CN114025789A - 侵入质粒抗原b的经优化的无细胞合成和有关的组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了用于合成与志贺氏菌属细菌有关的侵入质粒抗原B(IpaB)抗原的无细胞方法，所述方法包括向无细胞合成混合物中外源添加纯化的伴侣蛋白IpgC。本公开内容进一步提供了IpaB抗原突变体，其包含在无细胞合成期间掺入的非天然氨基酸，从而使得能够共价缀合至志贺氏菌O‑抗原多糖。进一步提供了Ipa B抗原及其缀合物，以及用合成的IpaB抗原及其缀合物制备的免疫原性组合物和使用方法。

Description

侵入质粒抗原B的经优化的无细胞合成和有关的组合物及使 用方法

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明总体上涉及志贺氏菌(Shigella)痢疾的预防和治疗，并更具体地涉及以高产率合成志贺氏菌抗原的方法，且涉及用所述志贺氏菌抗原制备的免疫原性组合物。

背景技术

志贺氏菌病或志贺氏菌痢疾是由志贺氏菌属细菌侵入结肠上皮细胞引起。在世界的许多地区，志贺氏菌痢疾是导致婴儿死亡的重要因素，并且也会在援助人员和其他旅行者中引起爆发。已知超过40种志贺氏菌血清型，它们基于O抗原多糖多样性进行分类。弗氏志贺菌(S.flexneri)和痢疾志贺菌(S.dysentery)被认为是导致地方性和流行性痢疾的主要病原体(Arabshahi等人(2018)Bioengineered 9(1):170-177)。

本领域需要适合用于治疗和预防志贺氏菌感染的组合物和方法。

发明内容

本公开内容提供了克服这些挑战的方法和组合物，因此提供了免疫原性组合物IpaB缀合物以及用于预防和治疗志贺氏菌感染的方法。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原，其包含至少一个掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列中的非天然氨基酸(nnAA)，其中所述nnAA掺入在选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。

在某些实施方案中，将nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:5的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:6的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:7的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述nnAA包含点击化学反应基团。在某些实施方案中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述nnAA是pAMF。

在某些实施方案中，所述IpaB抗原缀合至O-抗原志贺氏菌多糖(OPS)。在某些实施方案中，所述OPS选自血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、4b、5a、5b、6、7a、7b或前述的组合。

在某些实施方案中，纯化所述IpaB多肽抗原。

在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文描述的IpaB抗原的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种赋形剂。在某些实施方案中，所述至少一种赋形剂选自媒介物、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲系统、分散剂、稀释剂、粘度改进剂和吸收增强剂。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中，将所述组合物配制为无菌的可注射溶液。在某些实施方案中，以低压冻干形式配制所述组合物。

在某些实施方案中，本公开内容提供了从志贺氏菌属细菌表达侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原的方法，所述方法包括在有外源IpgC伴侣蛋白存在下使用无细胞蛋白合成表达IpaB多肽抗原。在某些实施方案中，所述志贺氏菌属细菌包含选自痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺菌(S.flexneri)、鲍氏志贺菌(S.boydii)和宋内氏志贺菌(S.sonnei)的志贺氏菌属种。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含与来自志贺氏菌属细菌的野生型IpaB多肽抗原序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，将至少一个非天然氨基酸(nnAA)掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。在某些实施方案中，将至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个nnAA掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。在某些实施方案中，将2至10个nnAA掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。在某些实施方案中，将nnAA掺入在一个或多个选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。在某些实施方案中，将nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:5的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:6的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:7的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述nnAA是pAMF。

在某些实施方案中，所述IpgC伴侣蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括纯化所述IpaB多肽抗原。在某些实施方案中，以提供基本上所有的在水溶液中呈二聚体形式的抗原的方式纯化所述IpaB多肽抗原。在某些实施方案中，在有效地降解IpgC伴侣蛋白而不实质上影响IpaB多肽抗原的去污剂存在下纯化所述IpaB多肽抗原。在某些实施方案中，所述去污剂是月桂基二甲基氧化胺(LDAO)。在某些实施方案中，LDAO以0.1％v/v或更少的量存在。

在某些实施方案中，本公开内容提供了通过本文所述的方法制备的纯化的IpaB抗原。

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文描述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的用途。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物作为肌肉内注射剂施用。在某些实施方案中，透粘膜地施用所述免疫原性组合物。在某些实施方案中，将所述免疫原性组合物施用一次。在某些实施方案中，将所述免疫原性组合物施用两次或更多次。在某些实施方案中，所述受试者表现出志贺氏菌痢疾的症状，且所述免疫原性组合物作为治疗性疫苗施用。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文描述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的用途。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险。在某些实施方案中，所述受试者具有发生志贺氏菌痢疾的至少一种风险因素。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用本文描述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的用途。在某些实施方案中，本公开内容提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答。

附图说明

图1示意地解释了侵入质粒抗原IpaB在志贺氏菌属细菌的类型3分泌系统中的作用。

图2表明了如在实施例1中所述，在递增浓度的IpaB pDNA使用无细胞蛋白表达系统合成的IpaB的表达水平。

图3表明了如在实施例2中所述，使用具有IpgC pDNA滴定的无细胞蛋白表达系统合成的IpaB的表达水平。

图4表明了如在实施例3中所述，在递增浓度的纯化的IpaB蛋白(外源地加入无细胞合成混合物中)使用无细胞蛋白表达系统合成的IpaB的表达水平。

图5是反映如在实施例4中所述递增量的纯化的IpgC的外源添加对IpaB的可溶性产率的影响的蛋白质印迹分析。

图6A、6B和6C也表示在实施例4中得到的结果。图6A提供的条形图和放射自显影图显示了递增量的纯化的IpgC的外源添加对IpaB的可溶性产率的影响，从而证实了图5中所示的结果。图6B是使用HisTrap亲和柱的洗脱级分的SDS-PAGE分析，显示了在去污剂介导的洗涤之前和之后存在的IpaB和IpgC的相对量。图6C显示了在溶液中的纯化的IpaB的结构的SEC-MALS分析结果。

图7示意地解释了如在实施例5中解释的定位扫描诱变和表达分析的结果，显示了非天然氨基酸pAMF有效掺入的位点。

图8解释了也如在实施例5中描述的，在IpaB的无细胞合成以后得到的结果，其中pAMF掺入在多个位点处。

图9表明了通过TAMRA标记和通过Safe Blue染色得到的含有3-和4-pAMF的IpaB突变体的表达。

图10表明了在缀合以后IpaB突变体的平均分子量。

图11对比了人血清对IpaB、IpaB突变体和IpaB-OPS缀合物的反应性。

图12A-图12B显示了在用弗氏志贺菌2a攻击后用IpaB、IpaB-OPS缀合物和CRM-OPS缀合物主动免疫接种的影响。图12A显示了存活百分比。图12B显示了通过ELISA测量的抗体滴度。

图13A-图13E描绘了在用弗氏志贺菌2a攻击后用IpaB、IpaB-OPS缀合物和CRM-OPS缀合物免疫接种后的另外结果。图13A显示了重量随时间的变化。图13B显示了随时间变化的活动评分。图13C显示了随时间变化的姿势评分。图13D显示了随时间变化的脱水评分。图13E显示了随时间变化的皮毛状态。

具体实施方式

概述

志贺氏菌病仍然是一种严重且常见的疾病。除了引起水样腹泻外，志贺氏菌还是痢疾(发热、痉挛、和粪便中的血液和/或粘液)的主要原因。通常难理解的是，痢疾会阻碍儿童的生长，而水样腹泻不会。

尽管1型痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)于1898年在日本被发现为流行性痢疾的病因，但目前还没有经许可的用于它的疫苗，也没有就宿主对志贺氏菌产生免疫的机制达成共识。疫苗开发已经受到四个因素阻碍：(i)胃肠外地注射的灭活的全细胞疫苗的无效性，其导致人们认为血清抗体不会赋予免疫；(ii)合适的动物模型的缺乏；(iii)在人类中的免疫机制的仅间接证据；和(iv)在传统的基于细胞的表达系统中表达志贺氏菌抗原的挑战，极大地阻碍了制造活疫苗候选物的商业放大。

志贺氏菌对上皮细胞的侵入依赖于230kb毒力质粒上31kb区域的产物，其包括ipa操纵子(其编码宿主免疫应答的主要靶标)、mxi和spa基因(其产物构成Ipa蛋白的适当部署所需的类型3分泌系统(T3SS))和virG(icsA)(其编码指导细菌的细胞内运动的表面蛋白)(Picking等人(1996)Protein Expression and Purification 8:401-408)。由弗氏志贺菌的毒力质粒编码的三种蛋白已被鉴定为细胞侵入过程的基本效应物：侵入质粒抗原(Ipa)B、C和D。

侵入质粒抗原B(“IpaB”)(一种62kDa蛋白，也被称作透明质酸酶IpaB)构成存在于T3SA背景下分子注射器设备的远端尖端的成孔组分。在功能上，IpaB促进孔形成以及随后毒素和毒力因子向宿主细胞中的分泌，这部分地介导与志贺氏菌痢疾相关的严重肠道炎症和血性腹泻。在志贺氏菌攻击的小鼠模型中，针对IpaB的疫苗接种已被证实在控制细菌感染中是高保护性的，并且IpaB-特异性抗体已被证实与人类中的志贺氏菌病严重程度负相关。参见，例如，Martinez-Becerra等人(2012)Infect.Immun.80(3):1222-1231；Martinez-Becerra等人(2013)Infect.Immun.81(12):447-4477；和Shimanovich等人(2017)Clin.Vaccine Immunol.24(2)。尽管前景广阔，但IpaB作为有效疫苗候选物的应用已经受限于抗原在常规的基于细胞的异源表达系统中的差表达。

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。如下定义对本发明的描述特别重要的特定术语。在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，“一种多肽”不仅指单一多肽，而且指两种或更多种不同多肽的组合，它们可以组合也可以不组合，“佐剂”表示单一佐剂以及可以分开或组合在单一组合物中的两种或更多种佐剂，等等。

IpaB抗原的合成

已知志贺氏菌寄居至宿主细胞的能力需要T3SS，即使细菌蛋白能够转移进宿主细胞中以改变细胞功能以有益于病原体的系统。志贺氏菌和某些其它革兰氏阴性细菌生物体具有通过基部或基体锚定在细菌包膜中的类型3分泌装置(T3SA)，从所述基体中伸出一根针，所述针通过内杆连接到基部。T3SA蛋白包括：构成基部、内杆和针的结构蛋白；效应蛋白，其分泌到宿主细胞中或以其它方式参与促进感染和/或抑制宿主细胞防御的过程；和伴侣蛋白，其结合细菌细胞质中的效应蛋白，保护它们免受降解和聚集，并向针复合物引导它们以注射到宿主细胞中。在本发明的上下文中，IpaB被表征为效应蛋白，因为它用于促进宿主细胞膜中的孔形成，并从而促进毒素和毒力因子向宿主细胞中的分泌。在本文中用于增加无细胞蛋白合成(CFPS)中的IpaB表达水平的伴侣蛋白是IpgC。

在某些实施方案中，本公开内容提供了使用可放大的无细胞蛋白合成(CFPS)来合成IpaB抗原的方法，如在美国专利号9,040,253、美国专利号9,650,621和Murray等人(2013)Current Opin.Chem.Biol.17(3):420-26(它们都通过引用并入本文)中所述。该方法被优化以提供增强的IpaB抗原表达，水平为至少200μg/ml，诸如至少400μg/ml、至少600μg/ml或更高，包括200μg/ml至800μg/ml、200μg/ml至700μg/ml、200μg/ml至650μg/ml、200μg/ml至600μg/ml、400μg/ml至800μg/ml、400μg/ml至700μg/ml、400μg/ml至650μg/ml、400μg/ml至600μg/ml等的表达水平范围。所述方法包括IpgC向CFPS系统的外源添加，所述IpgC是已经在文献中表征的IpaB的T3SS伴侣蛋白，IpaB/IpgC结合相互作用也已经在文献中表征。参见Birket等人(2007)Biochemistry 46:8128-37；和Lokareddy等人(2010)J.Biol.Chem.285(51):39965-75。IpaB抗原的前述表达水平与文献中报道的IpaB产量形成鲜明对比；Picking等人(1996)Protein Expression and Purification 8:401-408,例如，实现的产量为2mg至4mg/1.6L，相当于仅1.25μg/ml至2.5μg/mL。

该方法可以表征为使用无细胞蛋白合成来表达多肽抗原的改进方法，其中改进包括在有外源添加的、纯化的伴侣蛋白IpgC存在下合成IpaB抗原，即将IpgC添加到CFPS混合物中。如本文实施例中所确定的，相对于在没有IpgC存在下的IpaB无细胞合成，IpgC向无细胞合成混合物中的添加显著提高了获得的IpaB表达水平，当然也相对于常规的基于细胞的异源表达系统中的抗原表达而言，如上所述。在某些实施方案中，IpgC伴侣蛋白包含与SEQID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，IpgC伴侣蛋白氨基酸序列包含SEQ ID NO:8或者由其组成。

IpaB抗原

在某些实施方案中，本公开内容提供了根据本文所述的方法合成的IpaB多肽抗原。术语“多肽”意图包括由一个或多个氨基酸构成的任何结构，且因而包括二肽、寡肽、多肽、多肽片段和蛋白。形成多肽的全部或部分的氨基酸可以是二十种常规的、天然存在的氨基酸中的任一种，即，丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)、以及非常规氨基酸诸如常规氨基酸的异构体和修饰体，例如，D-氨基酸、非蛋白氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶促修饰的氨基酸、β-氨基酸、被设计成模仿氨基酸的构建体或结构(例如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和正亮氨酸)，和其它非常规氨基酸，如例如在Rosenberg等人的美国专利号5,679,782中所述。本文描述的多肽可以包括一个或多个带有官能团的非天然氨基酸，所述官能团能够缀合至第二抗原，例如，多糖。多肽可以是(a)天然存在的，(b)通过化学合成产生的，(c)通过重组DNA技术产生的，(d)通过较大分子的生化或酶促片段化产生的，(e)通过源自上面列出的方法(a)到(d)的组合的方法产生的，或(f)通过用于产生肽的任何其它方式产生的，诸如无细胞蛋白合成，如下文所述。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含与来自志贺氏菌属细菌诸如痢疾志贺菌(UniProt ID:Q03945)、弗氏志贺菌(UniProt ID:P18011)、鲍氏志贺菌(UniProt ID:Q8KXT4)或宋内氏志贺菌(UniProt ID:Q3YTQ2)的野生型IpaB抗原序列基本上同源的氨基序列。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含与来自志贺氏菌属细菌的野生型IpaB多肽抗原序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

在多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同源性百分比”和“序列同源性”表示，当在给定的长度(对比窗)上对比并对齐以得到最大对应性时，相同的或者具有特定百分比的相同氨基酸残基(或核苷酸)的两个或更多个序列，如使用序列对比算法(例如，BLASTP或Smith-Waterman同源性检索算法)所测量的。在本发明的上下文中，可以在多肽的全长或仅一部分上确定序列同源性百分比。一种用于计算序列同源性百分比的方法是BLASTP程序，其默认值设定在3的字长(W)、l 0的预期(E)和BLOSUM62评分矩阵；参见，例如，Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915。序列比对和％序列同一性的示例性确定采用GCG威斯康辛州软件包(Accelrys,Madison Wis.)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。如果这些优选的计算序列同一性的方法给出不同的量，以给出较高序列同一性的方法为准。术语“基本上同源的”表示在给定的长度(例如，多肽的“x”个氨基酸)上至少约50％的序列同源性百分比，因而包括,例如，至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％和100％。

来自弗氏志贺菌的野生型IpaB多肽抗原(一种含有580个氨基酸残基的62,160Da蛋白)的完整序列提供在SEQ ID NO:1中。因此，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性。

IpaB多肽抗原可以是全长IpaB蛋白或IpaB蛋白的部分，只要所选择的部分产生的多肽片段具有对志贺氏菌属细菌产生治疗性或预防性免疫原性应答的能力。通常，完整蛋白的这些免疫原性部分或片段的长度为至少20个氨基酸残基。如果维持期望的免疫原性性能，IpaB多肽抗原的长度是设计选择的问题，且可以是至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，直至并包括全长蛋白。IpaB多肽抗原可能不是它所对应的天然蛋白的精确拷贝。例如，经常由于起始密码子的添加而存在N-端甲硫氨酰基，其可以被视为在IpaB抗原序列之外以计算最大同一性或同源性百分比。如果保留有用的免疫原性性能，也可以发生添加、缺失和置换(经常是保守置换)。在动物或人类中的常规测试可以容易地证明如本文所述合成的IpaB多肽抗原是否对志贺氏菌属细菌的感染产生治疗性或预防性免疫原性应答。

在有IpgC伴侣蛋白存在下在IpaB抗原的无细胞合成以后，通过将CFPS合成混合物施加到合适的亲和柱(例如，HisTrap亲和柱)和去污剂洗涤，可以容易地纯化IpaB抗原。应当选择去污剂，使其优先降解IpgC，但不影响IpaB。该方法在水性(例如，缓冲液)溶液中提供基本上所有的呈二聚体形式的IpaB抗原，如在实施例4中所解释和在图6C中所示。合适的去污剂的一个例子是月桂基二甲基氧化胺(LDAO)，尽管本领域普通技术人员会明白，可以选择其它在功能上等同的去污剂。在某些实施方案中，LDAO以0.1％v/v或更少的浓度存在。例如，在某些实施方案中，LDAO以约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v、约0.01％v/v、约0.02％v/v、约0.03％v/v、约0.04％v/v、约0.05％v/v、约0.06％v/v、约0.07％v/v、约0.08％v/v、约0.09％v/v或约0.1％v/v的浓度存在。

在某些实施方案中，本公开内容提供了纯化的IpaB多肽抗原。如本文中使用的，当术语“纯化的”用于指分子时，它意味着被纯化的分子的浓度相对于在其天然环境中的分子的浓度已经增加。该术语还可以表示化学合成的分子从反应混合物中的纯化，所述分子在所述反应混合物中已经作为反应产物产生。如本文中使用的，当术语“分离的”用于指分子时，该术语是指，所述该分子已从其天然环境中移除。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与在其天然状态下共存的物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。分离的部分，无论是从天然环境还是从非天然环境(例如，重组表达、无细胞表达、化学合成等)分离，优选地是至少约1％纯、5％纯、10％纯、20％纯、30％纯、40％纯、50％纯、60％纯、70％纯、80％纯、90％纯、95％纯或99％纯，或者它们可能是100％纯。如本文中使用的，术语“％纯”表明了由感兴趣的分子组成的组合物的重量百分比。

nnAA向IpaB抗原中的掺入：

在某些实施方案中，非天然氨基酸(“nnAA”)残基在无细胞合成过程中掺入IpaB抗原。用于在CFPS期间掺入nnAA残基的方法详细描述在美国专利公开号US 2018/0333484 A1(SutroVax,Inc.)中，其通过引用整体并入本文。nnAA掺入的目的是，在IpaB抗原上提供化学“手柄”，其促进与O-抗原志贺氏菌多糖(OPS)的共价缀合，优选地通过“点击化学”反应(诸如发生叠氮化物官能化的nnAA如2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或“pAMF”与炔烃官能化的多糖之间)。在实施例5中描述了nnAA-取代的IpaB抗原的CFPS合成。

在某些实施方案中，一个或多个nnAA包含点击化学反应基团。在本文中，“点击化学反应基团”表示能够与第二点击化学反应基团进行点击化学反应的部分，诸如叠氮化物或炔烃。在某些实施方案中，一个点击化学反应基团与第二点击化学反应基团反应以形成取代的三唑。这类点击反应的例子可以参见，例如，国际PCT公开号WO 2018/126229。在生物医学应用中使用的无金属点击反应的一般例子可以参见，例如，Kim,等人,ChemicalScience,2019,10,7835-7851。包含点击化学反应基团的nnAA的例子包括(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-4-叠氮基丁酸、2-叠氮基-3-苯基丙酸、2-氨基-3-叠氮基丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸和2-氨基-5-叠氮基戊酸。

在某些实施方案中，将一个或多个nnAA掺入IpaB多肽抗原序列。在某些实施方案中，将2至10个nnAA掺入IpaB多肽抗原序列。在某些实施方案中，将至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个nnAA掺入IpaB多肽抗原序列。在某些实施方案中，掺入nnAA的位点选自SEQ ID NO:1的位置K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482。在某些实施方案中，掺入nnAA的位点选自K289、K299、K368、K395、K436和K470。在特定位点掺入的nnAA的规范表示nnAA对在指定位置的指定氨基酸的替换。例如，nnAA在位置K289处的掺入意味着存在于位置289处的赖氨酸残基被nnAA替代。

包含一个或多个nnAA的示例性IpaB多肽抗原的氨基酸序列提供在下面表1中。X＝nnAA掺入位点

表1：示例性的IpaB抗原

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个。例如，在某些实施方案中，所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

IpaB-多糖缀合物

在某些实施方案中，将本文描述的IpaB多肽抗原缀合至多糖。在某些实施方案中，所述多糖是O-抗原志贺氏菌多糖(OPS)。脂多糖(LPS)的OPS结构域是志贺氏菌的必需毒力因子和保护性抗原。在某些实施方案中，所述OPS选自血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、4b、5a、5b、6、7a、7b或它们的组合。

在某些实施方案中，从志贺氏菌属细菌培养物或细菌储备物纯化OPS多糖(参见实施例6)。这样的纯化的方法是本领域已知的，参见例如，WO2010/049806、国际PCT公开号WO2013/020090和van Sorge,等人,Cell Host Microbe.,2014,15(6),729-740。在某些实施方案中，所述缀合物多糖是合成的多糖。多糖合成的方法是本领域已知的，参见例如，Zhao,等人,Org.Chem.Front.,2019,6,3589-3596。在某些实施方案中，用点击化学反应基团修饰所述缀合物多糖以促进与IpaB抗原的缀合。例如，在某些实施方案中，用二苯并环辛炔-胺(DBCO)或DBCO-PEG(例如，DBCO-PEG-NH₂)修饰缀合物多糖。

免疫原性组合物

在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文描述的IpaB抗原的免疫原性组合物。本文中使用的术语“免疫原性的”表示抗原(例如，多肽)引起免疫应答的能力，所述免疫应答是体液或细胞免疫应答，且优选二者。在一个优选的实施方案中，所述受试者将对“有效量”或“免疫学上有效量”的本文中的免疫原性组合物的施用表现出治疗性或保护性免疫学应答，从而将增强对新感染的抵抗力和/或将减轻疾病的临床严重程度。通常通过与感染相关的至少一种症状的减轻或消除来证明免疫学应答。

在某些实施方案中，将所述IpaB抗原缀合至OPS多糖。所述免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种赋形剂。所述赋形剂是“药学上可接受的”免疫学上和药理学上惰性的组分。“药学上可接受的”组分在本文中是这样的组分：其(1)可以被包含在施用给受试者的免疫原性组合物中，而不会引起显著的不希望的生物学效应或不会以有害方式与制剂的任何其它组分相互作用；和(2)符合美国食品和药品管理局制定的非活性成分中规定的标准，并且优选地也被指定为“公认为安全的”(“GRAS”)。掺入本文描述的免疫原性组合物中的一种或多种赋形剂的类型将部分地取决于所选择的施用方式和特定制剂类型或剂型，例如，可注射的液体制剂、鼻内喷雾制剂等；施用模式和相应的制剂在下文讨论。但是，一般而言，可以有利地掺入本文描述的免疫原性组合物中的惰性组分包括、但不限于，媒介物、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲系统、分散剂、稀释剂、粘度改进剂、吸收增强剂和它们的组合。在Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,ISBN:0683306472中对药学上可接受的惰性添加剂进行了彻底讨论。

免疫原性组合物还可以包括另外的抗原，诸如也诱导对志贺氏菌感染和/或毒力因子的抗体应答的抗原，或针对除志贺氏菌生物体之外的病原体的抗原。

在某些实施方案中，将本文描述的免疫原性组合物作为用于施用于受试者的无菌制剂提供，例如作为悬浮液、溶液或在使用前再水合的低压冻干形式。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含一种或多种佐剂。

佐剂：

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含一种或多种佐剂以增强对免疫原性组合物中的一种或多种抗原的免疫应答。用于掺入本制剂的合适疫苗佐剂在相关文本和文献中有所描述，并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。本文的示例性佐剂包括基于铝的盐，诸如磷酸铝和氢氧化铝。

代表性的主要佐剂组如下：

矿物盐佐剂：包括基于明矾的佐剂诸如磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝、以及其它矿物盐佐剂诸如钙、铁和锆的磷酸盐、氢氧化物和硫酸盐；

皂苷制剂：包括Quillaia皂苷Quil A和Quil A-衍生的皂苷QS-21、以及在胆固醇、磷脂和皂苷的混合后形成的免疫刺激复合物(ISCOM)；

细菌衍生的和细菌相关的佐剂：包括、但不限于，从革兰氏阴性细菌诸如分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)、粒状棒状杆菌(C.granulosum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitis)衍生出的细胞壁肽聚糖和脂多糖，诸如脂质A、单磷酰脂质A(MPLA)、其它脂质A衍生物和模拟物(例如，RC529)、肠道细菌脂多糖(“LPS”)、TLR4配体和海藻糖二霉菌酸酯(“TDM”)；

胞壁酰基肽：诸如N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(“MDP”)和MDP类似物和衍生物，例如，苏氨酰基-MDP和正-MDP；

基于油的佐剂：包括水包油(O/W)和油包水(W/O)乳剂，诸如角鲨烯-水乳剂(例如，MF59、AS03、AF03)、完全弗氏佐剂(“CFA”)和不完全弗氏佐剂(“IFA”)；

脂质体佐剂：从可生物降解的和无毒的聚合物诸如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等形成的微球佐剂；

人免疫调节剂：包括细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；

生物粘着剂和粘膜粘着剂：诸如壳聚糖及其衍生物和酯化的透明质酸和微球或粘膜粘着剂，诸如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲纤维素的交联衍生物；

咪唑并喹诺酮化合物：包括咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物，例如，瑞喹莫德；

TLR-9激动剂：诸如Hsp90和含有未甲基化的CpG基序的寡脱氧核苷酸(参见，例如，Bode等人(2011)Expert Rev.Vaccines 10(4):499-511)；和

碳水化合物佐剂：包括菊糖-衍生的佐剂γ菊糖和algammulin、以及其它碳水化合物佐剂诸如基于葡萄糖和甘露糖的多糖，包括葡聚糖、右旋糖酐、香菇多糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚糖和木聚糖。

施用和用途

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文描述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了降低受试者中志贺氏菌痢疾感染的风险的方法，所述方法包括给所述受试者预防性地施用有效量的本文描述的免疫原性组合物。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文描述的免疫原性组合物。

在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的用途。在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者。在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物用于降低受试者中志贺氏菌痢疾感染的风险的用途。在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于降低受试者中志贺氏菌痢疾感染的风险。在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的用途。在某些实施方案中，本文提供了本文描述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答。

在本文中，术语”受试者”表示哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是小鼠、大鼠、狗、豚鼠、绵羊、非人灵长类动物或人。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述人受试者是18岁或更大。在某些实施方案中，所述人受试者小于18岁。

所述方法可以包括治疗性地施用免疫原性组合物，即，治疗遭受志贺氏菌痢疾的受试者。所述方法还可以包括预防性地施用免疫原性组合物，这意味着，例如，所述方法降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险。当预防性地使用免疫原性组合物时，所述受试者可能由于任何数目的风险因素易于发生志贺氏菌感染，所述风险因素包括位置、对清洁水的有限获取、生活在拥挤的环境中等。

免疫原性组合物的“免疫学有效量”或“有效量”是这样的量：作为单一剂量或作为一系列的两个或更多个剂量的一部分，有效地治疗或预防志贺氏菌痢疾。施用的量将随若干因素而变化，包括受试者的整体健康和身体状况、受试者的年龄、受试者的免疫系统合成相关抗体的能力、组合物的形式(例如，可注射液体、鼻腔喷雾剂等)，以及监督施用的医学从业人员已知的其它因素。

术语“治疗”表示通过施用免疫原性组合物的治疗性处理，其中目的是减轻或消除感染。例如，“治疗”可以包括直接影响、遏制、抑制和消除感染，以及降低感染的严重程度、延迟感染的发作和/或减轻与感染相关的症状。除非上下文另外明确地指出或暗示，术语“治疗”涵盖“预防”(或预防或预防性处理)，其中“预防”可以表示降低受试者发生感染的风险、延缓症状的发作、预防感染的复发、或预防感染的发展。

在本文中，术语“保护性免疫应答”涵盖在受试者中引发抗-志贺氏菌抗体应答。通过本领域已知的方式，例如通过来自免疫受试者的血清样品的ELISA测定，可以确定在施用本文描述的免疫原性组合物后产生的抗体滴度。在某些实施方案中，本文描述的免疫原性组合物在治疗的受试者中引起抗体应答，其中产生的抗体结合多种(即，两种或更多种)志贺氏菌血清型。

可以使用任何有效的全身递送模式进行免疫原性组合物的施用。通常胃肠外地施用所述组合物，例如通过注射，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、间质或皮下注射；注射也可以是牙龈，在这种情况下，将免疫原性组合物直接注射进牙龈中。此外，可以透粘膜地施用所述组合物，例如通过鼻内、舌下、经颊、阴道内或直肠内途径。但是，还设想了其它施用模式，并且本发明在这点上不受限制。作为例子，其它施用模式包括口服和透皮递送以及通过吸入或使用真皮下植入物的施用。

施用模式在很大程度上决定了包含免疫原性组合物的制剂或剂型的类型。为胃肠外施用配制的组合物包括无菌的水性溶液和非水性溶液、悬浮液和乳剂。可注射的水溶液含有水溶形式的活性剂。非水性溶剂或媒介物的例子包括脂肪油，诸如橄榄油和玉米油，合成的脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯，低分子量醇，诸如丙二醇，合成的亲水聚合物诸如聚乙二醇、脂质体等。胃肠外制剂还可以含有赋形剂诸如增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲系统、分散剂、稀释剂、粘度改进剂、吸收增强剂和它们的组合。通过掺入灭菌剂、穿过细菌截留过滤器过滤、辐照或加热，使可注射制剂无菌。也可以使用无菌的可注射介质制造它们。免疫原性组合物或其单个组分也可以是干燥形式，例如低压冻干形式，其可以在即将通过注射施用之前用合适的媒介物再水合。

在透粘膜途径中，鼻内施用通常是优选的，尽管不一定。鼻内制剂，包括鼻内地施用的免疫原性组合物，是本领域已知的，并且应当参考FDA的Guidance for Industry:Nasal Spray and Inhalation Solution,Suspension,and Spray Drug Products进行配制。鼻内制剂是液体，即溶液、乳剂、混悬液等，用于作为喷雾剂、鼻内注射剂或滴剂施用，并且可以含有上述佐剂和药学上可接受的赋形剂。由于制剂中抗原的尺寸相对较大，通过鼻内途径的全身递送需要在免疫原性组合物中掺入透粘膜吸收增强剂。合适的透粘膜吸收增强剂的例子包括、但不限于，烷基糖、环糊精和壳聚糖；参见Maggio(2014)J.Excip.FoodChem.5(2):100-12；和Merkus等人(1999)Adv.Drug Deliv.Rev.36:41-57。选择增强剂的浓度以确保免疫学有效量的制剂以有效的运输速率穿过鼻膜并进入体循环。例如，Aurora(2002年10月)Drug Development&Delivery 2(7)(通过引用并入本文)讨论了决定鼻内免疫原性组合物的组成和性质的各种解剖学和生理学考虑。

其它施用模式和对应的制剂包括、但不限于：用速溶剂型诸如速溶片剂舌下施用；使用口腔贴剂或其它口腔递送系统经颊施用；使用子宫托、软膏剂或乳膏剂阴道内施用；使用直肠栓剂、软膏剂或乳膏剂直肠内递送；使用透皮贴剂或制剂透皮施用；用注射植入物或丸剂真皮下施用；使用干粉肺制剂吸入；和使用口服剂型诸如片剂、胶囊剂等口服施用。

如本文前面提到的，在适当剂量方案的背景下将免疫原性组合物施用给受试者。所述组合物可以施用一次或在延长的时间段内施用隔开的两次或更多次。例如，初始“激发”剂量之后可以是至少一个“加强”剂量。激发和后续加强剂量之间以及加强剂量之间的时间间隔通常是在约2至约24周的范围内，更通常在约2至12周的范围内，诸如2至8周、3-6周等。无论施用模式如何，例如，肌肉内注射、牙龈注射、鼻内施用等，单剂量疫苗的体积通常是在约1μL至约500μL的范围内，通常在约1μL至约250μL的范围内，更通常在约2.5μL至约200μL的范围内，并且优选地在约5μL至约150μL的范围内。应当理解，免疫原性组合物中总抗原的浓度对应于每单位体积的组合物的免疫学有效剂量，根据上述剂量体积指南工作。

为了便于使用，可以将本发明的免疫原性组合物掺入包装产品或“试剂盒”中，包括关于自我施用或由医学从业人员施用的说明书。所述试剂盒包括密闭容器，该容器容纳一定剂量的免疫原性组合物，通常是适合于免疫学上有效的单次剂量事件的“单位剂量”。疫苗可以是液体形式，并因此准备好以注射剂等形式施用，或者它可以是另一种形式，需要使用者在施用前进行制备过程，例如低压冻干制剂的水合、惰性组分的活化等。所述试剂盒还可以包括两个或更多个密闭容器，激发剂量在第一个容器中且加强剂量在一个或多个额外容器中，或志贺氏菌免疫原性组合物在第一个容器中且针对另一种感染的疫苗(其可能与志贺氏菌感染有关或无关)在另一个容器中。

应当理解，虽然已经结合多个具体实施方案描述了本发明，但是前述描述以及随后的实验部分意图说明而非限制本发明的范围。在这点上，没有试图比对本发明的基本理解所必需的更详细地显示本发明的细节，结合附图和/或实施例进行的描述使本领域技术人员明白本发明可以如何体现在实践中。本公开内容包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等效方案。此外，除非另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的本发明的要素的任何组合都被本公开内容涵盖。

其它编号的实施方案

根据本公开内容的其它编号的实施方案提供如下：

实施方案1.一种侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原，其包含至少一个掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列中的非天然氨基酸(nnAA)，其中所述nnAA掺入在选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。

实施方案2.实施方案1的IpaB抗原，其中所述nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。

实施方案3.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。

实施方案4.实施方案3的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

实施方案5.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。

实施方案6.实施方案5的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

实施方案7.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。

实施方案8.实施方案7的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案9.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。

实施方案10.实施方案9的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

实施方案11.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。

实施方案12.实施方案11的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

实施方案13.实施方案2的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。

实施方案14.实施方案13的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

实施方案15.实施方案1-14中的任一个的IpaB抗原，其中所述nnAA包含点击化学反应基团。

实施方案16.实施方案15的IpaB抗原，其中所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。

实施方案17.实施方案16的IpaB抗原，其中所述nnAA是pAMF。

实施方案18.实施方案1-17的IpaB抗原，其缀合至O-抗原志贺氏菌多糖(OPS)。

实施方案19.实施方案18的IpaB多肽抗原，其中所述OPS选自血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、4b、5a、5b、6、7a、7b或前述的组合。

实施方案20.实施方案1-19中的任一个的IpaB多肽抗原，其中所述IpaB多肽抗原经过纯化。

实施方案21.一种免疫原性组合物，其包含实施方案1-20中的任一个的IpaB抗原。

实施方案22.实施方案21的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含至少一种赋形剂。

实施方案23.实施方案22的免疫原性组合物，其中所述至少一种赋形剂选自媒介物、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲系统、分散剂、稀释剂、粘度改进剂和吸收增强剂。

实施方案24.实施方案21-23中的任一个的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。

实施方案25.实施方案21-24中的任一个的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物配制为无菌的可注射溶液。

实施方案26.实施方案21-24中的任一个的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物以低压冻干形式配制。

实施方案27.一种用于从志贺氏菌属细菌表达侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原的方法，所述方法包括在有外源IpgC伴侣蛋白存在下使用无细胞蛋白合成表达IpaB多肽抗原。

实施方案28.实施方案27的方法，其中所述志贺氏菌属细菌包含选自痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌的志贺氏菌属种。

实施方案29.实施方案27或实施方案28的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含与来自志贺氏菌属细菌的野生型IpaB多肽抗原序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

实施方案30.实施方案27或实施方案28的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

实施方案31.实施方案27的方法，其中将至少一个非天然氨基酸(nnAA)掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。

实施方案32.实施方案31的方法，其中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个nnAA掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。

实施方案33.实施方案31的方法，其中将2至10个nnAA掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。

实施方案34.实施方案31-33中的任一个的方法，其中所述nnAA掺入在一个或多个选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。

实施方案35.实施方案31-33中的任一个的方法，其中所述nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。

实施方案36.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。

实施方案37.实施方案36的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

实施方案38.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。

实施方案39.实施方案38的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

实施方案40.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。

实施方案41.实施方案40的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施方案42.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。

实施方案43.实施方案42的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

实施方案44.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。

实施方案45.实施方案44的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

实施方案46.实施方案31的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。

实施方案47.实施方案44的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

实施方案48.实施方案31-44中的任一个的方法，其中所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。

实施方案49.实施方案48的方法，其中所述nnAA是pAMF。

实施方案50.实施方案27-49中的任一个的方法，其中所述IpgC伴侣蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列。

实施方案51.实施方案27-50中的任一个的方法，所述方法进一步包括纯化所述IpaB多肽抗原。

实施方案52.实施方案51的方法，其中以提供基本上所有的在水溶液中呈二聚体形式的抗原的方式纯化所述IpaB多肽抗原。

实施方案53.实施方案52的方法，其中在有效地降解IpgC伴侣蛋白而不实质上影响IpaB多肽抗原的去污剂存在下纯化所述IpaB多肽抗原。

实施方案54.实施方案53的方法，其中所述去污剂是月桂基二甲基氧化胺(LDAO)。

实施方案55.实施方案54的方法，其中LDAO以0.1％v/v或更少的量存在。

实施方案56.一种纯化的IpaB抗原，所述纯化的IpaB抗原通过实施方案27-55中的任一个的方法制备。

实施方案57.一种用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物。

实施方案58.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的用途。

实施方案59.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者。

实施方案60.实施方案57的方法或实施方案58或实施方案59的用途，其中所述免疫原性组合物作为肌肉内注射剂施用。

实施方案61.实施方案57的方法或实施方案58或实施方案59的用途，其中透粘膜地施用所述免疫原性组合物。

实施方案62.实施方案57的方法或实施方案58或实施方案59的用途，其中将所述免疫原性组合物施用一次。

实施方案63.实施方案57的方法或实施方案58或实施方案59的用途，其中将所述免疫原性组合物施用两次或更多次。

实施方案64.实施方案57的方法或实施方案58或实施方案59的用途，其中所述受试者表现出志贺氏菌痢疾的症状，且所述免疫原性组合物作为治疗性疫苗施用。

实施方案65.一种用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物。

实施方案66.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的用途。

实施方案67.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险。

实施方案68.实施方案65的方法或实施方案66或实施方案67的用途，其中所述受试者具有至少一种发生志贺氏菌痢疾的风险因素。

实施方案69.一种在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物。

实施方案70.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的用途。

实施方案71.实施方案21-26中的任一个的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答。

实施例

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有通常理解的含义。从业人员特别参考Green和Sambrook(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(增刊99)(New York:John Wiley&Sons,2012),和Plotkin等人,Vaccines,第六版(London:Elsevier,2013)。在以前通过引用并入的Fairman等人(SutroVax,Inc.)的美国专利公开号US 2018/0333484 A1中也描述和/或引用了用于产生重组核酸、克隆、激活和衍生化生物分子、纯化和鉴定蛋白和肽的适当分子技术以及其它相关技术的例子。对于本文所述的生物分子的胃肠外施用而言必需的技术和组分的例子，从业人员参考Remington,Essentials of Pharmaceutics,PharmaceuticalPress,London(2012)。在Spirin&Swartz(2008)Cell-free Protein Synthesis,Wiley-VCH(德国魏因海姆)中也描述了无细胞蛋白合成的方法。使用无细胞合成将非天然氨基酸掺入蛋白中的方法描述在：Shimizu等人(2006)FEBS Journal,273,4133-4140；Chong(2014)Curr Protoc Mol Biol.108:16.30.1-11；和Fairman等人,引述同上。

实施例1：IpaB的无细胞合成

在Sutro Biopharma,Inc.(South San Francisco,Calif.)所提供的无细胞蛋白合成(CFPS)提取物中表达IpaB(SEQ ID NO:1)。提取物的特征和制备在其它出版物中有所描述；在该情况下，通常如在Zawada等人(2011)Biotechnol.Bioeng.108(7):1570-1578中所述制备提取物。无细胞蛋白合成反应中的终浓度是35％(按体积计)细胞提取物、5μM RNA合成酶(‘RS’)、2mM GSSG(氧化的谷胱甘肽)、8mM谷氨酸镁、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、35mM丙酮酸钠、1.2mM AMP、0.86mM的GMP、UMP和CMP中的每一种、2mM氨基酸(除了0.5mM的酪氨酸和苯丙氨酸以外)、4mM草酸钠、1mM腐胺、1.5mM精脒、15mM磷酸钾和100nM T7RNA聚合酶。通过加入编码IpaB的质粒DNA，开始无细胞合成反应。

将反应物在48-孔Flower平板(m2p-labs#MTP-48-B)中在振荡器上在650rpm温育14h。温育时段以后，将反应物保持在4℃直至处理它用于纯化或分析。在无细胞蛋白合成反应之后，将含有IpaB的混合物转移到96-孔板(DyNa Block^TM,2mL；Labnet,Edison,N.J.)并在40℃在5000×g离心15分钟。

使用Kirchman等人(1985)Applied and Environmental Microbiology49(3):599-607所述的14C亮氨酸掺入方法收集和分析离心前和离心后CFPS混合物的样品，以评估可溶性蛋白(离心后样品)和总蛋白(离心前样品)的量。结果显示在图2的图中(连同SDS-PAGE电泳结果一起)，表明IpaB表达是pDNA剂量的函数。如在图中所见，在所有IpaB pDNA浓度，可溶性蛋白水平都大于200μg/ml，尽管在大于1μg/mL的pDNA浓度看到表达水平达到平顶。

实施例2：具有IpgC pDNA滴定的IpaB的无细胞合成

重复实施例1的规程，其中将IpgC pDNA以不同浓度滴定进无细胞合成混合物中。与以前一样，使用¹⁴C亮氨酸掺入方法，评价在加入的IpgC pDNA的不同浓度下表达的IpaB的水平。结果显示在图3中。如图所示，IpgC pDNA滴定对无细胞合成系统中的IpaB表达产生负面影响，IpgC pDNA的浓度越高产生的IpaB表达水平越低。

实施例3：具有IpgC蛋白滴定的IpaB的无细胞合成

重复实施例1的规程，但是将纯化的IpgC蛋白以不同浓度外源添加至无细胞合成混合物。与以前一样，使用¹⁴C亮氨酸掺入方法，评价在加入的IpgC的不同浓度下表达的IpaB的水平。结果显示在图4中。图中所示的分析表明，相对于在实施例1中获得的结果，IpaB表达以IpgC剂量依赖性的方式显著增加。

实施例4：IpaB的表达放大、纯化和表征

在室温在10cm培养皿中用递增量的纯化的IpgC蛋白表达组氨酸标记的IpaB。使用α-his6辣根过氧化物酶(HRP)的蛋白质印迹分析(图5)表明，递增量的纯化的IpgC的外源添加促进了IpaB的可溶性产率的伴随增加，在最高剂量从沉淀物几乎完全回收沉淀的蛋白。该结果也显示在图6A的条形图和放射自显影图中(其中“FL-IpaB”表示SEQ ID NO:1的全长WT IpaB蛋白)。

在用外源添加的纯化的IpgC无细胞合成IpaB后，可以通过使用去污剂清洗除去IpgC来纯化IpaB。图6B是使用HisTrap亲和柱的洗脱级分的SDS-PAGE分析，显示了在由来自30％月桂基二甲基氧化胺(LDAO)储备液的0.1％(v/v)介导的洗涤之前和之后存在的IpaB和IpgC的相对量。

使用具有多角度光散射的尺寸排阻色谱法(SEC-MALS)在溶液中评价由此获得的纯化的IpaB的结构。如图6C所示的SEC-MALS分析的结果指示，IpaB主要以二聚体形式存在，分子量为约111.5kDa。

实施例5：具有掺入的非天然氨基酸的IpaB的无细胞合成

nnAA 2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(“pAMF”)向SEQ ID NO:1的IpaB抗原序列中的掺入：基本上如在Zimmerman等人的美国专利公开号US 2016/0257946A1和Fairman等人的美国专利公开号US 2018/333484A1(二者通过引用并入本文)中所述进行定位扫描诱变和表达分析，以帮助鉴定用于掺入nnAA的位点。结果表明，pAMF掺入在IpaB的核心内的几个单独位点处、特别是在K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482处是非常有效的；参见图7。从那些位点中选择了六个单独位点K289、K299、K368、K395、K436和K470，并根据经验组合以产生两组各三个pAMF(IpaB突变体1、2和3，分别为SEQ ID NO:2、3和4)和四个pAMF位点(IpaB突变体4、5和6，分别为SEQID NO:5、6和7)。图8的数据表明，含有多pAMF的IpaB的表达类似于在实施例4中评价并在图6A中表示的WT全长IpaB的表达。

使用在美国专利公开号US 2018/333484 A1中详细描述的方法进行与第二抗原的共价缀合，并且也在实施例8中进行了描述。抗原可以是选自血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、4b、5a、5b、6、7a、7b及其组合的O-抗原志贺氏菌多糖。

实施例6：OPS纯化

从用pSEC10-wzzB质粒转化成过表达wzzB的志贺氏菌细胞生物质中的脂多糖(LPS)直接收获OPS，导致增加的OPS链长度和经调理的发酵生长培养基(补充了氨基酸)或摇瓶(STm D65)培养物，用冰醋酸将培养物的pH降低到3.5-3.7，并在浸没在沸水浴中的玻璃瓶中在100℃温育4小时。通过在Sorvall RC5冷冻离心机中使用GS3转子在4℃在10k x g离心30分钟，将水解后的上清液与不溶性物质分离。将上清液级分加入1M NaCl，并通过切向流微滤在4.5psi跨膜压强(TMP)下穿过0.2μm中空纤维过滤器进行过滤，使整个体积穿过，然后用等同体积的1M NaCl冲洗。然后将0.2μm清洁的1M NaCl渗透物在30kDaHydrosart TFF膜上在14psi TMP浓缩10倍，并在35倍透析体积的1M NaCl中渗滤，随后在10倍透析体积的50mM Tris pH 7中渗滤。

然后使用AKTA Purifier以10mL/min在20mM Tris pH 7、50mM NaCl中，使在20mMTris pH 7、50mM NaCl中的渗余物级分穿过串联的3x3mL Sartobind NanoQ阴离子交换膜。将穿流级分加入25％(v/v)硫酸铵并在4℃温育过夜。通过在Sorvall RC5冷冻离心机中使用GS3转子在10k x g/4℃离心30分钟来除去沉淀的物质，然后通过0.45μm Stericup真空过滤单元(Millipore,MA)过滤。然后使用Slice 200TFF装置使用10kDa Hydrosart膜在7.5psi TMP通过TFF将滤液浓缩10倍，并用10倍透析体积的去离子水渗滤。将TFF渗余物低压冻干并在-20℃储存直至使用。

实施例7：在有IpgC存在下含有多-pAMF的IpaB突变体的无细胞合成

根据在实施例5中描述的方法完成pAMF向IpaB抗原中的多位点掺入。使用实施例4的方法，在有0.2mg/mL IpgC存在下在10cm组织培养板中在室温表达(2.5μg DNA/mL)IpaBWT(SEQ ID NO:1，对照)和多位点pAMF突变体(SEQ ID NO:2-7)过夜。将培养物收获并加载到1mL hisTRAP^TM亲和柱上进行纯化。将各2μL的上清液、沉淀物和穿流级分以及10μL洗脱级分收集，并与DBCO-TAMRA(TAMRA:5-羧基四甲基罗丹明)一起温育以在运行凝胶之前进行标记。将凝胶通过荧光可视化，并且也用安全蓝(Safe Blue)染色。

除了含有4个pAMF残基的IpaB突变体(突变体4:K289、K368、K395、K436-SEQ IDNO:5；突变体5:K299、K395、K436、K470-SEQ ID NO:6；突变体6:K299、K368、K395、K436-SEQID NO:7)以外，表达并纯化含有3个pAMF残基的IpaB突变体(突变体1:K289、K367、K395-SEQID NO:2；突变体2:K299、K395、K436-SEQ ID NO:3；突变体3:K299、K368、K395-SEQ ID NO:4)。在有IpgC存在下这些突变体中的每一种的表达显示在图9中。突变体1在表达和纯化后显示出从洗脱液级分中的最高回收率。

实施例8：IpaB突变体与DBCO-衍生化的OPS的缀合

通过使DBCO基团的环辛炔部分与掺入突变体IpaB中的非天然氨基酸(pAMF)侧链的叠氮化物部分反应，将IpaB突变体1(SEQ ID NO:2)、2(SEQ ID NO:3)、3(SEQ ID NO:4)和4(SEQ ID NO:5)缀合至DCBO-衍生化的OPS。DBCO和叠氮基之间的缀合反应的示例方案可以参见例如：Zimmerman等人,Bioconjugate Chemistry,2014,25(2),351-361；Yin等人,SciRep 7,3026(2017)；和Kapoor等人,Biochemistry,2018,57(5),516-519。使用100kDa膜对粗制缀合物的透析会从反应混合物中除去大部分的游离多糖。

用IpaB突变体1-4产生的缀合物的分子量示于图10中。通过透析纯化后，观察到IpaB突变体1(SEQ ID NO:2)的缀合物具有最大的平均分子质量(529.20)。

实施例9：人血清对IpaB和IpaB:OPS缀合物的反应性

通过ELISA测量从志贺氏菌流行地区的个体获得的人血清对IpaB和IpaB:OPS缀合物的检测。利用抗-人第二抗体，按照下面实施例10中概述的一般方案进行ELISA。图11显示了随着血清浓度而变化的IpaB、IpaB突变体1-4和IpaB突变体1-4的OPS缀合物的反应性(以OD₄₅₀测量)。如图11所示，所有四种缀合物(1-4,SEQ ID NO:2-5)都表现出比单独的IpaB和突变体IpaB更高的与人血清的反应性。

实施例10：小鼠的主动免疫接种——弗氏志贺菌2a攻击

进行实验以评估IpaB-OPS(IpaB突变体#1)、CRM-OPS、IpaB和明矾对照免疫接种对弗氏志贺菌2a攻击引起的动物应答的效力。雌性BALB/c小鼠的分组如在表2中所示。

表2：用于弗氏志贺菌2a攻击的免疫接种组

在顺应期以后，在通过精密蒸发器(Mobile Laboratory Animal AnesthesiaSystem VetEquip)施用的异氟烷麻醉下通过眶后窦抽血从每只小鼠收集200μl血液，在40,000ppm±15％的异氟烷在100％O₂中和1-2％维护。在使用麻醉后密切监测小鼠的适当恢复。在开始血液收集时，将通过灭菌(70％乙醇)施用器应用的耳标(用70％乙醇灭菌)置于每只动物的内耳的中央。

根据上表2肌肉内地(IM)施用免疫接种。间隔14天进行3次疫苗接种(免疫接种1：第0天；免疫接种2：第13天；免疫接种3：第21天)。在每次疫苗接种之前和之后获得血液，并分离血清用于抗体测量。在第三个疫苗接种剂量以后大约4周，在约10μL体积中以9.5x10⁷CFU的剂量用弗氏志贺菌2a攻击小鼠。

通过ELISA测量对弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)LPS、IpaB和CRM具有特异性的血清IgG抗体。如下制备每种抗原的工作溶液：在碳酸盐包被缓冲液pH 9.6中稀释的5.0μg/mL的纯化的LPS株2457T，在1X PBS pH 7.4中稀释的0.2μg/ml的纯化的IpaB，在1X PBSpH 7.4中稀释的2.0μg/ml的纯化的CRM。随后，通过向平板的每个孔加入100μl适当的工作溶液，包被Immulon 2HB“U”形底微孔滴定板(Thermo Labsystems#3655)。然后将平板在37℃温育3小时。该温育以后，将平板用PBS-吐温(0.05％)洗涤六次，在洗涤之间浸泡两分钟。然后将平板在4℃用含有10％脱脂奶粉(NFDM)的1X PBS以250μl/孔封闭过夜。封闭后，如上所述再次洗涤平板。

将试验样品和阳性对照在PBS-吐温10％NFDM中稀释并添加给平板。在每个平板上进行的一系列2倍稀释中，对样本和阳性对照一式两份地进行试验。将平板在37℃温育1小时，并然后如上所述用PBS-吐温洗涤。接着，将辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗-小鼠IgG(SeraCare#5220-0460)在PBS-吐温10％NFDM中分别稀释至1:1000或1:2000。所有孔均接受100μl适当抗体溶液，并将平板在37℃温育1小时。再次洗涤平板，并将100μl TMB微孔过氧化物酶底物(SeraCare#5120-0047)加入到每个孔中。将平板在室温在黑暗中在搅拌下温育15分钟。通过向所有孔中加入100μl 1M磷酸来停止比色测量反应。使用MultiskanFCTM微量培养板读数器立即测量在450nm的吸光度值。

图12A和图12B显示了弗氏志贺菌2a攻击的结果。图12A显示了用弗氏志贺菌2a攻击后的存活百分比。与仅用CRM-OPS缀合物或明矾处理的组中的40％存活率相比，用IpaB-OPS缀合物处理的小鼠在8天后表现出90％存活率。图12B显示了抗-OPS Elisa滴度实验，证明了IpaB-OPS缀合物相对于IpaB和抽血前对照的高滴度水平。尽管CRM-OPS缀合物显示出强大滴度，但它没有提供与IpaB-OPS为免疫接种后小鼠提供的相同的保护水平。

图13A-E显示了用弗氏志贺菌攻击后的额外结果。用CRM-OPS免疫的小鼠在攻击后8天表现出最低的平均体重(图13A)。图13B-E显示了定性结果，以1-3的等级测量，其中较高的评分指示较差的状况。总体而言，施用明矾的小鼠在实验过程中的任何时间点都表现出最严重的评分(例如，关于姿势和皮毛状态的评分为3)，而CRM-OPS免疫的小鼠除了前面讨论的高死亡率外，在攻击后8天表现出最严重的评分。

通过引用并入

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请通过引用整体并入用于所有目的。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及没有且不应视作承认或以任何形式暗示：它们在世界上的任何国家构成有效的现有技术或形成普通一般知识的一部分。

序列表

<110> VAXCYTE公司

<120> 侵入质粒抗原B的经优化的无细胞合成和有关的组合物及使用方法

<130> PE01708A

<150> 62/828,364

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Val Ala Arg Leu Asn Xaa Phe Leu Gly Ala Ala Gly Asp Glu Val Ile

465 470 475 480

Ser Lys Gln Ile Ile Ser Thr His Leu Asn Gln Ala Val Leu Leu Gly

485 490 495

Glu Ser Val Asn Ser Ala Thr Gln Ala Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala

500 505 510

Val Phe Gln Asn Ser Ala Ser Thr Asn Leu Ala Asp Leu Thr Leu Ser

515 520 525

Lys Tyr Gln Val Glu Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Ser Glu Ala Ile Glu

530 535 540

Lys Phe Gly Gln Leu Gln Glu Val Ile Ala Asp Leu Leu Ala Ser Met

545 550 555 560

Ser Asn Ser Gln Ala Asn Arg Thr Asp Val Ala Lys Ala Ile Leu Gln

565 570 575

Gln Thr Thr Ala

580

<210> 7

<211> 580

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IpaB突变体6 K299/K368/K395/K436

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (299)..(299)

<223> X = pAMF

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (368)..(368)

<223> X = pAMF

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (395)..(395)

<223> X = pAMF

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (436)..(436)

<223> X = pAMF

<400> 7

Met His Asn Val Asn Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ala Lys Ile

1 5 10 15

Leu Ala Ser Thr Glu Leu Gly Asp Asn Thr Ile Gln Ala Gly Asn Asp

20 25 30

Ala Ala Asn Lys Leu Phe Ser Leu Thr Ile Ala Asp Leu Thr Ala Asn

35 40 45

Lys Asn Ile Asn Thr Thr Asn Ala His Ser Thr Ser Asn Ile Leu Ile

50 55 60

Pro Glu Leu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Asn Ala Ser Ser Gln Leu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Ile Gly Asn Leu Ile Gln Ile Leu Gly Glu Lys Ser Leu Thr

85 90 95

Ala Leu Thr Asn Lys Ile Thr Ala Trp Lys Ser Gln Gln Gln Ala Arg

100 105 110

Gln Gln Lys Asn Leu Glu Phe Ser Asp Lys Ile Asn Thr Leu Leu Ser

115 120 125

Glu Thr Glu Gly Leu Thr Arg Asp Tyr Glu Lys Gln Ile Asn Lys Leu

130 135 140

Lys Asn Ala Asp Ser Lys Ile Lys Asp Leu Glu Asn Lys Ile Asn Gln

145 150 155 160

Ile Gln Thr Arg Leu Ser Glu Leu Asp Pro Asp Ser Pro Glu Lys Lys

165 170 175

Lys Leu Ser Arg Glu Glu Ile Gln Leu Thr Ile Lys Lys Asp Ala Ala

180 185 190

Val Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys Thr Leu Ser Ile His Ser

195 200 205

Lys Leu Thr Asp Lys Ser Met Gln Leu Glu Lys Glu Ile Asp Ser Phe

210 215 220

Ser Ala Phe Ser Asn Thr Ala Ser Ala Glu Gln Leu Ser Thr Gln Gln

225 230 235 240

Lys Ser Leu Thr Gly Leu Ala Ser Val Thr Gln Leu Met Ala Thr Phe

245 250 255

Ile Gln Leu Val Gly Lys Asn Asn Glu Glu Ser Leu Lys Asn Asp Leu

260 265 270

Ala Leu Phe Gln Ser Leu Gln Glu Ser Arg Lys Thr Glu Met Glu Arg

275 280 285

Lys Ser Asp Glu Tyr Ala Ala Glu Val Arg Xaa Ala Glu Glu Leu Asn

290 295 300

Arg Val Met Gly Cys Val Gly Lys Ile Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ile

305 310 315 320

Val Ser Val Val Ala Ala Ala Phe Ser Gly Gly Ala Ser Leu Ala Leu

325 330 335

Ala Asp Val Gly Leu Ala Leu Met Val Thr Asp Ala Ile Val Gln Ala

340 345 350

Ala Thr Gly Asn Ser Phe Met Glu Gln Ala Leu Asn Pro Ile Met Xaa

355 360 365

Ala Val Ile Glu Pro Leu Ile Lys Leu Leu Ser Asp Ala Phe Thr Lys

370 375 380

Met Leu Glu Gly Leu Gly Val Asp Ser Lys Xaa Ala Lys Met Ile Gly

385 390 395 400

Ser Ile Leu Gly Ala Ile Ala Gly Ala Leu Val Leu Val Ala Ala Val

405 410 415

Val Leu Val Ala Thr Val Gly Lys Gln Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu

420 425 430

Asn Ile Gly Xaa Ile Ile Gly Lys Thr Leu Thr Asp Leu Ile Pro Lys

435 440 445

Phe Leu Lys Asn Phe Ser Ser Gln Leu Asp Asp Leu Ile Thr Asn Ala

450 455 460

Val Ala Arg Leu Asn Lys Phe Leu Gly Ala Ala Gly Asp Glu Val Ile

465 470 475 480

Ser Lys Gln Ile Ile Ser Thr His Leu Asn Gln Ala Val Leu Leu Gly

485 490 495

Glu Ser Val Asn Ser Ala Thr Gln Ala Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala

500 505 510

Val Phe Gln Asn Ser Ala Ser Thr Asn Leu Ala Asp Leu Thr Leu Ser

515 520 525

Lys Tyr Gln Val Glu Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Ser Glu Ala Ile Glu

530 535 540

Lys Phe Gly Gln Leu Gln Glu Val Ile Ala Asp Leu Leu Ala Ser Met

545 550 555 560

Ser Asn Ser Gln Ala Asn Arg Thr Asp Val Ala Lys Ala Ile Leu Gln

565 570 575

Gln Thr Thr Ala

580

<210> 8

<211> 155

<212> PRT

<213> 弗氏志贺氏菌

<400> 8

Met Ser Leu Asn Ile Thr Glu Asn Glu Ser Ile Ser Thr Ala Val Ile

1 5 10 15

Asp Ala Ile Asn Ser Gly Ala Thr Leu Lys Asp Ile Asn Ala Ile Pro

20 25 30

Asp Asp Met Met Asp Asp Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Asp Phe Tyr Asn

35 40 45

Lys Gly Arg Ile Glu Glu Ala Glu Val Phe Phe Arg Phe Leu Cys Ile

50 55 60

Tyr Asp Phe Tyr Asn Val Asp Tyr Ile Met Gly Leu Ala Ala Ile Tyr

65 70 75 80

Gln Ile Lys Glu Gln Phe Gln Gln Ala Ala Asp Leu Tyr Ala Val Ala

85 90 95

Phe Ala Leu Gly Lys Asn Asp Tyr Thr Pro Val Phe His Thr Gly Gln

100 105 110

Cys Gln Leu Arg Leu Lys Ala Pro Leu Lys Ala Lys Glu Cys Phe Glu

115 120 125

Leu Val Ile Gln His Ser Asn Asp Glu Lys Leu Lys Ile Lys Ala Gln

130 135 140

Ser Tyr Leu Asp Ala Ile Gln Asp Ile Lys Glu

145 150 155

Claims (71)

1.一种侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原，其包含至少一个掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列中的非天然氨基酸(nnAA)，其中所述nnAA掺入在选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。

2.根据权利要求1所述的IpaB抗原，其中所述nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。

3.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。

4.根据权利要求3所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

5.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。

6.根据权利要求5所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

7.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。

8.根据权利要求7所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

9.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。

10.根据权利要求9所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

11.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。

12.根据权利要求11所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

13.根据权利要求2所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。

14.根据权利要求13所述的IpaB抗原，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的IpaB抗原，其中所述nnAA包含点击化学反应基团。

16.根据权利要求15所述的IpaB抗原，其中所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。

17.根据权利要求16所述的IpaB抗原，其中所述nnAA是pAMF。

18.根据权利要求1-17所述的IpaB抗原，其缀合至O-抗原志贺氏菌多糖(OPS)。

19.根据权利要求18所述的IpaB多肽抗原，其中所述OPS选自血清型1a、1b、2a、2b、3b、4a、4b、5a、5b、6、7a、7b或前述的组合。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的IpaB多肽抗原，其中所述IpaB多肽抗原经过纯化。

21.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的IpaB抗原。

22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含至少一种赋形剂。

23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种赋形剂选自媒介物、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲系统、分散剂、稀释剂、粘度改进剂和吸收增强剂。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物配制为无菌的可注射溶液。

26.根据权利要求21-24中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物以低压冻干形式配制。

27.一种用于从志贺氏菌属细菌表达侵入质粒抗原B(IpaB)多肽抗原的方法，所述方法包括在有外源IpgC伴侣蛋白存在下使用无细胞蛋白合成表达IpaB多肽抗原。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述志贺氏菌属细菌包含选自痢疾志贺菌、弗氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌的志贺氏菌属种。

29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含与来自志贺氏菌属细菌的野生型IpaB多肽抗原序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

30.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

31.根据权利要求27所述的方法，其中将至少一个非天然氨基酸(nnAA)掺入IpaB多肽抗原氨基酸序列。

32.根据权利要求31所述的方法，其中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个nnAA掺入所述IpaB多肽抗原氨基酸序列。

33.根据权利要求31所述的方法，其中将2至10个nnAA掺入所述IpaB多肽抗原氨基酸序列。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述nnAA掺入在一个或多个选自SEQ ID NO:1的K241、K262、K269、K283、K289、K299、C309、K312、S329、S333、D347、E360、K368、E372、K376、D380、K384、E387、D392、K394、K395、K397、K424、K429、K436、K440、K448、K451、K470和K482的位置处。

35.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述nnAA掺入在选自K289、K299、K368、K395、K436和K470的位置处。

36.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368和K395中的每一个处。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

38.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395和K436中的每一个处。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

40.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368和K395中的每一个处。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

42.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K289、K368、K395和K436中的每一个处。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

44.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K395、K436和K470中的每一个处。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

46.根据权利要求31所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含nnAA，所述nnAA掺入在SEQ ID NO:1的位置K299、K368、K395和K436中的每一个处。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述IpaB多肽抗原包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

48.根据权利要求31-44中任一项所述的方法，其中所述nnAA选自2-氨基-3-(4-叠氮基苯基)丙酸(pAF)、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸(pAMF)、2-氨基-3-(5-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)吡啶-2-基)丙酸、2-氨基-3-(6-(叠氮基甲基)吡啶-3-基)丙酸、2-氨基-5-叠氮基戊酸和2-氨基-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)丙酸或它们的任意组合。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述nnAA是pAMF。

50.根据权利要求27-49中任一项所述的方法，其中所述IpgC伴侣蛋白包含与SEQ IDNO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列。

51.根据权利要求27-50中任一项所述的方法，所述方法进一步包括纯化所述IpaB多肽抗原。

52.根据权利要求51所述的方法，其中以提供基本上所有的在水溶液中呈二聚体形式的所述抗原的方式纯化所述IpaB多肽抗原。

53.根据权利要求52所述的方法，其中在有效地降解所述IpgC伴侣蛋白而不实质上影响所述IpaB多肽抗原的去污剂存在下纯化所述IpaB多肽抗原。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述去污剂是月桂基二甲基氧化胺(LDAO)。

55.根据权利要求54所述的方法，其中LDAO以0.1％v/v或更少的量存在。

56.一种纯化的IpaB抗原，所述纯化的IpaB抗原通过根据权利要求27-54中任一项所述的方法制备。

57.一种用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物。

58.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者的用途。

59.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于针对志贺氏菌痢疾免疫受试者。

60.根据权利要求57所述的方法或根据权利要求58或权利要求59所述的用途，其中所述免疫原性组合物作为肌肉内注射剂施用。

61.根据权利要求57所述的方法或根据权利要求58或权利要求59所述的用途，其中透粘膜地施用所述免疫原性组合物。

62.根据权利要求57所述的方法或根据权利要求58或权利要求59所述的用途，其中将所述免疫原性组合物施用一次。

63.根据权利要求57所述的方法或根据权利要求58或权利要求59所述的用途，其中将所述免疫原性组合物施用两次或更多次。

64.根据权利要求57所述的方法或根据权利要求58或权利要求59所述的用途，其中所述受试者表现出志贺氏菌痢疾的症状，并且所述免疫原性组合物作为治疗性疫苗施用。

65.一种用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物。

66.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险的用途。

67.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于降低在受试者中发生志贺氏菌痢疾感染的风险。

68.根据权利要求65所述的方法或根据权利要求66或权利要求67所述的用途，其中所述受试者具有至少一种发生志贺氏菌痢疾的风险因素。

69.一种在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物。

70.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答的用途。

71.根据权利要求21-26中任一项所述的免疫原性组合物在药物制备中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对志贺氏菌属细菌的保护性免疫应答。

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