JP7311227B2 - 低下した反応源性を有するlpsを含むボルデテラワクチン - Google Patents
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Description
さらに好ましい実施形態では、本発明は、改変された脂質A部分が、式(I):
[式中、X2、X3、X2’、X3’、R2、R3、R2’、及びR3’は、それぞれ独立に、-H、-OH、-Y、-O-(C=O)-CH(OH)-Y、及び-O-(C=O)-Yからなる群から選択され、Yは、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、Yのそれぞれの場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から独立に選ばれる整数である]の構造を有する、本明細書で定義されるボルデテラLPSに関する。
用語「相同性」、「配列同一性」等は、本明細書において同義的に用いられる。配列同一性は、これらの配列を比較することにより決定される通り、2種以上のアミノ酸(ポリペプチド又はタンパク質)配列又は2種以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列の間の関係として本明細書において定義される。当技術分野で、「同一性」はまた、かかる配列の弦線間の一致により決定される通り、場合に応じて、アミノ酸又は核酸配列の間の配列の因果関係の程度を意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列及び第2のポリペプチドの配列への1つのポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。
本発明は、ボルデテラ脂質A部分のアシル鎖の長さを縮小することにより、LPS内毒素性を低下させるという驚くべき発見に関する。本発明は、脂質A部分の3位でアシル鎖の長さを増加させることによって、ボルデテラ種の致死性をもたらすという予期しない知見をさらに開示している。したがって、本発明は、アシルトランスフェラーゼのある特定のサブセットが、ボルデテラ種において用いて、アシル鎖の長さを縮小し、したがって、ボルデテラLPSの内毒素性を低下させることができるということを開示している。
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも1本のアシル鎖の長さがより短く、より短いアシル鎖が、
i)脂質A部分の3’位におけるアシル鎖;
ii)脂質A部分の2’位における第1のアシル鎖;
iii)脂質A部分の2’位における第2のアシル鎖;及び
iv)脂質A部分の2位におけるアシル鎖からなる群から選択されるという点で、野生型ボルデテラLPSの脂質A部分と比較して、改変されている脂質A部分を有するボルデテラLPSに関する。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも1本のアシル鎖の長さがより短く、改変された脂質A部分が、式(I):
[式中、X2、X3、X2’、X3’、R2、R3、R2’、及びR3’は、それぞれ独立に、-H、-OH、-Y、-O-(C=O)-CH(OH)-Y、及び-O-(C=O)-Yからなる群から選択され、
Yは、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、Yのそれぞれの場合が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から独立に選ばれる整数である]の構造を有するという点で、野生型ボルデテラLPSの脂質A部分と比較して、改変されている脂質A部分を有するボルデテラLPSに関する。
熟練した読者には明らかな通り、Yは、X2、X3、X2’、X3’、R2、R3、R2’、及びR3’のそれぞれの場合に異なり得、したがって、Yの複数の異なる場合は、一般式(I)の単一の化合物内で生じ得る。したがって、一般式(I)の好ましい化合物では、
X2は、-H、-OH、-YX2、-O-YX2、-O-(C=O)-CH(OH)-YX2、及び-O-(C=O)-YX2からなる群から選択され、YX2は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;X2は、-OH又は-O-(C=O)-YX2であることが好ましく、X2は、-OHであることが最も好ましく;
X3は、-H、-OH、-YX3、-O-YX3、-O-(C=O)-CH(OH)-YX3、及び-O-(C=O)-YX3からなる群から選択され、YX3は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;X3は、-OH又は-Hであることが好ましく、X3は、-OHであることが最も好ましく;
X2’は、-H、-OH、-YX2’、-O-YX2’、-O-(C=O)-CH(OH)-YX2’、及び-O-(C=O)-YX2’からなる群から選択され、YX2’は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;X2’は、-OH、-O-(C=O)-CH(OH)-YX2’、又は-O-(C=O)-YX2’であることが好ましく、X2’が、-O-(C=O)-YX2’である場合、nは、1、3、5、7、9、11、又は13から選ばれる整数であることが好ましく、nは、11又は13であることがより好ましく、nは、13であることが最も好ましく、X2’が、-O-(C=O)-CH(OH)-YX2’である場合、nは、2、4、6、8、10、又は12から選ばれる整数であることが好ましく、nは、10又は12であることがより好ましく、nは、12であることが最も好ましく;X2’は、-O-(C=O)-YX2’であることが最も好ましく、nは、13であり;
X3’は、-H、-OH、-YX3’、-O-YX3’、-O-(C=O)-CH(OH)-YX3’、及び-O-(C=O)-YX3’からなる群から選択され、YX3’は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;X3’は、-OH又は-O-(C=O)-YX3’であることが好ましく、X3’が、-O-(C=O)-YX3’である場合、nは、1、3、5、7、9、11、13又は15から選ばれる整数であることが好ましく、nは、13又は15であることがより好ましく、nは、15であることが最も好ましく;X3’は、-OHであることが最も好ましく;
R2は、-H、-OH、-YR2、-O-YR2、-O-(C=O)-CH(OH)-YR2、及び-O-(C=O)-YR2からなる群から選択され、YR2は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;R2は、YR2であることが好ましく;nは、1、3、5、7、9、又は11から選ばれる整数であることが好ましく、nは、9又は11であることがより好ましく、nは、11であることが最も好ましく;R2は、YR2であることが最も好ましく、nは、11であり;
R3は、-H、-OH、-YR3、-O-YR3、-O-(C=O)-CH(OH)-YR3、及び-O-(C=O)-YR3からなる群から選択され、YR3は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;R3は、YR3であることが好ましく、nは、1、3、5、7、9、11、又は13から選ばれる整数であることが好ましく、nは、7、9、又は13から選ばれる整数であることがより好ましく、nは、7であることが最も好ましく;R3は、YR3であることが最も好ましく、nは、7であり;
R2’は、-H、-OH、-YR2’、-O-YR2’、-O-(C=O)-CH(OH)-YR2’、及び-O-(C=O)-YR2’からなる群から選択され、YR2’は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;R2’は、YR2’であることが好ましく、nは、1、3、5、7、9、又は11から選ばれる整数であることが好ましく、nは、9又は11であることがより好ましく、nは、11であることが最も好ましく;R2’はYR2’であることが最も好ましく、nは、11であり;
R3’は、-H、-OH、-YR3’、-O-YR3’、-O-(C=O)-CH(OH)-YR3’、及び-O-(C=O)-YR3’からなる群から選択され、YR3’は、一般式-(CH2)n-Hのアルキル部分であり、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から選ばれる整数であり;R3’は、YR3’であることが好ましく、nは、1、3、5、7、9、又は11から選ばれる整数であることが好ましく、nは、7又は11であることがより好ましく、nは、11であることが最も好ましく;R3’は、YR3’であることが最も好ましく、nは、11であり;
一般式(I)の化合物が、-YX2、-YX3、-YX2’、又は-YX3’を含む場合、nは、奇数であることが好ましく、5、7、9、11、13、又は15であることがより好ましく、11又は13であることが最も好ましい。一般式(I)の化合物が、-YR2、-YR3、-YR2’、又は-YR3’を含む場合、nは、奇数であることが好ましく、3、5、7、9、11、又は13であることがより好ましく、7又は11であることが最も好ましい。
一般式(II)の好ましい化合物では、nは、YR3’の場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11であり;nは、YR3’の場合、5、7、又は9であることがより好ましく;nは、YR3’の場合、7又は9であることがさらにより好ましく;nは、YR3’の場合、7であることが最も好ましい。一般式(III)の好ましい化合物では、nは、YR3’の場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11であり;nは、YR3’の場合、5、7、又は9であることがより好ましく;nは、YR3’の場合、7又は9であることがさらにより好ましく;nは、YR3’の場合、7であることが、最も好ましい。
第2の態様では、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌に関する。細菌は、好ましくは、上記で定義した改変された脂質A部分を有するLPSを含む。遺伝子改変細菌は、LPSを含むことができ、その総LPSのうちの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80又は90%は、本明細書で定義される改変された脂質A部分を有する。或いは、その総LPSのうち100%は、本明細書で定義される改変された脂質A部分を有する。
第3の態様では、本発明は、本明細書で定義されるボルデテラLPSを含むOMVに関する。例えば、ワクチンにおける使用のための、OMV(「blebs」としても公知である)は、界面活性剤抽出(dOMV精製プロセス)により従来から調製されており、例えば、デオキシコラート等の界面活性剤が用いられて、LPSを除去し、ベシクル放出を増加させる。細胞の超音波処理によって調製されたOMV調製、及びミョウバンアジュバントと組み合わせたDOCによる処置は、マウスモデルにおける百日咳の誘発に対する保護を提供し[Roberts、R.、Vaccine 2008年、26巻、4639~4646]、これは、全-細胞ワクチンの効果に匹敵した。PagL-脱アシル化された改変されたLPSを含有するOMVの別のバージョンによって、保護及びより低い反応源性が示され、後者は、体重増加及びサイトカイン誘導によりin vivoで決定される[Asensio、C.J.、Vaccine 2011年、29巻、1649~1656]。パラ百日咳菌OMVによる別の興味深い知見は、百日咳及びパラ百日咳に対するこれらの交差防御であった[Bottero、D.Vaccine 2013年、31巻、5262~5268]。
第4の態様では、本発明は、上記で本明細書において定義されるボルデテラLPS、遺伝子改変細菌及びOMVのうちの少なくとも1種を含む組成物に関する。本組成物は、医薬組成物であることが好ましい。医薬組成物は、当技術分野で通常どおり公知である、薬学的に許容される添加剤、担体、培地又は送達ビヒクルをさらに含むことがより好ましい(例えば、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」、Roweら編、第7版、2012年、www.pharmpress.comを参照のこと)。薬学的に許容される安定化剤、浸透物質、緩衝剤、分散化剤等はまた、医薬組成物に取り込むことができる。好ましい形態は、所期の投与のモード及び治療への適用に依存する。医薬用担体は、患者に送達するのに適した、任意の適合性の、非毒性物質となり得る。「本発明の有効成分」は、上記の本明細書で定義されるボルデテラLPS、遺伝子改変細菌又はOMVのうちの1種又は複数であることが、本明細書において理解される。
第5の態様では、本発明は、医薬品としての使用のための、上記で本明細書で定義されるボルデテラLPS、遺伝子改変細菌及びOMVのうちの少なくとも1種を含む組成物に関する。したがって、別の表現でいうと、本発明は、本発明のボルデテラLPS、本発明の遺伝子改変細菌、本発明のOMV、及び本発明の医薬組成物のうちの少なくとも1種の医薬品としての使用に関する。本発明は、さらに、上記で本明細書で定義されるボルデテラLPS、遺伝子改変細菌及びOMVのうちの少なくとも1種を用いた処置の方法に関する。
更なる実施形態は以下のとおりである。
[実施形態1]
少なくとも1本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラLPSの脂質A部分と比較して、改変されている脂質A部分を有するボルデテラLPS。
[実施形態2]
改変された脂質A部分の3位におけるアシル鎖の長さが、同じ3位における野生型ボルデテラ脂質A部分のアシル鎖よりも大きい長さを有さず、改変された脂質A部分の3位におけるアシル鎖の長さが、C 10 より大きくないことが好ましく、改変された脂質A部分の3位におけるアシル鎖の長さが、同じ3位における野生型ボルデテラ脂質A部分のアシル鎖と同じ長さであることがより好ましく、3位におけるアシル鎖の長さが、C 10 であることが好ましい、実施形態1に記載のボルデテラLPS。
[実施形態3]
改変された脂質A部分の3位におけるアシル鎖の長さが、3’位におけるアシル鎖の長さと同じである、実施形態1又は実施形態2に記載のボルデテラLPS。
[実施形態4]
より短いアシル鎖が、
i)脂質A部分の3’位におけるアシル鎖;
ii)脂質A部分の2’位における第1のアシル鎖;
iii)脂質A部分の2’位における第2のアシル鎖;及び
iv)脂質A部分の2位におけるアシル鎖からなる群から選択される、実施形態1~3のいずれか1つに記載のボルデテラLPS。
[実施形態5]
アシル鎖が、C原子が少なくとも2、4又は6個短く、
及び/又は、改変された脂質A部分を除き、LPSが、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌の構造を有し、LPSが、改変された脂質A部分を除き、百日咳菌の構造を有することが好ましく、
及び/又は改変された脂質A部分が、式(I):
[式中、X 2 、X 3 、X 2 ’、X 3 ’、R 2 、R 3 、R 2 ’、及びR 3 ’は、それぞれ独立に、-H、-OH、-Y、-O-(C=O)-CH(OH)-Y、及び-O-(C=O)-Yからなる群から選択され、Yは、一般式-(CH 2 ) n -Hのアルキル部分であり、nは、Yのそれぞれの場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15から独立に選ばれる整数である]の構造を有する、実施形態1~4のいずれか1つに記載のボルデテラLPS。
[実施形態6]
実施形態1~5のいずれか1つに記載のボルデテラLPSを含む、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌。
[実施形態7]
細菌が、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、
異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変が、異種LpxA、LpxL及びLpxDアシルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも1種を、細胞に与えることが好ましく、
遺伝子改変が、異種lpxA、lpxL、及びlpxD遺伝子のうちの少なくとも1種の発現を導入することがより好ましく、
i)lpxA遺伝子が、配列番号1と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するLpxAアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し;
ii)lpxL遺伝子が、配列番号2と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するLpxLアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し;及び/又は
iii)lpxD遺伝子が、配列番号4と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するLpxDアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、
及び/又は改変された細菌が、内因性lpxA遺伝子及び/又は内因性lpxD遺伝子によりコードされたLpxA及び/又はLpxDアシルトランスフェラーゼの活性を減少させる又は除去する遺伝子突然変異をさらに含む、実施形態6に記載の遺伝子改変細菌。
[実施形態8]
細菌が、異種UDP-2,3-ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変が、異種lpxH遺伝子の発現を導入することが好ましく、lpxH遺伝子が、配列番号5と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するLpxHをコードするヌクレオチド配列を有することがより好ましく、
及び/又は細菌が、遺伝子改変百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であり、遺伝子改変細菌が、遺伝子改変百日咳菌であることが好ましく、百日咳菌B213株であることが最も好ましく、
及び/又は細菌が、脂質A3-O-デアシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変を有する、実施形態6又は実施形態7に記載の遺伝子改変細菌。
[実施形態9]
実施形態6~8のいずれか1つに記載の遺伝子改変細菌から取得可能である、実施形態1~5のいずれか1つに記載のボルデテラLPS。
[実施形態10]
実施形態1~5及び9のいずれか1つに記載のボルデテラLPSを含むOMVであって、実施形態6~8のいずれか1つに記載の遺伝子改変細菌から取得可能であることが好ましい、OMV。
[実施形態11]
実施形態1~10のいずれか1つに記載の、ボルデテラLPS、遺伝子改変細菌及びOMVのうちの少なくとも1種を含む、組成物。
[実施形態12]
医薬品としての使用のための、実施形態11に記載の組成物。
[実施形態13]
免疫応答が、ボルデテラ感染症、好ましくは、百日咳菌感染症に対して誘導される又は刺激されることが好ましく、
及び/又は処置が、百日ぜき(whooping cough)の予防又は処置であることが好ましく、
及び/又は組成物が、薬学的に許容される添加剤をさらに含む医薬組成物である、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための、実施形態11に記載の組成物。
[実施形態14]
実施形態6~8のいずれか1つに記載の細菌を含む全細胞ワクチンであり、細菌が、不活性化されることが好ましい、実施形態12又は実施形態13に記載の組成物。
[実施形態15]
実施形態1~5及び9のいずれか1つに記載のボルデテラLPS、又は実施形態10に記載のOMVを含む無細胞ワクチンであり、及び/又は少なくとも1種の非ボルデテラ抗原をさらに含む、実施形態12又は実施形態13に記載の組成物。
材料及び方法
プラスミド、菌株及び増殖条件
表1では、本試験に用いられるすべてのプラスミド及び菌株を示す。百日咳菌株を、15%ヒツジ脱線維血(Biotrading)が補充されたBordet-Gengou寒天(Difco)で35℃で48h培養した。液体培養中で細菌を増殖させるために、細菌を、固形培地から収集し、OD5900.05までVerweij培地[16]に希釈し、125ml角培地ボトル中で175rpmで絶え間なく振とうしながら、インキュベートした。いくつかのアッセイにおいて、細菌を、60℃で1hインキュベートすることにより、不活性化させ、PBSに再懸濁し、OD5900.5に調整した。大腸菌株を、37℃で溶原性ブロス(LB)又はLB寒天中で増殖させた。
PCRを、High Fidelity Polymerase(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を用いて行った。PCRミックスは、鋳型DNA1μl、200μM dNTPs(Fermentas)、異なるプライマーの組合せ(配列番号7~24、表2を参照のこと)0.25μM、0.5U DNAポリメラーゼ、及びPCR緩衝液からなる。これらの混合物を、DNA変性のために95℃で10分間インキュベートし、その後、95℃で1分、58℃で0.5分及び72℃で期待される増幅産物サイズkbp当たり1分での伸長の30サイクルでインキュベートした。反応を、72℃で10分間拡張された伸長ステップによって終了した。得られた産物を、電気泳動により1%アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを用いて可視化した。
RNAを得るために、指数関数的に増殖する培養から得られた細胞を、OD5504に調整した、Eppendorf Centrifuge 5424において5000rpmで10分間遠心することにより収集し、トリゾール(Invitrogen、U.K.)に再懸濁させた。次いで、トリゾール1ml当たり、クロロホルム200μlを加え、その後、5000rpmで30分間遠心した。得られた上層を、氷冷75%エタノールの等量で混合した。次いで、RNAを、Nucleospin RNA II kit(Macherey-Nagel、U.S.A.)を用いて、製造業者の指示に従って、単離した。得られた溶液を、Turbo DNA free(Ambion、Germany)で37℃で1h処理して、ゲノムDNAを除去し、その後、製造業者の推奨に従ってDNase不活性化を行って、純粋なRNAを生成した。これを、直ちに用いて、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche、The Netherlands)を用いてcDNAを生成した。RNA、cDNA及び染色体DNAを、PCRにおいて、プライマー(表2を参照のこと、配列番号7~24、26及び27)により鋳型として用いて、特異的な転写物の発生を決定した。
全細胞ライセートを、OD6005.0に調整して二重強度(double-strength)サンプル緩衝液に1:1で可溶化し、100℃で10分間加熱した。LPSを可視化するために、沸騰後、全細胞ライセートを、37℃で1hの間プロテイナーゼKで処理した。タンパク質及びLPSを、14%及び16%アクリルアミドゲルでそれぞれ分離し、その後、これらを、クマシーブリリアントブルーG250又は銀染色でそれぞれ染色した。
LPSを、熱フェノール-水(Westphal、1965年)で細菌から抽出し、C8逆相カートリッジにおける固相抽出(SPE)によりさらに精製した。簡単にいうと、細菌を、遠心により培養懸濁液から収集し、水で70℃で懸濁し、同じ温度でフェノール0.8体積で混合した。遠心により水相及びフェノール相を分離した後、水相を、1体積の0.356M酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH7)(溶媒A)及び1/3体積の2-プロパノール:水:トリエチルアミン:酢酸(70:30:0.03:0.01、v/v)(pH8.9)(溶媒B)を加えることにより、SPEのために調製した。LPS抽出物を、20-ポジションバキュームマニホルド(Waters)を用いた逆相Sep-Pak C8カートリッジ(3mlシリンジバレルタイプVacカートリッジ、C8樹脂200mg、Waters)におけるSPEにより同時に精製した。カートリッジを、溶媒B3×1ml、2-プロパノール:水:トリエチルアミン:酢酸(10:90:0.03:0.01、v/v)(pH8.9)(溶媒C)、0.07mM TEAA(pH7)(溶媒D)及び溶媒Aを減圧下で連続的に適用することにより、SPEのために条件付けした。次いで、サンプルを、カートリッジに添加し、各カートリッジを、溶媒A、D及びC3×1mlのこの順序で洗浄した。LPSを、溶媒B2×0.3mlを適用することにより、カラムから溶出した。溶出液を、遠心真空濃縮器(centrifugal vacuum concentrator)において乾燥し、水に懸濁した。精製したサンプルの純度及び完全性を、LPS銀及びクマシー染色と合わせたトリシン-SDS-PAGEにより判断した。脂質A構造の分析について、精製されたLPSの負イオンナノ-エレクトロスプレーイオン化-フーリエ変換質量分析(ナノESI-FT-MS)を、LTQ Orbitrap XL機器(Thermo Scientific)において行った。LPSサンプルを、2-プロパノール、水及びトリエチルアミンの混合物(50:50:0.001、体積/体積/体積)(pH8.5)に溶解し、前述の通り(Pupoら、2014年)、金でコーティングされたプルドガラスキャピラリー(pulled glass capillary)を用いて、ナノ-ESIにより、質量分析計に注入した(Kondakov、A.、and Lindner、B.(2005年)Structural characterization of complex bacterial glycolipids by Fourier transform mass spectrometry.Eur J Mass Spectrom(Chichester、Eng)11巻、535~546頁)。スプレー電圧を、-1.2kV及び加熱したキャピラリーの温度を250℃に設定した。これらのイオン化条件下で、LPSの断片化はあまり生じなかった。脂質A質量スペクトルを記録するために、LPSのナノESI-FT-MSを、電位差100Vでインソースの衝突によって誘導された解離(CID)で行った。この設定下のインソースCIDは、未変化の脂質Aドメインに対応する強いフラグメントイオンを生成し、これは、野生型B213株の脂質Aの質量スペクトルに示す通り(図3a)、最小の脂質Aの断片化を有する、非還元脂質AグルコサミンとKdoとの間の不安定な連結の破損から生じる。
MD-2及びCD14と組み合わせた、ヒト又はマウスTLR4のいずれかで形質移入されたヒトNF-κB/SEAPレポーターHEK293細胞を、InvivoGenから購入した。両方の細胞株は、NF-κB-誘導性分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP:secreted embryonic alkaline phosphatase)レポーター遺伝子を含有し、これは、TLRシグナル伝達後に発現する。これらの細胞を、先に記載した通り、HEK-Blue培養培地中で増殖した[19]。SEAPを、基質クワンティ-ブルー(Quanti-Blue)(InvivoGen)を加えた後、培養上清中で検出した。ヒト単核球細胞株MonoMac6(MM6;DSMZ)を、10%熱失活FCS、50U/mlペニシリン、及び50μg/mlストレプトマイシンが補充されたIscoveのダルベッコ改変培地(IMDM;Gibco)中で増殖させた。すべての細胞株を、5%飽和CO2雰囲気中で37℃で培養した。
百日咳菌における異種LpxL及びLpxAの発現
百日咳菌脂質Aにおける、3及び3’位における第1のアシル鎖及び第2のアシル鎖のみの長さを改変するために、本発明者らは、他の細菌から得られたLpxA及びLpxLアシルトランスフェラーゼを使用した。百日咳菌脂質Aは、それぞれ3及び3’位において、3OH-C10及び3OH-C14鎖を含有する(図1A)。本発明者らは、髄膜炎菌(LpxA(Nm))又は緑膿菌(LpxA(Pa))から得られた対応する酵素によるLpxAの置換が、アシル鎖の改変をもたらすか否かを調査した。同様に、本発明者らは、ポルフィロモナス・ジンジバリス(LpxL(Pg))又は髄膜炎菌(LpxL(Nm))から得られた、対応する酵素による百日咳菌のLpxLの置換が、アシル鎖の改変をもたらすか否かを調査した。
次いで、脂質A構造を、1mM IPTGの存在下で12h増殖させた細胞全体から抽出した精製されたLPSを用いて、ナノ-ESI-MSにより分析した(対数増殖)。野生型株について、主なピークを、期待されたビス-リン酸化ペンタ-アセチル化脂質Aと対応する、m/z1557.97で観察した(図3a)。LpxA(Pa)を発現する株において、スペクトルによって、m/z1557.97におけるイオンの他、m/z1501.91及び1529.94における2個の追加のイオンが明らかになった(図3b)。m/z1501.91におけるイオンは、3OH-C10による3’位における第1の3OH-C14アシル鎖の置換と対応し(図1C)、m/z1529.94イオンによって、長さが中間のC12鎖である、ヒドロキシル化された脂肪酸の存在が示される。2つの新種の相対的な存在量は、m/z1557.97における野生型構造に対して、48及び75%に過ぎず、これは、染色体における内因性lpxAの発現によるものとなり得る。したがって、本発明者らは、染色体lpxAコピーをノックアウトすることを決定した。得られた菌株のMS分析によって、m/z1557.97イオンの完全な喪失及び置換に対応するm/z1501.91の主なピークを残すm/z1529.94イオンの存在量の大幅な減少が証明された(図1C及び図3c)。
次に、本発明者らは、変更された構造が、LPSの毒性に影響を与えるか否か調査した。この目的を達成するために、精製されたLPS調製を、ヒト又はマウスTLR4複合体(それぞれ、hTLR4及びmTLR4)を発現するHEK293細胞の培養に加えた。曝露後、受容体の活性化を、レポーター遺伝子の発現により評価した(図4)。興味深いことに、B213-pLpxA(Pa)から得られたLPSは、野生型株から得られたLPSよりもhTLR4をそれほど刺激しなかった(図4A)。さらに検出した残りの活性化は、この遺伝子の不活性化後に完全に除去されたため、染色体lpxA遺伝子の発現によるものであった(図4A)。したがって、3’位における第1のアシル鎖の長さは、百日咳LPSによるhTLR4の活性化に関連する。B213-pLpxL(Nm)及びB213-pLpxL(Pg)から得られたLPSは、それぞれ、hTLR4活性化を減少させ、増加させた(図4A)。したがって、hTLR4の刺激は、C16>C14>C12の順序で第2のアシル鎖の長さと相関する。
これらの反応源性は、サブユニットワクチンによる全細胞百日咳ワクチンの置換をもたらしているが、十分な保護を実現していない。新たな、反応源性が少ない全細胞ワクチンの開発によって、解決策が提供され得る。LPSは、かなりの程度まで、細胞の百日咳ワクチンの毒性の原因である[2]。本試験において、本発明者らは、百日咳菌脂質Aにおけるアシル鎖の長さの改変によって、毒性を低下させ得るかどうかを調査した。本発明者らは、異種LpxA及びLpxLアシルトランスフェラーゼの発現により、3’位における第1のアシル鎖の長さ及び2’位における第2のアシル鎖の長さを改変した。本発明者らは、両方のアシル鎖の長さの短縮によって、LPS毒性が大幅に低下したことを見出した(図4)。
実施例2
lpxD(Pa)及びlpxA(Pa)LPS突然変異によって、ウサギにおける発熱性の低下が示される
百日咳菌突然変異は、緑膿菌から得られたlpxA及びlpxD遺伝子の異種発現によるこれらのLPSにおける変更された脂質A部分によって構成された。詳細には、百日咳菌B1917株は、構成され、染色体lpxA遺伝子又はlpxD遺伝子は、対応する緑膿菌バージョンで置換された。両方の場合では、これによって、質量分析により示される通り、期待された短縮されたアシル鎖を有するLPSが合成された。
1.ビヒクル対照(食塩水)
2.参照ワクチン(acP)
3.ワクチン1:B1917 nOMV ompA prn
4.ワクチン2:B1917 nOMV ompA prn lpxD
5.ワクチン3:B1917 LPS lpxD
6.ワクチン4:B1917 LPS lpxA
7.ワクチン5:B1917 LPS野生型
体温の統計的に有意な上昇が、ワクチン1(注射の1,2及び4h後)及びワクチン5(注射の4h後)により示される。精製されたLPSでは、野生型により誘導されるが、lpxD及びlpxA突然変異により誘導されない明白な発熱ピークがある。OMVでは、野生型及びlpxD突然変異についてのより長期間の発熱があるが、後者の方が、低い。OMVが、LPSの他に、他の発熱性構成成分を含有するため、これは、期待されるものである。
これらのデータによって、野生型ボルデテラの脂質A部分と比較して、少なくとも1本のアシル鎖の長さがより短い、脂質A部分を有する突然変異ボルデテラLPSは、ウサギにおいて発熱性を明らかに低下させることを示すということが実証される。したがって、TLR4を発現するHEK細胞による上記の観察されるin vitroデータは、これらのin vivoデータによって実証される。
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Claims (6)
- 少なくとも1本のアシル鎖の長さがより短いという点で、遺伝子改変されていないボルデテラ属細菌のLPSのリピドA部分と比較して、改変されたリピドA部分を有する改変ボルデテラLPSであって、
前記改変されたリピドA部分が、一般式(I)
[式中、
X 3 ’、X 3 及びX 2 は、-OHであり、
X 2 ’は、-O-(C=O)-Yであり、
R 3 ’、R 2 ’、R 3 及びR 2 は、-Yであり、
Yは、一般式-(CH 2 ) n -Hのアルキル部分であり、
X 2’ 中のY中のnは、1~13から選ばれる整数であり、
R 3’ 中のY中のnは、1~11から選ばれる整数であり、
R 2’ 中のY中のnは、1~11から選ばれる整数であり、
R 3 中のY中のnは、1~7から選ばれる整数であり、
R 2 中のY中のnは、1~11から選ばれる整数であり、
ただし、
X 2’ 中のY中のnは、1~12から選ばれる整数である;
R 3’ 中のY中のnは、1~10から選ばれる整数である;
R 2’ 中のY中のnは、1~10から選ばれる整数である;
R 3 中のY中のnは、1~6から選ばれる整数である;及び/又は
R 2 中のY中のnは、1~10から選ばれる整数である]
で表される、改変ボルデテラLPS。 - 前記改変ボルデテラLPSは、前記改変されたリピドA部分を除いて、前記遺伝子改変されていないボルデテラ属細菌のLPSと同じ構造を有する、請求項1に記載の改変ボルデテラLPS。
- 前記改変されたリピドA部分の3位におけるアシル鎖の長さが、C 10である、請求項1又は2に記載の改変ボルデテラLPS。
- 前記改変されたリピドA部分の3位におけるアシル鎖の長さが、3’位におけるアシル鎖の長さと同じである、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変ボルデテラLPS。
- より短いアシル鎖が、
i)前記改変されたリピドA部分の3’位におけるアシル鎖;
ii)前記改変されたリピドA部分の2’位における第1のアシル鎖;
iii)前記改変されたリピドA部分の2’位における第2のアシル鎖;及び
iv)前記改変されたリピドA部分の2位におけるアシル鎖からなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の改変ボルデテラLPS。 - 前記遺伝子改変されていないボルデテラ属細菌が、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌である、請求項1~5のいずれか一項に記載の改変ボルデテラLPS。
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