CN110168086B - 疟疾疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明例如涉及多肽和包含该多肽的疟疾疫苗，所述多肽由选自下述中的氨基酸序列组成：(a)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(b)通过1~10个、优选1~5个、更优选1、2或3个氨基酸的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列；和(c)与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少95%、优选97%、更优选99%的序列一致性的氨基酸序列。

Description

疟疾疫苗

技术领域

本申请要求日本专利申请第2016-220512号和第2017-161442号的优先权，其以参考的方式整体并入本文中。

本发明涉及例如在预防疟原虫感染或预防疟疾发病中使用的疫苗抗原。

背景技术

疟疾是疟原虫属的寄生原虫如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的感染，在热带和亚热带区域广泛蔓延。疟疾感染在疟原虫通过利用按蚊作为载体而进入人体、并经过孢子体(sporozoite)阶段、肝脏阶段、和血红细胞阶段而增殖从而发病。在各阶段中，疟原虫在人体体内产生蛋白质。诱导对该蛋白质的抗体的疫苗因此被期待攻击疟原虫，或者抑制疟原虫的感染或在感染后的体内的增殖。尽管全世界已研究或正在开发疟疾疫苗，但临床上尚未使用疟疾疫苗。也被称为Ripr的Rh5相互作用蛋白(PlasmoDB gene code:PF3D7_0323400, http://plasmodb.org/)是被认为在恶性疟原虫的裂殖子(merozoite)阶段表达的蛋白质之一。Ripr被认为是疟疾疫苗的抗原(非专利文献1、2、和专利文献1~4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2015/0366958号

专利文献2：WO 2012/061882

专利文献3：WO 2015/144874

专利文献4：WO 2014/174054

非专利文献

非专利文献1：Nature(London)(1999),400(6744),532-538

非专利文献2：Nature(London,UnitedKingdom)(2002),419(6906),527-531。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的之一在于，提供作为疟疾疫苗抗原有用的多肽。

用于解决课题的手段

本发明人的深入研究已发现，以来自疟原虫的蛋白质Ripr的片段作为抗原而得到的抗体抑制了疟原虫的增殖，由此完成了本发明。即，本发明涉及：

[1] 多肽，其由选自下述中的氨基酸序列组成：

(a)SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列；

(b)通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的氨基酸序列；和

(c)与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少95%、优选97%、更优选99%的序列一致性的氨基酸序列。

[2] 多肽，其包含根据项1所述的多肽和连接于其的携带体（carrier）。

[3] 根据项2所述的多肽，其中，所述携带体是病毒颗粒、脂质颗粒、或携带体蛋白质。

[4] 根据项1~3中任一项所述的多肽，其中，所述多肽被用作疟疾疫苗抗原。

[5] 疟疾疫苗，其包含根据项1~4中任一项所述的多肽。

[6] 根据项5所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25或Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原、或与所述至少一种疟疾疫苗抗原组合给药。

[7] 根据项5或6所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含针对选自脊髓灰质炎、白喉、百日咳和破伤风中的至少一种感染症的疫苗抗原、或与该疫苗抗原组合给药。

[8] 根据项5~7中任一项所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗用于疟原虫的感染预防、疟原虫感染后疟疾的发病预防、或疟疾的治疗。

[9] 多核苷酸，其由编码根据项1所述的多肽的核苷酸序列组成。

[10] 多核苷酸，其包含根据项9所述的多核苷酸、和连接于其的使根据项9所述多核苷酸能够在宿主细胞中表达的启动子和/或调控元件。

[11] 表达载体，其包含根据项9或10所述的多核苷酸。

[12] 疟疾疫苗，其包含根据项9或10所述的多核苷酸、或根据项11所述的表达载体。

[13] 用根据项11所述的载体转化的重组宿主细胞。

[14] 根据项13所述的重组宿主细胞，其中，所述细胞为细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

[15] 抗体，其特异性地识别根据项1所述的多肽。

[16] 药物组合物，其含有根据项1~4中任一项所述的多肽、根据项9或10所述的多核苷酸、根据项11所述的表达载体、或根据项15所述的抗体作为有效成分。

发明的效果

本发明提供例如作为疟疾疫苗抗原有用的多肽、和包含所述多肽的疟疾疫苗。

附图说明

图1示出通过用在小麦胚芽无细胞蛋白质表达系统中制作的Ripr或Ripr的片段对兔进行免疫而得到的多克隆IgG抗体的疟原虫增殖抑制率。

图2示出通过用在小麦胚芽无细胞蛋白质表达系统中制作的Ripr 1-5(WGCFS-Ripr 1-5)和在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中制作的Ripr 1-5(Bac-Ripr 1-5)免疫而得到的兔多克隆IgG抗体的疟原虫增殖抑制率。

具体实施方式

1.定义

本说明书中使用的氨基酸、(多)肽、(多)核苷酸等缩写具有如IUPAC-IUBCommunication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)]、或JPO的“Guidelines for the preparation of the description comprising amino acidsequence or nucleotide sequence”中定义的含义，或者如本领域中常规使用的含义。

如本文中使用的，术语“Rh5相互作用蛋白”(或“Ripr”)是指被认为在恶性疟原虫的裂殖子(merozoite)阶段中表达的蛋白质，并且包括包含对应于PlasmoDB gene code：PF3D7_0323400 (http://plasmodb.org/)或NCBI Reference Sequence：XP_001351305(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质、以及包含与SEQ ID NO: 2实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。

“与SEQ ID NO: 2实质上相同的氨基酸序列”包括：

(a)通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的氨基酸序列；和

(b)与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少95%、优选至少97%、或更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列。

如本文中使用的，术语“Ripr基因”是指任何编码Ripr的多核苷酸，其可以是DNA或RNA。Ripr基因的具体实例包括具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的多核苷酸，该SEQ ID NO:1对应于PlasmoDB gene code：PF3D7_0323400 (http://plasmodb.org/)、或NCBIReference Sequence：XM_001351269(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

如本文中使用的，术语“序列一致性”是指2个蛋白质间的氨基酸序列一致性。“序列一致性”通过比较最佳对齐(aligned)的2个氨基酸序列而确定。同与其最佳对齐的另一氨基酸序列相比，可以在氨基酸序列中找到氨基酸添加或氨基酸缺失(或缺口)。可以通过例如使用Vector NTI而根据Clustal W算法(Nucleic Acid Res., 22(22):4673-4680(1994))进行氨基酸序列的对齐，从而对所述序列一致性进行定量。对于确定“序列一致性”而言有用的软件包括序列分析软件，例如Vector NTI、GENETYX-MAC、或其他可由公共的数据库、例如http://www.ddbj.nig.ac.jp获得的序列分析工具。

2.多肽

本发明涉及作为疟疾疫苗抗原有用的肽片段，其中，所述肽片段由Ripr的氨基酸序列中的一部分组成。更具体而言，本发明的肽片段在后文中也称为“本发明的多肽”，可以是由对应于SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列、或对应于SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸序列的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的多肽，或者由与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8实质上相同的氨基酸序列组成的多肽。

与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8实质上相同的氨基酸序列包括：

(a)通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的氨基酸序列；和

(b)与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少95%、优选至少97%、或更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列。

与原始氨基酸酸序列相比，本发明的多肽中的氨基酸残基修改数和修改的氨基酸残基的位置适当选择，以使得多肽具有等同于原始多肽的免疫学活性。为了制备这样的多肽，可以通过已知的计算机程序、例如DNA Star software来确定要置换、缺失、添加或插入的氨基酸的具体类型或位置。典型而言，可以修改原始多肽中的氨基酸残基的5%以下、优选3%以下、或更优选1%以下。当通过氨基酸置换而改变多肽时，置换氨基酸可以适当选择，以使得改变的多肽具有等同于原始多肽的免疫学活性。为了维持原始蛋白质的特征，置换氨基酸优选选自具有与原始氨基酸类似的极性、电性、可溶性、疏水性、两亲性、或其他特性。例如，可以在属于非极性氨基酸的一组氨基酸例如Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp之间进行氨基酸置换，可以在属于非荷电氨基酸的一组氨基酸例如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln之间进行氨基酸置换，可以在属于酸性氨基酸的一组氨基酸例如Asp和Glu之间进行氨基酸置换，或者可以在属于碱性氨基酸的一组氨基酸例如Lys、Arg和His之间进行氨基酸置换。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的多肽选自：

(a)由SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的氨基酸序列组成的多肽，其中，所述多肽具有与由SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的对应多肽同等的免疫学活性；或

(c)由与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列具有至少95%、优选至少97%、或更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列组成的多肽，其中，所述多肽具有与由SEQ IDNO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的对应多肽同等的免疫学活性。

更优选地，本发明的多肽选自：

(a)由SEQ ID NO: 4的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的氨基酸序列组成的多肽，其中，所述多肽具有与由SEQ ID NO: 4的氨基酸序列组成的对应多肽同等的免疫学活性；或

(c)由与SEQ ID NO: 4的氨基酸序列具有至少95%、优选至少97%、或更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列组成的多肽，其中，所述多肽具有与由SEQ ID NO: 4的氨基酸序列组成的对应多肽同等的免疫学活性。

如本文中使用的，在如“与由SEQ ID NO: X(其中X为整数)的氨基酸序列组成的多肽同等的免疫学活性”的上下文中的术语“免疫学的活性”是指对疟原虫的诱导免疫应答的活性。具有“与由SEQ ID NO: X的氨基酸序列组成的多肽同等的免疫学活性”的多肽是指具有由SEQ ID NO: X的氨基酸序列组成的多肽的至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的免疫学活性的多肽。多肽的免疫学活性可以通过本领域已知的方法或者根据如本申请实施例中记载的方法，例如通过确认由用所述多肽免疫的动物得到的抗体对疟原虫增殖的抑制活性，从而确认。多肽的免疫学活性还可以通过对疟疾感染动物模型给药所述多肽而确认。

本发明的多肽可以以缀合物形式提供，其中，所述多肽经由连接子而连接于常规已知的携带体；或者作为嵌合肽而提供，其包含杂合于常规已知的携带体肽的多肽。这样的缀合物和杂合体也包括在本发明的范围内。

本发明的多肽可以缀合或杂合的携带体的实例包括病毒样颗粒、脂质颗粒如脂质体、钥孔戚血蓝素、或者蛋白质如牛血清白蛋白、CRM197或细胞外绿脓杆菌毒素A（extracellular Pseudomonas aeruginosa toxin A）。

用于将本发明的多肽与携带体共价连接的连接子可以是同源二官能性连接子或异源二官能性连接子。同源二官能性连接子的实例包括辛二酸N,N'-二琥珀酰亚胺或1,4-双马来酰亚胺基丁烷。异源二官能性连接子的实例包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸3-磺基-N-琥珀酰亚胺钠或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

本发明的多肽和携带体的杂合体可以基于对应氨基酸序列或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，如对本发明的多肽所记载那样制备。

3.多核苷酸

在一个方面中，本发明提供由编码本发明的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸(以下称为“本发明的多核苷酸”)。更具体而言，本发明的多核苷酸可以是编码由对应于SEQID NO: 2的第720~934位氨基酸序列的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列、或对应于SEQ ID NO:2的第648~830位氨基酸序列的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者编码由与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8实质上相同的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA。

在此，由编码由与SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8实质上相同的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸包括：

(a)由编码下述氨基酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸：通过1~10个氨基酸残基、优选1~5个氨基酸残基、更优选1、2或3个氨基酸残基的置换、缺失、添加或插入而不同于SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的氨基酸序列；和

(b)由编码下述氨基酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸：与SEQ ID NO: 4或SEQID NO: 8的氨基酸序列具有至少95%、优选至少97%、或更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸的实例包括由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列组成的多核苷酸，或由SEQ ID NO: 7的核苷酸序列组成的多核苷酸。本发明的多核苷酸的进一步的实例包括由SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 10中任一核苷酸序列组成的多核苷酸。本文中公开的SEQ ID NO: 3的核苷酸序列和其他核苷酸序列的具体实例是DNA核苷酸序列，但也被理解为在DNA核苷酸序列中具有尿嘧啶(U)来替代胸腺嘧啶(T)的对应RNA核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以连接于启动子和/或调控元件，其使得能够在宿主细胞中表达由所述多核苷酸编码的本发明的多肽。这样的包含本发明的多核苷酸作为蛋白质编码区域、和连接于其的启动子和/或调控元件的多核苷酸也包括在本发明的范围中。

本发明的多核苷酸是双链时，可以将其引入表达载体中从而形成表达本发明的多肽的重组表达载体。这样的表达载体也包括在本发明的范围中。

为了制备本发明的表达载体，可以根据要引入该载体的宿主类型或其他具体因素，使用任意适当类型的载体。载体可以是质粒、噬菌体载体、或病毒载体。对于转染至大肠杆菌，质粒载体如pUC118、pUC119、pBR322、或pCR3、或者噬菌体载体如λZAPII、或λgt11可以是有用的。对于转染至酵母，pYES2、或pYEUra3可以是有用的。对于转染至昆虫细胞，通过使用pFastBac1而形成的杆粒、或pAcSGHisNT-A可以是有用的。对于转染至动物细胞，质粒载体如pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRC/RSV、或pRc/CMV、或者病毒载体如逆转录病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体可以是有用的。对于转染至植物细胞，烟草花叶病毒载体、或农杆菌（Agrobacterial）载体可以是有用的。

本发明的载体还任选包含用于基因表达的启动子、编码信号序列的基因、用于筛选细胞的标记物基因、或终止子。此外，本发明的载体可以包含编码用于蛋白的标签如Gp67、硫氧还蛋白、His标签、或者GST(谷胱甘肽S-转移酶)的序列，以用表达具有与其融的标签的蛋白质，以促进蛋白质的分离或提纯。表达这样的融合蛋白的载体可以是表达GST融合蛋白的载体(例如pGEX4T)、包含编码标签如Myc或His的序列的载体(例如pcDNA3.1/Myc-His)、或者表达与硫氧还蛋白或His标签融合的载体(例如pET32a)。这样的载体可以包含用于在宿主细胞内表达蛋白质的启动子(例如，lac、tac、trc、trp、CMV、或SV40早期启动子等)。

如上所述制备的表达载体然后可以引入至宿主内从而制备转染细胞或植物。用于转染的宿主可以是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或植物。大肠杆菌宿主的实例包括大肠杆菌株，如DH10Bac、E.coliK-12细胞系的HB101、C600、JM109、DH5α、或AD494(DE3)。酵母宿主的实例包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。动物细胞宿主的实例包括L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、Hela细胞、或293-EBNA细胞。昆虫细胞宿主的实例包括sf9。植物宿主的实例包括本氏烟（Nicotianabenthamiana）。

本发明的表达载体可以通过取决于宿主的类型而适当选择的常规技术引入宿主中，例如选自磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔、利用脂质(Cellfectin II、Lipofectamine、Lipofectin；Gibco-BRL)的转染、利用农杆菌的转染、显微注射、粒子枪。通过将其在含有适合的选择标记物的培养基中培养，可以从转染步骤后获得的细胞或植物中分离出期望的转化体。

可以培养或生长如上所述地制备的转化体从而制造本发明的多肽。所制造的多肽可以通过常规的生物化学领域的提纯技术而提纯，例如盐析、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱、或凝胶过滤色谱。当本发明的多肽被表达为与硫氧还蛋白、His标签、GST或其他标签融合的多肽时，所述标签融合多肽可以通过利用所述特定标签或标签融合多肽的特征而分离或提纯。

本发明的多核苷酸可以在并入例如用于基因治疗的载体中后对动物给药。这样的包含本发明的多核苷酸的用于基因治疗的载体也包括在本发明的范围中。

用于基因治疗的载体可以是病毒载体，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、或辛德毕斯病毒。优选为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、或痘苗病毒。还可以使用非病毒载体，如质粒。

表达本发明的多核苷酸的细胞在体内生产本发明的多肽。因此，本发明的多核苷酸或本发明的表达载体作为疟疾疫苗是有用的。

4.多肽的制造

本发明的多肽可以通过利用其中本发明的多肽可由转染有编码该多肽的多核苷酸的宿主细胞来制造的基因重组法、或通过无细胞合成、化学合成方法、或本领域中已知的任何其他适合方法而如以下所详述地制造。

本发明的多肽可以基于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7或SEQ IDNO: 10的基因序列信息，通过下述方法而制造，所述方法包括克隆DNA、构建表达载体、将载体引入宿主中、培养转化体、和从培养物中分离由转化体制造的多肽的步骤。对于所述方法，上述列出的任何表达载体和宿主均是有用的。所述方法可以通过使用对本领域技术人员而言已知或记载于文献中的流程(Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSHLaboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))而实施。表达本发明的多肽的转化细胞或植物也包括在本发明的范围中。

在一个实施方案中，本发明的多肽可以通过在昆虫培养细胞内的蛋白表达，例如根据Rohrmann GF. Baculovirus Molecular Biology [Internet]. 3rd edition.Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2013中记载的方法，或者根据本申请实施例中记载的方法，从而制造。在一个实例中，这样的方法可以包括将编码本发明的多肽的基因引入载体中、将载体引入用于将基因重组至杆粒中的大肠杆菌中、分离具有所述杆粒的细菌菌落、提纯杆粒并将其引入昆虫细胞中的步骤。由初次致敏生成的病毒液可以在下一次致敏中使用。可以重复生成病毒液和用所述病毒液致敏的步骤，直至得到处于最佳浓度的病毒液用于致敏以表达期望的多肽。多肽产物可以通过经由与多肽融合的组氨酸标签而吸附于镍树脂从而提纯。

本发明的多肽可以在无细胞系统中，通过常规已知的无细胞合成法，例如在WO05/030954中记载的小麦胚芽提取物中制造。WO 05/030954中记载的方法中，转录或转译反应在体外，在包含核糖体的小麦胚芽提取物中，通过向所述提取物添加转录或转译模板、底物基因、氨基酸、能量源、离子、缓冲液、和其他试剂而进行。当在这样的系统中将RNA用作模板时，该系统可以在下文被称为“无细胞转译系统”。当在这样的系统中将DNA用作模板时，系统额外地包含转录反应所要求的酶、如RNA聚合酶，并且所述系统可以在下文被称为“无细胞转录/转译系统”。为了制造本发明的多肽，可以将由包含本发明的多核苷酸的DNA转录的RNA用作转译模板，或者可以将包含本发明的多核苷酸的DNA用作转录模板，以形成体外合成系统中的转译模板。除了本发明的多核苷酸序列之外，转译模板可以包含RNA聚合酶识别序列(SP6、T3或T7启动子)、或者促进体外转译的序列(例如Ω序列或E01序列)。小麦胚芽提取物是商业可获得的，例如WEPROⓇ (CellFree Sciences)，或者可以根据例如在Johnston, F. B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957)中记载的方法而制备。小麦胚芽提取物可以通过提取从小麦中分离的胚芽，按照例如在Erickson, A. H. et al.,(1996) Meth. In Enzymol., 96, 38-50中记载的方法，从而制备。为了制备小麦胚芽提取物，WO 03/064671中记载的方法也可以是有用的。在本发明的一个实施方案中，将由SEQ IDNO: 6或SEQ ID NO: 9的多核苷酸序列组成的DNA、或由其转录的RNA用作模板，如下述实施例所述。

本发明的多肽可以通过肽化学中通常使用的方法而化学合成，例如PeptideSynthesis, Interscience New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic PressInc., New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., LTD., 1975; Basics andExperiment of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985; 或者Development ofPharmaceutical Product subsequent vol. 14, Peptide Synthesis, HirokawaShoten, 1991中记载的方法。本发明的多肽可以通过例如固相合成的Fmoc法或Boc法、或利用Boc-氨基酸或Z-氨基酸在液相中逐次缩合的液相合成(其中，Fmoc是指9-芴基甲氧基羰基，Boc是指叔丁氧基羰基，Z是指苯甲基氧基羰基)，从而制造。所合成的多肽可以通过肽化学中通常使用的方法而提纯，例如通过色谱(例如硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤、或反相色谱)、或从溶剂中重结晶，所述溶剂例如：醇如甲醇、乙醇或2-丙醇；醚如二乙基醚；酯如乙酸乙酯；芳族烃如苯或甲苯；酮如丙酮；烃如己烷；非质子溶剂如二甲基甲酰胺或乙腈；水；或它们的混合物。对于进一步有用的提纯方法，可以参照例如Jikken Kagaku Kouza(The Chemical Society of Japan ed., Maruzen) vol. 1。

5.抗体

在一个方面中，本发明提供对本发明的多肽而言特异性的抗体(以下称为“本发明的抗体”)。本文中使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、和这些抗体的一部分，如Fab片段或在Fab表达文库中表达的其他抗体片段。

本发明的抗体可以根据本领域已知的方法(Current protocols in MolecularBiology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section11.12-11.13; Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Edward A.Greenfield, Cold Spring Harber Laboratory Press, New York 2013)而制造。

具体而言，本发明的多克隆抗体可以从采集自诸如家兔的非人动物的血清得到，该诸如家兔的非人动物用可通过基因重组、无细胞合成或化学合成制备的本发明的多肽进行了免疫。本发明的单克隆抗体可以在通过脾脏细胞和骨髄瘤细胞的细胞融合而形成杂交瘤细胞中制备，所述脾脏细胞和骨髄瘤细胞回收自用本发明的多肽免疫的诸如小鼠的非人动物(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987)Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11; Antibodies: A LaboratoryManual, Second Edition, Edward A. Greenfield, Cold Spring Harber LaboratoryPress, New York 2013)。

在用多肽免疫的宿主中制造针对本发明的多肽的抗体可以通过根据宿主类型而适当选择的佐剂的共同给药来促进。这样的佐剂的实例包括弗氏佐剂；矿物凝胶如氢氧化铝；表面活性剂如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝素和二硝基苯酚；或人细胞来源佐剂如BCG(卡介苗)、短小棒状杆菌（Corynebacterium parvum）佐剂。

因此，可以从通过常规方法用多肽免疫的动物中容易地获得对本发明的多肽特异性且对于中和Ripr的作用而言有效的抗体。本发明的抗体例如在预防因疟原虫感染而导致的严重疾病中、以及作为亲和色谱或免疫学诊断中使用的试剂是有用的，所述免疫学的诊断基于例如免疫印迹法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、或者荧光或发光免疫测定法。

6.药物组合物

本发明的多肽、多核苷酸、表达载体、或对本发明的多肽特异性的抗体对于预防疟原虫感染、预防疟原虫感染后的疟疾发病、或治疗疟疾是有用的。在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽、多核苷酸、表达载体、或抗体被配制为药物组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物被用作疟疾疫苗。

本发明的药物组合物可以任选地包含药学上可接受的携带体或适当的佐剂，其能够改进该组合物的免疫效力。在本发明的一个替代的实施方案中，包含本发明的多肽、多核苷酸、表达载体、或抗体和药学上可接受的携带体的药物组合物可以与包含佐剂的组合物作为混合物给药或组合给药。在本发明的该实施方案中，本发明的药物组合物和包含佐剂的组合物可以以单一试剂盒提供。

用于本发明的佐剂可以选自例如在Nature Medicine, 19, 1597-1608, 2013中记载的常规已知的佐剂。佐剂的实例包括：病毒或细菌来源试剂或其衍生物、细胞因子、植物来源试剂或其衍生物、海洋生物来源试剂或其衍生物、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂或Pluronic多元醇、或者聚阴离子。

术语“细菌来源试剂或其衍生物”包括(i)死细菌、(ii)由细菌得到的细胞壁骨架(CWS)、和(iii)从微生物分离的组分或其衍生物。

死细菌(i)的实例包括粉末形式的死溶血性链球菌(例如PICIBANIL；Chugaipharmaceutical)、死细菌的悬浮液混合物形式(例如Broncasma Berna；Sanwa KagakuKenkyusho)、和死结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）。

CWS(ii)的实例包括由分枝杆菌属得到的CWS(例如来自牛结核分枝杆菌BCG的CWS)、由诺卡氏菌属得到的CWS(例如来自红色诺卡氏菌的CWS)、或者由棒状杆菌属得到的CWS。

从微生物分离的组分或其衍生物(iii)的实例包括：微生物多糖类如结核分枝杆菌多糖类(例如Ancer, Zeria Pharmaceutical)、担子菌多糖类(例如Lentinan,Ajinomoto; Krestin, Sankyo，云芝多糖)、胞壁酰二肽(MDP)相关化合物、脂多糖(LPS)、脂质A相关化合物(MPL)、糖脂质海藻酸二霉菌酸酯(TDM)、来自细菌的DNA(例如CpG低聚核苷酸)、来自病毒的核酸、或者它们的衍生物(例如polyI:C)。

从微生物分离的组分或其衍生物是商业可获得的，或者可以通过如在CancerRes., 33, 2187-2195 (1973), J. Natl. Cancer Inst., 48, 831-835 (1972, J.Bacteriol., 94, 1736-1745 (1967), Gann, 69, 619-626 (1978), J. Bacteriol.,92, 869-879 (1966), J. Natl. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)中记载的方法而从微生物分离从而获得。

“细胞因子”的实例包括IFN-α、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-γ、IL-18、或者IL-15。细胞因子可以是天然产生的细胞因子和重组细胞因子。这样的细胞因子可以是商业可获得的。重组细胞因子可以基于例如GenBank、EMBL或DDBJ的数据库中登记的核苷酸序列，通过包括克隆适当的基因、将所述基因引入表达载体、和将所述载体引入用于基因表达的宿主细胞的步骤的方法，从而制备。

“植物来源试剂或其衍生物”的实例包括皂苷的衍生物如Quil A (AccurateChemical & Scientific Corp)或QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals inc.)、或者甘草酸(SIGMA-ALDRICH)。

“海洋生物来源试剂或其衍生物”的实例包括源自海绵动物的糖脂质如α-半乳糖神经酰胺等。

本发明的药物组合物可以被配制为剂型，如油乳剂、脂质体、包含结合于直径为数微米的珠的活性试剂分子的颗粒剂、脂质结合剂型、微球剂、微胶囊剂。

呈油乳剂形式的本发明的药物组合物可以是油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂、或水包油包水(w/o/w)乳剂。w/o乳剂可以在水分散相中包含活性成分。o/w乳剂可以在水分散介质中包含活性成分。w/o/w乳剂可以在内水分散相中包含活性成分。本发明的呈乳剂形式的药物组合物可以根据例如JP H8-000985 A、或JP H9-122476 A中记载的方法而制备。

本发明的药物组合物可以被配制为脂质体形式。脂质体是由脂质双层膜形成的囊泡，并且能够在膜中包封活性试剂或包含活性试剂的水相。形成脂质体的脂质的实例包括磷酰胆碱和鞘磷脂。可以添加添加剂如磷酸二鲸蜡基酯、磷脂酸、或磷脂酰丝氨酸，从而改变脂质体电荷并稳定脂质体。本发明的呈脂质体形式的药物组合物可以通过超声法、乙醇注入法、醚注入法、反相蒸发法、或法压提取法(French Press extraction)而制备。

本发明的药物组合物可以被配制为微球剂形式。微球剂是高分子基质的微粒，并且能够并入分散于整个高分子基质中的活性试剂。作为形成基质的高分子，可以使用可生物降解的高分子，如白蛋白、明胶、几丁质、壳聚糖、淀粉、聚乳酸、或聚(氰基丙烯酸烷基酯)。本发明的呈微球剂形式的药物组合物可以通过例如Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:129-146, 2000, or Dev. Biol. Stand. 92: 63-78, 1998, Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997中记载的方法制备。

本发明的药物组合物可以被配制为微胶囊剂形式。微胶囊剂是具有包含活性试剂的芯核被包衣材料包衣的结构的微粒。芯核上的包衣可以是高分子材料的膜，该高分子材料例如为羧基甲基纤维素、纤维素乙酸酯邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、明胶、明胶·阿拉伯胶、硝基纤维素、聚乙烯醇、或羟基丙基纤维素。本发明的呈微胶囊剂形式的药物组合物可以通过凝聚法、或界面聚合法而制备。

本发明的药物组合物对于预防疟原虫感染、预防疟原虫感染后疟疾发病、或治疗疟疾是有用的。“预防疟原虫感染”是指防止宿主被疟原虫感染。“预防疟原虫感染后疟疾发病”是指防止疟原虫感染的宿主发展出任何疟疾的症状，包括例如发热、头疼、恶心、意识障碍或肾衰竭。“治疗疟疾”是指控制或减少由疟原虫感染引起的症状。

本发明的药物组合物可以以任何剂型，并通过根据特定给药目的或患者病况而适当选择的给药途径，从而对患者给药。本发明的药物组合物可以以选自例如注射剂、经皮剂、吸入剂或经口剂的适当剂型，静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、经皮、经鼻或经口给药。肌肉内给药是典型的疫苗给药途径，可以用于本发明的药物组合物。

为了用本发明的多核苷酸或表达载体转染细胞，可以使用病毒载体或者任何其他手段或技术(Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45; The pharmaceuticalsmonthly, 36(1), 23-48(1994); Experimental Medicine, extra edition, 12(15),(1994)；或其中引用的参考文献)。

作为引入了本发明的多核苷酸的病毒载体，可以使用DNA病毒或RNA病毒，如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、仙台病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、或辛德毕斯病毒。优选为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、或痘苗病毒。替代地，表达质粒可以作为DNA疫苗直接给药，或者用本发明的多核苷酸或表达载体转染细胞可以通过脂质体法、lipofectin法、显微注射法、磷酸钙法、或电穿孔法而实施。DNA疫苗、或通过脂质体法转染是优选的。

本发明的多核苷酸或表达载体可以作为疫苗通过直接对患者给药(体内法)而给药，或者通过包括从患者收集特定种类的细胞、用多核苷酸或表达载体体外转染该细胞、并将转染的细胞返回至患者内的方法(体外法)而给药(Nikkei Science, April 1994, pp.20-45; The pharmaceuticals monthly, 36(1), 23-48(1994); ExperimentalMedicine, extra edition, 12(15), (1994)；或其中引用的文献)。其中，优选为体内法。

为了通过体内法给药，可以将本发明的多核苷酸或表达载体配制为液体制剂，或典型地用于注射的制剂。可以向该制剂中添加药学上可接受的携带体。替代地，本发明的多核苷酸或表达载体可以被包封在脂质体或能够膜融合的脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体)中。这样的脂质体可以被配制为培养基中的混悬液，或者配制为冻干制剂或离心且冻干的制剂。还可以由用病毒感染的细胞的培养液制备疫苗，该病毒引入了包含本发明的多核苷酸的表达载体。

药物制剂的适当剂量或给药方案可以取决于制剂给药的特定目的、制剂接受者的年龄或体重、或者其他因素而决定。本发明的多肽的典型剂量可以为0.0001mg~1000mg、优选为0.001mg~100mg、更优选为0.01mg~10mg。

本发明的药物组合物的适当给药方案可以取决于制剂给药的特定目的、制剂接受者的年龄或体重、或者其他因素而决定。本发明的药物组合物可以以单一剂量给药，或者以数天或数周的间隔以重复剂量给药(例如2~5次给药)。本发明的药物组合物可以以包括初始免疫、和一定时间(例如一年至十年的时间)后为了维持和增强免疫而给予的额外免疫的给药方案来给药。对于各初始免疫和额外免疫，可以将药物组合物以单一剂量给药，或者以重复剂量给药(例如2~5次给药)。

除了本发明的多肽之外，本发明的药物组合物可以任选包含一种或多种其他已知的疟疾疫苗抗原。替代地，包含本发明的多肽的本发明的药物组合物可以与一种或多种其他已知的疟疾疫苗抗原组合给药。本发明的药物组合物和包含其他疟疾疫苗抗原的组合物可以在给药前组合，或者作为单独的制剂给药。可以以单一试剂盒形式提供包含本发明的多肽的药物组合物和包含其他疟疾疫苗抗原的组合物。其他疟疾疫苗抗原的实例包括CSP(环子孢子蛋白)、TRAP (血小板反应蛋白相关匿名蛋白)、MSP1 (裂殖子表面蛋白-1)、AMA-1 (顶端膜抗原-1)、SERA5 (丝氨酸重复抗原-5)、GAMA (GPI锚定微线体抗原)、EBA175 (红细胞结合抗原 175)、RH5 (网织红细胞结合蛋白同源物5)、Pfs25 (恶性疟原虫表面蛋白25)、和Pfs230 (恶性疟原虫表面蛋白230)、和它们的类似物。这样的类似物可以是抗原蛋白质的肽片段(部分肽)、通过一个或多个(优选为一个或数个)氨基酸的置换、缺失、添加或插入而不同于原始氨基酸序列的抗原蛋白质或其片段的改变形式、或者这些抗原蛋白质或其片段的一个或多个序列的融合多肽。

本发明的药物组合物除了本发明的多肽之外，可以任选包含一种或多种其他已知的用于非疟疾感染的感染的疫苗抗原。替代地，包含本发明的多肽的本发明的药物组合物可以与一种或多种其他已知的用于非疟疾感染的感染的疫苗抗原组合给药。包含本发明的多肽的药物组合物和包含其他用于非疟疾感染的感染的疫苗抗原的组合物可以在给药前组合，或者作为单独的制剂给药。可以以单一试剂盒形式提供包含本发明的多肽的药物组合物和包含其他用于非疟疾感染的感染的疫苗抗原的组合物。非疟疾感染的感染的实例包括脊髓灰质炎感染、白喉感染、百日咳感染、和破伤风感染。用于本发明的针对这些感染的疫苗抗原可以是任意已知的疫苗抗原，如百日咳杆菌（Bordetella pertussis）保护性抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、灭活脊髓灰质炎病毒。

在本发明的一个方面中，本发明提供预防疟原虫感染、预防疟原虫感染后疟疾发病、或治疗疟疾的方法，其中，所述方法包括将有效量的本发明的药物组合物对人受试者给药。“有效量”是指对于实现期望的预防或治疗效果而言充分的量。

实施例

下述实施例中更详细地说明本发明，但不限于此。

实施例1

使用包含在C端连接于His标签编码序列的编码Ripr的小麦密码子优化序列的载体、即pEU-E01-MCS；或包含从在C端连接于His标签编码序列的Ripr的密码子优化DNA亚克隆的11个片段之一的序列的载体、即pEU-E01-GST-TEV-N2，作为转录的模板。所有的肽用模板合成，所述模板在N端包含Met编码序列、且在C端包含6×His编码序列。

编码SEQ ID NO: 2的第21~1086位氨基酸、SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸(SEQ ID NO: 4)、和SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸(SEQ ID NO: 8)的小麦密码子优化序列分别示于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、和SEQ ID NO: 9。全部转录mRNA被用于利用小麦胚芽无细胞蛋白质合成试剂盒WEPRO®7240H(cell free Science)进行的蛋白质合成。所得的含有合成蛋白质的溶液通过使用Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare)而亲和提纯。将含有0.1mg或0.14mg多肽的抗原溶液与相同体积的弗氏完全佐剂混合，皮下给药于兔用于致敏。初次致敏4周后，将含有0.1mg多肽且混合有相同体积的弗氏完全佐剂的抗原溶液皮下给药，用于追加致敏。初次致敏6周后，从兔采血，并从收集的血液中获得血清。用HiTrap protein G Sepharose column (GE Healthcare)，从血清提纯IgG。为了提纯IgG，添加正常人血红细胞，以使得非特异性地结合于血红细胞的IgG被去除，并且最终得到多克隆抗体。将多克隆抗体、人血红细胞、和疟原虫感染血红细胞混合并培养25小时。培养后，将疟原虫的细胞核用cyber green染色，并通过使用FACS来定量疟原虫感染的血红细胞数。疟原虫增殖抑制率通过测定将未处理组中的疟原虫感染血红细胞数记作100时各抗体处理组的疟原虫感染血红细胞的相对数，并进一步从100中减去所得相对数，从而计算。

检验了下述全长Ripr和11种片段(抗原肽)。

Ripr full(全长Ripr)：由SEQ ID NO: 2的第21~1086位氨基酸序列组成的肽

Ripr 1-1：由SEQ ID NO: 2的第21~197位氨基酸序列组成的肽

Ripr 1-2：由SEQ ID NO: 2的第198~377位氨基酸序列组成的肽

Ripr 1-3：由SEQ ID NO: 2的第378~557位氨基酸序列组成的肽

Ripr 1-4：由SEQ ID NO: 2的第558~719位氨基酸序列组成的肽

Ripr 1-5：由SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列组成的肽(SEQ ID NO: 4)

Ripr 1-6：由SEQ ID NO: 2的第935~1086位氨基酸序列组成的肽

Ripr 2-1：由SEQ ID NO: 2的第108~287位氨基酸序列组成的肽

Ripr 2-2：由SEQ ID NO: 2的第288~467位氨基酸序列组成的肽

Ripr 2-3：由SEQ ID NO: 2的第468~647位氨基酸序列组成的肽

Ripr 2-4：由SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸序列组成的肽(SEQ ID NO: 8)

Ripr 2-5：由SEQ ID NO: 2的第831~1007位氨基酸序列组成的肽

通过用全长Ripr和11种片段(抗原肽)免疫兔而得到的兔多克隆抗体对疟原虫增殖的抑制活性示于图1。其结果表明，Ripr2-4和Ripr1-5肽对疟原虫增殖具有抑制活性，以及Ripr 1-5肽比全长Ripr具有对疟原虫增殖的更高抑制活性。

Ripr1-5和Ripr2-4的氨基酸序列示于如下。

Ripr1-5

CDLSCPSNKVCVIENGKQTCKCSERFVLENGVCICANDYKMEDGINCIAKNKCKRKEYENICTNPNEMCAYNEETDIVKCECKEHYYRSSRGECILNDYCKDINCKENEECSIVNFKPECVCKENLKKNNKGECIYENSCLINEGNCPKDSKCIYREYKPHECVCNKQGHVAVNGKCVLEDKCVHNKKCSENSICVNVMNKEPICVCTYNYYKKD(SEQID NO: 4)

Ripr2-4

STCYGNRFNYDCFCDNPYISKYGNKLCERPNDCESVLCSQNQVCQILPNDKLICQCEEGYKNVKGKCVPDNKCDLSCPSNKVCVIENGKQTCKCSERFVLENGVCICANDYKMEDGINCIAKNKCKRKEYENICTNPNEMCAYNEETDIVKCECKEHYYRSSRGECILNDYCKDINCKENEEC(SEQ ID NO: 8)

实施例2

将在N端连接于Gp67分泌信号编码序列、且在C端连接于His标签编码序列的编码Ripr1-5的杆状病毒密码子优化序列(SEQ ID NO: 10)亚克隆至pFastBac1载体中。通过使用所得表达载体和DH10Bac感受态细胞，制备重组杆粒。将重组杆粒用Cellfectin II试剂转染至Sf9昆虫细胞中，从而制作重组杆状病毒。所述重组杆状病毒被扩增，并用所述重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞，从而表达Ripr1-5。收集培养上清液，并用Ni-NTA亲和柱和Superdex200凝胶过滤柱提纯Ripr1-5。

以与实施例1中相同的方式，通过使用利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制作的Ripr1-5(Bac-Ripr 1-5)，得到兔多克隆抗体。兔多克隆抗体对疟原虫增殖的抑制活性与实施例1的通过用利用小麦胚芽无细胞蛋白质表达系统制作的Ripr 1-5(WGCFS-Ripr 1-5)免疫而得到的兔多克隆抗体进行比较。结果示于图2。该结果表明，用利用小麦胚芽无细胞蛋白质表达系统制作的Ripr1-5肽诱导的抗体具有与用利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制作的Ripr1-5诱导的抗体相当的对疟原虫增殖的抑制活性。

工业实用性

本发明的多肽、多核苷酸、表达载体和抗体在预防疟原虫感染或疟疾发病中是有用的。

序列自由文本

SEQ ID NO: 3：编码SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列的核苷酸序列

SEQ ID NO: 4：SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列

SEQ ID NO: 5：编码SEQ ID NO: 2的第21~1086位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

SEQ ID NO: 6：编码SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

SEQ ID NO: 7：编码SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸序列的核苷酸序列

SEQ ID NO: 8：SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸序列

SEQ ID NO: 9：编码SEQ ID NO: 2的第648~830位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

SEQ ID NO: 10：编码SEQ ID NO: 2的第720~934位氨基酸序列的杆状病毒密码子优化序列

序列表

<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.

NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION EHIME UNIVERSITY

<120> 疟疾疫苗

<130> 673742

<150> JP2016-220512

<151> 2016-11-11

<150> JP2017-161442

<151> 2017-08-24

<160> 10

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 3261

<212> DNA

<213> 恶性疟原虫

<400> 1

atgttcagaa ttttttttac ccttcttata ataatattaa tcaagaaaac atcggcaatt 60

gatttaatag aaggaatttt ttatgaaaaa aatgaaatag ataaattaac attttctctc 120

gatcatagag ttagagataa tttaaaaaca gatttgattt taaataataa tggggaaaat 180

gattatgctt atttaaacaa atacgtttat actatattaa atcgtgattc aacagaaaaa 240

attaaaacat ttttttctca taataaagac atgaaatcat gtgattattt tatatcaaaa 300

gaatataatt caagtgataa aacaaatcaa atatgttata aaaaaacatt ttgcggagta 360

gtaataccaa atagtgaaga aataaaaaca aataaaataa caaatgacaa actttattgt 420

gcacatttca attctacaca tataatcatt tattacatat cacaaccact tttattagaa 480

cctcatgttg tttatgaaga aacatttttt gaaaaaggaa aaaatgatca aattaattgc 540

caaggtatgt atatatctct aagatctgta catgtacata cacacaatgc tatattacaa 600

caagaaacac ttacatatat taaaaattta tgtgacggaa aaaacaattg taaattcgat 660

tttgattcaa taaaatatga aaataaatca cttactcatt atttgttttt tattaatata 720

caatatcaat gcataagtcc tctgaatcta caggaaaatg aaatgtgtga cgtatataat 780

gatgatacac ataaagcaac atgcaaatat ggttttaata aaatagaatt attaaaaaat 840

gtttgtgaag aaaattatag atgtacacaa gatatatgtt cagtaaatca attttgtgac 900

ggagaaaatg aaacatgtac atgcaaaaca tcattattac catcagctaa aaacaattgt 960

gaatacaacg atttatgtac agttttaaat tgtcctgaaa attccacatg tgaacaaata 1020

ggaaatggga aaaaagctga atgtaaatgt gaaaatggta aatattatca caataataaa 1080

tgttatacaa aaaatgattt agaattagcc ataaaaatag aaccacataa aaaagaaaaa 1140

ttttataaaa ataatttata tcaaggaaaa gcattaaaac cagaatatat ttttatgcaa 1200

tgtgaaaatg ggttctctat agaagttatt aatgcatatg tatcatgtta tagagtttca 1260

ttcaatctaa acaaattgaa atatgttaca gaatcattaa aaaaaatgtg tgatgggaaa 1320

accaaatgtg cttatggaaa tacaatagat ccaatagatg atttaaatca tcataatata 1380

tgtaataatt ttaatacaat atttaaatat gattatttat gtgtattcaa taatcaaaat 1440

attacttcag ataagaattc acatcttcat tctaatatac catcattata taattcaagt 1500

attctaccag atattaataa atctaaattc catttgattt caagaaatag tcgaaccaac 1560

caatatcctc ataacaatat atccatgcta gaaatacaaa atgaaatatc ctcacacaat 1620

tcaaatcagt ttagtacaga tccacacaca aatagtaata atataaacaa tatgaatatt 1680

aaaaaggtag aaatcttcag aagtcgtttt tcaagtaaat tacaatgtca agggggaaaa 1740

ataaatattg ataaagcaat tttaaaaggt ggggaaggat gtaatgattt gcttttgacg 1800

aattctttaa aatcatattg taatgattta tcagaatgtg atattggttt aatataccat 1860

tttgatactt attgtattaa tgatcaatat ctttttgtat cttacagctg ctccaattta 1920

tgtaataaat gtcataacaa ttctacatgc tatgggaaca gatttaatta tgattgtttt 1980

tgtgataatc cttatatttc aaaatatgga aataaattat gtgaacgtcc aaatgattgt 2040

gaatctgttt tgtgttcaca aaatcaagtt tgtcaaattc ttccaaatga taaattaata 2100

tgtcaatgtg aagaaggata taaaaatgtt aaaggtaaat gtgttccaga caacaaatgt 2160

gatctttcat gcccatcaaa caaagtttgt gttatcgaaa atggaaaaca aacatgtaaa 2220

tgttcagaac gttttgttct agagaatggt gtgtgtatat gtgctaatga ttataaaatg 2280

gaagatggta ttaattgtat agccaaaaat aaatgtaaaa gaaaagaata tgaaaatatt 2340

tgtacaaatc caaatgaaat gtgtgcttat aatgaagaaa cagatattgt aaaatgtgaa 2400

tgtaaagaac attattatag atcatcaaga ggtgaatgta tattaaatga ttattgtaaa 2460

gatattaatt gtaaagaaaa tgaagaatgt tctattgtaa actttaaacc agaatgtgta 2520

tgtaaagaaa atcttaaaaa aaataataaa ggagaatgta tttatgaaaa ctcctgttta 2580

attaatgaag ggaattgtcc aaaagattca aaatgtattt atagagaata taaaccacat 2640

gaatgtgtat gtaataaaca aggtcatgta gctgtcaatg gaaaatgtgt tttagaagat 2700

aaatgtgtac ataataaaaa atgttcagaa aattctatat gtgtaaatgt aatgaataaa 2760

gaaccaatat gtgtatgtac atataattat tataaaaaag atggtgtatg tttaatacaa 2820

aacccttgtc taaaagataa tggaggctgc tctagaaatt cagagtgtac atttaaatat 2880

agtaaaatta attgtacatg taaagaaaat tataaaaata aagatgattc ttgtgtacct 2940

aatacaaatg agtatgatga aagttttaca ttccaatata atgacgatgc atctattatt 3000

cttggagcat gtggtatgat cgaattttca tatatatata accaaattat ttggaaaata 3060

aataactcaa aagaatctta cgtattttat tatgattatc caacagcagg taatatagaa 3120

gttcaaatta aaaatgaaat atttcacact attatatatt tgaaaaaaaa aataggcaat 3180

agtgttatct atgatgattt ccaagtagat catcaaacat gtatatatga aaatgtattt 3240

tattatagta atcagaatta g 3261

<210> 2

<211> 1086

<212> PRT

<213> 恶性疟原虫

<400> 2

Met Phe Arg Ile Phe Phe Thr Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ile Asp Leu Ile Glu Gly Ile Phe Tyr Glu Lys Asn Glu

20 25 30

Ile Asp Lys Leu Thr Phe Ser Leu Asp His Arg Val Arg Asp Asn Leu

35 40 45

Lys Thr Asp Leu Ile Leu Asn Asn Asn Gly Glu Asn Asp Tyr Ala Tyr

50 55 60

Leu Asn Lys Tyr Val Tyr Thr Ile Leu Asn Arg Asp Ser Thr Glu Lys

65 70 75 80

Ile Lys Thr Phe Phe Ser His Asn Lys Asp Met Lys Ser Cys Asp Tyr

85 90 95

Phe Ile Ser Lys Glu Tyr Asn Ser Ser Asp Lys Thr Asn Gln Ile Cys

100 105 110

Tyr Lys Lys Thr Phe Cys Gly Val Val Ile Pro Asn Ser Glu Glu Ile

115 120 125

Lys Thr Asn Lys Ile Thr Asn Asp Lys Leu Tyr Cys Ala His Phe Asn

130 135 140

Ser Thr His Ile Ile Ile Tyr Tyr Ile Ser Gln Pro Leu Leu Leu Glu

145 150 155 160

Pro His Val Val Tyr Glu Glu Thr Phe Phe Glu Lys Gly Lys Asn Asp

165 170 175

Gln Ile Asn Cys Gln Gly Met Tyr Ile Ser Leu Arg Ser Val His Val

180 185 190

His Thr His Asn Ala Ile Leu Gln Gln Glu Thr Leu Thr Tyr Ile Lys

195 200 205

Asn Leu Cys Asp Gly Lys Asn Asn Cys Lys Phe Asp Phe Asp Ser Ile

210 215 220

Lys Tyr Glu Asn Lys Ser Leu Thr His Tyr Leu Phe Phe Ile Asn Ile

225 230 235 240

Gln Tyr Gln Cys Ile Ser Pro Leu Asn Leu Gln Glu Asn Glu Met Cys

245 250 255

Asp Val Tyr Asn Asp Asp Thr His Lys Ala Thr Cys Lys Tyr Gly Phe

260 265 270

Asn Lys Ile Glu Leu Leu Lys Asn Val Cys Glu Glu Asn Tyr Arg Cys

275 280 285

Thr Gln Asp Ile Cys Ser Val Asn Gln Phe Cys Asp Gly Glu Asn Glu

290 295 300

Thr Cys Thr Cys Lys Thr Ser Leu Leu Pro Ser Ala Lys Asn Asn Cys

305 310 315 320

Glu Tyr Asn Asp Leu Cys Thr Val Leu Asn Cys Pro Glu Asn Ser Thr

325 330 335

Cys Glu Gln Ile Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Cys Lys Cys Glu Asn

340 345 350

Gly Lys Tyr Tyr His Asn Asn Lys Cys Tyr Thr Lys Asn Asp Leu Glu

355 360 365

Leu Ala Ile Lys Ile Glu Pro His Lys Lys Glu Lys Phe Tyr Lys Asn

370 375 380

Asn Leu Tyr Gln Gly Lys Ala Leu Lys Pro Glu Tyr Ile Phe Met Gln

385 390 395 400

Cys Glu Asn Gly Phe Ser Ile Glu Val Ile Asn Ala Tyr Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Arg Val Ser Phe Asn Leu Asn Lys Leu Lys Tyr Val Thr Glu Ser

420 425 430

Leu Lys Lys Met Cys Asp Gly Lys Thr Lys Cys Ala Tyr Gly Asn Thr

435 440 445

Ile Asp Pro Ile Asp Asp Leu Asn His His Asn Ile Cys Asn Asn Phe

450 455 460

Asn Thr Ile Phe Lys Tyr Asp Tyr Leu Cys Val Phe Asn Asn Gln Asn

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Lys Asn Ser His Leu His Ser Asn Ile Pro Ser Leu

485 490 495

Tyr Asn Ser Ser Ile Leu Pro Asp Ile Asn Lys Ser Lys Phe His Leu

500 505 510

Ile Ser Arg Asn Ser Arg Thr Asn Gln Tyr Pro His Asn Asn Ile Ser

515 520 525

Met Leu Glu Ile Gln Asn Glu Ile Ser Ser His Asn Ser Asn Gln Phe

530 535 540

Ser Thr Asp Pro His Thr Asn Ser Asn Asn Ile Asn Asn Met Asn Ile

545 550 555 560

Lys Lys Val Glu Ile Phe Arg Ser Arg Phe Ser Ser Lys Leu Gln Cys

565 570 575

Gln Gly Gly Lys Ile Asn Ile Asp Lys Ala Ile Leu Lys Gly Gly Glu

580 585 590

Gly Cys Asn Asp Leu Leu Leu Thr Asn Ser Leu Lys Ser Tyr Cys Asn

595 600 605

Asp Leu Ser Glu Cys Asp Ile Gly Leu Ile Tyr His Phe Asp Thr Tyr

610 615 620

Cys Ile Asn Asp Gln Tyr Leu Phe Val Ser Tyr Ser Cys Ser Asn Leu

625 630 635 640

Cys Asn Lys Cys His Asn Asn Ser Thr Cys Tyr Gly Asn Arg Phe Asn

645 650 655

Tyr Asp Cys Phe Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Ser Lys Tyr Gly Asn Lys

660 665 670

Leu Cys Glu Arg Pro Asn Asp Cys Glu Ser Val Leu Cys Ser Gln Asn

675 680 685

Gln Val Cys Gln Ile Leu Pro Asn Asp Lys Leu Ile Cys Gln Cys Glu

690 695 700

Glu Gly Tyr Lys Asn Val Lys Gly Lys Cys Val Pro Asp Asn Lys Cys

705 710 715 720

Asp Leu Ser Cys Pro Ser Asn Lys Val Cys Val Ile Glu Asn Gly Lys

725 730 735

Gln Thr Cys Lys Cys Ser Glu Arg Phe Val Leu Glu Asn Gly Val Cys

740 745 750

Ile Cys Ala Asn Asp Tyr Lys Met Glu Asp Gly Ile Asn Cys Ile Ala

755 760 765

Lys Asn Lys Cys Lys Arg Lys Glu Tyr Glu Asn Ile Cys Thr Asn Pro

770 775 780

Asn Glu Met Cys Ala Tyr Asn Glu Glu Thr Asp Ile Val Lys Cys Glu

785 790 795 800

Cys Lys Glu His Tyr Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Cys Ile Leu Asn

805 810 815

Asp Tyr Cys Lys Asp Ile Asn Cys Lys Glu Asn Glu Glu Cys Ser Ile

820 825 830

Val Asn Phe Lys Pro Glu Cys Val Cys Lys Glu Asn Leu Lys Lys Asn

835 840 845

Asn Lys Gly Glu Cys Ile Tyr Glu Asn Ser Cys Leu Ile Asn Glu Gly

850 855 860

Asn Cys Pro Lys Asp Ser Lys Cys Ile Tyr Arg Glu Tyr Lys Pro His

865 870 875 880

Glu Cys Val Cys Asn Lys Gln Gly His Val Ala Val Asn Gly Lys Cys

885 890 895

Val Leu Glu Asp Lys Cys Val His Asn Lys Lys Cys Ser Glu Asn Ser

900 905 910

Ile Cys Val Asn Val Met Asn Lys Glu Pro Ile Cys Val Cys Thr Tyr

915 920 925

Asn Tyr Tyr Lys Lys Asp Gly Val Cys Leu Ile Gln Asn Pro Cys Leu

930 935 940

Lys Asp Asn Gly Gly Cys Ser Arg Asn Ser Glu Cys Thr Phe Lys Tyr

945 950 955 960

Ser Lys Ile Asn Cys Thr Cys Lys Glu Asn Tyr Lys Asn Lys Asp Asp

965 970 975

Ser Cys Val Pro Asn Thr Asn Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Thr Phe Gln

980 985 990

Tyr Asn Asp Asp Ala Ser Ile Ile Leu Gly Ala Cys Gly Met Ile Glu

995 1000 1005

Phe Ser Tyr Ile Tyr Asn Gln Ile Ile Trp Lys Ile Asn Asn Ser

1010 1015 1020

Lys Glu Ser Tyr Val Phe Tyr Tyr Asp Tyr Pro Thr Ala Gly Asn

1025 1030 1035

Ile Glu Val Gln Ile Lys Asn Glu Ile Phe His Thr Ile Ile Tyr

1040 1045 1050

Leu Lys Lys Lys Ile Gly Asn Ser Val Ile Tyr Asp Asp Phe Gln

1055 1060 1065

Val Asp His Gln Thr Cys Ile Tyr Glu Asn Val Phe Tyr Tyr Ser

1070 1075 1080

Asn Gln Asn

1085

<210> 3

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的第720-934位氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 3

tgtgatcttt catgcccatc aaacaaagtt tgtgttatcg aaaatggaaa acaaacatgt 60

aaatgttcag aacgttttgt tctagagaat ggtgtgtgta tatgtgctaa tgattataaa 120

atggaagatg gtattaattg tatagccaaa aataaatgta aaagaaaaga atatgaaaat 180

atttgtacaa atccaaatga aatgtgtgct tataatgaag aaacagatat tgtaaaatgt 240

gaatgtaaag aacattatta tagatcatca agaggtgaat gtatattaaa tgattattgt 300

aaagatatta attgtaaaga aaatgaagaa tgttctattg taaactttaa accagaatgt 360

gtatgtaaag aaaatcttaa aaaaaataat aaaggagaat gtatttatga aaactcctgt 420

ttaattaatg aagggaattg tccaaaagat tcaaaatgta tttatagaga atataaacca 480

catgaatgtg tatgtaataa acaaggtcat gtagctgtca atggaaaatg tgttttagaa 540

gataaatgtg tacataataa aaaatgttca gaaaattcta tatgtgtaaa tgtaatgaat 600

aaagaaccaa tatgtgtatg tacatataat tattataaaa aagat 645

<210> 4

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 2的第720-934位氨基酸序列

<400> 4

Cys Asp Leu Ser Cys Pro Ser Asn Lys Val Cys Val Ile Glu Asn Gly

1 5 10 15

Lys Gln Thr Cys Lys Cys Ser Glu Arg Phe Val Leu Glu Asn Gly Val

20 25 30

Cys Ile Cys Ala Asn Asp Tyr Lys Met Glu Asp Gly Ile Asn Cys Ile

35 40 45

Ala Lys Asn Lys Cys Lys Arg Lys Glu Tyr Glu Asn Ile Cys Thr Asn

50 55 60

Pro Asn Glu Met Cys Ala Tyr Asn Glu Glu Thr Asp Ile Val Lys Cys

65 70 75 80

Glu Cys Lys Glu His Tyr Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Cys Ile Leu

85 90 95

Asn Asp Tyr Cys Lys Asp Ile Asn Cys Lys Glu Asn Glu Glu Cys Ser

100 105 110

Ile Val Asn Phe Lys Pro Glu Cys Val Cys Lys Glu Asn Leu Lys Lys

115 120 125

Asn Asn Lys Gly Glu Cys Ile Tyr Glu Asn Ser Cys Leu Ile Asn Glu

130 135 140

Gly Asn Cys Pro Lys Asp Ser Lys Cys Ile Tyr Arg Glu Tyr Lys Pro

145 150 155 160

His Glu Cys Val Cys Asn Lys Gln Gly His Val Ala Val Asn Gly Lys

165 170 175

Cys Val Leu Glu Asp Lys Cys Val His Asn Lys Lys Cys Ser Glu Asn

180 185 190

Ser Ile Cys Val Asn Val Met Asn Lys Glu Pro Ile Cys Val Cys Thr

195 200 205

Tyr Asn Tyr Tyr Lys Lys Asp

210 215

<210> 5

<211> 3198

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的21-1086位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

<400> 5

gatctgatcg agggcatctt ctacgagaag aacgagatcg acaagctcac cttctccctg 60

gaccacaggg tccgcgataa cctcaagacg gacctcatcc tgaacaacaa cggcgagaac 120

gattacgcgt acctgaacaa gtatgtgtac accatcctca acagggactc aaccgagaag 180

atcaagacgt tcttctctca caacaaggat atgaagtctt gcgactactt catctccaag 240

gagtacaact ccagcgataa gaccaaccaa atctgctaca agaagacgtt ctgcggcgtg 300

gtcatcccaa actccgagga gatcaagacc aacaagatca cgaacgacaa gctctactgc 360

gcccatttca actccaccca catcatcatc tactacatca gccagccact cctgctggag 420

ccgcacgttg tgtacgagga gaccttcttc gagaagggca agaacgacca aatcaactgc 480

caggggatgt acatctcact gcggtctgtc cacgttcata cccacaacgc gatcctccaa 540

caggagaccc tgacgtacat caagaacctc tgcgacggca agaacaactg caagttcgac 600

ttcgatagca tcaagtacga gaacaagtcg ctcacccact acctgttctt catcaacatc 660

cagtaccagt gcatctcccc gctcaacctg caagagaacg agatgtgcga cgtctacaac 720

gacgataccc acaaggccac gtgcaagtac ggcttcaaca agatcgagct gctcaagaac 780

gtctgcgagg agaactaccg ctgcacccaa gatatctgct ccgttaacca gttctgcgac 840

ggcgagaacg agacctgcac gtgcaagacg tcgctgctcc cctcagcgaa gaacaactgc 900

gagtacaacg acctctgcac cgtgctgaac tgccctgaga acagcacgtg cgagcagatc 960

ggcaacggga agaaggctga gtgcaagtgc gagaacggca agtactacca taacaacaag 1020

tgctacacca agaacgacct ggagctggcg atcaagatcg agccacacaa gaaggagaag 1080

ttctacaaga acaacctcta ccaaggcaag gctctgaagc cggagtacat cttcatgcag 1140

tgcgagaacg ggttcagcat cgaggtcatc aacgcctacg tctcgtgcta ccgcgtttca 1200

ttcaacctca acaagctgaa gtatgtgacc gagtccctga agaagatgtg cgatggcaag 1260

accaagtgcg cgtacgggaa cacgatcgac ccaatcgacg atctcaacca ccataacatc 1320

tgcaacaact tcaacaccat cttcaagtac gattacctgt gcgtgttcaa caaccaaaac 1380

atcacgtctg acaagaactc ccatctccac agcaacatcc cctcgctcta caactcgtca 1440

atcctgcctg acatcaacaa gtcgaagttc catctgatct ccaggaacag ccgcaccaac 1500

cagtacccac acaacaacat ctccatgctg gagatccaaa acgagatctc ttcccataac 1560

tcaaaccagt tctctaccga cccgcacacg aacagcaaca acatcaacaa catgaacatc 1620

aagaaggtcg agatcttccg gtcgagattc agctcgaagc tgcaatgcca gggcgggaag 1680

atcaacatcg ataaggctat cctcaagggc ggggagggct gcaacgacct gctcctgacc 1740

aactcgctca agtcatactg caacgatctg agcgagtgcg acatcgggct catctaccat 1800

ttcgatacct actgcatcaa cgaccaatac ctgttcgtgt cctacagctg ctcgaacctc 1860

tgcaacaagt gccacaacaa ctccacctgc tacggcaaca ggttcaacta cgactgcttc 1920

tgcgataacc catacatcag caagtacggg aacaagctgt gcgagcgccc gaacgattgc 1980

gagtccgtgc tctgcagcca aaaccaggtc tgccaaatcc tcccaaacga caagctgatc 2040

tgccagtgcg aggaaggcta caagaacgtg aaggggaagt gcgtcccaga caacaagtgc 2100

gatctgtctt gcccgtccaa caaggtgtgc gtcatcgaga acggcaagca gacctgcaag 2160

tgcagcgagc ggttcgttct ggagaacggc gtgtgcatct gcgctaacga ttacaagatg 2220

gaggacggga tcaactgcat cgccaagaac aagtgcaaga gaaaggagta cgagaacatc 2280

tgcaccaacc ccaacgagat gtgcgcttac aacgaggaga cggacatcgt caagtgcgag 2340

tgcaaggagc actactaccg gtcatctaga ggcgagtgca tcctcaacga ctactgcaag 2400

gatatcaact gcaaggagaa cgaggagtgc tccatcgtta acttcaagcc tgagtgcgtg 2460

tgcaaggaga acctgaagaa gaacaacaag ggcgagtgca tctacgagaa ctcttgcctc 2520

atcaacgagg ggaactgccc caaggactcc aagtgcatct acagggagta caagcctcat 2580

gagtgcgtgt gcaacaagca aggccacgtt gccgtgaacg ggaagtgcgt cctggaggac 2640

aagtgcgttc acaacaagaa gtgcagcgag aactcgatct gcgtcaacgt tatgaacaag 2700

gagcccatct gcgtgtgcac ctacaactac tacaagaagg atggcgtctg cctcatccag 2760

aacccttgcc tgaaggacaa cggcgggtgc tcacgcaact ctgagtgcac cttcaagtac 2820

tcaaagatca actgcacgtg caaggagaac tacaagaaca aggacgattc ttgcgtgccc 2880

aacaccaacg agtacgacga gtcgttcacg ttccaataca acgacgatgc ctcaatcatc 2940

ctcggcgcgt gcgggatgat cgagttctcc tacatctaca accagatcat ctggaagatc 3000

aacaactcca aggagagcta cgttttctac tacgactacc cgaccgccgg caacatcgag 3060

gtgcaaatca agaacgagat cttccatacc atcatctacc tcaagaagaa gatcgggaac 3120

tcagtcatct acgacgattt ccaagttgac caccagacct gcatctacga gaacgtgttc 3180

tactactcca accagaac 3198

<210> 6

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的第720-934位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

<400> 6

tgcgatctgt cttgcccgtc caacaaggtg tgcgtcatcg agaacggcaa gcagacctgc 60

aagtgcagcg agcggttcgt tctggagaac ggcgtgtgca tctgcgctaa cgattacaag 120

atggaggacg ggatcaactg catcgccaag aacaagtgca agagaaagga gtacgagaac 180

atctgcacca accccaacga gatgtgcgct tacaacgagg agacggacat cgtcaagtgc 240

gagtgcaagg agcactacta ccggtcatct agaggcgagt gcatcctcaa cgactactgc 300

aaggatatca actgcaagga gaacgaggag tgctccatcg ttaacttcaa gcctgagtgc 360

gtgtgcaagg agaacctgaa gaagaacaac aagggcgagt gcatctacga gaactcttgc 420

ctcatcaacg aggggaactg ccccaaggac tccaagtgca tctacaggga gtacaagcct 480

catgagtgcg tgtgcaacaa gcaaggccac gttgccgtga acgggaagtg cgtcctggag 540

gacaagtgcg ttcacaacaa gaagtgcagc gagaactcga tctgcgtcaa cgttatgaac 600

aaggagccca tctgcgtgtg cacctacaac tactacaaga aggat 645

<210> 7

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的第648-830位氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 7

tctacatgct atgggaacag atttaattat gattgttttt gtgataatcc ttatatttca 60

aaatatggaa ataaattatg tgaacgtcca aatgattgtg aatctgtttt gtgttcacaa 120

aatcaagttt gtcaaattct tccaaatgat aaattaatat gtcaatgtga agaaggatat 180

aaaaatgtta aaggtaaatg tgttccagac aacaaatgtg atctttcatg cccatcaaac 240

aaagtttgtg ttatcgaaaa tggaaaacaa acatgtaaat gttcagaacg ttttgttcta 300

gagaatggtg tgtgtatatg tgctaatgat tataaaatgg aagatggtat taattgtata 360

gccaaaaata aatgtaaaag aaaagaatat gaaaatattt gtacaaatcc aaatgaaatg 420

tgtgcttata atgaagaaac agatattgta aaatgtgaat gtaaagaaca ttattataga 480

tcatcaagag gtgaatgtat attaaatgat tattgtaaag atattaattg taaagaaaat 540

gaagaatgt 549

<210> 8

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 2的第648-830位氨基酸序列

<400> 8

Ser Thr Cys Tyr Gly Asn Arg Phe Asn Tyr Asp Cys Phe Cys Asp Asn

1 5 10 15

Pro Tyr Ile Ser Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Cys Glu Arg Pro Asn Asp

20 25 30

Cys Glu Ser Val Leu Cys Ser Gln Asn Gln Val Cys Gln Ile Leu Pro

35 40 45

Asn Asp Lys Leu Ile Cys Gln Cys Glu Glu Gly Tyr Lys Asn Val Lys

50 55 60

Gly Lys Cys Val Pro Asp Asn Lys Cys Asp Leu Ser Cys Pro Ser Asn

65 70 75 80

Lys Val Cys Val Ile Glu Asn Gly Lys Gln Thr Cys Lys Cys Ser Glu

85 90 95

Arg Phe Val Leu Glu Asn Gly Val Cys Ile Cys Ala Asn Asp Tyr Lys

100 105 110

Met Glu Asp Gly Ile Asn Cys Ile Ala Lys Asn Lys Cys Lys Arg Lys

115 120 125

Glu Tyr Glu Asn Ile Cys Thr Asn Pro Asn Glu Met Cys Ala Tyr Asn

130 135 140

Glu Glu Thr Asp Ile Val Lys Cys Glu Cys Lys Glu His Tyr Tyr Arg

145 150 155 160

Ser Ser Arg Gly Glu Cys Ile Leu Asn Asp Tyr Cys Lys Asp Ile Asn

165 170 175

Cys Lys Glu Asn Glu Glu Cys

180

<210> 9

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的第648-830位氨基酸序列的小麦密码子优化序列

<400> 9

tccacctgct acggcaacag gttcaactac gactgcttct gcgataaccc atacatcagc 60

aagtacggga acaagctgtg cgagcgcccg aacgattgcg agtccgtgct ctgcagccaa 120

aaccaggtct gccaaatcct cccaaacgac aagctgatct gccagtgcga ggaaggctac 180

aagaacgtga aggggaagtg cgtcccagac aacaagtgcg atctgtcttg cccgtccaac 240

aaggtgtgcg tcatcgagaa cggcaagcag acctgcaagt gcagcgagcg gttcgttctg 300

gagaacggcg tgtgcatctg cgctaacgat tacaagatgg aggacgggat caactgcatc 360

gccaagaaca agtgcaagag aaaggagtac gagaacatct gcaccaaccc caacgagatg 420

tgcgcttaca acgaggagac ggacatcgtc aagtgcgagt gcaaggagca ctactaccgg 480

tcatctagag gcgagtgcat cctcaacgac tactgcaagg atatcaactg caaggagaac 540

gaggagtgc 549

<210> 10

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码SEQ ID NO: 2的第720-934位氨基酸序列的杆状病毒密码子优化序列

<400> 10

tgcgacttgt cttgtccctc aaacaaggtg tgcgtcatcg agaacggaaa gcagacctgc 60

aaatgttccg agaggttcgt gctggaaaac ggagtctgca tttgtgcaaa cgactacaag 120

atggaggatg gtatcaactg cattgccaag aacaagtgta agagaaaaga gtacgaaaac 180

atctgcacca acccaaacga aatgtgcgct tacaacgagg aaactgatat tgtgaagtgc 240

gagtgtaaag aacattacta ccgctccagc cgtggcgagt gcatcctcaa cgactactgc 300

aaggatatta actgtaaaga aaacgaggaa tgctctatcg tcaacttcaa gccggagtgc 360

gtttgtaagg aaaacctgaa gaaaaacaac aagggcgagt gcatctacga aaactcctgt 420

ctcattaacg agggaaactg ccctaaggac agcaaatgta tctaccgcga gtacaagccc 480

cacgaatgcg tctgtaacaa gcaaggtcat gttgctgtga acggcaagtg cgttctggag 540

gataaatgtg tgcacaacaa gaaatgcagt gaaaactcga tctgtgtcaa cgttatgaac 600

aaggagccca tctgtgtctg cacctacaac tactacaaaa aggac 645

Claims (37)

1.由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的多肽。

2.缀合物或杂合体，其包含根据权利要求1所述的多肽和连接于其的携带体。

3.根据权利要求2所述的缀合物或杂合体，其中，所述携带体是病毒颗粒、脂质颗粒、或携带体蛋白质。

4.疟疾疫苗，其包含根据权利要求1所述的多肽。

5.根据权利要求4所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25或Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原、或与所述至少一种疟疾疫苗抗原组合给药。

6.根据权利要求4所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含针对选自脊髓灰质炎、白喉、百日咳和破伤风中的至少一种感染症的疫苗抗原、或与该疫苗抗原组合给药。

7.疟疾疫苗，其包含根据权利要求2所述的缀合物或杂合体。

8.根据权利要求7所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25或Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原、或与所述至少一种疟疾疫苗抗原组合给药。

9.根据权利要求7所述的疟疾疫苗，其中，所述疟疾疫苗进一步包含针对选自脊髓灰质炎、白喉、百日咳和破伤风中的至少一种感染症的疫苗抗原、或与该疫苗抗原组合给药。

10.根据权利要求4所述的疟疾疫苗在制备用于疟原虫的感染预防、疟原虫感染后疟疾的发病预防、或疟疾的治疗的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述疟疾疫苗进一步包含选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25或Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原、或与所述至少一种疟疾疫苗抗原组合给药。

12.根据权利要求10所述的用途，其中，所述疟疾疫苗进一步包含针对选自脊髓灰质炎、白喉、百日咳和破伤风中的至少一种感染症的疫苗抗原、或与该疫苗抗原组合给药。

13.根据权利要求7所述的疟疾疫苗在制备用于疟原虫的感染预防、疟原虫感染后疟疾的发病预防、或疟疾的治疗的药物中的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述疟疾疫苗进一步包含选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25或Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原、或与所述至少一种疟疾疫苗抗原组合给药。

15.根据权利要求13所述的用途，其中，所述疟疾疫苗进一步包含针对选自脊髓灰质炎、白喉、百日咳和破伤风中的至少一种感染症的疫苗抗原、或与该疫苗抗原组合给药。

16.药物组合物，其含有根据权利要求1所述的多肽作为有效成分。

17.药物组合物，其含有根据权利要求2所述的缀合物或杂合体作为有效成分。

18.多核苷酸，其由编码根据权利要求1所述的多肽的核苷酸序列组成。

19.多核苷酸，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸、和连接于其的使根据权利要求18所述的多核苷酸能够在宿主细胞中表达的启动子和/或调控元件。

20.表达载体，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸。

21.表达载体，其包含根据权利要求19所述的多核苷酸。

22.疟疾疫苗，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸。

23.疟疾疫苗，其包含根据权利要求19所述的多核苷酸。

24.疟疾疫苗，其包含根据权利要求20所述的表达载体。

25.疟疾疫苗，其包含根据权利要求21所述的表达载体。

26.用根据权利要求20所述的载体转化的重组宿主细胞。

27.用根据权利要求21所述的载体转化的重组宿主细胞。

28.根据权利要求26所述的重组宿主细胞，其中，所述细胞为细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

29.根据权利要求27所述的重组宿主细胞，其中，所述细胞为细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

30.药物组合物，其含有根据权利要求18所述的多核苷酸作为有效成分。

31.药物组合物，其含有根据权利要求19所述的多核苷酸作为有效成分。

32.药物组合物，其含有根据权利要求20所述的表达载体作为有效成分。

33.药物组合物，其含有根据权利要求21所述的表达载体作为有效成分。

34.根据权利要求4所述的疟疾疫苗，其中所述疟疾疫苗进一步包含佐剂。

35.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物包含佐剂。

36.试剂盒，其包含：

(a)包含根据权利要求1所述的多肽的疟疾疫苗，和

(b)包含佐剂的药物组合物。

37.试剂盒，其包含：

(a)包含根据权利要求1所述的多肽的疟疾疫苗，和

(b)选自CSP、TRAP、MSP1、AMA-1、SERA5、GAMA、EBA175、RH5、Pfs25和Pfs230中的至少一种疟疾疫苗抗原。