CN109071586B - 经修饰的四酰化奈瑟球菌lps - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有四酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，四酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺乏二级酰基链之一，并且缺乏在脂质A部分的还原末端处的葡糖胺的3‑位上的一级酰基链。本发明进一步涉及这样的奈瑟球菌，其已进行遗传修饰，以降低内源lpxL1或lpxL2基因中任一种的表达，并且引入异源pagL基因的表达。本发明的奈瑟球菌LPS具有TLR4激动剂性质，并且因此可用于诱导或刺激免疫应答的组合物，例如疫苗，以及其它形式的免疫疗法中。

Description

经修饰的四酰化奈瑟球菌LPS

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是免疫学、医学微生物学和疫苗学领域。本发明涉及经修饰的LPS分子，其可以从生物工程脑膜炎球菌LPS突变体获得，并且可用作全细胞疫苗、OMV疫苗或者纯化的LPS或脂质A分子的部分。

背景技术

脂多糖(LPS)，也称为细菌内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的丰富组分。在被革兰氏阴性菌感染期间，LPS或更准确地说，LPS的脂质A部分激活宿主的先天免疫系统(1-3)。这种激活通过LPS与模式识别受体Toll样受体4/髓样分化因子2(TLR4/MD-2)复合物的结合而发生，所述结合启动信号传导级联，导致清除感染必需的细胞因子产生(3,4)。然而，这种信号级联的过度刺激和炎性细胞因子的过度产生对宿主是有害的，并且可以导致危及生命的状况，例如败血症性休克(5，6)。

为了完全激活TLR4/MD-2复合物，具有六个酰基链和两个磷酸基的脂质A结构是关键的(7)。然而，许多细菌物种携带可以通过改变酰基链或磷酸基的数目来改变其脂质A结构的酶，导致TLR4/MD-2复合物的激活改变(8)，甚至到成为拮抗剂而不是激动剂的点，如对于四酰化大肠杆菌(E.coli)脂质IVa结构中观察到的(7,9)。

TLR4/MD-2复合物在TLR受体家族中是独特的，因为它可以通过MyD88以及TRIF途径两者来发信号。经修饰的脂质A结构可以通过优先募集MyD88或TRIF衔接子分子来诱导选择信号传导。触发I型干扰素产生的通过TRIF途径的优先信号传导被认为对于疫苗佐剂是重要的(10，11)。单磷酰脂质A(MPLA)是经修饰的脂质A的实例，其触发TRIF偏向的信号传导(11)。MPLA是来自明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)的异质脂质A混合物，其已进行化学解毒，并且被批准用作一些疫苗中的佐剂(12)。MPLA的主要组分由六酰化的4'-单磷酰脂质A组成。MPLA的使用具有以下缺点：对于其制备，除来自细菌的LPS分离之外，还需要化学处理，并且其仅由LPS的脂质A部分组成，使得其不溶于水。

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)通常产生六酰化LPS，其中磷酸基和磷酸乙醇胺基团附着在脂质A的1和4'位置(13，14)。LPS修饰酶如PagL的异源表达或脂质A生物合成酶如LpxL1和LpxL2的缺失已用于使高活性脑膜炎球菌LPS解毒(13，15)。当制备脑膜炎球菌外膜囊泡疫苗时，LpxL1的缺失显示为用于解毒脑膜炎球菌LPS的有利方法，而无需使用去污剂来降低过量的LPS相关的反应原性(16)。然而，这种经修饰的LPS的活性已降低到它几乎不诱导人细胞上的TLR4/MD-2复合物激活的点，使其不太适合用作独立的疫苗佐剂(17)。脑膜炎奈瑟球菌中pagL的异源表达导致不同减毒的五酰化LPS结构，其仍能够诱导TLR4激活，并且在人单核细胞系上诱导TRIF偏向的细胞因子产生(13)。

Pupo等人(2014，J.Biol.Chem.289:8668–8680)描述了来自脑膜炎奈瑟球菌中的ΔlpxL1或pagL⁺单一突变体的五酰化突变脂质A的结构分析和经修饰的激动剂性质。

本发明的目的是提供可用作佐剂的经修饰的LPS分子，其具有在保留足够量的免疫激活同时限制毒性副作用之间的最佳平衡。本发明通过与脂质A生物合成基因的靶向缺失组合的LPS修饰酶的异源表达来解决该问题，以提供具有广泛范围的TLR4/MD-2激活能力的脑膜炎球菌LPS结构的多样化集合，其可用于各种预防和治疗应用中。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及具有四酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，四酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺乏二级酰基链之一，并且缺乏在脂质A部分的还原末端上的葡糖胺的3-位上的一级酰基链。优选地，除了四酰化的脂质A部分之外，LPS具有脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)或乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)的LPS结构，由此更优选地，脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌是lgtB^-和galE^-中的至少一种，并且由此最优选地，脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种。

在根据本发明的优选的奈瑟球菌LPS中，四酰化的脂质A部分具有式(I)或(II)的结构(参见下文)，其中R₁和R₂独立地是-P(O)(OH)₂、-[P(O)(OH)-O]₂-H、-[P(O)(OH)-O]₂-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-H或-P(O)(OH)-O-CH₂CH₂NH₂，并且其中优选地，R1和R2独立地是-P(O)(OH)₂、-[P(O)(OH)-O]₂-H、-[P(O)(OH)-O]₂-CH₂CH₂NH₂或-[P(O)(OH)-O]₃-CH₂CH₂NH₂。

根据本发明的特别优选的奈瑟球菌LPS是LPS，其中脂质A部分缺乏与附着至所述脂质A部分非还原末端上的葡糖胺的一级酰基链结合的二级酰基链，并且缺乏在脂质A部分的还原末端上的葡糖胺的3-位上的一级酰基链，或其中脂质A部分具有式(I)的结构。

在第二个方面，本发明涉及奈瑟球菌属(Neisseria)的遗传修饰的细菌，其中所述细菌包含：a)降低或消除由内源lpxL1基因或内源lpxL2基因编码的脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰；以及b)对细菌赋予脂质A3-O-脱酰酶活性的遗传修饰。优选地，细菌是遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌。优选地，在遗传修饰的细菌中，内源lpxL1基因是编码LpxL1蛋白的基因，所述LpxL1蛋白具有与SEQ ID NO：1-3中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或者内源lpxL2基因是编码LpxL2蛋白的基因，所述LpxL2蛋白具有与SEQ ID NO：4-7中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且对细菌赋予脂质A3-O-脱酰酶活性的遗传修饰是引入异源pagL基因的表达的遗传修饰，所述异源pagL基因具有编码与SEQ ID NO：8-17中的至少一个具有至少30％的氨基酸序列同一性的PagL脂质A3-O-脱酰酶的核苷酸序列。

本发明的遗传修饰的细菌进一步优选进行遗传修饰，以表达异源抗原，由此优选地，异源抗原在细菌的细胞外外膜表面上表达。在一个优选实施方案中，遗传修饰的细菌具有降低或消除内源lgtB基因和内源galE基因中的至少一种的表达的遗传修饰。

优选地，根据本发明的遗传修饰的细菌是脑膜炎奈瑟球菌血清群B，免疫型L3。更优选地，细菌是脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76或其衍生物。

在第三个方面，本发明涉及根据本发明的奈瑟球菌LPS，其中所述LPS可得自或得自根据本发明的遗传修饰的细菌。

在第四个方面，本发明涉及包含本发明的奈瑟球菌LPS的OMV。OMV优选可得自或得自根据本发明的遗传修饰的细菌。

在第五个方面，本发明涉及包含以下中的至少一种的组合物：本发明的奈瑟球菌LPS、本发明的遗传修饰的细菌和本发明的OMV。优选地，该组合物是药物组合物，其进一步包含药学可接受的赋形剂。优选的组合物是包含本发明的奈瑟球菌LPS或本发明的OMV的无细胞疫苗。另一种优选组合物是包含本发明的细菌的全细胞疫苗。优选地，本发明的组合物进一步包含至少一种非奈瑟球菌抗原。

在第六个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的奈瑟球菌LPS的方法。该方法优选包括以下步骤：a)培养本发明的细菌；以及b)任选地，LPS的提取和纯化中的至少一种。

在第七个方面，本发明涉及用于制备根据本发明的OMV的方法。该方法优选包括以下步骤：a)培养本发明的遗传修饰的细菌；b)任选地，提取OMV；以及c)回收OMV，其中所述回收至少包括从OMV中去除细菌。用于产生OMV的优选方法是无去污剂的方法。

在第八个方面，本发明涉及用于制备本发明的无细胞疫苗的方法。该方法优选包括以下步骤：a)产生以下中的至少一种：i)根据本发明的奈瑟球菌LPS，优选在如上文定义的方法中；以及ii)根据本发明的OMV，优选在如上文定义的方法中；以及b)任选地与进一步的疫苗组分一起，将奈瑟球菌LPS和OMV中的至少一种配制成疫苗制剂。

在第九个方面，本发明涉及用于制备本发明的全细胞疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：i)培养本发明的细菌；以及ii)任选地，细菌灭活和配制成疫苗中的至少一种。

在第十个方面，本发明涉及本发明的奈瑟球菌LPS、本发明的细菌、本发明的OMV或本发明的组合物，其用作药剂。

在第十一个方面，本发明涉及本发明的奈瑟球菌LPS，其用于包括在对象中诱导或刺激免疫应答的治疗中。优选地，奈瑟球菌LPS用作佐剂。

在一个优选实施方案中，奈瑟球菌LPS用于进一步包括将抗原连同奈瑟球菌LPS一起施用的治疗，并且其中所述治疗用于预防或治疗与抗原相关的传染病或肿瘤。

在另一个优选实施方案中，本发明的奈瑟球菌LPS用于用作免疫疗法中的Toll样受体4(TLR4)激动剂，其中优选地，免疫疗法是癌症或神经变性疾病的免疫疗法。在一个替代实施方案中，免疫疗法包括泛发性免疫刺激(generalized immune stimulation)，用于预防和/或降低不同微生物感染的传播和/或抑制细菌生长。

具体实施方式

定义

术语“同源性”、“序列同一性”等等在本文中可互换使用。序列同一性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配所确定的。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过比较一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二多肽的序列来确定。可以通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”。

“序列同一性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定，取决于两个序列的长度。优选使用全局比对算法(例如NeedlemanWunsch)比对相似长度的序列，所述全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)比对基本上不同长度的序列。当序列(当通过例如使用缺省参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性(如如下定义的)时，序列可以被称为“基本上相同的”或“基本上相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法，以在其整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数目并且最小化缺口数目。当两个序列具有相似长度时，全局比对适当地用于确定序列同一性。一般地，使用GAP缺省参数，其中缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的缺省评分矩阵是nwsgapdna，并且对于蛋白质，缺省评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。序列比对和关于序列同一性百分比的评分可以使用计算机程序来确定，所述计算机程序例如可得自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752USA的GCG WisconsinPackage，版本10.3，或使用开放资源软件，例如程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或EmbossWIN版本2.10.0中的“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上文GAP相同的参数，或使用缺省设置(关于‘needle’和‘water’两者以及关于对于蛋白质和DNA比对两者，缺省的缺口开放罚分为10.0，并且缺省缺口延伸罚分为0.5；缺省评分矩阵是用于蛋白质的Blossum62和用于DNA的DNAFull)。当序列具有基本上不同的总长度时，局部比对，例如使用Smith Waterman算法的那些是优选的。

可替代地，可以通过使用算法例如FASTA、BLAST等针对公共数据库搜索来确定相似性或同一性百分比。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以进行针对公共数据库的搜索，以例如鉴定其它家庭成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的BLASTn和BLASTx程序(版本2.0)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序、评分＝100、字长＝12进行，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序、评分＝50、字长＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述利用GappedBLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用分别程序(例如BLASTx和BLASTn)的缺省参数。参见在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页。

任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑到所谓的“保守”氨基酸取代，如技术人员明确的。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中已去除所公开序列中的至少一个残基并且在其位置中插入不同残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。关于天然存在的氨基酸中的每一种优选的保守取代如下：Ala与ser；Arg与lys；Asn与gln或his；Asp与glu；Cys与ser或ala；Gln与asn；Glu与asp；Gly与pro；His与asn或gln；Ile与leu或val；Leu与ile或val；Lys与arg；gln或glu；Met与leu或ile；Phe与met、leu或tyr；Ser与thr；Thr与ser；Trp与tyr；Tyr与trp或phe；以及Val与ile或leu。

如本文使用的，术语“选择性杂交(selectively hybridizing)”、“选择性杂交(hybridizes selectively)”和类似术语预期描述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。也就是说，此类杂交序列可以共享至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65、至少70％、至少75％、至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％或更优选至少99％的序列同一性。

此类杂交条件的优选的非限制性实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的杂交，随后为在约50℃下、优选在约55℃下、优选在约60℃下、且甚至更优选在约65℃下，在1X SSC、0.1％SDS中的一次或多次洗涤。

高度严格的条件包括例如在约68℃下在5x SSC/5x Denhardt溶液/1.0％SDS中的杂交，以及在室温下在0.2x SSC/0.1％SDS中的洗涤。可替代地，洗涤可以在42℃下进行。

技术人员将知道适用于严格和高度严格杂交条件的条件。关于这些条件的另外指导是本领域容易获得的，例如，Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；以及Ausubel等人(编辑)，Sambrook和Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York 1995，CurrentProtocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons，N.Y.)中。

当然，仅与聚A序列(例如mRNA的3'末端聚(A)束)或T(或U)残基的互补段杂交的多核苷酸，将不包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与含有聚(A)段或其互补序列(complement)的任何核酸分子(例如，实际上任何双链cDNA克隆)杂交。

“核酸构建体”或“核酸载体”在本文中应理解为意指起因于使用重组DNA技术的人造核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包括天然存在的核酸分子，尽管核酸构建体可以包含天然存在的核酸分子(的部分)。术语“表达载体”或“表达构建体”指能够在与此类序列相容的宿主细胞或宿主生物中实现基因表达的核苷酸序列。这些表达载体通常包括至少合适的转录调节序列和任选的3'转录终止信号。也可以存在实现表达中必需或有帮助的另外因子，例如表达增强子元件。表达载体将被引入合适的宿主细胞内，并且能够在宿主细胞的体外细胞培养物中实现编码序列的表达。表达载体适合于在本发明的宿主细胞或生物中复制。

如本文使用的，术语“启动子”或“转录调节序列”指核酸片段，其作用于控制一种或多种编码序列的转录，并且位于关于编码序列的转录起始位点的转录方向上游，并且通过以下的存在进行结构鉴定：关于DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点，转录起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活物结合位点，以及本领域技术人员已知直接或间接地起作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理或发育调节的启动子，例如，通过应用化学诱导剂。

术语“可选择标记物”是本领域普通技术人员熟悉的术语，并且在本文中用于描述任何遗传实体，其在表达时可以用于选择含有可选择标记物的一种或多种细胞。术语“报道分子”可以与标记物互换使用，尽管它主要用于指可见标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)。可选择标记物可以是显性的或隐性的或双向的。

如本文使用的，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸与另一种核酸序列置于功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，如果转录调节序列影响编码序列的转录，则它与编码序列可操作地连接。可操作地连接意指连接的DNA序列通常是连续的，并且在必要时，连接邻接且在阅读框中的两个蛋白质编码区。

如本文使用的，术语“肽”定义为氨基酸残基链，通常具有确定的序列。如本文使用的，术语肽可与术语“多肽”和“蛋白质”互换。在本发明的上下文中，术语“肽”定义为包含通过经修饰的或未经修饰的肽键连接的至少两个氨基酸的任何肽或蛋白质。术语“肽”指短链分子，例如寡肽或寡聚物，或指长链分子，例如蛋白质。蛋白质/肽可以是直链、支链或环状的。肽可以包括D氨基酸、L氨基酸或其组合。根据本发明的肽可以包含经修饰的氨基酸。因此，本发明的肽也可以通过自然过程如转录后修饰或通过化学过程进行修饰。这些修饰的一些实例是：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、与黄素的共价键合、与血红素的共价键合、与核苷酸或核苷酸衍生物的共价键合、与经修饰的或未经修饰的碳水化合物部分的共价键合、与脂质或脂质衍生物的键合、与磷脂酰肌醇的共价键合、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、半胱氨酸分子形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ-羧化、羟基化、碘化、甲基化、氧化、磷酸化、外消旋化、羟基化等。因此，不具有消除肽免疫原性的效应的肽的任何修饰都包括在本发明的范围内。

术语“基因”意指包含区域(转录区)的DNA片段，其在细胞中转录成RNA分子(例如mRNA)，与合适的调节区(例如启动子)可操作地连接。基因通常包含几个可操作连接的片段，例如启动子、5'前导序列、编码区和包含多腺苷酸化位点的3'-非翻译序列(3'-末端)。“基因的表达”指这样的过程，其中与适当的调节区特别是启动子可操作地连接的DNA区域被转录成RNA，其是生物活性的，即能够被翻译成生物活性的蛋白质或肽。当用于指示给定(重组)核酸或多肽分子与给定宿主生物或宿主细胞之间的关系时，术语“同源”应理解为意指在性质上，核酸或多肽分子由相同物种，优选相同变种或品系的宿主细胞或生物产生。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列通常(但不一定)可操作地连接到另一个(异源)启动子序列，并且如果适用的话，则与其自然环境中不同的另一个(异源的)分泌信号序列和/或终止子序列。应理解，调节序列、信号序列、终止子序列等也可以与宿主细胞同源。

当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”和“外源的”指这样的核酸或蛋白质，其不作为它存在于其中的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的部分天然存在，或者在基因组或DNA或RNA序列中不同于它在自然界中在其中发现的那种的细胞或者一个或多个位置中发现。异源和外源核酸或蛋白质对于它引入其内的细胞不是内源的，而是从另一种细胞获得或者合成或重组产生。一般地，尽管不是必需的，但此类核酸编码蛋白质，即外源蛋白质，其通常不由DNA在其中转录或表达的细胞产生。类似地，外源RNA编码在其中存在外源RNA的细胞中通常不表达的蛋白质。异源/外源核酸和蛋白质也可以称为外来核酸或蛋白质。本领域技术人员将识别为对于它在其中表达的细胞外来的任何核酸或蛋白质在本文中由术语异源或外源核酸或蛋白质涵盖。术语异源和外源也适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合，即其中组合序列中的至少两个相对于彼此是外来的组合。

如本文使用的，术语“免疫应答”指抗体和/或细胞(例如T淋巴细胞)的产生，其针对和/或帮助特定抗原实体的分解和/或抑制，在其表面处携带和/或表达或呈递抗原和/或抗原表位。出于本发明的目的，短语“有效的免疫保护应答”、“免疫保护”和类似术语意指针对病原体、病原体感染的细胞或癌细胞的一种或多种抗原表位的免疫应答，以便在接种疫苗的对象中保护不受通过病原体的感染或不受癌症。出于本发明的目的，不受通过病原体的感染的保护或不受癌症的保护不仅包括感染或癌症的绝对预防，还包括例如与未接种疫苗的感染对象相比，通过病原体的感染或癌症的程度或速率中的任何可检测的降低，或者接种疫苗的对象中起因于通过病原体的感染或癌症的疾病或者任何症状或状况的严重性中的任何可检测的降低。在癌症的情况下，有效的免疫保护应答还包括清除癌细胞，从而减少癌症的大小甚至消除癌症。为了实现这点的疫苗接种也称为治疗性疫苗接种。可替代地，可以在先前未被病原体感染和/或未被病原体感染或在接种疫苗时尚未患有癌症的对象中诱导有效的免疫保护性应答，此类疫苗接种可以称为预防性疫苗接种。

根据本发明，术语“抗原”在本文中的一般使用指与抗体特异性结合的任何分子。该术语还指可以被MHC分子结合且呈递给T细胞受体的任何分子或分子片段。抗原可以是例如蛋白质分子，即多氨基酸序列，任选包含非蛋白质基团，例如碳水化合物部分和/或脂质部分，或抗原可以是例如并非蛋白质的分子，例如碳水化合物。抗原可以是例如蛋白质的任何部分(肽、部分蛋白质、全长蛋白质)，其中所述蛋白质是天然存在的或合成衍生的、细胞组合物(全细胞、细胞裂解产物或破坏的细胞)、生物(整个生物、裂解产物或破坏的细胞)或碳水化合物或其它分子、或其一部分，其能够在特定对象中引发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，所述免疫应答优选可经由测定或方法测量。

术语“抗原”在本文中被理解为结构物质，其充当适应性免疫应答的受体的靶。抗原因此充当关于TCR(T细胞受体)或BCR(B细胞受体)或分泌形式的BCR(即抗体)的靶。抗原因此可以是蛋白质、肽、碳水化合物或其它半抗原，其通常是较大结构的部分，例如细胞或病毒粒子。抗原可以源自体内(“自身”)或外部环境(“非自身”)。由于胸腺中T细胞的阴性选择，免疫系统通常在正常条件下针对“自身”抗原无反应，并且应该仅鉴定且攻击来自外界的“非自身”入侵者、或者在例如疾病状况下存在于体内的经修饰的/有害的物质。其为细胞免疫应答的靶的抗原结构通过抗原呈递细胞(APC)以经加工的抗原肽的形式经由组织相容性分子呈递给适应性免疫系统的T细胞。取决于呈递的抗原和组织相容性分子的类型，几种类型的T细胞可以变得被激活。对于T细胞受体(TCR)识别，抗原在细胞内加工成小肽片段，并且通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递给T细胞受体。

术语“免疫原”在本文中用于描述包含或编码抗原的至少一个表位的实体，使得当施用于对象时，优选连同适当的佐剂一起，在对象中引发针对表位和包含表位的抗原的特异性体液和/或细胞免疫应答。免疫原可以与抗原相同或至少包含抗原的部分，例如包含抗原表位的部分。因此，在一个实施方案中，针对特定抗原给对象接种疫苗意指，由于施用包含至少一个抗原表位的免疫原，引发针对抗原或其免疫原性部分的免疫应答。疫苗接种优选导致保护或治疗效应，其中随后暴露于抗原(或抗原来源)引发针对抗原(或来源)的免疫应答，其降低或预防对象中的疾病或状况。疫苗接种的概念是本领域众所周知的。通过施用本发明的预防或治疗组合物引发的免疫应答可以是与不存在疫苗施用的情况下相比，免疫状态的任何方面(例如，细胞应答、体液应答、细胞因子产生)中的任何可检测变化。

“表位”在本文中定义为给定抗原内的单个免疫原性位点，其足以在对象中引发免疫应答。本领域技术人员将认识到T细胞表位在大小和组成中不同于B细胞表位，并且通过I类MHC途径呈递的T细胞表位不同于通过II类MHC途径呈递的表位。表位可以是线性序列或构象表位(保守结合区)，取决于免疫应答的类型。抗原可以与单个表位一样小或更大，并且可以包括多重表位。像这样，抗原的大小可以小至约5-12个氨基酸(例如，肽)并且大到：全长蛋白质，包括多聚体蛋白质、蛋白质复合物、病毒粒子、颗粒、全细胞、整个微生物或其一部分(例如，全细胞的裂解产物或微生物的提取物)。

佐剂在本文中被理解为实体，当与抗原组合施用于人或动物对象以在对象中产生针对抗原的免疫应答时，所述实体刺激免疫系统，从而激发、增强或促进抗原的免疫应答，优选不必生成对佐剂本身的特异性免疫应答。与在相同条件下但在不存在佐剂的情况下针对抗原生成的免疫应答相比，优选的佐剂将针对给定抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。用于确定超过相应的对照组，如通过一组动物或人对象中的佐剂产生的针对给定抗原的免疫应答的统计平均增强的测试是本领域可获得的。佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫应答。

OMV(也称为“水泡(bleb)”)是双层膜结构，通常为球形，直径在20-250nm(有时为10-500nm)的范围内，其从革兰氏阴性菌的外膜断开。OMV膜含有在内部上的磷脂(PL)以及在外部上的脂多糖(LPS)和PL，与不同位中的膜蛋白混合，在很大程度上反映了它们与其断开的细菌外膜的结构。OMV的管腔可以包含来自周质或细胞质的各种化合物，例如蛋白质、RNA/DNA和肽聚糖(PG)，然而，与细菌细胞不同，OMV缺乏自我复制的能力。在本发明的上下文中，取决于其制备方法，可以区分三种类型的OMV。sOMV是通过将完整细胞与已经形成的OMV分开，从培养上清液中纯化且浓缩的自发或天然OMV。去污剂OMV，dOMV，是用去污剂例如脱氧胆酸盐从细胞中提取的，这也降低了反应原性LPS的含量。在去污剂提取后，将dOMV与细胞和细胞碎片分开，并且进一步纯化且浓缩。最后，术语天然nOMV在本文中用于OMV，用非去污剂细胞破碎技术由浓缩的死细胞生成，或者用其它(非破坏性)无去污剂方法从细胞中提取，以能够将其与野生型自发性OMV和去污剂提取的dOMV明确地区分。

对本文公开序列数据库中可访问的核苷酸或氨基酸序列的任何提及指如在本文件的提交日期时可获得的序列条目的版本。

发明详述

本发明涉及新型奈瑟球菌LPS，其具有四酰化的脂质A部分，并且可用于生成和/或刺激免疫应答。与来自亲本株的相应的六酰化LPS相比，从lpxL1、lpxL2和pagL单一突变体奈瑟球菌菌株获得的五酰化LPS分子都具有降低的TLR4活性(13,15)。预期四酰化LPS总是比五酰化LPS更少活性。实际上，大肠杆菌的四酰化脂质IVa甚至已知是人TLR4/MD-2复合物的拮抗剂(7,9,28)。令人惊讶的是，本发明人已发现脑膜炎球菌四酰化ΔlpxL1-pagL LPS比五酰化ΔlpxL1LPS更具活性，而四酰化ΔlpxL1-ΔlpxL2LPS不产生可检测的活性(数据未显示)。与其五酰化的ΔlpxL2亲本株相比，用也携带四酰化LPS的ΔlpxL2-pagL的全细菌刺激再次增加TLR4/MD-2活性。总之，这些发现指示与二级酰基链或两个二级酰基链的单独去除相比，与二级酰基链的缺失组合的通过PagL从3'位去除C12OH导致四酰化的脂质A出乎意料地产生更高的TLR4活性。

因此，在第一个方面，本发明涉及具有四酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，或涉及四酰化的脂质A部分本身。优选地，与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，四酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺乏二级酰基链之一，并且因为它缺乏在脂质A部分的还原末端上的葡糖胺的3-位上的一级酰基链。因此，与野生型奈瑟球菌LPS的六酰化的脂质A部分相比，本发明的四酰化的脂质A部分具有两个修饰，其将脂质A部分上的酰基链总数目从六个降低到四个：1)脂质A部分缺乏两个二级酰基链中的任一个，即与附着至脂质A部分的非还原末端上的葡糖胺的一级酰基链结合的二级酰基链，或与在脂质A部分的还原末端上的葡糖胺附着的一级酰基链结合的二级酰基链；以及2)脂质A部分缺乏在脂质A部分的还原末端上的葡糖胺的3-位上的一级酰基链。优选地，分离奈瑟球菌LPS或四酰化的脂质A部分。

在本发明的优选的奈瑟球菌LPS中，四酰化的脂质A部分具有式(I)或(II)的结构：

其中R₁和R₂独立地是-P(O)(OH)₂、-[P(O)(OH)-O]₂-H、-[P(O)(OH)-O]₂-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-H或-P(O)(OH)-O-CH₂CH₂NH₂，并且其中优选地，R1和R2独立地是-P(O)(OH)₂、-[P(O)(OH)-O]₂-H、-[P(O)(OH)-O]₂-CH₂CH₂NH₂或-[P(O)(OH)-O]₃-CH₂CH₂NH₂。

在一个优选实施方案中，本发明的奈瑟球菌LPS具有四酰化的脂质A部分，其缺乏与附着至脂质A部分的非还原末端上的葡糖胺的一级酰基链结合的二级酰基链。优选地，在该实施方案中，四酰化的脂质A部分具有上文式(I)的结构。

除了四酰化的脂质A部分之外，本发明的奈瑟球菌LPS还具有脂多糖的结构，所述脂多糖得自或可得自奈瑟球菌属的细菌。奈瑟球菌LPS有时也被称为脂寡糖(LOS)，这是由于它们通过缺乏O侧链而不同于肠杆菌科的LPS的事实。然而，在本发明的上下文中，术语“LPS”和“LOS”是可互换的。出于一致性原因，我们应进一步提及LPS。本发明的LPS由其获得或可获得的奈瑟球菌属的细菌可以是野生型奈瑟球菌，或具有本文下文所述的一种或多种遗传修饰的奈瑟球菌。奈瑟球菌属的细菌优选是选自脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌和乳糖奈瑟球菌的物种，由此更优选脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种。

因此，优选地，除了四酰化的脂质A部分之外，本发明的奈瑟球菌LPS的剩余部分具有脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌或具有如本文下文所述的遗传修饰的这些物种菌株的LPS结构。更优选地，除了四酰化的脂质A部分之外，本发明的奈瑟球菌LPS的剩余部分具有脑膜炎奈瑟球菌的LPS结构，其是血清群B和免疫型L3中的至少一种或具有如本文下文所述的遗传修饰的该血清群和/或免疫型的菌株。

在一个优选实施方案中，本发明的奈瑟球菌LPS具有经修饰的寡糖结构，以便去除怀疑激发自身免疫应答的可能表位，和/或增加与树突状细胞的结合和佐剂活性。因此，优选地，本发明的奈瑟球菌LPS得自或可得自奈瑟球菌属的细菌，所述细菌具有降低或消除内源lgtB基因和内源galE基因中的至少一种的表达的遗传修饰。奈瑟球菌lgtB基因编码具有乳-N-新四糖生物合成糖基转移酶活性的酶，并且例如通过Jennings等人(Mol Microbiol，1995，18:729–740)和Arkin等人(J Bacteriol.2001，183:934–941)描述。来自具有lgtB破坏的奈瑟球菌菌株的LPS已显示靶向树突状细胞(DC)上的DC-SIGN凝集素受体，从而使由DC驱动的T细胞应答偏向于T辅助细胞1型活性(Steeghs等人Cell Microbiol.2006，8:316-25)。奈瑟球菌galE基因编码具有UDP-葡萄糖4-差向异构酶活性的酶，并且由Jennings等人(Mol Microbiol，1993，10:361–369)和Lee等人(Infect Immun.1995，63:2508–2515)描述。

在第二个方面，本发明涉及奈瑟球菌属的遗传修饰的细菌。细菌优选是包含根据本发明的第一个方面具有四酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS的细菌。细菌优选是遗传修饰的，因为它包含：a)降低或消除由内源lpxL1基因或内源lpxL2基因编码的脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰；以及b)对细菌赋予脂质A3-O-脱酰酶活性的遗传修饰。降低或消除月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰可以是例如错义突变，如Fransen等人(2009，PLoS Pathogens 5(4):e1000396)中所述。优选地，降低或消除脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰是降低或消除内源lpxL1基因或内源lpxL2基因的表达的修饰。遗传修饰的细菌优选是选自脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌和乳糖奈瑟球菌的物种的细菌。更优选地，遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种，最优选地，遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌H44/76株或其衍生物。

待修饰的内源lpxL1基因优选是编码脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶的基因。lpxL1基因也已被称为htrB1或msbB基因。在本发明的细菌中待降低或消除其表达的lpxL1基因优选是编码LpxL1(脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶)的基因，其包含与SEQ ID NO：1(脑膜炎奈瑟球菌H44/76的LpxL1)、SEQ ID NO：2(淋病奈瑟球菌的LpxL1，Genbank WP_050158792)、以及SEQ ID NO：3(乳糖奈瑟球菌的LpxL1，Genbank CBN86767)中的至少一个具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，lpxL1基因的表达通过基因的失活来消除，例如通过本领域已知的方法破坏或缺失基因。

待修饰的内源lpxL2基因优选是编码脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶的基因。lpxL2基因也已被称为htrB2基因。优选地，待降低或消除其表达的lpxL2基因优选是编码LpxL2(脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶)的基因，其包含与SEQ ID NO：4(脑膜炎奈瑟球菌H44/76的LpxL2，Genbank WP_055391354)、SEQ ID NO：5(淋病奈瑟球菌的LpxL2，GenbankWP_020996767)、以及SEQ ID NO：6(乳糖奈瑟球菌的LpxL2，Genbank WP_042508043)中的至少一个具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，lpxL2基因的表达通过基因的失活来消除，例如通过本领域已知的方法破坏或缺失基因。

对细菌赋予脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰优选是引入异源pagL基因的表达的遗传修饰，所述异源pagL基因具有编码PagL脂质A 3-O-脱酰酶的核苷酸序列。外膜PagL3-O-脱酰酶水解在脂质A的3位处的酯键，从而释放一级3-OH酰基部分，由此所述酶缺乏脂肪酰链长度特异性(Geurtsen等人，同上)。各种PagL同源物之间的总体序列保守性发现是相当低的，例如，在支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的PagL氨基酸序列之间仅具有32％的序列同一性。外膜PagL3-O-脱酰酶已在许多革兰氏阴性病原体中得到报道，所述病原体包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、罗尔斯通氏贪铜菌(Ralstonia metallidurans)、茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、Burkholderia fungorum、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、支气管败血性博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(Geurtsen等人，2005，J Biol Chem，280:8248–8259)。最近还显示PagL 3-O-脱酰酶在固氮内共生菌菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)中是有活性的(Brown等人，2013，J Biol Chem，288:12004–12013)。因此，用于表达PagL脂质A 3-O-脱酰酶活性的核苷酸序列可以是编码可从这些细菌获得的PagL脂质A3-O-脱酰酶的核苷酸序列。

然而，优选地，在本发明的遗传修饰的细菌中用于表达PagL脂质A3-O-脱酰酶活性的核苷酸序列是编码包含氨基酸序列的PagL脂质A3-O-脱酰酶的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：7(支气管败血性博德特氏菌，Genbank WP_003813842，与副百日咳博德特氏菌的PagL相同)、SEQ ID NO：8(肠炎沙门氏菌肠炎亚种鼠伤寒血清型，GenbankAAL21147)、SEQ ID NO：9(铜绿假单胞菌，Genbank NP_253350)、SEQ ID NO：10(荧光假单胞菌，Genbank AFJ58359)、SEQ ID NO：11(恶臭假单胞菌，Genbank BAN56395)、SEQ ID NO：12(丁香假单胞菌，Genbank KFE57666)、SEQ ID NO：13(伯克霍尔德氏菌属物种，Genbank WP_028199068)、SEQ ID NO：14(茄科罗尔斯通氏菌，Genbank CEJ17533)、SEQ ID NO：15(维涅兰德固氮菌，Genbank ACO76453)和SEQ ID NO：16(菜豆根瘤菌，Genbank WP_039619975)中的至少一个具有至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42.43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，核苷酸序列编码具有PagL脂质A3-O-脱酰酶活性的多肽，如它在自然界中发生，例如如它可以从野生型细菌中分离的。可替代地，核苷酸序列可以编码上文定义的任何PagL脂质A3-O-脱酰酶的工程化(engineered)形式，并且与相应的天然存在的PagL脂质A3-O-脱酰酶相比，其包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，但在如本文定义的同一性或相似性的范围内。

优选地，用于在本发明的遗传修饰的细菌中表达PagL脂质A3-O-脱酰酶活性的核苷酸序列是编码包含氨基酸序列的PagL脂质A3-O-脱酰酶的核苷酸序列，在ClustalW(1.83)中使用缺省设置的序列比对中，所述氨基酸序列至少包含在支气管败血性博德特氏菌PagL氨基酸序列(SEQ IDNO：8)中，分别对应于154和156位的位置中的活性位点残基His-154和Ser-156(Rutten等人，2006，PNAS 103:7071-7076)。进一步优选PagL脂质A3-O-脱酰酶氨基酸序列在其它不变的位置中的每一个(其用“*”指示，即Geurtsen等人，2005，J BiolChem，280:8248–8259的图2的序列比对中的星号)中包含在该不变位置中存在的氨基酸。更优选地，PagL脂质A3-O-脱酰酶氨基酸序列还在强烈保守的位置(其用“:”指示，即Geurtsen等人，2005，同上，图2中的冒号)中包含在分别强烈保守的位置中存在的氨基酸之一。最优选地，氨基酸序列进一步在弱保守的位置(其在Geurtsen等人，2005，同上，图2中用“.”，即点指示)中包含在分别弱保守的位置中存在的氨基酸之一。这些不变和保守的位置之外的氨基酸取代不太可能对PagL脂质A3-O-脱酰酶酶促活性具有负面作用。

本发明的遗传修饰的细菌进一步优选具有选自以下的一种或多种遗传修饰：(i)改变LPS生物合成途径的遗传修饰，优选以便进一步修改LPS的内毒性和/或反应原性；(ii)引起正常分泌抗原的外膜保留的遗传修饰；(iii)通过去除外膜锚蛋白来增加OMV产生的遗传修饰；(iv)去除可以触发不需要类型的免疫应答的免疫调节组分的遗传修饰；以及(v)引入异源抗原表达的遗传修饰。

被修饰为具有降低的内毒性的LPS在本文中应理解为被修饰为具有比相应野生型LPS的毒性更低的毒性的LPS。优选地，经修饰的LPS具有相应野生型LPS的毒性的小于约90、80、60、40、20、10、5、2、1、0.5或0.2％。可以在本领域已知的任何合适的测定中确定野生型和具有降低毒性的各种经修饰的LPS的毒性。用于确定毒性(即LPS的生物活性)的优选测定是MM6巨噬细胞细胞系中的IL-6诱导(参见下文的第1.4段)。

改变LPS生物合成途径的优选遗传修饰是选自以下的遗传修饰：a)降低或消除lptA基因、lpxK基因和这些基因的同源物中的至少一种的表达的遗传修饰；以及b)引入或增加lpxE基因、lpxF基因和这些基因的同源物中的至少一种的表达的遗传修饰。

增加OMV产生的优选遗传修饰是这样的遗传修饰，其降低或消除编码外膜和肽聚糖之间的锚蛋白的基因的表达，以便增加囊泡形成，并且从而增加OMV产率。用于此目的的合适的遗传修饰例如降低或消除OmpA同源物的表达，所述OmpA同源物通常在革兰氏阴性菌中发现，例如，奈瑟球菌属中的RmpM蛋白(Steeghs等人，2002Cell Microbiol，4:599–611；van de Waterbeemd等人，2010Vaccine，28:4810-4816)。因此，优选地，遗传修饰的细菌具有降低或消除rmpM基因或其同源物的表达的遗传修饰。

去除可能触发不需要类型的免疫应答的免疫调节组分的优选遗传修饰是降低或消除如上所述的内源lgtB基因和内源galE基因中的至少一种的表达的遗传修饰。进一步优选的遗传修饰降低或消除选自以下的至少一种基因的表达：cps、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、exbB、exbD、frpB、lpbB、nmb0033、opA、opC、phoP、pilC、pmrE、pmrF、porA、porB、siaA、siaB、siaC、siaD、synA、synB、synC、tbpA、tbpB和这些基因中任一种的同源物。在WO02/09746中综述了这些突变中的许多。

在一个进一步的实施方案中，进一步遗传修饰本发明的遗传修饰的细菌以表达异源抗原。优选地，异源抗原在细菌的细胞外膜表面上表达。异源抗原可以是例如来自另一种细菌，优选来自另一种革兰氏阴性菌的外膜蛋白。可替代地，异源抗原可以与在细菌的细胞外外膜表面上表达的蛋白质融合，例如，本领域本身众所周知的奈瑟球菌外膜蛋白。

优选地，由本发明的遗传修饰的细菌表达的异源抗原包含至少一个表位，用于诱导和/或增强针对包含表位的抗原的免疫应答。优选地，B细胞、体液或抗体应答由异源抗原中的表位引发。优选地，异源抗原中的表位引发保护性和/或中和性抗体应答。可替代地和/或另外，异源抗原包含引发T细胞应答的表位。由免疫原性肽诱导和/或增强的优选T细胞应答包含HLAI类限制性CTL应答和HLA II类限制性Th应答中的至少一种。更优选地，T细胞应答由HLA I类限制性CTL应答和同时HLA II类限制性Th应答组成，并且可以有利地伴随有B细胞应答。

异源抗原可以包含来自广泛多样的病原体(传染原)和/或肿瘤抗原的一个或多个表位。例如，异源抗原可以包含来自病原体和传染原例如病毒、细菌、真菌和原生动物的抗原的一个或多个表位。来自抗原的表位可以由其衍生的引起感染或肿瘤的致病性病毒的一些实例包括：肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、SV40病毒(引起间皮瘤)、流感病毒、黄病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、虫媒病毒性脑炎病毒和人免疫缺陷病毒(HIV病毒；例如I型和II型)、人乳头状瘤病毒(HPV)。来自抗原的表位可以由其衍生的引起感染的致病菌的一些实例包括：疏螺旋体属(Borrelia)、李斯特菌属(Listeria)、埃希氏菌属(Escherichia)、衣原体属(Chlamydia)、柯克斯体属(Coxiella)、立克次氏菌属(Rickettsial)细菌、分枝杆菌属(Mycobacteria)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptocci)、肺炎球菌属(Pneumonococci)、脑膜炎球菌属(Meningococci)、淋球菌属(Gonococci)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、军团菌属(Legionella)、白喉(Diphtheria)、沙门氏菌属(Salmonella)、杆菌属(Bacilli)、博德特氏菌(Bordetella)、引起霍乱、破伤风、食物中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病、百日咳和莱姆病的细菌。来自抗原的表位可以由其衍生的引起感染的致病性真菌的一些实例包括：念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)和热带念珠菌(tropicalis))、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(例如烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger))、毛霉菌目(Mucorales)的真菌(毛霉属(Mucor)、犁头霉属(Absidia)和根霉属(Rhizopus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。来自抗原的表位可以由其衍生的引起感染的致病性寄生物的一些实例包括：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleria Fowleri)、棘阿米巴属物种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparis)。

另外，C-末端融合物可以包含来自广泛多样的肿瘤抗原的一个或多个表位，包括例如MAGE、BAGE、RAGE、GAGE、SSX-2、NY-ESO-1、CT-抗原、CEA、PSA、p53、XAGE和PRAME以及病毒诱导的恶性肿瘤，包括人乳头状瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、EB病毒诱导的淋巴瘤(EBV)。用于本发明中的表位可以由其衍生的肿瘤抗原的其它实例是已知与癌症相关的各种遍在表达的自身抗原，其包括例如p53、MDM-2、HDM2和在p53途径中起作用的其它蛋白质，分子如存活(surviving)、端粒酶、细胞色素P450同种型1B1、Her-2/neu和CD19以及所有所谓的持家蛋白。可根据本发明治疗的癌症选自下述列表中：肺癌、结肠癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌、脑癌、肾上腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、间皮瘤、肾癌、甲状腺癌、血液癌症、类癌、黑色素瘤、甲状旁腺癌、子宫颈癌、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、睾丸癌、垂体癌和嗜铬细胞瘤癌症。在一个实施方案中，异源抗原包含来自传染原或肿瘤的蛋白质抗原的一个或多个表面暴露的表位或者由其组成。异源抗原可以例如包含传染原或肿瘤的蛋白质抗原的细胞外和/或表面暴露结构域或者由其组成。

在第三个方面，本发明涉及如上文定义的奈瑟球菌LPS，其中所述LPS得自或可得自如上文定义的遗传修饰的细菌。

在第四个方面，本发明涉及包含如本文上文定义的奈瑟球菌LPS的OMV。用于疫苗中的OMV(也称为“水泡”)传统上已通过去污剂提取(dOMV纯化方法)制备，其中去污剂如脱氧胆酸盐用于去除LPS并且增加囊泡释放。大多数革兰氏阴性菌例如脑膜炎奈瑟球菌的LPS是高毒性的，但OMV中需要残留量(大约1％)以维持囊泡结构和用于佐剂活性。然而，本发明的奈瑟球菌LPS将降低的毒性与有用的佐剂活性结合，并且因此优选在OMV中保持以比毒性野生型LPS大得多的程度存在。因此，去污剂提取方法不太适合于制备包含本发明的奈瑟球菌LPS的OMV。去污剂提取方法因此较不适合于制备包含根据本发明的奈瑟球菌LPS的OMV。包含根据本发明的奈瑟球菌LPS的OMV优选不是去污剂提取的OMV。然而，应理解，用于制备并非去污剂提取的OMV的OMV的方法不排除任何去污剂的使用。只要与来自等量相同培养物的自发性或上清OMV中存在的奈瑟球菌LPS的量相比，大多数根据本发明的奈瑟球菌LPS，即至少5、10、20、50、60、70、80、90、95或99％的奈瑟球菌LPS得到维持，就不排除低浓度去污剂的使用和/或温和去污剂的使用。

包含本发明的奈瑟球菌LPS的优选OMV是上清液或自发性OMV，即如上文定义的sOMV，或天然OMV，即如上文定义的nOMV。用于制备nOMV的方法例如在Saunders等人(1999，Infect Immun，67，113-119)、van de Waterbeemd等人(2012，Vaccine，30:3683-3690)和WO2013006055中描述，并且用于制备sOMV的方法例如在van de Waterbeemd等人(2013，PLoS ONE，8(1):e54314.doi:10.1371/journal.pone.0054314)和Lee等人(2007，Proteomics，7:3143-3153)中描述，所述参考文献全部以引用的方式并入本文。包含本发明的奈瑟球菌LPS的OMV优选得自或可得自如本文上文定义的遗传修饰的奈瑟球菌细菌。

在第五个方面，本发明涉及包含奈瑟球菌LPS、遗传修饰的细菌和如本文上文定义的OMV中的至少一种的组合物。

在一个优选实施方案中，如本文定义的组合物包含至少约0.01、0.05、0.10、1、5、10、20、30、40、50、100或500μg/ml的奈瑟球菌LPS、遗传修饰的细菌或OMV。

优选地，该组合物是药物组合物，其进一步包含如本领域常规已知的药学可接受的赋形剂、载体、介质或递送媒介物(参见例如“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，Rowe等人编辑，第7版，2012，www.pharmpress.com)。药学可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等等也可以掺入药物组合物内。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。药物载体可以是适于递送给患者的任何相容的无毒物质。“本发明的活性成分”在本文中应理解为如本文上文定义的奈瑟球菌LPS、遗传修饰的细菌或OMV中的一种或多种。

用于胃肠外递送的药学可接受的载体例示为通过任选补充有20％白蛋白的无菌缓冲的0.9％NaCl或5％葡萄糖。可替代地，可以将本发明的活性成分悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用于胃肠外施用的制剂必须是无菌的。用于施用本发明的活性成分的胃肠外途径依照已知方法，例如，通过静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或损伤内途径的注射或输注。用于肌内注射的典型药物组合物制备为含有例如1-10ml磷酸盐缓冲盐水，其包含有效剂量的本发明的活性成分。用于制备可胃肠外施用的组合物的方法是本领域众所周知的，并且在各种来源中更详细地描述，所述来源包括例如“Remington:The Science and Practice ofPharmacy”(编辑Allen，L.V.，第22版，2012，www.pharmpress.com)。

在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗。疫苗可以是无细胞疫苗，优选包含至少一种奈瑟球菌LPS和如本文上文定义的OMV。可替代地，疫苗可以是包含至少如上文定义的细菌的全细胞疫苗，其中所述细菌优选使用本领域本身已知的方法灭活或杀死。

在第六个方面，本发明涉及用于制备本发明的奈瑟球菌LPS的方法。该方法优选包括以下步骤：a)优选在有助于LPS产生的条件下，培养如本文上文定义的遗传修饰的细菌；以及b)任选地，LPS的提取和纯化中的至少一种。用于提取LPS的方法是本领域众所周知的(参见例如19)。用于纯化LPS的方法在本文的实施例中描述，并且可以例如包括在反相筒上的固相提取(SPE)。

在第七个方面，本发明涉及用于制备本发明的OMV的方法。该方法优选包括以下步骤：a)优选在有助于LPS产生的条件下，培养如本文上文定义的遗传修饰的细菌；b)任选地，提取OMV；以及回收OMV，其中所述回收至少包括从OMV中去除细菌。用于制备OMV的方法，优选用于制备OMV的无去污剂的方法，在本文上文中描述。因此，用于制备本发明的OMV的优选方法是无去污剂的方法，例如，用于制备nOMV或sOMV的方法。

在第八个方面，本发明涉及用于制备如本文上文定义的无细胞疫苗的方法。该方法优选包括以下步骤：a)产生以下中的至少一种：i)如本文上文定义的奈瑟球菌LPS，优选在用于制备如本文上文定义的奈瑟球菌LPS的方法中；以及ii)如本文上文定义的OMV，优选在用于制备如本文上文定义的OMV的方法中；以及b)任选地与进一步的疫苗组分一起，将奈瑟球菌LPS和OMV中的至少一种配制成疫苗制剂。

在第九个方面，本发明涉及用于制备如本文上文定义的全细胞疫苗的方法。该方法优选包括以下步骤：i)培养如本文定义的遗传修饰的细菌；以及ii)任选地，细菌灭活和配制成疫苗中的至少一种。

在第十个方面，本发明涉及本发明的奈瑟球菌LPS、本发明的遗传修饰的细菌、本发明的OMV和本发明的药物组合物中的至少一种作为药剂的用途。

在第十一个方面，本发明涉及本发明的奈瑟球菌LPS，其用于包括在对象中诱导或刺激免疫应答的治疗中。优选地，在治疗中，奈瑟球菌LPS用作佐剂。本发明的奈瑟球菌LPS可以例如作为佐剂包括在疫苗组合物中，优选连同期望诱导或刺激针对其的免疫应答的抗原一起。因此，优选地，本发明的奈瑟球菌LPS用于包括在对象中诱导或刺激免疫应答的治疗中，其中所述治疗进一步包括施用连同抗性奈瑟球菌LPS一起的抗原，并且其中所述治疗用于预防或治疗传染病或与抗原相关的肿瘤，其中所述抗原优选为如本文上文定义的抗原。

在这个方面，本发明因此涉及用于针对传染病或肿瘤接种疫苗的方法，或者用于预防或治疗传染病或肿瘤的方法，或者用于诱导或刺激针对传染病或肿瘤的免疫应答的方法。该方法优选至少包括向需要所述预防、治疗或免疫应答的对象施用治疗或预防有效量的本发明的奈瑟球菌LPS或包含所述LPS的药物组合物的步骤。药物组合物优选还包含与传染病或肿瘤相关的抗原，其中所述抗原优选为如本文上文定义的抗原。

在第十二个方面，本发明涉及用作Toll样受体4(TLR4)激动剂的本发明的奈瑟球菌LPS。优选地，奈瑟球菌LPS在免疫疗法中用作TLR4激动剂。优选地，免疫疗法是癌症(参见例如37)或神经变性疾病(参见例如35)的免疫疗法，包括例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。可替代地，奈瑟球菌LPS在泛发性免疫刺激中用作TLR4激动剂，用于预防和/或降低(不同)微生物感染的传播和/或抑制细菌生长(参见例如36)。

在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化以其非限制性含义使用，以意指包括在该词后的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，通过不定冠词“一个”或“一种”对元件的提及不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元件。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常意指“至少一个/种”。

本说明书中引用的所有专利和参考文献都以引用的方式在此全文并入。

下述实施例提供仅用于说明性目的，并且不预期以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1.LPS的电荷解卷积ESI-FT质谱。从12种不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株分离的LPS的电荷解卷积ESI-FT质谱如下显示：亲本HB-1菌株(A)、ΔlpxL1(B)、ΔlpxL2(C)、pagL(D)、ΔlpxL1-pagL(E)、ΔlpxL2-pagL(F)、在30℃下培养5小时(G)或在25℃下培养过夜(H)的ΔlpxL1-lpxP、ΔlptA(I)、ΔlptA-ΔlpxL1(J)、ΔlptA-pagL(K)和ΔlptA-lpxE(L)。分配给3408.507u离子的LPS结构的简化表示包括在质谱(A)中。在3408.514u的质量(其对应于该后一个LPS种类的计算分子量)处的垂直线用作参考，以指示分配给其它离子信号的LPS组成。关于详细的LPS组成建议参见补充表1。所有注释都指中性分子的单同位素质量。

图2.如所示的通过脑膜炎奈瑟球菌菌株的TLR4激活。用5倍连续稀释的热灭活的脑膜炎奈瑟球菌刺激HEK-blue hTLR4细胞20小时。通过检测分泌的碱性磷酸酶来测量TLR4激活。连续稀释的结果在线图(A)中描绘，并且对于0.0004的OD_600nm单个，在条形图(B)中描绘。数据表示为三次独立实验的平均值或平均值±SD。用ANOVA检验针对HB-1比较确定统计学显著性。*，p<0.05；****，p<0.0001。数据也呈现于表4中。

图3.通过纯化的LPS结构的TLR4激活。用10倍连续稀释的12种不同LPS结构刺激HEK-blue hTLR4细胞。通过检测分泌的碱性磷酸酶来测量TLR4激活。数据是来自三个独立实验的代表性结果，并且被描绘为一式三份的平均值。

图4.用纯化的LPS结构刺激的MM6细胞的细胞因子释放。将MM6细胞与10倍连续稀释的不同LPS结构一起温育20小时。通过ELISA测量IL-6(A)、IP-10(B)、IL-1β(C)、MCP-1(D)的产生。IL-6和IL-1β视为MyD88依赖性细胞因子，并且IP-10和MCP-1是更TRIF依赖性的。用5ng/ml LPS刺激的MM6细胞的细胞因子水平也呈现为HB-1株的百分比(E)以及以浓度(F)和百分比(G)的细胞因子比率。对于细胞因子比率(F+G)，扣除没有LPS刺激的背景。显示的数据描述为两个独立实验的平均值。使用双因素ANOVA检验针对HB-1比较来确定统计学显著性。*，p<0.05。数据也呈现于表5和6中。

实施例

1.材料与方法

1.1细菌菌株和质粒

使用质粒pMF121在脑膜炎奈瑟球菌H44/76株(HB-1)菌株中制备所有突变体，导致包括galE基因的荚膜生物合成基因座的缺失。脑膜炎奈瑟球菌菌株在补充有IsoVitaleX的GC培养基基础(Difco)平板上，在含有5％CO2的潮湿大气中在37℃下生长。对于液体培养，菌株在37℃下在锥形烧瓶中在36mg/mL胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Difco)中生长，以140RPM振荡。将所需的抗生素加入平板和液体培养物中(卡那霉素100μg/ml、氯霉素3μg/ml)。通过用由van der Ley等人(15)描述的携带具有卡那霉素抗性盒的基因的线性化PCRII质粒(Invitrogen)、或含有具有用氯霉素(CAM)盒替换的缺失区段的lpxL1基因的pGem T easy质粒(Promega)的转化获得lpxL1和lpxL2突变体。对于lptA突变体，通过PCR从H44/76菌株中扩增基因，克隆到pGem T easy质粒(Promega)内，并且将卡那霉素盒置于基因中的MunI限制性位点处。质粒通过用在基因外切割的限制性酶消化而线性化，并且转化到脑膜炎奈瑟球菌H44/76(HB-1)株内。携带基因pagL、lpxP和lpxE的脑膜炎奈瑟球菌衍生物使用先前对于支气管败血性博德特氏菌pagL基因表达描述的pEN11质粒进行制备(13,18)。为了获得lpxP和lpxE衍生物，将pEN11质粒中的pagL基因分别用来自大肠杆菌和支气管败血性博德特氏菌的PCR扩增的lpxP或lpxE基因替换。通过向液体培养基中加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和CAM(3μg/ml)诱导pen11质粒上的基因的表达。引物在表1中列出。

表1.用于构建突变株的PCR引物

引物	序列(5’-3’)	来源	SEQ ID NO
				LptA Fw	GCCTTCCTTTCCCTGTATTC	脑膜炎奈瑟球菌
LptA Re	GGTGTTCGGACACATATGC	脑膜炎奈瑟球菌
				LpxL 1Fw	CTGATCGGGCAGATACAG	脑膜炎奈瑟球菌
LpxL1 Re	GTGCGCTACCGCAATAAG	脑膜炎奈瑟球菌
				LpxL2 Fw	AAACAGATACTGCGTCGGAA	脑膜炎奈瑟球菌
LpxL2 Re	CCCTTTGCGAACCGCCAT	脑膜炎奈瑟球菌
				PagL Fw	ATGCAATTTCTCAAG	支气管败血性博德特氏菌
PagL Re	TCAGAACTGGTACGT	支气管败血性博德特氏菌
				LpxP Fw	CATATGGCCGCTTACGCAGACAATACAC	大肠杆菌
LpxP Re	GACGTCACGCCTGAATGACTTCATTACACC	大肠杆菌
				LpxE Fw	CATATGATCCGGCCCTCATCCCATTCCC	支气管败血性博德特氏菌
LpxE Re	TCATGACCCGAAAGGCGCTTCCCTTCAG	支气管败血性博德特氏菌

1.2 LPS分离

来自细菌突变体的LPS用热酚-水(19)提取，并且通过在反相筒上的固相提取(SPE)进一步纯化。简言之，通过在20℃下以2,739×g离心1小时，收集来自OD_600nm为1.4的50ml细菌培养物(或在30℃下生长的100mlΔlpxL1-lpxP突变体)的细胞。然后，将细菌悬浮于20ml水中，并且在20℃下以2,739×g离心25分钟。对于热酚-水提取，将细菌团块用4ml水悬浮，加热至70℃，在相同温度下与3.2ml苯酚混合，并在70℃下在搅动下保持10分钟。通过在20℃下以2,739×g离心15分钟，将水相与酚相分开。在将水相转移到新小瓶后，通过在70℃下加入3ml水并且重复提取程序再次提取酚相。合并来自两次连续提取的水相(～6.5ml)，并且通过加入5ml 0.356M乙酸三乙基铵(TEAA)pH 7(溶剂A)和3.8ml 2-丙醇:水:三乙胺:乙酸(70:30:0.03:0.01，v/v)pH 8.7(溶剂B)准备用于SPE。总共，各自来自不同细菌突变体的10个LPS提取物可以通过SPE在反相Sep-PakC18筒(1ml注射器-桶型Vac筒，50mgC18树脂，Waters)上使用20位真空歧管(Waters)同时纯化。通过在真空下连续施加1ml 2-丙醇:水:三乙胺:乙酸(85:15:0.015:0.005，v/v)pH 8.7(溶剂C)、0.07mM TEAA pH 7(溶剂D)和溶剂A来条件化筒用于SPE。然后，将样品分成等体积的两个等分试样，并且将每个等分试样施加到不同的筒内。接下来，将筒用1ml溶剂A洗涤一次，且用溶剂D中的1ml 20％(v/v)溶剂B洗涤两次。通过施加0.6ml溶剂C从柱中洗脱LPS。将来自相同样品的洗脱液合并(每个样品总共1.2ml)，并且在室温下在离心真空浓缩器(Concentrator plus，Eppendorf)中干燥。通过3-脱氧-D-甘露-辛-β-酮糖酸(Kdo)测定(20)来确定分离样品中的LPS浓度。另外，纯化样品的纯度和完整性通过Tricine-SDS-PAGE来判断，使用1mm厚、16％预制

迷你凝胶(Thermo Fisher Scientific Inc.)、LPS银染色(21)和用Imperial^TM蛋白质染剂(Thermo Scientific)的蛋白质显现。

1.3质谱法

电喷雾电离傅里叶变换质谱法(ESI-FT-MS)在负离子模式下在LTQOrbitrap XL仪器(Thermo Scientific)上进行。将LPS样品溶解于水、2-丙醇和三乙胺(按体积计50:50:0.001)pH 8.5的混合物中，并且通过静态纳米ESI注入质谱仪内(22,23)。遵循由制造商(Thermo Scientific)提供的标准程序，使用Pierce Negative Ion CalibrationSolution(Thermo Scientific)并且用牛磺胆酸内部校准MS仪器。通过源内碰撞诱导断裂(SID)进行完整LPS的断裂分析。分别对应于LPS的脂质A和寡糖部分的Y-和B-型碎片离子通过SID在100V的电势差下生成。根据Domon和Costello的命名法注释碎片离子(24)。使用Thermo Xcalibur 3.0软件(Thermo Scientific)的Xtract工具对质谱进行电荷解卷积。给出的所有质量值都指单同位素分子量。提出的LPS组合物基于先前报道的来自脑膜炎奈瑟球菌的L3免疫型LPS的一般化学结构(25,26)。

1.4细胞刺激

将Mono Mac 6细胞以每孔1x10⁵个细胞种植在96孔微量滴定板中的100μl Iscove改良达尔贝科培养基(IMDM)(Invitrogen)培养基中，所述培养基补充有100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、292μg/ml l-谷氨酰胺(Invitrogen)和10％胎牛血清(Invitrogen)。Hek blue-hTLR4细胞(Invivogen)，稳定表达人TLR4、MD-2和CD14的HEK293细胞系，以每孔3.5x10⁴个细胞种植在96孔微量滴定板中的100μl DMEM(Invitrogen)培养基中，所述培养基补充100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、292μg/ml1-谷氨酰胺(Invitrogen)和10％胎牛血清(Invitrogen)。在含有5％CO₂的潮湿大气中，用在IMDM(MM6细胞)或DMEM(HEK blue-hTLR4细胞)中10倍系列稀释的LPS刺激细胞18-20小时。还用连续稀释的全细菌细胞刺激HEK-blue-hTLR4细胞。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定MM6细胞的上清液中的细胞因子浓度。使用DUOset ELISA开发试剂盒(R&Dsystems)，遵循制造商的说明书，测定所有细胞因子(IL-6、IL-1β、IP-10、MCP-1)浓度。为了定量由HEK-blue-hTLR4细胞分泌的碱性磷酸酶，将来自每个孔的20μl上清液加入200μl Quanti-blue(Invivogen)中，并且在37℃下温育2-3小时。读数在分光光度计上的649nm处完成。通过使用GraphPad Prism 6.04统计软件(GraphPad Software，Inc.)，通过单因素(碱性磷酸酶分泌)或双因素(细胞因子释放)ANOVA检验，确定统计学显著性差异。

2.结果

2.1经修饰的LPS结构的生物工程化

在脑膜炎奈瑟球菌中的LPS突变体在菌株H44/76的HB-1衍生物中构建。HB-1菌株是荚膜缺陷的并且具有galE缺失，其导致LPS寡糖的截短。质谱分析证实HB-1菌株表达六酰化、三磷酸、双-磷酸乙醇胺脂质A结构(参见下文)。为了在菌株HB-1中构建LPS突变体的不同集合，我们灭活了编码LPS酶LptA、LpxL1和LpxL2的自体基因，并且通过克隆pen11质粒上lac启动子后面的基因，异源表达LpxE、LpxP和PagL LPS酶(参见表2)。

表2.灭活编码LPS酶LptA、LpxL1和LpxL2的自体基因，并且异源表达LpxE、LpxP和PagL LPS酶的概述。

酶	缩写	活性	来源生物
				LpxL1	L1	将C<sub>12</sub>加入在2'-位处的一级连接的酰基链中	脑膜炎奈瑟球菌
LpxL2	L2	将C<sub>12</sub>加入在2-位处的一级连接的酰基链中	脑膜炎奈瑟球菌
				LpxE	E	去除1个磷酸基	支气管败血性博德特氏菌
LpxP	Lp	将棕榈油酸酯加入在2'-位处的一级连接的酰基链中。	大肠杆菌
				PagL	P	从3位去除酰基链	支气管败血性博德特氏菌
LptA	La	在1和/或4'-位处加入磷酸乙醇胺基团	脑膜炎奈瑟球菌

另外，构建了自体基因的缺失和异源酶的表达的组合。该方法导致如表3中列出的11种LPS突变株。

对于LpxE(蛋白质ID：CAE41138.1)的表达，我们最初克隆了来自百日咳博德特氏菌的lpxE同源物。然而，该基因在HB-1或其lptA突变型衍生物中的表达不导致如通过质谱法测定的任何LPS结构变化。作为替代方案，克隆且在ΔlptA突变株中表达来自支气管败血性博德特氏菌的lpxE(Genbank登录号：WP_003809405.1)同源物，其在百日咳博德特氏菌中作为假基因存在。这导致脂质A中的磷酸基丧失，并且包括在我们的LPS突变株实验对象组中(图1L)。

LpxP(Genbank登录号：U49787.1)，已知在大肠杆菌中向2'酰基链添加二级9-十六碳烯酸(C16:1)的酶(27)，在脑膜炎奈瑟球菌ΔlpxL1突变株中表达，因为LpxL1酶也在同一位置上添加了二级酰基链。完成该修饰，以通过在2'位中携带更长的C16二级酰基链而不是C12，制备与原始不同的六酰化的脂质A结构。当LpxP在ΔlpxL1突变株中在37℃下表达时，这导致非常微弱的C16:1添加。然而，仅在12℃下将C16:1添加到大肠杆菌LPS上，因此我们在较低温度下培养该细菌。与大肠杆菌不同，低于25℃的脑膜炎球菌培养是不可能的，但在25℃和30℃下，我们已经发现携带另外C16:1的LpxP六酰化的脂质A结构高得多的相对丰度。其中25℃导致最高效率(至少50％的相对丰度)(图1H)。

表3.脑膜炎奈瑟球菌HB-1株中构建的LPS突变体的概述

2.2经修饰的LPS的质谱表征

从构建的脑膜炎奈瑟球菌突变体分离的完整LPS的电荷解卷积ESI-FT质谱显示于图1中。HB-1(galE^-)亲本株(图1A)的LPS质谱展示与LPS一致的3408.507u的离子信号，所述LPS由携带三个磷酸基(P)和两个磷酸乙醇胺(PEA)基团、以及用甘氨酸(Gly)残基取代的L3-免疫型寡糖结构的野生型六酰基脂质A组成，并且由于galE基因的失活，在其α链的近端半乳糖(Gal)处截短(Mcalc.＝3408.514u，关于LPS组成提议，参见补充表1)。3351.488、3285.501和3228.480u的伴随离子峰(图1A)分别对应于缺乏Gly(Δmeas.＝-57.019u)、在脂质A中携带少一个PEA基团(Δmeas.＝-123.006u)或两者(Δmeas.＝-180.027u)的LPS种类。来自HB-1(galE-)株的LPS的这种化学异质性可能通过脂质A磷酸化中的变化和由甘氨酸的寡糖非化学计量取代引起。基于完整LPS的质谱的组成提议另外通过对应于脂质A和寡糖部分的LPS碎片离子的FT-MS分析来支持，其通过完整LPS的源内碰撞诱导解离(SID)生成。例如，来自HB-1(galE^-)株的LPS的SID FT质谱展示1916.098和2039.106u的碎片离子，其对应于具有2个和3个PEA基团的六酰基脂质A种类(分别为Mcalc.＝1916.100和2039.109u)，以及1369.404u的碎片离子，其对应于上述寡糖部分的脱水衍生物(Mcalc.＝1369.406u)。此处描述的衍生自脑膜炎奈瑟球菌的其它菌株的LPS断裂分析显示，不同类型的LPS携带相同的寡糖部分(PEA₁·Hex₁·Hep₂·HexNAc₁·Kdo₂·Gly₁)，除了缺乏甘氨酸或携带第二个己糖残基(Hex)的一些LPS种类之外(补充表2)。因而，在LPS种类之间观察到的其它差异，例如PEA和P基团的数目，可以归于脂质A的组成中的变化(补充表2)。

来自ΔlpxL1突变体的完整LPS的分析揭示，与来自亲本HB-1(galE-)株的LPS的4个主要离子信号(图1A)相比，质谱的主要离子峰(3046.315、3103.336、3169.324和3226.342u，图1B)已移位-182.165u。这与lpxl1基因缺失后，脂质A中缺乏十二烷酸(C12)(Δcalc.＝-182.167u)一致。

来自ΔlpxL2突变体的LPS质谱的比较分析展示3023.367、2966.348、3185.419和3128.398u的离子峰(图1C)，这与C12脂肪酰链连同PPEA一起从脂质A中丧失((Δcalc.＝-385.142u)与寡糖由Gly(Δcalc.＝57.021u)或第二己糖(Δcalc.＝162.053u)的非化学计量取代组合一致。这与lpxL2基因的有效缺失一致。值得注意的是，lpxL2基因的缺失不仅导致C12脂肪酰基链的丧失，如较早在lpxL1基因缺失时观察到的，而且还导致P和PEA基团从脂质A中的丧失。

发现来自pagL突变体的LPS的质谱中的离子峰(3210.345、3153.325、3087.338和3030.318u，图1D)从来自亲体HB株的LPS的4个主要离子峰移位-198.163u。这与通过PagL酶从脂质A中有效去除3-羟基-十二烷酸(C12OH)(Δcalc.＝-198.162u)一致。尽管如此，对应于未经修饰的六酰基LPS种类的次要离子峰3408.505和3351.485u(图1D)的展示指示PagL酶的LPS 3-O-脱酰活性无法完全耗尽六酰基脂质A底物。

来自ΔlpxL1-pagL突变体的LPS质谱中的4个主要离子信号(3028.180、2971.160、2905.173和2848.152u，图1E)与来自HB-1株的LPS的4个主要离子信号相差-380.328u，这与ΔlpxL1-pagL突变体的脂质A中的C12和C12OH缺乏(Δcalc.＝-380.329u)一致。对应于携带两个C12酰基链的LPS的离子信号的不存在指示lpxL1基因的缺失导致从脂质A完全去除单个C12(关于详细的LPS组成提议，参见补充表1)。相比之下，来自ΔlpxL1-pagL突变体的LPS的质谱中存在3226.339和3169.319u的次要离子信号，其对应于携带两个C 12OH酰基链的五酰基LPS种类。这指示低水平的LPS分子不被PagL酶3-O-脱酰。

来自ΔlpxL2-pagL突变体的LPS的质谱显示2825.206u的离子峰(图1F)，其从来自亲本HB-1株的LPS质谱的3408.507u的离子信号移位-583.301u(图1A)。这符合C12OH、C12和PPEA从脂质A中的预期丧失(Δcalc.＝-583.304u)。2768.187、2930.236和2987.257u的其它离子信号(图1F)与寡糖由Gly或第二Hex的非化学计量取代一致。

来自在30℃下生长的ΔlpxL1-lpxP突变体(图1G)的LPS质谱与来自ΔlpxL1突变体的LPS质谱(图1B)的比较揭示来自ΔlpxL1-lpxP突变体的LPS不仅含有来自ΔlpxL1突变体的LPS中存在的主要LPS种类(3046.315、3103.333、3169.322和3226.340u，图1G)，对应于缺乏C12的五酰基LPS，而且还含有在光谱中向更高的质量值移位236.211u的LPS种类(3282.524、3339.543、3405.533和3462.553u，图1G)。这与9-十六碳烯酸(C16:1)掺入脂质A中一致。因此，该制剂包含缺乏C12的五酰基LPS和缺乏C12的六酰基LPS的混合物，并且另外携带C16:1。

来自在25℃下培养的ΔlpxL1-lpxP突变体的LPS的质谱(图1H)显示对应于缺乏C12并且另外携带C16:1的六酰基LPS的离子信号(3282.526、3339.546、3405.535和3462.554u，图1H)，其与来自在30℃下生长的ΔlpxL1-lpxP突变体的LPS光谱中的相同信号相比具有更高的相对丰度。此外，展示了对应于携带C16:1的六酰基LPS的其它离子峰，其起于寡糖用第二Hex的延伸(3624.608u)或后者与Gly取代的丧失(3567.586u)和PEA基团从脂质A(3501.596u)中的丧失组合(图1H)。

来自ΔlptA突变体(图1I)的LPS质谱中3162.489u的离子峰与来自亲本HB-1株的LPS质谱的3408.507u的离子信号相差-246.018u(图1A)。这表明两个PEA基团从脂质A中的丧失(Δcalc.＝-246.017u)。其它离子信号对应于这样的LPS种类，除缺乏脂质A中的PEA之外，其缺乏寡糖中的Gly(3105.471)，含有寡糖中的第二Hex(3324.541)，或含有第二Hex并且缺乏寡糖中的Gly(3267.521u)(图1I)。

来自ΔlptA-ΔlpxL1突变体的LPS的质谱展示2980.324、2923.307、3142.375和3085.354u的离子峰，指示与寡糖由Gly或第二Hex的非化学计量取代组合的2PEA和C12从脂质A中的丧失(Δcalc.＝-428.184u)(图1J)。另外，通过源内碰撞诱导的LPS解离产生的主要脂质A碎片离子的MS/MS谱与在脂质A的1和4'位两者处存在P基团一致(数据未显示)。因此，LpxE酶的活性由去除脂质A中存在的三个P基团之一组成，产生双磷酸化的脂质A种类，其中在二葡糖胺主链的每一侧具有P基团。

来自ΔlptA-pagL突变体的LPS质谱的主要离子信号(2964.328和2907.311u，图1K)与2PEA和C12OH从脂质A中的丧失(Δcalc.＝-444.179u)连同寡糖由Gly的非化学计量取代(Δcalc.＝-444.179u)一起一致。观察到3105.468和3162.488u的次要离子峰，其对应于从脂质A中仅丧失2PEA的六酰基LPS种类，指示通过PagL酶的低水平的不完全LPS 3-O-脱酰。

最后，来自ΔlptA-lpxE突变体的LPS的质谱显示3082.525和3025.508u的2个主要离子峰，与2PEA和P从脂质A中的丧失((Δcalc.＝-325.983u)与寡糖由Gly的非化学计量取代(图1L)相结合一致。

2.3通过LPS突变株的TLR4刺激

为了确定通过脂质A突变体结构的整个集合的TLR4激活范围，使用HEK-Blue人TLR4细胞完成初始筛选。这些细胞表达人TLR4、MD-2和CD14，并且含有激活B细胞核因子κ-轻链增强子(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)依赖性分泌胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报道基因。用连续稀释的不同LPS突变体刺激细胞产生广泛范围的TLR4活性(图2和表4)，其中HB-1诱导最强的TLR4激活，并且ΔLpxL2细菌产生最低水平的激活。其它LPS突变体显示中等TLR4刺激活性(图2)。特别值得注意的结果是ΔlptA株中磷酸乙醇胺的不存在导致六酰化野生型菌株以及五酰化ΔlpxL1和pagL背景两者中降低的TLR4激活。ΔlptA菌株中LpxE的诱导显示与ΔlptA株相似的TLR4激活，其略微低于HB-1野生型菌株。这指示在脂质A结构中三个磷酸盐降低至两个，其中在二葡糖胺主链的每一侧具有一个磷酸盐，不影响TLR4信号传导。

LpxP在25℃下的表达与LpxL1的缺失组合导致异源的六-和五-酰化结构-LPS表达菌株，与野生型细菌相比具有略微降低的TLR4激活潜力。在30℃下培养该菌株导致更少的六酰化的脂质A以及甚至略微更少的TLR4活性。

令人惊讶的是，当ΔlpxL1菌株与PagL的表达组合，将五酰化的脂质A结构还原为四酰化的脂质A结构时，获得了TLR4活性的增加。这是出乎意料的，因为四酰化的脂质A结构通常充当TLR4拮抗剂，如对于大肠杆菌脂质Iva报道的(7,9,28)。

2.4使用纯化的突变型LPS的人TLR4刺激

我们还从所有菌株中纯化了LPS，并且用它们刺激HEK-Blue TLR4细胞，以确认我们用全细菌的初步发现。纯化的LPS一般产生与用完整细菌获得的相似的结果，尽管纯化的LPS、ΔlpxL1、ΔlptA-ΔlpxL1、ΔlpxL2和ΔlpxL2-pagL几乎没有显示TLR4活性的诱导，并且几乎不能彼此区分(图3)，而细菌这些变体展示超过背景的低但不同的TLR4活性。另外，对于TLR4的激活需要比用所有六酰化LPS衍生物更高浓度的纯化五酰化pagLLPS，但是对于全细菌刺激，对于pagL株需要比其他六酰化突变株更低的吸收密度来诱导TLR4活性(图2+3)。然而，与六酰化突变株相比，关于pagL突变株的碱性磷酸酶分泌的最大量仍更低。值得注意的是，当与野生型LPS相比时，三种LPS突变体ΔlpxL1-pagL、pagL和ΔlptA-pagL具有基本上降低的激活能力，但仍诱导高于未刺激细胞的背景水平的激活(图3)。

2.5通过纯化的突变型LPS的细胞因子诱导

在人单核细胞系Mono Mac 6(MM6)中调查了经修饰的LPS结构的细胞因子诱导谱。在用纯化的LPS刺激20小时后(图4E、F和G以及表6)，测定分泌的MyD88依赖性细胞因子IL-6(图4A和表5A)和IL-1β(图4B和表5B)、以及TRIF依赖性细胞因子干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)(图4C和表5C)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(图4D和表5D)的浓度。LPS样品中的轻微蛋白质污染对观察到的应答的可能贡献被排除，因为通过LPS样品的HEK-hTLR2细胞系激活在测试的LPS浓度范围内是可忽略不计的(数据未显示)。

从不同的LPS结构确定了广泛多样的细胞因子水平，其中最高水平由HB-1野生型六酰化LPS和范围从接近野生型到几乎为零的细胞因子诱导的所有其它LPS产生，如对于ΔlpxL2LPS可见的。除细胞因子诱导的定量差异外，我们还观察到关于LPS结构的定性差异引起某些细胞因子的水平降低，但仍能够产生其它细胞因子。一些实例是pagL和ΔlptA-pagLLPS，其展示诱导产生MyD88依赖性促炎细胞因子IL-6和IL-1β产生的能力降低，仅分别诱导通过野生型LPS诱导的水平的10％和25％，保留了诱导TRIF依赖性IP-10(50％)和MCP-1(90％)分泌的大部分能力。有趣的是，在30℃和25℃下生长的ΔlpxL1-lpxP之间观察到差异，其中在30℃下生长的ΔlpxL1-lpxP产生30-40％的IL-6和IL-1β，以及在25℃下产生60-85％的这些细胞因子，而IP-10和MCP-1诱导是相似的。这些结果强调了LPS生物工程如何能够提供广泛范围的激动剂来微调细胞因子释放。

3.讨论

尽管LPS作为佐剂具有很大的潜力，但不利效应仍是关注。找到佐剂活性和最小毒性效应之间的最佳平衡需要开发新的LPS衍生物。在此处，我们报告了新型脑膜炎球菌LPS结构的集合，诱导广泛范围的TLR4应答和差异细胞因子模式。这些组合的生物工程LPS突变体可以用作全细胞疫苗、OMV疫苗的部分或者用作纯化的LPS或脂质A分子。脑膜炎奈瑟球菌的OMV作为潜在的疫苗正在被积极调查，并且已经被批准用于人中，作为针对血清群B脑膜炎球菌疾病的Bexsero疫苗的组分(29,30)。减毒ΔlpxL1LPS作为脑膜炎球菌OMV疫苗的组成成分处于调查中，并且是解毒OMV的安全方法(16,31)。另外，在免疫研究中，纯化的ΔlpxL1LPS保留与野生型脑膜炎球菌LPS相比相似的佐剂活性，但具有降低的毒性(15)。

与亲本株相比，经修饰的LPS分子LpxL1、LpxL2和PagL全部导致降低的TLR4活性(13,15)。这是预期的，因为它们将LPS中的酰基链数目从六降低到五。令人惊讶的是，我们的结果挑战了四酰化LPS总是比五酰化LPS更少活性的预期。大肠杆菌的四酰化的脂质IVa是人TLR4/MD-2复合物的已知拮抗剂(7,9,28)。然而，我们显示脑膜炎球菌四酰化的ΔlpxL1-pagL LPS比五酰化的ΔlpxL1LPS更多活性，而四酰化的ΔlpxL1-ΔlpxL2LPS不产生可检测的活性(数据未显示)。与其五酰化的ΔlpxL2亲本株相比，使用也携带四酰化LPS的ΔlpxL2-pagL全细菌的刺激再次增加了TLR4/MD-2活性，尽管来自ΔlpxL2-pagL和ΔlpxL2的纯化LPS是无活性的。这些发现一起指示与单独去除二级酰基链或两个二级酰基链相比，通过PagL从3'位去除C12OH与缺失二级酰基链导致四酰化的脂质A组合产生更高的TLR4活性。通过Needham等人(32)在大肠杆菌中改造的LPS结构，包括通过PagL的表达和LpxM的缺失产生的四酰化LPS，通过PagL从3'位去除C12OH和从脂质A的还原末端上的葡糖胺中缺失二级酰基链。在大肠杆菌中产生的这种四酰化LPS因此具有与本发明的ΔlpxL1-pagL突变型脂质A的四酰化结构不同的酰基链分布和链长，即使它也比来自其亲本株的五酰化LPS更多活性。

有趣的是，将来自大肠杆菌的LpxP引入脑膜炎奈瑟球菌对脑膜炎奈瑟球菌赋予温度敏感性脂质A修饰。因为不太可能保存温度敏感性基因表达信号，所以这意指酶本身在较低温度下是最活性的。选择25或30℃的温度用于培养ΔlpxL1-lpxP菌株影响了由该突变体产生的五-和六-酰化LPS混合物中存在的六酰化LPS种类的量，其中较低的温度导致最高的取代程度。LpxP酶的温度敏感性因此使得能够以受控方式制备五-和六-酰化LPS混合物。通过选择突变株生长的时间和/或温度，增加或减少六酰化的脂质A结构的量，并且从而增加或减少TLR4活性和细胞因子谱是可行的。这提供了微调脑膜炎球菌OMV疫苗的免疫性质的新方法。

另外，我们已获得了LpxE酶的特异性的新了解。以前，在大肠杆菌中表达的来自土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)或新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)的lpxE基因显示对于去除在1'位中的P基团是特异性(32,33)。我们已发现来自支气管败血性博德特氏菌的lpxE同源物从脑膜炎奈瑟球菌的脂质A中存在的总共三个中仅去除一个P基团。来自ΔlptA-lpxE突变体的脂质A的MS/MS谱与在脂质A的1和4'位两者处的P基团的存在一致。另外，仅在双重ΔlptA-lpxE突变体中可见P基团的去除，因此仅在不存在脂质A的PEA取代的情况下。因此，PEA的存在可能阻止lpxE去除P基团。最有可能的是，新近描述的LpxE酶是焦磷酸酶，仅催化两个磷酸基之间的水解。通过缺失lptA基因在脂质A中不存在PEA导致TLR4/MD-2活性降低。这与通过John等人(34)较早的观察一致，其显示在用LptA缺乏菌株刺激后，通过THP-1细胞的TNFα释放的显著降低。在此处，我们显示当用五酰化的ΔlptA-pagL LPS或全细菌刺激时，活性的降低甚至更显而易见。

有趣的是，我们的结果指示通过缺失LpxL2不存在2'C12脂肪酰基链伴随着单个P基团和PEA基团的去除。这是先前未观察到的，由于在质谱分析之前通过酸水解方法的脂质A分离，这可以导致P基团从脂质A中的丧失(15)。在本研究中，我们使用完整的LPS分子而不引入任何有害的化学修饰用于质谱分析，使我们有可能观察到脂质A的新的磷酸化变化。

构建的减毒LPS结构中的几种不仅需要更高的浓度来诱导TLR4刺激，而且并未产生对于亲本株观察到的激活水平。这对于pagL LPS是最显而易见的。关于这种现象的原因尚不明确，但可能是由于在细胞表面处的LPS-TLR4-MD2受体复合物的不稳定二聚化，但细胞内部稳定的二聚化，和/或用高浓度的特定LPS的较不稳定二聚化。另外，某些LPS种类完全没有显示激活并且可能潜在具有拮抗特征，并且因此可以充当TLR4阻断药物。实际上，当连同六酰化的野生型脑膜炎球菌LPS一起施用时，脑膜炎球菌ΔlpxL1和pagL五酰化LPS可以阻断TLR4应答(13)。

在本研究中，我们已使用脑膜炎球菌中的组合生物工程，来制备具有广泛阵列的TLR4活性和细胞因子谱的一系列LPS种类。这些结构的应用可以是非常广泛的，从作为佐剂包括在疫苗中到它们在各种形式的免疫疗法中的应用，所述免疫疗法已对于LPS进行描述或建议，例如癌症疗法、阿尔茨海默氏病病或泛发性免疫刺激以预防不同感染(3,35-37)。

表4.通过脑膜炎奈瑟球菌菌株的TLR4激活(相同的数据图示呈现于图2A中)。HEK-blue hTLR4细胞用在热灭活的脑膜炎奈瑟球菌的A600nm(y轴)处的5倍系列稀释物刺激20小时。通过在A649nm处检测分泌的碱性磷酸酶来测量TLR4激活。数据表示为三次独立实验的平均值。

A600nm	HB-1	ΔL1	ΔL2	P	ΔL1-P	ΔL2-P	ΔL1-Lp37	ΔL1-Lp30	ΔL1-Lp25	ΔLa	ΔLa-ΔL1	ΔLa-P	ΔLa-E
														0,01	1,102	0,318	0,124	0,715	0,596	0,277	0,534	1,070	1,011	0,874	0,157	0,501	0,911
0,002	1,083	0,247	0,092	0,692	0,569	0,199	0,450	0,967	0,964	0,855	0,098	0,469	0,872
														0,0004	1,093	0,187	0,096	0,703	0,536	0,172	0,340	0,925	0,974	0,856	0,090	0,431	0,915
0,00008	1,031	0,124	0,100	0,723	0,387	0,115	0,217	0,607	0,687	0,836	0,087	0,354	0,840
														1,6E-05	0,959	0,089	0,094	0,669	0,164	0,111	0,146	0,301	0,344	0,553	0,088	0,156	0,466
3,2E-06	0,551	0,101	0,092	0,377	0,100	0,094	0,137	0,189	0,162	0,219	0,083	0,107	0,174
														6,4E-07	0,239	0,089	0,100	0,164	0,104	0,108	0,135	0,167	0,116	0,098	0,079	0,081	0,106
1,3E-07	0,141	0,095	0,116	0,125	0,101	0,110	0,138	0,169	0,102	0,087	0,094	0,089	0,090
														2,6E-08	0,131	0,101	0,097	0,115	0,099	0,104	0,141	0,171	0,103	0,089	0,087	0,091	0,092
5,1E-09	0,134	0,095	0,108	0,108	0,098	0,114	0,158	0,188	0,101	0,088	0,085	0,095	0,094
														1E-09	0,151	0,107	0,119	0,120	0,104	0,120	0,165	0,205	0,133	0,098	0,090	0,111	0,112

表5.用纯化的LPS刺激的MM6细胞的细胞因子释放(相同的数据图示呈现于图4中)。将MM6细胞与10倍连续稀释的不同LPS突变体一起温育20小时。通过ELISA测量IL-6、IP-10、IL-1β、MCP-1产生。所示数据描述为两次独立实验的以pg/mL的平均值。

A:IL-6(pg/mL)

B:IP-10(pg/mL)

C:IL-1β(pg/mL)

D:MCP-1(pg/mL)

表6.用纯化的LPS刺激的MM6细胞百分比中的细胞因子释放(相同的数据图示呈现于图4中)。用5ng/ml LPS刺激MM6细胞。数据表示为两个独立实验的平均值。

补充表1。在来自脑膜炎奈瑟球菌的12个突变体的完整LOS的电荷解卷积的ESI-FT质谱中观察到的主要离子峰的组成(参见图1)。

(*)单钠加合物。(**)二钠加合物。缩写：Kdo，3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸；Hep，L-甘油-D-甘露-庚糖；Hex，己糖；HexNAc，N-乙酰己糖胺；Gly，甘氨酸；PEA，磷酸乙醇胺；P，磷酸盐；C12OH，3-羟基-十二烷酸；C14OH，3-羟基-十四烷酸；C12，十二烷酸；C16:1，9-十六碳烯酸

补充表2.关于通过LOS的源内碰撞诱导解离ESI-FT MS获得的电荷解卷积碎片离子峰的提议组成。

由于Kdo和脂质A之间的糖苷键破裂，源内碰撞诱导的LOS解离产生对应于寡糖和脂质A结构域的B-和Y-型碎片离子。碎片离子根据Domon和Costello(24)的命名。给出的质量数指中性分子的单同位素质量。缩写：Kdo，3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸；Hep，L-甘油-D-甘露-庚糖；Hex，己糖；HexNAc，N-乙酰己糖胺；Gly，甘氨酸；PEA，磷酸乙醇胺；P，磷酸盐；C12OH，3-羟基-十二烷酸；C14OH，3-羟基-十四烷酸；C12，十二烷酸；C16:1，9-十六烯

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序列表

<110> 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国

<120> 经修饰的四酰化奈瑟球菌LPS

<130> P6059084PCT

<150> NL2016169

<151> 2016-01-28

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

<400> 1

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<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis

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<212> PRT

<213> Neisseria gonorrhoeae

<400> 5

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Leu Ser Cys Leu His Thr Leu Gly Asn Arg Leu Gly His Leu Ala Phe

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<212> PRT

<213> Neisseria lactamica

<400> 6

Met His Ile Leu Leu Thr Ala Leu Leu Lys Cys Leu Ser Leu Leu Pro

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Leu Pro Ser Leu His Lys Leu Gly Val Phe Leu Gly His Leu Ala Phe

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<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 7

Met Gln Phe Leu Lys Lys Asn Lys Pro Leu Phe Gly Ile Val Thr Leu

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<213> Salmonella typhimurium

<400> 8

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<213> Pseudomonas aeruginosa

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<213> Pseudomonas fluorescens

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<213> Pseudomonas putida

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Met Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Phe Thr Leu Gly

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<212> PRT

<213> Pseudomonas syringae

<400> 12

Met Lys Arg Leu Phe Cys Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly

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<210> 13

<211> 187

<212> PRT

<213> Burkholderia sp.

<400> 13

Met Lys Asn Lys Lys Asn Ala Leu Arg Gly Leu Thr Val Lys Gly Val

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Ser Ala Ala Ile Leu Leu Ala Ala Ser Gly Leu Ala Ala Ala Asp Gln

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<210> 14

<211> 187

<212> PRT

<213> Ralstonia solanacearum

<400> 14

Met Ile Arg Ser Ala Leu Pro Arg Ser Ala Lys Pro Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ala Gln Ala Asp Pro

20 25 30

Ser Val Arg Ala Ile Tyr Gly Arg Asp Asn Arg His Gly Ile Glu Lys

35 40 45

Tyr Gly Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Gly Phe His Trp Gly Asn Pro

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Gln Gly Trp Phe Leu Asn Leu Asp Trp Glu Ile Ala Leu Gly Gln Trp

65 70 75 80

Arg Ser Thr Lys Gly Thr Asn Arg Gln Asn Leu Thr Glu Phe Gly Val

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Ile Glu Ala Gly Ile Gly Pro Arg Leu Leu Ser His Thr Arg Thr Ser

115 120 125

Asp Glu His Asn Phe Ser Thr Ala Phe Gln Phe Ser Asp Met Ile Gly

130 135 140

Val Gly Val Ala Phe Gly Ser Arg Gln Gln Phe Gln Val Gly Tyr Arg

145 150 155 160

Phe Glu His Leu Ser Asn Ala Ser Ile Lys Arg Pro Asn Pro Gly Thr

165 170 175

Asp Leu Asn Glu Leu Tyr Leu Arg Tyr Thr Phe

180 185

<210> 15

<211> 177

<212> PRT

<213> Azotobacter vinelandii

<400> 15

Met Arg Lys Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Val Ala Val Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gly Val Ala Gln Ala Val Glu Val Gly Ala Ala Val Gly Val

20 25 30

Thr Ser Gln Asn Asp Met Thr Tyr Arg Leu Ser Leu Gly Leu Pro Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Trp Trp Lys Ser Asp Leu Gly Tyr Val Thr Gly Tyr Trp

50 55 60

Asp Ala Gly Tyr Thr Tyr Trp Glu Gly Gly Ser Gly Asn Asp Asn Tyr

65 70 75 80

Ala Gly Ala His Ser Leu Ser Phe Ser Pro Val Phe Thr Tyr Glu Phe

85 90 95

Ser Gly Phe Ser Ser Val Thr Pro Phe Leu Glu Leu Gly Val Gly Val

100 105 110

Ala Phe Phe Ser Lys Thr Arg Val Gly Glu Gln Gln Leu Gly Ser Ser

115 120 125

Phe Asn Phe Glu Asp Arg Ile Gly Ala Gly Ile Lys Phe Ala Gly Gly

130 135 140

Gln Lys Val Gly Ile Arg Ala Ile His Tyr Ser Asn Ala Gly Ile Lys

145 150 155 160

Gln Pro Asn Asp Gly Ile Glu Ser Phe Ser Ala Tyr Tyr Ser His Ala

165 170 175

Phe

<210> 16

<211> 191

<212> PRT

<213> Rhizobium etli

<400> 16

Met Ser Ala Asp Phe Gly Ser Ile Val Leu Arg Phe Leu Thr Thr Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ala Ala Val Ala Gly Thr Val Ala Gly Ser Ala Ser Ala Gly

20 25 30

Glu Gln Ile Phe Asp Glu Leu Arg Phe Gly Val Ser Thr Ser Leu Gln

35 40 45

Ser Gly His Ser Arg Glu Asp Gly Val Phe Pro Glu Ile Thr Ala Leu

50 55 60

Phe Asp Pro Phe Gly Tyr Glu Gln Ala Val Gly Trp Gln Gln Gln Leu

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Val His Leu Gly Thr Ser Ile Gly Thr Ala Gly Glu

85 90 95

Ala Thr Gln Phe Phe Thr Gly Phe Thr Trp Thr Val Asp Leu Asn Glu

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Glu Ala Gly Phe Gly Gly Val Ile His Thr Gly Asp

115 120 125

Leu Asp Asn Asn Asp Asp Gly Pro Asp Leu Gly Cys Arg Val Leu Phe

130 135 140

His Glu Tyr Ala Gly Ala Gly Tyr Arg Phe Thr Pro His Trp Asn Val

145 150 155 160

Met Ala Gln Ile Ala His Ser Ser His Ala Asn Leu Cys Asp Gly Pro

165 170 175

Asn Asp Gly Met Thr Arg Ala Gly Ile Gln Ile Gly Tyr Lys Phe

180 185 190

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LptA Fw primer

<400> 17

gccttccttt ccctgtattc 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LptA Re primer

<400> 18

ggtgttcgga cacatatgc 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxL1 Fw primer

<400> 19

ctgatcgggc agatacag 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxL1 Re primer

<400> 20

gtgcgctacc gcaataag 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxL2 Fw primer

<400> 21

aaacagatac tgcgtcggaa 20

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxL2 Re primer

<400> 22

ccctttgcga accgccat 18

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PagL Fw primer

<400> 23

atgcaatttc tcaag 15

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PagL Re primer

<400> 24

tcagaactgg tacgt 15

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxP Fw primer

<400> 25

catatggccg cttacgcaga caatacac 28

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxP Re primer

<400> 26

gacgtcacgc ctgaatgact tcattacacc 30

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxE Fw primer

<400> 27

catatgatcc ggccctcatc ccattccc 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LpxE Re primer

<400> 28

tcatgacccg aaaggcgctt cccttcag 28

Claims (33)

1.一种具有四酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，所述四酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺乏二级酰基链之一，并且缺乏在所述脂质A部分的还原末端上的葡糖胺的3-位上的一级酰基链，其中除了所述四酰化的脂质A部分外，LPS具有脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌的LPS结构，并且其中所述四酰化的脂质A部分具有式(I)或(II)的结构：

其中R₁和R₂独立地是-P(O)(OH)₂、-[P(O)(OH)-O]₂-H、-[P(O)(OH)-O]₂-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-CH₂CH₂NH₂、-[P(O)(OH)-O]₃-H或-P(O)(OH)-O-CH₂CH₂NH₂。

2.根据权利要求1的奈瑟球菌LPS，其中所述脂质A部分缺乏与附着至所述脂质A部分非还原末端上的葡糖胺的一级酰基链结合的二级酰基链，或其中所述脂质A部分具有式(I)的结构。

3.根据权利要求1或2的奈瑟球菌LPS，其中所述脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌是lgtB^-和galE^-中的至少一种。

4.根据权利要求1-3中任一项的奈瑟球菌LPS，其中所述脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种。

5.一种奈瑟球菌属的遗传修饰的细菌，包含权利要求1-4中任一项的LPS，其中所述细菌包含：

a)降低或消除由内源lpxL1基因或内源lpxL2基因编码的脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰，其中内源lpxL1基因是编码LpxL1蛋白的基因，所述LpxL1蛋白具有与SEQ ID NO：1-3中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或其中内源lpxL2基因是编码LpxL2蛋白的基因，所述LpxL2蛋白具有与SEQ ID NO：4-6中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和

b)对所述细菌赋予脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰，其中对细菌赋予脂质A 3-O-脱酰酶活性的遗传修饰是引入异源pagL基因的表达的遗传修饰，所述异源pagL基因具有编码与SEQ ID NO：7-16中的至少一个具有至少50％的氨基酸序列同一性的PagL脂质A 3-O-脱酰酶的核苷酸序列。

6.根据权利要求5的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌。

7.根据权利要求5或6的遗传修饰的细菌，其中所述内源lpxL1基因是编码LpxL1蛋白的基因，所述LpxL1蛋白具有与SEQ ID NO：1-3中的至少一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或者其中所述内源lpxL2基因是编码LpxL2蛋白的基因，所述LpxL2蛋白具有与SEQID NO：4-6中的至少一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求5-7中任一项的遗传修饰的细菌，其中对所述细菌赋予脂质A 3-O-脱酰酶活性的所述遗传修饰是引入异源pagL基因的表达的遗传修饰，所述异源pagL基因具有编码与SEQ ID NO：7-16中的至少一个具有至少90％的氨基酸序列同一性的PagL脂质A 3-O-脱酰酶的核苷酸序列。

9.根据权利要求5-8中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌进一步进行遗传修饰，以表达异源抗原。

10.根据权利要求9的遗传修饰的细菌，其中所述异源抗原在所述细菌的细胞外外膜表面上表达。

11.根据权利要求5-10中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌具有降低或消除内源lgtB基因和内源galE基因中的至少一种的表达的遗传修饰。

12.根据权利要求5-11中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是脑膜炎奈瑟球菌血清群B，免疫型L3。

13.根据权利要求5-12中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76。

14.根据权利要求1-4中任一项的奈瑟球菌LPS，其中所述LPS可从根据权利要求5-13中任一项的遗传修饰的细菌获得。

15.一种OMV，其包含根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS。

16.根据权利要求15的OMV，其中所述OMV可从如权利要求5-13中任一项定义的细菌获得。

17.一种组合物，其包含根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS、根据权利要求5-13中任一项的遗传修饰的细菌，和根据权利要求15和16中任一项的OMV中的至少一种。

18.根据权利要求17的组合物，其中所述组合物是药物组合物，其进一步包含药学可接受的赋形剂。

19.根据权利要求17或18的组合物，其中所述组合物是无细胞疫苗，其包含如权利要求1-4和14中任一项定义的奈瑟球菌LPS、或者如权利要求15或16定义的OMV。

20.根据权利要求17或18的组合物，其中所述组合物是包含如权利要求5-13中任一项定义的细菌的全细胞疫苗。

21.根据权利要求17-20中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种非奈瑟球菌抗原。

22.一种用于制备根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)培养如权利要求5-13中任一项定义的细菌；和，

b)任选地，所述LPS的提取和纯化中的至少一种。

23.一种用于制备根据权利要求15或16的OMV的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)培养如权利要求5-13中任一项定义的细菌；

b)任选地，提取所述OMV；和，

c)回收所述OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV中去除所述细菌。

24.根据权利要求22的方法，其中所述方法是无去污剂的方法。

25.一种用于制备如权利要求19中定义的无细胞疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)产生以下中的至少一种：

i)根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，在如权利要求22中定义的方法中；和，

ii)根据权利要求15或16的OMV，在如权利要求22或23中定义的方法中；和，

b)任选地与进一步的疫苗组分一起，将所述奈瑟球菌LPS和OMV中的至少一种配制成疫苗制剂。

26.一种用于制备如权利要求20中定义的全细胞疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)培养如权利要求5-13中任一项定义的细菌；和，

ii)任选地，所述细菌灭活和配制成疫苗中的至少一种。

27.根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS、根据权利要求5-13中任一项的细菌、根据权利要求15或16的OMV，或根据权利要求17-21中任一项的组合物，其用作药剂。

28.根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，其用于包括在对象中诱导或刺激免疫应答的治疗中。

29.根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，其用作药剂，其中所述奈瑟球菌LPS用作佐剂。

30.根据权利要求1至4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，其用作药剂或用于包括在对象中诱导或刺激免疫应答的治疗中，其中所述治疗进一步包括将抗原连同所述奈瑟球菌LPS一起施用，并且其中所述治疗用于预防或治疗与所述抗原相关的传染病或肿瘤。

31.如权利要求1-4和14中任一项定义的奈瑟球菌LPS，其用作免疫疗法中的Toll样受体4激动剂。

32.根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，其用作免疫疗法中的Toll样受体4激动剂，其中所述免疫疗法是癌症或神经变性疾病的免疫疗法。

33.根据权利要求1-4和14中任一项的奈瑟球菌LPS，其用作免疫疗法中的Toll样受体4激动剂，其中所述免疫疗法包括泛发性免疫刺激，用于预防和/或降低不同微生物感染的传播和/或抑制细菌生长。

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