PT2201100E - Aperfeiçoamento da capacidade estimulatória de células t das células que apresentam antígeno humano e o seu uso na vacinação - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"APERFEIÇOAMENTO DA CAPACIDADE ESTIMULATÓRIA DE CÉLULAS T DAS CÉLULAS QUE APRESENTAM ANTÍGENO HUMANO E O SEU USO NA VACINAÇÃO"
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção está situada no campo da imunoterapia com o uso de células que apresentam antigeno de um paciente modificadas de modo que tenham a capacidade de apresentar um antigeno especifico para alvo no paciente, levando a uma resposta imunológica mediada por hospedeiro para as células que expressam alvo. A invenção está especialmente relacionada com o aumento do efeito imunoestimulatório das células que apresentam antigeno em vista da vacinação de pacientes que sofrem de cancro ou distúrbios infeciosos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:
Ao longo dos anos, as células que apresentam antigeno como as células dendríticas (DCs) surgiram como peças chaves na orquestração de respostas imunológicas e, em particular, na indução de respostas primárias em pacientes em geral. Atualmente, as DCs podem ser geradas em grande escala em sistemas fechados, rendendo números de células suficientes para uso em testes clínicos. Simultaneamente, os antígenos derivados de microrganismos infeciosos e muitos antígenos diferentes associados a tumor, que são seletiva ou preferencialmente expressos por células tumorais, foram identificados. Além disso, uma faixa completa de estratégias para carregar as DCs com tais antígenos foi projetada. Juntas, essas constatações permitiram o início de estudos clínicos com DC carregada com antígeno em pacientes com cancro e em pacientes que sofrem de infeções. No entanto, a satisfação de respostas imunológicas e resultados clínicos não foram alcançados até o momento.
Um grande problema relacionado com o uso de DCs carregadas com um antígeno específico para alvo como células que apresentam antígeno (APCs) é que as mesmas são insuficientes no desencadeamento de uma resposta imunológica forte tanto in vitro quanto in vivo. Uma causa dessa imunoestimulação insuficiente é a manipulação in vitro complicada das DCs antes do seu uso, levando à perda das suas propriedades características, como a secreção de citocinas e outros fatores que acionam as respostas imunológicas. Outro problema é que as DCs produzidas artificialmente não expressam marcadores celulares necessários com frequência na sua superfície celular, necessários para ativar uma resposta de célula T para o antígeno específico para alvo apresentado pelas DCs superando, assim, a tolerância de célula T de ocorrência frequente em relação aos antígenos específico para alvo. É, portanto, o objetivo da presente invenção fornecer uma solução para os problemas declarados acima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores estabeleceram que a capacidade estimulatória de célula T das células que apresentam antígeno pulsadas com péptido antigénico ou células que apresentam antígeno (co-)eletroporada com um mRNA que codifica um antígeno específico para alvo pode ser muito aperfeiçoada ao fornecer as mesmas com três adjuvantes moleculares diferentes através da eletroporação com uma mistura de moléculas de mRNA ou ADN que codifica dois ou mais fatores imunoestimulatórios. A invenção fornece a prova de conceito que tais células modificadas que apresentam antigeno pulsadas com um péptido especifico para alvo ou coeletroporadas com mRNA que codifica um antigeno especifico para alvo podem estimular células T especificas para antigeno tanto in vitro quanto após a vacinação e, portanto, formar uma nova abordagem promissora para imunoterapia antitumor, antiviral, antibacteriana ou antifúngica. A invenção fornece, portanto, um método para aprimorar as características imunoestimulatórias das células que apresentam antigeno que compreende a introdução simultânea de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam proteínas que modificam a funcionalidade dos APCs, distinguido pelo facto de que, de entre as proteínas funcionais, pelo menos dois antígenos são introduzidos, selecionados a partir do grupo que compreende CD40L, CD70, caTLR4, IL-I2p70, EL-selectina, CCR7, e/ou 4-1 BBL; ou em combinação com moléculas que inibem a expressão ou função de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3. Numa modalidade específica, as estimulações específicas para antigeno realizadas sem a adição de qualquer IL-2 e/ou IL-7 exógeno para suportar a sobrevivência e proliferação de célula T. Em determinadas modalidades, as células que apresentam antigeno são adicionalmente estimuladas com fatores solúveis selecionados a partir do grupo que compreende ligantes de TLR, IFN-gama, TNF-alfa, IL-6, IL-1 beta e/ou PGE2.
De preferência, o método usado para a introdução simultânea de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes é selecionado a partir do grupo de eletroporação, transdução viral, lipofecção e transfecção de mRNA ou ADN que codifica os antigenos imunoestimulatórios. A invenção fornece adicionalmente um método para preparar um agente de imunoterapia que compreende as etapas de: a) obter ou fornecer células que apresentam antigeno, b) modificar in vitro o dito agrupamento de células que apresenta antigeno da etapa a) com pelo menos 2 antigenos imunoestimulatórios selecionados a partir do grupo que compreende CD40L, CD70, caTLR4, IL-12p70, EL-selectina, CCR7 e/ou 4-1 BBL; e/ou inibição de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3, e c) modificar in vitro o agrupamento de células que apresentam antigeno da etapa b) de modo que apresentem epitopos derivados de antigeno especifico para alvo. Nas modalidades preferenciais, o método de modificação usado na etapa b) e/ou c) é selecionado a partir do grupo de eletroporação, transdução virai, lipofecção ou transfecção de mRNA ou ADN que codifica os antigenos imunoestimulatórios.
De preferência, as proteínas imunoestimulatórias específicas e os antigenos alvo são introduzidos através de um mecanismo de uma etapa. Numa modalidade preferencial, a coeletroporação do mRNA ou ADN que codifica um antigeno específico para alvo com o mRNA ou ADN que codifica os fatores imunoestimulatórios é usada.
Em outra modalidade, a pulsação de proteína ou péptido é usada para carregar o antígeno específico para alvo ou os seus péptidos antigénicos derivados nas células que apresentam antígeno.
Uma combinação de fatores imunoestimulatórios usada nos métodos da invenção é a combinação das moléculas imunoestimulatórias CD40L, CD70 e caTLR4 usada, que é chamada de "TriMix" doravante no presente documento.
As células que apresentam antígeno usadas nos métodos da invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em células B ou células dendríticas (DCs) específicas para paciente; ou linhagens de célula dendrítica ou linhagens de célula B estabelecidas. A invenção fornece adicionalmente uma vacina que compreende o agente de imunoterapia obtido por qualquer um dos métodos da invenção mencionados acima, que compreendem adicionalmente adjuvante(s) farmaceuticamente aceitável(eis).
Numa modalidade específica, o agente de imunoterapia é direcionado para um antígeno específico para alvo que pode ser um antígeno de tumor, ou um antígeno bacteriano, virai ou fúngico. 0 dito antígeno específico para alvo pode ser derivado de qualquer um de entre: mRNA isolado total de (a) célula (s) alvo, uma ou mais moléculas de mRNA de alvo específico, lisados de proteína de (a) célula(s) alvo, proteínas específicas para (a) célula (s) alvo, ou uma proteína ou péptido específico para alvo sintético e mRNA ou ADN sintético que codifica um antígeno específico para alvo ou os seus péptidos derivados. A invenção abrange adicionalmente o uso de uma preparação de células que apresentam antigeno obtido pelo método da invenção ou o agente de imunoterapia obtido pelo método da invenção na fabricação de uma vacina com a capacidade de desencadear uma resposta imunológica num paciente com necessidade da mesma. A invenção fornece adicionalmente um método para testar por novos epitopos específicos para alvo que podem ser usados para a vacinação de pacientes, com o uso de células que apresentam antigeno obtido pelo método de imunoestimulação da invenção que compreende; a) estimular células T de doadores saudáveis ou pacientes (vacinado anteriormente ou não com uma vacina antialvo) com células que apresentam antigeno obtido pelo método de imunoestimulação da invenção; b) identificar células T específicas para o antigeno alvo usado; e c) identificar o epítopo derivado de antigeno alvo para o qual a célula T é específica.
Além disso, a invenção fornece um método de acompanhamento dos efeitos do tratamento com uma vacina antialvo num paciente; que compreende a deteção e análise da resposta imunológica em relação ao antigeno específico para alvo desencadeado no indivíduo injetado anteriormente com a vacina antialvo obtida por qualquer um dos métodos da invenção. Nas modalidades preferenciais, o paciente está a sofrer de uma doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo de: cancro, infeção bacteriana, virai ou fúngica, por exemplo, infeção por VIH ou hepatite. A invenção também fornece um kit para aprimorar as características imunoestimulatórias das células que apresentam antigeno, que compreende uma combinação de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam a proteína imunoestimulatória funcional selecionada a partir do grupo que consiste em CD40L, CD70, caTLR4, IL-12p70, EL-selectina, CCR7, e/ou 4-1 BBL, e opcionalmente que compreende moléculas que inibem a expressão ou função de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3. Numa modalidade preferencial, o kit compreende moléculas de mRNA ou ADN que codificam CD40L, CD70 e caTLR4, resultando no assim chamado "TriMix". Em determinadas modalidades, o kit da invenção compreende uma única molécula de mRNA ou ADN, em que as ditas duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam as proteínas imunoestimulatórias são combinadas. De preferência, a única molécula de mRNA ou ADN tem a capacidade de expressar as duas ou mais proteínas imunoestimulatórias simultaneamente, por exemplo, as duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam a proteína imunoestimulatória são ligadas na única molécula de mRNA ou ADN por um sítio de entrada ribossómico interno (IRES) ou uma sequência de codificação de péptido 2a autoclivante.
Além disso, a invenção fornece um método ex vivo de amplificação de células T específicas para antígeno de um paciente. 0 paciente pode ser vacinado anteriormente ou não. 0 agrupamento de células T amplificado pode, então, ser usado para nova vacinação ou adicional (reforço) do paciente. A invenção fornece, portanto, um método para a amplificação ex vivo de um agrupamento de células T de um paciente que compreende; a) obter células T de um paciente que foi vacinado antes do isolamento ou não b) colocar as células T em contacto com o agente de imunoterapia da invenção, que compreende células que apresentam antígeno da invenção, e c) identificar, isolar e expandir células T ex vivo que são especificas para o antígeno apresentado pelas células que apresentam antígeno com as quais estavam em contacto. Opcionalmente, o método compreende a seguinte etapa adicional d) administração dessas células T específicas para antígeno expandidas e estimuladas in vitro ao paciente é uma definição de transferência de célula T adotiva. A invenção fornece adicionalmente métodos de uso das células que apresentam antígeno modificadas da invenção para tratar cancro ou doenças infeciosas como infeções virais, bacterianas ou fúngicas, por exemplo, VIH e hepatite. No caso da imunoterapia ativa para cancro ou doenças infeciosas, o tratamento com células que apresentam antígeno da invenção pode ser combinado ou seguido por um tratamento não específico para imunomodulação a fim de reforçar o sistema imunológico do paciente. No caso do tratamento de cancro, isso pode representar anticorpos anti-CTLA4 ou IFN-alfa ou outros métodos de imunomodulação a fim de reforçar o sistema imunológico do paciente. 0 fornecimento das células que apresentam antígeno como células dendríticas (DCs), células B, linhagens de células dendríticas, ou linhagens de célula B com um sinal de maturação através de eletroporação de mRNA oferece várias vantagens:
Inicialmente, não há necessidade de pré-incubar as células que apresentam antígeno por até 48 horas com sinais de maturação solúvel como citocinas pró-inflamatórias ou ligantes de TLR para alcançar a ativação da célula que apresenta antigeno, que pode tornar as células "exaustas" e inferiores para propósitos de vacinação. Como um resultado, as células que apresentam antigeno eletroporado com mRNA ou ADN que codifica dois ou mais fatores imunoestimulatórios (por exemplo, o TriMix de CD40L, CD70 e caTRLA4), que podem ser injetados no paciente dentro de algumas horas após a eletroporação, amadurecerão e secretarão a maior parte de suas citocinas imunoestimulatórias e quimosinas in situ.
Em segundo lugar, foi postulado que a maturação das células que apresentam antigeno in situ assemelha-se mais ao processo fisiológico envolvido na resposta à infeção por patógeno, e, portanto, que a maturação in situ pode levar a uma imunidade de célula T aperfeiçoada. A pulsação das ditas células que apresentam antigeno com um péptido especifico para alvo resulta na apresentação do dito péptido ao sistema imunológico do paciente.
Adicionalmente, os inventores mostram que as células que apresentam antigeno eletroporado com mRNA ou ADN que codifica dois ou mais fatores imunoestimulatórios (por exemplo, o TriMix de CD40L, CD70 e caTRLA4), podem ser coeletroporadas com mRNA que codifica antigeno ao invés de serem pulsadas com péptidos antigénicos. Essa abordagem oferece várias vantagens adicionais:
Em primeiro lugar, a maturação e carregamento de antigeno das células que apresentam antigeno podem ser combinadas numa etapa simples. A obviação da etapa de pulsação de péptido na produção de vacina resulta, portanto, em menos manipulaçao das células e em menos perda de célula e risco de contaminação.
Em segundo lugar, ao usar mRNA que codifica antigeno de comprimento completo todos os epítopos antigénicos possíveis do TAA serão apresentados ao invés de alguns epítopos selecionados. Consequentemente, essa estratégia pode induzir uma resposta de célula T específica para antigeno e não é dependente de (o conhecimento de) cada haplotipo de HLA do paciente ou da identificação anterior dos epítopos derivados de antigeno.
Em terceiro lugar, o plasmídeo que codifica antigeno pode ser geneticamente modificado ao adicionar uma sequência de alvejamento de HLA classe II . Isso não roteia apenas o antigeno para os compartimentos de HLA classe II para o processamento e apresentação de péptidos derivados de antigeno restritos de HLA classe II, mas também aperfeiçoa o processamento e apresentação no contexto de moléculas de HLA classe I.
Estabeleceu-se adicionalmente, que as células que apresentam antigeno de TriMix (isto é, eletroporadas com mRNA que codifica CD40L, CD70 e caTRLA4) podem estimular de modo quase igual as células T específicas para MelanA quando eletroporadas com mRNA que codifica MelanA completo do que quando está a ser pulsado com péptido derivado de MelanA. Ademais, as células que apresentam antigeno de TriMix podem estimular as células T específicas para outros antígenos com uma frequência de precursor inferior tanto in vitro quanto in vivo.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Expressão de Transgene após a eletroporação de mRNA. (A) as DCs foram eletroporadas com CD40L apenas ou em combinação com CD70 e/ou caTLR4. Imediatamente após a eletroporação, o transporte de proteína foi bloqueado com Golgi-plug e após 4 horas, as células foram submetidas à coloração intracelular para CD40L. As DCs imaturas eletroporadas com mRNA irrelevante foram usadas como controlo negativo. Os resultados são representativos para 3 experimentos independentes. (B) as DCs foram eletroporadas com CD70 apenas ou e, combinação com CD40L e CD40L juntamente com caTLR4. Em vários pontos no tempo após a eletroporação, as DCs foram submetidas à coloração para a expressão de CD70. As DCs imaturas eletroporadas com mRNA irrelevante foram usadas como controlo negativo. Os resultados são representativos para 3 experimentos independentes.
Figura 2. Ensaio de ativação de NF-kappaB. 293 células T foram transfectadas com o plasmídeo pNFconluc de gene repórter (que codifica o gene de luciferase de vagalume acionado por um promotor responsivo a NF-kappaB mínimo) e o plasmídeo pHR-GLuc-YFP (que codifica a luciferase de Gaussia secretada humanizada fundida à proteína fluorescente amarela). Quando indicado, as células foram co-transfectadas com o plasmídeo de expressão pcDNA3-caTLR4 ou pcDNA3-CD27. De nota, as 293 células T expressam de modo endógeno CD40. As transfecções foram realizadas em triplicado e as quantidades totais de plasmídeo foram mantidas constantes ao adicionar plasmídeo pcDNA3 vazio. Após a transfecção, lxlO5 DCs eletroporadas com mRNA de CD40L ou CD70 foram adicionadas quando indicado. Após 24h, as atividades de luciferase foram determinadas e normalizadas com base na atividade de luciferase de Gaussia secretada. Os resultados são mostrados como média mais/menos EP e são representativos para 3 experimentos independentes.
Figura 3. Eletroporação de DCs imaturas com mRNA de CD40L e/ou caTLR4 induz a maturação fenotipica, secreção de IL-12 aperfeiçoada e estimulação de células T CD4+ virgens para diferenciar nas células que secretam IFN-gama. (A) as DCs eletroporadas com combinações diferentes de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 foram submetidas à coloração após 24 horas para moléculas coestimulatórias CD40, CD80, CD83 e CD86 e para moléculas de HLA classe I. A percentagem de células positivas e a intensidade de fluorescência média são indicadas. Os resultados são representativos para pelo menos 8 experimentos independentes. (B) IL-12p70 produzido dentro de 24 horas após a eletroporação foi doseado no sobrenadante. Cada ponto representa um experimento individual e a média é indicada por uma linha horizontal. (C) as DCs eletroporadas foram usadas para estimular células T CD4+ virgens CD45RA+ alogénicas. Seis dias depois, as células T CD4+ foram reestimuladas com esferas expansoras de célula T CD3/CD28. Após 24 horas, a secreção de IFN-gama foi avaliada no sobrenadante por ELISA. Cada ponto representa um experimento individual e a média é indicada por uma linha horizontal.
Figura 4. Maior indução de células T CD8+ especificas para MelanA restritas a HLA-A2, células T CD8+ citoliticas e células T CD8+ que secretam IFN-gama/TNF-alfa por DCs eletroporadas com combinações diferentes de CD40L, CD70 e caTLR4 mRNA e pulsadas com péptido de MelanA-A2. (A) células T CD8+ virgens foram estimuladas 3 vezes com DCs pulsadas com péptido eletroporadas. Então, as células T foram contadas e submetidas à coloração para especificidade de CD8 e MelanA. 0 aumento em vezes em relação às DCs imaturas eletroporadas com mRNA irrelevante é mostrado. Cada ponto representa um experimento individual e a média é indicada por uma linha horizontal. (B) a atividade citolitica das células T especificas para MelanA foi determinada por um ensaio de mobilização de CD107a. As células T iniciadas foram reestimuladas com células T2 pulsadas com péptido de gag ou MelanA na presença de mAB anti-CD107-PE-Cy5 e Golgi-stop. Após a cultura de um dia para o outro, as células foram colhidas, submetidas à coloração com anti-CD8-FITC e analisadas por citometria de fluxo. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. (C) A produção de IFN-gama/TNF-alfa intracelular por células T CD8+ iniciadas por MelanA foi medida por citometria de fluxo. As células T iniciadas foram reestimuladas com células T2 pulsadas com péptido de gag ou MelanA na presença de Golgi-plug. Após a cultura de um dia para o outro, as células T foram submetidas à coloração para positividade de CD8, IFN-gama e TNF-alfa. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. A percentagem das células que secretam IFN-gama e/ou TNF-alfa é dada, após a subtração de resposta basal induzida por T2 pulsada com péptido gag. Os resultados nos painéis (B) e (C) são dados para o Experimento 2 (consulte a Tabela 2) . A percentagem de células positivas de tetrâmero MelanA-A2 é indicada. Para todos os outros experimentos, a positividade de CD107a e secreção de IFN-gama/TNF-alfa correlacionada com a percentagem de células T específicas para MelanA presentes na cultura. (D) Fenótipo de células T CD8+ específicas para MelanA. As células T foram submetidas à coloração para positividade de tetrâmero de CD8 e MelanA-A2 em combinação com os marcadores de célula T a seguir: CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CCR7 e CD62L. Os resultados são mostrados para as células T CD8+ específicas para MelanA induzidas por DCs eletroporadas com mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 e são representativas para todas as células T CD8+ específicas para MelanA, independentemente de quais DCs foram usadas para a estimulação.
Figura 5. Eficácia de eletroporação, fenótipo e secreção de IL-12p70 por DCs eletroporados somente com mRNA de TriMix ou em combinação com mRNA de antigeno tumoral. (A) as DCs foram eletroporadas com somente mRNA de TriMix (mRNA que codifica CD40L, CD70 e caTLR4) ou em combinação com mRNA de antigeno tumoral. Vinte de quatro horas depois, a eficácia de eletroporação foi investigada por coloração para a expressão de CD70 de superfície. As DCs imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante foram usadas como controlo negativo. Os resultados são representativos para pelo menos 5 experimentos independentes. (B) Vinte e quatro horas após a eletroporação, as DCs foram submetidas à coloração para moléculas coestimulatórias CD40, CD80, CD83 e CD86 e para moléculas de HLA classe I e II. A percentagem de células positivas e a intensidade de fluorescência média são indicadas. 0 fenótipo é comparado com as DCs amadurecidas com coquetel de citocina e imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante. Os resultados são representativos para pelo menos 5 experimentos independentes. (C) IL-12p70 produzido dentro de 24 horas após a eletroporação foi doseado no sobrenadante. Cada ponto representa um experimento individual e a média é indicada por uma linha horizontal.
Figura 6. Indução in vitro de células T CD8+ específicas para MelanA restritas a HLA-A2 e células T CD8+ que secretam IFN-gama/TNF-alfa por DCs eletroporadas com mRNA de TriMix (mRNA que codifica CD40L, CD70 e caTLR4) pulsadas com péptido antigénico ou coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral. (A) As células T CD8+ virgens foram estimuladas 3 vezes, com um intervalo semanal com DCs de TriMix, isto, DCs eletroporadas com uma mistura de moléculas de mRNA que codificam as proteínas imunoestimulatórias CD40L, CD70 e caTRLA4). A cada semana, as células T foram contadas, submetidas à coloração para especificidade de CD8 e MelanA e o número absoluto de células CD8+ específicas para MelanA presentes na cultura foi calculado. A percentagem relativa em comparação ao número de células T CD8+ específicas para MelanA obtida após 3 estimulações com DCs de TriMix pulsadas com péptido MelanA-A2 (estabelecida em 100 por cento) é mostrada. (B) A situação de ativação e atividade citolítica de células T específicas para MelanA foi determinada por um ensaio de CD137/CD107a. As células T iniciadas foram reestimuladas com células T2 pulsadas com péptido de gag ou MelanA na presença de mAB anti-CD107-PE-Cy5 e Golgi-stop. Após a cultura de um dia para o outro, as células foram colhidas, submetidas à coloração com anti-CD8-FITC, CD137-PE e analisadas por citometria de fluxo. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. A percentagem das células duplamente positivas CD137/CD107a é dada, após a subtração de resposta basal induzida por T2 pulsada com péptido gag. (C) A produção de IFN-gama/TNF-alfa intracelular por células T CD8+ iniciadas por MelanA foi medida por citometria de fluxo. As células T iniciadas foram reestimuladas de um dia para o outro com células T2 pulsadas com péptido de gag ou MelanA na presença de Golgi-plug. Então, as células T foram submetidas à coloração para positividade de CD8, IFN-gama e TNF-alfa. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. A percentagem das células que secretam IFN-gama e/ou TNF-alfa é dada, após a subtração de resposta basal induzida por T2 pulsada com péptido gag. Os resultados nos painéis B e C são dados para o Experimento 1 (consulte a Tabela 3). Em cada experimento, a positividade de CD137/CD107a e secreção de IFN-gama/TNF-alfa correlacionada com a percentagem de células T específicas para MelanA presentes na cultura.
Figura 7. Capacidade estimulatória de célula T CD4+das DCs de TriMix pulsadas com péptido antigénico ou coeletroporadas com mRNA de antígeno tumoral. As DCs foram pulsadas com o péptido Mage-A3-DP4 ou coeletroporadas com mRNA de MageA3-DCLamp. Quatros horas depois, as células foram cocultivadas com células T restritas a HLA-DP4 específicas para Mage-A3 por 20 horas. As DCs imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante foram usadas como um controlo negativo. A produção de IFN-gama é mostrada. Cada ponto representa um experimento individual e a média é indicada por uma linha horizontal.
Figura 8. Indução de células T CD8+ especificas para outros antígenos além de MelanA em pacientes com melanoma tanto in vitro quanto in vivo. (A) As DCs de TriMix preparadas para vacinação foram usadas para estimular as células T CD8+ isoladas do sangue dos pacientes com melanoma HLA-A2+ antes da vacinação. As DCs maturadas com coquetel de citocina pulsadas com péptido específico para gplOO, Tirosinase, Mage-C2, Mage-A3 ou restringido a HLA-A2 foram usadas como controlo. Após 3 estimulações semanais, as células foram submetidas à coloração com um painel de tetrâmeros de HLA- A2 carregados com péptidos específicos para Mage-A3, Mage-C2, Tirosinase ou gplOO e Ab anti-CD8. As células T CD8 + específicas para TAA foram então identificadas por citometria de fluxo. A coloração basal com tetrâmeros de HLA-A2 específicos para NY-ESO-1 foi subtraída. (B) Situação de ativação e atividade citolítica das células T CD8+ dos pacientes com melanoma antes ou após a vacinação com DCs de TriMix foi determinada por um ensaio de CD107a/137. As células T CD8 + isoladas do sangue de pacientes com melanoma HLA-A2+ antes ou após a vacinação com DCs de TriMix foram estimuladas 2 vezes in vitro com as mesmas DCs que usadas para a vacinação. Uma semana após a última estimulação, as células foram reestimuladas de um dia para o outro com DCs madura eletroporadas com mRNA de TAA ou NGFR como controlo irrelevante na presença de mAb anti-CD107-PE-Cy5 e Golgi-stop. As células foram colhidas, submetidas à coloração com antÍ-CD8-FITC, CD137-PE e analisadas por citometria de fluxo. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. A percentagem das células duplamente positivas de CD137/CD107a é dada. (C) A produção de citocina das células T CD8+ dos pacientes com melanoma antes ou após a vacinação com DCs de TriMix foi determinada por coloração de citocina intracelular. As células T CD8+ isoladas do sangue de pacientes com melanoma HLA-A2+ antes ou após a vacinação com DCs de TriMix foram estimuladas 2 vezes in vitro com as mesmas DCs que usadas para a vacinação. Uma semana após a última estimulação, as células foram reestimuladas de um dia para o outro com DCs madura eletroporadas com mRNA de TAA ou NGFR como controlo irrelevante na presença de Golgi-plug. Então, as células T foram submetidas à coloração para positividade de CD8, IFN-gama e TNF-alfa. As células T foram separadas em características de FSC/SSC e positividade de CD8. A percentagem de células que secretam IFN-gama e/ou TNF-alfa é dada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na procura por novos métodos para produzir vacinas anticancro, os inventores investigaram se o estado de ativação de DCs é um fator critico na determinação de se as DCs que apresentam um antigeno especifico para alvo serão indutores potentes de uma resposta imunológica antialvo após a vacinação ou não. Os inventores constataram, inesperadamente, que a eficácia dos protocolos de vacinação de DC usados atualmente poderia ser aprimorada de forma significativa ao fornecer as DCs com um sinal de ativação mais potente e ao utilizar um processo de manipulação mais curto.
Através da invenção, o termo "TriMix" significa uma mistura de moléculas de mRNA que codificam as proteínas imunoestimulatórias CD40L, CD70 e caTRLA4.
Através da invenção o termo "DCs de TriMix" ou "células que apresentam antigeno de TriMix" significa, respetivamente, células dendríticas ou células que apresentam antigeno que foram modificadas para expressar a mistura TriMix de moléculas de mRNA que codificam as proteínas imunoestimulatórias CD40L, CD70 e caTLR4. 0 termo "alvo" usado através da descrição não se limita aos exemplos específicos que podem ser descritos no presente documento. Qualquer agente infecioso como um vírus, uma bactéria ou um fungo pode ser alvejado. Além disso, qualquer tumor ou célula cancerígena pode ser alvejada. 0 termo "antígeno específico para alvo" usado através da descrição não se limita aos exemplos específicos que podem ser descritos no presente documento. Será evidente para a pessoa versada que a invenção refere-se à indução de imunoestimulação em células que apresentam antígeno, independente do antígeno específico para alvo que é apresentado. 0 antígeno que está a ser apresentado dependerá do tipo de alvo para o qual se pretende desencadear uma resposta imunológica num indivíduo. Os exemplos típicos de antígenos específicos para alvo são marcadores expressos ou secretados que são específicos para células tumorais, bacterianas e fúngicas ou para proteínas virais específicas ou estruturas virais.
Sem desejar limitar o âmbito de proteção da invenção, alguns exemplos de marcadores possíveis são listados abaixo. 0 termo "células que apresentam antígeno" usado por toda a descrição inclui todas as células que apresentam antígeno. Exemplos não limitadores específicos são células dendríticas, linhagens de células dendríticas, células B, ou linhagens de célula B. As células dendríticas ou células B podem ser isoladas ou geradas a partir do sangue de um paciente ou indivíduo saudável. 0 paciente ou indivíduo pode ter sido o indivíduo de vacinação anterior ou não.
Os termos "cancro" e/ou "tumor" usados por toda a descrição não se destinam a ser limitados aos tipos de cancro ou tumores que podem ter sido exemplificados. 0 termo, portanto, abrange todos os distúrbios proliferativos como neoplasma, displasia, lesões pré-malignas ou pré-cancerosas, crescimentos celulares anormais, tumores benignos, tumores malignos, cancro ou metástase, em que o cancro é selecionado a partir do grupo de: leucemia, cancro pulmonar de célula não pequena, cancro pulmonar de célula pequena, cancro do SNC, melanoma, cancro do ovário, cancro do rim, cancro da próstata, cancro da mama, glioma, cancro do cólon, cancro da bexiga, sarcoma, cancro pancreático, cancro colorretal, cancro da cabeça e pescoço, cancro de figado, cancro do osso, cancro da medula óssea, cancro do estômago, cancro do duodeno, cancro esofágico, cancro da tiroide, cancro hematológica e linfoma. Os antigenos específicos para cancro podem, por exemplo, ser MelanA/MARTl, antigenos de cancro de linha germinal, gplOO, Tyrosinase, CEA, PSA, Her-2/neu, survivina, telomerase. 0 termo "doença infeciosa" ou "infeção" usado através da descrição não se destina a ser limitado para os tipos de infeções que podem ter sido exemplificados no presente documento. 0 termo, portanto, abrange todos os agentes infeciosos para os quais a vacinação seria benéfico para o indivíduo. Os exemplos não limitadores são as seguintes infeções causadas por vírus ou distúrbios: Síndrome de Imunodeficiência Adquirida - Infeções por Adenovirus Infeções por Alfavírus - Infeções por Arbovirus - Paralisia de Bell - Doença de Borna - Infeções por Buniavirus -Infeções por Calicivírus - Catapora - Constipação Comum -Condiloma acuminado - Infeções por Coronavírus - Infeções por vírus de Coxsackie - Infeções por Citomegalovirus -Dengue - Infeções por Vírus ADN - Ectima Contagioso -Encefalite - Encefalite por Arbovirus - Encefalite, Herpes Simples - Infeções por vírus Epstein-Barr - Eritema infecioso - Exantema súbito - Síndrome de Fadiga crónica -Infeções por Hantavirus - Febres Hemorrágicas Virais -Hepatite Virai Humana - Herpes labial - Herpes simples -
Herpes Zoster - Herpes Zoster Oticus - Infeções por Herpesvirus - Infeções por VIH - Mononucleose Infeciosa -Influenza Aviária - Influenza Humana - Febre de Lassa -Sarampo - Meningite Virai - Molusco contagioso - Poxvirus do Macaco - Papeira - Mielite - Infeções por Papillomavirus - Infeções por Paramixovírus - Febre por flebótomos Poliomielite - Infeções por Poliomavirus - Sindrome Pós-Poliomielite - Raiva - Infeções por Virus Sincicial Respiratório - Febre do vale do Rift - Infeções por virus de ARN - Rubéola - Sindrome Respiratória Aguda Grave -Doenças por Vírus Lento - Varíola - Panencefalite Esclerosante Subaguda - Doenças Transmitidas por Carrapatos - Infeções Tumorais por Vírus - Verrugas - Febre do Nilo Ocidental - Viroses - Febre amarela - Zoonoses - Etc. Os antígenos específicos para vírus podem ser VIH-gag, - tat, -rev ou -nef, ou antígenos de Hepatite C.
Os exemplos não limitadores adicionais são as infeções causadas por vírus ou fungo ou distúrbios: Abscesso -Actinomicose - Anaplasmose - Antraz - Artrite Reativa -Aspergilose - Bacteremia - Infeções Bacterianas e Micoses -Infeções por Bartonella - Botulismo - Abscesso Encefálico -Brucelose - Infeções por Burkholderia - Infeções por
Campylobacter - Candidíase - Candidíase, Vulvovaginal -Doença de Arranhão de Gato - Celulite - Infeções do Sistema Nervoso Central - Cancro Mole - Infeções por Clamídia -Infeções por Clamidiáceas - Cólera - Infeções por
Clostridium - Coccidioidomicose - Úlcera da Córnea -Infeção Cruzada - Criptococose - Dermatomicoses - Difteria - Erliquiose - Empiema, Pleural - Endocardite Bacteriana -
Endoftalmite - Enterocolite, Pseudomembranosa - Erisipela -Infeções por Escherichia coli - Fasciite Necrosante
Gangrena de Fournier - Furunculose - Infeções por
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Como uma alternativa para caTLR4, outros recetores semelhantes a Toll (TLR) poderiam ser utilizados. Para cada TLR, uma forma ativa constitutiva é conhecida e poderia ser possivelmente introduzida nas DCs a fim de desencadear uma resposta imunológica do hospedeiro. Na presente vista, entretanto, caTLR4 é a molécula de ativação mais potente e é, portanto, preferencial. A introdução de mRNA que codifica uma citocina adicional, como IL-12p70 nas DCs poderia ser benéfica para aumentar, adicionalmente, a excreção de citocina das DCs, estimulando ainda, subsequentemente, a resposta imunológica do hospedeiro. A introdução adicional de EL-selectina ou CCR7 nos DCs poderia ser benéfica para promover a migração in vivo dos DCs manipulados em direção aos linfonodos, o local em que a resposta imunológica é naturalmente iniciada no hospedeiro.
As moléculas coestimulatórias adicionais, como 4-1 BBL ou uma forma constitutivamente ativa de Akt poderia também ser introduzida nas DCs.
Além disso, a expressão e/ou função de moléculas inibitórias, como SOCS, A20, PD-L1, STAT3 poderia ser reduzida ou interrompida através da introdução adicional de moléculas inibitórias especificas, como moléculas de siRNA especificas nas DCs. A incubação in vitro adicional das DCs com fatores solúveis, como ligantes de TLR, IFN-gama, TNF-alfa, IL- 6, PGE2 e/ou IL—1 beta poderia também ser utilizada para a maturação das DCs. A invenção usa, de preferência, DCs derivadas a partir de células monocelulares de sangue periférico (PBMCs) diretamente isoladas a partir do sangue do paciente, mas alternativas, como DCs diferenciadas a partir de células positivas para CD34 ou linhagens de células dendriticas disponíveis comercialmente poderiam também ser utilizadas. 0 método da invenção usa eletroporação de mRNA, transdução viral (por exemplo, através de lentivírus, adenovirus ou vírus vaccinia), lipofecção de mRNA ou transfecção de ADN para introduzir moléculas imunoestimulatórias e antígenos específicos para alvo nas DCs. A eletroporação de mRNA é especialmente preferencial devido a sua alta eficácia e seu amplo uso aceito em ambientes clínicos em contraste com a transdução virai. Para a introdução dos antígenos específicos para alvo, a pulsação das células com os péptidos específicos para antígeno ou com proteína pode ser utilizada como uma alternativa para a eletroporação de mRNA. 0 mRNA introduzido pode ser uma sequência especificamente sintetizada com base em marcadores específicos para tumor conhecidos, ou pode ser isolada a partir de (a) linhagem(ns) de células de tumor ou a partir de uma biopsia de tumor do paciente.
Para a produção dos DCs, a invenção usa, de preferência, o plasma autólogo obtido a partir do paciente, mas o soro AB humano que é comercialmente disponível pode também ser utilizado. A introdução simultânea de CD40L e CD70 em DCs, conduz a efeitos imunoestimulatórios aumentados das DCs. Numa modalidade preferencial, a combinação específica para CD40L, CD70 e caTLR4 é utilizada para aprimorar os efeitos imunoestimulatórios das DCs. Em ambas as modalidades, qualquer um de entre os marcadores a seguir poderiam ser introduzidos simultaneamente: IL-12p70, EL-selectina, CCR7, 4-1 BBL para expressão aumentada ou inibição de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3. Adicionalmente aos adjuvantes moleculares, um antígeno específico para alvo ou os seus epítopos derivados são introduzidos nas DCs a fim de possibilitar que as mesmas desencadeiem uma resposta imunológica de célula T em direção ao antígeno específico para alvo. Várias combinações listadas acima mostraram ter efeitos imunoestimulatórios inesperadamente altos sobre as DCs. Vários obstáculos precisaram de ser superados para que o método funcionasse. Inicialmente avaliou-se a expressão de transgene de CD40L após a eletroporação em células K562 e DCs. Embora CD40L pudesse ser prontamente detetada sobre a membrana de células K562 eletroporadas até 24 h após a eletroporação, o mesmo não pode ser detetado sobre a membrana de DC. Isso é provavelmente devido ao facto de que a proteína de CD40L recém sintetizada encontra CD40 sobre a membrana de DC e é re-internalizada, um processo que não pode ocorrer em células K562 negativas para CD40. De facto, quando o tráfego trans-Golgi de CD40L foi bloqueado com brefeldina A, a proteína de CD40L intracelular pode ser detetada nas DCs.
Embora a forte expressão de CD70 em DCs murinas maduras tenha sido relatada após a ligação de CD40 e TLR sozinha ou em combinação, muito pouco é conhecido sobre a expressão de CD70 em DCs humanas. Por outro lado, as DCs imaturas, DCs amadurecidas por coquetel de citocina ou DCs eletroporadas com CD40L e/ou TLR4 não expressam CD70. Até após a ligação de CD40 combinada através de CD40L associada a 3T6 e ligação de TLR através de LPS ou dsRNA, apenas uma percentagem menor de DCs mostrou a expressão de CD70. Se essa expressão baixa de CD70 por DCs humanas for um fenómeno geral ou pudesse ser relacionado com o presente protocolo de geração de DC, permanece estabelecida.
Esses experimentos mostram claramente que a simples extrapolação do conceito imunoestimulatório de murganho para a situação humana é de nenhuma maneira direta. Em contrapartida, se tem de induzir-se explicitamente a expressão de CD70 através da eletroporação de mRNA de CD70 em DCs humanas. Só então poderia ser estabelecida uma forte expressão que persistisse por vários dias, o qual deveria possibilitar que as DCs interagissem com células T CD27 + durante um período prolongado de tempo.
Embora fosse tecnicamente impossível investigar a expressão da proteína de caTLR4, o ensaio de ativação de NF-kappaB indica que a eletroporação de mRNA do presente plasmídeo caTLR4 conduz à expressão de uma proteína funcional. Em paralelo, pode mostrar-se também que os plasmídeos CD40L e CD70 codificam proteínas funcionais, uma vez que DCs CD40L e CD70 eletroporadas ativam a rota de sinalização de NF-kappaB após a ligação de CD40 e CD27, respetivamente.
Num experimento adicional, os inventores investigaram o efeito da eletroporação de CD40L, CD70 e caTLR4 em diferentes combinações no fenótipo de DC, o seu padrão de secreção de citocina/quimiocina e a sua capacidade para estimular as células T CD4+ virgens. Para todas as três propriedades testadas, as mesmas conclusões podem ser tiradas: [1] Tanto a eletroporação de CD40L como de caTLR4 em DCs induziram a maturação fenotípica, a secreção de citocina/quimiocina aperfeiçoada e essas DCs eletroporadas estimularam as células T CD4+ virgens a tornarem-se células T do tipo Thl produtoras de IFN-gama, [2] Combinação de CD40L com eletroporação de caTLR4 estimulam ainda mais o efeito, enquanto [3] a (co-) eletroporação de CD70 não teve efeito sobre o fenótipo e a secreção de quimiocina/citocina (que é conforme esperado devido ao facto de que a DC não expressa o ligante de CD70 (CD27).
No nível de fenótipo, observou-se uma expressão aperfeiçoada das moléculas coestimulatórias CD40, CD80, CD83, CD86 e das moléculas de HLA classe I. Convém destacar que o empenho de CD40 através da eletroporação de CD40L não confere a regulação ascendente da expressão de CD40. No nível de secreção de citocina, descobriu-se uma regulação ascendente marcada na secreção da citocina Thl IL-12p70, várias citocinas pró-inflamatórias (IL-1 beta, IL-6, TNF-alfa), fatores de crescimento hematopoiéticos (G-CSF, GM-CSF) , IFN-gama, e IL-10. No nível de secreção de quimiocina, a secreção aperfeiçoada de IL-8 (recrutamento de neutrófilos), MIP-1 alfa (recrutamento de monócitos e células T) , IP-10 (proteína 10 kDa induzível por IFN-gama; recrutamento de monócitos e células T) e RANTES (recrutamento de células T, basófilos e eosinófilos) foram observados. MIP-1 alfa, RANTES e IP-10 são todos quimiotát icos para células T, mas tem sido mostrado que MIP-1 alfa e RANTES são produzidos por DCs promotoras de Thl/Th2, enquanto que a produção de IP-10 é restrita às DCs promotoras de TM. A (co-) eletroporação de CD70 não induz mudanças fenotípicas ou secreção de citocina/quimiocina aperfeiçoada por DCs, devido ao facto de que as DCs são desprovidas da expressão de seu ligante de sinalização CD27 . 0 padrão de secreção de citocina e secreção de quimiocina sugere que as DCs eletroporadas com CD40L e/ou caTLR4 mRNA iria induzir, preferencialmente, as células Thl produtoras de IFN-gama, uma descoberta que foi confirmada na estimulação alogénica de células T CD45RA+ CD4+. De facto, as células T estimuladas com DCs eletroporadas com CD40L e caTLR4, sozinhas ou em combinação, produziram quantidades muito altas de IFN-gama, mas quase nenhum IL-4 e IL-10, cuja secreção não foi aumentada em comparação com células T estimuladas com DCs eletroporadas com mRNA irrelevante. Não foi observada uma secreção de IFN-gama aumentada por células T CD4 + estimulada com DCs (co-)eletroporadas de CD7 0, demonstrando que as DCs que expressam CD70 humana não instruem diretamente para o desenvolvimento de Thl e secreção de IFN-gama. Todavia, as DCs que expressam CD70 humana poderiam sensibilizar as células T CD4+ virgens em direção ao desenvolvimento de Thl através da indução de T-bet e IL-12Rbeta2.
Num experimento a seguir, os inventores analisaram se as DCs eletroporadas com diferentes combinações de CD40L, CD70 e caTLR4 mRNA exerceram funções coestimulatórias num ambiente especifico para antigeno. De facto, poderia ser mostrado que DCs pulsadas por péptido MelanA-A2 que expressam CD40L, CD70 e caTLR4 em diferentes combinações induziram números aumentados de células T CD8+ especificas para MelanA, com a combinação de todas as três moléculas produzindo a melhor estimulação. DCs eletroporadas com CD70 sozinha não estimularam um número aumentado de células T CD8+ especificas para MelanA em comparação com DCs eletroporadas com NGFR mRNA. Em contrapartida, a coeletroporação de CD70 com CD40L, juntamente ou não com caTLR4, induziu um aumento adicional de células T especificas para MelanA, quando comparadas a DCs eletroporadas com CD40L juntamente ou não com caTLR4. Isso é provavelmente devido a um efeito de sobrevivência induzido pela ligação de CD70 nas DCs com CD27 sobre as células T durante a estimulação.
Após ter estabelecido que a expressão de CD40L, caTLR4 e CD70 por DCs aumenta sua capacidade para estimular células T CD8+ específicas para MelanA, investigou-se as propriedades fenotípicas e funcionais das células T estimuladas. Em correlação com o número aumentado de células T CD8+ específicas para MelanA, mais células produtoras de IFN-gama/TNF-alfa foram geradas e um número maior de células T CD8+ com uma capacidade citolítica poderia ser detetado. Mediante a análise do fenótipo das células T CD8+ específicas para MelanA, todas as células pareceram ser CD45RA"CD45RO+CD27+CD28+, juntamente com uma expressão variável de CD62L e CCR7. Isso indica que as células T de memória central (CD62L+ e CCR7+) têm sido induzidas, assim como as células T de memória efetoras ou células EMI (CD62L" e CCR7), dependendo da nomenclatura.
Os resultados dos experimentos listados abaixo nos exemplos estabelecem claramente uma prova de princípio que as DCs coeletroporadas com mRNA que codifica múltiplas proteínas estimulantes e pulsadas com péptido antigénico são estimuladores de célula T melhores que as DCs maturadas com coquetel de citocina ou imaturas. Ademais, é possível coeletroporar essas DCs com mRNA que codifica antígeno específico para alvo, fornecendo, assim, seu espectro antigénico total. Os dados adicionais em que as DCs foram coeletroporadas com CD40L, CD70, e caTLR4 mRNA juntamente com mRNA que codifica o antígeno MelanA ligado ao sinal de alvejamento de HLA classe II de D CLAMP indicam que essas células são também superiores na indução de células T CD8+ específicas para MelanA, conduzindo a um aumento adicional de 300 em comparação com DCs imaturas. Os dados sugerem que as DCs coeletroporadas com CD40L, CD70 e caTLR4 mRNA são também capazes de iniciar células T específicos para antígenos associados a alvo além de MelanA, em particular, para MAGE-A3, gplOO e tirosinase; antígenos para os quais frequências menores de precursor de célula T foram relatadas. É evidente que a presente invenção não deveria ser considerada como limitada aos exemplos utilizados para provar o conceito de usar as células que apresentam antigeno da invenção para criar uma resposta imunológica num indivíduo. Qualquer antigeno possível ao qual uma resposta imunológica poderia ser benéfica para um indivíduo pode ser previsto e é uma parte integral da invenção. Os marcadores podem ser marcadores específicos para tumor ou podem ser específicos para vírus, específicos para bactéria ou específicos para fungo. A invenção fornece pela primeira vez evidência que as DCs geneticamente modificadas que expressam pelo menos duas moléculas estimulantes selecionadas a partir de várias dentre CD40L, CD70 e caTLR4, IL-12p70, EL-selectina, CCR7, 4-1 BBL; ou em combinação com a supressão de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3 oferecem uma vacina baseada em DC que possui todas as características consideradas necessárias para a indução de respostas imunológicas reativas a alvo ideais. Numa modalidade preferencial da invenção, a combinação de moléculas estimulantes é o TriMix de CD40L, CD70 e caTLR4. É importante o facto de que, nos métodos da invenção, todas as estimulações específicas para antigeno foram realizadas sem a adição de qualquer IL-2 e/ou IL-7 exógeno para suportar a sobrevivência e proliferação de célula T, que está em contraste com a maioria dos estudos que relatam estimulações in vitro. De acordo com a presente opinião, a omissão de citocinas exógenas cria um ambiente menos artificial e é mais próximo à situação in vivo. De facto, tem sido mostrado que a adição de 50 IU/mL de IL-2 durante a estimulação específica para antigeno não teve efeito sobre o número de células T específicas para antigeno induzidas, mas influenciou o perfil funcional das células T específicas induzidas, ou seja, mediante o aumento tanto do número de líticos como de células T secretoras de IFN-gama/TNF-alfa, indicando que a adição de citocinas exógenas a estimulações de célula T pode alterar o resultado de técnicas de monitoramento. 0 uso dos métodos da invenção tem uma vantagem adicional sobre a técnica anterior, pelo facto de que a manipulação in vitro das DCs é reduzida a um minimo a fim de impedir a excreção de citocinas fisiologicamente relevantes no meio de cultura in vitro. Isso é alcançado através do uso de um método de transdução de uma etapa altamente eficaz, de preferência, através da eletroporação de mRNA, possibilitando a introdução simultânea de pelo menos duas moléculas de mRNA que codificam adjuvantes moleculares (possivelmente em combinação com um antígeno específico para alvo) . Isso possibilita que as DCs libertem as suas citocinas naturais no seu ambiente futuro, seja in vitro para os experimentos ou in vivo no paciente, conduzindo para uma resposta imunológica de célula T aumentada.
Numa modalidade adicional, as DCs da invenção são úteis em métodos para a identificação de novos marcadores específicos para alvo. As DCs modificadas podem ser utilizadas para estimular células T a partir de doadores saudáveis ou pacientes que têm cancro ou uma doença infeciosa, que foram ou não anteriormente vacinados com uma vacina que contém um antígeno específico para alvo. Subsequentemente, após uma ou mais estimulações com DCs modificadas, as células T específicas para antígeno alvo podem ser identificadas e o epítopo derivado de antígeno alvo contra o qual as células T estão a responder, podem ser caracterizadas.
Foi inicialmente mostrado que as DCs derivadas de monócito humano eletroporadas com mRNA que codifica CD40L, CD70 e caTLR4 mRNA (criando, assim, DCs de TriMix), adquirem um fenótipo maduro, aperfeiçoam a sua secreção de citocina e secreção de quimiocina e têm uma capacidade aumentada para inclinar CD4+ virgem para uma resposta Th 1 e para induzir células T CD8+ especificas para MelanA quando pulsadas com o péptido MelanA-A2 imunodominante.
Adicionalmente, os inventores mostram que DCs de TriMix podem ser coeletroporadas com mRNA que codifica antigeno tumoral em vez de serem pulsadas com péptidos antigénicos. Essa abordagem oferece várias vantagens adicionais. Inicialmente, a maturação e o carregamento de antigeno tumoral das DCs podem ser combinados numa etapa simples. A remoção da etapa de pulsação de péptido na produção de vacina resulta, dessa forma, em menor manipulação das células e em menor perda de células e risco de contaminação. Em segundo lugar, com o uso de mRNA que codifica antigeno tumoral de comprimento total, todos os epitopos antigénicos possíveis do antigeno tumoral serão apresentados em vez de alguns epitopos selecionados. Consequentemente, essa estratégia poderia induzir uma resposta de célula T específica para antigeno tumoral mais ampla e não é dependente do conhecimento de cada haplótipo de HLA do paciente ou da identificação anterior de epitopos derivados de antigeno tumoral. Em terceiro lugar, o plasmídeo que codifica antigeno tumoral pode ser geneticamente modificado mediante a adição de uma sequência de alvejamento de HLA classe II. Isso não encaminha apenas o antigeno tumoral para os compartimentos de HLA classe II para o processamento e apresentação de péptidos derivados de antigeno tumoral restringidos a HLA classe II, mas também aperfeiçoa o processamento e a apresentação no contexto de moléculas de HLA classe I.
Os inventores confirmaram que não houve diferenças na eficácia de eletroporação, maturação potencial e secreção de citocina quando DCs de TriMix foram preparadas como tal ou coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral.
Adicionalmente, os inventores mostraram a capacidade de DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral para estimular tanto células T CD8+ restringidas a HLA-A2 como especificas para MelanA e compará-las às DCs de TriMix pulsadas com péptido. Foi observado que DCs de TriMix coeletroporadas com sig-MelanA-DCLamp mRNA tiveram, de facto, capacidade para iniciar células T CD8+ especificas para MelanA a partir do sangue de doadores saudáveis e que, semelhante às suas contrapartes pulsadas com péptido, foram muito mais potentes que DCs maturadas com coquetel de citocina ou imaturas.
Quando comparado a DCs de TriMix pulsadas com péptido, os inventores observaram que após 1 ou 2 estimulações, DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral foram ligeiramente menos potentes que DCs de TriMix pulsadas com péptido, enquanto que, após 3 estimulações, foram igualmente potentes em 2 de 4 experimentos. Embora as DCs de TriMix coeletroporadas pareçam induzir um número menor de células T específicas para epítopo que suas contrapartes pulsadas com péptido nesse ambiente, isso não necessariamente significa que as mesmas serão menos eficazes quando utilizadas para propósitos de vacinação, e isso por várias razões. Inicialmente, mediante a investigação da funcionalidade qualitativa das células T induzidas, observou-se consistentemente que as células T estimuladas com DCs de TriMix coeletroporadas induziram mais células que secretam tento IFN-gama como TNF-alfa. Ademais, a intensidade da fluorescência média da coloração de IFN-gama intracelular foi aumentada, indicando que mais citocina por célula tinha sido produzida. Esses dados sugerem que essas células T são multifuncionais, os quais têm sido correlacionados com uma função efetora melhor. Em segundo lugar, conforme discutido anteriormente, mediante a eletroporação de mRNA de antigeno tumoral de comprimento total ligado a um sinal de alvejamento de HLA classe II nas DCs, todos os epitopos antigénicos são introduzidos, incluindo epitopos não identificados e epitopos restringidos a todos os possíveis haplótipos de HLA que são HLA classe I, assim como classe II. Portanto, essa abordagem é propensa a induzir uma resposta de célula T específica para TAA mais ampla. 0 péptido imunodominante restringido a HLA-A2 de MelanA é um epítopo para o qual existe uma frequência de precursor muito alta no sangue. Em seguida, avaliou-se as DCs de TriMix coeletroporadas com outros antígenos tumorais seriam capazes de induzir respostas de célula T CD8+ específica para antigeno. Uma vez que esse trabalho é parte da avaliação pré-clínica de um estudo de vacinação em que DCs de TriMix coeletroporadas com Mage-A3, Mage-C2, Tirosinase ou gplOO mRNA serão injetadas em pacientes com melanoma, investigou-se se as respostas específicas para esses antígenos poderiam ser induzidas tanto in vitro no sangue de pacientes com melanoma não vacinados como in vivo após a vacinação. Observou-se que em pacientes não vacinados, as DCs de TriMix poderiam de facto estimular as células T específicas para TAA e similares para o antigeno de MelanA, foram mais potentes que as Des maturadas com coquetel de citocina. Todavia, pode se observar apenas as responses especificas para o epítopo de tirosinase restringida a HLA-A2, conforme demonstrado pela coloração de tetrâmero. Nenhuma resposta foi observada para os outros epítopos de Mage-A3, Mage-C2 ou gplOO restringido a HLA-A2 testados. Ademais, os ensaios funcionais não mostraram que as DCs de TriMix tinha induzido células T especificas para outros epítopos além daqueles testados na coloração de tetrâmero, embora, nesses experimentos, os resultados positivos pudessem ter sido ocultados pela ativação de célula T não específica relativamente alta induzida por DCs de TriMix. Essa ativação de célula T não específica parece inerente a DCs de TriMix e ocorre tanto in vitro como in vivo. A razão para essa observação permanece não clara nesse ponto. Por outro lado, poderia ser devido ao facto de que as DCs eletroporadas com CD40L e caTLR4 secretam quantidades completamente altas de citocinas e quimiocinas, o que poderia atrair e ativar células T de uma maneira não específica. Por outro lado, tem sido mostrado que a estimulação crónica de células T virgens por células que apresentam antígeno que expressam continuamente CD70, conduz à ativação do agrupamento de células T e à conversão em células de memória efetoras. Nesse modelo de camundongo transgênico CD70, a ativação de célula T eventualmente conduziu à exaustão do agrupamento de célula T virgem e imunodeficiência letal. Embora sejam também usadas células que apresentam antígeno que expressam continuamente CD70, não se espera isso no presente estudo de vacinação, devido ao facto de que o agrupamento de célula T não é continuamente estimulado com CD7 0, uma vez que as DCs são injetadas de maneira bissemanal e têm uma vida útil limitada in vivo.
Quando comparado à indução massiva de células T especificas para MelanA por DCs de TriMix, a indução de células T especificas para outros antigenos específicos para alvo in vitro é, de preferência, insatisfatória. Isso é mais provavelmente devido à baixa frequência de precursor do mencionado por último. De modo geral, os relatos sobre a indução de células T CD8+ específicas para Mage-A3, Mage-C3, tirosinase ou gplOO por DCs são escassos e as comparações com os presentes resultados são difíceis de se fazer devido ao facto de que IL-2 e/ou IL-7 exógeno são comummente adicionados durante essas estimulações, que suportam a ativação e a proliferação de célula T e, dessa forma, criam um ambiente estimulatório de célula T artificial.
Embora as respostas induzidas em células T CD8+ de pacientes não vacinados fossem completamente insatisfatórias, observou-se que as DCs de TriMix são capazes de induzir respostas robustas para os antigenos de Mage-A3, Mage-C2 e tirosinase através de vacinação. A coloração de tetrâmero mostrou que essas respostas não foram direcionadas para os epítopos restringidos a HLA-A2 testados, evidenciando a vantagem de usar mRNA de antígeno tumoral de comprimento total.
Embora seja evidente que as DCs de TriMix induzam, de preferência, células T TM CD4 + , não se investigou se as mesmas foram também capazes de processar e apresentar péptidos restringidos a HLA classe II a partir de mRNA que codifica antígeno específico para alvo eletroporado. A invenção mostra, adicionalmente, que as DCs de TriMix coeletroporadas com Mage-A3 ligado à sequência de alvejamento de HLA classe II podem, de facto, estimular células T CD4+ específicas para Mage-A3 e restringida a HLA-DP4 estabelecidas. Ademais, sua capacidade para fazer isso é similar à capacidade estimulatória de célula T CD4+ de células pulsadas com péptido. A invenção, portanto, fornece claramente a prova de conceito que as DCs de TriMix pulsadas com um péptido específico para alvo ou coeletroporadas com mRNA que codifica um antígeno específico para alvo podem estimular as células T específicas para antígeno tanto in vitro como após a vacinação e, dessa forma, formar uma nova abordagem promissora para imunoterapia antitumor, antiviral, antibacteriana ou antifúngica. 0 último objetivo da invenção é fornecer uma vacina antialvo que seja capaz de desencadear ou aperfeiçoar uma resposta imunológica específica para hospedeiro em um paciente com cancro ou em um paciente infetado com um vírus, bactérias ou fungos. Com essa finalidade, as DCs são modificadas com pelo menos duas moléculas imunoestimulatórias e um antígeno específico para alvo ou epítopo(s) derivado(s) de antígeno alvo in vitro e reintroduzidas no paciente de maneira intradérmica. No paciente, as DCs são capazes de estimular células T e desencadear uma resposta imunológica mediada por hospedeiro devido a suas características imunoestimulatórias específicas. A reação imune no hospedeiro pode ser, então, analisada através de técnicas conhecidas. A análise do aumento de marcadores inflamatórios aponta para o estabelecimento de uma reação imune no hospedeiro, provavelmente direcionada ao antígeno alvo. Com a finalidade de verificar se a resposta imunológica é especificamente direcionada para o antígeno alvo apresentado pelas DCs na preparação de vacina, várias técnicas conhecidas, como coloração de citocina intracelular através de citometria de fluxo, ELISPOT ou ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA) com o uso de fragmentos de péptido do antigeno alvo ou o antigeno inteiro a fim de capturar e detetar as células T hospedeiras especificas para antigeno podem ser utilizadas. A resposta imunológica pode ser monitorizada tanto no sangue periférico do paciente como na pele, após a indução de uma reação de hipersensibilidade do tipo atrasada (DTH)-biópsia subsequente da região de DTH. A invenção abrange, adicionalmente, um método de seguir os efeitos do tratamento com uma vacina anticancro num paciente com cancro, que compreende a deteção e análise da resposta imunológica em direção ao antigeno especifico para tumor desencadeada no indivíduo anteriormente injetado com a vacina anticancro obtenível ou obtida por meio dos métodos da invenção.
Além disso, a invenção abrange, adicionalmente, um método de seguir os efeitos do tratamento com uma vacina antiviral, antibacteriana ou antifúngica em um paciente respetivamente infetado ou em risco de ser infetado com um vírus, bactérias ou fungo, que compreende a deteção e análise da resposta imunológica em direção ao antigeno específico para alvo desencadeada no indivíduo anteriormente injetado com a vacina obtenível ou obtida por meio dos métodos da invenção. A invenção fornece, adicionalmente, um kit para aprimorar as características imunoestimulatórias de células que apresentam antigeno que compreende uma combinação de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam proteína imunoestimulatória funcional selecionada a partir do grupo que consiste em CD40L, CD70, caTLR4, IL-12p70, EL-selectina, CCR7, e/ou 4-1 BBL; ou em combinação com moléculas que inibem a função ou expressão de SOCS, A20, PD-L1 ou STAT3. Numa modalidade preferencial, a combinação compreende mRNA que codifica as moléculas imunoestimulatórias CD40L, CD70 e caTLR4.
Numa modalidade adicional, as duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam a proteína imunoestimulatória são parte de uma única molécula de mRNA ou ADN. Essa única molécula de mRNA ou ADN é, de preferência, capaz de expressar as duas ou mais proteínas de maneira independente. Em uma modalidade preferencial, as duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam a proteína imunoestimulatória são ligadas na única molécula de mRNA ou ADN por um sítio de entrada ribossómico interno (IRES), possibilitando a tradução separada de cada uma dentre as duas ou mais sequências de mRNA em uma sequência de aminoácidos. Alternativamente, uma sequência de codificação de péptido 2a autoclivável é incorporada entre as sequências de codificação dos diferentes fatores imunoestimulatórios. Dessa forma, dois ou mais fatores podem ser codificados por uma única molécula de mRNA ou ADN. Os dados preliminares em que as células foram eletroporadas com mRNA que codifica CD40L e CD70 ligado por uma sequência de IRES ou um péptido 2a autoclivável mostra que essa abordagem é de facto praticável. A invenção fornece assim, adicionalmente, uma molécula de mRNA que codifica dois ou mais fatores imunoestimulatórios, em que os dois ou mais fatores imunoestimulatórios são traduzidos separadamente da única molécula de mRNA através do uso de um IRES entre as duas ou mais sequências de codificação. Alternativamente, a invenção fornece uma molécula de mRNA que codifica dois ou mais fatores imunoestimulatórios separados por um a sequência de codificação de péptido 2a autoclivável, possibilitando a divagem de duas sequências de proteínas após a tradução.
Além disso, a invenção fornece um método ex vivo para a amplificação de células T específicas para antígeno a partir de um paciente. Esse paciente poderia ser anteriormente vacinado ou não. Esse agrupamento de células T amplificado ex vivo pode ser, então, utilizado para o propósito de "transferência de célula adotiva". A transferência de célula adotiva de células imunológicas autólogas, que foram amplificadas ex vivo com o auxílio da invenção, poderia ser realizada em pacientes que se submeteram ou não a um tratamento de condicionamento (como, mas não restrito a, quimioterapia não mielossupressora) e poderia ser realizada com ou sem as administrações concomitante da invenção ou com ou sem tratamentos imunomodulatórios adicionais (como, mas não limitado a, a administração de citocinas ou moléculas de modificação de sinal coestimulatório). A invenção fornece, dessa forma, um método para a amplificação ex vivo de um agrupamento de células imunológicas autólogas a partir de um paciente que compreende; a) obter ou fornecer células T a partir de um paciente que foi vacinado antes do isolamento ou não, b) colocar as células T ex vivo em contacto com células que apresentam antígeno ou agente de imunoterapia obtido pelo método de acordo com a invenção, c) identificar, isolar e expandir células T ex vivo que são especificas para o antigeno apresentado pelas células que apresentam antigeno que as mesmas foram colocadas em contacto (esses antigenos poderiam ser definidos ou indefinidos conforme seria o caso se o ARN de tumor total fosse utilizado como uma fonte de antigeno). d) a administração dessas células T especificas para antigeno expandidas e amplificadas in vitro ao paciente é uma configuração de um protocolo de tratamento de transferência de célula T adotiva que envolve ou não regimes de pré-condicionamento e tratamento imunomodulatório concomitante. A invenção fornece, adicionalmente, métodos de tratamento de um paciente com necessidade do mesmo com um agrupamento de células que apresentam antigeno da invenção ou com a vacina da invenção. A invenção fornece, adicionalmente, métodos de uso das células que apresentam antigeno modificadas da invenção para o tratamento de cancro ou doenças infeciosas (como infeções virais, bacterianas ou fúngicas, por exemplo, infeções por virus da hepatite e VIH). No caso de imunoterapia ativa para cancro ou doenças infeciosas, o tratamento com as células que apresentam antigeno da invenção podem ser precedidas por, combinadas com ou seguidas de qualquer tratamento não especifico de imunomodulação, a fim de aprimorar a atividade da própria invenção ou para explorar qualquer sinergia entre as diferentes modalidades de tratamento (por exemplo, mediante o aprimoramento da resposta imunológica para a invenção através de estimulação não especifica do sistema imunológico do paciente com citocinas (por exemplo, interleucina-2 ou Interferon alfa-2b) ou ligantes de TLR; ou, por exemplo, pela combinação da invenção com um fármaco de modificação de sinal coestimulatório, como ipilimumabe ou tremelimumabe); ou qualquer outra forma de imunoterapia. A invenção fornece, também, regimes de tratamento complexos em que a própria invenção e um número definido de outros tratamentos imunomodulatórios são utilizados para resultar num plano de tratamento mais ativo (por exemplo, o uso sequencial da invenção com a modalidade 1 (por exemplo, uma citocina) seguida do uso da invenção para a expansão ex vivo de células imunológicas de vacina, seguida de uma transferência celular adotiva dessas células seguida de um tratamento de combinação da invenção com uma modalidade adicional (por exemplo, um modificador de sinal de recetor coestimulatório) ou qualquer combinação possível de uso concomitante e/ou sequencial da invenção e tratamentos imunomodulatórios adicionais.
EXEMPLOS A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes
Exemplo 1: Geração de células dendriticas imaturas a partir de células mononucleares de sangue de paciente (PBMCs).
Dia 0: A manipulação in vitro de PBMCs: após o paciente submeter-se a uma leucaférese a fim de obter um número significativo de PBMCs, o produto de leucaférese é cuidadosamente lavado e subsequentemente distribuído em câmaras de cultivo para permitir que o mesmo adira ao plástico das câmaras durante duas horas a 37 °C, no meio adequado, como meio XVIVO, suplementado com 1 por cento de plasma autólogo, obtido anteriormente a partir do mesmo paciente. Após essas duas horas, as câmaras de cultivo são lavadas com, por exemplo, tampão de solução salina com fosfato (PBS) a fim de remover as células não aderentes. As células aderentes, por sua vez, são adicionalmente cultivadas em meio de cultura que compreende fatores de diferenciação de células dendriticas, como GM-CSF (em uma concentração de cerca de 1.000 U/mL) e IL-4 (em uma concentração de 500 U/mL) num meio adequado (por exemplo, RPMH 640) suplementado com 1 por cento de plasma autólogo do paciente.
Dia 2 e 4: Nos dias 2 e 4, o meio é novamente suplementado com GM/CSF e IL-4, nas mesmas quantidades que no dia 0.
Dia 6: As células dendriticas imaturas são colhidas a partir das câmaras de cultivo e podem ser crioconservadas para o uso futuro ou utilizadas imediatamente. A crioconservação é feita em um meio adequado, como 1 mL de plasma autóloqo do paciente complementado com 10 por cento de DMSO e 2 por cento de glicose. Entre 5 e 20 10<Superscript>6</Superscript> células dendriticas são congeladas por recipiente e o congelamento é realizado de acordo com técnicas de padrão em nitrogénio líquido a -192 °C.
Exemplo 2: Modificação das células dendriticas obtidas de modo que expressem tanto um péptido derivado de antigeno tumoral como os fatores imunoestimulatórios CD40L, CD70 e TLR4 para obter uma vacina antitumor.
Materiais e métodos:
Constructos genéticos. A clonagem do plasmídeo pGEM4Z-NGFR que codifica uma forma truncada do recetor de fator de crescimento de nervo (fragmento transmembrânico e extracelular) foi descrita anteriormente. CD40L foi amplificado a partir de cDNA de célula T CD4+ ativada com os iniciadores a seguir: CD40LS 5'-GATGGzA 7CCGTCATGATCGAAACATACAAC-3' (SEQ ID NO:3) e CD40LAS 5'-GCT CGG74CCCATCAGAGTTTGAGTAAGCC-3' (SEQ ID NO:4) e foi inserida no plasmídeo pGEM4ZA64 (gentilmente fornecido por Dr. N. Schaft, Department of Dermatology, University Hospital of Erlangen, Alemanha) como um fragmento BamH\-Kpn\. CD70 foi amplificada a partir do plasmídeo pIRESneo2-CD70 (um presente gentil de Dr. S. Iwamoto, Department of Biochemistry, Showa University, Japão) com os iniciadores a seguir: CD70S 5'- AA4 ?GC7 7 CCACCATGCCGGAGGAGGGTTC-3' (SEQ ID NO:5) e CD70AS 5'-GGGGG G ? ? 7 7 CTCAGGGGCGCACCCAC-3' (SEQ ID NO:6) e foi inserida no plasmídeo pGEM4Z-A64 como um fragmento /-//nc/III-EcoRI. Para a clonagem do plasmídeo pGEM4Z-caTLR4-A64, a sequência líder (sig) de LAMP1 foi fundida ao TLR4 humano, truncado entre aa M620 e P621, deletando, assim, o domínio de ligação a LPS extracelular e criando a forma constitutivamente ativa de TLR4. caTLR4 foi amplificado a partir de cDNA de DC madura humana com os iniciadores a seguir: caTLR4S 5'-GGGG/A7CCTGTGCTGAGTTTGAATA TCACC-3' (SEQ ID NO:7) e caTLR4AS 5'- GGG? ? 77CTCAGATAGATGTTCTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 8) . caTLR4 cDNA foi inserido no pGEM4Z-sig-LAMP1- A64 como um fragmento SamHI-EcoRI, deletando, assim, a sequência de alvejamento de LAMP1 do vetor. Em paralelo, o caTLR4 cDNA foi também inserido como um fragmento SamHI-
EcoRI no vetor pcDNA3 contendo sig.
Transcrição in vitro da eletroporação de mRNA e mRNA terminada das DCs . 0 mRNA terminado que codifica as moléculas imunoestimulatórias diferentes foi transcrito a partir de ADN de plasmideo linearizado com T7 polimerase. NO dia 6, 4xl06 DCs obtidas como no Exemplo 1 foram eletroporadas com 10 mg de cada mRNA. A eletroporação foi realizada em 200 pL de Solução Optimix B (Equibio) numa tina de eletroporação de 4 mm, com o uso do aparelho EQUIBIO Easyject Plus(R). As condições a seguir foram usadas para a eletroporação: tensão 300 V, capacitância 150 pF e resistência 99 O, resultando em um tempo de pulso de cerca de 5 ms. Imediatamente após a eletroporação, as células foram transferidas para IMDM que contém soro Ab inativado por calor a 1 por cento (PAA Laboratories, Linz, Áustria), PSG, 0,24 mM de L-asparagina e 0,55 mM de L-arginina (ambas da Cambrex) (referido como o meio de estimulação) em uma concentração de lxlO6 células/mL para uso adicional. Nenhuma citocina de amadurecimento, GM-CSF ou foi adicionada às DCs após a eletroporação. Péptidos sintéticos e pulsação de péptido. O péptido derivado de MelanA/MART-1 restringido a HLA-A*0201 correspondente ao epítopo imunodominante otimizado (aa 26-35; ELAGIGILTV) foi adquirido junto à Thermo Electron (Thermo Electron Corporation, Ulm, Alemanha). O péptido gag restringidos a HLA-A2 (gag-A2 peptide, HXB2 gag peptidecomplete Set, NIH, AIDS Research and Reference Reagent Program, McKesson BioServices Corporation,
Rockville, MD) foi utilizado como um controlo negativo. Para a pulsação de péptido, DCs foram diluidas para uma densidade final de 2xl06 células/mL em IMDM que contém 10 mg/mL de péptido e foram incubadas por 2 horas a 37 °C.
Citometria de Fluxo.
As células foram submetidas à coloração utilizando anticorpos monoclonais (mAbs) contra CD40L-PE ou CD70-PE (Beckton Dickinson, BD, San Jose, CA, EUA) . Para coloração de CD40L, DCs foram incubadas com Golgi-plug (brefeldin A, BD, San Jose, CA, EUA) por 4h e, após isso, uma coloração intracelular para CD40L foi realizada utilizando o kit BD Cytofix/Cytoperm plus.
Resultados:
Expressão de Transgene após a eletroporação de mRNA.
Quando as células K562 foram eletroporadas com mRNA de CD40L, cerca de 80 por cento das células exibiram uma expressão de superfície forte de CD40L após 4h. Após 24h, mais que 40 por cento das células ainda expressaram CD40L (dados não mostrados) . Ao contrário, quando as DCs foram eletroporadas com mRNA de CD40L, nenhuma expressão de membrana poderia ser detetada. CD40L seria detetada como sendo intracelular, mas apenas quando Golgi-plug foi adicionado imediatamente após a eletroporação para impedir a diapedese na membrana celular. Sob essas condições, cerca de 60 por cento das DCs eletroporadas expressaram CD40L durante as primeiras 4h após a eletroporação (Figura IA). A percentagem de células positivas diminuiu um pouco quando o mRNA de CD40L foi eletroporado em combinação com um ou dois outros mRNAs. DCs maturadas com coquetel de citocina ou imaturas não mostraram expressão de CD70 conforme detetado por FACS, nem DCs eletroporadas com mRNA de CD40L e/ou de caTLR4. Quando essas células foram plaqueadas em fibroblastos 3T6 que expressam CD40L por 48h, observou-se uma leve suprarregulação de expressão de CD70 em cerca de 3 +/- 1,8 por cento (n=2) das DCs imaturas e 4,9 +/- 2,1 por cento (n=2) das DCs maturadas com coquetel de citocina (dados não mostrados). Quando as células foram maturadas com LPS ou por pulsação passiva ou eletroporação com o Ampligen análogo de dsRNA, a expressão de CD70 poderia ser detetada em cerca de 5,8 +/- 0,3 por cento, 9 +/- 3,3 por cento e 11,2 +/- 3 por cento das DCs, respetivamente. Por outro lado, DCs eletroporadas com mRNA de CD70 mostraram uma expressão forte e prolongada de CD70 na sua membrana (Figura 1B). Vinte e quatro horas após a eletroporação, 78 por cento das DCs eletroporadas expressaram CD70, enquanto que 96h após a eletroporação, 67 por cento ainda expressaram CD70. Novamente, as DCs de expressão de CD70 reduziram um pouco quando uma combinação de dois ou três mRNAs diferentes foi eletroporada em comparação ao mRNA de CD70 sozinho.
As DCs já expressam TLR4 e os anticorpos comercialmente disponíveis contra TLR4 reconhecem o domínio extracelular, que foi deletado no constructo de caTLR4. Portanto, não foi possível avaliar a expressão de caTLR4 após eletroporação de mRNA.
Exemplo 3: Teste do efeito imunoestimulador da vacina antitumoral obtida in vitro.
Materiais e Métodos:
Ativação da trajetória de NF-kappaB. Os constructos genéticos usados foram conforme a seguir: o plasmídeo pNFconluc que codifica o gene de luciferase de vagalume acionado por um promotor responsivo a NF-kappaB mínimo foi geneticamente fornecido por Dr. R. Beyaert (VIB, Ghent University, Bélgica). 0 plasmídeo CSCW-GLuc-YFP, que codifica a luciferase de Gaussia secretada humanizada fundida à proteína fluorescente amarela foi um gentil presente de Dr. B.A. Tannous (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) . 0 GLuc-YFP foi subclonado a partir desse plasmídeo no vetor pHR. CD27 foi amplificado pelo cDNA de célula EBV-B com os seguintes iniciadores: CD27S 5' — AA A4 7GCTTCCACCATGGCACGGCCACATCCCTG-3' (SEQ ID N0:1) e CD27AS 5'- CCCCTCGAG TCAGGGGGAGCAGGCAGG-S' (SEQ ID NO:2) e foi inserido no vetor pCDNA3 como um fragmento de Hind\\\-Xho\ .
Para ensaio de luciferase NF-kappaB, as células 293T (lxlO5 células por poço) foram semeadas em placas com 24 poços. Após 24 h, as células foram transfectadas com 10 ng do plasmídeo pNFconluc de gene repórter, 10 ng de pHR-GLuc-YFP e com 100 ng do plasmídeo de expressão pcDNA3-caTLR4 ou pcDNA3-CD27 quando indicado. As transfecções foram realizadas em triplicado com o reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche) e as quantidades totais de plasmídeo foram mantidas constantes pela adição de plasmídeo pcDNA3 vazio. A transfecção a seguir, lxlO5 de DCs eletroporadas foram adicionadas aos poços quando indicado. Os extratos celulares foram preparados 24h depois e a atividade de gene repórter foi determinada pelo sistema de ensaio de luciferase (Promega, Leiden, Países Baixos). Os resultados foram normalizados para a atividade de Gaussia luciferase secretada.
Citometria de Fluxo. DCs foram submetidas à coloração utilizando anticorpos monoclonais (mAbs) contra CD40-PE, CD80-PE, CD83-FITC, CD86-FITC e HLA-ABC-FITC (todos de Pharmingen, San Jose, CA) . As células T foram fenotipadas com mAbs em relação a CD4-FITC, CD8- FITC, CD8-APC-Cy7, CD27- APC, CD28-APC, CD45RA-biotin, CD45RO-APC, CD62L-FITC (todas de Pharmingen) e CCR7-APC (R e D Systems, Oxford, Reino Unido). CD45RA biotinilada foi detetada com estreptavidina conjugada de PerCP.
Os mAbs correspondentes em isótopo não reativos (Pharmingen) foram utilizados como controlos. Os dados foram coletados utilizando um citómetro de fluxo FACSCanto e analisados utilizando software FACSDiva ou CellQuest. As células foram separadas eletronicamente de acordo com propriedades de dispersão de luz a fim de excluir células de contaminação e mortas.
Ensaio de secreção de citocina. A secreção de 27 diferentes citocinas e quimiocinas por DCs durante as primeiras 24h após a eletroporação ter sido avaliada com o painel A de 27-plex de citocina humana Bio-Plex de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, Nazareth, Bélgica).
Indução de uma resposta de célula T CD4* virgem por DCs eletroporadas
As células T CD4+ virgens foram isoladas da fração não aderente de células mononucleares sanguíneas periféricas por seleção imunomagnética utilizando o Kit II de isolamento de célula T CD4+ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha), após isso, as células T CD45RA+ foram positivamente selecionadas utilizando microesferas de CD45RA (Miltenyi Biotec). As células T CD4+ eram, consistentemente, mais do que 85 por cento puras e mais do que 90 por cento positivas quanto ao CD45RA (dados não mostrados) . A seguir, 5xl04 células T CD4+ virgens foram co-cultivadas com lxlO4 DCs eletroporadas alogénicas com o mRNA indicado. Cada cocultura foi realizada 12 vezes no meio de estimulação de 200 mL por 96 poços de fundo redondo. Após 6 dias, as células T estimuladas foram colhidas, ressuspensas em um meio de estimulação com densidade de lxlO6 células T/mL na presença de 4,7xl04 esferas de CD3/CD28 de expansor de célula T (Dynal, Invitrogen) e substituídas em 200 mL por 96cavidade com fundo redondo. Após 24h de incubação a 37 °C, o sobrenadante foi colhido e analisado em relação ao teor de IFN-gama (BioSource International, Camarillo, CA, EUA), IL-4 (Pierce Biotechnology, Aalst, Bélgica) e IL-10 (R e D Systems) utilizando kits ELISA comercialmente disponíveis. Cada cocultura foi testada em duplicata em ELISA.
Indução de células T CD8+ específicas para MelanA.
As células T e DCs foram obtidas a partir de dadores saudáveis de HLA-A2+. DCs foram eletroporadas com o mRNA indicado e imediatamente pulsadas com péptido de MelanA-A2 por 2h. Após a lavagem, DCs eletroporadas de mRNA pulsado por péptido foram co-cultivadas com 10x10® células T CD8+ autólogas purificadas através da seleção imunomagnética pela utilização de microesferas CD8 (Miltenyi). As células T CD8+ eram, consistentemente, mais do que 90 por cento puras (dados não mostrados). As estimulações foram executadas em uma razão de DC: célula T de 1:10 em meio de estimulação de 5 mL por 6 poços. As células T CD8+ foram reestimuladas semanalmente com as mesmas DCs estimuladoras conforme utilizado na estimulação primária. Após 3 rodadas de estimulação, as células T CD8+ foram colhidas e sua função e especificidade de antigeno foram determinadas.
Coloração de tetrâmero.
As células T foram submetidas à coloração com 10 nM de tetrâmeros HLA-A2 marcados com PE que contêm péptido de MelanA (ELAGIGILTV) ou péptido MAGE-A3 (FLWGPRALV). Os tetrâmeros foram preparados internamente. De modo subsequente, as células foram submetidas à coloração com um anti-CD8 Ab marcado com FITC e lxlO5 células foram analisadas por citometria de fluxo.
Coloração de citocina intracelular. A capacidade de células T CD8+ preparadas com MelanA para produzir citocinas mediante a reestimulação especifica foi investigada utilizando coloração intracelular para IFN-gama e TNF-alfa de acordo com as instruções do fabricante. As células T2 pulsadas com péptido MelanA-A2 ou gag-A2 foram co-cultivadas com células T CD8+ preparadas em uma razão respondedor: estimulador de 10:1 por 2 a 3h a 37 °C, Golgi-plug foi então adicionado para bloquear a secreção de citocina e as células foram incubadas por 12h adicionais a 37 °C, as células T CD8+ foram então submetidas à coloração com anti-CD8 de APC-Cy7-conjugado, lavadas, permeabilizadas e submetidas à coloração intracelular com IFN-gama-PE/TNF-alfa-FITC utilizando o kit BD Cytofix/Cytoperm plus. Cem mil células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliar a percentagem de citocina que produz células T CD8+.
Ensaio de mobilização de CDl07a. lxlO5 células T CD8+ preparadas foram reestimuladas com 4 x 104 células T2 carregadas de péptido de MelanA-A2 ou gag-A2 na presença de Golgi-stop (monensina, BD) e mAb de anti-CD107a marcado com PE-Cy5 ou um controlo de isótopo irrelevante. Após 12 horas de incubação a 37 °C, as células foram colhidas, submetidas à coloração com mAb de anti-CD8 marcado com FITC e lxlO5 células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliar a percentagem de células T CD8+ CD107a+.
Resultados:
Ativação da trajetória de NF-kappaB.
Conforme mostrado na Figura 2, quando comparado às DCs eletroporadas com mRNA de NGFR, ambas as DCs eletroporadas com mRNA de CD40L e CD70 levaram à ativação de NF-kappaB em células 293T que expressam CD40 ou CD27, respetivamente. Embora esse tipo de experimento não tenha sido possível com mRNA de caTLR, foi possível mostrar que as células 293T cotransfectadas com ADN de caTLR4 (que codifica a mesma proteína como o mRNA de caTLR4) e plasmídeo repórter NF-kappaB também levam a uma ativação da trajetória de NF-kappaB quando comparada às células 293T cotransfectadas com plasmídeo repórter NF-kappaB e plasmídeo pcDNA3 vazio (Figura 2). Esses dados indicam que mRNAs de CD40L, CD70 e caTLR4 codificam proteínas funcionalmente ativas.
Fenótipo de DCs diferencialmente eletroporadas.
Avaliou-se o fenótipo de DCs eletroporadas com as diferentes combinações de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 e em comparação a DCs eletroporadas imaturas (Imm) e maturadas com coquetel de citocina (Mat) com mRNA de NGFR irrelevante como controlos positivo e negativo, respetivamente. Conforme mostrado na Figura 3A, a eletroporação de DCs imaturas com mRNA de CD40L e/ou caTLR4 induziu uma suprarregulação marcada das moléculas coestimulatórias CD40, CD80, CD83 e CD86 e de moléculas HLA da classe I. Em geral, DCs eletroporadas de mRNA de caTLR4 mostraram uma maturação fenotipica pronunciada um pouco menor que DCs eletroporadas de mRNA de CD40L enquanto que a combinação de mRNA de CD40L e de caTLR4 induziu a maioria da maturação fenotipica pronunciada, que foi comparável com a maturação induzida pelo coquetel de citocina. Ao contrário, a coeletroporação ou a eletroporação de CD70 não tenho efeito no fenótipo de DCs.
Secreção de citocina/quimiocina por DCs diferencialmente eletroporadas.
Além de uma maturação fenotipica, a eletroporação com mRNA de CD40L ou caTLR4 induziu uma secreção aperfeiçoada de IL-12p70 bioativo. A combinação de CD40L e caTLR4 impulsionou ainda mais a produção de IL-12p70. Novamente, a coeletroporação ou a eletroporação de CD70 não teve efeito (Figura 3B) . Investigou-se também a secreção de diversas outras citocinas e quimiocinas. A secreção por DCs coeletroporadas com mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4, em comparação às DCs eletroporadas maturadas com coquetel de citocina e imaturas com mRNA de NGFR irrelevante é mostrada na Tabela 1. Para cada citocina/quimiocina listada na Tabela 1, verificou-se que (co-)eletroporação de CD70 não teve efeito, enquanto que eletroporação de CD40L e caTLR4 aumentou a secreção de citocina/quimiocina e a combinação de ambas produziu a secreção mais elevada. Além disso, não foi observado secreção de IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17, eotaxina, FGF básico ou PDGF por qualquer uma das preparações de DC.
Tabela 1. Produção de citocina e quimiocina (pq/ml) por DCs eletroporadas. DCs foram eletroporadas com mRNA irrelevante ou a combinação de CD40L, eD70 e mRNA de caTLR4. Após a eletroporação, DCs foram cultivadas por 24h em uma densidade celular de lxlO6 células/mL em meio de estimulação sem adição de citocinas suplementares. A secreção de citocina e a secreção de quimiocina foram medidas com o painel A de 27-plex de citocina humana Bio-Plex. Um fora dos 3 experimentos mostrados.
Estimulação de células T CD4+ virgens por DCs diferencialmente eletroporadas. A seguir, investigou-se se DCs eletroporadas com diferentes combinações de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 poderiam induzir uma resposta de célula T CD4+ virgem e se a alteração para uma resposta Thl ou Th2 foi observada. Portanto, DCs eletroporadas foram utilizadas para estimular células T CD4+ CD45RA+ alogénicas e após a reestimulação com esferas expansoras de célula T CD3/CD28, o sobrenadante foi avaliado para conteúdo IL-4, IL-10 e IFN-gama. Em geral, as células T estimuladas secretaram quantidades muito baixas de IL-4 (menos que 50 pg/mL) e IL-10 (menos que 200 pg/mL) e nenhuma diferença foi encontrada entre as células T diferencialmente estimuladas (dados não mostrados) . Por outro lado, DCs eletroporadas com mRNA de CD40L e de caTLR4 estimulam as células T CD4+ a secretar altas quantidades de IFN-gama. No presente documento, também, a combinação de CD40L com caTLR4 impulsionou ainda mais a secreção de IFN-gama e (co-)eletroporação de CD70 não teve efeito (Figura 3C), embora a análise de FACS tenha confirmado que células T CD4+CD45RA+ expressaram CD27.
Indução de células T CD8* específicas para MelanA por DCs diferencialmente eletroporadas.
Em um próximo conjunto de experimentos, investigou-se se as DCs eletroporadas com diferentes combinações de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 poderiam iniciar as células T CD8+ especificas para MelanA virgens. Portanto, DCs de dadores saudáveis de HLA-A2+ foram eletroporadas com diferentes combinações de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4, pulsadas com o péptido imunodominante de MelanA e co-cultivadas com células T CD8+ autólogas. As DCs maturadas com coquetel de citocina e imaturas, eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante e pulsadas com péptido de MelanA, foram utilizadas como controlos. Após 3 estimulações semanais, o número de células restantes e a percentagem de células T CD8+ especificas para MelanA tetrâmero-positivas foram determinados (Tabela 2) . A partir desses dados, o número absoluto de células T CD8+ especificas para MelanA tetrâmero-positivas (Tabela 2) e as vezes de aumento em relação a DCs imaturas eletroporadas com mRNA irrelevante (Figura 4A) foram calculados. Os dados mostram que a eletroporação de DCs com mRNA de CD40L ou caTLR4 sozinho produziu um número maior de células T CD8+ especificas para MelanA, que ainda foi aumentado através da combinação de CD40L com eletroporação de CD70 ou caTLR4. A combinação de todas as três moléculas resultou, consistentemente, em um aumento mais alto de números de célula T especifica para antigeno, com um aumento em vezes médio de 573 e 203 em relação às DCs maturadas com coquetel de citocina ou imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR, respetivamente.
Tabela 2. Indução de células T CD8+ especificas para MelanA restringidas a HLA-A2 por DCs eletroporadas com diferentes combinações de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 e pulsadas com péptido de MelanA. Os resultados são mostrados para 4 experimentos individuais a partir de diferentes dadores saudáveis.
Propriedades fenotípicas e funcionais de células T CD8+estimuladas.
Finalmente, avaliou-se as propriedades fenotípicas e funcionais de células T CD8+ estimuladas 3 vezes com DCs pulsadas com péptido MelanA-A2 diferencialmente eletroporadas. Os mecanismos efetores principais de células T CD8+ estimuladas, isto é, citólise e produção de citocina, foram investigados. Em primeiro lugar, realizou-se um ensaio de mobilização de CD107a (Figura 4B) , que mede a exposição de CDl07a, presente na membrana de grânulos citotóxicos, sobre a superfície de célula T como resultado de desgranulação mediante a estimulação antigénica. Mostrou-se que a mobilização de CD107a pode ser utilizada como um marcador para atividade lítica. Em segundo lugar, realizou-se colorações de citocina intracelular para enumerar o número de células que secretam IFN-gama e/ou TNF-alfa, ambos mediadores principais da resposta imunológica, mediante a estimulação antigénica (Figura 4C). Para todos os dadores testados, foi observado que a percentagem de células T específicas para MelanA, correlacionadas à percentagem de células T líticas e com a percentagem de células T de produção de IFN-gama/TNF-alfa. Por outro lado, também foi analisado o fenótipo das células T CD8+ específicas para MelanA induzidas. As células T CD8+ específicas para MelanA preparadas foram todas CD45RA"CD45RO+CD27+CD28 + , juntamente com uma expressão variável de CD62L e CCR7 (Figura 4D) . Em geral, não houve nenhuma diferença significante no fenótipo das células T CD8+ específicas para MelanA dos diferentes dadores, independente desse tipo de DC que foi utilizado para estimulação.
Exemplo 4: DCs de TriMix podem ser coeletroporadas com mKNA TAA sem afetar sua eficácia de eletroporação, secreção madura fenotipada e de citocina.
Materiais e Métodos:
Constructos Genéticos.
Os plasmideos pGEM-CD40L, pGEM-CD70, pGEM-caTLR4 que codificam CD40L, CD70 e a forma constitutivamente ativa de TLR4 (que contém os fragmentos irregulares e de transmembrana de TLR4), respetivamente; o plasmideo pGEM-NGFR que codifica uma forma truncada do recetor de fator de crescimento do tecido nervoso (NGFR, que contém os fragmentos extracelulares e de transmembrana); e o plasmideo pGEM-sig-MelanA-DCLamp que codifica o antigeno MelanA integral, que contém o epitopo imunodominante de MelanA-A2 otimizado e ligados ao sinal de alvejamento de DC-Lamp foram descritos.
Geração in vitro de DCs derivadas de monócito humano, transcrição in vitro de eletroporação de mRNA e mRNA terminados de DCs. A geração, a maturação e a criopreservação de DCs maturadas com coquetel de citocina e imaturas, produção de mRNA terminado e eletroporação de mRNA de DCs de TriMix pulsadas com péptido de MelanA foram descritas acima. Para coeletroporação com mRNA de antigeno tumoral, DCs foram eletroporadas da mesma maneira conforme descrito no exemplo 2, mas 2 0 yg de mRNA de antigeno tumoral foi incluído na mistura de mRNA.
Citometria de Fluxo. DCs foram submetidas à coloração utilizando as seguintes mAbs: CD40-APC, CD7 0-PE, CD80-PE, CD83-PE, CD86-PE, HLA-ABCFITC (todas do BD Pharmingen, Erembodegem, Bélgica) e HLA-DR (purificadas a partir do clone L243). O anticorpo anti-HLA-DR foi marcado com biotina e detetado através de estreptavidina-APC (BD Pharmingen). Os mAbs correspondentes em isótopo não reativos (BD Pharmingen) foram utilizados como controles. Os dados foram coletados utilizando um citómetro de fluxo FACSCanto e analisados utilizando software FACSDiva. As células foram separadas eletronicamente de acordo com propriedades de dispersão de luz a fim de excluir células de contaminação e mortas.
Ensaio de secreção de citocina. A secreção de IL-12p70 por DCs durante a primeira 24h após eletroporação foi avaliada por ELISA utilizando um kit comercialmente disponível (eBioscience, Zoersel, Bélgica).
Resultados: DCs eletroporadas com um TriMix de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 são tipicamente eletroporadas de modo muito eficaz: em média, cerca de 80 por cento das DCs expressam a molécula CD70 em sua superfície 24h após a eletroporação. Devido ao facto de que se observou que a eficácia de eletroporação diminuiu ligeiramente quando uma combinação de três mRNAs diferentes foi eletroporada em comparação com um único mRNA, investigou-se se a adição de um quarto mRNA afetaria a eficácia de eletroporação. Verificou-se que, quando as DCs de TriMix são coeletroporadas com mRNA TAA, a eficácia de eletroporação não altera de modo notável conforme demonstrado pela expressão de CD70 24h após a eletroporação (Figura 5A).
Após a eletroporação com mRNA de TriMix, DCs imaturas adquirem um fenótipo maduro e aperfeiçoam sua secreção de citocina conforme demonstrado pela suprarregulação de moléculas coestimulatórias (CD40, CD80, CD83, CD86) e moléculas HLA, e secreção de IL-12p70, respetivamente. Além disso, no presente documento, quando as DCs de TriMix são coeletroporadas com mRNA TAA, o fenótipo maduro (Figura 5B) e a secreção de citocina (Figura 5C) não são acentuadamente alterados.
Exemplo 5: Indução de células T CD8+ específicas para MelanA por DCs de TriMix pulsadas com péptido ou coeletroporadas com mRNA de antígeno tumoral total.
Materiais e Métodos: DCs de TriMix pulsadas com péptido ou coeletroporadas com mRNA de antígeno tumoral total foram preparadas conforme descrito acima, bem como a indução in vitro de células T CD8+ específicas de MelanA e coloração de tetrâmero.
Citometria de Fluxo.
As células T foram fenotipadas com os seguintes mAbs: CD8-FITC, CD8-APC-Cy7, CD27-APC, CD28-APC, CD45RAbiotin, CD45RO-APC, CD62L-FITC (todos de BD Pharmingen) e CCR7-APC. CD45RA biotinilada foi detetada com estreptavidina conjugada de PerCP (BD Pharmingen). Os mAbs correspondentes em isótopo não reativos (BD Pharmingen) foram utilizados como controlos. Os dados foram coletados utilizando um citómetro de fluxo FACSCanto e analisados utilizando software FACSDiva. As células foram separadas eletronicamente de acordo com propriedades de dispersão de luz a fim de excluir células de contaminação e mortas.
Coloração de citocina intracelular e ensaio de CDl 07a/CDl 3 7.
Para coloração de citocina intracelular, 2xl05 células T CD8+ preparadas foram reestimuladas com 2 x 104 células estimuladoras na presença de Golgi-plug (brefeldinA, Becton Dickinson, BD, Erembodegem, Bélgica). Após 12h de incubação a 37 °C, células T CD8+ foram então submetidas à coloração com mAb de anti-CD8 de APC-Cy7-conjugado ou FITC, lavadas, permeabilizadas e submetidas à coloração intracelular utilizando o kit BD Cytofix/Cytoperm plus com IFN-gama-PE/TNF-alfa-APC ou IFN-gama-PE/TNFalfa- FITC, respetivamente. Para o ensaio de CD107a/CD137, lxlO5 células T CD8+ preparadas foram reestimuladas com 2xl04 células estimuladoras na presença de Golgi-stop (monensin, BD) e mAb de anti-CD107a marcado com PE-Cy5 (BD Pharmingen) . Após 12h de incubação a 37 °C, as células foram colhidas e submetidas à coloração com mAb de anti-CD8 marcado com FITC e mAb de CD137 marcado com PE (ambos a partir de BD Pharmingen). As células estimuladoras, as células T2 HLA-A2+ deficientes de TAP pulsadas com péptido ou DCs maturadas com coquetel de citocina eletroporadas com TAA-mRNA foram utilizadas. As células foram analisadas por citometria de fluxo utilizando um software FACSDiva e citómetro de fluxo FACSCanto. As células foram separadas eletronicamente de acordo com propriedades de dispersão de luz a fim de excluir células de contaminação e mortas.
Resultados:
Investigou-se se DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA de codificação de MelanA integral poderiam iniciar as células T CD8+ especificas para MelanA virgens. Portanto, DCs dos dadores saudáveis de HLA-A2+ foram eletroporadas com mRNA de TriMix e pulsadas com o péptido imunodominante de MelanA ou coeletroporadas com mRNA de MelanA-DCLamp. As DCs foram então cocultivadas com células T CD8+autólogas sem a adição de citocinas exógenas. As DCs maturadas com coquetel de citocina e imaturas, eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante e pulsadas com péptido de MelanA, foram utilizadas como controlos. As células foram estimuladas 3 vezes com um intervalo semanal. Após cada ronda de estimulação, o número de células restantes e a percentagem de tetrâmero-positivas, células T CD8 + especificas para MelanA foram determinados e o número absoluto de tetrâmero-positivas, células T CD8+ especificas para MelanA foi calculado (Tabela 3). Além disso, a percentagem relativa de células T especificas para MelanA obtida após cada estimulação foi comparada ao número absoluto de células T CD8+ especificas para MelanA obtido após 3 estimulações semanais com DCs de TriMix pulsadas por péptido (definido em 100 por cento) (Figura 6A). Foi observado que, após 1 ou 2 estimulações, DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA TAA eram um pouco menos potentes do que DCs de TriMix pulsadas por péptido, enquanto que após 3 estimulações, as mesmas foram igualmente potentes em 2 de 4 experimentos. A seguir, avaliou-se as propriedades fenotípicas e funcionais de células T CD8+ estimuladas 3 vezes com DCs de TriMix pulsadas com péptido ou coeletroporadas com mRNA TAA. Os mecanismos efetores principais de células T CD8+ estimuladas, isto é ativação, citólise e produção de citocina, foram investigados. As células T foram reestimuladas de um dia para outro com células T2 pulsadas com péptido de MelanA-A2 ou péptido gag como um controlo negativo. Um primeiro lugar, realizou-se um ensaio de mobilização de CD107a combinado com um ensaio de ativação de CD137 (Figura 6B) , que mede, respetivamente, atividade litica (14) e ativação de célula T (15) mediante a estimulação antigénica. Em segundo lugar, realizou-se coloração de citocina intracelular para enumerar o número de células que secretam IFN-gama e/ou TNF-alfa mediante a estimulação antigénica; ambos mediadores principais da resposta imunológica (Figura 6C) . Para todos os dadores testados, foi observado que a percentagem de células T especificas para MelanA, correlacionadas à percentagem de células T liticas/ativada e com a percentagem de células T de produção de IFN-gama/TNF-alfa. Em geral, nenhuma diferença principal foi observada entre células T estimuladas com péptido pulsado ou DCs coeletroporadas de TAA, exceto um ligeiro aumento, porém reproduzível da intensidade de fluorescência principal de coloração de IFN-gama e, também, na percentagem de células positivas duplas de IFN-gama/TNF-alfa, sugerindo que as células T iniciadas com DCs de TriMix coeletroporadas exercem mais funções de uma vez (16). Além disso, analisou-se o fenótipo das células T CD8+ específicas para MelanA induzidas. As células T CD8+ específicas para MelanA preparadas foram todas CD45RA" CD45RO+CD27+CD28+, juntamente com uma expressão variável de CD62L e CCR7 (dados não mostrados), que sugere que tanto as células T de memória central (CD62L+ e CCR7+) quanto as células T de memória precursoras anteriores (CD62L)" e CCR7") foram induzidas (17). Em geral, não houve diferença significante no fenótipo das células T CD8+ específicas para MelanA dos diferentes dadores, independente em relação a se o péptido pulsado ou DCs coeletroporadas de TAA foram utilizadas para estimulação.
Tabela 3. Indução de células T CD8+ específicas para MelanA restringidas a HLA-A2 por DCs de TriMix pulsadas com péptido de MelanA-A2 ou coeletroporadas com MelanA-DC Lamp mRNA".
Abreviações: Imm, DCs imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante; Mat, DCs maturadas com coquetel de citocina eletroporadas com mRNA de NGFR; ND, nao realizadas .
Exemplo 6: Estimulação de células T CD4+ específicas para Mage-A3 por DCs de TriMix pulsadas com péptido ou coeletroporadas com mRNA TAA total.
Devido ao facto de que todos os constructos de TAA utilizadas contêm um sinal de alvejamento da classe II de HLA, desejou-se investigar se as DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA TAA poderiam estimular células T CD4+ estabelecida. Portanto, DCs de TriMix foram pulsadas com péptido Mage-A3-DP4 ou coeletroporadas com mRNA de MageA3-DCl_amp. Quatro horas depois, as células foram coculturadas com células T restringidas com HLA-DP4 e especificas para Mage-A3, por 20h. Essas células T são HLA-DP4 (HLA-DPBl *0401) restringidas e especificas para o epitopo aa 243-258 Mage-A3 com a sequência KKLLTQHFVQENYLEY. As DCs imaturas eletroporadas com mRNA de NGFR irrelevante foram usadas como controlo negativo. IFN-gama libertado no sobrenadante durante a cocultura foi medido por ELISA (Figura 7). Observou-se que DCs de TriMix têm, de facto, capacidade para apresentar epítopos antigénicos no contexto de moléculas HLA da classe II, sem diferenças notáveis entre o péptido pulsado e células coeletroporadas de TAA.
Exemplo 7: Indução in vitro de células T CD8+ específicas para outros antigenos que MelanA no sangue de pacientes com melanoma não vacinados.
Materiais e Métodos:
Constructos Genéticos. 0 plasmídeo pGEM-sig-MageA3-DCLamp gue codifica o antigeno Mage-A3 integral ligado à seguência de alvejamento de HLA da classe II de DC-Lamp (região de transmembrana/citoplásmica) foi descrito. 0 plasmídeo pGEM-sig-MageC2-DCLamp contém o gene MageC2 integral, flanqueado pela sequência de sinal e pela sequência de alvejamento de HLA da classe II de DC-Lamp. Os plasmídeos pGEM-sig-gpl00-Lamp e pGEM-sig-Tirosinase-Lamp contêm o gene gplOO e Tirosinase, respetivamente, com sua própria sequência de sinal e com suas regiões de transmembrana e citosólicas substituídas pela sequência de alvejamento de HLA da classe II de Lamp-1.
Eletroporação de DCs.
Para coeletroporação com mRNA de MageA3-DC-Lamp, MageC2-DC-Lamp, Tirosinase-Lamp ou gplOO-Lamp, 50xl06 DCs foram eletroporadas com 20 mg de mRNA de CD40L, CD70 e caTLR4 juntamente com 60 yg de mRNA que codifica TAA em uma tina de eletroporação de 4mm e as condições a seguir foram utilizadas para eletroporação: voltagem de 300 V, capacitância de 450 yF e resistência de 99 O em um volume final de 600 yL. Péptidos sintéticos e pulsação de péptido.
Os péptidos derivados de gplOO (aa 209-217; ITDQVPFSV), Tirosinase (aa 369-377; YMDGTMSQV), Mage-C2 (aa 336-344; ALKDVEERV), Mage-A3 (aa 112-120; KVAELVHFL), e restringidos a HLA-A*0201 foram adquiridos junto a Thermo Electron (Ulm, Alemanha). O péptido gag restringidos a HLA-A2 (gag-A2 peptide, HXB2 gag peptidecomplete Set, NIH, AIDS Research and Reference Reagent Program, McKesson BioServices Corporation, Rockville, MD) foi utilizado como um controlo negativo. Para a pulsação de péptido, DC ou células T2 foram diluídas a uma densidade final de 2xl06 células/mL em IMDM que contém 10 pg/mL de péptido e foram incubadas por 2 h a 37 °C.
Indução de células T CD8+ específicas para TAA.
As células T CD8+ foram isoladas a partir do sangue dos pacientes com melanoma HLA-A2+. As células T CD8+ foram purificadas através da seleção imunomagnética pela utilização de microesferas CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e eram consistentemente mais que 90 por cento puras (dados não mostrados). Vinte milhões de células T CD8+ foram coculturadas com DCs autólogas em uma razão de DC: célula T de 1:10 por 6 poços em 7,5 mL de meio de estimulação que consiste em meio de IMDM que contém 1 por cento soro AB inativado pelo calor (PAA Laboratories, Linz, Áustria), 100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,24 mM de L-asparagina e 0,55 mM de L-arginina (todas a partir de Cambrex) sem qualquer adição adicional de citocinas exógenas tal como IL-2 ou IL- 7. Como as DCs estimuladoras, DCs maturadas com o coquetel de citocina que contém IL-1 alfa, IL-6, TNF-alfa e PGE2 e pulsadas com um péptido derivado de gplOO, Tirosinase, Mage-C2, Mage-A3 ou restringidos a HLA-A2 (sequências KVAELVHFL, ALKDVEERV, YMDGTMSQV e ITDQVPFSV, respetivamente; misturadas em uma razão de 1:1:1:1); ou DCs de TriMix conforme preparado para vacinação foram utilizadas. As células T CD8+ foram reestimuladas semanalmente com as mesmas DCs estimuladoras conforme utilizado na estimulação primária. Após 2 rodadas de estimulação, as células T CD8+ foram colhidas e sua função e especificidade de antigeno foram determinadas.
Coloração de tetrâmero.
As células T foram submetidas à coloração com a anti-CD8 marcado com FITC (BD Pharmingen) e com 10 nM de tetrâmeros HLA-A2 marcados com PE (preparados internamente). Os tetrâmeros continham um dos péptidos derivados de TAA restringidos a HLA-A2 a seguir: FLWGPRALV - SEQ ID NO: 9 -ou KVAELVHFL - SEQ ID NO:10 - (Mage-A3-derived) ; ALKDVEERV - SEQ ID NO:l 1 - (derivado de Mage-C2); YMDGTMSQV - SEQ ID NO: 12 - (derivado de Tirosinase); ITDQVPFSV - SEQ ID NO:13 YLEPGPVTA - SEQ ID NO:14 - ou KTWGQYWQV - SEQ ID NO:15 -(derivado de gplOO); ou SLLMWITQC - SEQ ID NO:16 -(derivado de NYESO-1, controlo negativo). As células foram analisadas por citometria de fluxo. A coloração de citocina intracelular e ensaio de CD107a/CD137 foram realizados conforme descrito no exemplo 5.
Resultados:
Devido ao facto de gue esse trabalho é parte do avaliação pré-clinica de um estudo de vacinação em que DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA de Mage-A3, Mage-C2, Tirosinase ou gplOO serão injetadas em pacientes com melanoma, desejou-se investigar se essas DCs tiveram capacidade para induzir células T CD8+ específicas para esses antígenos in vitro nas PBMCs de pacientes com melanoma não vacinados. Portanto, as células T CD8+ dos pacientes com melanoma HLA- A2+ foram coculturadas com DCs autólogas conforme preparado para vacinação, isto é, eletroporadas com mRNA de TriMix juntamente com um dos quatro mRNAs de antigeno tumoral e misturadas posteriormente em quantidades iguais. As DCs maturadas com coquetel de citocina pulsadas com um péptido derivado de gplOO, Tirosinase, Mage-C2, Mage-A3 ou restringido a HLA-A2 (também misturadas em quantidades iguais) foram utilizadas como controlos. Durante o período de estimulação total, nenhuma citocina exógena como IL-2 ou IL-7 para suportar sobrevivência e proliferação de célula T foi adicionada. Após 3 estimulações semanais, as células T foram submetidas à coloração com um painel de tetrâmeros que reconhecem 7 diferentes epítopos derivados de gplOO, Tirosinase, Mage-C2, Mage-A3 ou restringidos a HLA-A2. Para todos os 3 pacientes testados, foi observado que DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA TAA tinham capacidade para induzir células T específicas para Tirosinase restringidas a HLA-A2, enquanto que as DCs maturadas com coquetel de citocina pulsadas com o péptido Tirosinase-A2 falharam na realização disso (Figura 8A) . Não foi observado células T que reconhecem os outros tetrâmeros específicos para gplOO, Mage-C2 ou Mage-A3, nem quando as DCs de TriMix nem DCs maturadas com coquetel de citocina foram utilizadas para estimulação in vitro (dados não mostrados). Embora DCs de TriMix foram coeletroporadas com mRNA TAA integral que codifica todos os epítopos derivados de TAA possíveis, não foi observado indução de outras células T específicas para gplOO, Tirosinase, Mage-C2 ou Mage-A3 conforme avaliado por CD137/CD107a e ensaios de coloração de citocina intracelular (Figura 8B e C e dados não mostrados), embora baixas frequências de células T específicas possam ter sido encobertas pela ativação de célula T não específica induzida por DCs de TriMix.
Exemplo 8: Indução de células T CD8+ específicas para outros antígenos do que MelanA no sangue de pacientes com melanoma após vacinação com DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA TAA. 0 objetivo final da invenção é, certamente, a provisão de uma vacina anticancro que compreende as DCs manipuladas de acordo com a invenção, que apresenta epítopo derivado de antigeno especifico para tumor no contexto de moléculas HLA da classe I ou II em sua superfície, que pode ser introduzida novamente no paciente, desencadeando de modo subsequente uma resposta imunológica contra o marcador de tumor específico. Esse procedimento de imunovacinação compreende as etapas de (1) obter a manipulação das DCs conforme esboçado nos exemplos 1 e 7 e (2) injetar as DCs no indivíduo. 0 indivíduo será uma modelo de murganho para análise adicional do efeito imunoestimulador da vacina in vivo ou o indivíduo pode ser um paciente de cancro, a fim de ajudar o estabelecimento de uma resposta imunológica mediada por hospedeiro para o antigeno específico para tumor. Em resumo, uma preparação de DC que compreende, de preferência, 10 a 100 x 106 DCs, mais preferencialmente, 10 a 50 x 106 DCs, ressuspensas em 250 pL de salina tamponada com fosfato (PBS), suplementadas com albumina de soro humano é injetada no indivíduo, de preferência, por via intradérmica.
No indivíduo, as DCs têm capacidade para estimular as células T e obter uma resposta imunológica mediada por hospedeiro devido a suas características imunoestimulatórias específicas. A reação imunológica no hospedeiro pode, então, ser analisada através das técnicas padrão. A análise do aumento de marcadores inflamatórios apontará para o estabelecimento de uma reação imunológica no hospedeiro, provavelmente, direcionada para o antigeno tumoral. A fim de verificar se a resposta imunológica é especialmente direcionada para o antigeno tumoral apresentado pelas DCs na preparação de vacina, diversas técnicas conhecidas tal como coloração intracelular através de citometria de fluxo, ELISPOT ou Ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), utilizando fragmentos de péptido do antigeno tumoral ou o antigeno tumoral total a fim de capturar e detetar células T de hospedeiro especifico de antigeno tumoral podem ser utilizadas. A resposta imunológica pode ser monitorizada tanto no sangue periférico do paciente quanto na pele, após a indução de uma reação hipersensitiva do tipo retardada (DTH) e biopsia subsequente da região DTH.
Pacientes, preparação de vacina e calendário de vacinação.
Três pacientes com HLA-A2+ (2M/1 F) com melanoma de estágio IV ou estágio III recorrente foram recrutados em um teste-piloto institucional continuo (UZ Brussel) com vacina TriMix-DC autóloga para pacientes com melanoma avançada. Para propósitos de vacinação, DCs foram eletroporadas com mRNA que codifica um dos quatro antigenos tumorais (Mage-A3, Mage-C2, Tirosinase e gplOO) e o TriMix-mRNA. Após um período de descanso de uma hora, as células são misturadas em razões iguais. A primeira vacina foi administrada antes da criopreservação da DC-vacina, vacinas subsequentes foram realizadas com células que foram descongeladas no dia da vacinação. As vacinas consistem em ± 12,5 X 106 TriMix DC por antigeno e são administradas por 4 injeções intradérmicas bissemanais em 4 sítios de injeção diferentes (região axilar e/ou inguinal).
Investigou-se se DCs de TriMix coeletroporadas com mRNA de Mage-A3, Mage-C2, Tirosinase ou gplOO teriam capacidade para induzir uma resposta de célula T CD8+ especifica para antigeno in vivo. Portanto, 2 pacientes com melanoma HLA-A2+ (pacientes 2 e 3) foram vacinados 4 vezes em intervalos bissemanais com DCs de TriMix. Duas semanas após a última vacinação, células T CD8+ isoladas do sangue desses pacientes foram reestimuladas in vitro com DCs autóloga, com DCs de TriMix conforme preparado para vacinação ou com DCs maturadas com coquetel de citocina coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral. Novamente, durante o período de estimulação total, nenhuma citocina exógena foi adicionada. Após 2 estimulações semanais, a especificidade de antigeno e a funcionalidade das células T foram investigadas pela coloração com o painel de tetrâmero de HLA-A2 e pelo CDl37/CD107a e ensaios de coloração de citocina intracelular; e isso foi comparado com a resposta induzida nas células T CD8+ dos mesmos pacientes, mas antes da vacinação. Para ambos pacientes, não foi observado células T específicas para os epítopos derivados de gplOO, Tirosinase, Mage-C2, Mage-A3 ou restringidos a HLA-A2 conhecidos na coloração de tetrâmero (dados não mostrados), embora tenha se tido capacidade para induzir células T específicas de Tirosinase-A2 nas células T CD8+ desses mesmos pacientes antes da vacinação (Figura 8A). Essa ainda era o cado após as células T terem recebido uma ronda de estimulação extra in vitro (dados não mostrados). Devido ao facto de que os pacientes foram vacinados com DCs coeletroporadas com mRNA de antigeno tumoral integral que codifica todos os epítopos derivados de antigeno tumoral possíveis, investigou-se se uma resposta de célula T específica para outros epítopos que os epítopos restringidos a HLA-A2 conhecidos foi induzida. Portanto, uma semana após a segunda reestimulação in vitro, as células T foram reestimuladas de um dia para outro com DCs maduras eletroporadas com mRNA de antigeno tumoral ou NGFR como irrelevante, após isso um CD137/CD107a (Figura 8B) e uma coloração de ensaio de citocina intracelular (Figura 8C) foram realizados. De facto, foi observado fortes respostas induzidas por vacina contra outros epítopos de Mage-A3 (paciente 2), epítopos de Mage-C2 (paciente 2 e 3) e epítopos de Tirosinase (paciente 2), que não estavam presentes antes da vacinação. Em geral, os resultados similares foram obtidos quando TriMix ou DCs maturadas com coquetel de citocina foram utilizadas para reestimulação in vitro, exceto pelo facto de que o último induziu menos células T não específicas (dados não mostrados).
Exemplo_9j_Combinação_de_diferentes_fatores imunoestimuladores de codificação de mRNAs em uma única molécula de mRNA para eletroporação
Para transfecção de 2 ou mais moléculas de fatores imunoestimuladores funcionais de codificação de mRNA ou ADN e/ou fatores que inibem moléculas inibidoras, preparações de mRNA ou ADN distintas podem ser utilizadas conforme é mostrado nos exemplos acima. Nesse caso, cada fator único é codificado por uma única molécula de mRNA ou ADN. Nesse exemplo alternativo, diversos fatores são ligados entre si por meio de uma sequência de IRES (sítio de entrada ribossómico interno) ou uma sequência de codificação de péptido 2a clivável. Dessa maneira, dois ou mais fatores podem ser codificados por uma única molécula de mRNA ou ADN. Os dados preliminares em que as células foram eletroporadas com mRNA que codifica CD40L e CD70 ligado por uma sequência de IRES ou um péptido 2a clivável mostram que essa abordagem é, de facto, viável. A extrapolação desse sistema para mais que dois fatores imunoestimulatórios é, certamente, também antecipada por esse exemplo.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Vrije Universiteit Brussel <120> Aperfeiçoamento da capacidade estimulatória de célula T de células dendriticas humanas e seu uso em vacinação de cancro
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Lisboa,
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES1. Método in vitro para aprimorar as características imunoestimulatórias de células que apresentam antígeno humano que compreende a introdução simultânea de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam proteína imunoestimulatória nas ditas células que apresentam antígeno, caracterizado por de entre as ditas proteínas funcionais pelo menos CD40L e caTLR4 serem introduzidos, e em que, opcional e adicionalmente, CD70 é introduzido.
- 2. Método in vitro caracterizado por ser para preparar um agente de imunoterapia que compreende as etapas de: a) modificar in vitro um agrupamento de células que apresentam antígeno ao introduzir moléculas de mRNA ou ADN nas ditas células que apresentam antígeno que codifica o antígeno imunoestimulatório CD40L e caTLR4 e opcional e adicionalmente CD70, b) modificar in vitro o agrupamento de células que apresentam antígeno da etapa a) ao introduzir um antígeno específico para alvo nas ditas células que apresentam antígeno de modo que apresentem epítopos derivados de antígeno específico para alvo.
- 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por as células que apresentam antígeno serem selecionadas a partir do grupo que consiste em células dendríticas (DCs), células B isoladas do ou geradas a partir do sangue de um indivíduo, linhagens de células dendríticas, ou linhagens de célula B.
- 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o antigeno especifico para alvo ser um antigeno tumoral, bacteriano, virai ou fúngico.
- 5. Vacina caracterizada por compreender um agente de imunoterapia que compreende células que apresentam antigeno que são modificadas in vitro por: a) introduzir moléculas de mRNA ou ADN nas ditas células que apresentam antigeno que codifica pelo menos o antigeno imunoestimulatório CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente CD70, sendo que as ditas células apresentam antigeno que expressa, assim, o antigeno imunoestimulatório, e b) introduzir nas ditas células que apresentam antigeno um antigeno especifico para alvo, sendo que as ditas células que apresentam antigeno apresentam, assim, o antigeno específico para alvo, sendo que a dita vacina compreende adicionalmente adjuvante(s) farmaceuticamente aceitável(eis).
- 6. Preparação de células que apresentam antigeno para uso no desencadeamento de uma resposta imunológica num paciente com necessidade do mesmo, caracterizada por pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam proteína imunoestimulatória funcional de entre as quais é pelo menos CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente CD70 serem introduzidas nas ditas células que apresentam antigeno.
- 7. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser para uso no desencadeamento de uma resposta imunológica num paciente com necessidade do mesmo.
- 8. Método in vitro para testar por novos epítopos específicos para alvo que podem ser usados para a vacinação de pacientes caracterizado por compreender as etapas de: a) estimular in vitro células T de doadores saudáveis ou pacientes, anteriormente vacinados ou não com uma vacina antialvo, com células que apresentam antígeno em que pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes codificam proteína imunoestimulatória funcional são introduzidas, de entre as quais é pelo menos CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente CD70, sendo que as ditas células que apresentam antígeno expressam, assim, a proteína imunoestimulatória; b) identificar células T específicas para o antígeno alvo usado; e c) identificar o epítopo derivado de antígeno alvo para o qual a célula T é específica.
- 9. Composição caracterizada por compreender uma combinação de pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam: a) uma proteína imunoestimulatória funcional CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente b) uma proteína imunoestimulatória funcional CD70.
- 10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por as ditas duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam a proteína imunoestimulatória serem parte de uma única molécula de mRNA ou ADN, em que a única molécula de mRNA ou ADN tem a capacidade de expressar as duas ou mais proteínas simultaneamente, ou em que as duas ou mais moléculas de mRNA ou ADN que codificam a proteína imunoestimulatória são separadas na única molécula de mRNA ou ADN por um sítio de entrada ribossómico interno (IRES) ou uma sequência de codificação de péptido 2a autoclivante.
- 11. Método in vitro caracterizado por ser para acompanhar os efeitos do tratamento com uma vacina antialvo num paciente, sendo que compreende a deteção e análise da resposta imunológica em relação ao antígeno específico para alvo desencadeado numa biopsia cutânea de hipersensibilidade do tipo atrasada ou uma amostra sanguínea periférica do indivíduo anteriormente injetado com a vacina, conforme definido na reivindicação 5, ou a composição, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 10.
- 12. Preparação de células que apresentam antígeno, conforme definido na reivindicação 6, ou o método, conforme definido nas reivindicações 8 ou 11, caracterizada por o dito paciente estar a sofrer de uma doença ou distúrbio selecionado a partir do grupo de: presença de tumor, cancro, presença de melanoma, infeção bacteriana, virai ou fúngica, infeção por VIH ou infeção por hepatite.
- 13. Método para a amplificação ex vivo de um agrupamento de células T de um paciente caracterizado por compreender; a) colocar as células T obtidas de um paciente que foi vacinado antes do isolamento, ou que não foi vacinado, em contacto com um agente de imunoterapia que compreende células que apresentam antígeno em que pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes que codificam proteína imunoestimulatória funcional são introduzidas, de entre as quais é pelo menos CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente CD70, sendo que as ditas células que apresentam antigeno expressam, assim, a proteína imunoestimulatória; e em que um antigeno específico para alvo é introduzido, sendo que as células que apresentam antigeno apresentam, assim, epítopos derivados de antigeno específico para alvo, e b) identificar, isolar e expandir as células T ex vivo que são específicas para o antigeno apresentado pelas ditas células que apresentam antigeno com as quais estiveram em contacto.
- 14. Agrupamento de células T para uso numa definição de transferência de célula T adotiva num paciente caracterizado por o dito agrupamento de células T consistir em células T obtidas a partir do paciente, que foram estimuladas ex vivo com o agente de imunoterapia que compreende células que apresentam antigeno em que pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN diferentes codificam a proteína imunoestimulatória funcional de entre as quais é pelo menos CD40L e caTLR4, e opcional e adicionalmente CD70, são introduzidas nas ditas células que apresentam antigeno; em que um antigeno específico para alvo é introduzido nas ditas células que apresentam antigeno, apresentando, assim, epítopos derivados de antigeno específico para alvo; que foram expandidos ex vivo; e que são específicos para o antigeno apresentado pelas células que apresentam antigeno com as quais estavam em contacto. RESUMO "APERFEIÇOAMENTO DA CAPACIDADE ESTIMULATÓRIA DE CÉLULAS T DAS CÉLULAS QUE APRESENTAM ANTÍGENO HUMANO E O SEU USO NA VACINAÇÃO" A presente invenção refere-se ao fornecimento de novos métodos de aperfeiçoamento da capacidade estimulatória de célula T das células dendriticas humanas (DCs) e o seu uso na vacinação de cancro. 0 método compreende a introdução de adjuvantes moleculares diferentes nas DCs humanas através da transfecção com pelo menos duas moléculas de mRNA ou ADN que codificam marcadores selecionados a partir do grupo de CD40L, CD70, TLR4 constitutivamente ativo (caTLR4), IL-12p70, el-selectina, CCR7 e/ou 4-1 BBL; ou em combinação com inibição da expressão deSOCS, A20, PD-L1 e/ou STAT3, por exemplo, através da transfecção de siRNA. Pode-se mostrar um aumento evidente na capacidade imunoestimulatória das DCs obtidas desta forma, permitindo-lhes desencadear uma resposta imunológica de célula T inesperadamente alta in vitro. Introdução de pelo menos duas das moléculas acima, em combinação com um antígeno específico para tumor permite que as DCs desencadeiem uma resposta imunológica de célula T mediada por hospedeiro significativa in vivo em relação ao antígeno de tumor e, portanto, torna-as muito atrativas na fabricação de vacinas anticancro.
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