CN110461865A - 包含具有降低的反应原性的lps的博德特氏菌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学领域，更特别属于疫苗学领域。本发明涉及一种新的博德特氏菌(Bordetella)LPS及包含这种修饰的LPS的博德特氏菌属的修饰的细菌。与未修饰的博德特氏菌LPS相比，本发明的LPS具有降低的内毒性。因此，本发明的经修饰的LPS特别适用于诱导或刺激受试者的免疫应答，其中针对博德特氏菌感染诱导或刺激免疫应答。本发明的修饰的博德特氏菌LPS可通过在博德特氏菌细胞中导入异源酰基转移酶的表达而获得。特别地，本发明的修饰的博德特氏菌细胞具有增加的异源LpxA、LpxL或LpxD酰基转移酶的表达。

Description

包含具有降低的反应原性的LPS的博德特氏菌疫苗

发明领域

本发明属于疫苗学领域，特别是预防或治疗博德特氏菌(Bordetella)感染的领域。

本发明涉及具有降低的内毒性的博德特氏菌LPS，以及包含这种修饰的LPS的博德特氏菌属的遗传修饰细菌。本发明进一步涉及可得自所述修饰的细菌的外膜囊泡(OMV)。本发明还涉及包含所述LPS、遗传修饰的细菌和/或OMV的组合物以及所述组合物作为药物的用途。本发明进一步涉及用于治疗的所述组合物，包括在受试者中诱导或刺激免疫应答。

背景技术

百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)是一种革兰氏阴性菌及是一种专性人类病原体，导致百日咳，这是一种急性呼吸道疾病，也称为顿咳。已经开发了针对百日咳的一些疫苗制剂。在上个世纪五十年代引入的全细胞百日咳疫苗是有效的，但产生了不可接受的副作用。因此，其目前已退出工业化国家的市场。基于亚单位的疫苗取代了全细胞疫苗，因为其被证明是安全的并且赋予对该疾病的相对保护(55-95％的覆盖)。然而，病原体的快速适应和免疫力的迅速减弱等降低了这些制剂的功效。在过去几十年中，工业化国家的情况特别令人担忧，其中包括免疫接种者在内的病例数量大幅增加[1]。因此，对新的、安全的和有效的疫苗制剂具有强烈的医学需求。实现这一目标的策略可以是引入毒性降低的新型全细胞疫苗。由于毒性主要由脂多糖(LPS)的脂质A部分决定[2]，因此这种方法需要脂质A工程化。

LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。其由脂质A部分、核心寡糖和称为O-抗原的长多糖组成，然而在包括百日咳博德特氏菌在内的一些菌种中缺乏这种多糖[3-5]。脂质A部分由哺乳动物LPS受体TLR4/MD-2复合物识别，导致结束于促炎细胞因子和趋化因子的产生的信号传导级联的激活[6]。这些介质可激活免疫防御[7，8]，但过度刺激会导致具有致命后果的多种失调[9]。因此，LPS可以作为佐剂，也可以作为有效的内毒素。大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A由葡糖胺二糖组成，其在1和4′位置被磷酸化并含有四个羟基化脂肪酰基链，通过酰胺键连接到2和2′位置及通过酯键连接到3和3′位置。两个仲酰基链在2′和3′位置被酯化成脂肪酸的羟基[4]。脂质A的生物合成途径需要9种保守的酶[4]。在第一步中，通过LpxA将3-羟基酰基链从酰基载体蛋白转移至活化的糖UDP-GlcNAc中N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的位置3[10，11]。然后通过LpxC将所得产物脱乙酰化，随后通过LpxD在位置2用3-羟基酰基链酰化。然后LpxH将UMP分子从所得分子一部分中除去，及一个修饰的分子通过LpxB与未修饰的分子连接。通过LpxK将所得产物在4′位置磷酸化以产生四酰化和二磷酸化的脂质IVA。然后通过WaaA将两个3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基加入6′位置，之后通过LpxL和LpxM酰基转移酶加入仲酰基链。

在不同的细菌物种中发现脂质A结构的变化。这些变化影响LPS受体的活化。特别地，酰基链的数量和长度以及磷酸基团的数量均可以决定活化强度[4，12，13]。

酰基链长度的变化由酰基转移酶LpxA、LpxD、LpxL和LpxM中的分子标尺决定，其在不同细菌物种的这些酶之间变化[14]。此外，在保守的生物合成途径之后，可以通过位于内膜或外膜中的酶在脂质A中在其被转运至外膜期间或之后导入修饰。这些修饰包括酰化、去酰化和去磷酸化，细菌物种之间这些酶的存在不同[15]。

百日咳博德特氏菌的脂质A(图1A)与大肠杆菌的脂质不同之处在于其是五酰化的：其错失与3′位置的伯酰基链(primary acylchain)连接的仲酰基链(secondary acylchain)。此外，剩余仲酰基链是C14而不是大肠杆菌中发现的C12，奇怪的是在3和3′位置的伯羟基化酰基链的长度不同(图1A)，即使其是通过相同LpxA酶加入的。

先前报道了博德特氏菌3-O-脱酰基的LPS降低LPS毒性(见例如WO 2006/065139)。然而，在3位置失去伯酰基链的百日咳博德特氏菌LPS的毒性降低由于其从膜上释放的增加而在全细胞制剂中无效[2]。

因此，本领域仍然强烈需要具有降低的内毒性的博德特氏菌LPS。特别地，需要具有这种具有降低的内毒性的LPS的博德特氏菌物种。优选地，LPS的内毒性足够低以适用于预防或治疗博德特氏菌感染。更确切地说，本领域仍然需要包含具有降低的内毒性的LPS的全细胞博德特氏菌疫苗。

发明概述

第一方面，本发明涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度更短。

优选地，在修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链相比不具有更长的长度，及优选在修饰的脂质A部分的3位置的酰基链长度不大于C₁₀。优选地，修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链具有相同长度，优选在3位置的酰基链长度为C₁₀。

在本发明的一个优选实施方案中，修饰的脂质A部分的3位置的酰基链长度与3′位置的酰基链长度相同。

优选地，较短的酰基链选自：i)脂质A部分的3′位置的酰基链；ii)脂质A部分2′位置的伯酰基链；iii)脂质A部分2′位置的仲酰基链；及iv)脂质A部分2位置的酰基链。优选地，所述酰基链短至少2个、4个或6个C原子。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如本文定义的博德特氏菌LPS，其中除了修饰的脂质A部分外，LPS具有百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)或支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)的结构。优选地，除了修饰的脂质A部分之外，LPS具有百日咳博德特氏菌的结构。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如本文定义的博德特氏菌LPS，其中所述修饰的脂质A部分具有式(I)的结构：

其中X²、X³、X²’、X³’、R²、R³、R²’和R³’均独立地选自-H、-OH、-Y、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n对于Y的每种情况均是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。

第二方面，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌包含如本文定义的LPS。优选地，所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰。优选地，导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰赋予细胞至少一种异源LpxA、LpxL和LpxD酰基转移酶活性。优选地，遗传修饰导入至少一种异源lpxA、lpxL和lpxD基因的表达，其中i)lpxA基因具有编码与SEQ ID NO：1具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列；ii)lpxL基因具有编码与SEQ ID NO：2具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列；和/或iii)lpxD基因具有编码与SEQ ID NO：4具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxD酰基转移酶的核苷酸序列。

优选地，修饰的细菌进一步包含基因突变，其降低或消除由内源lpxA基因和/或内源lpxD基因编码的LpxA和/或LpxD酰基转移酶的活性。

在进一步优选的实施方案中，本文定义的细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性的遗传修饰，其中优选所述遗传修饰导入异源lpxH基因的表达，及其中优选lpxH基因具有编码与SEQ ID NO：5具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxH的核苷酸序列。

优选地，如本文所定义的细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌，其中优选遗传修饰的细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌，最优选百日咳博德特氏菌B213菌株。优选地，如本文定义的遗传修饰的细菌另外具有增加脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如本文定义的博德特氏菌LPS，其中所述LPS可得自如本文定义的遗传修饰的细菌。

第三方面，本发明涉及包含如本文定义的博德特氏菌LPS的OMV。优选地，所述OMV可得自如本文定义的遗传修饰的细菌。

第四方面，本发明涉及包含如本文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌及OMV中至少之一的组合物。

第五方面，本发明涉及用作药物的如本文所定义的组合物。

第六方面，本发明涉及用于治疗的如本文定义的组合物，所述治疗包括在受试者中诱导或刺激免疫应答。优选地，针对博德特氏菌感染、优选百日咳博德特氏菌感染诱导或刺激免疫应答。在优选的实施方案中，所述治疗是预防或治疗顿咳。优选地，用于本文所述用途的组合物是药物组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。

优选地，用于如本文所述用途的组合物是包含如本文定义的细菌的全细胞疫苗，其中优选所述细菌是灭活的。

在一个优选的实施方案中，用于如本文定义用途的组合物是无细胞疫苗，其包含本文所述的博德特氏菌LPS或如本文定义的OMV。

在优选的实施方案中，用于如本文定义用途的组合物进一步包含至少一种非博德特氏菌抗原。

发明描述

定义

术语“同源性”、“序列相同性”等在本文中可互换使用。序列相同性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间通过比较序列确定的关系。在本领域中，“相同性”视情况而定还表示氨基酸或核酸序列之间通过这些序列串之间的匹配而确定的序列相关程度。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过比较一个多肽与另一多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代而确定。可以通过已知方法容易地计算“相同性”和“相似性”。

“序列相同性”和“序列相似性”可以通过根据两个序列的长度使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列而确定。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)比对，该算法在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如SmithWaterman)比对。当序列(当通过例如使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时)呈现至少一定最小百分比的序列相同性(如下定义)时，可将序列称为“基本相同”或“实质相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数及最小化缺口数。当两个序列具有相似长度时，全局比对适用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质使用的默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。序列比对和序列相同性百分比评分可以使用计算机程序确定，如可得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA的GCGWisconsinPackage，Version 10.3，或者使用开源软件如EmbossWIN version 2.10.0中程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或者“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数，或者使用默认设置(对于“needle”和“water”以及对于蛋白质和DNA比对，默认缺口开放罚分为10.0，默认缺口延伸罚分为0.5；对于蛋白质的默认评分矩阵是Blosum62，对于DNA使用的是DNAFull)。当序列具有基本不同的总长度时，优选局部比对，例如使用Smith Waterman算法的比对。

或者，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法搜索公共数据库来确定相似性或相同性百分比。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作执行搜索公共数据库的“查询序列”，以例如鉴别其它家族成员或相关序列。这种搜索可以使用Altschul， et al.(1990)J.Mol.Biol.215∶403-10的BLASTn和BLASTx程序(version 2.0)进行。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的酰基转移酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。见国家生物技术信息中心的主页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。

任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这是本领域技术人员知晓的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文揭示的氨基酸序列的取代变体是其中在公开序列中的至少一个残基已被除去并在其位置插入不同残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。每个天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala至ser；arg至lys；asn至gln或his；asp至glu；cys至ser或ala；gln至asn；glu至asp；gly至pro；his至asn或gln；ile至leu或val；leu至ile或val；lys至arg；gln或glu；met至leu或ile；phe至met、leu或tyr；ser至thr；thr至ser；trp至tyr；tyr至trp或phe；及val至ile或leu。

如本文所用，术语“选择性杂交”和类似术语旨在描述杂交和洗涤的条件，在此条件下至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％彼此同源的核苷酸序列典型保持彼此杂交。也就是说，这种杂交序列可以共有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％的序列相同性。

这种杂交条件的优选的非限制性实例是在大约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在大约50℃、优选在大约55℃、优选在大约60℃甚至更优选在大约65℃在1×SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次。

高度严格条件包括例如在大约68℃在5×SSC/5×Denhardt溶液/1.0％SDS中杂交，及在室温在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，可在42℃进行洗涤。

技术人员将知道适用于严格和高度严格杂交条件的条件。关于这些条件的其它指导在本领域中易于获得，例如在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；及Ausubel et al.(eds.)，Sambrook and Russell(2001)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rdedition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York 1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley&Sons，N.Y.)中。

当然，仅与poly A序列(例如mRNA的3′末端poly(A)tract)或者与T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在本发明用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的多核苷酸中，因为这种多核苷酸将与含有poly(A)序列节段或其互补序列(例如实际上任何双链cDNA克隆)的任何核酸分子杂交。

“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中应理解为意指由使用重组DNA技术产生的人工核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子，尽管核酸构建体可包含(部分)天然存在的核酸分子。术语“表达载体”或“表达构建体”是指这样的核苷酸序列，其能在与这些序列相容的宿主细胞或宿主生物中实现基因表达。这些表达载体通常包括至少合适的转录调节序列及任选包括3′转录终止信号。也可以存在实现表达必需或有帮助的其它因子，例如表达增强子元件。表达载体将被导入合适的宿主细胞中及能在宿主细胞的体外细胞培养物中实现编码序列的表达。表达载体适于在本发明的宿主细胞或生物体中复制。

如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指用于控制一或多个编码序列转录的核酸片段，位于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，根据DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点及任何其它DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点及本领域技术人员已知的直接或间接起作用以调节启动子转录量的任何其它核苷酸序列)的存在进行结构鉴定。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数细胞、优选细菌细胞中有活性的启动子。“可诱导”启动子是例如通过应用化学诱导剂而被生理学或发育调节的启动子。

术语“选择标记”是本领域技术人员熟知的术语，在本文中用于描述任何遗传实体，在其表达时可用于选择含有所述选择标记的细胞。术语“报道蛋白”可与标记互换使用，但主要用于指可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。选择标记可以是显性的或隐性的或双向的。

如本文所用，术语“可操纵地连接”是指多核苷酸元件以功能关系的连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，其是“可操纵地连接的”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则其与所述编码序列是可操纵地连接的。可操纵地连接意指连接的DNA序列通常是连续的，及在必要时是连续且符合读框地连接两个蛋白质编码区域。

如本文所用，术语“肽”定义为氨基酸残基链，通常具有确定的序列。如本文所用，术语肽可与术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。在本发明的上下文中，术语“肽”定义为包含通过修饰或未修饰的肽键连接的至少两个氨基酸的任何肽或蛋白质。术语“肽”是指短链分子，例如寡肽或寡聚体，或者是指长链分子，例如蛋白质。蛋白质/肽可以是线性、支链或环状的。肽可包括D氨基酸、L氨基酸或其组合。根据本发明的肽可包含修饰的氨基酸。因此，本发明的肽也可以通过自然方法修饰例如转录后修饰或者通过化学方法修饰。这些修饰的一些实例是：乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，与黄素共价键合，与血红素共价键合，与核苷酸或核苷酸衍生物共价键合，与修饰或未修饰的碳水化合物部分共价键合，与脂质或脂质衍生物键合，与磷脂酰肌醇共价键合，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，半胱氨酸分子形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，羟基化，碘化，甲基化，氧化，磷酸化，外消旋化等。因此，不具有消除肽免疫原性作用的任何肽修饰均包含在本发明的范围内。

术语“基因”是指包含区域(转录区域)的DNA片段，与合适的调节区(例如启动子)可操纵地连接，在细胞中转录为RNA分子(例如mRNA)。基因通常包含几个可操纵连接的片段，例如启动子、5′前导序列、编码区和包含多腺苷酸化位点的3′-非翻译序列(3′-末端)。“基因表达”是指其中与适当的调节区、特别是启动子可操纵地连接的DNA区域被转录成RNA(其是生物活性的，即能被翻译成生物活性蛋白质或肽)的过程。当用于表示指定(重组)核酸或多肽分子与指定宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源”应理解为意指所述核酸或多肽分子在自然中由相同物种优选相同品种或株系的宿主细胞或生物体产生。如果与宿主细胞同源，与在其自然环境中不同，编码多肽的核酸序列通常(但不一定)与另一个(异源)启动子序列可操纵地连接，以及如果适用的话，还可以与另一个(异源)分泌信号序列和/或终止子序列可操纵地连接。应理解，调节序列、信号序列、终止子序列等也可与宿主细胞同源。

当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源”和“外源”是指不作为其存在于其中的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在的核酸或蛋白质，或者在与其自然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列位置中发现。异源和外源核酸或蛋白质对于其被导入之中的细胞而言不是内源的，但是得自另一种细胞或者经合成或重组产生的。通常，尽管不是必需的，这种核酸编码蛋白质，即外源蛋白质，其不是由DNA在之中转录或表达的细胞正常产生。相似地，外源RNA编码通常在存在所述外源RNA的细胞中不表达的蛋白质。异源/外源核酸和蛋白质也可称为外来核酸或蛋白质。本领域技术人员认为是其在之中表达的细胞外源的任何核酸或蛋白质涵盖在本文术语异源或外源核酸或蛋白质内。术语异源和外源也适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合，即其中组合序列中至少两个相对于彼此是外来的组合

如本文所用，术语“免疫应答”是指抗体和/或细胞(例如T淋巴细胞)的产生，其针对和/或有助于特定抗原性实体(在其表面携带和/或表达或呈递抗原和/或抗原表位)的分解和/或抑制。对于本发明，短语“有效的免疫保护应答”、“免疫保护”等术语是指针对病原体、病原体感染的细胞或癌细胞的一或多种抗原表位的免疫应答，以在接种疫苗对象中防止病原体感染或抵抗癌症。对于本发明，针对病原体感染或癌症的保护作用不仅包括绝对预防感染或癌症，还包括病原体感染或癌症的程度或速度的任何可检测的降低，或者例如与未接种疫苗的感染对象相比，接种对象中得自病原体感染或癌症的疾病严重程度或者任何症状或状况的任何可检测的降低。在癌症的情况中，有效的免疫保护反应还包括清除癌细胞，从而减小癌症的大小或甚至消除癌症。为实现这一目的，免疫接种也称为治疗性免疫接种。或者，可以在先前已经未感染病原体和/或尚未感染病原体或在接种疫苗时尚未患癌症的对象中诱导有效的免疫保护应答，这种免疫接种可称为预防性免疫接种。

根据本发明，术语“抗原”在本文中一般是指与抗体特异性结合的任何分子。该术语还指可以由MHC分子结合并呈递给T细胞受体的任何分子或分子片段。抗原可以是例如蛋白质分子，即多氨基酸序列，任选地包含非蛋白质基团如碳水化合物部分和/或脂质部分，或者抗原可以是例如非蛋白质分子，如碳水化合物。抗原可以是例如蛋白质的任何部分(肽，部分蛋白质，全长蛋白质)，其中蛋白质是天然存在的或合成衍生的、细胞组成成分(全细胞，细胞裂解物或破坏的细胞)、生物体(整个生物体，裂解物或破坏的细胞)或碳水化合物或其它分子或其部分，其能在特定对象中激发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，所述免疫应答优选是可通过测定或方法测量的。

术语“抗原”在本文中被理解为作为适应性免疫应答的受体的靶的结构物质。因此，抗原作为TCR(T细胞受体)或BCR(B细胞受体)或分泌形式的BCR即抗体的靶。因此，抗原可以是蛋白质、肽、碳水化合物或其它半抗原，其通常是较大结构例如细胞或病毒体的一部分。抗原可以源自体内(“自身”)或来自外部环境(“非自身”)。由于胸腺中T细胞的负选择，免疫系统通常在正常条件下对“自身”抗原无反应性，且应该仅识别和攻击来自外界的“非自身”侵入物或者在例如疾病状态下机体中存在的修饰的/有害的物质。作为细胞免疫应答靶的抗原结构以经处理的抗原肽形式由抗原呈递细胞(APC)通过组织相容性分子呈递给适应性免疫系统的T细胞。根据呈递的抗原和组织相容性分子的类型，一些类型的T细胞可以被激活。对于T细胞受体(TCR)识别，将抗原处理为细胞内的小肽片段并通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递给T细胞受体。

术语“免疫原”在本文中用于描述包含或编码抗原的至少一个表位的实体，使得当施用给对象时优选与合适的佐剂一起施用时，在该对象体内激发针对所述表位和包含表位的抗原的特异性体液和/或细胞免疫应答。免疫原可以与抗原相同或者至少包含抗原的一部分，例如包含抗原表位的部分。因此，在一个实施方案中，针对特定抗原接种对象意味着由于施用包含至少一个抗原表位的免疫原导致针对所述抗原或其免疫原性部分的免疫应答被激发。免疫接种优选地产生保护或治疗效果，其中随后暴露于抗原(或抗原来源)激发针对所述抗原(或来源)的免疫应答，其降低或预防对象的疾病或状况。免疫接种的概念在本领域中是熟知的。通过施用本发明的预防性或治疗性组合物激发的免疫应答与未施用疫苗相比，可以是免疫状态的任何方面(例如细胞应答，体液应答，细胞因子产生)的任何可检测的变化。

“表位”在本文中定义为足以在对象中激发免疫应答的指定抗原内的单个免疫原性位点。本领域技术人员认识到T细胞表位与B细胞表位的大小和组成不同，及通过I类MHC途径呈递的T细胞表位不同于通过II类MHC途径呈递的表位。根据免疫应答的类型，表位可以是线性序列或构象表位(保守结合区)。抗原可以与单个表位一样小或更大，且可以包括多个表位。因此，抗原的大小可以小如大约5-12个氨基酸(例如肽)，及大如全长蛋白质，包括多聚体蛋白质、蛋白质复合物、病毒体、颗粒、全细胞、整体微生物或其部分(例如全细胞的裂解物或微生物的提取物)。

佐剂在本文中被理解为是一种实体，当与抗原组合施用给人或动物对象时在所述对象体内产生针对所述抗原的免疫应答，刺激免疫系统，从而激发、增强或促进针对所述抗原的免疫应答，优选不必对佐剂本身产生特异性免疫应答。与在相同条件下但在不存在佐剂的情况下针对抗原产生的免疫应答相比，优选的佐剂使针对指定抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。本领域可获得用于确定与相应对照组相比，在一组动物或人对象中针对指定抗原由佐剂产生的免疫应答的统计学平均增强的测试。佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。

OMV(也称为“blebs”)是双层膜结构，通常为球形，直径在20-250nm(有时为10-500nm)的范围内，从革兰氏阴性菌的外膜上夹断。OMV膜内部含有磷脂(PL)，外部含有脂多糖(LPS)和PL，与不同位置的膜蛋白混合，很大程度上反映了其从中夹断的细菌外膜的结构。OMV的腔可以包含来自周质或细胞质的各种化合物，例如蛋白质、RNA/DNA和肽聚糖(PG)，然而，与细菌细胞不同，OMV缺乏自我复制的能力。在本发明的上下文中，根据其产生方法可以区分三种类型的OMV。sOMV是从培养上清液中通过从已形成的OMV中分离完整细胞而纯化和浓缩的自发或天然OMV。洗涤剂OMV、dOMV是用洗涤剂例如脱氧胆酸盐从细胞中提取的，这也降低了反应原性LPS的含量。在洗涤剂提取后，将dOMV与细胞和细胞碎片分离并进一步纯化和浓缩。最后，本文关于OMV使用的术语天然nOMV是指其通过非洗涤剂细胞破碎技术从浓缩的死细胞产生，或者用其它(非破坏性)无洗涤剂方法(例如使用螯合剂如EDTA)从细胞中提取，可以将其与野生型自发OMV和洗涤剂提取的dOMV清晰区分。

对本文任何提及的公开序列数据库中可访问的核苷酸或氨基酸序列是指在本文件的提交日期可获得的序列条目的版本。

修饰的博德特氏菌LPS的脂质A部分的酰基链长度

本发明涉及令人惊讶的发现，即缩短博德特氏菌脂质A部分的酰基链长度可降低LPS内毒性。本发明进一步揭示了意外的发现，即增加脂质A部分的3位置的酰基链的长度导致博德特氏菌种的致死性。因此，本发明揭示了可以在博德特氏菌种中使用特定的酰基转移酶亚组以缩短酰基链的长度及因此降低博德特氏菌LPS的内毒性。

第一方面，本发明因此涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度更短。不希望受任何理论的束缚，酰基链长度的这种修饰可能影响辅助分子例如CD14的结合。辅助分子对不同细菌的LPS具有显着不同的结合亲和力[23]，其可能潜在受酰基链长度的影响。

野生型博德特氏菌脂多糖(LPS)含有五酰化的脂质A部分。野生型百日咳博德特氏菌LPS的脂质A部分示于图1。如图1所示，百日咳博德特氏菌的脂质A部分含有四个伯酰基链和一个仲酰基链。仲酰基链在2′(2 prime)位置与伯酰基链连接，仲酰基链的野生型长度为C14。此外，与仲酰基链相反，伯酰基链总是在其3′末端羟基化(3-OH)。

伯酰基链分别位于脂质A部分的2和3位置以及2′(2 prime)和3′(3 prime)位置。野生型伯酰基链的酰基链长度在2、2′和3′位置是C14，野生型酰基链的长度在3位置是C10。

此外，应理解术语“在2、3、2′或3′位置的酰基链”和“在2、3、2′或3′位置的伯酰基链”在本文中可互换使用。

此外，在本文中应理解，当提及脂质A部分中“prime”位置的酰基链时，意指在非还原末端葡糖胺的位置。例如，3′位置的酰基链是附着在非还原末端上葡糖胺的3位置的酰基链。

此外，在本文中应理解，当提及脂质A部分特定(即非prime)位置的酰基链时，意指在还原末端的葡糖胺位置。例如，3位置的酰基链是附着于还原末端上葡糖胺的3位置的酰基链。类似地，短语“大于...的酰基链和“长于...酰基链”可以在本文中互换使用。

短语“短于...的酰基链”和“小于...的酰基链”在本文中可以互换使用。

在此应理解，较短的酰基链不包括完全不存在酰基链。因此，较短的酰基链表示存在酰基链，但是短于野生型脂质A部分的相同位置的酰基链的长度。优选地，所述酰基链不短于3-羟基丙酸，或不短于丙酸(C₃)。

当在文中提及野生型脂质A部分(或未修饰的脂质A部分)时，除非另有说明，否则是指至少如图1中举例说明的野生型百日咳博德特氏菌LPS的脂质A部分。类似地，其它博德特氏菌种的野生型脂质A部分是本发明的一部分。博德特氏菌脂质A部分例如在Caroff等(Microbes and Infection 4(2002)∶915-926，在此并入作参考)的图2中揭示。野生型脂质A部分可以是五-或六-酰化的。在野生型LPS的脂质A部分是六酰化的情况下，存在两个仲酰基链(一个位于2′位置，一个位于3′位置)。在博德特氏菌野生型脂质A部分酰基链是六酰化的情况中，则文中提及的仲酰基链应解释为在2′位置和/或3′位置的仲酰基链。

在一个优选的实施方案中，仅一个酰基链的长度短于相同位置的野生型脂质A部分的酰基链。优选地，一个伯酰基链的长度更短。更优选地，仅在2、3、2′或3′位置的伯酰基链的长度短于分别在2、3、2′或3′位置的野生型博德特氏菌酰基链的长度。或者，仅仲酰基链的长度短于野生型博德特氏菌仲酰基链的长度。

在另一个实施方案中，至少一个酰基链的长度较短。特别地，至少在2位置的酰基链的长度短于野生型在2位置的长度，因此短于C14。或者，至少在3位置或者2’位置的酰基链分别短于在3或2′位置的野生型长度，因此分别短于C10或C14。在另一个实施方案中，至少3′位置的酰基链长度短于3′位置的野生型酰基链长度，因此短于C14。或者，至少仲酰基链的酰基链的长度短于野生型仲酰基链的长度，因此短于C14。

在一个优选的实施方案中，本发明因此涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短，其中较短的酰基链选自：

i)在脂质A部分3′位置的酰基链；

ii)在脂质A部分2′位置的伯酰基链；

iii)在脂质A部分2′位置的仲酰基链；及

iv)在脂质A部分2位置的酰基链。

在进一步优选的实施方案中，脂质A部分中至少2、3、4或(全部)5个酰基链的长度短于在相同位置的野生型长度。优选地，(至少)2和2′位置的酰基链的长度比分别短于2和2′位置的野生型酰基链的酰基链长度。

在一个优选的实施方案中，本发明因此涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短，其中所述酰基链短至少2、4或6个C原子。所述至少一个较短的酰基链可以是如上所述任何酰基链。与野生型博德特氏菌的脂质A部分相同位置的酰基链长度相比，所述至少一个较短的酰基链优选短至少12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10或12个C原子。更优选地，所述酰基链短至少8、6、4或2个C原子，更优选短至少4或2个C原子，甚至更优选短至少2个C原子。在最优选的实施方案中，所述修饰的酰基链与野生型博德特氏菌脂质A部分的相同位置的酰基链长度相比短2个C原子。

在一个优选的实施方案中，在2位置的酰基链长度优选比野生型博德特氏菌脂质A部分的2位置的酰基链长度短至少12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10或12个C原子。因此，所述修饰的脂质A部分的2位置的酰基链的长度优选为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

或者或另外，3位置的酰基链的长度优选比野生型博德特氏菌脂质A部分的3位置的酰基链长度短至少14、12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10、12或14个C原子。因此，所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度优选为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀、C₁₂或C₁₄，更优选为C₂、C₄、C₆或C₈。

或者或另外，2′位置的酰基链的长度优选比野生型博德特氏菌的脂质A部分2′位置的酰基链长度短至少12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10或12个C原子。因此，所述修饰的脂质A部分2′位置的酰基链长度优选为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

或者或另外，3′位置的酰基链长度优选比野生型博德特氏菌脂质A部分3′位置的酰基链长度短至少12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10或12个C原子。因此，所述修饰的脂质A部分3′位置的酰基链长度优选为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

最后，或者或另外，仲酰基链的酰基链长度与野生型博德特氏菌脂质A部分的仲酰基链长度相比优选短至少12、10、8、6、4或2个C原子。或者，所述较短的酰基链优选短至多2、4、6、8、10或12个C原子。因此，所述修饰的脂质A部分的仲酰基链长度优选为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂。

此外，所述修饰的脂质A部分的1、2、3或4个酰基链的长度不短于野生型酰基链的长度，可以比野生型脂质A部分相同位置的酰基链长度更长。因此，在另一个实施方案中，所述修饰的脂质A部分的至少一个酰基链的长度大于脂质A部分中相同位置的野生型酰基链的长度，优选除了相同的修饰的脂质A部分中其长度如上所述较短的另一个酰基链之外。优选地，至少在2、3、2′和/或3′位置、更优选在2、2′和/或3′位置的伯酰基链的长度大于脂质A部分相同位置的野生酰基链的长度。或者或另外，仲酰基链的长度大于野生型博德特氏菌脂质A部分的仲酰基链的长度。

然而，在优选的实施方案中，本发明涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短，且其中在所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不大于野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链的长度。

因此，3位置的酰基链优选为C₁₆或更少(在野生型博德特氏菌的脂质A部分是例如副百日咳博德特氏菌的情况下)、C₁₂或更少(在野生型博德特氏菌的脂质A部分是例如支气管炎博德特氏菌或欣氏博德特氏菌(B.hinzii)的情况下)或者C₁₀或更少(在野生型博德特氏菌的脂质A部分是例如百日咳博德特氏菌情况下)，如上所述。特别地，如下示例的本发明教导了增加3位置的酰基链长度超过在相同3位置的野生型酰基链的长度可导致博德特氏菌种的致死性。因此，在最优选的实施方案中，所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不超过C₁₀。

相似地，在优选的实施方案中，所述修饰的脂质A部分的2、2′或3′位置的伯酰基链的长度不超过C₁₄和/或仲酰基链的长度不超过C₁₄。

或者或另外，所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与3′位置的酰基链的长度相同。因此，3位置的酰基链以及3′位置的酰基链均是C₂、C₄、C₆、C₁₀、C₁₂、C₁₄或C₁₆。优选这两个酰基链均是C₁₀或C₁₂，最优选这两个酰基链均是C₁₀。

如上所述，所述修饰的脂质A部分中的一或几个酰基链的长度短于脂质A部分中相同位置的野生型酰基链的长度。与野生型长度相比不短的酰基链可以具有与野生型酰基链长度相同的长度或可以更长。优选地，与野生型长度相比不短的酰基链保持与野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链相同的长度，例如保持不变。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短，其中在所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链长度与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链具有相同长度。因此，所述修饰的博德特氏菌脂质A部分的3位置的酰基链长度优选为C₁₀。另外或或者，所述修饰的脂质A部分中2、2′和3′位置至少之一的酰基链可与分别在野生型博德特氏菌脂质A部分的2、2′或3′位置的酰基链具有相同长度。因此，在优选的实施方案中，所述修饰的脂质A部分的2、2′或3′位置至少之一的酰基链的长度是C₁₄。相似地，2′位置的仲酰基链的长度与野生型仲酰基链的长度相同，即为C₁₄。

因此，本发明的修饰的博德特氏菌脂质A部分可具有比野生型博德特氏菌脂质A部分在相同位置的酰基链更短的一或多个酰基链和/或比野生型博德特氏菌脂质A部分在相同位置的酰基链更长的一或多个酰基链和/或与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同位置的酰基链具有相同长度的一或多个酰基链。最优选地，所述修饰的脂质A部分具有比野生型博德特氏菌脂质A部分在相同位置的酰基链的长度更短的至少一个酰基链。

在另一个实施方案中，所述修饰的脂质A部分的酰基链中C原子总数与如上述野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链中C原子总数相同。野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链中的C原子总数为：C₁₄(2位置)+C_1o(3位置)+C₁₄(2′位置)+C₁₄(仲酰基链)+C₁₄(3′位置)，总计66个C原子。在一个优选的实施方案中，所述修饰的脂质A部分的酰基链中C原子总数因此是66个C原子。

或者，所述修饰的脂质A部分的酰基链中C原子总数高于野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链中C原子总数，因此高于66个C原子，优选高于68、70、72或74个C原子。

然而，优选所述修饰的脂质A部分的酰基链中C原子总数低于野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链中C原子总数，因此低于66个C原子，优选总计64、62、60、58、56、54、52、50、48、46、44、42或40个C原子。

特别地，如下示例本发明示出，不依赖于较短酰基链的位置获得对毒性的影响。因此，脂质A分子的疏水部分的总体积对于正确结合和激活hTLR4复合物显然是重要的。据推测，较短的酰基链影响LPS与其受体的相互作用。在膜上，TLR4与MD-2形成复合物[21]。MD-2结合LPS并在疏水袋中容纳六酰化脂质A的六个酰基链中的五个，而一个链位于外部并通过其与第二个TLR4-MD-2复合物的结合刺激TLR4二聚化。此外，脂质A的磷酸基团通过与第二个TLR4分子上的带正电荷的残基相互作用而促进受体二聚化。在四酰化脂质A物种中，酰基链被包埋在MD-2配体结合袋中且不能刺激受体二聚化，而酰基链的暴露在五酰化LPS中是可变的[22]。因此，通过酰基链的数量、长度和位置确定的配体的总酰基链体积可以确定触发TLR4二聚化的酰基链的暴露。不希望受任何理论的束缚，减少博德特氏菌脂质A中酰基链的长度降低了酰基链的体积，这可以使其完全容纳在MD-2结合袋内，从而防止受体二聚化所需的酰基链的暴露。

在进一步优选的实施方案中，本发明的博德特氏菌LPS具有如上定义的经修饰的脂质A部分。除了修饰的脂质A部分外，本发明的博德特氏菌LPS还具有脂多糖结构，所述脂多糖是从博德特氏菌属细菌获得或可获得。博德特氏菌属包括9种革兰氏阴性菌。研究最广泛的是呼吸道病原体百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌。百日咳博德特氏菌仅感染人类，且是婴儿顿咳和成人持续性呼吸道感染的致病因子。副百日咳博德特氏菌存在两个独立的谱系。一种适应人类宿主并引起顿咳；另一种适应绵羊宿主，可以导致慢性肺炎。相比之下，支气管炎博德特氏菌定植于大量动物的呼吸道，虽然在一些农场、宠物和野生动物中引起呼吸道感染，但大多数支气管炎博德特氏菌感染是无症状和慢性的。支气管炎博德特氏菌偶尔从人的呼吸道分离，可能是通过与受感染的动物接触而获得(Preston et al，J.ofBiol.Chem，2006，281(26)：18135-18144)。

例如，百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、欣氏博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌的脂质A部分在Caroff等(Microbes and Infection 4(2002)：915-926，并入本文作参考)的图2中揭示。与支气管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的LPS相反，百日咳博德特氏菌的LPS从不含有O-抗原结构域(Peppler，1984；DiFabio et al.，1992)。因此，百日咳博德特氏菌LPS通常被称为脂寡糖(LOS)。在本发明的上下文中，术语“LOS”和“LPS”在本文中可互换使用。出于一致性原因，将进一步是指LPS。百日咳博德特氏菌产生两种主要LPS形式，即A带和B带LPS(Peppler，1984)。B带LPS由脂质A和由9个碳水化合物组成的核心寡糖组成(Carofr et al.，2000)。向B带LPS添加由N-乙酰葡糖胺、2，3-二乙酰氨基-2，3-二脱氧-甘露糖醛酸和2-乙酰氨基-4-N-甲基-2，4-二脱氧-岩藻糖组成的末端三糖，形成称为A带的LPS。

因此，优选地，本发明涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短且其中除了如本文定义的修饰的脂质A部分之外，所述LPS具有百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌的结构，或具有遗传修饰的这些菌种的菌株，例如下文所述。优选地，所述博德特氏菌LPS除了所述修饰的脂质A部分外，具有百日咳博德特氏菌或副百日咳博德特氏菌的结构，其中百日咳博德特氏菌是最优选的。

在本发明的另一个优选实施方案中，涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短，及其中所述修饰的脂质A部分具有式(I)的结构：

其中X²、X³、X²’、X³’、R²、R³、R²’和R³’各自独立地选自-H、-OH、-Y、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，

其中Y是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n对于每种Y的情况是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。

优选地，X²、X³、X²’、X³’、R²、R³、R²’和R³’各自独立地选自-H、-OH、-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n对于每种Y的情况是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。

在优选的通式(I)化合物中，X₂、X₃、X₂’和X₃’各自独立地选自-H、-OH、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH₂)n-H的烷基部分，n对于每种Y的情况是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数，更优选独立地选自1、3、5、7、9、11、13或15。

在优选的通式(I)化合物中，R₂、R₃、R₂’和R₃’各自均为-Y，其中Y为通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n对于每种Y的情况是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数，更优选独立地选自1、3、5、7、9、11、13或15。

如技术人员所明了，Y对于每种X²、X³、X²’、X³’、R²、R³、R²’和R³’可以是不同的，因此在单个通式(I)化合物中可以出现多种不同的Y。因此，在优选的通式I所示化合物中：

X²选自-H、-OH、-Y^X2、-O-Y^X2、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X2和-O-(C＝O)-Y^X2，其中Y^X2是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数，优选X²是-OH或-O-(C＝O)-Y^X2，最优选X²是-OH；

X³选自-H、-OH、-Y^X3、-O-Y^X3、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X3和-O-(C＝O)-Y^X3，其中Y^X3是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数，优选X³是-OH或-H，最优选X³是-OH；

X²’选自-H、-OH、-Y^X2’、-O-Y^x2’、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X2’和-O-(C＝O)-Y^X2’，其中Y^x2’是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选X²’是-OH、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X2’或者-O-(C＝O)-Y^X2’，其中当X²’是-O-(C＝O)-Y^X2’时，n优选是选自1、3、5、7、9、11或13的整数，更优选n是11或13，最优选n是13，其中当X²’是-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X2’时，n优选是选自2、4、6、8、10或12的整数，更优选n是10或12，最优选n是12；最优选X²’是-O-(C＝O)-Y^X2’，其中n是13；

X³’选自-H、-OH、-Y^X3’、-O-Y^x3’、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^X3’和-O-(C＝O)-Y^X3’，其中Y^X3’是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选X3’是-OH或-O-(C＝O)-Y^X3’，其中当X3’是-O-(C＝O)-Y^X3’时，n优选是选自1、3、5、7、9、11、13或15的整数，更优选n是13或15，最优选n是15；最优选X³’是-OH；

R²选自-H、-OH、-Y^R2、-O-Y^R2、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^R2和-O-(C＝O)-Y^R2，其中Y^R2是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选R²是Y^R2；其中n优选是选自1、3、5、7、9或11的整数，更优选n是9或11，最优选n是11；最优选R²是Y^R2，其中n是11；

R³选自-H、-OH、-Y^R3、-O-Y^R3、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^R3和-O-(C＝O)-Y^R3，其中Y^R3是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选R³是Y^R3，其中n优选是选自1、3、5、7、9、11或13的整数，更优选n是选自7、9或13的整数，最优选n是7；最优选R³是Y^R3，其中n是7；

R²’选自-H、-OH、-Y^R2’、-O-Y^R2’、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^R2’和-O-(C＝O)-Y^R2’，其中Y^R2’是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选R²’是Y^R2’，其中n优选是选自1、3、5、7、9或11的整数，更优选n是9或11，最优选n是11；最优选R²’是Y^R2’，其中n是11；

R³’选自-H、-OH、-Y^R3’、-O-Y^R3’、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y^R3’和-O-(C＝O)-Y^R3’，其中Y^R3’是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数；优选R³’是Y^R3’，其中n优选是选自1、3、5、7、9或11的整数，更优选n是7或11，最优选n是11；最优选R3’是Y^R3’，其中n是11；

当通式(I)的化合物包含-Y^X2、-Y^X3、-Y^X2’或-Y^X3’时，n优选为奇数，更优选为5、7、9、11、13或15，最优选为11或13。当通式(I)的化合物包含-Y^R2、-Y^R3、-Y^R2’或-Y^R3’时，n优选为奇数，更优选为3、5、7、9、11或13，最优选7或11。

在优选的通式(I)化合物中，R²是Y^R2，其中n是9或11。因此，在优选的通式(I)化合物中，R²是-(CH₂)₉-H或X²是-(CH₂)₁₁-H。在进一步优选的通式(I)化合物中，X²是-OH。在更优选的通式(I)化合物中，R²是-(CH₂)9-H或-(CH₂)₁₁-H，X²是-OH。在最优选的通式(I)化合物中，R²是-(CH₂)₁₁-H，X²是-OH。

在优选的通式(I)化合物中，R²′是Y^R2′，其中n是9或11。因此，在优选的通式(I)化合物中，R²′是-(CH₂)₉-H或R²′是-(CH₂)₁₁-H。在进一步优选的通式(I)化合物中，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′。在更优选的通式(I)化合物中，R²′是-(CH₂)₉-H或R²′是-(CH₂)₁₁-H，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′。在最优选的通式(I)化合物中，R²′是-(CH₂)₁₁-H，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′。

在更优选的通式(I)化合物中，X²是Y^R2，其中n是9或11，R²′是Y^R2′，其中n是9或11。因此，在优选的通式(I)化合物中，R²和R²′是-(CH₂)₉-H或-(CH₂)₁₁-H。在更优选的通式(I)化合物中，X²是-OH，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′。在甚至更优选的通式(I)化合物中，R²和R²′是-(CH₂)₉-H或-(CH₂)₁₁-H，X₂是-OH，X₂′是-O-(C＝O)-Y^X2′。更优选地，R²和R²′均为-(CH₂)9-H或均为-(CH₂)₁₁-H，甚至更优选R²和R²′为-(CH₂)₁₁-H。在最优选的通式(I)化合物中，R²和R²′是-(CH₂)₁₁-H，X²是-OH，X²′是-O-(C＝O)-YX²′。

在优选的通式(I)化合物中，R³是Y^R3。在进一步优选的通式(I)化合物中，R³′是Y^R3′。在更优选的通式(I)化合物中，R³是Y^R3，R³′是Y^R3′。在甚至更优选的通式(I)化合物中，R³是Y^R3，R³′是Y^R3′，X³是-H或-OH。

在一组最优选的通式(I)化合物中，R²和R²′是-(CH₂)₉-H，X²是-OH，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′，R³是Y^R3，R³′是Y^R3′，X³是-H或-OH。这些化合物如通式(II₁₂)所示。通式(II₁₂)如下所示。

在另一组最优选的通式(I)化合物中，R²和R²′是-(CH₂)₁₁-H，X²是-OH，X²′是-O-(C＝O)-Y^X2′，R³是Y^R3，R³′是Y^R3′，X³是-H或-OH。这些化合物如通式(II₁₄)所示。通式(II₁₄)如下所示。通式(II₁₂)或(II₁₄)所示化合物可称为通式(II)化合物。在这种情况下，单独提及是指通式(II₁₂)和通式(II₁₄)两者。

在优选的通式(II)化合物中，X³是-OH。在其它优选的通式(II)化合物中，X³′是-OH。在更优选的通式(II)化合物中，X³和X³′是-OH。

在优选的通式(II)化合物中，Y^R3是-(CH₂)₇-H。在更优选的通式(II)化合物中，Y^R3是-(CH₂)₇-H，X3和X3′是-OH。这些化合物如通式(III₁₂)或通式(III₁₄)所示。通式(III₁₂)和(III₁₄)如下所示。通式(III₁₂)或(III₁₄)的化合物可称为通式(III)化合物。在这种情况下，单独提及是指通式(III₁₂)和通式(III₁₄)两者。

在优选的通式(II)化合物中，对于Y^R3′，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；更优选地，对于Y^R3′，n是5、7或9；甚至更优选地，对于Y^R3′，n是7或9；最优选地，对于Y^R3′，n是7。在优选的通式(III)化合物中，对于Y^R3′，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；更优选地，对于Y^R3′，n是5、7或9；甚至更优选地，对于Y^R3，n是7或9；最优选地，对于Y^R3′，n是7。

在优选的通式(II)化合物中，对于Y^X2′，n是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；更优选地，对于Y^x2′，n是7、9、11或13；甚至更优选地，对于Y^X2′，n是为9、11或13；最优选地，对于Y^X2′，n是11或13。在优选的通式(III)化合物中，对于Y^X2′，n是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13；更优选地，对于Y^X2′，n是7、9、11或13；甚至更优选地，对于Y^X2′，n是9、11或13；最优选地，对于Y^X2′，n是11或13。

在更优选的通式(II)化合物中，对于Y^R3′，n是5、7、9或11，对于Y^X2′，n是7、9、11或13；甚至更优选地，对于Y^R3′，n是7或9，对于Y^X2′，n是9、11或13；最优选地，对于Y^R3′，n是7，对于Y^x2′，n是11或13。在特别优选的通式(II)化合物中，对于Y^R3′，n是7，对于Y^X2′，n是11。在另一特别优选的通式(II)化合物中，对于Y^R3′，n是7，对于Y^x2′，n是13。在更优选的通式(III)化合物中，对于Y^R3′，n是5、7、9或11，对于Y^X2′，n是7、9、11或13；甚至更优选地，对于Y^R3′，n是7或9，对于Y^X2′，n是9、11或13；最优选地，对于Y^R3′，n是7，对于Y^X2′，n是11或13。

在高度优选的通式(III)化合物中，该化合物如通式(III₁₄)所示，对于Y^R3′，n是7，对于Y^X2′，n是11。在另一高度优选的通式(III)化合物中，该化合物如通式(III₁₄)所示，对于Y^R3′，n是7，对于Y^X2′，n是13。在高度优选的通式(III)化合物中，该化合物如通式(III_l2)所示，对于Y^R3′，n是7，对于Y^x2′，n是11。在另一高度优选的通式(III)化合物中，该化合物如通式(III₁₂)所示，对于Y^R3′，n是7，对于Y^x2′，n是13。

在进一步的实施方案中，如上文定义的LPS通过或可通过如下文定义的遗传修饰的细菌获得。

遗传修饰的细菌

在第二方面，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌。所述细菌优选包含具有如上定义的修饰的脂质A部分的LPS。所述遗传修饰的细菌可包含LPS，其中其总LPS的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％具有如本文定义的修饰的脂质A部分。或者，其总LPS的100％具有如本文定义的修饰的脂质A部分。

在一个优选的实施方案中，所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰。优选地，导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰赋予细胞异源LpxA、LpxL和LpxD酰基转移酶活性至少之一。

可以使用本领域已知的任何方法完成异源酰基转移酶活性的导入。例如，可以通过修饰内源野生型博德特氏菌酰基转移酶基因、优选通过修饰内源/pxA、/pxL和/pxD酰基转移酶基因的至少之一而导入异源酰基转移酶活性。

在优选的实施方案中，内源酰基转移酶的分子标尺的结构被修饰。为此，本领域已知酰基转移酶具有严格的分子(烃)标尺(ruler)，其决定了对于酰基链长度的特异性。因此，修饰这种烃标尺的结构将改变酰基链长度的特异性。酰基转移酶烃标尺的氨基酸序列为本领域已知(参见例如Wyckoff TJ et al， J Biol Chem.1998273(49)：32369-72和Williams AH et al，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(34)：13543-50)或者可以使用例如与具有已知烃标尺的酰基转移酶的计算机比对而直接获取。

内源酰基转移酶可以使用本领域已知的任何方法进行修饰，包括置换、添加或缺失特定核苷酸或密码子以改变酰基链长度的特异性。

酰基转移酶活性优选通过在博德特氏菌属细菌中表达至少一种异源基因而导入，例如表达异源酰基转移酶。为此，可以将一或多种异源酰基转移酶导入细菌中以获得本文揭示的修饰的LPS。根据本发明使用的这种酰基转移酶能将一定(较短)长度的酰基链转移至博德特氏菌LPS的脂质A部分，从而获得与野生型博德特氏菌LPS脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短的脂质A部分。异源酰基转移酶的表达可以通过本领域已知的任何方法实现。

在特别优选的实施方案中，通过导入异源酰基转移酶来实现异源酰基转移酶活性的导入，所述异源酰基转移酶是LpxA，LpxD和LpxL中的至少一种。或者或另外，导入的异源酰基转移酶是LpxM。这种酰基转移酶为本领域已知，可以得自或者可得自不是如本文定义的野生型博德特氏菌的任何革兰氏阴性菌。此外，还预期异源酰基转移酶可以得自或可得自与野生型博德特氏菌不同物种的博德特氏菌。

酰基链长度的变化由酰基转移酶中的分子标尺确定，其在不同细菌物种的这些酶之间可不同。因此，在本发明的一个优选实施方案中，异源LpxA酰基转移酶可以转移长度为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂的酰基链。相似地，异源LpxD酰基转移酶可以转移长度为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂的酰基链，异源LpxL酰基转移酶可以转移长度为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂的酰基链和/或异源LpxM酰基转移酶可以转移长度为C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀或C₁₂的酰基链。

在进一步优选的实施方案中，酰基转移酶得自或可得自奈瑟氏球菌属(Neisseria)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)或假单胞菌属(Pseudomonas)。因此，酰基转移酶LpxA得自或可得自奈瑟氏球菌属、卟啉单胞菌属或假单胞菌属，酰基转移酶LpxD得自或可得自奈瑟氏球菌属、卟啉单胞菌属或假单胞菌属，和/或酰基转移酶LpxL得自或可得自奈瑟氏球菌属、卟啉单胞菌属或假单胞菌属。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，其它酰基转移酶可同样适用于本发明。

奈瑟氏球菌属的优选菌种包括脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和乳酰胺奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)，其中最优选脑膜炎奈瑟氏球菌。

优选的卟啉单胞菌属菌种包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)、犬齿龈液卟啉单胞菌(Porphyromonas cangingivalis)、犬嘴卟啉单胞菌(Porphyromonas canoris)、犬口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas cansulei)、卡托氏卟啉单胞菌(Porphyromonas catoniae)、牙周卟啉单胞菌(Porphyromonas circumdentaria)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonascrevioricanis)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis)、狗牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivicanis)、Porphyromonas gulae、利氏卟啉单胞菌(Porphyromonaslevii)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)和唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)，其中最优选牙龈卟啉单胞菌。

优选假单胞菌属菌种包括铜绿假单胞菌(Pesudomonas aeruginosa)，恶臭假单胞菌(Pesudomonas putida)，荧光假单胞菌(Pesudomonas fluorescens)和丁香假单胞菌(Pesudomonas syringa)，其中最优选铜绿假单胞菌。

在一个特别优选的实施方案中，博德特氏菌属的细菌具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入lpxA基因的表达，及其中存在如下至少之一情况：i)lpxA基因得自或可得自铜绿假单胞菌，ii)lpxD基因得自或可得自铜绿假单胞菌，和iii)lpxL基因得自或可得自脑膜炎奈瑟氏球菌。

在另一个实施方案中，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比因被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxA基因的表达，其中所述lpxA基因具有编码具有SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：6所示序列的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，或者具有编码与SEQ IDNO：l或SEQ ID NO：6具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，其中优选所述遗传修饰导入至少一种异源lpxA基因的表达，其中所述lpxA基因具有编码具有SEQ ID NO：1所示序列的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，或具有编码与SEQ ID NO：1具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列。

或者或另外，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxL基因的表达，其中所述lpxL基因具有编码具有SEQ ID NO：2、SEQIDNO：3或SEQ ID NO：32所示序列的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列，或者具有编码与SEQIDNO：2、SEQ IDNO：3或SEQ IDNO：32具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列，其中优选所述lpxL基因具有编码具有SEQ ID NO：2所示序列的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列，或具有编码与SEQ ID NO：2具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列。

或者或另外，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxD基因的表达，其中所述lpxD基因具有编码具有SEQ ID NO：4所示序列的LpxD酰基转移酶的核苷酸序列，或基因编码与SEQ ID NO：4具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxD酰基转移酶的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方案中，如上文定义的与SEQ ID NO：1、6、2、3、32或4具有特定程度序列相同性的序列分别保留LxpA(_Pa)、LpxA(_Nm)、LpxL(_Nm)、LpxL(_Pg)、LpxL(_Pa)或LpxD(_Pa)酰基转移酶活性。

在另一个实施方案中，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxA基因的表达，其中所述lpxA基因具有编码具有GenBankWP_003092373.1定义的序列的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，或者具有编码与GenBankWP_003092373.1定义的序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列。

或者或另外，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxL基因的表达，其中所述lpxL基因具有编码具有GenBank WP_002222305.1或GenBank WP_043876343.1定义的序列的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列，或者具有编码与GenBank WP_002222305.1或GenBank WP_043876343.1定义的序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列。

或者或另外，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，其中所述遗传修饰导入至少一种异源lpxD基因的表达，其中所述lpxD基因具有编码具有GenBank WP_003098585.1定义的序列的LpxD酰基转移酶的核苷酸序列，或具有编码与GenBank WP_003098585.1定义的序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的LpxD酰基转移酶的核苷酸序列。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述修饰的细菌包含具有脂质A部分的LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短及其中所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入至少一种异源酰基转移酶活性和异源UDP-2，3二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性的遗传修饰。优选地，所述遗传修饰的细菌具有导入异源酰基转移酶活性和异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性的遗传修饰。

优选地，这种遗传修饰的细菌具有脂质A部分，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为在所述修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度比野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链更长。

优选通过导入异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶实现异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性的导入。这种UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶为本领域已知，可以从不是如本文定义的野生型博德特氏菌的任何革兰氏阴性菌中获得或可获得。此外，还预期异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶可以从与野生型博德特氏菌不同菌种的博德特氏菌获得或可获得。

优选的UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶是LpxH。因此，在优选的实施方案中，所述遗传修饰导入异源lpxH基因的表达。因此，异源lpxH基因的表达在细胞中导入异源UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性。

lpxH基因优选得自或可得自如上文定义的奈瑟氏球菌属、卟啉单胞菌属或假单胞菌属。在更优选的实施方案中，lpxH基因得自或可得自奈瑟氏球菌，更优选地lpxH基因得自或可得自脑膜炎奈瑟氏球菌。最优选地，lpxH基因具有编码LpxH的核苷酸序列，所述LpxH与SEQ ID NO：5具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。

在进一步优选的实施方案中，如上文定义与SEQ ID NO：5具有特定程度的序列相同性的序列保留UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性。

在进一步优选的实施方案中，所述/pxH基因具有编码LpxH的核苷酸序列，所述LpxH与GenBank WP_002222897.1定义的序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性。

如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌可以进一步包含内源/pxH基因，即表达内源LpxH(UDP-2，3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶)的基因，或者所述遗传修饰的细菌仅包含异源LpxH活性，例如确实具有内源LpxH活性。在最优选的实施方案中，所述遗传修饰的细菌不表达与SEQ ID NO：30具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的内源LpxH。

在另一个关于LpxH的实施方案中，所述遗传修饰的细菌仅包含内源/pxH基因，即仅表达内源LpxH。特别地，所述遗传修饰的细菌因此不包含表达异源LpxH的基因。更优选地，如本文定义的遗传修饰的细菌不表达异源奈瑟氏球菌LpxH，最优选不表达异源脑膜炎奈瑟氏球菌LpxH。在进一步优选的实施方案中，所述遗传修饰的细菌仅包含导入表达异源lpxA、lpxL和lpxD基因至少之一的遗传修饰。

本发明的遗传修饰的细菌可含有不同类型LPS的混合物。特别地，所述修饰的细菌除了具有如本文所述的具有至少一个较短酰基链的脂质A部分的LPS之外，还可以含有野生型LPS。或者，所述博德特氏菌属的遗传修饰的细菌主要或仅含有如本文定义的具有较短酰基链的LPS。因此，所述修饰的细菌可以不含有或仅含有痕量的野生型LPS。为了获得不包含或仅包含痕量野生型LPS的博德特氏菌属细菌，可以进一步修饰如上定义的遗传修饰的细菌。为此，在一个优选的实施方案中，如上定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌进一步包含遗传突变，所述遗传突变降低或消除至分别由内源/pxA、/pxD或内源lpxL基因编码的LpxA、LpxD和LpxL酰基转移酶至少之一的活性。

因此，这种遗传修饰的细菌可具有导入异源酰基转移酶活性的突变和降低相应的内源LpxA和/或LpxD酰基转移酶活性的进一步突变。因此，与野生型博德特氏菌比，所述遗传修饰的细菌的总体LpxA和/或LpxD酰基转移酶活性可以增加、相似或降低。

如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰细菌可包含在内源基因中的遗传突变，所述内源基因具有SEQ ID NO：28所示序列，或者具有与SEQ ID NO：28具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性的序列。

或者或另外，如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌可包含在内源基因中的遗传突变，所述内源基因具有SEQ IDNO：29所示序列，或者具有与SEQ IDNO：29具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性的序列。

或者或另外，如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌可包含在内源基因中的遗传突变，所述内源基因具有SEQ IDNO：31所示序列，或者具有与SEQ IDNO：31具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性的序列。

在一个优选的实施方案中，内源lpxA基因、内源lpxD基因和/或内源lpxL基因的表达通过失活所述基因而消除，例如通过本领域已知的方法破坏或缺失所述基因。

在本发明的另一个实施方案中，如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌。优选地，所述遗传修饰的细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌。在进一步优选的实施方案中，所述遗传修饰的细菌是百日咳博德特氏菌Tohama I菌株或其衍生物。优选地，所述Tohama I菌株衍生物是Tohama I菌株的链霉素抗性衍生物，最优选所述遗传修饰的细菌衍生自菌株B213或其衍生物。或者，所述遗传修饰的细菌是百日咳博德特氏菌B1917或B1920菌株或其衍生物。

此外，本发明的遗传修饰的细菌可以具有一或若干个进一步修饰，例如降低LPS内毒性的突变。例如，本发明的博德特氏菌LPS可具有修饰的寡糖结构，以除去可能引起自身免疫应答的表位，和/或增加与树突细胞的结合和佐剂活性。此外，如本文定义的本发明的遗传修饰的细菌可以进一步包含增加脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰。

如上所述，在此应理解，较短的酰基链不包括完全不存在酰基链。因此，较短的酰基链表示存在酰基链。然而，修饰的脂质A部分除了较短的酰基链之外还可具有与野生型博德特氏菌脂质A部分的酰基链数目相比较少的酰基链。例如，至少部分3-O-脱酰的LPS和/或脂质A的存在可以进一步降低LPS毒性且可以减少对象的副作用数量和严重性。

因此，所述博德特氏菌属的遗传修饰的细菌可以包含LPS分子的混合物，其中所述LPS分子可以是i)野生型LPS和/或ii)具有脂质A部分的LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度较短和/或iii)脱酰基例如3-O-脱酰化的LPS的混合物。或者或另外，本发明的遗传修饰的细菌可包含具有脂质A部分的LPS分子，所述脂质A部分具有至少一个较短的酰基链且也是3-O-脱酰化的。本发明还涉及得自这种遗传修饰的细菌的LPS。

优选地，如本文定义的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌进一步包含编码具有SEQID NO：25的多肽(支气管炎博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的PagL蛋白，GenBank WP_003813842.1)的核酸，或者包含编码与SEQ ID NO.25具有至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的氨基酸相同性的多肽的核酸，并且所述多肽呈现出脂质A 3-O-脱酰酶活性。

包含本发明LPS的OMV

第三方面，本发明涉及包含如本文定义的博德特氏菌LPS的OMV。例如用于疫苗中的OMV(也称为“blebs”)，传统上是通过洗涤剂提取(dOMV纯化方法)制备，其中洗涤剂如脱氧胆酸盐用于除去LPS并增加囊泡释放。通过细胞超声处理和DOC处理制备的OMV制剂与明矾佐剂组合在小鼠模型中提供了针对百日咳的保护作用[Roberts，R.，Vaccine 2008，26，4639-4646]，其效果与全细胞疫苗相当。含有PagL-脱酰化修饰的LPS的另一种形式的OMV示出保护作用和较低的反应原性，后者通过体重增加和细胞因子诱导在体内测定[Asensio，C.J.，Vaccine 2011，29，1649-1656]。副百日咳博德特氏菌OMV的另一个有趣的发现是其对百日咳和副百日咳的交叉保护作用[Bottero，D.Vaccine 2013，31，5262-5268]。

大多数革兰氏阴性细菌如博德特氏菌的LPS是毒性的。然而，本发明的博德特氏菌LPS可以比毒性野生型LPS更大程度地存在于OMV中。因此，洗涤剂提取过程因此可以用不需要存在洗涤剂的方法代替。因此，包含根据本发明的博德特氏菌LPS的OMV不必是洗涤剂提取的OMV。然而应理解，制备不是洗涤剂提取的OMV的OMV的方法不排除使用任何洗涤剂。只要(例如与等量相同培养物的自发或上清OMV中存在的博德特氏菌LPS的量相比)保留大多数本发明的修饰的博德特氏菌LPS即保留至少5％、10％、20％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰的博德特氏菌LPS，则不排除使用低浓度洗涤剂和/或使用温和洗涤剂。

包含本发明的博德特氏菌LPS的优选OMV是上清或自发OMV，即如上文所定义的sOMV，或者天然OMV，即如上文定义的nOMV。或者，包含本发明的博德特氏菌LPS的OMV是洗涤剂提取的OMV。制备dOMV、sOMV和nOMV的方法在van de Waterbeemd et al(2010)和van deWaterbeemd et al(2013)(van de Waterbeemd B et al，Vaccine.2010；28(30)：4810-6以及van de Waterbeemd B，.PLoS One.201331；8(5)：e65157)和WO2013/006055中描述，所有文献均并入本文参考。

在一个优选的实施方案中，所述包含所述修饰的博德特氏菌LPS的OMV可得自或得自如上定义的遗传修饰的细菌。

组合物

第四方面，本发明涉及一种组合物，其包含如上文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌和OMV中的至少一种。优选地，所述组合物是药物组合物。更优选地，所述药物组合物进一步包含本领域常规已知的药学可接受的赋形剂、载体、介质或递送载体(参见例如“Handbook ofPharmaceutical Excipients”，Rowe et al eds.7th edition，2012，www.pharmpress.com)。药学可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等也可以掺入药物组合物中。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。药物载体可以是适于递送给患者的任何相容的无毒物质。“本发明的活性成分”在本文中被理解为如上文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌或OMV中的一或多种。

用于肠胃外递送的药学可接受的载体例如是无菌缓冲的0.9％NaCl或5％葡萄糖，任选地补充有20％白蛋白。或者，可以将本发明的活性成分悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。肠胃外施用的制剂必须是无菌的。施用本发明活性成分的肠胃外途径与已知方法一致，例如通过静脉内、腹膜内、肌肉内和动脉内或病灶内途径注射或输注。或者，可以通过吸入施用所述组合物。可以通过输注连续或推注注射施用所述组合物。优选地，通过推注注射施用所述组合物。用于肌内注射的典型药物组合物可以制成含有例如1-10ml磷酸盐缓冲盐水，其包含有效剂量的本发明活性成分。制备胃肠外可施用组合物的方法为本领域熟知且在各种资源中更详细地描述，包括例如“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”(Ed.Allen，L.V.22nd edition，2012，www.pharmpress.com)。

医学用途

第五方面，本发明涉及用作药物的包含如上文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰细菌和OMV中至少之一的组合物。换句话说，本发明因此涉及本发明的博德特氏菌LPS、本发明的遗传修饰的细菌、本发明的OMV和本发明的药物组合物中至少之一作为药物的应用。本发明还涉及使用如上文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌和OMV中至少之一的治疗方法。

第六方面，本发明涉及用于治疗的包含如上文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌和OMV中至少之一的组合物，所述治疗包括在对象中诱导免疫应答。或者，本发明涉及用于治疗的包含如本文定义的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌和OMV至少之一的组合物，所述治疗包括在对象中刺激免疫应答。特别地，本发明因此涉及免疫接种方法。

在优选的实施方案中，诱导或刺激针对博德特氏菌感染的免疫应答。为此，三种博德特氏菌是已知的人病原体(百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌)。在特别优选的实施方案中，因此诱导或刺激针对百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌感染的免疫应答。

百日咳博德特氏菌及偶尔地副百日咳博德特氏菌在人体导致百日咳或顿咳，一些副百日咳博德特氏菌菌株可定植于绵羊。尽管已报道了免疫功能低下患者中发生疾病，但支气管炎博德特氏菌很少感染健康人。支气管炎博德特氏菌在其它哺乳动物中导致一些疾病，包括在狗和猪中导致犬舍咳和萎缩性鼻炎。这个菌属的其它成员(欣氏博德特氏菌，鸟博德特氏菌(B.avium))在其它哺乳动物和鸟类中导致相似疾病。

最优选地，针对百日咳博德特氏菌感染诱导或刺激免疫应答。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及如上文定义的用于治疗的组合物，所述治疗包括在对象中诱导或刺激免疫应答，其中所述治疗是治疗顿咳。为此，所述对象未接种疫苗或可能先前针对博德特氏菌进行了接种。另外或或者，所述治疗是预防顿咳。还应注意，术语“百日咳”、“顿咳”和“100天的咳嗽”在本文中可互换使用。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗。所述疫苗可以是无细胞疫苗，优选包含如上文定义的博德特氏菌LPS和OMV中至少之一。更优选地，所述疫苗是全细胞疫苗，其至少包含如上文定义的细菌。

因此，本发明涉及用作药物优选用于治疗的(药物)组合物，所述治疗包括在对象中诱导或刺激免疫应答，其中所述组合物是包含如上定义的遗传修饰的细菌的全细胞疫苗。本发明的遗传修饰的细菌可以是活的或减毒活细菌或非存活的细菌。优选地，使用本领域已知的方法灭活或杀死细菌。例如，所述遗传修饰的细菌可以通过冷冻、热处理、机械破碎、化学处理或者通过药学和免疫接种领域中已知的其它方法灭活(参见例如J.L.Pace，H.A.Rossi，V.M.Esposito，S.M.Frey，K.D.Tucker，R.I.Walker.Inactivated whole-cellbacterial vaccines：current status and novel strategies.Vaccine 16：1563-1574(1998))。优选地，所述细菌是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌，最优选百日咳博德特氏菌。

在另一个优选的实施方案中，本发明的(药物)组合物是无细胞疫苗，其包含如上文定义的博德特氏菌LPS或者如上文定义的OMV。

本发明的(无细胞)疫苗可以进一步包含博德特氏菌属细菌的1、2、3或更多种免疫原性成分。优选地，(无细胞)疫苗进一步包含灭活的博德特氏菌毒素，单独或与其它博德特氏菌成分例如丝状血细胞凝集素、菌毛抗原和百日咳杆菌粘附素组合。

如本文定义的修饰的LPS或OMV可用于激发针对博德特氏菌的保护性免疫应答，但或者也可与其它组合物混合使用。在另一个实施方案中，本发明因此涉及用作药物或用于治疗的如上定义的组合物，所述治疗包括在对象中诱导或刺激免疫应答，其中所述组合物还包含至少一种非博德特氏菌抗原。所述抗原是如上定义的任何抗原。特别地，博德特氏菌疫苗可以与本领域已知的其它疫苗组合。在优选的实施方案中，将博德特氏菌疫苗、最优选全细胞博德特氏菌疫苗与白喉和破伤风疫苗中至少之一组合。在最优选的实施方案中，将(全细胞)博德特氏菌疫苗与白喉以及破伤风疫苗组合。

第七方面，本发明的LPS用作合适的佐剂物质。本领域中已知LPS是用于免疫接种目的的合适佐剂，激活Toll样受体并刺激先天免疫应答。本发明的部分去毒的LPS和/或脂质A可以保留这种免疫刺激(佐剂)活性，同时引起较少毒性相关的不良副作用，例如局部肿胀、发红、疼痛和发热。

本发明的药学可接受的组合物和疫苗可用于治疗患有病原性革兰氏阴性细菌感染、优选博德特氏菌感染或处于获得病原性革兰氏阴性细菌感染、优选博德特氏菌感染的危险中的对象的方法，包括施用本发明的药物组合物、全细胞疫苗或者无细胞疫苗。特定佐剂的使用、组合物中物质的相对和绝对量以及施用的剂量方案是已知的或者可由技术人员确定，且可以根据如特定病原体感染或者治疗的特殊对象的状态等情况而调整。剂量方案可以包括单剂量，但也可以包括多剂量，例如加强剂量，且可以口服、鼻内或肠胃外施用。用于免疫接种目的的各种剂量方案为本领域已知且可以由技术人员适当调整。

第八方面，本发明涉及本发明的修饰的博德特氏菌LPS用作Toll样受体4(TLR4)拮抗剂。优选地，这种拮抗剂可用于治疗或减少败血症或抗大量免疫反应，例如细胞因子风暴。更优选地，本发明的修饰的LPS用于治疗在流感感染期间发生的细胞因子风暴。

第九方面，本发明涉及产生本发明的博德特氏菌属的遗传修饰的细菌、博德特氏菌LPS或OMV的方法。所述方法优选包括以下步骤：a)培养如上文定义的遗传修饰的细菌；和任选地包括b)纯化和灭活所述遗传修饰的细菌的至少之一。另外，或者代替步骤b)，可以提取和/或纯化所述LPS或OMV。纯化和灭活博德特氏菌的方法为本领域熟知。相似地，LPS或OMV的纯化/提取可以使用本领域已知的任何合适方法进行。

第十方面，本发明涉及生产疫苗制剂，所述疫苗制剂包含本文定义的灭活的修饰的博德特氏菌细菌、OMV和LPS中至少一种。所述方法优选包括步骤a)培养如上文定义的遗传修饰的细菌；b)对所述遗传修饰的细菌进行纯化和灭活至少之一，和c)将所述博德特氏菌细菌、OMV和LPS至少之一，任选与其它疫苗组分一起，配制成疫苗制剂。另外，或者代替步骤b)，可以提取和/或纯化LPS或OMV。

还应理解，所述组合物在治疗如上所述医学状况中的用途还包括该组合物在生产用于相应医学治疗的药物中的应用，以及通过给对象施用有效量的该组合物治疗患有这种医学状况的对象的方法。

在本文及其权利要求中，动词“包含”及其变化用语以其非限制性含义使用，表示包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，提及某元件时，不定冠词“一个”不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元件。因此，不定冠词“一个”通常意味着“至少一个”。

本说明书中引用的所有专利和参考文献均以其全部内容并入本文参考。

提供以下实施例仅用于举例说明目的，不意图以任何方式限制本发明的范围。

附图简述

图1.野生型和遗传修饰百日咳博德特氏菌的脂质A结构。(A)野生型百日咳博德特氏菌的脂质A结构。B)预测的表达LpxA_(Nm)ΔlpxA的百日咳博德特氏菌的脂质A结构。C)表达LpxA(_Pa)ΔlpxA的百日咳博德特氏菌的脂质A结构。D)表达LpxL(_Nm)ΔlpxL的百日咳博德特氏菌的脂质A结构，及E)表达LpxL(_Pg)ΔlpxL的百日咳博德特氏菌的脂质A结构，及F)表达LpxD(_Pa)ΔlpxD的百日咳博德特氏菌的脂质A结构，ΔlpxA、ΔlpxL和ΔlpxD分别表示染色体lpxA、lpxL和ΔlpxD基因的失活。

图2.异源酶表达对生长的影响。A)示出在存在1mM IPTG条件下在Verweij培养基中生长18小时后，B213及自pMMB67EH质粒表达LpxL_(Nm)、LpxA_(Pa)或LpxL_(Pg)的衍生物的培养物的OD₅₉₀。起始OD₅₉₀为0.05。数据来自一式两份的代表性实验，其中给出了平均值和标准差。表达LpxL_(Nm)的菌株的生长缺陷在另外两个实验中再现。B)LpxD_(Pa)示出在存在1mM IPTG条件下在液体Verweij培养基中生长12和24小时后，B213和B213-pLpxD_pa克隆4(cl4)和克隆5(cl5)的培养物在590nm的OD (OD₅₉₀)。起始OD₅₉₀为0.05。

图3.通过ESI-MS对脂质A的结构分析。负离子脂质A质谱通过完整LPS的源内碰撞诱导解离纳米ESI-FT-MS获得，所述完整LPS分离自B213、表达LpxA_(Pa)的B213(B213-pLpxA_(Pa))、表达LpxA_(Pa)背景的B213的ΔlpxA突变体(B213ΔlpxA-pLpxA_(Pa))、表达LpxL_(Nm)的B213(B213-pLpxL_(Nm))、表达LpxL_(pg)的B213(B213-pLpxL_(Pg))和表达LpxD(Pa)的B213(B213-pLpxD(Pa))(克隆4和5)。将细菌在存在1mM IPTG条件下在液体Verweij培养基中生长12小时。在m/z 1557.97的主要单去质子化离子解释为典型百日咳博德特氏菌脂质A结构：具有两个磷酸残基(2P)五酰化(三个3OH-C14，一个3OH-C10和一个C14)的二葡糖胺(2GlcN)，如图1所示。在不同的衍生物中检测到另外的单去质子化的脂质A离子，也示出其解释。仅示出了覆盖脂质A离子的m/z范围。

图4.用纯化的LPS(A，B)或B213和LPS突变体衍生物的全细胞制剂(C，D)刺激表达hTLR4(A，C)或mTLR4(B，D)的HEK293细胞。将调节至OD₅₉₀为0.1的LPS制剂和细菌悬浮液连续稀释。在与表达mTLR4的HEK293细胞温育2小时或者与表达hTLR4的HEK293细胞温育4小时后，通过加入底物并测量在630nm的OD而确定碱性磷酸酶活性。示出一个代表性实验。

图5.用纯化自B21、B213ΔlpxA-pLpxA_(Pa)和B213-pLpxD_(Pa)cl4及cl5的LPS刺激表达hTLR4的HEK293细胞。将浓度为2μg/ml的纯化LPS连续稀释，加入培养的细胞中并温育4小时。提供了在630nm的OD，其是由于SEAP活性的结果。

图6.体内致热原性。通过纯化自lpxA_(Pa)突变体和lpxD_(Pa)突变体的突变百日咳博德特氏菌LPS及提取自lpxD_(Pa)突变体的OMV在兔中诱导的致热原性，均与百日咳博德特氏菌野生型LPS和OMV进行对比。致热原性以0-48小时和0-8小时间隔的曲线下面积表示。

实施例

实施例1

材料和方法

质粒、菌株和生长条件

表1列出了本研究中使用的所有质粒和菌株。将百日咳博德特氏菌菌株在补充有15％去纤维蛋白的绵羊血(Biotrading)的Bordet-Gengou琼脂(Difco)上在35℃培养48小时。为了在液体培养物中生长细菌，从固体培养基中收集细菌并在Verweij培养基[16]中稀释至OD₅₉₀为0.05，在125ml方形培养基瓶中以175rpm恒定振荡温育。在一些测定中，将细菌在60℃温育1小时灭活，重悬浮于PBS中并调节至OD₅₉₀为0.5。将大肠杆菌菌株在37℃的溶原肉汤(LB)或LB琼脂中生长。

对于所有菌株，当需要时为培养基补加卡那霉素(100μg/ml)、庆大霉素(10μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)、萘啶酸(50μg/ml)或链霉素(300μg)，对于大肠杆菌或百日咳博德特氏菌，分别补加0.1或1mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白质表达。

表1：使用的质粒和菌株

AmpR，氨苄青霉素抗性；GmR，庆大霉素抗性；KanR，卡那霉素抗性；StrR，链霉素抗性。

遗传操纵

使用高保真聚合酶(Roche Diagnostics GmbH，Germany)进行PCR。PCR混合物由1μl模板DNA、200μM dNTP(Fermentas)、0.25μM不同引物组合(SEQ ID NO：7-24，见表2)、0.5UDNA聚合酶和PCR缓冲液组成。将混合物在95℃温育10分钟进行DNA变性，然后进行30次如下循环：95℃1分钟，58℃0.5分钟以及每kbp的预期扩增子大小在72℃延伸1分钟。在72℃进行10分钟的延长的延伸步骤终止反应。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离所得产物，使用溴化乙锭显像。

将编码不同细菌的LPS生物合成酶的基因通过PCR从细菌原种扩增并克隆进广泛宿主范围的表达载体pMMB67EH中。为此，分别使用Promega提供的Clean-Up System和Plasmid Extraction试剂盒纯化PCR产物和质粒pMMB67EH-PagL_(Pa)。将纯化的质粒和PCR产物用位点包含在引物中(SEQ ID NO：7-24、26和27，见表2)的限制酶(Fermentas，TheNetherlands)消化，随后连接在一起。为了敲除染色体lpxA和lpxL基因，使用所述质粒。

按照标准方案用连接产物或质粒转化大肠杆菌DH5α。通过PCR选择正确克隆，及在Macrogen测序服务部门(Amsterdam)对所述质粒进行纯化和测序。然后，通过转化将质粒移至大肠杆菌菌株SM10λpir中，然后通过缀合移至百日咳博德特氏菌菌株B213中，使用氨苄青霉素和萘啶酸分别用于选择和反选择。为了产生染色体突变，通过选择卡那霉素或庆大霉素抗性转移接合子，通过单一交换将含有赋予链霉素敏感性的rpsL基因的敲除质粒(Skorupsky and Taylor，1996)整合到染色体中；所得细菌已失去链霉素抗性。随后，为了通过第二次交换选择质粒丧失，将细菌在液体培养基中培养，在具有链霉素和卡那霉素或庆大霉素的平板上选择突变体。通过PCR验证百日咳博德特氏菌转移接合子中质粒的存在和敲除突变体的正确产生。

为了在百日咳博德特氏菌中表达靶向酶LpxD_Pa，使用载体pMMB67EH通过PCR使用校正读码酶(高保真聚合酶，Roche Diagnostics GmbH)用引物LpxD-Fw Pa NdeI(SEQ ID NO：26)和LpxD-rev-His Pa HindIII(SEQ ID NO：27)从铜绿假单胞菌菌株PAO1扩增lpxD。所述引物均均含有用于限制酶的序列以促进克隆，反向引物还含有编码His₆-标签的序列，以便通过western印迹检测重组蛋白。克隆后，PCR产物在pMMB67EH上tac启动子之后，确认了插入物的正确序列。

RNA提取和RT-PCR

为了获得RNA，通过在Eppendorf离心机5424中以5000rpm离心10分钟收集来自指数生长培养物的细胞，调节至OD₅₅₀为4，并重悬于trizol(Invitrogen，U.K.)中。然后，加入200μl氯仿/ml trizol，然后在5000rpm离心30分钟。将所得上层与等量的冰冷的75％乙醇混合。接着，使用Nucleospin RNAII试剂盒(Macherey-Nagel，U.S.A.)根据厂商指导分离RNA。将所得溶液用Turbo DNA free(Ambion，Germany)在37℃处理1小时以除去基因组DNA，然后根据厂商指导进行DNase灭活以产生纯RNA。使用Transcriptor High FidelitycDNASynthesis Kit(Roche，The Netherlands)将该RNA立即用于产生cDNA。RNA、cDNA和染色体DNA在使用引物(参见表2，SEQ IDNO：7-24、26和27)的PCR中用作模板，以确定特定转录物的产生。

电泳技术

将全细胞裂解物调节为OD600为5.0，以1∶1溶于双倍强度的样品缓冲液中及在100℃加热10分钟。对于LPS观测，在煮沸后将全细胞裂解物用蛋白酶K在37℃处理1小时。将蛋白质和LPS分别在14％和16％丙烯酰胺凝胶上分离，之后分别用考马斯亮蓝G250或银染色染色。

LPS纯化和分析

用热酚水(Westphal，1965)从细菌中提取LPS并在C8反相柱上通过固相萃取(SPE)进一步纯化。简言之，通过离心从培养悬浮液中收集细菌，在70℃用水悬浮并在相同温度下与0.8体积的苯酚混合。通过离心分离水相和酚相后，通过加入1体积0.356M乙酸三乙基铵(TEAA)pH7(溶剂A)和1/3体积的2-丙醇：水∶三乙胺∶乙酸(70：30：0.03：0.01，v/v)pH8.9(溶剂B)制备水相用于SPE。使用20位真空歧管(Waters)，通过SPE在反相Sep-Pak C8柱(3ml注射器-桶型Vac柱，200mg C8树脂，Waters)上同时纯化LPS提取物。通过在真空下连续施加3×1ml溶剂B、2-丙醇：水：三乙胺：乙酸(10：90：0.03：0.01，v/v)pH8.9(溶剂C)、0.07mM TEAApH7(溶剂D)和溶剂A对SPE柱条件化。然后，将样品加样于柱中，并将每个柱依次用3×1ml溶剂A、D和C洗涤。通过施加2×0.3ml溶剂B从柱中洗脱LPS。将洗脱物在离心真空浓缩器中干燥并悬浮在水中。通过Tricine-SDS-PAGE组合LPS银和考马斯染色来判断纯化样品的纯度和完整性。为了分析脂质A结构，在LTQ Orbitrap XL仪器(Thermo Scientific)上对纯化的LPS进行负离子纳米电喷雾电离-Fourier转换-质谱分析(nano-ESI-FT-MS)。将LPS样品溶解在pH8.5的2-丙醇、水和三乙胺(50∶50∶0.001，vol/vol/vol)的混合物中，使用镀金拉丝玻璃毛细管通过nano-ESI注入质谱仪中，如先前所述(Pupo etal，2014)(Kondakov，A.，andLindner，B.(2005)Structural characterization of complex bacterial glycolipidsby Fourier transform mass spectrometry.Eur J Mass Spectrom(Chichester，Eng)11，535-546)。喷雾电压设定为-1.2kV，加热毛细管的温度为250℃。在这些电离条件下，没有产生明显的LPS片段化。为记录脂质A质谱，LPS的nano-ESI-FT-MS使用源内碰撞诱导解离(CID)在100V的电位差下进行。在这个设置下的源内CID产生相应于完整脂质A结构域的强力片段，源自非还原性脂质A葡糖胺和Kdo之间不稳定连接的断裂，具有最小的脂质A片段化，如野生型B213菌株的脂质A的质谱中所示(图3a)。

真核细胞系培养和刺激

用人或小鼠TLR4组合MD-2和CD14转染的人NF-κB/SEAP报告基因HEK293细胞购自InvivoGen。这两个细胞系均含有NF-κB可诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，其在TLR信号传导后表达。如前所述，将细胞在HEK-Blue培养基中生长[19]。加入底物Quanti-Blue(InvivoGen)后，在培养物上清中检测SEAP。将人单核细胞系MonoMac6(MM6；DSMZ)在补加10％热灭活的FCS、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM；Gibco)中生长。所有细胞系均在37℃在5％饱和CO₂环境中培养。

对于TLR4信号传导，将HEK-Blue细胞系(2.5×10⁴)与纯化的LPS或热灭活的全细胞制剂的系列稀释液一起在96孔平板中温育。在37℃温育2、4或6小时后，收集上清并与Quanti-Blue底物一起温育2小时，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)读器测量OD₆₃₀。

结果

在百日咳博德特氏菌中表达异源LpxL和LpxA

为了修饰百日咳博德特氏菌脂质A的3和3′位置的伯酰基链以及仅仲酰基链的长度，使用来自其它细菌的LpxA和LpxL酰基转移酶。百日咳博德特氏菌脂质A在3和3’位置分别含有3OH-C10和3OH-C14链(图1a)。我们研究了用来自脑膜炎奈瑟氏球菌(LpxA(_Nm))或铜绿假单胞菌(LpxA_(Pa))的相应酶置换LpxA是否会导致酰基链的修饰。相似地，我们研究了用来自牙龈卟啉单胞菌(LpxL_(Pg))或脑膜炎奈瑟氏球菌(LpxL_(Nm))的相应酶取代百日咳博德特氏菌的LpxL是否会导致酰基链的修饰。

将异源酶的基因克隆进广泛宿主范围的表达载体pMMB67EH中在tac启动子控制下。首先通过RT-PCR在克隆宿主大肠杆菌BL21(DE3)中评估重组酶LpxA和LpxL的表达(数据未显示)。这些测定证实当细菌与IPTG一起生长时存在感兴趣基因的转录，而当细菌在不存在IPTG的情况下生长时，这些转录物的丰度低很多或者不可检测。通过SDS-PAGE也检测蛋白质表达；LpxA蛋白比LpxL蛋白以更高的丰度表达(数据未显示)。

然后将质粒转移至百日咳博德特氏菌菌株B213，这是菌株Tohama I的衍生物(表1)。令人惊讶地，尽管pMMB67EH-LpxA_(Nm)被成功地导入百日咳博德特氏菌中，如PCR所证明，但是在重新铺板在含有氨苄青霉素以维持质粒及在无IPTG条件的平板上之后，转移接合子不能生长。因此，显然，甚至脑膜炎奈瑟球菌LpxA的未诱导的表达水平在百日咳博德特氏菌中也是致命的，尽管在大肠杆菌中不是这种情况。预计通过导入Lpx_(Nm)酶产生的LPS如图1B所示。我们还注意到LpxL_(Nm)的表达损害生长(图S1C)。所有其它重组菌株均如野生型一样生长(图2(S1C))。

首先在质粒移至其中的大肠杆菌菌株BL21(DE3)中测试重组蛋白LpxD_(pa)的表达。所得菌株称为BL21-pLpxD_Pa。向培养物中加入IPTG不影响生长(数据未显示)。在分析BL21(DE3)和BL21-pLpxD_Pa的全细胞裂解物的常规考马斯蓝染色凝胶上未检测到蛋白质的表达。然而，Western印迹分析示出抗Hi_s6-标签抗体与BL21-pLpxD_Pa中预期大小LpxD_Pa(36.4kDa)条带的反应(数据未显示)，该条带在BL21(DE3)样品中不存在。接下来，使用大肠杆菌菌株SM10λpir作为供体通过接合将质粒转移至百日咳博德特氏菌B213，并保存两个转移接合子。在1mM IPTG存在下，这两个克隆与亲本相比均示出生长缺陷(图2B)，这对于克隆5更为明显。Western印迹测定证实这两种克隆中酶的表达(数据未显示)，同时观测到表达水平没有差异。

重组脂质A结构的分析

然后使用从在1mM IPTG存在下生长12小时(对数生长)的全细胞中提取的纯化的LPS，通过nano-ESI-MS分析脂质A结构。对于野生型菌株，在m/z 1557.97观测到主峰，其相应于预期的二磷酸化的五乙酰化脂质A(图3A)。在表达LpxA_(Pa)的菌株中，除了在m/z1557.97的离子外，光谱显示在m/z 1501.91和1529.94的两个其它离子(图3B)。在m/z1501.91的离子相应在3′位置3OH-C10取代伯3OH-C14酰基链(图1C)，而m/z 1529.94离子表示存在具有中间C12链长的羟基化脂肪酸。这两个新物种相对于m/z 1557.97野生型结构的相对丰度仅为48％和75％，这可能是由于染色体上内源/pxA的表达所致。因此，我们决定敲除染色体/pxA拷贝。对所得菌株的MS分析表明m/z 1557.97离子完全丧失，以及m/z1529.94离子的丰度急剧下降，留下相应于所述取代的m/z 1501.9l的主峰(图lC和图3C)。

对B213-LpxL_(Nm)的MS分析检测到野生型m/z 1557.97离子是次要物种，而m/z1529.94的主峰相应于C12取代仲C14酰基链(图1D和图3D)。尝试缺失染色体/pxL失败。百日咳博德特氏菌在染色体上含有两个相邻的/pxL同源物，但只有一个称为lpxL2在实验室生长条件下具有活性[20]。使用不同的构建体部分或完全缺失lpxL2基因；然而，尽管付出了相当大的努力，但我们未获得希望的敲除。

显然，考虑到野生型菌株中LpxL_(Nm)的表达已经改变了大约65％的脂质A结构，因此lpxL2基因序列而不是酶对百日咳博德特氏菌是必需的。这可能是由于lpxL2破坏对下游基因dapF表达的极性影响所致，所述dapF基因编码L，L-DAP差向异构酶，其将L，L-二氨基庚二酸(DAP)催化为meso-DAP。Meso-DAP对细胞壁合成和赖氨酸生物合成至关重要。然而，在meso-DAP存在下试图使lpxL₂基因失活也失败了。对B213-LpxL_(Pg)的MS分析表明m/z1557.98离子的丰度急剧减少，及出现m/z 1586.01的新峰，其相应于用C16链取代C14(图1E和图2e)。总之，LpxA_(Pa)、LpxL_(Nm)和LpxL_(Pg)在百日咳博德特氏菌中的异源表达导致LPS改变，如图1所示。

对B213-pLpxD_(Pa)克隆4和5的分析表明在这两种突变体中，发现在m/z 1557.97的离子相应于野生型中发现的标准五酰化脂质A(图3F和3G)。此外，发现m/z 1529.94和1501.91的丰富离子分别相应于一或两个酰基链自3OH-C14至3OH-C12的长度的缩短(图3F和3G)。这些其它主要离子的丰度在两个克隆之间变化；克隆5中m/z1529.94峰的相对丰度低于克隆4，对于m/z为1501.91峰反之亦然。因此，克隆5比克隆4具有较高量的脂质A分子，其中脂质A中两个酰基链的长度完全修饰，但在这两种情况下都保留了相当量的未改变的脂质A。这些结果表明LpxD_Pa的表达修饰了脂质A的结构，如图1所示。

通过LPS变体不同激活TLR4

我们接下来研究了改变的结构是否影响LPS的毒性。为此，将纯化的LPS制剂加入到表达人或小鼠TLR4复合物(分别为hTLR4和mTLR4)的HEK293细胞培养物中。暴露后，通过报告基因表达评估受体的活化(图4)。有趣的是，来自B213-pLpxA_(Pa)的LPS刺激hTLR4远低于来自野生型菌株的LPS(图4A)。仍然检测到的剩余活化是由于染色体lpxA基因的表达所致，因为其在这个基因失活后完全消除(图4A)。因此，3′位置的伯酰基链的长度与百日咳LPS激活hTLR4相关。来自B213-pLpxL_(Nm)和B213-pLpxL_(Pg)的LPS分别降低和增加hTLR4活化(图4A)。因此，hTLR4的刺激与仲酰基链的长度以C16＞C14＞C12的顺序相关。

为了评估表达LpxD_(Pa)的菌株的改变的LPS的毒性，将来自两个突变体和野生型的纯化的LPS的制备物加入表达人TLR4受体(hTLR4)(InvivoGen)的HEK-Blue细胞培养物中。作为阴性对照，我们使用来自菌株B213ΔlpxA-pLpxA_(Pa)的纯化的LPS，其在3′位置含有3OH-C10酰基链而不是3OH-C14且不激活hTLR4。在暴露4小时后，通过SEAP报告基因表达评估受体的活化，结果示于图5中。来自B213-pLpxD_(Pa)克隆4和克隆5的LPS示出比野生型LPS明显较低的活性。用来自克隆5的LPS刺激的细胞的SEAP活性与未刺激的细胞一样低，而用来自克隆4的LPS刺激的细胞示出低剩余活性，这可能与这个克隆中酰基链的略低效的修饰一致(图3)。用来自B213ΔlpxA-pLpxA_(Pa)的LPS刺激的细胞示出甚至比未刺激的细胞更低的SEAP活性。

用来自野生型菌株B213的LPS制剂刺激表达mTLR4的HEK293细胞产生比在表达hTLR4的细胞中观测到的更强的应答(比较图4A和B)。来自表达异源酶的B213细胞的LPS制剂在刺激这些细胞方面的效果稍差(图4B)。然而，当染色体lpxA基因在表达LpxA_(Pa)的B213中失活时，所得LPS根本不激活mTLR4(图4B)。因此，人和小鼠TLR4由修饰的百日咳LPS不同地激活，但是在两种情况下3′位置的伯酰基链的长度是关键的。先前报道，失去3位置伯酰基链的百日咳博德特氏菌LPS的毒性降低在全细胞制剂中由于其从膜释放增加而是无效的[2]。考虑到这一点，我们希望确定全细胞制剂的生物活性。在菌株B213中异源LPS酶的表达在全细胞和纯化的LPS制剂中类似地影响对表达hTLR4的HEK293细胞的刺激(比较图4A和C)。全细胞制剂对表达mTLR4的HEK293细胞的刺激几乎不受B213中异源酶的表达影响(图4D)。然而，表达LpxA_(Pa)的B213的ΔlpxA突变体的全细胞制剂不能激活这些细胞(图4D)。

过论

其反应原性导致用亚单位疫苗代替全细胞百日咳疫苗，然而这种亚单位疫苗不能提供令人满意的保护作用。开发新的低反应原性全细胞疫苗可以提供解决方案。LPS在很大程度上是细胞百日咳疫苗毒性的原因[2]。在本研究中，我们研究如果修饰百日咳博德特氏菌脂质A中酰基链长度是否会导致毒性降低。我们通过异源LpxA和LpxL酰基转移酶的表达改变3′位置的伯酰基链和2′位置的仲酰基链的长度。我们发现这两个酰基链长度的缩短导致LPS毒性明显降低(图4)。

更确切地说，在脂质A的3′位置用3OH-C10酰基链取代3OH-C14链消除了内毒性。另外，通过C12取代与2′位置的伯酰基链连接的仲C14链降低了内毒性。一致地，当这个链被C16取代时，内毒性增加。

进一步观测到百日咳博德特氏菌脂质A的2和2′位置的酰基链长度的缩短对hTLR4活化也具有很大影响。考虑到对毒性的影响是独立于较短酰基链的位置而获得的，因此脂质A分子的疏水部分的总体积对于正确结合和激活hTLR4复合物显然是重要的。产生的新LPS似乎起到hTLR4拮抗剂的作用，因为即使存在相当量的野生型LPS(图3)，其也可以耗竭任何hTRL4应答(图5)。对于具有较短仲酰基链的LPS可能不是这种情况，因为来自B213-pLpxL_(Nm)的LPS在激活hTLR4中示出剩余活性，即使其比来自表达LpxA_(Pa)或LpxD_(Pa)菌株的纯化LPS制剂含有更低量的野生型LPS。应注意，百日咳博德特氏菌中LpxD_(Pa)的表达导致生长缺陷。相似地，我们先前的结果示出表达LpxL_(Nm)的百日咳博德特氏菌的生长缺陷。

总之，我们的结果证实酰基链长度对免疫系统的激活及对于百日咳博德特氏菌LPS的内毒性的重要性。

我们的结果还表明LPS修饰对小鼠和人TLR4活化的不同影响，在大多数情况下，mTLR4对修饰更不敏感。先前的研究报道了TLR4激活的物种依赖性差异[24，25]。这些差异可通过MD-2和TLR4的种间变异解释。这些差异限制了疫苗试验中从实验动物到人的数据外推[25]。然而，重要的是，表达LpxA_(Pa)的菌株B213的lpxA敲除突变体的LPS在体外不能激活mTLR4和hTLR4，使得可以将计划的小鼠实验结果外推至人。

值得注意的是，百日咳博德特氏菌脂质A的3和3′位置的酰基链长度不同[4]。LpxA通过将特定长度的酰基链移至UDP-GlcNAc中GlcNAc的3位置而催化脂质A生物合成途径中的第一反应。这个酰基链的确切长度由LpxA中的烃标尺定义[26]。在所述途径的后段，LpxH在产生脂质X的部分UDP-二酰基葡糖胺(UDP-DAG)前体群中去除UMP，之后LpxB连接UDP-DAG和脂质X分子，产生单磷酸化、四酰化葡糖胺二糖，其中3和3′位置的酰基链均通过LpxA衍生自原始酰化，因此通常是相同的。极少数情况下，在自然界中发现在3和3′位置具有不同酰基链长度的LPS物种。与不同的酰基链长度一致，在大肠杆菌中进行的表达研究示出百日咳博德特氏菌LpxA具有降低的链长特异性，但是在3和3′位置均掺入了各种长度的酰基链[27]。因此，百日咳博德特氏菌脂质A中完美的不对称性必须通过该途径下游的酶的链长特异性加以解释，我们假设酶是Lpxm。在我们的研究中，LpxA_(Pa)的表达在3和3′位置产生两条3OH-C10链，这是耐受的。然而，在这些位置产生两条伯3OH-C12链的LpxA_(Nm)的表达(图1)似乎是致命的。如果百日咳博德特氏菌LpxH仅能从在3位置含有短3OH-C10链的UDP-DAG分子中除去UMP，则可以解释这一点。实际上，当我们在百日咳博德特氏菌中表达LpXH_(Nm)时，不对称性消失，证实了我们的LpxH假说(数据未显示)。相似地，LpxA_(Nm)和LpXm_(Nm)的异源表达产生活细胞(数据未显示)。因此，为了获得在3位置具有长于3OH-C10的酰基链的修饰的博德特氏菌脂质A部分，可以(除了修饰的酰基转移酶之外)需要存在修饰的LpxH，例如LpxH_(Nm)。

总之，我们通过本文揭示的脂质A工程化降低全细胞百日咳博德特氏菌疫苗的毒性的方法是有效的。我们的结果示出百日咳博德特氏菌LPS的内毒性活性很大程度上取决于其脂肪酰基链的长度。我们首次成功地工程化了一种菌株，其在体外测定中完全没有内毒性活性。重要的是，这种LPS在体外也不激活mTLR4，使得可以将计划的动物研究中获得的数据外推至人。因此，我们的发现将可以产生百日咳博德特氏菌和其它病原体的新的细胞疫苗。

表2A：SEQ ID NO和相应蛋白质和生物体

SEQ ID NO	蛋白质	生物体＊
			1	LpxA	Pa(PA01)
2	LpxL	Nm(H44/76)
			3	LpxL	Pg(ATCC33277)
4	LpxD	Pa(PA01)
			5	LpxH	Nm(H44/76)
6	LpxA	Nm(H44/76)
			25	PagL	Bb和Bp(GenBank WP-003813842.1)
28	LpxA	Bpe(GenBank：CAE41721.1)
			29	LpxD	Bpe(GenBank：CAE41719.1)
30	LpxH	Bpe(Genbank：CAE42187.1)
			31	LpxL	Bpe(Genbank：CAE43342.1)
32	LpxL	Pa(Genbank：AAG06812.1)

*Pa＝铜绿假单胞菌，Nm＝脑膜炎奈瑟菌，Pg＝牙龈卟啉单胞菌，Bb＝支气管炎博德特氏菌，Bp＝副百日咳博德特氏菌，Bpe＝百日咳博德特氏菌表2B：SEQ ID NO和引物名称

实施例2

lpxD_(Pa)和lpxA_(Pa)LPS突变体在兔中示出降低的致热原性

通过异源表达来自铜绿假单胞菌的lpxA和lpxD基因，在其LPS中构建具有改变的脂质A部分的百日咳博德特氏菌突变体。具体地，构建百日咳博德特氏菌B1917菌株，其中染色体lpxA基因或lpxD基因被相应的铜绿假单胞菌基因置换。在这两种情况下，这导致具有预期缩短的酰基链的LPS的合成，如通过质谱法示出。

为了测试这些改变在体内的影响，用纯化自lpxA突变体和lpxD突变体的LPS及提取自lpxD的OMV进行兔致热原性试验，所有均与野生型进行对比。OMV(nOMV)是用EDTA作为螯合剂通过无洗涤剂提取细菌生物质方法提取的，基本如van de Waterbeemd et al.(2010，Vaccine，28(30)：4810-6)所述进行。

为新西兰白兔肌内注射0.5ml含有nOMV(50μg蛋白质)或纯化的LPS(10μg)的溶液，无细胞百日咳疫苗和盐水作为对照。使用以下组(每组5只动物)：

1.载体对照(盐水)

2.参考疫苗(acP)

3.疫苗1：B1917 nOMV ompA pm

4.疫苗2：B1917 nOMV ompA pm lpxD

5.疫苗3：B1917 LPS lpxD

6.疫苗4：B1917 LPS lpxA

7.疫苗5：B1917 LPS野生型

在注射后0.5、1、2、4、6、24和48小时，使用来自皮下植入的转发器的外部扫描仪测量体温。结果示于表3和图6。

结果

对于疫苗1(注射后1、2和4小时)和疫苗5(注射后4小时)观测到体温有统计学意义的显著升高。对于纯化的LPS，由野生型诱导明显的发热峰，但lpxD和lpxA突变体不诱导。对于OMV，野生型和lpxD突变体均呈现更长时间的发热，但后者较低。这是可以预期的，因为OMV除了LPS之外还含有其它热原成分。

结论

数据表明，具有脂质A部分(其中与野生型博德特氏菌脂质A部分相比，至少一个酰基链的长度较短)的突变体博德特氏菌LPS在兔中示出明显降低的致热原性。因此，通过这些体内数据证实了上述观测到的用表达TLR4的HEK细胞的体外数据。

参考文献

[1]Clark TA.Changing pertussis epidemiology:everything old is newagain.J Infect Dis 2014Apr 1；209(7):978-81.

[2]Geurtsen J,Steeghs L,Hamstra HJ,et al.Expression of thelipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxicactivity of Bordetella pertussis.Infect Immun 2006Oct；74(10):5574-85.

[3]Peppler MS.Two physically and serologically distinctlipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and theirphenotype variants.Infect Immun 1984Jan；43(1):224-32.

[4]Raetz CR,Whitfield C.Lipopolysaccharide endotoxins.Annu RevBiochem 2002；71:635-700.

[5]Rietschel ET,Schade U,Jensen M,Wollenweber HW,Luderitz O,GreismanSG.Bacterial endotoxins:chemical structure,biological activity and role insepticaemia.Scand J Infect Dis Suppl 1982；31:8-21.

[6]Palsson-McDermott EM,O'Neill LA.Signal transduction by thelipopolysaccharide receptor,Toll-like receptor-4.Immunology 2004Oct；113(2):153-62.

[7]Alexander C,Rietschel ET.Bacterial lipopolysaccharides and innateimmunity.J Endotoxin Res 2001；7(3):167-202.

[8]Conti P,Dempsey RA,Reale M,et al.Activation of human naturalkiller cells by lipopolysaccharide and generation of interleukin-1alpha,beta,tumour necrosis factor and interleukin-6.Effect of IL-1receptorantagonist.Immunology 1991Aug；73(4):450-6.

[9]Cinel I,Dellinger RP.Advances in pathogenesis and management ofsepsis.Curr Opin Infect Dis 2007Aug；20(4):345-52.

[10]Crowell DN,Anderson MS,Raetz CR.Molecular cloning of the genesfor lipid A disaccharide synthase and UDP-N-acetylglucosamine acyltransferasein Escherichia coli.J Bacteriol 1986Oct；168(1):152-9.

[11]Coleman J,Raetz CR.First committed step of lipid A biosynthesisin Escherichia coli:sequence of the lpxA gene.J Bacteriol 1988Mar；170(3):1268-74.

[12]Loppnow H,Brade H,Durrbaum I,et al.IL-1induction-capacity ofdefined lipopolysaccharide partial structures.Expression of foreign LpxAacyltransferases in Neisseria meningitidis results in modified lipid A withreduced toxicity and retained adjuvant activity.Cell Microbiol 2002Sep；4(9):599-611.

[14]Wyckoff TJ,Lin S,Cotter RJ,Dotson GD,Raetz CR.Hydrocarbon rulersin UDP-N-acetylglucosamine acyltransferases.J Biol Chem 1998Dec 4；273(49):32369-72.

[15]Raetz CR,Reynolds CM,Trent MS,Bishop RE.Lipid A modificationsystems in gram-negative bacteria.Annu Rev Biochem 2007；76:295-329.

[16]Verwey WF,Thiele EH,Sage DN,Schuchardt LF.A SIMPLIFIED LIQUIDCULTURE MEDIUM FOR THE GROWTH OF HEMOPHILUS PERTUSSIS.J Bacteriol1949Aug；58(2):127-34.

[17]Westphal O,K.Jann.Bacterial lipopolysaccharides extraction withphenol-waterand further applications of the procedure.Methods carbohydrateschemistry 1965；5:83-91.

[18]Pupo E,Hamstra HJ,Meiring H,van der Ley P.Lipopolysaccharideengineering in Neisseria meningitidis:structural analysis of differentpentaacyl lipid A mutants and comparison of their modified agonistproperties.J Biol Chem 2014 Mar 21；289(12):8668-80.

[19]Brummelman J,Veerman RE,Hamstra HJ,et al.Bordetella pertussisnaturally occurring isolates with altered lipooligosaccharide structure failto fully mature human dendritic cells.Infect Immun 2015 Jan；83(1):227-38.

[20]Geurtsen J,Angevaare E,Janssen M,et al.A novel secondary acylchain in the lipopolysaccharide of Bordetella pertussis required forefficient infection of human macrophages.J Biol Chem 2007 Dec 28；282(52):37875-84.

[21]Park BS,Song DH,Kim HM,Choi BS,Lee H,Lee JO.The structural basisof lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex.Nature 2009 Apr30；458(7242):1191-5.

[22]DeMarco ML,Woods RJ.From agonist to antagonist:structure anddynamics of innate immune glycoprotein MD-2 upon recognition of variablyacylated bacterial endotoxins.Mol Immunol 2011 Oct；49(1-2):124-33.

[23]Cunningham MD,Seachord C,Ratcliffe K,Bainbridge B,Aruffo A,Darveau RP.Helicobacter pylori and Porphyromonas gingivalislipopolysaccharides are poorly transferred to recombinant soluble CD14.InfectImmun 1996 Sep；64(9):3601-8.

[24]Akashi S,Nagai Y,Ogata H,et al.Human MD-2 confers on mouse Toll-like receptor 4 species-specific lipopolysaccharide recognition.Int Immunol2001Dec；13(12):1595-9.

[25]Steeghs L,Keestra AM,van Mourik A.,et al.Differential activationof human and mouse Toll-like receptor 4 by the adjuvant candidate LpxL1 ofNeisseria meningitidis.Infect Immun2008 Aug；76(8):3801-7.

[26]Smith EW,Zhang X,Behzadi C,Andrews LD,Cohen F,Chen Y.Structuresof Pseudomonas aeruginosa LpxA Reveal the Basis for Its SubstrateSelectivity.Biochemistry 2015 Sep 29；54(38):5937-48.

[27]Sweet CR,Preston A,Toland E,et al.Relaxed acyl chainspecificityof Bordetella UDP-N-acetylglucosamine acyltransferases.J Biol Chem 2002 May24；277(21):18281-90.

序列表

<110> 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国

<120> 包含具有降低的反应原性的LPS的博德特氏菌疫苗

<130> P6064720PCT

<150> EP17160604.9

<151> 2017-03-13

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 258

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 1

Met Ser Leu Ile Asp Pro Arg Ala Ile Ile Asp Pro Ser Ala Arg Leu

1 5 10 15

Ala Ala Asp Val Gln Val Gly Pro Trp Ser Ile Val Gly Ala Glu Val

20 25 30

Glu Ile Gly Glu Gly Thr Val Ile Gly Pro His Val Val Leu Lys Gly

35 40 45

Pro Thr Lys Ile Gly Lys His Asn Arg Ile Tyr Gln Phe Ser Ser Val

50 55 60

Gly Glu Asp Thr Pro Asp Leu Lys Tyr Lys Gly Glu Pro Thr Arg Leu

65 70 75 80

Val Ile Gly Asp His Asn Val Ile Arg Glu Gly Val Thr Ile His Arg

85 90 95

Gly Thr Val Gln Asp Arg Ala Glu Thr Thr Ile Gly Asp His Asn Leu

100 105 110

Ile Met Ala Tyr Ala His Ile Gly His Asp Ser Val Ile Gly Asn His

115 120 125

Cys Ile Leu Val Asn Asn Thr Ala Leu Ala Gly His Val His Val Asp

130 135 140

Asp Trp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Thr Leu Val His Gln Tyr Cys Arg

145 150 155 160

Ile Gly Ala His Ser Phe Ser Gly Met Gly Ser Ala Ile Gly Lys Asp

165 170 175

Val Pro Ala Tyr Val Thr Val Phe Gly Asn Pro Ala Glu Ala Arg Ser

180 185 190

Met Asn Phe Glu Gly Met Arg Arg Arg Gly Phe Ser Ser Glu Ala Ile

195 200 205

His Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Lys Val Val Tyr Arg Gln Gly His Thr

210 215 220

Val Glu Glu Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Ser Ala Ala Gln Phe Pro

225 230 235 240

Glu Val Ala Val Phe Arg Asp Ser Ile Gln Ser Ala Thr Arg Gly Ile

245 250 255

Thr Arg

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 2

Met Lys Phe Ile Phe Phe Val Leu Tyr Val Leu Gln Phe Leu Pro Phe

1 5 10 15

Ala Leu Leu His Lys Ile Ala Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ala Tyr Leu

20 25 30

Leu Val Lys Pro Arg Arg Arg Ile Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Cys

35 40 45

Phe Ser Glu Trp Ser Glu Glu Lys Arg Lys Thr Val Leu Lys Gln His

50 55 60

Phe Lys His Met Ala Lys Leu Met Leu Glu Tyr Gly Leu Tyr Trp Tyr

65 70 75 80

Ala Pro Ala Gly Arg Leu Lys Ser Leu Val Arg Tyr Arg Asn Lys His

85 90 95

Tyr Leu Asp Asp Ala Leu Ala Ala Gly Glu Lys Val Ile Ile Leu Tyr

100 105 110

Pro His Phe Thr Ala Phe Glu Met Ala Val Tyr Ala Leu Asn Gln Asp

115 120 125

Ile Pro Leu Ile Ser Met Tyr Ser His Gln Lys Asn Lys Ile Leu Asp

130 135 140

Glu Gln Ile Leu Lys Gly Arg Asn Arg Tyr His Asn Val Phe Leu Ile

145 150 155 160

Gly Arg Thr Glu Gly Leu Arg Ala Leu Val Lys Gln Phe Arg Lys Ser

165 170 175

Ser Ala Pro Phe Leu Tyr Leu Pro Asp Gln Asp Phe Gly Arg Asn Asp

180 185 190

Ser Val Phe Val Asp Phe Phe Gly Ile Gln Thr Ala Thr Ile Thr Gly

195 200 205

Leu Ser Arg Ile Ala Ala Leu Ala Asn Ala Lys Val Ile Pro Ala Ile

210 215 220

Pro Val Arg Glu Ala Asp Asn Thr Val Thr Leu His Phe Tyr Pro Ala

225 230 235 240

Trp Lys Ser Phe Pro Gly Glu Asp Ala Lys Ala Asp Ala Gln Arg Met

245 250 255

Asn Arg Phe Ile Glu Asp Arg Val Arg Glu His Pro Glu Gln Tyr Phe

260 265 270

Trp Leu His Lys Arg Phe Lys Thr Arg Pro Glu Gly Ser Pro Asp Phe

275 280 285

Tyr

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 3

Met Gln Ala Val Leu Pro Leu Trp Met Val Arg Leu Gln Ser Arg Ile

1 5 10 15

Leu Ala Gly Leu Leu His Thr Val Val Arg Tyr Arg Arg Lys Val Val

20 25 30

Arg Asp Asn Leu Thr Arg Cys Phe Pro Glu Lys Ser Leu Gln Glu Ile

35 40 45

Arg Arg Ile Glu Arg Arg Phe Tyr Tyr Asn Phe Thr Tyr Gln Ile Leu

50 55 60

Ser Ser Phe Lys Leu Leu Thr Tyr Ser Gln Thr Gln Leu Arg Arg His

65 70 75 80

Ile Ser Phe Glu Asn Leu Asp Val Leu Ile Arg Leu Arg Ala Glu Gly

85 90 95

His Pro Ala Ile Leu Leu Met Met Gly His Phe Gly Asn Trp Glu Tyr

100 105 110

Phe Ser Gly Ser Gln Ala Ile Ile Lys Asp Leu Gly Leu Gln Ile Tyr

115 120 125

Gln Ile Phe Arg Pro Leu Lys Ser Thr Ser Ser Asp Arg Leu Met His

130 135 140

Arg Ile Arg Glu Arg Phe Gly Ser Arg Gly Ile Ala Lys His Asp Val

145 150 155 160

Pro Arg Glu Leu Leu Arg Leu Val Arg Asn Pro Ile Pro Thr Glu Thr

165 170 175

Pro Leu Val Ile Phe Ile Ala Asp Gln Ser Pro Ala Tyr Ala Gly Ser

180 185 190

Tyr Trp Thr Thr Phe Phe Gly Arg Glu Thr Ala Phe Phe Asn Gly Thr

195 200 205

Glu Lys Leu Gly His Lys Phe Ser Leu Pro Val Val Tyr Met Asp Val

210 215 220

Glu Lys Thr Gly His Asp Val Phe Thr Gly Thr Ile Lys Leu Leu His

225 230 235 240

His Pro Gln Asp Asp Ser Pro Glu Gly Ser Ile Thr Glu Glu Tyr Val

245 250 255

Arg Leu Met Glu Ala Thr Ile Arg Arg Asp Pro Ser Gln Trp Leu Trp

260 265 270

Ser His Arg Arg Trp Lys Arg Pro Arg Leu His Asn Thr Arg Gln Pro

275 280 285

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 4

Met Met Ser Thr Leu Ser Tyr Thr Leu Gly Gln Leu Ala Ala His Val

1 5 10 15

Gly Ala Glu Val Arg Gly Asp Ala Asp Leu Pro Ile Gln Gly Leu Ala

20 25 30

Thr Leu Gln Glu Ala Gly Pro Ala Gln Leu Ser Phe Leu Ala Asn Pro

35 40 45

Gln Tyr Arg Lys Tyr Leu Pro Glu Ser Arg Ala Gly Ala Val Leu Leu

50 55 60

Thr Ala Ala Asp Ala Asp Gly Phe Ala Gly Thr Ala Leu Val Val Ala

65 70 75 80

Asn Pro Tyr Leu Ala Tyr Ala Ser Leu Ser His Leu Phe Asp Arg Lys

85 90 95

Pro Lys Ala Ala Ala Gly Ile His Pro Thr Ala Ile Val Ala Ala Asp

100 105 110

Ala Glu Val Asp Pro Ser Ala Ser Val Gly Ala Tyr Ala Val Ile Glu

115 120 125

Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ala Gly Val Ser Ile Gly Ala His Cys Val

130 135 140

Ile Gly Ala Arg Ser Val Ile Gly Glu Gly Gly Trp Leu Ala Pro Arg

145 150 155 160

Val Thr Leu Tyr His Asp Val Thr Ile Gly Ala Arg Val Ser Ile Gln

165 170 175

Ser Gly Ala Val Ile Gly Gly Glu Gly Phe Gly Phe Ala Asn Glu Lys

180 185 190

Gly Val Trp Gln Lys Ile Ala Gln Ile Gly Gly Val Thr Ile Gly Asp

195 200 205

Asp Val Glu Ile Gly Ala Asn Thr Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Ser

210 215 220

Asp Thr Leu Ile Gly Asn Gly Val Lys Leu Asp Asn Gln Ile Met Ile

225 230 235 240

Ala His Asn Val Gln Ile Gly Asp His Thr Ala Met Ala Ala Cys Val

245 250 255

Gly Ile Ser Gly Ser Ala Lys Ile Gly Arg His Cys Met Leu Ala Gly

260 265 270

Gly Val Gly Leu Val Gly His Ile Glu Ile Cys Asp Asn Val Phe Val

275 280 285

Thr Gly Met Thr Met Val Thr Arg Ser Ile Thr Glu Pro Gly Ser Tyr

290 295 300

Ser Ser Gly Thr Ala Met Gln Pro Ala Ala Glu Trp Lys Lys Ser Ala

305 310 315 320

Ala Arg Ile Arg Gln Leu Asp Asp Met Ala Arg Arg Leu Gln Gln Leu

325 330 335

Glu Lys Arg Leu Ala Ala Val Thr Ser Ser Gly Asp Ala Ser Ser Asp

340 345 350

Ala

<210> 5

<211> 240

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 5

Met Lys Pro Ala Tyr Phe Ile Ser Asp Leu His Leu Ser Glu Lys Gln

1 5 10 15

Pro Glu Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ser Ser Ala Ala

20 25 30

Arg Gln Ala Arg Ala Val Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Phe Asp Phe Trp

35 40 45

Val Gly Asp Asp Glu Val Ser Glu Leu Asn Thr Ser Val Ala Arg Glu

50 55 60

Ile Arg Lys Leu Ser Asp Lys Gly Val Ala Val Phe Phe Val Arg Gly

65 70 75 80

Asn Arg Asp Phe Leu Ile Gly Gln Asn Phe Cys Arg Gln Ala Gly Met

85 90 95

Thr Leu Leu Pro Asp Tyr Ser Val Leu Asp Leu Phe Gly Cys Lys Thr

100 105 110

Leu Ile Cys His Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp Arg Ala Tyr Gln

115 120 125

Arg Phe Arg Lys Ile Val His Arg Lys Arg Leu Gln Lys Leu Phe Leu

130 135 140

Met Leu Pro Leu Lys Trp Arg Thr Arg Leu Ala Thr Lys Ile Arg Arg

145 150 155 160

Val Ser Lys Met Glu Lys Gln Val Lys Pro Ala Asp Ile Met Asp Val

165 170 175

Asn Ala Ala Phe Thr Ala Arg Gln Val Arg Ala Phe Gly Ala Glu Arg

180 185 190

Leu Ile His Gly His Thr His Arg Glu His Ile His His Glu Asn Gly

195 200 205

Phe Thr Arg Ile Val Leu Gly Asp Trp His Asn Asp Tyr Ala Ser Ile

210 215 220

Leu Arg Val Asp Gly Asp Gly Ala Val Phe Val Pro Leu Glu Lys Tyr

225 230 235 240

<210> 6

<211> 258

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 6

Met Thr Leu Ile His Pro Thr Ala Val Ile Asp Pro Lys Ala Glu Leu

1 5 10 15

Asp Ser Gly Val Lys Val Gly Ala Tyr Thr Val Ile Gly Pro Asn Val

20 25 30

Gln Ile Gly Ala Asn Thr Glu Ile Gly Pro His Ala Val Ile Asn Gly

35 40 45

His Thr Ser Ile Gly Glu Asn Asn Arg Ile Phe Gln Phe Ala Ser Leu

50 55 60

Gly Glu Ile Pro Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Asp Glu Pro Thr Lys Leu

65 70 75 80

Ile Ile Gly Asn Gly Asn Thr Ile Arg Glu Phe Thr Thr Phe Asn Leu

85 90 95

Gly Thr Val Thr Gly Ile Gly Glu Thr Arg Ile Gly Asp Asp Asn Trp

100 105 110

Ile Met Ala Tyr Cys His Leu Ala His Asp Cys Val Ile Gly Asn His

115 120 125

Thr Ile Phe Ala Asn Asn Ala Ser Leu Ala Gly His Val Thr Ile Gly

130 135 140

Asp Tyr Val Val Leu Gly Gly Tyr Thr Leu Val Phe Gln Phe Cys Arg

145 150 155 160

Ile Gly Asp Tyr Ala Met Thr Ala Phe Ala Ala Gly Val His Lys Asp

165 170 175

Val Pro Pro Tyr Phe Met Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Glu Pro Ala Gly

180 185 190

Leu Asn Ser Glu Gly Met Arg Arg Asn Gly Phe Thr Ala Glu Gln Ile

195 200 205

Ser Ala Val Lys Asp Val Tyr Lys Thr Leu Tyr His Arg Gly Ile Pro

210 215 220

Phe Glu Glu Ala Lys Ala Asp Ile Leu Arg Arg Ala Glu Thr Gln Ala

225 230 235 240

Glu Leu Ala Val Phe Arg Asp Phe Phe Ala Gln Ser Ala Arg Gly Ile

245 250 255

Ile Arg

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

aagcgcgcca tatgaccctc atccacccga ccg 33

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

aagcgcgcaa gctttcagcg gatgatgccg cgtgccgatt g 41

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 9

aagcgcgcca tatgagtttg atcgatcctc g 31

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

aagcgcgaag cttatcagcg ggtgatgccg cgggttgcgc t 41

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

aacgcgcgca tatgaaattt atattttttg tact 34

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 12

aagcgcgcaa gctttcagta aaaatcgggg ctgccttccg 40

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

aagcgcgcca tatgaaagcg acactttccc t 31

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

aagcgcgcaa gctttcatag ttgtcgggta ttatgca 37

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

gtccaaatcg gcgcgaatac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 16

ctttgacggc ggaaatctgc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 17

ccattggcga ccacaacctg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 18

tgccgaagac cgtcacgtag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 19

tgaaatcgct ggtgcgctac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 20

atcgggcaga tacagaaacg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 21

gtgctaccgc tatggatggt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 22

ctataccacg cgaaccgaat 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 23

ctatgtggcg cggtattatc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 24

caactttatc cgcctccatc 20

<210> 25

<211> 178

<212> PRT

<213> Bordetella parapertussis

<400> 25

Met Gln Phe Leu Lys Lys Asn Lys Pro Leu Phe Gly Ile Val Thr Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ala Cys Ala Thr Ala Gln Ala Gln Pro Thr Gln Gly Gly Val

20 25 30

Ser Leu His Tyr Gly Ile Gly Asp His Tyr Gln Arg Val Thr Leu Asn

35 40 45

Tyr Glu Thr Pro Thr Leu Trp Ser His Gln Phe Gly Gly Asn Trp Gly

50 55 60

Arg Leu Asp Leu Thr Pro Glu Leu Gly Ala Ser Tyr Trp Trp Ala Asp

65 70 75 80

Gly Ser Arg Ser Pro Gly His Val Trp Gln Ala Ser Ala Ile Pro Met

85 90 95

Phe Arg Trp Trp Thr Gly Glu Arg Phe Tyr Ile Glu Ala Gly Ile Gly

100 105 110

Ala Thr Val Phe Ser Ser Thr Ser Phe Ala Asp Lys Arg Ile Gly Ser

115 120 125

Ala Phe Gln Phe Gly Asp His Ile Gly Leu Gly Phe Leu Leu Thr Pro

130 135 140

Ser Asn Arg Ile Gly Leu Arg Tyr Ser His Phe Ser Asn Ala Gly Ile

145 150 155 160

Lys Glu Pro Asn Pro Gly Leu Asp Ile Val Gln Leu Thr Tyr Thr Tyr

165 170 175

Gln Phe

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 26

cgcgcgcata tgatgagtac cttgtccta 29

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 27

gcgcgcaagc ttttaatgat gatgatgatg atgatgatgg ccgccgcccg catcagatga 60

<210> 28

<211> 264

<212> PRT

<213> Bordetella pertussis

<400> 28

Met Ser Gly Asn Ile His Pro Thr Ala Val Val Asp Pro Ala Ala Gln

1 5 10 15

Ile Asp Ser Ser Val Val Ile Gly Pro Tyr Ser Val Val Gly Pro Gly

20 25 30

Val Ser Ile Ala Ala Gly Thr Glu Val Gly Ala His Cys Val Leu Asp

35 40 45

Gly Val Thr Ser Ile Gly Arg Asp Asn Arg Phe Tyr Arg Phe Cys Ser

50 55 60

Ile Gly Gly Met Pro Gln Asp Lys Lys Tyr Ser Gly Glu Pro Thr Arg

65 70 75 80

Leu Val Ile Gly Asp Arg Asn Thr Val Arg Glu Phe Thr Thr Phe Asn

85 90 95

Thr Gly Thr Val Gln Asp Gly Gly Val Thr Ser Ile Gly Asp Asp Asn

100 105 110

Trp Ile Met Ala Tyr Val His Ile Ala His Asp Cys His Ile Gly Asn

115 120 125

Asn Thr Ile Leu Ala Asn Ser Val Gln Leu Gly Gly His Val Gln Val

130 135 140

Gly Asp Trp Ala Ile Val Gly Gly Leu Thr Gly Val His Gln Phe Ala

145 150 155 160

Lys Ile Gly Ala His Ser Met Thr Gly Gly Asn Ser Ser Leu Met Gln

165 170 175

Asp Ala Pro Pro Phe Val Leu Ala Ala Gly Asn Pro Cys Arg Pro Val

180 185 190

Gly Val Asn Val Glu Gly Leu Lys Arg Arg Gly Phe Ser Ala Ala Ala

195 200 205

Ile Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Lys Ser Ile Tyr Arg Arg Gly Leu

210 215 220

Ser Leu Asp Glu Gly Arg Ala Glu Leu Arg Ala Arg Gln Gln Ala Glu

225 230 235 240

Pro Asp Val Ala Glu His Leu Gln Thr Met Leu Asp Phe Leu Asp Ala

245 250 255

Ser Thr Arg Gly Ile Ile Arg Pro

260

<210> 29

<211> 363

<212> PRT

<213> Bordetella pertussis

<400> 29

Met Pro Val Leu Leu Asp Pro Glu Asn Ala Leu Ala Leu Asp Val Leu

1 5 10 15

Leu Ala Gly Ile Asp Ala Gln Gly Leu Asp Trp His Leu Ser Ala Pro

20 25 30

Asp Ala Ala Asp Leu Pro Arg Ile Arg Gly Ile Gly Thr Leu Ser Ser

35 40 45

Ala Gly Asn Glu Glu Ile Ser Phe Leu Ser Asn Pro Arg Tyr Gln Asn

50 55 60

Gln Leu Ala Thr Thr Arg Ala Ala Ala Val Ile Val Thr Pro Asp Val

65 70 75 80

Ala Gln Ala Arg Gln Glu Gln Gly Ala Ser Gly His Val Leu Val Val

85 90 95

Cys Lys His Pro Tyr Leu Leu Tyr Ala Arg Leu Ala Gln Trp Phe Glu

100 105 110

Arg Ala Ser Arg Pro Ala Gly Pro Ala Gly Val His Pro Ser Ala Val

115 120 125

Val Asp Pro Ser Ala Glu Ile Asp Ala Asp Val Arg Val Gly Ala Gln

130 135 140

Cys Val Ile Glu Ala Gly Ala Arg Ile Gly Arg Gly Ala Arg Leu Gly

145 150 155 160

Pro Gly Cys Val Ile Gly Ala Gly Ser Thr Val Gly Ala Asp Ser Leu

165 170 175

Leu His Pro Arg Val Thr Leu Tyr Ala Gly Val His Val Gly Glu Arg

180 185 190

Ala Ile Ile His Ser Gly Ala Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe

195 200 205

Ala Pro Asp Pro Thr Leu Gly Arg Gly Ala Trp Gly Lys Ile Pro Gln

210 215 220

Leu Gly Glu Val Arg Val Gly Asn Asp Val Glu Ile Gly Ala Asn Thr

225 230 235 240

Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Asp Asp Thr Ile Val Gly Asp Gly Val

245 250 255

Lys Leu Asp Asn Gln Ile Met Val Ala His Asn Val Arg Ile Gly Ala

260 265 270

His Thr Ala Ile Ala Ala Cys Val Gly Ile Ala Gly Ser Thr Thr Ile

275 280 285

Gly Glu Arg Cys Thr Ile Gly Gly Ala Ser Met Leu Ser Gly His Leu

290 295 300

Ala Ile Ala Asp Asp Val Asn Ile Ser Gly Gly Thr Ala Val Thr Ser

305 310 315 320

Asn Ile Ala Lys Ala Gly Arg Tyr Thr Gly Val Tyr Pro Tyr Ala Glu

325 330 335

His Ser Glu Trp Gln Arg Asn Ala Ala Val Ile Gln Gln Leu Ala Leu

340 345 350

Leu Arg Arg Arg Leu Arg Ala Leu Glu Arg Glu

355 360

<210> 30

<211> 249

<212> PRT

<213> Bordetella pertussis

<400> 30

Met Trp Leu Ala Ser Asp Leu His Leu Gly Pro Ala Thr Pro Ala Thr

1 5 10 15

Ala Glu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Gln Ala Ala Ala Asp Glu Ala Ser

20 25 30

Ala Leu Leu Leu Pro Gly Asp Ile Phe Asp Ala Trp Ile Gly Asp Asp

35 40 45

Val Ile Arg Ala Ala Pro Pro Trp Leu Ala Ala Val Leu His Gly Ile

50 55 60

Arg Ala Ala Ala Gly Arg Ile Pro Val Tyr Leu Gly Arg Gly Asn Arg

65 70 75 80

Asp Phe Leu Ile Gly Gln Glu Leu Ala Asp Ala Leu Gly Ala His Leu

85 90 95

Leu Pro Glu Pro Val Leu Leu Glu Thr Asp Tyr Gly Arg Ile Leu Leu

100 105 110

Thr His Gly Asp Glu Tyr Cys Thr Asp Asp Ser Ala Tyr Gln Gln Phe

115 120 125

Arg Ala Met Val Arg Asn Pro Gln Trp Gln Ala Gln Phe Leu Ala Lys

130 135 140

Ser Ile Pro Glu Arg Leu Ala Met Ala Glu Gln Ala Arg Gly Glu Ser

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Gln Ala Lys Ser Met Glu Ile Met Asp Val Asn Pro

165 170 175

Ala Ala Val Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Asp Val Asp Val Leu Val

180 185 190

His Gly His Thr His Arg Pro Ala Arg His Val Leu Ser Val Asp Gly

195 200 205

Arg Lys Arg Glu Arg Trp Val Leu Pro Asp Trp Asp Cys Asp His Ala

210 215 220

Asp Pro Pro Arg Gly Gly Trp Leu Val Ile Asp Arg Asp Gly Leu Gln

225 230 235 240

Cys Phe Asp Leu Val Glu Asp Glu Asp

245

<210> 31

<211> 296

<212> PRT

<213> Bordetella pertussis

<400> 31

Met Ser Gln Phe Lys Thr Arg Ala Leu Thr Ala Met Leu Arg Gly Phe

1 5 10 15

Ala Arg Met Arg Pro Ala Thr Arg Gln Arg Ala Gly Ala Leu Val Gly

20 25 30

Trp Leu Ser Tyr Arg Leu Ala Arg Ser Arg Val Arg Ile Val Arg Arg

35 40 45

Asn Leu Glu Leu Cys Phe Pro Gly Gln Pro Glu Ala Val Arg Glu Arg

50 55 60

Trp Thr Arg Glu His Phe Arg Ala Leu Gly Gln Ser Ile Val Asp Arg

65 70 75 80

Gly Val Leu Trp Tyr Gly Ser Pro Glu Ala Val Arg Glu Met Val Thr

85 90 95

Gln Thr Gly Ala Glu Arg Ile Asn Ala Leu Ile Ala Ala Gly Arg Pro

100 105 110

Val Ile Leu Leu Ala Pro His Phe Val Ala Leu Asp Ala Ala Ala Thr

115 120 125

Arg Leu Thr Met Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Met Tyr Thr Pro Gln

130 135 140

Ser Asp Pro Ala Val Asp Ala Ile Val Arg Ala Gly Arg Ala Arg Phe

145 150 155 160

Asn Glu Val Phe Leu Val Ser Arg Lys Asp Gly Val Arg Asp Leu Val

165 170 175

Arg His Leu Arg Glu Pro Arg Pro Val Tyr Tyr Leu Pro Asp Met Asp

180 185 190

Phe Gly Arg Ala Gly Ser Ile Phe Val Pro Phe Phe Gly Val Pro Ala

195 200 205

Ala Thr Leu Leu Ala Thr Ala Gln Leu Ala Arg Lys Trp Asn Ala Ala

210 215 220

Val Leu Pro Ile Leu Asp Phe Trp Asp Pro Arg Thr Gly Arg Tyr His

225 230 235 240

Val Glu Val Leu Pro Glu Leu Pro Asp Phe Pro Gly Asp Gly Ser Leu

245 250 255

Glu Asp Ala Thr Thr Arg Leu Asn Arg Glu Leu Glu Ser Trp Val Leu

260 265 270

Arg Cys Pro Ser Gln Tyr Tyr Trp Val His Arg Arg Phe Lys Thr Arg

275 280 285

Pro Leu Gly Lys Pro Lys Leu Tyr

290 295

<210> 32

<211> 468

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 32

Met Ser Ala Trp Arg His Leu Ser Leu Trp Met Asn Gln Leu Asp Asp

1 5 10 15

Pro Leu Glu Ala Arg Pro Ser Leu Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Val

20 25 30

Ala Ile Val Gly Ala Gly Tyr Thr Gly Leu Trp Thr Ala Tyr Tyr Leu

35 40 45

Lys Arg Arg Ala Pro Gln Leu Arg Val Ala Ile Val Glu Ala Glu Thr

50 55 60

Ala Gly Phe Gly Ala Ser Gly Arg Asn Gly Gly Trp Leu Met Gly Asn

65 70 75 80

Leu Leu Gly Glu Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu Pro Pro Glu Arg Arg

85 90 95

Arg Ala Gly Tyr Asp Leu Leu His Gly Ile Pro Asp Glu Val Ala Arg

100 105 110

Val Leu Gln Glu Glu Gly Ile Asp Cys Asp Tyr Arg Lys Gly Gly Val

115 120 125

Leu Tyr Cys Ala Ala Arg Tyr Pro Glu Gln Glu Arg Arg Leu Arg Ala

130 135 140

Tyr Leu His Asp Leu Tyr Ala Glu Gly Leu Asp Glu Ser Asp Tyr Arg

145 150 155 160

Trp Leu Thr Pro Gln Glu Leu Asp Gln Gln Leu Arg Ile Pro Gly Ser

165 170 175

Tyr Gly Ala Ile His Ser Pro His Cys Ala Thr Ile Gln Pro Ala Arg

180 185 190

Leu Ala Arg Gly Leu Ala Arg Ala Val Glu Arg Leu Gly Val Arg Leu

195 200 205

Phe Glu Lys Ser Arg Val Leu His Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Thr

210 215 220

Glu Arg Gly Glu Leu Arg Ala Glu Trp Ile Val Pro Ala Val Glu Gly

225 230 235 240

Tyr Ala Ala Ser Leu Pro Pro Leu Gly His Tyr Gln Leu Pro Val Gln

245 250 255

Ser Leu Leu Val Ala Thr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Val Trp Ala Glu

260 265 270

Ile Gly Leu Glu Arg Gly Gln Ala Phe Ser Glu Phe Ser Arg Gln Val

275 280 285

Thr Tyr Gly Gln Arg Thr Ala Asp Asp Arg Leu Ala Phe Gly Ala Arg

290 295 300

Gly Gly Tyr Arg Phe Gly Gly Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Leu Asp

305 310 315 320

Asp Glu Glu Val Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Phe Gly Glu Leu Phe Pro

325 330 335

Leu Leu Lys Asp Ala Arg Ile Ser His Thr Trp Gly Gly Asn Leu Gly

340 345 350

Met Ala Arg Arg Phe Arg Pro His Met Leu Leu Asp Arg Ala Ser Gly

355 360 365

Ile Ala Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Glu Gly Val Gly Ala Ser Asn

370 375 380

Leu Gly Gly Arg Thr Leu Ala Ala Leu Ile Leu Gly Glu Asp Ser Glu

385 390 395 400

Leu Leu Arg Gln Pro Trp Val Leu Gly Glu Arg Pro Leu Asp Ser Leu

405 410 415

Ala Arg Trp Glu Pro Glu Pro Cys Arg Trp Leu Gly Tyr Asn Ala Ile

420 425 430

Ile Arg Ser Phe Val His Glu Asp Arg Val Leu Ala Asp Pro His Ser

435 440 445

Ala Pro Trp Arg Arg Ser Leu Ala Gln Thr Leu Ala Ala Gly Met Glu

450 455 460

Ser Leu Met Arg

465

Claims (15)

1.一种博德特氏菌(Bordetella)LPS，其具有脂质A部分，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰成至少一个酰基链的长度较短。

2.权利要求1的博德特氏菌LPS，其中所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不具有比在野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链更长的长度，其中优选所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不大于C₁₀，其中更优选所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度具有与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链相同的长度，且优选在3位置的酰基链长度为C₁₀。

3.权利要求1或2的博德特氏菌LPS，其中在所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与在3'位置的酰基链的长度相同。

4.权利要求1-3任一项的博德特氏菌LPS，其中所述较短的酰基链选自：

i)所述脂质A部分的3'位置的酰基链；

ii)所述脂质A部分的2'位置的伯酰基链；

iii)所述脂质A部分的2'位置的仲酰基链；及

iv)所述脂质A部分的2位置的酰基链。

5.权利要求1-4任一项的博德特氏菌LPS，其中所述酰基链短至少2、4或6个C原子，

和/或，其中除了所述修饰的脂质A部分之外，所述LPS具有百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)或支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的结构，其中优选除了所述修饰的脂质A部分之外，所述LPS具有百日咳博德特氏菌的结构，

和/或，其中所述修饰的脂质A部分具有式(I)的结构：

其中X²、X³、X²’、X³’、R²、R³、R²’和R³’各自独立地选自-H、-OH、-Y、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH₂)_n-H的烷基部分，且n对于Y的每种情况均是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。

6.一种遗传修饰的博德特氏菌属细菌，其中所述细菌包含权利要求1-5任一项定义的LPS。

7.权利要求6的遗传修饰的细菌，其中与野生型博德特氏菌属细菌相比，所述细菌被修饰成具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，

其中优选所述导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰赋予细胞异源LpxA、LpxL和LpxD酰基转移酶活性中的至少一种，

及其中更优选所述遗传修饰导入异源lpxA、lpxL和lpxD基因中至少一种的表达，其中

i)所述lpxA基因具有编码LpxA酰基转移酶的核苷酸序列，所述LpxA酰基转移酶与SEQID NO:1具有至少60％的氨基酸序列相同性；

ii)所述lpxL基因具有编码LpxL酰基转移酶的核苷酸序列，所述LpxL酰基转移酶与SEQID NO:2具有至少60％的氨基酸序列相同性；和/或

iii)所述lpxD基因具有编码LpxD酰基转移酶的核苷酸序列，所述LpxD酰基转移酶与SEQ ID NO:4具有至少60％的氨基酸序列相同性；

和/或其中所述修饰的细菌进一步包含遗传突变，其降低或消除由内源lpxA基因和/或内源lpxD基因编码的LpxA和/或LpxD酰基转移酶的活性。

8.权利要求6或7的遗传修饰的细菌，其中与野生型博德特氏菌属细菌相比，所述细菌被修饰成具有导入异源UDP-2,3-二酰基葡糖胺焦磷酸酶活性的遗传修饰，其中优选所述遗传修饰导入了异源lpxH基因的表达，及其中更优选所述lpxH基因具有编码LpxH的核苷酸序列，所述LpxH与SEQ ID NO:5具有至少60％的氨基酸序列相同性，

和/或其中所述细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌，其中优选所述遗传修饰的细菌是遗传修饰的百日咳博德特氏菌，且最优选百日咳博德特氏菌B213菌株，

和/或其中所述细菌具有增加脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰。

9.权利要求1-5任一项的博德特氏菌LPS，其中所述LPS可得自权利要求6-8任一项的遗传修饰的细菌。

10.包含权利要求1-5和9任一项的博德特氏菌LPS的OMV，其中优选所述OMV可得自权利要求6-8任一项定义的遗传修饰的细菌。

11.包含前述权利要求任一项的博德特氏菌LPS、遗传修饰的细菌和OMV中至少之一的组合物。

12.用作药物的权利要求11的组合物。

13.用于治疗的权利要求11的组合物，所述治疗包括在受试者中诱导或刺激免疫应答，其中优选诱导或刺激针对博德特氏菌感染、优选百日咳博德特氏菌感染的免疫应答，

和/或其中优选所述治疗是预防或治疗顿咳，

和/或其中所述组合物是进一步包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

14.权利要求12或13的用于所述用途的组合物，其中所述组合物是包含权利要求6-8任一项定义的细菌的全细胞疫苗，其中优选所述细菌是灭活的。

15.权利要求12或13的用于所述用途的组合物，其中所述组合物是包含权利要求1-5和9任一项定义的博德特氏菌LPS或者权利要求10定义的OMV的无细胞疫苗和/或其中所述组合物进一步包含至少一种非博德特氏菌抗原。