JP2022527206A - 侵入プラスミド抗原ｂの最適化された無細胞合成、および関連する組成物、および使用方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、精製されたシャペロンタンパク質ＩｐｇＣの無細胞合成混合物への外部添加を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌に関連する侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）抗原を合成するための無細胞方法を提供する。本開示は、無細胞合成中に組み込まれた非天然アミノ酸を含むＩｐａＢ抗原変異体をさらに提供し、Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｏ抗原多糖への共有コンジュゲーションを可能にする。さらに、Ｉｐａ Ｂ抗原およびそのコンジュゲート、ならびに合成されたＩｐａＢ抗原およびそのコンジュゲートで調製された免疫原性組成物、ならびに使用方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２日に出願された米国仮出願第６２／８２８，３６４号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＳＴＲＯ＿００７＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３７．６ｋｂで、２０２０年３月２７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

本発明は、概して、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢の予防および治療に関し、より具体的には、高収率でＳｈｉｇｅｌｌａ抗原を合成するための方法、および該Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原を用いて調製される免疫原性組成物に関する。

細菌性赤痢、またはＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌による結腸上皮細胞の侵入によって引き起こされる。Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢は、世界の多くの地域における乳児死亡率の重大な一因であり、また、救援者およびその他の旅行者の間で大流行を引き起こす。４０を超えるＳｈｉｇｅｌｌａ血清型が知られており、Ｏ抗原多糖の多様性に基づいて分類されている。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｙは、主に風土性および流行性赤痢に関与する病原体であると考えられている（Ａｒａｂｓｈａｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ９（１）：１７０－１７７）。

当該技術分野において、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染の治療および予防に適した組成物および方法の必要性がある。

本開示は、これらの課題を克服するための方法および組成物を提供し、したがって、免疫原性組成物ＩｐａＢコンジュゲート、およびＳｈｉｇｅｌｌａ感染の予防および治療における使用方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれた少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原を提供し、ｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される位置で組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、クリックケミストリー反応性基を含む。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐＡＭＦである。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢ抗原は、Ｏ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖（ＯＰＳ）とコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＯＰＳは、血清型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、７ａ、７ｂ、または前述の組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、精製される。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＩｐａＢ抗原を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、ビヒクル、可溶化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、等張剤、緩衝系、分散剤、希釈剤、粘度調整剤、および吸収促進剤から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、滅菌注射液として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥形態で製剤化される。

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原を発現するための方法を提供し、本方法は、外因性ＩｐｇＣシャペロンタンパク質の存在下での無細胞タンパク質合成を使用して、ＩｐａＢポリペプチド抗原を発現することを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、およびＳ．ｓｏｎｎｅｉから選択されるＳｈｉｇｅｌｌａ種を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の野生型ＩｐａＢポリペプチド抗原配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）が、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、２～１０個のｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される１つ以上の位置で組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐＡＭＦである。

いくつかの実施形態では、ＩｐｇＣシャペロンタンパク質は、配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、ＩｐａＢポリペプチド抗原を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、水溶液中に二量体形態で抗原の実質的にすべてを提供する様式で精製される。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、ＩｐａＢポリペプチド抗原に実質的に影響を及ぼすことなく、ＩｐｇＣシャペロンタンパク質を分解するのに有効な洗剤の存在下で精製される。いくつかの実施形態では、洗剤は、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）である。いくつかの実施形態では、ＬＤＡＯは、０．１％ｖ／ｖ以下の量で存在する。

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法によって調製される、精製されたＩｐａＢ抗原を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、筋肉内注射として投与される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、経粘膜的に投与される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、１回投与される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、２回以上投与される。いくつかの実施形態では、対象は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢の症状を呈し、免疫原性組成物は、治療ワクチンとして投与される。

いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢を発症する少なくとも１つのリスク因子を有する。

いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供し、本方法は、対象に、本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用を提供する。

Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌の３型分泌系における侵入プラスミド抗原ＩｐａＢの役割を概略的に示す。 実施例１に記載されるように、ＩｐａＢ ｐＤＮＡの上昇する濃度で無細胞タンパク質発現系を使用して合成された、ＩｐａＢの発現レベルを示す。 実施例２に記載されるように、ＩｐｇＣ ｐＤＮＡが滴定された無細胞タンパク質発現系を使用して合成された、ＩｐａＢの発現レベルを示す。 実施例３に記載されるように、無細胞合成混合物に外部添加される精製されたＩｐａＢタンパク質の上昇する濃度で、無細胞タンパク質発現系を使用して合成された、ＩｐａＢの発現レベルを示す。 実施例４に記載されるように、ＩｐａＢの可溶性収率に対する、増加する量の精製されたＩｐｇＣの外部添加の効果を反映するウェスタンブロット分析である。 図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃも、実施例４で得られた結果を表す。図６Ａは、ＩｐａＢの可溶性収率に対する、増加する量の精製されたＩｐｇＣの外部添加の効果を示す棒グラフおよびオートラジオグラムを提供し、図５に示される結果を裏付ける。図６Ｂは、ＨｉｓＴｒａｐ親和性カラムを使用した溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、洗剤による洗浄の前および後に存在するＩｐａＢおよびＩｐｇＣの相対量を示す。図６Ｃは、溶液中の精製されたＩｐａＢの構造のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析の結果を示す。 実施例５に説明されるように、非天然アミノ酸ｐＡＭＦが効率的に組み込まれる部位を示す、部位特異的スキャニング変異誘発および発現分析の結果を概略的に示す。 実施例５にも記載されるように、ｐＡＭＦが複数の部位で組み込まれたＩｐａＢの無細胞合成後に得られた結果を示す。 ＴＡＭＲＡ標識およびＳａｆｅ Ｂｌｕｅ染色による、３－および４－ｐＡＭＦ含有ＩｐａＢ変異体の発現を示す。 コンジュゲーション後のＩｐａＢ変異体の平均分子量を示す。 ＩｐａＢ、ＩｐａＢ変異体、およびＩｐａＢ－ＯＰＳコンジュゲートに対するヒト血清の反応性を比較する。 図１２Ａ～図１２Ｂは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａでの攻撃後のＩｐａＢ、ＩｐａＢ－ＯＰＳコンジュゲート、およびＣＲＭ－ＯＰＳコンジュゲートを用いた能動免疫化の効果を示す。図１２Ａは、生存率を示す。図１２Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された抗体価を示す。 図１３Ａ～図１３Ｅは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａでの攻撃後のＩｐａＢ、ＩｐａＢ－ＯＰＳコンジュゲート、およびＣＲＭ－ＯＰＳコンジュゲートを用いた免疫化後のさらなる結果を示す。図１３Ａは、経時的な体重の変化を示す。図１３Ｂは、経時的な活動性スコアを示す。図１３Ｃは、経時的な姿勢スコアを示す。図１３Ｄは、経時的な脱水スコアを示す。図１３Ｅは、経時的な毛の状態を示す。

概要
細菌性赤痢は、依然として深刻かつ一般的な疾患である。Ｓｈｉｇｅｌｌａは、水様性下痢を引き起こすことに加えて、赤痢（発熱、痙攣、ならびに便中の血液および／または粘液）の主要な原因である。水様性下痢ではなく赤痢が、小児の成長を遅らせることは、一般的に理解されていない。

Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ１型は、１８９８年に日本で流行性赤痢の原因として発見されたが、それに対する認可されたワクチンも、Ｓｈｉｇｅｌｌａに対する宿主免疫の機構（複数可）に関するコンセンサスもない。ワクチン開発は、次の４つの要因によって妨げられている：（ｉ）血清抗体が免疫を付与しないという考えに至った、非経口で注射された不活化全細胞ワクチンの無効性、（ｉｉ）好適な動物モデルの欠如、（ｉｉｉ）ヒトにおける免疫機構（複数可）の間接的な証拠のみ、および（ｉｖ）実行可能なワクチン候補の製造のための商業的スケールアップを著しく妨げる、従来の細胞ベースの発現系におけるＳｈｉｇｅｌｌａ抗原の発現の課題。

Ｓｈｉｇｅｌｌａによる上皮細胞の侵入は、２３０ｋｂの病原性プラスミド上の３１ｋｂ領域の産物に依存しており、これには、宿主免疫応答の主要な標的をコードするｉｐａオペロン、産物がＩｐａタンパク質の適切な展開に必要な３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を構成するｍｘｉ遺伝子およびｓｐａ遺伝子、ならびに細菌の細胞内移動を方向付ける表面タンパク質をコードするｖｉｒＧ（ｉｃｓＡ）が含まれる（Ｐｉｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４０１－４０８）。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの病原性プラスミドによってコードされる３つのタンパク質が、細胞侵入プロセスの必須エフェクターとして同定されている：侵入プラスミド抗原（Ｉｐａ）Ｂ、Ｃ、およびＤ。

インベイシンＩｐａＢとも称される６２ｋＤａのタンパク質である侵入プラスミド抗原Ｂ（「ＩｐａＢ」）は、Ｔ３ＳＡとの関連において分子注射器装置の遠位端に存在する細孔形成成分を構成する。機能的には、ＩｐａＢは、毒素および病原性因子の細孔形成およびその後の宿主細胞への分泌を促進し、これは部分的には、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に関連する重度の腸炎および出血性下痢を媒介する。ＩｐａＢに対するワクチン接種は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ攻撃のマウスモデルにおける細菌感染の制御において高度に防御的であることが示されており、ＩｐａＢ特異的抗体は、ヒトにおける細菌性赤痢の重症度と負に相関することが示されている。例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｂｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８０（３）：１２２２－１２３１、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｂｅｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８１（１２）：４４７－４４７７、およびＳｈｉｍａｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（２）を参照されたい。期待が非常に大きいにもかかわらず、強力なワクチン候補としてのＩｐａＢの使用は、従来の細胞ベースの異種発現系における抗原の不十分な発現によって制限されてきた。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明の記載にとって特に重要な特定の用語が、以下に定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、単一のポリペプチドだけでなく、組み合わされても組み合わされなくてもよい２つ以上の異なるポリペプチドの組み合わせも指し、「アジュバント（ａｎ ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、単一のアジュバント、ならびに分離していてもよく、または単一の組成物中で組み合わされてもよい２つ以上のアジュバントを指す、などである。

ＩｐａＢ抗原の合成
Ｓｈｉｇｅｌｌａが宿主細胞に定着する能力は、病原体の利益のために細胞機能を変化させるために、細菌タンパク質が宿主細胞内に移行することを可能にする系であるＴ３ＳＳを必要とすることが知られている。Ｓｈｉｇｅｌｌａおよび他のある特定のグラム陰性細菌性生物は、基部または基底小体によって細菌エンベロープ内に固定された３型分泌装置（Ｔ３ＳＡ）を有し、そこから内側ロッドによって基部に連結された針が延在する。Ｔ３ＳＡタンパク質には、基部、内側ロッド、および針を構成する構造タンパク質、宿主細胞中に分泌されるか、またはそうでなければ感染を促進し、かつ／または宿主細胞防御を抑制するプロセスに関与するエフェクタータンパク質、ならびに細菌細胞質中のエフェクタータンパク質に結合し、それらが分解および凝集するのを防ぎ、かつそれらを宿主細胞への注射のために針複合体に向けるシャペロンタンパク質が含まれる。本文脈において、ＩｐａＢは、宿主細胞膜における細孔形成を促進し、したがって毒素および病原性因子の宿主細胞への分泌を促進する働きをするため、エフェクタータンパク質として特徴付けられる。無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）におけるＩｐａＢ発現のレベルを増加させるために本明細書において採用されるシャペロンタンパク質は、ＩｐｇＣである。

いくつかの実施形態では、本開示は、米国特許第９，０４０，２５３号、米国特許第９，６５０，６２１号、およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（３）：４２０－２６（それらすべてが参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、スケーラブルな無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）を使用してＩｐａＢ抗原を合成するための方法を提供する。方法は、２００μｇ／ｍＬ～８００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～７００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～６５０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ～６００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～８００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～７００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～６５０μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ～６００μｇ／ｍＬなどの発現レベル範囲を含む、少なくとも４００μｇ／ｍＬ、少なくとも６００μｇ／ｍＬ、またはそれ以上などの少なくとも２００μｇ／ｍＬのレベルで、ＩｐａＢ抗原の強化された発現をもたらすように最適化される。方法は、ＩｐａＢ／ＩｐｇＣ結合相互作用を有するものとして、文献で特徴付けられているＩｐａＢのためのＴ３ＳＳシャペロンタンパク質であるＣＦＰＳ系へのＩｐｇＣの外部添加を伴う。Ｂｉｒｋｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：８１２８－３７、およびＬｏｋａｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（５１）：３９９６５－７５を参照されたい。ＩｐａＢ抗原の上記の発現レベルは、文献において報告されているＩｐａＢの収率とは際立って対照的であり、例えば、Ｐｉｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８：４０１－４０８は、わずか１．２５μｇ／ｍＬ～２．５μｇ／ｍＬと同等の１．６Ｌ当たり２ｍｇ～４ｍｇの収率を達成している。

方法は、無細胞タンパク質合成を使用してポリペプチド抗原を発現するための改善された方法として特徴付けられ得、改善は、外部添加され、精製されたシャペロンタンパク質ＩｐｇＣの存在下でＩｐａＢ抗原を合成することを伴い、すなわち、ＩｐｇＣは、ＣＦＰＳ混合物に添加される。本明細書の実施例で確立されるように、ＩｐｇＣを無細胞合成混合物に添加することは、上述のように、ＩｐｇＣの非存在下での無細胞合成と比較して、かつ確実に従来の細胞ベースの異種発現系における抗原発現に関して、得られたＩｐａＢ発現レベルを大幅に強化する。いくつかの実施形態では、ＩｐｇＣシャペロンタンパク質は、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐｇＣシャペロンタンパク質アミノ酸配列は、配列番号８を含むか、またはそれからなる。

ＩｐａＢ抗原
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法に従って合成されたＩｐａＢポリペプチド抗原を提供する。「ポリペプチド」という用語は、１つ以上のアミノ酸で構成される任意の構造を含むことが意図され、したがって、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリペプチド断片、およびタンパク質を含む。ポリペプチドの全部または一部を形成するアミノ酸は、２０個の従来型の天然に存在するアミノ酸、すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）、ならびに従来型アミノ酸の異性体および修飾などの非従来型アミノ酸、例えば、Ｄ－アミノ酸、非タンパク性アミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素的に修飾されたアミノ酸、β－アミノ酸、アミノ酸を模倣するための構築物または構造（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、β－アラニン、ナフチルアラニン、３－ピリジルアラニン、４－ヒドロキシプロリン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、およびノル－ロイシン）、および例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらの米国特許第５，６７９，７８２号に記載されるような他の非従来型アミノ酸のうちのいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、二次抗原、例えば、多糖へのコンジュゲーションを可能にする官能基を有する１つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、（ａ）天然に存在し得る、（ｂ）化学合成によって産生され得る、（ｃ）組換えＤＮＡ技術によって産生され得る、（ｄ）より大きい分子の生化学的もしくは酵素的断片化によって産生され得る、（ｅ）上記に列挙された方法（ａ）～（ｄ）の組み合わせから生じる方法によって産生され得る、または（ｆ）以下に記載される無細胞タンパク質合成などの、ペプチドを産生するための任意の他の手段によって産生され得る。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ０３９４５）、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１８０１１）、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８ＫＸＴ４）、またはＳ．ｓｏｎｎｅｉ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ３ＹＴＱ２）などのＳｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の野生型ＩｐａＢ抗原配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の野生型ＩｐａＢポリペプチド抗原配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

ポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」、「配列相同性パーセント」、および「配列相同性」という用語は、配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴＰまたはスミス・ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを使用して測定された、所与の長さ（比較ウィンドウ）にわたる最大一致性について比較およびアライメントされた場合に同一であるか、または同一であるアミノ酸残基（またはヌクレオチド）の特定の割合を有する２つ以上の配列を指す。本文脈において、配列相同性パーセントは、ポリペプチドの完全長にわたって、または一部分のみにわたって決定されてもよい。配列相同性パーセントを計算するための一方法は、そのデフォルトが３の語長（Ｗ）、ｌ ０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスに設定されるＢＬＡＳＴＰプログラムであり、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい。配列アライメントおよび配列同一性％の例示的な決定は、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いる。配列同一性を計算するこれらの好ましい方法が、異なる量をもたらす場合、より高い配列同一性をもたらす方法が優先する。「実質的に相同」という用語は、少なくとも約５０％、したがって例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、および１００％を含む所定の長さ（例えば、ポリペプチドのｘ個のアミノ酸）にわたる配列相同性パーセントを指す。

５８０個のアミノ酸残基を含有する６２，１６０Ｄａのタンパク質であるＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来の野生型ＩｐａＢポリペプチド抗原の全配列が、配列番号１に提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である。

ＩｐａＢポリペプチド抗原は、選択された部分が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌による感染に対する治療的または予防的免疫原性応答を引き起こす能力を有するポリペプチド断片をもたらす限り、完全長ＩｐａＢタンパク質またはＩｐａＢタンパク質の一部分であってもよい。通常、これらの免疫原性部分または完全タンパク質の断片は、長さが少なくとも２０個のアミノ酸残基である。所望の免疫原性特性が維持されるという条件で、ＩｐａＢポリペプチド抗原の長さは、設計選択の問題であり、完全長タンパク質を含むそれ以下の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアミノ酸残基であり得る。ＩｐａＢポリペプチド抗原は、それが対応する天然タンパク質の正確なコピーではない場合がある。例えば、最大同一性または相同性パーセントを計算するためにＩｐａＢ抗原配列の外側として処理され得るＮ末端メチオニルは、開始コドンの付加が原因でしばしば存在する。有用な免疫原性特性が保持されるという条件で、付加、欠失、および置換（しばしば、保存的置換）も生じ得る。動物またはヒトにおける日常試験は、本明細書に記載されるように合成されたＩｐａＢポリペプチド抗原が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌による感染に対する治療的または予防的免疫原性応答を引き起こすかどうかを容易に実証することができる。

ＩｐｇＣシャペロンの存在下でのＩｐａＢ抗原の無細胞合成に続いて、ＩｐａＢ抗原は、好適な親和性カラム（例えば、ＨｉｓＴｒａｐ親和性カラム）および洗剤洗浄へのＣＦＰＳ合成混合物の適用によって容易に精製され得る。洗剤は、ＩｐｇＣを選択的に分解するが、ＩｐａＢに影響を与えないように選択されなければならない。方法は、実施例４に説明され、図６Ｃに示されるように、水溶液（例えば、緩衝液）中に二量体形態でＩｐａＢ抗原の実質的にすべてを提供する。好適な洗剤の一例は、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）であるが、当業者であれば理解するように、他の機能的に同等な洗剤が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＤＡＯは、０．１％ｖ／ｖ以下の濃度で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＤＡＯは、約０．００１％ｖ／ｖ、約０．００２％ｖ／ｖ、約０．００３％ｖ／ｖ、約０．００４％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ、約０．００６％ｖ／ｖ、約０．００７％ｖ／ｖ、約０．００８％ｖ／ｖ、約０．００９％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ、約０．０２％ｖ／ｖ、約０．０３％ｖ／ｖ、約０．０４％ｖ／ｖ、約０．０５％ｖ／ｖ、約０．０６％ｖ／ｖ、約０．０７％ｖ／ｖ、約０．０８％ｖ／ｖ、約０．０９％ｖ／ｖ、または約０．１％ｖ／ｖの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、本開示は、精製されたＩｐａＢポリペプチド抗原を提供する。本明細書で使用される場合、「精製された」という用語が分子に関連して使用される場合、精製される分子の濃度が、その自然環境中の分子の濃度と比較して増加したことを意味する。この用語はまた、分子が反応産物として生成された反応混合物からの化学的に合成された分子の精製を指し得る。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語が分子に関連して使用される場合、この用語は、分子がその天然環境から除去されたことを意味する。例えば、生体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されている。単離部分は、天然環境から、または非自然環境（例えば、組換え発現、無細胞発現、化学合成など）から分離されたかどうかにかかわらず、好ましくは、少なくとも約１％純粋、５％純粋、１０％純粋、２０％純粋、３０％純粋、４０％純粋、５０％純粋、６０％純粋、７０％純粋、８０％純粋、９０％純粋、９５％純粋、もしくは９９％純粋であるか、またはそれらは、１００％純粋であり得る。本明細書で使用される場合、「％純粋」という用語は、対象となる分子から構成される組成物の重量パーセントを示す。

ＩｐａＢ抗原へのｎｎＡＡの組み込み：
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）残基は、無細胞合成中にＩｐａＢ抗原に組み込まれる。ＣＦＰＳ中にｎｎＡＡ残基を組み込むために使用される方法は、米国特許公開第２０１８／０３３３４８４Ａ１号（ＳｕｔｒｏＶａｘ，Ｉｎｃ．）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳述されている。ｎｎＡＡ組み込みの目的は、ＩｐａＢ抗原上に化学的「ハンドル」を提供することであり、これは、好ましくは、「クリックケミストリー」反応（２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、または「ｐＡＭＦ」、およびアルキン官能化多糖のような、アジド官能化ｎｎＡＡ間で生じるものなど）を通して、Ｏ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖（ＯＰＳ）への共有コンジュゲーションを促進する。ｎｎＡＡ置換ＩｐａＢ抗原のＣＦＰＳ合成は、実施例５に記載される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のｎｎＡＡが、クリックケミストリー反応性基を含む。本明細書において、「クリックケミストリー反応性基」は、第２のクリックケミストリー反応性基とクリックケミストリー反応を受けることができる、アジドまたはアルキンなどの部分を指す。いくつかの実施形態では、１つのクリックケミストリー反応性基が、第２のクリックケミストリー反応性基と反応して、置換トリアゾールを形成する。このタイプのクリック反応の例は、例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２６２２９号で見ることができる。生物医学的用途で使用される無金属クリック反応の一般的な例は、例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，１０，７８３５－７８５１で見ることができる。クリックケミストリー反応性基を含むｎｎＡＡの例には、（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－４－アジドブタン酸、２－アジド－３－フェニルプロピオン酸、２－アミノ－３－アジドプロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、および２－アミノ－５－アジドペンタン酸が含まれる。

いくつかの実施形態では、１つ以上のｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、２～１０個のｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡが組み込まれる部位は、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡが組み込まれる部位は、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される。特定の部位で組み込まれたｎｎＡＡの特定は、ｎｎＡＡの指定された位置での指定されたアミノ酸の置き換えを指す。例えば、位置Ｋ２８９でｎｎＡＡを組み込むことは、位置２８９に存在するリジン残基がｎｎＡＡによって置き換えられることを意味する。

１つ以上のｎｎＡＡを含む例示的なＩｐａＢポリペプチド抗原のアミノ酸配列が、以下の表１に提供される。Ｘ＝ｎｎＡＡ組み込み部位
表１：例示的なＩｐａＢ抗原

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩｐａＢポリペプチド抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

ＩｐａＢ－多糖コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩｐａＢポリペプチド抗原は、多糖にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、多糖は、Ｏ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖（ＯＰＳ）である。リポ多糖（ＬＰＳ）のＯＰＳドメインは、Ｓｈｉｇｅｌｌａの必須の病原性因子および防御抗原の両方である。いくつかの実施形態では、ＯＰＳは、血清型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、７ａ、７ｂ、またはそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、ＯＰＳ多糖は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌培養物または細菌ストックから精製される（実施例６を参照されたい）。そのような精製方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ２０１０／０４９８０６、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０２００９０号、およびｖａｎ Ｓｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．，２０１４，１５（６），７２９－７４０を参照されたい。いくつかの実施形態では、コンジュゲート多糖は、合成多糖である。多糖合成の方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｒｏｎｔ．，２０１９，６，３５８９－３５９６を参照されたい。いくつかの実施形態では、コンジュゲート多糖は、ＩｐａＢ抗原へのコンジュゲーションを促進するために、クリックケミストリー反応性基で修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲート多糖は、ジベンゾシクロオクチン－アミン（ＤＢＣＯ）またはＤＢＣＯ－ＰＥＧ（例えば、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＮＨ_２）で修飾される。

免疫原性組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＩｐａＢ抗原を含む免疫原性組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫応答、液性または細胞性免疫応答のいずれか、および好ましくは両方を誘発する抗原（例えば、ポリペプチド）の能力を指す。好ましい実施形態では、対象は、新たな感染に対する耐性が強化され、かつ／または疾患の臨床的重症度が低減されるような、「有効量」または「免疫学的有効量」の本明細書の免疫原性組成物の投与に対する治療的または防御的な免疫応答のいずれかを示す。免疫応答は通常、感染に関連する少なくとも１つの症状の軽減または除去によって示される。

いくつかの実施形態では、ＩｐａＢ抗原は、ＯＰＳ多糖にコンジュゲートされる。免疫原性組成物は、１つ以上の賦形剤をさらに含み得る。賦形剤は、「薬学的に許容される」免疫学的および薬理学的に不活性な成分である。本明細書の「薬学的に許容される」成分は、（１）望ましくない重大な生物学的影響を引き起こすことなく、または製剤の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、対象に投与される免疫原性組成物中に含まれ得る、および（２）Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって作成されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔに提示された基準を満たし、かつ好ましくは、「Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ」（「ＧＲＡＳ」）と指定されてもいる成分である。本明細書に記載される免疫原性組成物に組み込まれる賦形剤（複数可）のタイプは、部分的には、選択された投与方法、および特定の製剤タイプまたは剤形、例えば、注射用液体製剤、鼻腔内スプレー製剤などに依存し、投与方法および対応する製剤は、以下に考察される。しかしながら、概して、本明細書に記載される免疫原性組成物に有利に組み込まれ得る不活性成分としては、ビヒクル、可溶化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、等張剤、緩衝系、分散剤、希釈剤、粘度調整剤、吸収促進剤、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される不活性添加剤についての徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で入手可能である。

免疫原性組成物はまた、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染および／または病原性因子に対する抗体応答も誘導する抗原、またはＳｈｉｇｅｌｌａ生物以外の病原体に向けられる抗原などの追加の抗原を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、対象に投与するための滅菌製剤として、例えば、懸濁液、溶液、または使用前に再水和される凍結乾燥形態として提供される。

いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含む。

アジュバント：
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、免疫原性組成物中の１つ以上の抗原に対する免疫応答を増強するための１つ以上のアジュバントをさらに含む。本製剤への組み込みに適したワクチンアジュバントは、関連するテキストおよび文献に記載されており、当業者には明らかであろう。本明細書の例示的なアジュバントには、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのミョウバンベースの塩が含まれる。

代表的な主要アジュバント群は、以下のとおりである。

無機塩アジュバント：リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、および硫酸アルミニウムなどのミョウバンベースのアジュバント、ならびにカルシウム、鉄、およびジルコニウムのリン酸塩、水酸化物塩、および硫酸塩などの他の無機塩アジュバントを含む。

サポニン製剤：ＱｕｉｌｌａｉａサポニンＱｕｉｌ ＡおよびＱｕｉｌ Ａ由来サポニンＱＳ－２１、ならびにコレステロール、リン脂質、およびサポニンの混合時に形成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含む。

細菌由来および細菌関連アジュバント：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓなどのグラム陰性細菌由来の細胞壁ペプチドグリカンおよびリポ糖類、例えば、Ｌｉｐｉｄ Ａ、モノホスホリルＬｉｐｉｄ Ａ（ＭＰＬＡ）、他のＬｉｐｉｄ Ａ誘導体および模倣体（例えば、ＲＣ５２９）、腸内細菌リポ多糖（「ＬＰＳ」）、ＴＬＲ４リガンド、ならびにトレハロースジミコール酸（「ＴＤＭ」）を含むが、これらに限定されない。

ムラミルペプチド：Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（「ＭＤＰ」）、ならびにＭＤＰ類似体および誘導体、例えば、トレオニル－ＭＤＰおよびノル－ＭＤＰなど。

油性アジュバント：水中油（Ｏ／Ｗ）および油中水（Ｗ／Ｏ）エマルション、例えば、スクアレン－水エマルション（例えば、ＭＦ５９、ＡＳ０３、ＡＦ０３）、完全フロイントアジュバント（「ＣＦＡ」）、および不完全フロイントアジュバント（「ＩＦＡ」）を含む。

リポソームアジュバント：ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ヒドロキシ酪）酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなどの生分解性ポリマーおよび非毒性ポリマーから形成されるミクロスフェアアジュバント。

ヒト免疫調節剤：サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２）、インターフェロン（例えば、インターフェロン－γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子を含む。

生体接着剤および粘膜接着剤：例えば、キトサンおよびその誘導体、ならびにエステル化ヒアルロン酸およびミクロスフェア、または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体。

イミダゾキノロン化合物：イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその相同体、例えば、レシキモドを含む。

ＴＬＲ－９アゴニスト：例えば、Ｈｓｐ９０およびメチル化されていないＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ １０（４）：４９９－５１１を参照されたい）。ならびに

炭水化物アジュバント：イヌリン由来アジュバント、ガンマイヌリンおよびアルガムリン、ならびに他の炭水化物アジュバント、例えば、グルカン、デキストラン、レンチナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、およびキシランを含む、グルコースおよびマンノースベースの多糖を含む。

投与および使用
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染のリスクを低減するための方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を予防的に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための方法を提供し、本方法は、対象に、有効量の本明細書に記載される免疫原性組成物を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象におけるＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染のリスクを低減するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象におけるＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染のリスクを低減するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための薬剤の製造における、本明細書に記載される免疫原性組成物の使用が本明細書に提供される。

本明細書において、「対象」という用語は、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒツジ、非ヒト霊長類、またはヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８歳以上である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、１８歳未満である。

方法は、治療的な、すなわち、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に罹患する対象を治療するための、免疫原性組成物の投与を伴い得る。方法はまた、予防的な免疫原性組成物の投与を伴い得、例えば、本方法が、対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染を発症するリスクを低減することを意味する。免疫原性組成物が予防的に使用される場合、対象は、場所、清浄水へのアクセス制限、混雑した状態下での生活などを含む、いくつものリスク因子の結果として、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染にかかりやすい場合がある。

免疫原性組成物の「免疫学的有効量」または「有効量」は、単回投与または一連の２回以上の投与の一部のいずれかとして、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢を治療または予防するのに有効である量である。投与される量は、対象の全体的な健康および身体状態、対象の年齢、関連抗体を合成する対象の免疫系の能力、組成物の形態（例えば、注射用液体、鼻腔用スプレーなど）、および投与を監視する医師に既知の他の要因を含む、いくつかの要因によって変化する。

「治療すること」という用語は、目的が感染を低減または除去することである、免疫原性組成物の投与による治療的処置を指す。例えば、「治療すること」は、感染に直接影響を及ぼすこと、感染を抑制すること、阻害すること、および排除すること、ならびに感染の重症度を低減すること、感染の発症を遅らせること、および／または感染に関連する症状を低減することを含み得る。文脈が別途明確に指示または暗示しない限り、「治療すること」という用語は、「予防すること」（または予防もしくは予防的処置）を包含し、「予防すること」は、対象が感染を発症するリスクを低減すること、症状の発症を遅らせること、感染の再発を予防すること、または感染の発症の予防することを指し得る。

本明細書において、「防御免疫応答」という用語は、対象における抗Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗体応答を誘発することを包含する。本明細書に記載される免疫原性組成物の投与後に生成される抗体価は、当該技術分野において既知の手段によって、例えば、免疫化された対象由来の血清試料のＥＬＩＳＡアッセイによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、治療された対象において抗体応答を誘発し、生成された抗体は、複数の（すなわち、２つ以上の）Ｓｈｉｇｅｌｌａ血清型に結合する。

免疫原性組成物の投与は、任意の有効な全身送達方法を使用して実行され得る。組成物は通常、静脈内、筋肉内、腹腔内、間質、または皮下注射を含む注射によって非経口的に投与され、注射は、歯肉でもあり得、この場合、免疫原性組成物は、歯肉に直接注射される。組成物はさらに、鼻腔内、舌下、経口腔、膣内、または直腸内経路を介してなど、経粘膜的に投与されてもよい。しかしながら、他の投与方法も想定され、本発明は、この点で限定されない。一例として、他の投与方法には、経口および経皮送達、ならびに吸入を介した、または皮下インプラントを使用した投与が含まれる。

投与方法は、免疫原性組成物を含む製剤または剤形のタイプを大きく決定付ける。非経口投与のために製剤化された組成物には、滅菌水溶液および非水溶液、懸濁液、ならびにエマルションが含まれる。注射用水溶液は、水溶性形態の活性薬剤を含有する。非水性溶媒またはビヒクルの例には、オリーブ油およびトウモロコシ油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコールなどの合成親水性ポリマー、リポソームなどが挙げられる。非経口製剤はまた、可溶化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、等張剤、緩衝系、分散剤、希釈剤、粘度調整剤、吸収促進剤、およびそれらの組み合わせなどの賦形剤を含有してもよい。注射用製剤は、滅菌剤の組み込み、細菌保持フィルターを通した濾過、照射、または熱によって滅菌される。それらはまた、滅菌注射用媒体を使用して製造され得る。免疫原性組成物またはその個々の成分はまた、注射を介した投与の直前に好適ななビヒクルで再水和され得る乾燥形態、例えば、凍結乾燥形態であってもよい。

経粘膜的経路のうち、鼻腔内投与は必ずしもではないが概して好ましい。鼻腔内投与された免疫原性組成物を含む鼻腔内製剤は、当該技術分野において既知であり、ＦＤＡのＧｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｎａｓａｌ Ｓｐｒａｙ ａｎｄ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓを参照して製剤化されなければならない。鼻腔内製剤は、スプレー、鼻腔内注射、または点滴薬としての投与のための液体、すなわち、溶液、エマルション、懸濁液などであり、上記のアジュバントおよび薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。製剤中の抗原のサイズが比較的大きいため、鼻腔内経路を介した全身送達は、免疫原性組成物中に経粘膜吸収促進剤を組み込むことを必要とする。好適な経粘膜吸収促進剤の例としては、アルキルサッカライド、シクロデキストリン、およびキトサンが挙げられるが、これらに限定されず、Ｍａｇｇｉｏ（２０１４）Ｊ．Ｅｘｃｉｐ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５（２）：１００－１２、およびＭｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３６：４１－５７を参照されたい。促進剤の濃度は、免疫学的有効量の製剤が効率的な輸送速度で鼻粘膜を通過し、体循環に入ることを確実にするように選択される。鼻腔内免疫原性組成物の組成および性質を決定付ける様々な解剖学的および生理学的な検討事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｕｒｏｒａ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＆ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２（７）によって考察されている。

他の投与方法および対応する製剤としては、速溶性錠剤などの速溶性剤形を用いた舌下投与、口腔パッチまたは他の口腔送達システムを使用した経口腔投与、ペッサリー、軟膏、またはクリームを使用した膣内投与、坐薬、軟膏、またはクリームを使用した直腸内送達、経皮パッチまたは製剤を使用した経皮投与、注射インプラントまたはペレットを用いた皮下投与、乾燥粉末経肺製剤を使用した吸入、および錠剤、カプセルなどの経口剤形を使用した経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書の初めで示唆したように、免疫原性組成物は、適切な投与レジメンとの関連において対象に投与される。組成物は、１回、または長期間にわたって２回以上間隔を置いて投与されてもよい。例えば、最初の「プライム」投与の後に、少なくとも１回の「ブースト」投与が続いてもよい。プライム投与とその後のブースト投与との間の、およびブースト投与間の時間間隔は通常、約２～約２４週間の範囲、より典型的には２～８週間、３～６週間など、約２～１２週間の範囲である。投与方法、例えば、筋肉内注射、歯肉注射、鼻腔内投与などにかかわらず、ワクチンの単回投与の体積は概して、約１μＬ～約５００μＬの範囲、典型的には約１μＬ～約２５０μＬの範囲、より典型的には約２．５μＬ～約２００μＬの範囲、および好ましくは約５μＬ～約１５０μＬの範囲である。免疫原性組成物中の全抗原の濃度は、上記の用量体積ガイドラインから作用する単位体積当たりの組成物の免疫学的有効用量に対応することが理解されるであろう。

使用を容易にするために、本発明の免疫原性組成物は、自己投与または医師による投与のための説明書を含む、包装された製品または「キット」に組み込まれ得る。キットには、典型的には、免疫学的に有効である単回投与事象に適切な「単位用量」である、免疫原性組成物の１回分を収容する密封容器が含まれる。ワクチンは、液体形態であってもよく、したがって、注射などとして投与する準備ができていてもよく、または例えば、凍結乾燥製剤の水和、不活性成分の活性化などの、投与前に調製プロセスを実施することをユーザに要求する別の形態であってもよい。キットはまた、第１の容器にプライム用量、および１つ以上の追加の容器にブースト用量を有する２つ以上の密封容器、または第１の容器にＳｈｉｇｅｌｌａ免疫原性組成物、および別の容器にＳｈｉｇｅｌｌａ感染と関連していても関連していないくてもよい別の感染に向けられたワクチンを含んでもよい。

本発明が多数の特定の実施形態と併せて説明されてきたが、前述の説明ならびに以下の実験セクションは、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。この点に関して、本発明の基本的理解に必要であるよりも詳細に本発明の詳細を示そうとする試みは行われず、図面および／または実施例と併せた説明は、本発明がどのように実際に具現化され得るかを当業者に明らかにする。本開示は、適用法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正物および同等物を含む。さらに、本明細書に記載される本発明の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈上明らかな矛盾がない限り、本開示によって包含される。

さらなる番号付けされた実施形態
本開示によるさらなる番号付けされた実施形態は、以下のように提供される。

実施形態１．ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれた少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原であって、ｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される位置で組み込まれる、侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原。

実施形態２．ｎｎＡＡが、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる、実施形態１に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態３．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態４．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態５．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態６．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態７．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態８．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態９．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１０．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１１．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１２．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１３．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態２に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１４．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１５．ｎｎＡＡが、クリックケミストリー反応性基を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１６．ｎｎＡＡが、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態１５に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１７．ｎｎＡＡが、ｐＡＭＦである、実施形態１６に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１８．Ｏ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖（ＯＰＳ）にコンジュゲートされた、実施形態１～１７に記載のＩｐａＢ抗原。

実施形態１９．ＯＰＳが、血清型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、７ａ、７ｂ、または前述の組み合わせから選択される、実施形態１８に記載のＩｐａＢポリペプチド抗原。

実施形態２０．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、精製される、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のＩｐａＢポリペプチド抗原。

実施形態２１．実施形態１～２０のいずれか１つに記載のＩｐａＢ抗原を含む、免疫原性組成物。

実施形態２２．少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、実施形態２１に記載の免疫原性組成物。

実施形態２３．少なくとも１つの賦形剤が、ビヒクル、可溶化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、等張剤、緩衝系、分散剤、希釈剤、粘度調整剤、および吸収促進剤から選択される、実施形態２２に記載の免疫原性組成物。

実施形態２４．アジュバントをさらに含む、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

実施形態２５．滅菌注射液として製剤化された、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

実施形態２６．凍結乾燥形態で製剤化された、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。

実施形態２７．Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原を発現するための方法であって、外因性ＩｐｇＣシャペロンタンパク質の存在下での無細胞タンパク質合成を使用して、ＩｐａＢポリペプチド抗原を発現することを含む、方法。

実施形態２８．Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌が、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、およびＳ．ｓｏｎｎｅｉから選択されるＳｈｉｇｅｌｌａ種を含む、実施形態２７に記載の方法。

実施形態２９．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の野生型ＩｐａＢポリペプチド抗原配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２７または実施形態２８に記載の方法。

実施形態３０．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２７または実施形態２８に記載の方法。

実施形態３１．少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）が、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、実施形態２７に記載の方法。

実施形態３２．少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、実施形態３１に記載の方法。

実施形態３３．２～１０個のｎｎＡＡが、ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、実施形態３１に記載の方法。

実施形態３４．ｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される１つ以上の位置で組み込まれる、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３５．ｎｎＡＡが、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態３６．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態３７．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の方法。

実施形態３８．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態３９．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載の方法。

実施形態４０．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態４１．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態４０に記載の方法。

実施形態４２．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態４３．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態４２に記載の方法。

実施形態４４．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態４５．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の方法。

実施形態４６．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、実施形態３１に記載の方法。

実施形態４７．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態４４に記載の方法。

実施形態４８．ｎｎＡＡが、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態３１～４４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態４９．ｎｎＡＡが、ｐＡＭＦである、実施形態４８に記載の方法。

実施形態５０．ＩｐｇＣシャペロンタンパク質が、配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２７～４９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５１．ＩｐａＢポリペプチド抗原を精製することをさらに含む、実施形態２７～５０のいずれかに記載の方法。

実施形態５２．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、水溶液中に二量体形態で抗原の実質的にすべてを提供する様式で精製される、実施形態５１に記載の方法。

実施形態５３．ＩｐａＢポリペプチド抗原が、ＩｐａＢポリペプチド抗原に実質的に影響を及ぼすことなく、ＩｐｇＣシャペロンタンパク質を分解するのに有効な洗剤の存在下で精製される、実施形態５２に記載の方法。

実施形態５４．洗剤が、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）である、実施形態５３に記載の方法。

実施形態５５．ＬＤＡＯが、０．１％ｖ／ｖ以下の量で存在する、実施形態５４に記載の方法。

実施形態５６．実施形態２７～５５のいずれか１つに記載の方法によって調製される、精製されたＩｐａＢ抗原。

実施形態５７．Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための方法であって、対象に、有効量の実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。

実施形態５８．Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

実施形態５９．Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための薬剤の製造における、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

実施形態６０．免疫原性組成物が、筋肉内注射として投与される、実施形態５７に記載の方法、または実施形態５８もしくは実施形態５９に記載の使用。

実施形態６１．免疫原性組成物が、経粘膜的に投与される、実施形態５７に記載の方法、または実施形態５８もしくは実施形態５９に記載の使用。

実施形態６２．免疫原性組成物が、１回投与される、実施形態５７に記載の方法、または実施形態５８もしくは実施形態５９に記載の使用。

実施形態６３．免疫原性組成物が、２回以上投与される、実施形態５７に記載の方法、または実施形態５８もしくは実施形態５９に記載の使用。

実施形態６４．対象が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢の症状を呈し、免疫原性組成物が、治療ワクチンとして投与される、実施形態５７に記載の方法、または実施形態５８もしくは実施形態５９に記載の使用。

実施形態６５．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための方法であって、対象に、有効量の実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。

実施形態６６．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

実施形態６７．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための薬剤の製造における、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

実施形態６８．対象が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢を発症する少なくとも１つのリスク因子を有する、実施形態６５に記載の方法、または実施形態６６もしくは実施形態６７に記載の使用。

実施形態６９．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導する方法であって、対象に、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。

実施形態７０．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

実施形態７１．対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための薬剤の製造における、実施形態２１～２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物の使用。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般的に理解される意味を有する。実践者は、特にＧｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ９９）（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２０１２）、およびＰｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３）が指示される。組換え核酸の生成、生体分子のクローニング、活性化、および誘導体化、タンパク質およびペプチドの精製および特定のための適切な分子技術、ならびに他の関連技術の例は、Ｆａｉｒｍａｎらの米国特許公開第ＵＳ２０１８／０３３３４８４Ａ１号（ＳｕｔｒｏＶａｘ，Ｉｎｃ．）（すでに参照により組み込まれている）にも記載および／または列挙されている。本明細書に記載される生体分子の非経口投与に必要な技術および構成要素の例については、開業医は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（２０１２）が指示される。無細胞タンパク質合成のための方法は、Ｓｐｉｒｉｎ ＆ Ｓｗａｒｔｚ（２００８）Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにも記載されている。無細胞合成を使用したタンパク質への非天然アミノ酸の組み込みのための方法は、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７３，４１３３－４１４０、Ｃｈｏｎｇ（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０８：１６．３０．１－１１、およびＦａｉｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（上記に列挙）に記載されている。

実施例１：ＩｐａＢの無細胞合成
ＩｐａＢ（配列番号１）を、Ｓｕｔｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）によって提供される細胞非タンパク質合成（ＣＦＰＳ）抽出物中で発現した。抽出物の特徴および調製は、他の刊行物に記載されている。この場合、概して、Ｚａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８（７）：１５７０－１５７８に記載されるように、抽出物を調製した。無細胞タンパク質合成反応における最終濃度は、３５％（体積で）の細胞抽出物、５μＭのＲＮＡシンテターゼ（「ＲＳ」）、２ｍＭのＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、８ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、３５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭのＡＭＰ、それぞれ０．８６ｍＭのＧＭＰ、ＵＭＰ、およびＣＭＰ、２ｍＭのアミノ酸（チロシンおよびフェニルアラニンについての０．５ｍＭを除く）、４ｍＭのシュウ酸ナトリウム、１ｍＭのプトレシン、１．５ｍＭのスペルミジン、１５ｍＭのリン酸カリウム、ならびに１００ｎＭのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであった。ＩｐａＢをコードするプラスミドＤＮＡの添加によって、無細胞合成反応を開始した。

反応物を、４８ウェルＦｌｏｗｅｒプレート（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ＃ＭＴＰ－４８－Ｂ）において、６５０ｒｐｍの振盪器上で１４時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、反応物を、精製または分析のために処理するまで４℃で保持した。無細胞タンパク質合成反応の後、ＩｐａＢを含有する混合物を、９６ウェルプレート（ＤｙＮａ Ｂｌｏｃｋ（商標）、２ｍＬ、Ｌａｂｎｅｔ、Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）に移し、４０℃で１５分間、５０００×ｇで遠心分離した。

遠心分離の前および後のＣＦＰＳ混合物の試料を収集し、Ｋｉｒｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４９（３）：５９９－６０７に記載されるような１４Ｃロイシン組み込み方法を使用して分析して、可溶性タンパク質（遠心分離後の試料）および全タンパク質（遠心分離前の試料）の量を評価した。結果は、図２のグラフに（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果と共に）示され、これは、ｐＤＮＡ用量の関数としてのＩｐａＢ発現を示す。図に見られるように、可溶性タンパク質レベルは、すべてのＩｐａＢ ｐＤＮＡ濃度で２００μｇ／ｍＬを超えたが、発現レベルは、１μｇ／ｍＬを超えるｐＤＮＡ濃度で停滞しているように見えた。

実施例２：ＩｐｇＣ ｐＤＮＡ滴定を用いたＩｐａＢの無細胞合成
異なる濃度で無細胞合成混合物にＩｐｇＣ ｐＤＮＡを滴定して、実施例１の手順を繰り返した。添加したＩｐｇＣ ｐＤＮＡの異なる濃度で発現されたＩｐａＢのレベルを、前と同様に、^１４Ｃロイシン組み込み方法を使用して評価した。結果は、図３に示される。図に示されるように、ＩｐｇＣ ｐＤＮＡ滴定は、無細胞合成系におけるＩｐａＢ発現にマイナスの影響を与え、ＩｐｇＣ ｐＤＮＡの濃度が上昇し、その結果、ＩｐａＢ発現のレベルが低下した。

実施例３：ＩｐｇＣタンパク質滴定を用いたＩｐａＢの無細胞合成
実施例１の手順を繰り返したが、精製されたＩｐｇＣタンパク質を異なる濃度で無細胞合成混合物に外部添加した。添加したＩｐｇＣの異なる濃度で発現されたＩｐａＢのレベルを、前と同様に、^１４Ｃロイシン組み込み方法を使用して評価した。結果は、図４に示される。図に表される分析は、実施例１で得られた結果と比較して、ＩｐｇＣ用量依存的にＩｐａＢ発現の顕著な増加を示す。

実施例４：ＩｐａＢ、精製、および特徴付けの発現スケールアップ
ヒスチジンタグ付きＩｐａＢを、室温において１０ｃｍのペトリ皿で、増加する量の精製されたＩｐｇＣタンパク質で発現した。α－ｈｉｓ６西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用したウェスタンブロット分析（図５）は、増加する量の精製されたＩｐｇＣの外部添加が、ＩｐａＢの可溶性収率の同時増加を促進し、最大用量でペレットから沈殿したタンパク質をほぼ完全に回収したことを示した。この結果は、図６Ａの棒グラフおよびオートラジオグラムにも示される（ここで、「ＦＬ－ＩｐａＢ」は、配列番号１の完全長ＷＴ ＩｐａＢタンパク質を表す）。

精製されたＩｐｇＣを外部添加したＩｐａＢの無細胞合成の後、ＩｐａＢは、洗剤洗浄を使用してＩｐｇＣを除去することによって精製され得る。図６Ｂは、ＨｉｓＴｒａｐ親和性カラムを使用した溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析であり、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）の３０％ストックからの０．１％（ｖ／ｖ）による洗浄の前および後に存在するＩｐａＢおよびＩｐｇＣの相対量を示す。

この結果得られる精製されたＩｐａＢの構造を、多角度光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）を使用して溶液中で評価した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析の結果は、図６Ｃに示され、ＩｐａＢが主に、約１１１．５ｋＤａの分子量で二量体として存在することを示す。

実施例５：非天然アミノ酸が組み込まれたＩｐａＢの無細胞合成
配列番号１のＩｐａＢ抗原配列へのｎｎＡＡ ２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（「ｐＡＭＦ」）の組み込み：部位特異的スキャニング変異誘発および発現分析を、実質的にＺｉｍｍｅｒｍａｎらの米国特許公開第ＵＳ２０１６／０２５７９４６Ａ１号およびＦａｉｒｍａｎらの同第ＵＳ２０１８／３３３４８４Ａ１号（両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実行して、ｎｎＡＡの組み込みのための部位の特定を助けた。結果は、ｐＡＭＦ組み込みが、ＩｐａＢのコア内のいくつかの個々の部位において、特に、Ｋ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２において非常に効率的であったことを示した。図７を参照されたい。これらの部位から、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の６つの個々の部位を選択し、経験的に組み合わせて、３つのｐＡＭＦ（それぞれ、ＩｐａＢ変異体１、２、および３、配列番号：２、３、および４）および４つのｐＡＭＦ部位（それぞれ、ＩｐａＢ変異体４、５、および６、配列番号５、６、および７）の２つのセットを生成した。図８のデータは、複数のｐＡＭＦを含有するＩｐａＢの発現が、実施例４で評価され、かつ図６Ａに表されるＷＴ完全長ＩｐａＢの発現と同様であったことを示す。

第２の抗原への共有コンジュゲーションは、米国特許公開第ＵＳ２０１８／３３３４８４Ａ１号に詳述される方法を使用して実行され、実施例８にも記載される。抗原は、血清型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、７ａ、７ｂ、およびそれらの組み合わせから選択されるＯ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖であってもよい。

実施例６：ＯＰＳ精製
ｗｚｚＢを過剰発現するようにｐＳＥＣ１０－ｗｚｚＢプラスミドで形質転換されたＳｈｉｇｅｌｌａ細胞バイオマス中のリポ多糖（ＬＰＳ）から、ＯＰＳを直接採取し、培養ｐＨを氷酢酸で３．５～３．７に低減し、沸騰浴に沈めたガラス瓶中で、１００℃において４時間インキュベートすることによって、増加したＯＰＳ鎖長および発酵の条件成長培地（アミノ酸が補充された）、または振盪フラスコ（ＳＴｍ Ｄ６５）培養物をもたらした。加水分解後の上清を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５冷却遠心分離器中でＧＳ３ローターを使用して、１０ｋ×ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって不溶性物質から分離した。上清画分を１Ｍ ＮａＣｌにし、４．５ｐｓｉの膜間圧（ＴＭＰ）での０．２μｍの中空繊維フィルターを通した接線流精密濾過によって濾過し、全体積を通過させ、続いて等体積の１Ｍ ＮａＣｌで洗い流した。次いで、０．２μｍの取り除かれた１Ｍ ＮａＣｌ透過物を、３０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔ ＴＦＦ膜上で１４ｐｓｉのＴＭＰにおいて１０倍濃縮し、１Ｍ ＮａＣｌの３５ダイアボリューム、続いて５０ｍＭのトリスｐＨ７の１０ダイアボリュームに対して透析濾過した。

次いで、２０ｍＭのトリスｐＨ７、５０ｍＭ ＮａＣｌ中の未透過物画分を、２０ｍＭのトリスｐＨ７、５０ｍＭ ＮａＣｌ中、１０ｍＬ／分のＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒを使用して、直列に連結された３×３ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＮａｎｏＱアニオン交換膜に通した。フロースルー画分を、２５％（ｖ／ｖ）硫酸アンモニウムにし、４℃で一晩インキュベートした。沈殿した物質を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５冷却遠心分離器中でＧＳ３ローターを使用して、１０ｋ×ｇ／４℃で３０分間遠心分離することによって除去し、続いて、０．４５μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐ真空フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を通して濾過した。次いで、濾液を、７．５ｐｓｉのＴＭＰで１０ｋＤａのＨｙｄｒｏｓａｒｔ膜を使用して、Ｓｌｉｃｅ ２００ ＴＦＦを用いたＴＦＦによって１０倍濃縮し、１０ダイアボリュームの脱イオン水に対して透析濾過した。ＴＦＦ未透過物を凍結乾燥し、使用まで－２０℃で保存した。

実施例７：ＩｐｇＣの存在下での複数のｐＡＭＦを含有するＩｐａＢ変異体の無細胞合成
ＩｐａＢ抗原へのｐＡＭＦの複数部位組み込みを、実施例５に記載される方法に従って達成した。ＩｐａＢ ＷＴ（配列番号１、対照）および複数部位ｐＡＭＦ変異体（配列番号２～７）を、実施例４の方法を使用して、１０ｃｍの組織培養プレート中、０．２ｍｇ／ｍＬのＩｐｇＣの存在下で、室温において（２．５μｇ ＤＮＡ／ｍＬ）、一晩発現した。培養物を採取し、精製のために１ｍＬのｈｉｓＴＲＡＰ（商標）親和性カラムに装填した。各２μＬの上清、ペレット、およびフロースルー画分、ならびに１０μＬの溶出画分を収集し、ゲルを流す前に標識化するためにＤＢＣＯ－ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ：５－カルボキシテトラメチルローダミン）とインキュベートした。ゲルを蛍光によって可視化し、Ｓａｆｅ Ｂｌｕｅでも染色した。

３つのｐＡＭＦ残基を含有するＩｐａＢ変異体（変異体１：Ｋ２８９、Ｋ３６７、Ｋ３９５－配列番号２；変異体２：Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６－配列番号３；変異体３：Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５－配列番号４）を、４つのｐＡＭＦ残基を含有するＩｐａＢ変異体（変異体４：Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６－配列番号５；変異体５：Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、Ｋ４７０－配列番号６；変異体６：Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６－配列番号７）に加えて発現および精製した。ＩｐｇＣの存在下でのこれらの変異体の各々の発現は、図９に示される。変異体１は、発現および精製後の溶離液画分からの最も高い回収を示した。

実施例８：ＤＢＣＯ誘導体化ＯＰＳへのＩｐａＢ変異体のコンジュゲーション
ＤＢＣＯ基のシクロオクチン部分を、変異体ＩｐａＢに組み込まれた非天然アミノ酸（ｐＡＭＦ）側鎖のアジド部分と反応させることによって、ＩｐａＢ変異体１（配列番号２）、２（配列番号３）、３（配列番号４）、および４（配列番号５）をＤＣＢＯ誘導体化ＯＰＳにコンジュゲートした。ＤＢＣＯ基とアジド基との間のコンジュゲーション反応のための試料プロトコルは、例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２５（２），３５１－３６１、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７，３０２６（２０１７）、およびＫａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８，５７（５），５１６－５１９で見ることができる。１００ｋＤａの膜を使用した粗コンジュゲートの透析によって、反応混合物から遊離多糖の大部分を除去した。

ＩｐａＢ変異体１～４で生成されたコンジュゲートの分子量は、図１０に示される。透析による精製後、ＩｐａＢ変異体１（配列番号２）のコンジュゲートが、最大の平均分子量（５２９．２０）を有することが観察された。

実施例９：ＩｐａＢおよびＩｐａＢ：ＯＰＳコンジュゲートに対するヒト血清反応性
Ｓｈｉｇｅｌｌａ流行地における個人から得られたヒト血清によるＩｐａＢおよびＩｐａＢ：ＯＰＳコンジュゲートの検出を、ＥＬＩＳＡによって測定した。抗ヒト二次抗体を利用して、以下の実施例１０に概説される一般プロトコルに従ってＥＬＩＳＡを実施した。図１１は、血清濃度の関数としてのＩｐａＢ、ＩｐａＢ変異体１～４、およびＩｐａＢ変異体１～４のＯＰＳコンジュゲートの反応性（ＯＤ_４５０で測定）を示す。４つすべてのコンジュゲート（１～４、配列番号２～５）が、図１１に示されるように、ＩｐａＢおよび変異体ＩｐａＢ単独よりもヒト血清との高い反応性を示した。

実施例１０：マウスの能動免疫化－Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ攻撃
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ攻撃への動物応答に対する、ＩｐａＢ－ＯＰＳ（ＩｐａＢ変異体＃１）、ＣＲＭ－ＯＰＳ、ＩｐａＢ、およびミョウバン対照免疫化の有効性を評価するための実験を実施した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、表２に示されるようにグループ化した。
表２：Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ攻撃のための免疫化群

順応期間後、高精度気化器（Ｍｏｂｉｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ Ｓｙｓｔｅｍ ＶｅｔＥｑｕｉｐ）を通して、１００％ Ｏ_２中４０，０００ｐｐｍ±１５％のイソフルランにおいて、１～２％の維持で投与されるイソフルラン麻酔下で、眼窩後方洞出血によって２００μＬの血液を各マウスから採取した。マウスを、適切な回復のために麻酔の使用後に注意深く監視した。滅菌（７０％エタノール）アプリケータによって適用る耳タグ（７０％エタノールで滅菌された）を、初回採血時に各動物の耳介の中心に配置した。

上記の表２に従って免疫化を筋肉内（ＩＭ）に行った。３回のワクチン接種を１４日間空けて与えた（免疫化１：０日目、免疫化２：１３日目、免疫化３：２１日目）。各ワクチン接種の前および後に採血し、血清を抗体測定のために分離した。３回目のワクチン接種の投与のおよそ４週間後に、約１０μＬの体積中９．５×１０^７ＣＦＵの用量において、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａでマウスを攻撃した。

Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ＬＰＳ、ＩｐａＢ、およびＣＲＭに特異的な血清ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。各抗原に対する希釈標準溶液を次のように調製した：炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６中に希釈された５．０μｇ／ｍＬの精製されたＬＰＳ株２４５７Ｔ、１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４中の０．２μｇ／ｍＬの精製されたＩｐａＢ、１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４中の２．０μｇ／ｍＬの精製されたＣＲＭ。続いて、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ「Ｕ」底部マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ ＃３６５５）を、プレートの各ウェルに１００μＬの適切な希釈標準溶液を添加することによってコーティングした。次いで、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。このインキュベーション後、洗浄の間に２分間の浸漬期間を伴ってＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で６回、プレートを洗浄した。次いで、プレートを、２５０μＬ／ウェルで１０％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を含有する１Ｘ ＰＢＳを用いて、４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを上述のように再度洗浄した。

試験試料および陽性対照を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ １０％ ＮＦＤＭで希釈し、プレートに添加した。検体および陽性対照を、各プレート上で実施される一連の２倍希釈で２回試験した。プレートを、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、上記のようにＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳｅｒａＣａｒｅ ＃５２２０－０４６０）を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ １０％ ＮＦＤＭ中で、１：１０００または１：２０００のそれぞれに希釈した。すべてのウェルは、１００μＬの適切な抗体溶液を受容し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、１００μＬのＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｅｒａＣａｒｅ ＃５１２０－００４７）を各ウェルに添加した。プレートを、撹拌しながら暗所で１５分間、室温においてインキュベートした。１００μＬの１Ｍリン酸をすべてのウェルに添加することによって、比色反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度値を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣＴＭ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して直ちに測定した。

図１２Ａおよび図１２Ｂは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ攻撃の結果を示す。図１２Ａは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａを用いた攻撃後の生存率を示す。ＩｐａＢ－ＯＰＳコンジュゲートで処置したマウスは、ＣＲＭ－ＯＰＳコンジュゲートまたはミョウバン単独で処置したマウスにおける４０％の生存率と比較して、８日後に９０％の生存率を示した。図１２Ｂは、抗ＯＰＳ Ｅｌｉｓａ力価実験を示し、ＩｐａＢおよび出血前対照と対比して、ＩｐａＢ－ＯＰＳコンジュゲートの高い力価レベルを実証する。ＣＲＭ－ＯＰＳコンジュゲートは、堅固な力価を示したが、免疫化後、ＩｐａＢ－ＯＰＳがマウスに与えたのと同じ防御レベルを与えなかった。

図１３Ａ～Ｅは、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉを用いた攻撃後のさらなる結果を示す。ＣＲＭ－ＯＰＳで免疫化されたマウスは、攻撃の８日後に最低平均体重を示した（図１３Ａ）。図１３Ｂ～Ｅは、１～３のスケールで測定された定性的結果を示し、スコアが高いほど、悪化した状態を示す。全体的に、ミョウバンを投与されたマウスは、実験の過程中どの時点でも最も重度のスコアリングを示し（例えば、姿勢および毛の状態について３のスコア）、一方で、ＣＲＭ－ＯＰＳ免疫化マウスは、前に考察した高い死亡率に加えて、攻撃の８日後に最も重度のスコアリングを示した。

参照による組み込み
本明細書に引用されるすべての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、世界の任意の国において、有効な先行技術を構成する、または共通の一般知識の一部を形成するという承認または任意の形態の提案ではなく、かつそのようにみなされるべきではない。

Claims (71)

1. ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれた少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原であって、前記ｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される位置で組み込まれる、侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原。
2. 前記ｎｎＡＡが、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる、請求項１に記載のＩｐａＢ抗原。
3. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
4. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＩｐａＢ抗原。
5. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
6. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＩｐａＢ抗原。
7. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
8. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＩｐａＢ抗原。
9. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
10. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＩｐａＢ抗原。
11. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
12. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＩｐａＢ抗原。
13. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項２に記載のＩｐａＢ抗原。
14. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のＩｐａＢ抗原。
15. 前記ｎｎＡＡが、クリックケミストリー反応性基を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＩｐａＢ抗原。
16. 前記ｎｎＡＡが、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１５に記載のＩｐａＢ抗原。
17. 前記ｎｎＡＡが、ｐＡＭＦである、請求項１６に記載のＩｐａＢ抗原。
18. Ｏ抗原Ｓｈｉｇｅｌｌａ多糖（ＯＰＳ）にコンジュゲートされた、請求項１～１７に記載のＩｐａＢ抗原。
19. 前記ＯＰＳが、血清型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６、７ａ、７ｂ、または前述の組み合わせから選択される、請求項１８に記載のＩｐａＢポリペプチド抗原。
20. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、精製される、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＩｐａＢポリペプチド抗原。
21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載のＩｐａＢ抗原を含む、免疫原性組成物。
22. 少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
23. 前記少なくとも１つの賦形剤が、ビヒクル、可溶化剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、等張剤、緩衝系、分散剤、希釈剤、粘度調整剤、および吸収促進剤から選択される、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
24. アジュバントをさらに含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
25. 滅菌注射液として製剤化された、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
26. 凍結乾燥形態で製剤化された、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
27. Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の侵入プラスミド抗原Ｂ（ＩｐａＢ）ポリペプチド抗原を発現するための方法であって、外因性ＩｐｇＣシャペロンタンパク質の存在下での無細胞タンパク質合成を使用して、前記ＩｐａＢポリペプチド抗原を発現することを含む、方法。
28. 前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌が、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、およびＳ．ｓｏｎｎｅｉから選択されるＳｈｉｇｅｌｌａ種を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌由来の野生型ＩｐａＢポリペプチド抗原配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
31. 少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）が、前記ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、請求項２７に記載の方法。
32. 少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのｎｎＡＡが、前記ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、請求項３１に記載の方法。
33. ２～１０個のｎｎＡＡが、前記ＩｐａＢポリペプチド抗原アミノ酸配列に組み込まれる、請求項３１に記載の方法。
34. 前記ｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２４１、Ｋ２６２、Ｋ２６９、Ｋ２８３、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｃ３０９、Ｋ３１２、Ｓ３２９、Ｓ３３３、Ｄ３４７、Ｅ３６０、Ｋ３６８、Ｅ３７２、Ｋ３７６、Ｄ３８０、Ｋ３８４、Ｅ３８７、Ｄ３９２、Ｋ３９４、Ｋ３９５、Ｋ３９７、Ｋ４２４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４４０、Ｋ４４８、Ｋ４５１、Ｋ４７０、およびＫ４８２から選択される１つ以上の位置で組み込まれる、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ｎｎＡＡが、Ｋ２８９、Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０から選択される位置で組み込まれる、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
37. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
39. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、およびＫ３９５の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
41. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２８９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
43. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３９５、Ｋ４３６、およびＫ４７０の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
45. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号１の位置Ｋ２９９、Ｋ３６８、Ｋ３９５、およびＫ４３６の各々で組み込まれるｎｎＡＡを含む、請求項３１に記載の方法。
47. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
48. 前記ｎｎＡＡが、２－アミノ－３－（４－アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２－アミノ－３－（５－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）ピリジン－２－イル）プロパン酸、２－アミノ－３－（６－（アジドメチル）ピリジン－３－イル）プロパン酸、２－アミノ－５－アジドペンタン酸、および２－アミノ－３－（４－（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３１～４４のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記ｎｎＡＡが、ｐＡＭＦである、請求項４８に記載の方法。
50. 前記ＩｐｇＣシャペロンタンパク質が、配列番号８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原を精製することをさらに含む、請求項２７～５０のいずれかに記載の方法。
52. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、水溶液中に二量体形態で前記抗原の実質的にすべてを提供する様式で精製される、請求項５１に記載の方法。
53. 前記ＩｐａＢポリペプチド抗原が、前記ＩｐａＢポリペプチド抗原に実質的に影響を及ぼすことなく、前記ＩｐｇＣシャペロンタンパク質を分解するのに有効な洗剤の存在下で精製される、請求項５２に記載の方法。
54. 前記洗剤が、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）である、請求項５３に記載の方法。
55. ＬＤＡＯが、０．１％ｖ／ｖ以下の量で存在する、請求項５４に記載の方法。
56. 請求項２７～５４のいずれか一項に記載の方法によって調製される、精製されたＩｐａＢ抗原。
57. Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
58. Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
59. Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢に対して対象を免疫化するための薬剤の製造における、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
60. 前記免疫原性組成物が、筋肉内注射として投与される、請求項５７に記載の方法、または請求項５８もしくは請求項５９に記載の使用。
61. 前記免疫原性組成物が、経粘膜的に投与される、請求項５７に記載の方法、または請求項５８もしくは請求項５９に記載の使用。
62. 前記免疫原性組成物が、１回投与される、請求項５７に記載の方法、または請求項５８もしくは請求項５９に記載の使用。
63. 前記免疫原性組成物が、２回以上投与される、請求項５７に記載の方法、または請求項５８もしくは請求項５９に記載の使用。
64. 前記対象が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢の症状を呈し、前記免疫原性組成物が、治療ワクチンとして投与される、請求項５７に記載の方法、または請求項５８もしくは請求項５９に記載の使用。
65. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
66. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
67. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ赤痢感染が発症するリスクを低減するための薬剤の製造における、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
68. 前記対象が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ赤痢を発症する少なくとも１つのリスク因子を有する、請求項６５に記載の方法、または請求項６６もしくは請求項６７に記載の使用。
69. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
70. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
71. 対象においてＳｈｉｇｅｌｌａ細菌に対する防御免疫応答を誘導するための薬剤の製造における、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。

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