JP7031933B2 - 改変されたテトラアシル化ナイセリアｌｐｓ - Google Patents

Description

本発明は、医療分野、特に免疫学、医学微生物学、及びワクチン学の分野に関する。本発明は、生物工学的に作出された髄膜炎菌ＬＰＳ突然変異体から取得可能であり、また全細胞ワクチン、ＯＭＶワクチンの一部、又は精製済みのＬＰＳ若しくはリピドＡ分子として有用である改変されたＬＰＳ分子に関する。

リポ多糖（ＬＰＳ）は、バクテリアエンドトキシンとしても知られており、グラム陰性バクテリアの外膜に豊富に存在する成分である。グラム陰性バクテリアに感染している期間中、ＬＰＳ、より正確にはＬＰＳのリピドＡ部分は、宿主の自然免疫系を活性化させる（１～３）。この活性化は、ＬＰＳとパターン認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体４／ミエロイド系分化因子２（ＴＬＲ４／ＭＤ－２）複合体との結合を通じて生じ、この活性化により、感染症を除去するのに必要なサイトカイン産生を引き起こすシグナル伝達カスケードが開始する（３，４）。しかし、このシグナル伝達カスケードの過剰刺激、及び炎症性サイトカインの過剰生成は、宿主にとって有害であり、また敗血症性ショック等の生命を脅かす状態を引き起こすおそれがある（５、６）。

ＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体が完全に活性化するには、６つのアシル鎖及び２つのリン酸基を有するリピドＡ構造が重要である（７）。但し、多くのバクテリア種は、アシル鎖又はリン酸基の数を変化させることにより、そのリピドＡ構造を改変することが可能であり、テトラアシル化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リピドＩＶａ構造において認められるように（７，９）、作動薬ではなく拮抗薬となるまでＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体の活性化に変化をもたらす（８）酵素を有する。

ＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体は、ＭｙＤ８８並びにＴＲＩＦ経路の両方を通じてシグナル伝達することができるので、ＴＬＲ受容体ファミリーにおいて独特である。改変されたリピドＡ構造は、ＭｙＤ８８又はＴＲＩＦアダプター分子の優先的動員により、シグナル伝達の選択を誘発することができる。ＴＲＩＦ経路を経由する優先的シグナル伝達は、Ｉ型インターフェロン産生の契機となり、ワクチンアジュバントにおいて重要と考えられている（１０，１１）。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、ＴＲＩＦへとバイアスがかかったシグナル伝達を引き起こす契機となる改変型リピドＡの例である（１１）。ＭＰＬＡは、化学的に無毒化されており、いくつかのワクチンにおいてアジュバントとしての使用が承認されているサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）に由来する不均質のリピドＡ混合物である（１２）。ＭＰＬＡの主要成分は、ヘキサアシル化４’－モノホスホリルリピドＡから構成される。ＭＰＬＡの使用には、その製造において、バクテリアからのＬＰＳ単離に加えて化学的処理が必要とされ、またＬＰＳのリピドＡ部分のみから構成され、水不溶性であるといった欠点が存在する。

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は、リピドＡの１及び４’の位置に付加したリン酸基及びホスホエタノールアミン基を有するヘキサアシル化ＬＰＳを一般的に産生する（１３、１４）。ＰａｇＬ等のＬＰＳ修飾酵素の異種発現、又はＬｐｘＬ１及びＬｐｘＬ２等のリピドＡ生合成酵素の欠損が、極めて活性な髄膜炎菌ＬＰＳを無毒化するのに使用されてきた（１３、１５）。ＬｐｘＬ１の欠損は、ＬＰＳ関連の過剰の反応源性を低下させるのに界面活性剤を使用する必要がなく、髄膜炎菌外膜小胞ワクチンを製造する際に、髄膜炎菌ＬＰＳを無毒化するのに有利な方法であることが判明した（１６）。しかし、この改変型ＬＰＳの活性は、任意のＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体の活性化をヒト細胞においてほとんど誘発しなくなるほどまで低下しており、スタンドアローン型のワクチンアジュバントとしての適用性を減じさせている（１７）。髄膜炎菌において、ｐａｇＬが異種発現すると、その結果、なおもＴＬＲ４活性化を誘発する能力を有し、そしてヒト単核株化細胞においてＴＲＩＦへとバイアスがかかったサイトカイン産生を誘発する、弱毒化された異なるペンタアシル化ＬＰＳ構造が生じる（１３）。

Ｐｕｐｏら（２０１４年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８９巻：８６６８～８６８０頁）は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のΔｌｐｘＬ１又はｐａｇＬ^＋単一突然変異体に由来するペンタアシル化突然変異体リピドＡの構造解析及び改変された作動薬特性について記載する。

毒性副作用の制限、それと併行した十分量の免疫活性化の保持、その両者間の最適なバランスを有する、アジュバントとして有用な改変型ＬＰＳ分子を提供することが本発明の目的である。本発明は、様々な予防上及び治療上の用途で有用である、ＴＬＲ４／ＭＤ－２活性化能力を広範囲にわたり有する多様な一連の髄膜炎菌ＬＰＳ構造を提供するために、リピドＡ生合成遺伝子の標的欠損と組み合わせてＬＰＳ改変酵素を異種発現させることによりこの問題に対処する。

第１の態様では、本発明は、テトラアシル化リピドＡ部分を有するナイセリアＬＰＳに関し、テトラアシル化リピドＡ部分は、野生型ナイセリアＬＰＳのリピドＡ部分と比較して、二次アシル鎖のうちの１つを欠いており、且つリピドＡ部分の還元末端に位置するグルコサミンの３位の一次アシル鎖を欠いている、という点において改変されている。テトラアシル化リピドＡ部分を除き、ＬＰＳは、髄膜炎菌、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、又はナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｃｔａｍｉｃａ）のＬＰＳの構造を有することが好ましく、髄膜炎菌、淋菌、又はナイセリア・ラクタミカが、ｌｇｔＢ^－及びｇａｌＥ^－のうちの少なくとも１つであることがより好ましく、髄膜炎菌が、血清群Ｂ及び免疫型Ｌ３のうちの少なくとも１つであることが最も好ましい。

本発明による好ましいナイセリアＬＰＳでは、テトラアシル化リピドＡ部分は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構造を有し（下記参照）、式中、Ｒ_１及びＲ_２は、独立に－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－Ｈ、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－Ｈ、又は－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２であり、並びに式中、Ｒ１及びＲ２は、独立に－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－Ｈ、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、又は－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２であることが好ましい。

本発明による特に好ましいナイセリアＬＰＳは、リピドＡ部分が、該リピドＡ部分の非還元末端にあるグルコサミンに連結した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖を欠いており、且つ該リピドＡ部分の還元末端にあるグルコサミンの３位において一次アシル鎖を欠いている、又は該リピドＡ部分が、式（Ｉ）の構造を有するＬＰＳである。

第２の態様では、本発明は、ナイセリア属の遺伝的に改変されたバクテリアに関し、前記バクテリアは、ａ）内因性ｌｐｘＬ１遺伝子又は内因性ｌｐｘＬ２遺伝子によりコードされるリピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼの活性を低下させる、又は取り除く遺伝的改変；及びｂ）前記バクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変を含む。バクテリアは、遺伝的に改変された髄膜炎菌、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、又はナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）であることが好ましい。遺伝的に改変されたバクテリアにおいて、内因性ｌｐｘＬ１遺伝子は、配列番号１～３のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｐｘＬ１タンパク質をコードする遺伝子であり、又は内因性ｌｐｘＬ２遺伝子は、配列番号４～７のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｐｘＬ２タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてバクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変は、配列番号８～１７のうちの少なくとも１つと、少なくとも３０％のアミノ酸配列同一性を有するＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する異種ｐａｇＬ遺伝子の発現を導入する遺伝的改変であることが好ましい。

本発明の遺伝的に改変されたバクテリアは、異種抗原を発現するように更に遺伝的に改変されることが更に好ましく、異種抗原が、バクテリアの細胞外外膜表面において発現することが好ましい。好ましい実施形態では、遺伝的に改変されたバクテリアは、内因性ｌｇｔＢ遺伝子及び内因性ｇａｌＥ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変を有する。

本発明による遺伝的に改変されたバクテリアは、髄膜炎菌血清群Ｂ、免疫型Ｌ３であることが好ましい。バクテリアは、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又はその派生株であることがより好ましい。

第３の態様では、本発明は、本発明によるナイセリアＬＰＳに関し、ＬＰＳは、本発明による遺伝的に改変されたバクテリアから取得可能である、又は取得される。

第４の態様では、本発明は、本発明のナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶに関する。ＯＭＶは、本発明による遺伝的に改変されたバクテリアから取得可能である、又は取得されることが好ましい。

第５の態様では、本発明は、本発明のナイセリアＬＰＳ、本発明の遺伝的に改変されたバクテリア、及び本発明のＯＭＶのうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。組成物は、薬学的に許容される添加剤を更に含む医薬組成物であることが好ましい。好ましい組成物は、本発明のナイセリアＬＰＳ、又は本発明のＯＭＶを含む無細胞ワクチンである。別の好ましい組成物は、本発明のバクテリアを含む全細胞ワクチンである。本発明の組成物は、少なくとも１つの非ナイセリア抗原を更に含むことが好ましい。

第６の態様では、本発明は、本発明によるナイセリアＬＰＳの混合物を製造する方法に関する。方法は、ａ）本発明のバクテリアを培養するステップと、ｂ）任意選択で、ＬＰＳを、抽出するステップ及び精製するステップのうちの少なくとも１つのステップとを含むことが好ましい。

第７の態様では、本発明は、本発明によるＯＭＶを製造する方法に関する。方法は、ａ）本発明の遺伝的に改変されたバクテリアを培養するステップと、ｂ）任意選択で、ＯＭＶを抽出するステップと、ｃ）前記ＯＭＶを回収するステップであって、前記ＯＭＶからバクテリアを除去することを少なくとも含むステップとを含むことが好ましい。ＯＭＶを製造する好ましい方法は、界面活性剤フリー法である。

第８の態様では、本発明は、本発明の無細胞ワクチンを製造する方法に関する。方法は、ａ）ｉ）好ましくは本明細書でこれまでに定義した方法において、本発明によるナイセリアＬＰＳ及びｉｉ）好ましくは本明細書でこれまでに定義した方法において、本発明によるＯＭＶのうちの少なくとも１つを製造するステップと、ｂ）前記ナイセリアＬＰＳ及び前記ＯＭＶのうちの少なくとも１つを、任意選択で更なるワクチン成分と共に、ワクチン製剤に製剤化するステップとを含むことが好ましい。

第９の態様では、本発明は、本発明の全細胞ワクチンを製造する方法に関し、方法は、ｉ）本発明のバクテリアを培養するステップと、ｉｉ）任意選択で、前記バクテリアを不活性化するステップ及びワクチンに製剤化するステップのうちの少なくとも１つを含む。

第１０の態様では、本発明は、医薬として使用される、本発明のナイセリアＬＰＳ、本発明のバクテリア、本発明のＯＭＶ、又は本発明の組成物に関する。

第１１の態様では、本発明は、対象において、免疫応答を誘発又は刺激するステップを含む処置で使用される、本発明のナイセリアＬＰＳに関する。ナイセリアＬＰＳは、アジュバント用であることが好ましい。

好ましい実施形態では、ナイセリアＬＰＳは、ナイセリアＬＰＳと共に抗原を投与することを更に含む処置で使用され、前記処置は、前記抗原と関連した感染性疾患又は腫瘍を予防又は処置することに関する。

別の好ましい実施形態では、本発明のナイセリアＬＰＳは、免疫療法において、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）作動薬として使用するためであり、前記免疫療法は、がん又は神経変性疾患の免疫療法であることが好ましい。代替的実施形態では、免疫療法は、多様な微生物感染症の伝播を予防及び／若しくは低減するため、並びに／又はバクテリアの増殖を抑制するための一般的免疫刺激を含む。

ＬＰＳの電荷デコンボリューション型ＥＳＩ－ＦＴ質量分析スペクトルを示す図である。髄膜炎菌の１２種類の異なる株から単離されたＬＰＳの電荷デコンボリューション型ＥＳＩ－ＦＴ質量分析スペクトルは、以下に示す通り：（Ａ）親ＨＢ－１株、（Ｂ）ΔｌｐｘＬ１、（Ｃ）ΔｌｐｘＬ２、（Ｄ）ｐａｇＬ、（Ｅ）ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ、（Ｆ）ΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬ、（Ｇ）３０℃で５時間培養したΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ、又は（Ｈ）２５℃でオーバーナイト培養したΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ、（Ｉ）ΔｌｐｔＡ、（Ｊ）ΔｌｐｔＡ－ΔｌｐｘＬ１、（Ｋ）ΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬ、及び（Ｌ）ΔｌｐｔＡ－ｌｐｘＥ。３４０８．５０７ｕのイオンに割り振られたＬＰＳ構造の簡潔表現を質量スペクトル（Ａ）に含める。３４０８．５１４ｕの質量における縦線は、この後者のＬＰＳ種について算出された分子質量に対応し、その他のイオンシグナルに割り振られたＬＰＳ組成物を示す基準として用いられる。詳細なＬＰＳ組成物候補については付録表１を参照すること。すべての注記は、中性分子のモノアイソトピック質量を表す。 ＬＰＳの電荷デコンボリューション型ＥＳＩ－ＦＴ質量分析スペクトルを示す図である。髄膜炎菌の１２種類の異なる株から単離されたＬＰＳの電荷デコンボリューション型ＥＳＩ－ＦＴ質量分析スペクトルは、以下に示す通り：（Ａ）親ＨＢ－１株、（Ｂ）ΔｌｐｘＬ１、（Ｃ）ΔｌｐｘＬ２、（Ｄ）ｐａｇＬ、（Ｅ）ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ、（Ｆ）ΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬ、（Ｇ）３０℃で５時間培養したΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ、又は（Ｈ）２５℃でオーバーナイト培養したΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ、（Ｉ）ΔｌｐｔＡ、（Ｊ）ΔｌｐｔＡ－ΔｌｐｘＬ１、（Ｋ）ΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬ、及び（Ｌ）ΔｌｐｔＡ－ｌｐｘＥ。３４０８．５０７ｕのイオンに割り振られたＬＰＳ構造の簡潔表現を質量スペクトル（Ａ）に含める。３４０８．５１４ｕの質量における縦線は、この後者のＬＰＳ種について算出された分子質量に対応し、その他のイオンシグナルに割り振られたＬＰＳ組成物を示す基準として用いられる。詳細なＬＰＳ組成物候補については付録表１を参照すること。すべての注記は、中性分子のモノアイソトピック質量を表す。 表示する髄膜炎菌株によるＴＬＲ４活性化を示す図である。ＨＥＫ－ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ４細胞を、連続５倍希釈した熱失活髄膜炎菌を用いて２０時間刺激した。ＴＬＲ４の活性化を、アルカリホスファターゼの分泌を検出することにより測定した。連続希釈の結果を折れ線グラフ（Ａ）に表し、また０．０００４の単一ＯＤ_{６００ｎｍ}について棒グラフで表す（Ｂ）。データは、平均値、又は３回の独立した実験による平均±ＳＤとして表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較によるＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。データは、表４にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造によるＴＬＲ４活性化を示す図である。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ｈＴＬＲ４細胞を、連続１０倍希釈した１２種類の異なるＬＰＳ構造を用いて刺激した。ＴＬＲ４の活性化をアルカリホスファターゼの分泌を検出することにより測定した。データは、３回の独立した実験に由来する代表的な結果であり、また三重測定の平均値として表す。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。 精製済みのＬＰＳ構造を用いて刺激したＭＭ６細胞のサイトカインの放出を示す図である。ＭＭ６細胞を、連続１０倍希釈した異なるＬＰＳ構造を用いて２０時間インキュベートした。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＰ－１０、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＭＣＰ－１の各生成をＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ－６及びＩＬ－１βは、ＭｙＤ８８依存性サイトカインと考えられ、またＩＰ－１０及びＭＣＰ－１は、よりＴＲＩＦ依存性である。５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激したＭＭ６細胞のサイトカインレベルも、ＨＢ－１株に対する割合（％）（Ｅ）、及び濃度（Ｆ）及び割合（％）（Ｇ）で表したサイトカイン比としても提示する。サイトカイン比（Ｆ＋Ｇ）では、ＬＰＳ刺激を与えないバックグラウンドを差し引いた。データは、２回の独立した実験の平均値として表す。統計的有意性を、ＨＢ－１との比較による２元配置ＡＮＯＶＡ検定を用いて判断した。＊、ｐ＜０．０５。データは、表５及び６にも提示する。

［発明の説明］
定義
用語「相同性」、「配列同一性」等は、本明細書では交換可能に使用される。配列同一性は、本明細書では、２つ又はそれ超のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列、又は２つ若しくはそれ超の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間において、配列を比較することにより求められる関連性として定義される。当技術分野において、「同一性」とは、アミノ酸又は核酸配列の間において、そのような配列の紐の間の一致により決定される配列関連性の程度も、場合に応じて意味する。２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸の置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に計算可能である。

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列をアライメントすることにより決定可能である。類似した長さの配列では、配列を全長にわたり最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアライメントすることが好ましい一方、長さが実質的に異なる配列では、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアライメントすることが好ましい。配列は、配列が少なくともある最低割合（％）の配列同一性（下記で定義する通り）を共有するとき（例えば、デフォルトパラメーターを使用して、ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適にアライメントされたとき）、「実質的に同一」又は「実質的に類似」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、全長（完全長）にわたり、２つの配列をアライメントするのにＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用し、一致数を最大化し、ギャップ数を最低限に抑える。グローバルアライメントは、２つの配列が類似した長さを有するとき、配列同一性を決定するのに好適に使用される。一般的に、ギャップ構築ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ延長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）であるＧＡＰデフォルトパラメーターが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、またタンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ、８９巻、９１５～９１９頁）。配列同一性の割合（％）に関する配列アラインメント及びスコアは、コンピュータープログラム、例えば米国、ＣＡ ９２１２１－３７５２、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ ９６８５のＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．社から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、バージョン１０．３等を使用して、又は上記ＧＡＰの場合と同一のパラメーターを使用して、若しくはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について、並びにタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトのギャップ開始ペナルティーは１０．０であり、またデフォルトギャップ延長ペナルティーは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡについてＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して、オープンソースソフトウェア、例えばプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０の「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）等を使用して決定され得る。配列が実質的に異なる全長を有するとき、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するローカルアラインメント等が好ましい。

或いは、類似性又は同一性の割合（％）は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムを使用して、公開データベースと対比させてサーチすることにより決定され得る。したがって、本発明の核酸及びタンパク質の配列は、公開データベースと対比させたサーチを実施して、例えばその他のファミリーメンバー又は関連配列を識別するために、「問い合わせ配列」として更に使用可能である。そのようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３～１０頁のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を用いて実施可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、本発明の酸化還元酵素核酸分子と相同であるヌクレオチド配列を取得するために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を取得するために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施可能である。比較目的でギャップ付きアライメントを取得するために、ギャップ付きＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁の記載に従い利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターが利用可能である。米国国立生物工学情報センターのホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照。

任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際には、当業者にとって明白なように、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換も考慮することができる。保存的なアミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；並びにイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。本明細書で開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列内の少なくとも１つの残基が除去されており、そして異なる残基がその場所に挿入されている置換バリアントである。アミノ酸の変化は保存的であることが好ましい。天然アミノ酸のそれぞれについて好ましい保存的な置換は以下の通りである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；はＡｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及び、Ｖａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。

本明細書で用いる場合、用語「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「選択的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」、及び類似した用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄するための条件を記載するように意図され、その条件下では、相互に少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおいっそうより好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％相同のヌクレオチド配列が、相互にハイブリダイズした状態に一般的に留まる。すなわち、そのようにハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおいっそうより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。

そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例として、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、及びなおいっそうより好ましくは約６５℃での１回又は複数回の洗浄が挙げられる。

高度に厳密な条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中、約６８℃でのハイブリダイゼーション、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温での洗浄が含まれる。或いは、洗浄は、４２℃で実施され得る。

当業者は、どの条件が厳密なハイブリダイゼーション条件及び高度に厳密なハイブリダイゼーション条件に適用されるか知っている。そのような条件に関する追加のガイダンスは、当技術分野において、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１年）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）において容易に入手可能である。

もちろん、ポリＡ配列（例えばｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト等）、又はＴ（又はＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含有する任意の核酸分子、又はその相補体にハイブリダイズするので（例えば、実際的には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）、そのようなポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分に特異的にハイブリダイズさせるのに使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。

「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、組換えＤＮＡ技術の使用に起因する人工核酸分子を意味するものと本明細書では理解される。核酸構築物は、天然の核酸分子（の一部）を含み得るものの、用語「核酸構築物」には、したがって天然の核酸分子は含まれない。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、ヌクレオチド配列を指し、そのような配列と適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を有効にする能力を有する。このような発現ベクターとして、少なくとも適する転写制御配列及び任意選択で３’転写終結シグナルが一般的に挙げられる。発現を有効にするのに必要な又は役立つ追加の因子、例えば発現エンハンサーエレメント等も存在し得る。発現ベクターは、適する宿主細胞に導入され、また宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養においてコーディング配列の発現を有効にすることができる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適する。

本明細書で用いる場合、用語「プロモーター」又は「転写制御配列」とは、１つ又は複数のコーディング配列の転写を制御するように機能し、並びにコーディング配列の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、並びにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位、及び転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を直接的又は間接的に制御するように作用する、当業者にとって公知のヌクレオチドの任意のその他の配列を含む、但しこれらに限定されない任意のその他のＤＮＡ配列の存在により構造的に識別される核酸断片を意味する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生的条件下において、ほとんどの組織で活性なプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、例えば化学的誘導物質の適用により、生理学的又は発生的に制御を受けるプロモーターである。

用語「選択マーカー」は、当業者にとってなじみ深い用語であり、また任意の遺伝的実体を記載するのに本明細書では使用され、発現した場合、選択マーカーを含有する１つの細胞又は複数の細胞を選択するのに利用可能である。用語「レポーター」は、目視可能なマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等を指すのに主に使用されるものの、マーカーと交換可能に利用可能である。選択マーカーは、優性又は劣性又は双方向性であり得る。

本明細書で用いる場合、用語「作動可能に連結した」とは、機能的に関連性のあるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連した状態に置かれたとき、「作動可能に連結している」。例えば、転写制御配列は、コーディング配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列と作動可能に連結している。作動可能に連結しているとは、連結されるＤＮＡ配列が一般的に連続的であり、また２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、連続的であり、且つリーディングフレーム内にあることを意味する。

用語「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、定義された配列を通常有するアミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書で使用する場合、ペプチドという用語は、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」と交換可能である。本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、改変型又は非改変型ペプチド結合により連結した少なくとも２つのアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質として定義される。用語「ペプチド」とは、オリゴペプチド若しくはオリゴマー等の短鎖分子、又はタンパク質等の長鎖分子を意味する。タンパク質／ペプチドは、直線状、分岐状、又は環状であり得る。ペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、又はその組み合わせを含み得る。本発明によるペプチドは、改変されたアミノ酸を含み得る。したがって、本発明のペプチドは、転写後修飾等の天然のプロセスにより、又は化学的プロセスによっても改変可能である。このような改変のいくつかの例として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘムとの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との共有結合、改変型又は非改変型炭化水素部分への共有結合、脂質又は脂質誘導体との結合、ホスホチジルイノシトールとの共有結合、架橋化、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン分子形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、酸化、リン酸化、ラセミ化、ヒドロキシル化等が挙げられる。したがって、ペプチドの免疫原性を除去する効果を有さないペプチドのあらゆる改変は、本発明の範囲に含まれる。

用語「遺伝子」とは、適する制御領域（例えば、プロモーター）と作動可能に連結した、細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、いくつかの作動可能に連結した断片、例えばプロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）等を通常含む。「遺伝子の発現」とは、しかるべき制御領域、特にプロモーターと作動可能に連結しているＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳される能力を有するＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。用語「相同的」とは、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子及び所与の宿主生物又は宿主細胞の間の関係を示すのに使用される場合、本質的に、核酸又はポリペプチド分子が、同一種、好ましくは同一の品種又は株の宿主細胞又は生物により産生されることを意味すると理解される。宿主細胞と相同の場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、別の（異種）プロモーター配列と、また該当する場合には、その天然の環境には存在しない別の（異種の）分泌シグナル配列及び／又は転写終結配列と一般的に（必ずというわけではない）作動可能に連結している。制御配列、シグナル配列、転写終結配列等も、宿主細胞と相同である場合もあると理解される。

用語「異種」及び「外因性」とは、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質について使用される場合、核酸又はタンパク質が存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部として自然に生じない核酸又はタンパク質を意味する、或いは核酸又はタンパク質が天然に見出される細胞、又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列内の１つの場所若しくは複数の場所とは異なる細胞、又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列内の１つの場所若しくは複数の場所に見出される核酸又はタンパク質を意味する。異種及び外因性の核酸又はタンパク質は、該核酸又はタンパク質が導入される細胞にとって内因性ではなく、別の細胞から取得された、又は合成若しくは組換えにより生成されたものである。必ずしもそうではないが、一般的に、そのような核酸は、ＤＮＡを転写又は発現する細胞により通常は産生されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性のＲＮＡは、外因性のＲＮＡが存在する細胞内で通常は発現されないタンパク質をコードする。異種／外因性の核酸及びタンパク質は、外来の核酸又はタンパク質と呼ばれる場合もある。核酸又はタンパク質が発現している細胞にとって外来であると当業者が認識する任意の核酸又はタンパク質は、本明細書では、異種又は外因性の核酸又はタンパク質という用語に含まれる。異種及び外因性という用語は、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち、組み合わされた配列のうちの少なくとも２つが相互に外来である組み合わせにも適用される。

用語「免疫応答」とは、本明細書で使用する場合、表面に抗原及び／又は抗原性のエピトープを有し、及び／又は発現若しくは提示する特別な抗原性の実体を標的とする、並びに／又はその分解及び／若しくは阻害に役立つ抗体及び／又は細胞（例えばＴリンパ球等）の産生を意味する。慣用句「有効な免疫防御応答」、「免疫防御」等の用語は、本発明の目的に照らせば、ワクチン接種を受けた対象を病原体による感染から防御する、又はがんから防御するために、病原体、病原体に感染した細胞、又はがん細胞の１つ又は複数の抗原性のエピトープを標的とする免疫応答を意味する。本発明の目的に照らせば、病原体による感染に対する防御又はがんに対する防御には、感染又はがんの絶対的な予防に限らず、病原体による感染又はがんの程度又は頻度のあらゆる検出可能な低下、或いは、例えばワクチン接種を受けていない感染した対象と比較して、ワクチン接種を受けた対象において、疾患の重症度、又は病原体による感染若しくはがんに起因するあらゆる症状若しくは状態のあらゆる検出可能な低下も含まれる。がんの場合の有効な免疫防御応答には、がん細胞を除去し、これによりがんのサイズを低減すること、又はがんを阻害することさえも含まれる。これを実現するためのワクチン接種は、治療的ワクチン接種とも呼ばれる。或いは、有効な免疫防御応答は、これまでに病原体に感染したことのない、及び／又は病原体に感染していない、又はワクチン接種時にいまだがんに罹患していない対象において誘発され得るが、そのようなワクチン接種は、予防的ワクチン接種と呼ばれる場合がある。

本発明によれば、用語「抗原」の本明細書における一般的な使用は、抗体に特異的に結合するあらゆる分子を指す。該用語は、ＭＨＣ分子が結合可能であり、またＴ細胞受容体に提示され得る任意の分子又は分子断片も指す。抗原は、例えば、タンパク質性の分子、すなわち、任意選択で非タンパク質の群、例えば炭化水素部分及び／若しくは脂質部分等を含むポリアミノ酸配列であり得る、又は、抗原は、例えば、タンパク質性でない分子、例えば炭化水素等であり得る。抗原は、例えば、特定の対象において抗原特異的免疫応答（体液性及び／又は細胞性免疫応答）を誘発することができるが、その免疫応答は、アッセイ又は方法により測定可能であることが好ましい、天然由来若しくは合成由来のタンパク質（ペプチド、部分的なタンパク質、完全長タンパク質）の任意の部分、細胞組成物（細胞全体、細胞ライセート、若しくは破壊された細胞）、生物（生物全体、ライセート、若しくは破壊された細胞）、又は炭化水素、又はその他の分子、又はその一部分であり得る。

用語「抗原」は、適応性免疫応答の受容体に対応する標的として機能する構造的な物質として本明細書では理解される。抗原は、したがってＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）又はＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）、又はＢＣＲの分泌形態、すなわち抗体に対する標的として機能する。抗原は、したがってタンパク質、ペプチド、炭化水素、又は通常より大きな構造、例えば細胞若しくはビリオン等の一部であるその他のハプテンであり得る。抗原は、身体（「自己」）又は外部環境（「非自己」）に由来し得る。免疫系は、胸腺内のＴ細胞のネガティブ選択に起因して、正常状態では「自己」抗原に対して通常非反応性であり、また外界からの「非自己」侵入物、又は例えば、疾患状態下で身体中に存在する変化した／有害な物質を識別し、そしてそれのみを攻撃すると考えられている。細胞性免疫応答の標的である抗原構造は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、処理された抗原性ペプチドの形態で、組織適合性分子を介して適応性免疫系のＴ細胞に対して提示される。提示された抗原及び組織適合性分子の種類に応じて、いくつかの種類のＴ細胞が活性化した状態となり得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）認識では、抗原は、細胞内部で小さいペプチド断片に処理され、そして主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりＴ細胞受容体に対して提示される。

用語「免疫原」は、本明細書では、好ましくはしかるべきアジュバントと共に対象に投与されたときに、対象においてエピトープ及びエピトープを含む抗原に対する特異的体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発するように、抗原の少なくとも１つのエピトープを含む、又はそれをコードする実体を記載するのに使用される。免疫原は、抗原と同一であり得る、又は抗原の一部、例えば、抗原のエピトープを含む部分を少なくとも含む。したがって、特定の抗原に対して対象にワクチン接種することとは、１つの実施形態では、抗原の少なくとも１つのエピトープを含む免疫原を投与した結果として、免疫応答が抗原又はその免疫原性部分に対して誘発されることを意味する。ワクチン接種は、防御効果又は治療効果を引き起こすことが好ましく、その後、抗原（又は抗原供給源）に曝露されると、対象内の疾患又は状態を低下させる、又は予防する免疫応答が抗原（又は供給源）に対して誘発される。ワクチン接種の概念は、当技術分野において周知されている。本発明の予防的又は治療的組成物の投与により誘発される免疫応答は、ワクチン投与が存在しない場合と比較して、免疫状態（例えば、細胞性応答、体液性応答、サイトカイン産生）のいずれかの側面におけるあらゆる検出可能な変化であり得る。

「エピトープ」は、本明細書では、対象において免疫応答を誘発するのに十分である、所定の抗原内の単一の免疫原性部位として定義される。当業者は、Ｔ細胞エピトープはサイズ及び組成においてＢ細胞エピトープとは異なること、及びクラスＩ ＭＨＣ経路を通じて提示されるＴ細胞エピトープは、クラスＩＩ ＭＨＣ経路を通じて提示されるエピトープとは異なることを認識している。エピトープは、免疫応答の種類に応じて直線状配列又は高次構造エピトープ（保存された結合領域）であり得る。抗原は、単一のエピトープほどに小型であり、又はより大型であり得るが、また複数のエピトープを含み得る。したがって、抗原のサイズは、アミノ酸約５～１２個（例えば、ペプチド）ほどに小型であり得、また多量体タンパク質、タンパク質複合体、ビリオン、粒子、細胞全体、微生物全体、又はその一部分（例えば、全細胞のライセート、又は微生物の抽出物）を含む完全長タンパク質ほどに大型であり得る。

アジュバントは、本明細書では、対象内の抗原に対する免疫応答が高まるように、抗原と組み合わせてヒト又は動物の対象に投与されると、免疫系を刺激し、これにより抗原に対する免疫応答を、好ましくはアジュバントそのものに対する特異的免疫応答を必然的に生成することなく惹起、増強、又は促進する実体であると理解される。好ましいアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を、同一条件下であるがアジュバントが存在しない場合に抗原に対して生成される免疫応答と比較して、少なくとも１．５、２、２．５、５、１０、又は２０倍増強する。動物又はヒト対象の群においてアジュバントにより生み出される所与の抗原に対する免疫応答の統計的平均増強率を、対応する対照群に対して決定する試験が、当技術分野において利用可能である。アジュバントは、少なくとも２つの異なる抗原に対する免疫応答を増強する能力を有することが好ましい。

ＯＭＶ（「ｂｌｅｂ」とも呼ばれる）は、直径が２０～２５０ｎｍ（時に１０～５００ｎｍ）の範囲の通常球状のグラム陰性バクテリアの外膜から採取された二分子膜構造である。ＯＭＶ膜は、様々な位置において膜タンパク質と混合した内部リン脂質（ＰＬ）、及びリポ多糖類（ＬＰＳ）、及び外部ＰＬを含有し、それらが採取されるバクテリア外膜の構造を概ね反映する。ＯＭＶの管は、周辺質又は細胞質に由来する様々な化合物、例えばタンパク質、ＲＮＡ／ＤＮＡ、及びペプチドグリカン（ＰＧ）等を含み得るが、但しバクテリア細胞とは異なり、ＯＭＶは自己複製する能力を欠く。本発明の文脈において、３種類のＯＭＶが、その製造方法に応じて区別され得る。ｓＯＭＶは、すでに形成されたＯＭＶから無傷細胞を分離することにより、培養上清から精製及び濃縮される自然発生的又は天然のＯＭＶである。界面活性剤ＯＭＶ、ｄＯＭＶは、デオキシコール酸等の界面活性剤を用いて細胞から抽出され、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）ＬＰＳの含有量も低下させる。界面活性剤抽出後、ｄＯＭＶは、細胞及び細胞残屑から分離され、そして更に精製及び濃縮される。最後に、天然型ｎＯＭＶという用語は、本明細書では、野生型自然発生的ＯＭＶ及び界面活性剤抽出ｄＯＭＶとは明確に区別することができるように、濃縮された死亡細胞から非界面活性剤細胞破壊技術を用いて生成した、又はその他の（非破壊的）界面活性剤を含まない方法を用いて細胞から抽出したＯＭＶについて使用される。

公開の配列データベースにおいてアクセス可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列について引用する場合、そのいずれも、本文書の申請日において利用可能な配列登録バージョンを本明細書では意味する。

［発明の詳細な説明］
本発明は、テトラアシル化リピドＡ部分を有する新規ナイセリアＬＰＳに関し、免疫応答を生成及び／又は刺激する際に有用である。ｌｐｘＬ１、ｌｐｘＬ２、及びｐａｇＬの単一突然変異体ナイセリア株から得られたペンタアシル化ＬＰＳ分子は、いずれも親株由来の対応するヘキサアシル化ＬＰＳと比較して、ＴＬＲ４活性が低下している（１３，１５）。テトラアシル化ＬＰＳは、ペンタアシル化ＬＰＳよりも常に活性が低いと予想される。実際、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のテトラアシル化リピドＩＶａは、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体の拮抗薬としても知られている（７，９，２８）。驚くべきことに、本発明者らは、髄膜炎菌テトラアシル化ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ ＬＰＳは、ペンタアシル化ΔｌｐｘＬ１ ＬＰＳよりも活性である一方、テトラアシル化ΔｌｐｘＬ１－ΔｌｐｘＬ２ ＬＰＳは、検出可能な活性を示さないことを見出した（データは示さない）。また、テトラアシル化ＬＰＳも有するΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬの全バクテリアで刺激すると、そのペンタアシル化ΔｌｐｘＬ２親株と比較して、ＴＬＲ４／ＭＤ－２活性はやはり増加した。このような所見を総合すると、二次アシル鎖の欠損と組み合わせて、ＰａｇＬにより３’の位置からＣ１２ＯＨを除去すると、その結果、テトラアシル化リピドＡは二次アシル鎖の一方、又は二次アシル鎖の両方を除去したものと比較して、それより高いＴＬＲ４活性を予想外にも引き起こすことを示唆する。

したがって、第１の態様では、本発明は、テトラアシル化リピドＡ部分を有するナイセリアＬＰＳ、又はテトラアシル化リピドＡ部分そのものに関係する。テトラアシル化リピドＡ部分は、野生型ナイセリアＬＰＳのリピドＡ部分と比較して、二次アシル鎖のうちの１つを欠いており、且つリピドＡ部分の還元末端に位置するグルコサミンの３位の一次アシル鎖を欠いている、という点において改変されていることが好ましい。したがって、野生型ナイセリアＬＰＳのヘキサアシル化リピドＡ部分と比較して、本発明のテトラアシル化リピドＡ部分は、該リピドＡ部分上のアシル鎖の合計数を６つから４つに低下させる、１）リピドＡ部分は、２つの二次アシル鎖のうちの１つ、すなわち、該リピドＡ部分の非還元末端にあるグルコサミンに連結した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖、又は該リピドＡ部分の還元末端にあるグルコサミンに連結した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖を欠く；及び２）リピドＡ部分は、該リピドＡ部分の還元末端にあるグルコサミンの３位の一次アシル鎖を欠く、という２つの改変を有する。ナイセリアＬＰＳ又はテトラ－アシル化リピドＡ部分が単離されることが好ましい。

本発明の好ましいナイセリアＬＰＳでは、テトラアシル化リピドＡ部分は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構造：

を有し、式中、Ｒ_１及びＲ_２は、独立に－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－Ｈ、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－Ｈ、又は－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２であり、そしてＲ１及びＲ２は、独立に－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－Ｈ、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、又は－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２であることが好ましい。

好ましい実施形態では、本発明のナイセリアＬＰＳは、リピドＡ部分の非還元末端にあるグルコサミンに連結した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖を欠いているテトラアシル化リピドＡ部分を有する。好ましくは、本実施形態では、テトラアシル化リピドＡ部分は、上記式（Ｉ）の構造を有する。

上記テトラアシル化リピドＡ部分を除き、本発明のナイセリアＬＰＳは、ナイセリア属のバクテリアから取得される、又は取得可能なリポ多糖の構造を有する。ナイセリアＬＰＳは、それがＯ側鎖を欠いていることによりエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のＬＰＳとは異なるという事実に起因して、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）とも時に呼ばれる。但し、本発明の文脈において、用語「ＬＰＳ」及び「ＬＯＳ」は交換可能である。一貫性を保つために、ＬＰＳと更に呼ぶこととする。本発明のＬＰＳが取得される、又は取得可能なナイセリア属のバクテリアは、野生型ナイセリア、又は本明細書で以下に記載する遺伝的改変のうちの１つ若しくは複数を有するナイセリアであり得る。ナイセリア属のバクテリアは、髄膜炎菌、淋菌、及びナイセリア・ラクタミカから選択される種のバクテリアであることが好ましく、髄膜炎菌は、血清群Ｂ及び免疫型Ｌ３のうちの少なくとも１つであることがより好ましい。

したがって、テトラアシル化リピドＡ部分を除き、本発明のナイセリアＬＰＳの残りの部分は、髄膜炎菌、淋菌、若しくはナイセリア・ラクタミカのＬＰＳの構造を有する、又はこのような種の株は、本明細書で以下に記載するような遺伝的改変を有することが好ましい。テトラアシル化リピドＡ部分を除き、本発明のナイセリアＬＰＳの残りの部分は、血清群Ｂ及び免疫型Ｌ３のうちの少なくとも１つである髄膜炎菌のＬＰＳの構造を有する、又はこの血清群及び／又は免疫型の株は、本明細書で以下に記載するような遺伝的改変を有することがより好ましい。

好ましい実施形態では、本発明のナイセリアＬＰＳは、自己免疫応答を誘発する疑いのある考え得るエピトープを除去するために、並びに／又は樹状細胞との結合及びアジュバント活性を増加させるために、改変されたオリゴ糖構造を有する。したがって、本発明のナイセリアＬＰＳは、内因性ｌｇｔＢ遺伝子及び内因性ｇａｌＥ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変を有するナイセリア属のバクテリアから取得される、又は取得可能であることが好ましい。ナイセリアｌｇｔＢ遺伝子は、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース生合成グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードし、また例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９５年、１８巻：７２９～７４０頁）により、及びＡｒｋｉｎら（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、２００１年、１８３巻：９３４～９４１頁）により記載されている。ｌｇｔＢが破壊されたナイセリア株に由来するＬＰＳは、樹状細胞（ＤＣ）上のＤＣ－ＳＩＧＮレクチン受容体を標的とし、これによりＤＣにより惹起されたＴ細胞応答がＴヘルパー１型活性側に向くように歪められることが明らかにされている（Ｓｔｅｅｇｈｓら、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００６年、８巻：３１６～２５頁）。ナイセリアｇａｌＥ遺伝子は、ＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼ活性を有する酵素をコードし、またＪｅｎｎｉｎｇｓら（Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９３年、１０巻：３６１～３６９頁）により、及びＬｅｅら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、１９９５年、６３巻：２５０８～２５１５頁）により記載されている。

第２の態様では、本発明は、ナイセリア属の遺伝的に改変されたバクテリアに関する。バクテリアは、本発明の第１の態様に基づくテトラアシル化リピドＡ部分を有するナイセリアＬＰＳを含むバクテリアであることが好ましい。バクテリアは、ａ）内因性ｌｐｘＬ１遺伝子又は内因性ｌｐｘＬ２遺伝子によりコードされるリピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼの活性を低下させる、又は取り除く遺伝的改変と、ｂ）前記バクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変を含む、という点においてバクテリアは遺伝的に改変されていることが好ましい。ラウロイルアシルトランスフェラーゼの活性を低下させる、又は取り除く遺伝的改変は、例えば、Ｆｒａｎｓｅｎら（２００９年、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、５巻（４号）：ｅ１０００３９６）に記載されているようなミスセンス突然変異であり得る。リピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼの活性を低下させる、又は取り除く遺伝的改変は、内因性ｌｐｘＬ１遺伝子又は内因性ｌｐｘＬ２遺伝子の発現を低下させる、又は取り除く改変であることが好ましい。遺伝的に改変されたバクテリアは、髄膜炎菌、淋菌、及びナイセリア・ラクタミカから選択される種のバクテリアであることが好ましい。遺伝的に改変された髄膜炎菌は、血清群Ｂ及び免疫型Ｌ３のうちの少なくとも１つであることがより好ましく、遺伝的に改変された髄膜炎菌は、髄膜炎菌Ｈ４４／７６株又はその派生株であることが最も好ましい。

改変される内因性ｌｐｘＬ１遺伝子は、リピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。ｌｐｘＬ１遺伝子は、ｈｔｒＢ１又はｍｓｂＢ遺伝子とも呼ばれてきた。本発明のバクテリアにおいて、発現が低下している、又は取り除かれるｌｐｘＬ１遺伝子は、配列番号１（髄膜炎菌Ｈ４４／７６のＬｐｘＬ１）、配列番号２（淋菌のＬｐｘＬ１、ジェンバンクＷＰ＿０５０１５８７９２）、及び配列番号３（ナイセリア・ラクタミカのＬｐｘＬ１、ジェンバンクＣＢＮ８６７６７）のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｐｘＬ１（リピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子であることが好ましい。好ましい実施形態では、ｌｐｘＬ１遺伝子の発現は、例えば、当技術分野において公知の方法それ自体により、遺伝子を破壊又は欠損させて、遺伝子を不活性化することにより取り除かれる。

改変される内因性のｌｐｘＬ２遺伝子は、リピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。ｌｐｘＬ２遺伝子は、ｈｔｒＢ２遺伝子とも呼ばれてきた。好ましくは、発現を低下させる、又は取り除くべきｌｐｘＬ２遺伝子は、配列番号４（髄膜炎菌Ｈ４４／７６のＬｐｘＬ２、ジェンバンクＷＰ＿０５５３９１３５４）、配列番号５（淋菌のＬｐｘＬ２、ジェンバンクＷＰ＿０２０９９６７６７）、及び配列番号６（ナイセリア・ラクタミカのＬｐｘＬ２、ジェンバンクＷＰ＿０４２５０８０４３）のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｐｘＬ２（リピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子であることが好ましい。好ましい実施形態では、ｌｐｘＬ２遺伝子の発現は、当技術分野においてそれ自体公知の方法により、例えば、遺伝子を破壊する又は欠損させ、遺伝子を不活性化することにより取り除かれる。

バクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変は、ＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する異種ｐａｇＬ遺伝子の発現を導入する遺伝的改変であることが好ましい。外膜ＰａｇＬ ３－Ｏ－デアシラーゼは、リピドＡの３の位置のエステル結合を加水分解し、これにより一次の３－ＯＨアシル部分を放出させ、この酵素は脂肪アシル鎖長特異性を欠く（Ｇｅｕｒｔｓｅｎら、前出）。様々なＰａｇＬ同族体間の全体的な配列保存はかなり低く、例えば、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）と緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰａｇＬアミノ酸配列間では、例えば、３２％の配列同一性しか認められないことが判明した。外膜ＰａｇＬ ３－Ｏ－デアシラーゼは、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、緑膿菌、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ラルストニア・メタリデュランス（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）、ラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・フンゴルム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ボルデテラ・パラパータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）及び百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を含むいくつかのグラム陰性病原体で報告されている（Ｇｅｕｒｔｓｅｎら、２００５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８０巻：８２４８～８２５９頁）。より最近では、ＰａｇＬ ３－Ｏ－デアシラーゼは、窒素固定内部共生体リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）において活性であることも明らかにされた（Ｂｒｏｗｎら、２０１３年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８８巻：１２００４～１２０１３頁）。ＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を発現させるためのヌクレオチド配列は、したがってこのようなバクテリアから取得可能なＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列であり得る。

しかし、好ましくは、本発明の遺伝的に改変されたバクテリアにおいて、ＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を発現させるためのヌクレオチド配列は、配列番号７（ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ジェンバンクＷＰ＿００３８１３８４２、Ｂ．パラパータシスのＰａｇＬと同一）、配列番号８（サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種のネズミチフス菌（ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ジェンバンクＡＡＬ２１１４７）、配列番号９（緑膿菌、ジェンバンクＮＰ＿２５３３５０）、配列番号１０（シュードモナス・フルオレッセンス、ジェンバンクＡＦＪ５８３５９）、配列番号１１（シュードモナス・プチダ、ジェンバンクＢＡＮ５６３９５）、配列番号１２（シュードモナス・シリンゲ、ジェンバンクＫＦＥ５７６６６）、配列番号１３（バークホルデリア種、ジェンバンクＷＰ＿０２８１９９０６８）、配列番号１４（ラルストニア・ソラナセラム、ジェンバンクＣＥＪ１７５３３）、配列番号１５（アゾトバクター・ビネランジイ、ジェンバンクＡＣＯ７６４５３）、及び配列番号１６（リゾビウム・エトリ、ジェンバンクＷＰ＿０３９６１９９７５）のうちの少なくとも１つと、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列であることが好ましい。

１つの実施形態では、ヌクレオチド配列は、天然において生ずるような、例えば、野生型起源のバクテリアから単離可能なようなＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、上記において定義されたＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼのいずれかについて、その工学的に作出された形態をコードすることができ、そしてそのような形態は、対応する天然のＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼと比較して、１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠損を含むが、しかし本明細書で定義するような同一性又は類似性の範囲内にある。

本発明の遺伝的に改変されたバクテリアにおいて、ＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を発現させるためのヌクレオチド配列は、デフォルト設定を使用して配列アラインメントを行うＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）において、ボルデテラ・ブロンキセプチカＰａｇＬアミノ酸配列（配列番号８）内の位置１５４及び１５６にそれぞれ対応する位置に、活性部位残基であるＨｉｓ－１５４及びＳｅｒ－１５６（Ｒｕｔｔｅｎら、２００６年、ＰＮＡＳ、１０３巻：７０７１～７０７６頁）を少なくとも含むアミノ酸配列を含むＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列であることが好ましい。ＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼアミノ酸配列が、その他の不変の位置（Ｇｅｕｒｔｓｅｎら、２００５年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８０巻：８２４８～８２５９頁の図２の配列アラインメントにおいて「＊」、すなわちアステリスクで示す位置）のそれぞれに、不変の位置に存在するアミノ酸を含むことが更に好ましい。また、ＰａｇＬ リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼアミノ酸配列が、強く保存された位置（Ｇｅｕｒｔｓｅｎら、２００５年、前出の図２では「：」、すなわち、コロンで示す位置）においても、強く保存された各位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むことが、より好ましい。アミノ酸配列は、弱く保存された位置（Ｇｅｕｒｔｓｅｎら、２００５年、前出の図２では「．」、すなわちドットで表される位置）において、弱く保存された各位置に存在するアミノ酸のうちの１つもやはり更に含むことが最も好ましい。このような一定不変の位置及び保存された位置の外部にあるアミノ酸置換が、ＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ酵素活性に対するマイナス効果を有する可能性はより低い。

本発明の遺伝的に改変されたバクテリアは、（ｉ）好ましくはＬＰＳの内毒素性及び／又は反応原性を更に改変するために、ＬＰＳ生合成経路を変化させる遺伝的改変；（ｉｉ）通常分泌される抗原の外膜保持を引き起こす遺伝的改変；（ｉｉｉ）外膜アンカータンパク質を除去することによりＯＭＶ産生量を増加させる遺伝的改変；（ｉｖ）望ましくない種類の免疫応答を引き起こす契機となる可能性がある免疫調節成分を取り除く遺伝的改変；並びに（ｖ）異種抗原の発現を導入する遺伝的改変からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝的改変を有することが更に好ましい。

内毒素性が低下するように改変されたＬＰＳは、対応する野生型ＬＰＳの毒性よりも毒性が低くなるように改変されたＬＰＳとして本明細書では理解される。改変されたＬＰＳが有する毒性は、対応する野生型ＬＰＳの毒性の約９０、８０、６０、４０、２０、１０、５、２、１、０．５、又は０．２％未満であることが好ましい。野生型の毒性及び毒性が低下した様々な改変されたＬＰＳの毒性は、当技術分野において公知の任意の適するアッセイ法で決定され得る。毒性、すなわちＬＰＳの生物活性を決定する好ましいアッセイ法は、ＭＭ６マクロファージ株化細胞内でのＩＬ－６誘発である（下記のｐａｒ．１．４を参照）。

ＬＰＳ生合成経路を変化させる好ましい遺伝的改変は、ａ）ｌｐｔＡ遺伝子、ｌｐｘＫ遺伝子、及びこのような遺伝子の相同体のうちの少なくとも１つの発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変；並びにｂ）ｌｐｘＥ遺伝子、ｌｐｘＦ遺伝子、及びこのような遺伝子の相同体のうちの少なくとも１つの発現を導入する、又は増加させる遺伝的改変からなる群から選択される遺伝的改変である。

ＯＭＶ産生量を増加させる好ましい遺伝的改変は、小胞形成を増加させ、これによりＯＭＶ収量を増加させるために、外膜とペプチドグリカンの間のアンカータンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変である。これを目的とした好適な遺伝的改変は、例えば、グラム陰性バクテリアに一般的に見出されるＯｍｐＡ相同体、例えば、ナイセリア中のＲｍｐＭタンパク質の発現を低下させる、又は取り除く（Ｓｔｅｅｇｈｓら、２００２年、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４巻：５９９～６１１頁； ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら、２０１０年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２８巻：４８１０～４８１６頁）。したがって、遺伝的に改変されたバクテリアは、ｒｍｐＭ遺伝子又はその相同体の発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変を有することが好ましい。

望ましくない種類の免疫応答を引き起こす契機となる可能性がある免疫調節成分を取り除く好ましい遺伝的改変は、上記のような内因性ｌｇｔＢ遺伝子及び内因性ｇａｌＥ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変である。更に好ましい遺伝的改変は、ｃｐｓ、ｃｔｒＡ、ｃｔｒＢ、ｃｔｒＣ、ｃｔｒＤ、ｅｘｂＢ、ｅｘｂＤ、ｆｒｐＢ、ｌｐｂＢ、ｎｍｂ００３３、ｏｐＡ、ｏｐＣ、ｐｈｏＰ、ｐｉｌＣ、ｐｍｒＥ、ｐｍｒＦ、ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｓｉａＡ、ｓｉａＢ、ｓｉａＣ、ｓｉａＤ、ｓｙｎＡ、ｓｙｎＢ、ｓｙｎＣ、ｔｂｐＡ、ｔｂｐＢ、及び任意のこのような遺伝子の相同体からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低下させる、又は取り除く。このような突然変異の多くは、国際公開第０２／０９７４６号でレビューされている。

更なる実施形態では、本発明の遺伝的に改変されたバクテリアは、異種抗原を発現するように更に遺伝的に改変されている。異種抗原は、バクテリアの細胞外外膜表面において発現していることが好ましい。異種抗原は、例えば、別のバクテリア由来、好ましくは別のグラム陰性バクテリア由来の外膜タンパク質であり得る。或いは、異種抗原は、バクテリアの細胞外外膜表面において発現しているタンパク質、例えば、当技術分野においてそれ自体周知されているナイセリアの外膜タンパク質に融合することができる。

本発明の遺伝的に改変されたバクテリアが発現する異種抗原は、エピトープを含む抗原に対する免疫応答を誘発及び／又は増強するために、そのようなエピトープを少なくとも１つ含むことが好ましい。Ｂ細胞、体液性又は抗体の応答は異種抗原内のエピトープにより誘発されることが好ましい。異種抗原内のエピトープは、防御的応答及び／又は中和性抗体応答を誘発することが好ましい。或いは及び／又は更に、異種抗原は、Ｔ細胞応答を誘発するエピトープを含む。免疫原性ペプチドにより誘発及び／又は増強された好ましいＴ細胞応答は、ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＴＬ応答、及びＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔｈ応答のうちの少なくとも１つを含む。Ｔ細胞応答は、ＨＬＡクラスＩ拘束ＣＴＬ応答と同時にＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔｈ応答の両方から構成されることがより好ましく、また有利なことにはＢ細胞応答を伴い得る。

異種抗原は、病原体（感染因子）及び／又は腫瘍の広範な抗原に由来する１つ又は複数のエピトープを含み得る。例えば、異種抗原は、病原体及び感染因子、例えばウイルス、バクテリア、菌類、及びプロトゾア等を起源とする抗原に由来する１つ又は複数のエピトープを含み得る。抗原に由来するエピトープが起源とし得る感染症又は腫瘍を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例として、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス（中皮腫を引き起こす）、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス脳炎ウイルス、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶウイルス；例えば、Ｉ型及びＩＩ型）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）が挙げられる。抗原に由来するエピトープが起源とし得る感染症を引き起こす病原性バクテリアのいくつかの例として、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、リケッチア性バクテリア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）、淋菌（Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、セラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ジフテリア属（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽病、ペスト、レプトスピラ症、百日ぜき、及びライム病を引き起こすバクテリアが挙げられる。抗原に由来するエピトープが起源とし得る感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例として、カンジダ属（例えば、白色体、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、及びトロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ））、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ））、ケカビ（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）属の菌類（ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、アブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、及びリゾープス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロスリックス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、及びヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が挙げられる。抗原に由来するエピトープが起源とする感染症を引き起こす病原性寄生体のいくつかの例として、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ Ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、クリプトスポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、及びプラスモヂウム・ファルシパリス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｓ）が挙げられる。

更に、Ｃ末端融合は、例えば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＴ－抗原、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ｐ５３、ＸＡＧＥ、及びＰＲＡＭＥに限らず、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）を含むウイルスにより誘発された悪性腫瘍、エプスタイン・バーウイルス誘発性リンパ腫（ＥＢＶ）も含む、広範な腫瘍抗原に由来する１つ又は複数のエピトープを含み得る。本発明で使用されるエピトープの由来となる腫瘍抗原のその他の例は、がん関連であることが公知である様々な普遍的に発現している自己抗原に由来し得るが、そのような抗原として、例えば、ｐ５３、ＭＤＭ－２、ＨＤＭ２、及びｐ５３経路において役割を演ずるその他のタンパク質、生存性のテロメラーゼ、チトクロームＰ４５０アイソフォーム１Ｂ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、及びＣＤ１９、及びハウスホールドタンパク質と称されるあらゆるタンパク質等の分子が挙げられる。本発明に基づき処置され得るがんは、下記のリストより選択される：肺、結腸、食道、卵巣、膵臓、皮膚、胃、頭部・頸部、膀胱、肉腫、前立腺、肝細胞性、脳、副腎、乳房、子宮内膜、中皮腫、腎臓、甲状腺、血液学、カルチノイド、メラノーマ、副甲状腺、子宮頚部、神経芽細胞腫、ウィルムス、睾丸、脳下垂体、及びクローム親和細胞腫等のがん。１つの実施形態では、異種抗原は、感染因子又は腫瘍のタンパク質性抗原に由来する、１つ若しくは複数の表面露出エピトープを含む、又はそれから構成される。異種抗原は、例えば、感染因子又は腫瘍のタンパク質性抗原の細胞外及び／又は表面露出ドメインを含む、又はそれから構成され得る。

第３の態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳに関し、該ＬＰＳは、本明細書でこれまでに定義した遺伝的に改変されたバクテリアから取得される、又は取得可能である。

第４の態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶに関する。ワクチンで使用されるＯＭＶ（「ｂｌｅｂ」としても知られている）は、界面活性剤抽出法（ｄＯＭＶ精製プロセス）により伝統的に調製されてきたが、デオキシコール酸のような界面活性剤が、ＬＰＳを取り除き、小胞の放出を増加させるのに使用される。髄膜炎菌等のほとんどのグラム陰性バクテリアのＬＰＳは、極めて毒性であるものの、小胞構造を維持するため、及びアジュバント活性のためにＯＭＶには残存量（約１％）が必要とされる。しかし、本発明のナイセリアＬＰＳは、毒性低下と有用なアジュバント活性を併せ持ち、したがって好ましくは、毒性の野生型ＬＰＳよりもかなり大量にＯＭＶ中に存在したままである。界面活性剤抽出プロセスは、したがって本発明のナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶを生成するにはそれほど適さない。本発明によるナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶは、したがって界面活性剤抽出ＯＭＶではないことが好ましい。但し、界面活性剤抽出ＯＭＶではないＯＭＶを調製する方法であっても、界面活性剤の使用を一切除外するものではないと理解される。本発明によるナイセリアＬＰＳのほとんど、すなわち、例えば等しい量の同一培養から得られた自然発生的ＯＭＶ又は上清ＯＭＶ中に存在するナイセリアＬＰＳの量と比較して、ナイセリアＬＰＳの少なくとも５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％が維持される限り、低濃度の界面活性剤の使用及び／又は低強度の界面活性剤の使用は除外されない。

本発明のナイセリアＬＰＳを含む好ましいＯＭＶは、上清ＯＭＶ若しくは自然発生的ＯＭＶ、すなわち本明細書でこれまでに定義したｓＯＭＶ、又は天然型ＯＭＶ、すなわち本明細書でこれまでに定義したｎＯＭＶである。ｎＯＭＶの調製方法は、例えばＳａｕｎｄｅｒｓら（１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６７巻、１１３～１１９頁）、ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、３０巻：３６８３～３６９０頁）、及び国際公開第２０１３００６０５５号に記載されており、またｓＯＭＶの調製方法は、例えばｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１３年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８巻（１号）：ｅ５４３１４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４３１４）、及びＬｅｅら（２００７、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、７巻：３１４３～３１５３頁）に記載されており、そのすべては参照として本明細書に組み込まれている。本発明のナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶは、本明細書でこれまでに定義した遺伝的に改変されたナイセリアバクテリアから取得される、又は取得可能であることが好ましい。

第５の態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳ、遺伝的に改変されたバクテリア、及びＯＭＶのうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。

好ましい実施形態では、本明細書で定義する組成物は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１０、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、又は５００μｇ／ｍｌのナイセリアＬＰＳ、遺伝的に改変されたバクテリア、又はＯＭＶを含む。

組成物は、当技術分野において慣習的に知られているような薬学的に許容される添加剤、担体、媒体、又は送達ビヒクルを更に含む医薬組成物であることが好ましい（例えば、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”、Ｒｏｗｅら編、第７版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照）。薬学的に許容される安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤等も、医薬組成物に組み込まれる場合もある。好ましい形態は、意図した投与様式及び治療用途に依存する。医薬担体は、患者に送達するのに適する任意の適合性を有する無毒性の物質であり得る。「本発明の有効成分」は、本明細書でこれまでに定義したようなナイセリアＬＰＳ、遺伝的に改変されたバクテリア、又はＯＭＶのうちの１つ又は複数であると本明細書では理解される。

非経口送達用の薬学的に許容される担体の例として、任意選択で２０％アルブミンが補充された無菌の緩衝化された０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコースが挙げられる。或いは、本発明の有効成分は、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁可能である。非経口投与用の調製物は、無菌でなければならない。本発明の有効成分を投与するための非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、又は病変内経路による注射又は輸液に基づく。筋肉内注射用の代表的な医薬組成物は、例えば、有効用量の本発明の有効成分を含むリン酸緩衝生理食塩水１～１０ｍｌを含むように作成される。非経口的に投与可能な組成物の調製方法は、当技術分野において周知されており、また例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｖ．編、第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を含む様々な情報源においてより詳細に記載されている。

好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、ワクチンである。ワクチンは、無細胞ワクチンであり得るが、本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳ及びＯＭＶのうちの少なくとも１つを含むことが好ましい。或いは、ワクチンは、本明細書でこれまでに定義したバクテリアを少なくとも含む全細胞ワクチンであり得るが、該バクテリアは、当技術分野においてそれ自体公知の手段を使用して不活性化又は死滅させることが好ましい。

第６の態様では、本発明は、本発明のナイセリアＬＰＳを製造する方法に関する。方法は、ａ）本明細書でこれまでに定義した遺伝的に改変されたバクテリアを、好ましくはＬＰＳの製造に役立つ条件下で培養するステップ；及びｂ）任意選択で、ＬＰＳを抽出するステップ及び精製するステップのうちの少なくとも１つのステップを含むことが好ましい。ＬＰＳの抽出方法は当技術分野において周知されている（例えば、１９を参照）。ＬＰＳを精製する方法は、本明細書の実施例に記載されており、例えば、逆相カートリッジ上での固相抽出法（ＳＰＥ）を含み得る。

第７の態様では、本発明は、本発明のＯＭＶを製造する方法に関する。方法は、ａ）本明細書でこれまでに定義した遺伝的に改変されたバクテリアを、好ましくはＯＭＶの製造に役立つ条件下で培養するステップと、ｂ）任意選択で、ＯＭＶを抽出するステップと、前記ＯＭＶを回収するステップであって、前記ＯＭＶから前記バクテリアを除去することを少なくとも含むステップとを含むことが好ましい。ＯＭＶの調製方法は、界面活性剤フリーのＯＭＶの調製方法であることが好ましく、本明細書でこれまでに記載されている。本発明のＯＭＶを調製する好ましい方法は、したがって界面活性剤フリー法、例えばｎＯＭＶ又はｓＯＭＶを調製する方法である。

第８の態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義した無細胞ワクチンを製造する方法に関する。該方法は、ａ）ｉ）好ましくは本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳを製造する方法において、本明細書でこれまでに定義したナイセリアＬＰＳ、及びｉｉ）好ましくは本明細書でこれまでに定義したＯＭＶを製造する方法において、本明細書でこれまでに定義したＯＭＶのうちの少なくとも１つを製造するステップと、ｂ）ナイセリアＬＰＳ及びＯＭＶのうちの少なくとも１つを、任意選択で更なるワクチン成分と共に、ワクチン製剤に製剤化するステップとを含むことが好ましい。

第９の態様では、本発明は、本明細書でこれまでに定義した全細胞ワクチンを製造する方法に関する。方法は、ｉ）本明細書で定義した遺伝的に改変されたバクテリアを培養するステップと、ｉｉ）任意選択で、バクテリアを不活性化するステップ、及びワクチンに製剤化するステップのうちの少なくとも１つのステップとを含むことが好ましい。

第１０の態様では、本発明は、本発明のナイセリアＬＰＳ、本発明の遺伝的に改変されたバクテリア、本発明のＯＭＶ、及び本発明の医薬組成物のうちの少なくとも１つを医薬として使用することに関する。

第１１の態様では、本発明は、対象において、免疫応答を誘発又は刺激するステップを含む処置で使用される、本発明のナイセリアＬＰＳに関する。処置では、ナイセリアＬＰＳがアジュバントとして用いられることが好ましい。本発明のナイセリアＬＰＳは、例えば、アジュバントとしてワクチン組成物に、好ましくは抗原と共に含めることができ、その抗原に対して免疫応答を誘発又は刺激することが望ましい。したがって、本発明のナイセリアＬＰＳは、対象において、免疫応答を誘発又は刺激するステップを含む処置で使用されることが好ましく、該処置は、ナイセリアＬＰＳと共に抗原を投与することを更に含み、また該処置は、該抗原と関連した感染性疾患又は腫瘍を予防又は処置することに関し、該抗原は、本明細書でこれまでに定義した抗原であることが好ましい。

この態様では、したがって、本発明は、感染性疾患若しくは腫瘍に対するワクチン接種、又は感染性疾患若しくは腫瘍の予防若しくは治療、又は感染性疾患若しくは腫瘍に対する免疫応答の誘発若しくは刺激を目的とする方法に関する。該方法は、治療上若しくは予防上有効な量の本発明のナイセリアＬＰＳ、又は前記ＬＰＳを含む医薬組成物を、前記予防、治療、又は免疫応答を必要とする対象に投与するステップを少なくとも含むことが好ましい。該医薬組成物は、感染性疾患又は腫瘍と関連した抗原も含むことが好ましく、該抗原は、本明細書でこれまでに定義した抗原であることが好ましい。

第１２の態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）作動薬として使用される本発明のナイセリアＬＰＳに関する。ナイセリアＬＰＳは、免疫療法においてＴＬＲ４作動薬として用いられることが好ましい。免疫療法は、がん（例えば、３７を参照）、又は例えば、アルツハイマー病若しくはパーキンソン病を含む神経変性疾患（例えば、３５を参照）の免疫療法であることが好ましい。或いは、ナイセリアＬＰＳは、（多様な）微生物感染症の伝播を予防及び／若しくは低減する、並びに／又はバクテリア増殖を抑制するための一般的免疫刺激において、ＴＬＲ４作動薬として用いられる（例えば、３６を参照）。

本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用形は、該単語の後の事項が含まれるが、但し特に記載されていない事項が除外されることでもないことを意味するように、その非限定的な意味合いで使用される。更に、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によりある要素を指す場合、文脈より唯一無二の要素しか存在しないことが明確に必要とされない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、したがって「少なくとも１つ」を通常意味する。

本明細書で引用されたすべての特許及び引用文献は、本明細書により参考としてそのまま援用する。

下記の実施例は、説明目的に限定して提供され、またいかなる場合においても、本発明の範囲を限定するようには意図されない。

１．方法及び材料
１．１ バクテリア株及びプラスミド
プラスミドｐＭＦ１２１を使用して、髄膜炎菌Ｈ４４／７６株（ＨＢ－１）においてすべての突然変異体を作出し、その結果、ｇａｌＥ遺伝子を含む莢膜生合成遺伝子座の欠損を引き起こした。髄膜炎菌株を、５％のＣＯ２を含有する３７℃の多湿雰囲気内、ＩｓｏＶｉｔａｌｅＸを補充したＧＣ培地ベース（Ｄｉｆｃｏ社）プレート上で増殖させた。液体培養では、コニカルフラスコ内に３６ｍｇ／ｍＬのトリプシンダイズ肉汁培地（Ｄｉｆｃｏ社）を入れ、３７℃、１４０ＲＰＭで振盪させた中で株を増殖させた。必要とされる抗生物質をプレート及び液体培養物に添加した（カナマイシン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３μｇ／ｍｌ）。ｌｐｘＬ１及びｌｐｘＬ２突然変異体を、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｙら（１５）が記載するカナマイシン耐性カセットを含む遺伝子を有する直線化したＰＣＲＩＩプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、又はクロラムフェニコール（ＣＡＭ）カセットと置き換わった欠損セクションを有するｌｐｘＬ１遺伝子を含むｐＧｅｍ Ｔ簡便プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた変換により取得した。ｌｐｔＡ突然変異体では、遺伝子をＨ４４／７６株からＰＣＲにより増幅し、ｐＧｅｍ Ｔ簡便プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローン化し、そしてカナマイシンカセットを、遺伝子内、ＭｕｎＩ制限部位に配置した。プラスミドを、遺伝子外部において開裂させる制限酵素を用いた消化により直線化し、そして髄膜炎菌Ｈ４４／７６（ＨＢ－１）株に変換した。ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｐａｇＬ遺伝子の発現について、これまでに記載されているｐＥＮ１１プラスミドを使用して、遺伝子ｐａｇＬ、ｌｐｘＰ、及びｌｐｘＥを有する髄膜炎菌派生体を作出した（１３、１８）。ｌｐｘＰ及びｌｐｘＥ派生体を取得するために、ｐＥＮ１１プラスミド内のｐａｇＬ遺伝子を、ＰＣＲにより大腸菌及びＢ．ブロンキセプチカからそれぞれ増幅したｌｐｘＰ又はｌｐｘＥ遺伝子に置き換えた。１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及びＣＡＭ（３μｇ／ｍｌ）を液体培養培地に添加することにより、ｐｅｎ１１プラスミド上での遺伝子発現を誘発した。プライマーを表１に列挙する。

１．２ ＬＰＳの単離
バクテリアの突然変異体から得たＬＰＳを、熱フェノール－水で抽出し（１９）、そして逆相カートリッジ上での固相抽出法（ＳＰＥ）により更に精製した。手短に述べると、ＯＤ_{６００ｎｍ}が１．４のバクテリア培養物５０ｍｌに由来する細胞（又は３０℃で増殖させたΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ突然変異体１００ｍｌ）を、２０℃、２，７３９×ｇで１時間遠心分離して収集した。次に、バクテリアを水２０ｍｌに懸濁し、そして２０℃、２，７３９×ｇで２５分間遠心分離した。熱フェノール－水抽出では、バクテリアペレットを水４ｍｌで懸濁し、７０℃まで加熱し、同一温度のフェノール３．２ｍｌと混合し、そして撹拌しながら７０℃で１０分間保った。２０℃、２，７３９×ｇで１５分間遠心分離することにより、水相をフェノール相から分離した。水相を新しいバイアルに移した後、７０℃の水３ｍｌを添加してフェノール相を再度抽出し、そして該抽出手順を繰り返した。連続２回の抽出から得た水相をプールし（約６．５ｍｌ）、そして０．３５６Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７（溶媒Ａ）を５ｍｌ、及び２－プロパノール：水：トリエチルアミン：酢酸（７０：３０：０．０３：０．０１、ｖ／ｖ）、ｐＨ８．７（溶媒Ｂ）を３．８ｍｌ添加して、ＳＰＥ用に調製した。全体として、２０ポジション吸引マニホールド（Ｗａｔｅｒｓ社）を使用する逆相Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８カートリッジ（１ｍｌシリンジバレル型Ｖａｃカートリッジ、５０ｍｇのＣ１８樹脂、Ｗａｔｅｒｓ社）上でＳＰＥを実施することにより、異なるバクテリアの突然変異体にそれぞれ由来する１０個のＬＰＳ抽出物を同時に精製することができた。減圧下で、１ｍｌの２－プロパノール：水：トリエチルアミン：酢酸（８５：１５：０．０１５：０．００５、ｖ／ｖ）、ｐＨ８．７（溶媒Ｃ）、０．０７ｍＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７（溶媒Ｄ）、及び溶媒Ａを連続的に適用することにより、カートリッジをＳＰＥ用に条件調整した。次に、サンプルを等しい体積の２分量に分割し、そして各分量を異なるカートリッジに適用した。次に、カートリッジを、溶媒Ａ、１ｍｌで１回、及び溶媒Ｄに溶解した２０％（ｖ／ｖ）溶媒Ｂ、１ｍｌで２回洗浄した。溶媒Ｃ、０．６ｍｌを適用することにより、ＬＰＳをカラムから溶出させた。同一サンプルに由来する溶出液を統合し（１サンプル当たり、合計１．２ｍｌ）、そして遠心減圧式濃縮装置（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｐｌｕｓ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）中、室温で乾燥した。単離したサンプル中のＬＰＳ濃度を、３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクト－２－ウロソン酸（Ｋｄｏ）アッセイ法により決定した（２０）。更に、精製済みのサンプルの純度及び完全性を、厚さ１ｍｍの１６％ｐｒｅｃａｓｔ Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ミニ－ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社）を使用して、トリシン－ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより判定し、ＬＰＳを銀染色し（２１）、そしてタンパク質の可視化を、Ｉｍｐｅｒｉａｌ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて行った。

１．３ 質量分析
エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換質量分析法（ＥＳＩ－ＦＴ－ＭＳ）を、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上、陰イオンモードで実施した。ＬＰＳサンプルを、水、２－プロパノール、及びトリエチルアミン混合物（５０：５０：０．００１の体積比）、ｐＨ８．５に溶解し、そしてスタティックナノ－ＥＳＩにより質量分析装置に注入した（２２、２３）。ＭＳ装置をＰｉｅｒｃｅ陰イオン校正溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で校正し、そして製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が提供する標準手順に従い、タウロコール酸を用いて内部校正した。無処理ＬＰＳのフラグメンテーション分析を、インソース衝突誘起フラグメンテーション法（ＳＩＤ）により実施した。ＬＰＳのリピドＡ及びオリゴ糖部分にそれぞれ対応するＹ－及びＢ－型フラグメントイオンを、１００Ｖの電位差でＳＩＤにより生成した。フラグメントイオンを、Ｄｏｍｏｎ及びＣｏｓｔｅｌｌｏの命名法に基づき命名した（２４）。質量分析スペクトルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ３．０ソフトウェアのＸｔｒａｃｔツール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して電荷デコンボリューションした。得られたすべての質量値は、モノアイソトピック分子質量を指す。提案されたＬＰＳ組成物は、これまでに報告された髄膜炎菌由来のＬ３免疫型ＬＰＳの一般化学構造に基づく（２５、２６）。

１．４ 細胞刺激
１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２９２μｇ／ｍｌのｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１００μｌ中において、Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート内の１ウェル当たり細胞１×１０^５個で播種した。１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２９２μｇ／ｍｌのｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）培地、１００μｌ中に、Ｈｅｋ Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ヒトＴＬＲ４、ＭＤ－２、及びＣＤ１４を安定的に発現するＨＥＫ２９３株化細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート内の１ウェル当たり細胞３．５ｘ１０^４個で播種した。ＩＭＤＭ（ＭＭ６細胞）又はＤＭＥＭ（ＨＥＫ Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞）中で連続１０倍希釈したＬＰＳを用いて、５％ＣＯ_２を含有する多湿雰囲気内、３７℃で１８～２０時間、細胞を刺激した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞を、連続希釈した全バクテリア細胞も用いて刺激した。ＭＭ６細胞の上清中のサイトカイン濃度を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定した。製造業者の指示に従い、ＤＵＯｓｅｔ ＥＬＩＳＡ開発キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、すべてのサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１）濃度を決定した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ｈＴＬＲ４細胞により分泌されたアルカリホスファターゼを定量化するために、各ウェルから得た上清２０μｌを、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、２００μｌに添加し、そして３７℃で２～３時間インキュベートした。分光光度計上、６４９ｎｍにて読み取りを実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０４統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．社）を使用して、一元（アルカリホスファターゼの分泌）又は二元配置（サイトカインの放出）ＡＮＯＶＡ検定により統計的有意差を判定した。

２．結果
２．１ 改変されたＬＰＳ構造の生物工学
髄膜炎菌のＬＰＳ突然変異体を、株Ｈ４４／７６のＨＢ－１派生株において構築した。ＨＢ－１株は莢膜欠損性であり、またＬＰＳオリゴ糖のトランケーションを引き起こすｇａｌＥ欠損を有する。質量分光分析により、ＨＢ－１株は、ヘキサアシル化、トリホスフェート、ビス－ホスホエタノールアミンリピドＡ構造を発現することが実証された（下記参照）。株ＨＢ－１において多様な一連のＬＰＳ突然変異体を構築するために、ＬＰＳ酵素ＬｐｔＡ、ＬｐｘＬ１、及びＬｐｘＬ２をコードする自己遺伝子を不活性化し、そしてｌａｃプロモーター後方のｐｅｎ１１プラスミド上に遺伝子をクローニングすることにより、ＬｐｘＥ、ＬｐｘＰ、及びＰａｇＬの各ＬＰＳ酵素を異種的に発現させた（表２を参照）。

更に、自己遺伝子の欠損と異種酵素の発現との組み合わせを構築した。このアプローチから、表３に列挙する１１種類のＬＰＳ突然変異株が得られた。

ＬｐｘＥ（タンパク質ＩＤ：ＣＡＥ４１１３８．１）の発現では、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来のｌｐｘＥ相同体を最初にクローン化した。但し、ＨＢ－１又はそのｌｐｔＡ突然変異派生株において遺伝子を発現させても、質量分析により確認されるようなＬＰＳの構造的変化を一切引き起こさなかった。代替案として、百日咳菌内で偽遺伝子として存在するボルデテラ・ブロンキセプチカ由来のｌｐｘＥ（ジェンバンク受け入れ番号：ＷＰ＿００３８０９４０５．１）相同体をクローン化し、そしてΔｌｐｔＡ突然変異株内で発現させた。これは、リピドＡ内のリン酸基喪失を引き起こし、本発明者らのＬＰＳ突然変異株のパネルに組み込まれた（図１Ｌ）。

ＬｐｘＬ１酵素は、同一位置において二次アシル鎖も付加するので、ＬｐｘＰ（ジェンバンク受け入れ番号：Ｕ４９７８７．１）は、大腸菌において２’アシル鎖に二次の９－ヘキサデセン酸（Ｃ１６：１）を付加することが公知の酵素であるが（２７）、この酵素を髄膜炎菌ΔｌｐｘＬ１突然変異株内で発現させた。２’の位置に、Ｃ１２に代わり、より長いＣ１６二次アシル鎖を有することによりオリジナルとは異なるヘキサアシル化リピドＡ構造を作出するために、この改変を実施した。ＬｐｘＰをΔｌｐｘＬ１突然変異株内、３７℃で発現させると、ごくわずかなＣ１６：１の付加を引き起こした。しかし、Ｃ１６：１は、１２℃のときに限り大腸菌ＬＰＳに付加し、このような理由により、バクテリアをより低い温度で増殖させた。２５℃未満での髄膜炎菌の培養は、大腸菌とは異なり不可能であるが、２５℃及び３０℃であれば、追加のＣ１６：１を有するＬｐｘＰヘキサアシル化リピドＡ構造の相対的存在量がかなり高めとなり、２５℃の方が最高効率（少なくとも５０％相対的存在量）を実現することをすでに見出した（図１Ｈ）。

２．２ 改変されたＬＰＳの質量分析的特徴付け
構築後の髄膜炎菌突然変異体から単離された無処理ＬＰＳの電荷デコンボリューション型ＥＳＩ－ＦＴ質量分析スペクトルを図１に示す。ＨＢ－１（ｇａｌＥ^－）親株のＬＰＳの質量スペクトル（図１Ａ）は、３つのリン酸（Ｐ）基及び２つのホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）基を有する野生型ヘキサ－アシルリピドＡ、並びにグリシン（Ｇｌｙ）残基で置換され、及びｇａｌＥ遺伝子の不活性化に起因して、そのα鎖の隣接するガラクトース（Ｇａｌ）においてトランケーションされたＬ３免疫型オリゴ糖構造から構成されるＬＰＳと一致する３４０８．５０７ｕのイオンシグナルを示した（Ｍｃａｌｃ．＝３４０８．５１４ｕ、ＬＰＳ組成物候補に関する付録表１を参照）。３３５１．４８８ｕ、３２８５．５０１ｕ、及び３２２８．４８０ｕの付随的なイオンピーク（図１Ａ）は、Ｇｌｙを欠く（Δｍｅａｓ．＝－５７．０１９ｕ）、リピドＡ内に１つ少ないＰＥＡ基を有する（Δｍｅａｓ．＝－１２３．００６ｕ）、又はその両方（Δｍｅａｓ．＝－１８０．０２７ｕ）のＬＰＳ種にそれぞれ相当する。ＨＢ－１（ｇａｌＥ－）株に由来するＬＰＳのこの化学的不均一性は、リピドＡのリン酸化における変動、及びグリシンによるオリゴ糖の非化学量論的置換により引き起こされた可能性がある。無処理ＬＰＳの質量分析スペクトルに基づく組成物候補は、未処理ＬＰＳの衝突誘起解離（ＳＩＤ）により生成したリピドＡ及びオリゴ糖部分に対応するＬＰＳフラグメントイオンのＦＴ－ＭＳ分析により更に裏付けられた。例えば、ＨＢ－１（ｇａｌＥ^－）株に由来するＬＰＳのＳＩＤ ＦＴ質量分析スペクトルは、２つ及び３つのＰＥＡ基を有するヘキサ－アシルリピドＡ種（それぞれ、Ｍｃａｌｃ．＝１９１６．１００ｕ及び２０３９．１０９ｕ）に対応する１９１６．０９８ｕ及び２０３９．１０６ｕのフラグメントイオン、並びに上記オリゴ糖部分の脱水した誘導体（Ｍｃａｌｃ．＝１３６９．４０６ｕ）に対応する１３６９．４０４ｕのフラグメントイオンを示した。本明細書に記載する髄膜炎菌のその他の株に由来するＬＰＳのフラグメンテーション分析より、異なる種類のＬＰＳは、同一のオリゴ糖部分（ＰＥＡ_１・Ｈｅｘ_１・Ｈｅｐ_２・ＨｅｘＮＡｃ_１・Ｋｄｏ_２・Ｇｌｙ_１）を有するが、グリシンを欠いた、又は第２のヘキソース残基（Ｈｅｘ）を有するいくつかのＬＰＳ種の例外も存在することが判明した（付録表２）。したがって、ＬＰＳ種間に認められたその他の差異、例えばＰＥＡ及びＰ基の数における差異は、リピドＡの組成の変化に起因すると考えることができる（付録表２）。

ΔｌｐｘＬ１突然変異体に由来する無処理ＬＰＳについて分析を行い、質量スペクトルの主要なイオンピーク（３０４６．３１５ｕ、３１０３．３３６ｕ、３１６９．３２４ｕ、及び３２２６．３４２ｕ、図１Ｂ）は、親ＨＢ－１（ｇａｌＥ－）株に由来するＬＰＳの４つの主要なイオンシグナルと比較して、－１８２．１６５ｕシフトしていることが明らかとなった（図１Ａ）。これは、ｌｐｘｌ１遺伝子欠損後のリピドＡにおけるドデカン酸（Ｃ１２）の喪失（Ｄｃａｌｃ．＝－１８２．１６７ｕ）と整合する。

ΔｌｐｘＬ２突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルを比較分析すると、３０２３．３６７ｕ、２９６６．３４８ｕ、３１８５．４１９ｕ、及び３１２８．３９８ｕのイオンピークが認められたが（図１Ｃ）、Ｃ１２脂肪アシル鎖に加え、リピドＡに由来するＰＰＥＡの喪失と（Ｄｃａｌｃ．＝－３８５．１４２ｕ）、それにＧｌｙ（Ｄｃａｌｃ．＝５７．０２１ｕ）、又は第２のヘキソース（Ｄｃａｌｃ．＝１６２．０５３ｕ）によるオリゴ糖の非化学量論的置換とが組み合わさったものと一致する。これは、ｌｐｘＬ２遺伝子の効率的な欠損と整合する。特記事項として、ｌｐｘＬ２遺伝子の欠損は、ｌｐｘＬ１遺伝子が欠損した際にこれまでに認められたのと同様に、Ｃ１２脂肪アシル鎖の喪失を引き起こしただけでなく、リピドＡに由来するＰ基及びＰＥＡ基の喪失も引き起こしたことが挙げられる。

ｐａｇＬ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルに認められたイオンピーク（３２１０．３４５ｕ、３１５３．３２５ｕ、３０８７．３３８ｕ、及び３０３０．３１８ｕ、図１Ｄ）は、親ＨＢ－１株に由来するＬＰＳの４つの主要なイオンピークから－１９８．１６３ｕシフトしていることが判明した。これは、ＰａｇＬ酵素により、リピドＡから３－ヒドロキシ－ドデカン酸（Ｃ１２ＯＨ）が効率的に除去されたこと（Ｄｃａｌｃ．＝－１９８．１６２ｕ）と整合する。それにもかかわらず、非改変型のヘキサアシルＬＰＳ種に対応する３４０８．５０５ｕ及び３３５１．４８５ｕのマイナーなイオンピークが認められ（図１Ｄ）、ＰａｇＬ酵素のＬＰＳ ３－Ｏ－脱アシル化活性は、ヘキサ－アシルリピドＡ基質を完全に消費できなかったことを示唆した。

ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルにおいて、ＨＢ－１株に由来するＬＰＳの４つの主要なイオンシグナルから－３８０．３２８ｕ異なる４つの主要なイオンシグナルが認められ（３０２８．１８０ｕ、２９７１．１６０ｕ、２９０５．１７３ｕ、及び２８４８．１５２ｕ、図１Ｅ）、その差異はΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ突然変異体のリピドＡにおけるＣ１２及びＣ１２ＯＨの喪失と整合する（Ｄｃａｌｃ．＝－３８０．３２９ｕ）。２つのＣ１２アシル鎖を有するＬＰＳに対応するイオンシグナルが存在しないことから、ｌｐｘＬ１遺伝子が欠損した結果、リピドＡから単一のＣ１２が完全に除去されたことが示唆される（詳細なＬＰＳ組成物候補に関する付録表１を参照）。対照的に、ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルに３２２６．３３９ｕ及び３１６９．３１９ｕのマイナーなイオンシグナルが存在したが、それらは、２つのＣ１２ＯＨアシル鎖を有するペンタアシルＬＰＳ種に対応する。これは、低レベルのＬＰＳ分子が、ＰａｇＬ酵素により３－Ｏ－脱アシル化されなかったことを示唆する。

ΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルでは、親ＨＢ－１株に由来するＬＰＳの質量スペクトルの３４０８．５０７ｕのイオンシグナル（図１Ａ）から－５８３．３０１ｕシフトした２８２５．２０６ｕのイオンピークが認められた（図１Ｆ）。これは、リピドＡからのＣ１２ＯＨ、Ｃ１２、及びＰＰＥＡの予想される喪失に符合する（Ｄｃａｌｃ．＝－５８３．３０４ｕ）。２７６８．１８７ｕ、２９３０．２３６ｕ、及び２９８７．２５７ｕのその他のイオンシグナル（図１Ｆ）は、Ｇｌｙ又は第２のＨｅｘによるオリゴ糖の非化学量論的置換に一致する。

３０℃で増殖させたΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトル（図１Ｇ）と、ΔｌｐｘＬ１突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトル（図１Ｂ）との比較から、ΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ突然変異体に由来するＬＰＳは、ΔｌｐｘＬ１突然変異体に由来するＬＰＳ内に存在した、Ｃ１２を欠くペンタアシルＬＰＳに対応する主要なＬＰＳ種（３０４６．３１５ｕ、３１０３．３３３ｕ、３１６９．３２２ｕ、及び３２２６．３４０ｕ、図１Ｇ）を含むだけでなく、スペクトル内で２３６．２１１ｕだけ質量値が高値シフトしたＬＰＳ種（３２８２．５２４ｕ、３３３９．５４３ｕ、３４０５．５３３ｕ、及び３４６２．５５３ｕ、図１Ｇ）も含むことが明らかになった。これは、９－ヘキサデセン酸（Ｃ１６：１）がリピドＡに組み込まれたことと整合する。したがって、この調製物は、Ｃ１２を欠くペンタアシルＬＰＳ及びＣ１２を欠き、且つＣ１６：１を更に有するヘキサアシルＬＰＳの混合物を含んだ。

２５℃で培養したΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトル（図１Ｈ）は、Ｃ１２を欠き、且つＣ１６：１を更に有するヘキサアシルＬＰＳに対応するイオンシグナル（３２８２．５２６、３３３９．５４６、３４０５．５３５、及び３４６２．５５４ｕ、図１Ｈ）を示したが、それらは３０℃で増殖させたΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ突然変異体に由来するＬＰＳのスペクトル内の同一のシグナルと比較して相対的存在量がより高いシグナルであった。更に、Ｃ１６：１を有するヘキサアシルＬＰＳに対応するその他のイオンピークが認められ、そのイオンピークは、第２のＨｅｘによるオリゴ糖の伸長（３６２４．６０８ｕ）、又はＧｌｙ置換の喪失が組み合わさった後者（３５６７．５８６ｕ）、及びリピドＡからのＰＥＡ基の喪失（３５０１．５９６ｕ）に起因した（図１Ｈ）。

ΔｌｐｔＡ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルに認められる３１６２．４８９ｕのイオンピーク（図１Ｉ）は、親ＨＢ－１株に由来するＬＰＳの質量スペクトルの３４０８．５０７ｕのイオンシグナル（図１Ａ）とは－２４６．０１８ｕ異なる。これは、リピドＡからの２つのＰＥＡ基の喪失（Ｄｃａｌｃ．＝－２４６．０１７ｕ）に該当する。その他のイオンシグナルは、リピドＡ内でのＰＥＡの欠損に加えて、オリゴ糖内でＧｌｙが欠損し（３１０５．４７１）、オリゴ糖内に第２のＨｅｘを含む（３３２４．５４１）ＬＰＳ種、又は第２のＨｅｘを含み、且つオリゴ糖内でＧｌｙが欠損した（３２６７．５２１ｕ）ＬＰＳ種に対応した（図１Ｉ）。

ΔｌｐｔＡ－ΔｌｐｘＬ１突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルは、２９８０．３２４ｕ、２９２３．３０７ｕ、３１４２．３７５ｕ、及び３０８５．３５４ｕのイオンピークを示し、Ｇｌｙ又は第２のＨｅｘによるオリゴ糖の非化学量論的置換と組み合わさったリピドＡからの２ＰＥＡ及びＣ１２の喪失（Ｄｃａｌｃ．＝－４２８．１８４ｕ）を示唆した（図１Ｊ）。更に、ＬＰＳのインソース衝突誘起解離法により生成した主要なリピドＡフラグメントイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは、リピドＡの１及び４’の位置の両方においてＰ基が存在することと一致した（データは示さない）。したがって、ＬｐｘＥ酵素の活性は、リピドＡ中に存在する３つのＰ基のうちの１つを除去して、ジグルコサミン骨格の各側にＰ基を有するビスリン酸化リピドＡ種を生成することに依拠した。

ΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルの主要イオンシグナル（２９６４．３２８ｕ及び２９０７．３１１ｕ、図１Ｋ）は、Ｇｌｙによるオリゴ糖の非化学量論的置換（Ｄｃａｌｃ．＝５７．０２１ｕ）を伴う、リピドＡからの２ＰＥＡ及びＣ１２ＯＨの喪失（Ｄｃａｌｃ．＝－４４４．１７９ｕ）と一致した。リピドＡから２ＰＥＡのみが失われたヘキサアシルＬＰＳ種に対応した３１０５．４６８ｕ及び３１６２．４８８ｕのマイナーなイオンピークが認められ、ＰａｇＬ酵素による低レベルの不完全なＬＰＳ３－Ｏ－脱アシル化が示唆される。

最終的に、ΔｌｐｔＡ－ｌｐｘＥ突然変異体に由来するＬＰＳの質量スペクトルは、Ｇｌｙによるオリゴ糖の非化学量論的置換と組み合わさったリピドＡからの２ＰＥＡ及びＰの喪失（Ｄｃａｌｃ．＝－３２５．９８３ｕ）と一致する３０８２．５２５ｕ及び３０２５．５０８ｕの２つの主要なイオンピークを示した（図１Ｌ）。

２．３ ＬＰＳ突然変異株によるＴＬＲ４刺激
リピドＡ突然変異体構造の全セットからＴＬＲ４活性化の範囲を決定するために、初期のスクリーニングを、ＨＥＫ－ＢｌｕｅヒトＴＬＲ４細胞を使用して実施した。このような細胞は、ヒトＴＬＲ４、ＭＤ－２、及びＣＤ１４を発現し、また核内因子である活性化Ｂ細胞のκ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）、及びアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）依存性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を含む。異なるＬＰＳ突然変異体の連続希釈物を用いて細胞を刺激すると、広範なＴＬＲ４活性を引き起こし（図２及び表４）、ＨＢ－１が最強のＴＬＲ４活性化を誘発し、またΔＬｐｘＬ２バクテリアが最低レベルの活性化を引き起こした。他のＬＰＳ突然変異体は、中間的なＴＬＲ４刺激活性を示した（図２）。特に注目すべき結果は、ΔｌｐｔＡ株内にホスホエタノールアミンが存在しないと、その結果ヘキサアシル化野生型株及びペンタアシル化ΔｌｐｘＬ１の両方におけるＴＬＲ４の活性化、並びにｐａｇＬのバックグラウンドが低下したことであった。ΔｌｐｔＡ株においてＬｐｘＥを誘発すると、ＨＢ－１野生型株よりも若干低めのΔｌｐｔＡ株と類似したＴＬＲ４活性化が認められた。これは、リピドＡ構造内で３つのリン酸が２つ減少し、ジグルコサミン骨格の各側にリン酸が１個となっても、ＴＬＲ４シグナル伝達には影響を及ぼさなかったことを示唆する。

ＬｐｘＬ１の欠損と組み合わせて、２５℃でＬｐｘＰを発現させると、その結果、野生型バクテリアと比較してＴＬＲ４活性化能力が若干低下している、不均質なヘキサ及びペンタアシル化構造のＬＰＳを発現する株が生じた。この株を３０℃で培養すると、その結果ヘキサアシル化リピドＡの減少、及びＴＬＲ４活性のわずかな低下さえも引き起こした。

驚くべきことに、ΔｌｐｘＬ１株をＰａｇＬの発現と組み合わせ、ペンタアシル化リピドＡ構造をテトラアシル化リピドＡ構造に低減したとき、ＴＬＲ４活性の増加が実現した。大腸菌のリピドＩＶａにおいて報告されているように、テトラアシル化リピドＡ構造はＴＬＲ４拮抗薬として一般的に作用するので、これは予想外であった（７，９，２８）。

２．４ 精製済みの突然変異体ＬＰＳを使用したヒトＴＬＲ４刺激
すべての株に由来するＬＰＳを精製し、全バクテリアを用いた本発明者らの初期の所見を確認するために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＴＬＲ４細胞を刺激するのに、それを使用した。精製済みのＬＰＳから、無処理のバクテリアについて得られた結果と類似した結果が一般的に得られたが、但し、精製済みのＬＰＳ、ΔｌｐｘＬ１、ΔｌｐｔＡ－ΔｌｐｘＬ１、ΔｌｐｘＬ２、及びΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬは、ＴＬＲ４活性の誘発をほとんど示さず、また相互の区別はほとんどできなかった一方（図３）、バクテリアのこのようなバリアントは、低いが区別可能なバックグラウンドを上回るＴＬＲ４活性を示した。更に、ヘキサアシル化ＬＰＳ派生体のいずれよりも高濃度の精製済みペンタアシル化ｐａｇＬ ＬＰＳが、ＴＬＲ４の活性化に必要とされたが、全バクテリア刺激では、ＴＬＲ４活性を誘発するには、その他のヘキサアシル化突然変異株よりも低い吸収密度がｐａｇＬ株において必要であった（図２＋３）。しかし、最大アルカリホスファターゼ分泌量は、ヘキサアシル化突然変異株と比較してｐａｇＬ突然変異株においてなおも低めであった。とりわけ、３つのＬＰＳ突然変異体ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ、ｐａｇＬ、及びΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬでは、野生型ＬＰＳと比較したとき、活性化能力が実質的に低下していたが、刺激を受けなかった細胞のバックグラウンドレベルを上回る活性化をなおも誘発した（図３）。

２．５ 精製済みの突然変異体ＬＰＳによるサイトカイン誘発
改変されたＬＰＳ構造のサイトカイン誘発プロファイルをヒト単核株化細胞であるＭｏｎｏ Ｍａｃ６（ＭＭ６）において調査した。分泌型ＭｙＤ８８依存性サイトカインのＩＬ－６（図４Ａ及び表５Ａ）及びＩＬ－１β（図４Ｂ及び表５Ｂ）、並びにＴＲＩＦ依存性サイトカインのインターフェロンγ誘導型タンパク質１０（ＩＰ－１０）（図４Ｃ及び表５Ｃ）、及び単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）（図４Ｄ及び表５Ｄ）の濃度を、精製済みのＬＰＳを用いて２０時間刺激した後に測定した（図４Ｅ、Ｆ、及びＧ、並びに表６）。ＬＰＳサンプルによるＨＥＫ－ｈＴＬＲ２株化細胞の活性化は、試験したＬＰＳ濃度範囲において無視し得るので、ＬＰＳサンプルにおいて、微量タンパク質汚染が実測された応答に寄与した可能性は除外された（データは示さない）。

多種多様なサイトカインレベルを異なるＬＰＳ構造から決定したが、最高レベルは、ＨＢ－１野生型ヘキサアシル化ＬＰＳにより生成され、またその他すべてのＬＰＳは、ΔｌｐｘＬ２ ＬＰＳについて認められたように野生型の付近から事実上ゼロのサイトカイン誘発までの範囲であった。サイトカイン誘発における定量的な相違の他、特定のサイトカインのレベル低下を引き起こすものの、その他のサイトカイン生成能力をなおも有する質的な相違もＬＰＳ構造について認められた。ＭｙＤ８８依存性炎症促進性サイトカインであるＩＬ－６及びＩＬ－１βの産生を誘発する能力が低下しており、野生型ＬＰＳが誘発するレベルのそれぞれ１０％及び２５％しか誘発しなかったが、ＴＲＩＦ依存性ＩＰ－１０（５０％）及びＭＣＰ－１（９０％）の分泌を誘発する能力については、そのほとんどを保持することが認められたいくつかの例として、ｐａｇＬ及びΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬ ＬＰＳが挙げられる。興味深いことに、３０℃及び２５℃で増殖させたΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰの間で相違が認められ、３０℃で増殖させたΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰは、３０～４０％のＩＬ－６及びＩＬ－１β、並びに２５℃では６０～８５％の同サイトカインを産生した一方、ＩＰ－１０及びＭＣＰ－１の誘発は類似した。このような結果から強調されることとして、ＬＰＳの生物工学は、サイトカイン放出量を微調整するために、いかに幅広い範囲の作動薬を提供することができるかという点が挙げられる。

３．考察
ＬＰＳは、アジュバントとして優れた能力を有するものの、副作用が懸念されている。アジュバント活性と最低毒性効果との間の最適なバランスを見つけるには、新規ＬＰＳ誘導体の開発を必要とする。ここでは、広範囲のＴＬＲ４応答及び差次的サイトカインパターンを誘発する新規の髄膜炎菌ＬＰＳ構造の収集について報告する。このような生物工学的に作出されたコンビナトリアルＬＰＳ突然変異体は、全細胞ワクチン、ＯＭＶワクチンの一部として、又は精製済みのＬＰＳ若しくはリピドＡ分子として利用可能である。髄膜炎菌のＯＭＶは、有望なワクチンとして活発に調査されており、血清群Ｂ髄膜炎菌疾患に対するＢｅｘｓｅｒｏワクチンの成分として、ヒト用にすでに承認済みである（２９，３０）。弱毒化されたΔｌｐｘＬ１ ＬＰＳは、髄膜炎菌ＯＭＶワクチンの構成成分として調査対象にあり、またＯＭＶを無毒化する安全な方法である（１６，３１）。更に、免疫研究では、精製後のΔｌｐｘＬ１ ＬＰＳは、野生型髄膜炎菌ＬＰＳと比較して類似した、但し毒性が低下したアジュバント活性を保持した（１５）。

改変されたＬＰＳ分子であるＬｐｘＬ１、ＬｐｘＬ２、及びＰａｇＬは、いずれも親株と比較してＴＬＲ４活性の低下を引き起こす（１３，１５）。ＬＰＳ内のアシル鎖の数がヘキサからペンタに減少しているので、これは予想されたことである。驚くべきことに、テトラアシル化ＬＰＳは、ペンタアシル化ＬＰＳよりも常に活性が低いという予想は、本発明者らの結果と矛盾している。大腸菌のテトラアシル化リピドＩＶａは、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ－２複合体の既知拮抗薬である（７、９、２８）。なおも、本発明者らは、髄膜炎菌のテトラアシル化ΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ ＬＰＳは、ペンタアシル化ΔｌｐｘＬ１ ＬＰＳよりも活性である一方、テトラアシル化ΔｌｐｘＬ１－ΔｌｐｘＬ２ ＬＰＳは検出可能な活性をもたらさなかったことを示す（データは示さず）。ΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬで刺激すると、ΔｌｐｘＬ２－ｐａｇＬ及びΔｌｐｘＬ２の両方に由来する精製後のＬＰＳは不活化であったものの、テトラアシル化ＬＰＳも有する全バクテリアは、そのペンタアシル化ΔｌｐｘＬ２親株と比較して、ＴＬＲ４／ＭＤ－２活性をやはり増加させた。同時に、これらの所見から、二次アシル鎖の欠損と組み合わせて、ＰａｇＬにより３’位置からＣ１２ＯＨを除去すると、その結果、テトラアシル化リピドＡは、一方の二次アシル鎖又は両方の二次アシル鎖を除去した場合と比較して、より高いＴＬＲ４活性をもたらすことが示唆される。Ｎｅｅｄｈａｍらにより、大腸菌において工学的に作出されたＬＰＳ構造（３２）には、ＰａｇＬの発現及びＬｐｘＭの欠損を通じて、ＰａｇＬによる３’位置からのＣ１２ＯＨの除去、及びリピドＡの還元末端にあるグルコサミンからの二次アシル鎖の欠損を引き起こすテトラアシル化ＬＰＳが含まれた。大腸菌中で産生されたこのテトラアシル化ＬＰＳは、したがってその親株に由来するペンタアシル化ＬＰＳよりも活性でありながら、本発明のΔｌｐｘＬ１－ｐａｇＬ突然変異体リピドＡのテトラアシル化構造とは異なったアシル鎖分布及び鎖長を有する。

興味深いことに、大腸菌由来のＬｐｘＰを髄膜炎菌に導入すると、温度感受性リピドＡの改変が髄膜炎菌にもたらされた。温度感受性遺伝子発現シグナルが保存されるとは考えにくいので、酵素そのものがより低い温度で最も活性であることを意味する。ΔｌｐｘＬ１－ｌｐｘＰ株を培養するために２５℃又は３０℃の温度を選択したが、その温度は、この突然変異体により産生されたペンタ及びヘキサアシル化ＬＰＳの混合物中に存在するヘキサアシル化ＬＰＳ種の量に影響を及ぼし、温度が低いほど最高の置換度をもたらす。ＬｐｘＰ酵素の温度感受性は、したがって制御された方式でのペンタ及びヘキサアシル化ＬＰＳ混合物の調製を可能にする。突然変異株を増殖させる時間及び／又は温度を選択することにより、ヘキサアシル化リピドＡ構造の量を増加又は減少させ、これによりＴＬＲ４活性及びサイトカインプロファイルの調整が実現可能となる。これは、髄膜炎菌ＯＭＶワクチンの免疫学的特性を微調整する新規アプローチを提供する。

更に、ＬｐｘＥ酵素の特異性について新たな見識が得られた。これまでに、大腸菌で発現するフランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）又はフランシセラ・ノビサイダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のｌｐｘＥ遺伝子は、１’の位置でのＰ基除去について特異的であることを明らかにした（３２、３３）。本発明者らは、Ｂ．ブロンキセプチカ由来のｌｐｘＥ相同体は、髄膜炎菌のリピドＡ中に存在する合計３つのＰ基のうち１つのみを除去することを見出した。ΔｌｐｔＡ－ｌｐｘＥ突然変異体由来のリピドＡのＭＳ／ＭＳスペクトルは、リピドＡの１及び４’の位置の両方にＰ基が存在することに一致する。更に、Ｐ基の除去は、ΔｌｐｔＡ－ｌｐｘＥ二重突然変異体にのみ、したがってリピドＡのＰＥＡ置換が存在しない場合にのみ認められた。したがって、ＰＥＡが存在すると、ｌｐｘＥがＰ基を除去するのを妨害する可能性がある。新規に記載されているＬｐｘＥ酵素は、２つのリン酸基間の加水分解のみを触媒するピロホスファターゼである可能性が極めて高い。ｌｐｔＡ遺伝子の欠損を通じてリピドＡ内にＰＥＡが存在しなくなると、その結果、ＴＬＲ４／ＭＤ－２活性が低下した。これは、ＬｐｔＡ欠損株により刺激した際に、ＴＨＰ－１細胞によるＴＮＦα放出の有意な低下を示すＪｏｈｎらによるこれまでの観察所見と一致する（３４）。ここでは、ペンタアシル化ΔｌｐｔＡ－ｐａｇＬ ＬＰＳ又は全バクテリアで刺激したとき、活性の低下はより一層明白であることを、本発明者らは明らかにした。

興味深いことに、本発明者らの結果は、ＬｐｘＬ２の欠損により２’のＣ１２脂肪のアシル鎖が存在しない場合、それに伴って単一のＰ基及びＰＥＡ基が除去されていることを示唆する。これは、質量分光分析前に行われ、リピドＡからのＰ基の喪失を引き起こす可能性がある酸加水分解法によるリピドＡの単離に起因してこれまで認められなかった（１５）。本試験では、質量分光分析にとって有害な化学修飾を一切含めることなく完全なＬＰＳ分子を使用したので、リピドＡの新たなリン酸化の変化を観察することが可能であった。

構築された弱毒化ＬＰＳ構造のいくつかは、ＴＬＲ４刺激を誘発するのにより高い濃度を必要としなかっただけでなく、親株について認められた活性化レベルも達成できなかった。これは、ｐａｇＬ ＬＰＳについて最も明白であった。この現象に対する理由は不明であるが、細胞内では安定であるが細胞表面では不安定なＬＰＳ－ＴＬＲ４－ＭＤ２受容体複合体の二量化、及び／又は特定のＬＰＳの濃度が高まった時のそれほど安定ではない二量化に起因すると考えられた。更に、特定のＬＰＳ種は、活性化をまったく示さず、またおそらくは拮抗的特性を有する可能性があり、したがってＴＬＲ４遮断薬として機能し得る。実際、髄膜炎菌ΔｌｐｘＬ１及びｐａｇＬペンタアシル化ＬＰＳは、ヘキサアシル化野生型髄膜炎菌ＬＰＳと共に投与すると、ＴＬＲ４応答を遮断することができる（１３）。

本試験では、多岐にわたるＴＬＲ４活性及びサイトカインプロファイルを有する一連のＬＰＳ種を生成するのに、髄膜炎菌においてコンビナトリアル生物工学を使用した。このような構造の応用は、アジュバントとしてのワクチンへの組み込みから、ＬＰＳについて記載又は示唆されている様々な形態の免疫療法、例えばがん療法、アルツハイマー病、又は多様な感染症を予防するための一般的免疫刺激等におけるその使用まで非常に多岐にわたり得る（３、３５～３７）。

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30.Snape, M. D., Dawson, T., Oster, P.,Evans, A., John, T. M., Ohene-Kena, B., Findlow, J., Yu, L. M., Borrow, R.,Ypma, E., Toneatto, D., and Pollard, A. J. (2010) Immunogenicity of twoinvestigational serogroup B meningococcal vaccines in the first year of life: arandomized comparative trial. The Pediatric infectious disease journal 29,e71-79
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Claims (34)

1. テトラアシル化リピドＡ部分を有するナイセリアＬＰＳであって、前記テトラアシル化リピドＡ部分が、野生型ナイセリアＬＰＳのリピドＡ部分と比較して、二次アシル鎖のうちの１つを欠いており、且つリピドＡ部分の還元末端にあるグルコサミンの３位の一次アシル鎖を欠いている、という点において改変されているナイセリアＬＰＳ。
2. 前記テトラアシル化リピドＡ部分を除き、ＬＰＳが、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、又はナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）のＬＰＳの構造を有する、請求項１に記載のナイセリアＬＰＳ。
3. 前記髄膜炎菌、淋菌、又はナイセリア・ラクタミカが、ｌｇｔＢ^－及びｇａｌＥ^－のうちの少なくとも１つである、請求項２に記載のナイセリアＬＰＳ。
4. 前記髄膜炎菌が、血清群Ｂ及び免疫型Ｌ３のうちの少なくとも１つである、請求項２又は３に記載のナイセリアＬＰＳ。
5. 前記テトラアシル化リピドＡ部分が、式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
   

   

   
   

   

   
   の構造を有し、
   式中、Ｒ_１及びＲ_２は、独立に－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－Ｈ、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_２－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、－［Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ］_３－Ｈ、又は－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２である、請求項１～４のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ。
6. 前記リピドＡ部分が、前記リピドＡ部分の非還元末端にあるグルコサミンに連結した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖を欠いている、又は前記リピドＡ部分が、式（Ｉ）の構造を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ。
7. ナイセリア属の遺伝的に改変されたバクテリアであって、
   ａ）内因性ｌｐｘＬ１遺伝子又は内因性ｌｐｘＬ２遺伝子によりコードされるリピドＡ生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼの活性を取り除く遺伝的改変と、
   ｂ）前記バクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変と
   を含み、
   前記バクテリアに、リピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼ活性を付与する遺伝的改変が、配列番号８～１７のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＰａｇＬリピドＡ ３－Ｏ－デアシラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する異種ｐａｇＬ遺伝子の発現を導入する遺伝的改変である、遺伝的に改変されたバクテリア。
8. 遺伝的に改変された髄膜炎菌、淋菌、又はナイセリア・ラクタミカである、請求項７に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
9. 前記内因性ｌｐｘＬ１遺伝子が、配列番号１～３のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｐｘＬ１タンパク質をコードする遺伝子である、又は前記内因性ｌｐｘＬ２遺伝子が、配列番号４～７のうちの少なくとも１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＬｐｘＬ２タンパク質をコードする遺伝子である、請求項７又は８に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
10. 異種抗原を発現するように更に遺伝的に改変されている、請求項７～９のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
11. 前記異種抗原が、前記バクテリアの細胞外外膜表面において発現している、請求項１０に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
12. 内因性ｌｇｔＢ遺伝子及び内因性ｇａｌＥ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を低下させる、又は取り除く遺伝的改変を有する、請求項７～１１のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
13. 髄膜炎菌の血清群Ｂ、免疫型Ｌ３である、請求項７～１２のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
14. 髄膜炎菌株Ｈ４４／７６又はその派生株である、請求項７～１３のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたバクテリア。
15. ＬＰＳが、請求項７～１４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変されたバクテリアから取得可能である、請求項１～６のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ。
16. 請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳを含むＯＭＶ。
17. 請求項７～１４のいずれか一項に記載のバクテリアから取得可能である、請求項１６に記載のＯＭＶ。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ、遺伝的に改変されたバクテリア、及びＯＭＶのうちの少なくとも１つを含む組成物。
19. 薬学的に許容される添加剤を更に含む医薬組成物である、請求項１８に記載の組成物。
20. 請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ、又は請求項１６若しくは１７に記載のＯＭＶを含む無細胞ワクチンである、請求項１８又は１９に記載の組成物。
21. 請求項７～１４のいずれか一項に記載のバクテリアを含む全細胞ワクチンである、請求項１８又は１９に記載の組成物。
22. 少なくとも１つの非ナイセリア抗原を更に含む、請求項２０又は２１に記載の組成物。
23. 請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳを製造する方法であって、
    ａ）請求項７～１４のいずれか一項に記載のバクテリアを培養するステップと、
    ｂ）任意選択で、ＬＰＳを、抽出するステップ及び精製するステップのうちの少なくとも１つのステップと
    を含む方法。
24. 請求項１６又は１７に記載のＯＭＶを製造する方法であって、
    ａ）請求項７～１４のいずれか一項に記載のバクテリアを培養するステップと、
    ｂ）任意選択で、前記ＯＭＶを抽出するステップと、
    ｃ）前記ＯＭＶを回収するステップであって、前記ＯＭＶから前記バクテリアを除去することを少なくとも含むステップと
    を含む方法。
25. 界面活性剤フリー法である、請求項２４に記載の方法。
26. 請求項２０に記載の無細胞ワクチンを製造する方法であって、
    ａ）
    ｉ）請求項２３に記載の方法において、請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳ、及び
    ｉｉ）請求項２４又は２５に記載の方法において、請求項１６又は１７に記載のＯＭＶ
    のうちの少なくとも１つを製造するステップと、
    ｂ）前記ナイセリアＬＰＳ及び前記ＯＭＶのうちの少なくとも１つを、任意選択で更なるワクチン成分と共に、ワクチン製剤に製剤化するステップと
    を含む方法。
27. 請求項２１に記載の全細胞ワクチンを製造する方法であって、
    ｉ）請求項７～１４のいずれか一項に記載のバクテリアを培養するステップと、
    ｉｉ）任意選択で、前記バクテリアを不活性するステップ、及びワクチンに製剤化するステップのうちの少なくとも１つのステップと
    を含む方法。
28. 医薬として使用されるための、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。
29. 対象において、免疫応答を誘発又は刺激するステップを含む処置で使用されるための、請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳを含む組成物。
30. ナイセリアＬＰＳがアジュバントとして用いられる、請求項２８に記載の組成物。
31. 前記処置が、ナイセリアＬＰＳと共に抗原を投与することを更に含み、及び前記処置が、前記抗原と関連した感染性疾患又は腫瘍を予防又は治療するためである、請求項２９に記載の組成物。
32. 免疫療法において、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）作動薬として使用するための、請求項１～６及び１５のいずれか一項に記載のナイセリアＬＰＳを含む組成物。
33. 前記免疫療法が、がん又は神経変性疾患の免疫療法である、請求項３２に記載の組成物。
34. 前記免疫療法が、多様な微生物感染症の伝播を予防及び／若しくは低減するため、並びに／又はバクテリアの増殖を抑制するための一般的免疫刺激を含む、請求項３２に記載の組成物。
    
    

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