+) T cells by phy-tohemagglutinin-stimulated antigen-mRNA-trans- duced CD4(+) T cells. J. Immunol. Methods., 2006, vol. 314, 54-66 [0091] • Novellino,L.; Castelli,C.; Parmiani,G. A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 48 update. Câncer Immunol. Immunother., 2005, vol. 54, 187-207 [0092] • 0'Rourke,M.G.; Johnson,M.; Lanagan,C.; See,J.; Yang,J.; Bell,J.R; Slater,G.J.; Kerr,B.M.; Crowe,B.; Purdie,D.M.

Durable complete clinicai responses in a phase I/II trial using an autologous melanoma cell/dendritic cell vaccine. Câncer Immunol. Immunother, 2003, vol. 52, 387-395 [0093] • Palucka,A.K.; Ueno,H.; Connolly,J.; Kerneis-Norvell,F.;

Blanck,J.P; Johnston,D.A.; Fay,J.; Banchereau,J.

Dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells can induce objective clinicai responses and MART-1 specific CD8+ T-cell immunity. J. Immunother, 2006, vol. 29, 545-557 [0093] • Patard,J.J.; Brasseur,F.; Gil-Diez,S.; Radvanyi,F.; Marchand,M.; Francois,P.; Abi-Aad,A.; Van Cangh,P.; Abbou,C.C; Cho-pin,D. Expression of MAGE genes in transitional-cell carcinomas of the urinary bladder. Int. J. Câncer, 1995, vol. 64, 60-64 [0094] • Reynolds,S.R.; Zeleniuch-Jacquotte,A.; Shapiro,R.L.;

Roses,D.F.; Harris,M.N.; Johnston,D.; Bystryn,J.C. Vaccine-induced CD8+ T-cell responses to MAGE-3 correlate with clinicai outcome in patients with melanoma. Clin. Câncer Res., 2003, vol. 9, 657-662 [0095] • Rimoldi,D.; Salvi,S.; Schultz—Thater,E.; Spagnoli,G.C.;

Cerottini,J.C. Anti-MAGE-3. antibody 57b and anti-MAGE-1 antibody 6C1 can be used to study different proteins of the MAGE-A family. Int. J. Câncer, 2000, vol. 86, 749- 751 [0096] • Romani,N.; Gruner,S.; Brang,D.; Kãmpgen,E.; Lenz,A.;

Trockenbacher,B.; Konwalinka,G.; Fritsch,P.O.;

Steinman,R.M.; Schuler,G. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J. Exp. Med., 1994, vol. 180, 83-93 [0097] 49 • Salcedo,M.; Bercovici,N.; Taylor,R.; Vereecken,P.;

Massicard,S.; Duriau,D; Vernel-Pauillac,F.; Boyer,A.; Baron-Bodo,V.; Mallard,E. Vaccination of melanoma patients using dendritic cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. Câncer Immunol. Immunother., 2005, vol. 55, 819-829 [0098] • Sallusto,F; Geginat,J.; Lanzavecchia,A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol., 2004, vol. 22, 745-763 [0099] • Schaft,N.; Dorrie,J.; Thumann,P.; Beck,V.E.; Muller,I.;

Schultz,E.S.; Kampgen,E.; Dieckmann,D.; Schuler,G.

Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfecting defined RNAs after rather than before maturation. J. Immunol., 2005, vol. 174, 3087-3097 [0100] • Thurner,B.; Haendle,l.; Rõder,C.; Dieckmann,D.; Keikavoussi,P.; Jonuleit,H.; Bender,A.; Maczek,C.; Schreiner,D.; von den Driesch,P. Vaccination with Mage-3A1 pep-tide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J. Exp. Med., 1999, vol. 190, 1669-1678 [0101] • Straten, P.; Kirkin, A. F.; Seremet, T.; Zeuthen, J. Expression of transporter associated with antigen Processing 1 and 2 (TAPI/2) in malignant melanoma cell lines. Int.J.Câncer, 1997, vol. 70, 582-556 [0102] • Thurner,B.; Rõder,C.; Dieckmann,D.; Heuer,M.; Kruse,M.; Glaser,A.; Keikavoussi,P.; Kámpgen,E.; Bender,A.; Schuler,G. Generation of large numbers of fully mature and stable dendritic cells from leukapheresis products for clinicai application. J. Immunol. Methods, 1999, vol. 223, 1-15 [0103] • van Pel,A.; van der Bruggen,P.; Coulie,P.G.;

Brichard,V.G.; Lethé,B.; Van den Eynde,B.J.; 50

Uyttenhove,C.; Renauld,J.C; Boon, T. Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes. Immunol. Rev., 1995, vol. 145, 229-250 [0104] • Vatolin,S.; Abdullaev,Z.; Pack,S.D.; Flanagan,P.T.; Custer,M.; Loukinov,D.I.; Pugacheva,E.; Hong,J.A.; Morse,H., III; Schrump,D.S. Conditional expression of the CTCF-paralogous transcriptional factor BORIS in normal cells results in demethylation and derepres-sion of MAGE-A1 and reactivation of other can-cer-testis genes. Câncer Res., 2005, vol. 65, 7751-7762 [0105] • Weber,J.; Salgaller,M.; Samid,D.; Johnson,B.; Herlyn,M.; Lassam,N.; Treisman,J.; Rosen-berg,S.A. Expression of the MAGE-1 tumor antigen is up-regulated by the demethylating agent 5-Aza-2'-deoxycytidine. Câncer Res., 1994, vol. 54, 1766-1771 [0106] • Weiser, T.S; Ohnmachi,G.A.; Guo,Z.S; Fis-chette.M R.; Chen,G.A.; Hong,J.A.; Nguyen,D.M.; Schrump,D.S. Induction of MAGE-3 expression in lung and esophageal câncer cells. Ann. Thorae. Surg., 2001, vol. 71, 295-301 [0106] • Wischnewski,F.; Pantel,K; Schwarzenbach,H. Promoter demethylation and histone acetylation mediate gene expression of MAGE-A1, -A2, -A3, and -AI 2 in human câncer cells. Mol, Câncer Res., 2006, vol. 4, 339-49 [0107] • Yee,C. Adoptive T cell therapy: Addressing challenges in câncer Immunotherapy. J. Transi. Med., 2005, vol. 3, 17 [0108] • Zendman, A.J.; Ruiter,D.J.; van Muijen, G.N.P. Câncer/testis-associated genes: Identification, expression profile, and putative function. J. Cell Physíol, 2003, vol. 194, 272-288 [0109]

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de preparação de uma composição de apresentação de antigénios enriquecida em células CD4+, que compreende estimular a proliferação de células linfóides inactivadas normais utilizando células dendriticas maturas normais que não foram carregadas com antigénios contra os que se deveria dirigir a reacção imune que será induzida, e tratar quimicamente as células em proliferação com agentes que induzem a desmetilação do ADN ou a acetilação de histonas, para induzir a expressão de antigénios de cancro/testículo.

2. Um método de acordo com a reivindicação 1, em que as células linfóides são linfócitos de sangue periférico extraídos de sangue heterólogo ou autólogo.

3. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os antigénios foram induzidos durante a fase logarítmica de proliferação.

4. Um método de preparação de uma composição citotóxica, que compreende preparar uma composição de apresentação de antigénios pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e utilizar a composição de apresentação de antigénios para activar linfócitos de células T activados, obtendo deste modo uma composição citotóxica que contém linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores.

5. Um método de acordo com a reivindicação 4, em que o número de linfócitos de células T se expande após a activação mediante a utilização de células dendriticas maturas. 2

6. Uma composição para induzir uma resposta imune num mamífero, que compreende células linfóides nas quais a expressão de antigénios de cancro/testiculo foi induzida quimicamente por metilação do ADN ou acetilação de histonas após a activação com células dendríticas maturas normais que não se carregaram com antigénios contra os que se deveria dirigir a reacção imune que se vai induzir.

7. Uma composição de acordo com a reivindicação 10, em que as células linfóides são linfócitos, preferentemente linfócitos de sangue periférico.

8. Uma composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que os antigénios foram induzidos durante a fase logarítmica de proliferação.

9. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, em que os linfócitos que expressam antigénios incluem células CD4+.

10. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que a desmetilação do ADN compreende o tratamento com 5-aza-2-desoxicitidina ou um inibidor da desacetilação de histonas.

11. Uma vacina para o tratamento profiláctico ou terapêutico que compreende uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 e um veículo aceitável.

12. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 para a preparação de uma 3 vacina para a estimulação de uma resposta imune contra os antigénios tumorais.

13. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 como células apresentadoras de antigénios para a activação de linfócitos T citotóxicos.

14. Um método de preparação de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores que compreende activar linfócitos T utilizando uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 como células apresentadoras de antigénios.

15. Utilização de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumores obtidos pelo método da reivindicação 14 para a preparação de uma composição farmacêutica para a imunoterapica adoptiva de células T.