KR20190128056A - 감소된 반응원성을 갖는 lps 함유 보르데텔라 백신 - Google Patents

감소된 반응원성을 갖는 lps 함유 보르데텔라 백신 Download PDF

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에스카로나 엘더 푸포
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드 슈타트 데르 네덜란덴, 베르테겐부어디그트 두어 드 미니스터 반 베이웨이에스, 미니스테리 반 폭스겐트존하이트, 벨지인 엔 스포츠
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Abstract

본 발명은 의학 분야 및 보다 구체적으로 백신학 분야에 있다. 본 발명은 신규의 보르데텔라 LPS 및 상기와 같은 변형된 LPS를 포함하는 보르데텔라 속의 변형된 세균에 관한 것이다. 본 발명의 LPS는 변형되지 않은 보르데텔라 LPS에 비해 감소된 내독성을 갖는다. 따라서 본 발명의 변형된 LPS는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는데 사용하기에 특히 적합하며, 여기에서 상기 면역 반응은 보르데텔라 감염에 대해 유도되거나 자극된다. 본 발명의 변형된 보르데텔라 LPS는 이종 아실 트랜스퍼라제의 발현을 보르데텔라 세포에 도입시킴으로써 수득될 수 있다. 특히, 본 발명의 변형된 보르데텔라 세포는 이종 LpxA, LpxL 또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제의 증가된 발현을 갖는다.

Description

감소된 반응원성을 갖는 LPS 함유 보르데텔라 백신
본 발명은 백신학 분야 및 특히 보르데텔라(Bordetella) 감염의 예방 또는 치료 분야에 있다.
본 발명은 감소된 내독성을 갖는 보르데텔라 LPS, 및 상기와 같은 변형된 LPS를 포함하는 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 변형된 세균으로부터 수득할 수 있는 외막 소포(OMV)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 LPS, 유전자 변형된 세균 및/또는 OMV를 포함하는 조성물 및 약제로서 상기 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 대상체(subject)에서 면역 반응을 유도하거나 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 상기 조성물에 관한 것이다.
보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis)는 그람 음성 세균이며, 심한 기침으로서 또한 알려진 급성 호흡기 질병인 백일해를 일으키는 편성 인간 병원체이다. 다수의 백신 제형이 백일해에 대해 개발되었다. 앞선 세기의 50년대에 도입된 전세포 백일해 백신은 유효하였지만 허용될 수 없는 부작용을 발생시켰다. 따라서, 현재 선진국에서는 판매되고 있지 않다. 서브유닛-기반 백신이 안전하고 상기 질병에 대한 관련 보호(커버리지의 55 내지 95%)를 부여하는 것으로 입증되었기 때문에 상기 전세포 백신(whole cell vaccine)을 대체하였다. 그러나, 다른 것들 중에서도, 상기 병원체의 빠른 적응과 면역성의 급속한 감소는 상기 제형의 효능을 감소시키고 있다. 이는 지난 수십년간 선진국에서 특히 걱정거리가 되었으며, 백신을 포함한 사례의 수가 상당히 증가한 것이 목격되었다[1]. 따라서, 신규의 안전하고 유효한 백신 제형에 대한 강한 의학적 요구가 존재한다. 상기 목적에 도달하기 위한 전략은 감소된 독성을 갖는 신규의 전세포 백신의 도입일 수 있었다. 독성은 주로 리포폴리사카라이드(LPS)의 지질 A 부분(moiety)에 의해 결정되기 때문에[2], 상기 접근법은 지질 A 조작을 필요로 한다.
LPS는 그람 음성 세균의 외막의 주성분이다. 상기는 지질 A 부분, 코어 올리고사카라이드, 및 O-항원으로서 공지된 긴 폴리사카라이드(그러나 상기는 비 페르투씨스(B. pertussis)를 포함한 일부 종에 결여되어 있다)로 이루어진다[3-5]. 지질 A 부분은 포유동물 LSP 수용체인 TLR4/MD-2 복합체에 의해 인식되어, 염증전 사이토킨 및 케모킨의 생성으로 끝나는 신호전달 캐스케이드의 활성화를 생성시킨다[6]. 이들 매개체는 면역 방어를 활성화시키지만[7,8], 과도한 자극은 종종 치명적인 결과를 갖는 다양한 질환을 야기한다[9]. 따라서, LPS는 항원보강제로서 작용할 수 있지만 또한 강한 내독소로서도 작용할 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 지질 A는 1 및 4'번 위치에서 인산화되는 글루코스아민 디사카라이드로 이루어지며 아미드 결합을 통해 2 및 2'번 위치에 및 에스테르 결합을 통해 3 및 3'번 위치에 연결되는 4개의 하이드록실화된 지방 아실 쇄를 함유한다. 2개의 2차 아실 쇄는 2' 및 3'번 위치에서 지방산의 하이드록실기로 에스테르화된다[4]. 지질 A의 생합성 경로는 9개의 잘-보존된 효소를 필요로 한다[4]. 첫 번째 단계에서, 3-하이드록실 아실 쇄는 아실 담체 단백질로부터 LpxA에 의해 활성화된 당 UDP-GlcNAc 중의 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)의 3번 위치로 전달된다[10;11]. 이어서 생성되는 생성물은 LpxC에 의해 탈-아세틸화되고 후속적으로 2번 위치에서 LpxD에 의해 3-하이드록실 아실 쇄로 아실화된다. 이어서 LpxH는 상기 생성되는 분자의 일부로부터 UMP 분자를 제거하고 하나의 변형된 분자는 LpxB에 의해 변형되지 않은 것에 연결된다. 상기 생성되는 생성물은 4'번 위치에서 LpxK에 의해 인산화되어 4-아실화된 및 비스-인산화된 지질 IVA를 생성시킨다. 이어서 2개의 3-데옥시-D-만노-옥트-2-울로손산(KDO) 잔기가 6'번 위치에 WaaA에 의해 부가되고 그 후에 2차 아실 쇄가 LpxL 및 LpxM 아실 트랜스퍼라제에 의해 부가된다.
지질 A 구조의 변화가 상이한 세균 종들에서 발견된다. 이러한 변화는 LPS 수용체의 활성화에 영향을 미친다. 특히, 아실 쇄의 수 및 길이뿐만 아니라 포스페이트기의 수가 모두 활성화의 강도를 결정할 수 있었다[4;12;13].
아실-쇄 길이의 변화는 아실 트랜스퍼라제 LpxA, LpxD, LpxL 및 LpxM의 분자 자(molecular ruler)(상이한 세균 종의 상기 효소마다 다르다)에 의해 결정된다[14]. 더욱 또한, 상기 보존된 생합성 경로후에, 내막 또는 외막 중에 위치한 효소에 의한 외막으로의 수송 중에 또는 상기 수송 후에 지질 A에 변형이 도입될 수 있다. 이러한 변형은 아실화, 탈-아실화 및 탈-인산화를 포함하며, 이들 효소의 존재는 세균 종간에 상이하다[15].
비 페르투씨스의 지질 A(도 1A)는 상기가 5-아실화된다는 점에서 이 콜라이(E. coli)의 경우와 상이하다: 상기는 3'번 위치에서 1차 아실 쇄에 연결된 2차 아실 쇄가 빠져있다. 더욱 또한, 남아있는 2차 아실 쇄는 이 콜라이에서 발견되는 바와 같은 C12 대신에 C14이며, 신기하게도 3 및 3'번 위치에서 1차 하이드록실화된 아실 쇄는 상기가 동일한 LpxA 효소에 의해 부가된다 하더라도 길이가 상이하다(도 1A).
앞서, 보르데텔라 3-O-탈아실화된 LPS는 LPS 독성을 감소시킴이 보고되었다(예를 들어 WO 2006/065139를 참조하시오). 그럼에도 불구하고, 3번 위치에서 1차 아실 쇄를 상실한 비 페르투씨스 LPS의 감소된 독성은 막으로부터의 그의 증가된 방출에 의해 전-세포 제제에서 무효화되었다[2].
따라서, 당해 분야에서는 감소된 내독성을 갖는 보르데텔라 LPS에 대한 강한 필요성이 여전히 존재한다. 특히, 감소된 내독성을 갖는 상기와 같은 LPS를 갖는 보르데텔라 종이 필요하다. 바람직하게는 LPS의 내독성은 보르데텔라 감염의 예방 또는 치료에 사용하기에 적합할만큼 충분히 낮다. 보다 정확하게, 당해 분야에서는 낮아진 내독성을 갖는 LPS를 포함하는 전세포 보르데텔라 백신이 여전히 필요하다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이다.
바람직하게는, 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이는 동일한 3번 위치에서의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄보다 더 큰 길이를 갖지 않으며, 바람직하게는 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이는 C10 이하이다. 바람직하게는 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이는 동일한 3번 위치에서의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄와 동일한 길이를 가지며, 바람직하게는 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이는 C10이다
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이는 3'번 위치에서의 아실 쇄의 길이와 동일하다.
바람직하게는, 보다 짧은 아실 쇄는 i) 지질 A 부분의 3'번 위치에서의 아실 쇄; ii) 지질 A 부분의 2'번 위치에서의 1차 아실 쇄; iii) 지질 A 부분의 2'번 위치에서의 2차 아실 쇄; 및 iv) 지질 A 부분의 2번 위치에서의 아실 쇄로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 아실 쇄는 적어도 2, 4 또는 6 C 원자 더 짧다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, LPS는 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)의 구조를 갖는다. 바람직하게는, 상기 LPS는 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 보르데텔라 페르투씨스의 구조를 갖는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 변형된 지질 A 부분은 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서, X2, X3, X2', X3', R2, R3, R2', 및 R3'은 각각 독립적으로 -H, -OH, -Y, -O-(C=O)-CH(OH)-Y, 및 -O-(C=O)-Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택되는 정수이다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 본 명세서에 정의된 바와 같은 LPS를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형된다. 바람직하게는, 상기 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형은 세포에 이종 LpxA, LpxL 및 LpxD 아실 트랜스퍼라제 활성 중 적어도 하나를 부여한다. 바람직하게는, 상기 유전자 변형은 이종 lpxA, lpxL, 및 lpxD 유전자 중 적어도 하나의 발현을 도입시키며, 여기에서 i) lpxA 유전자는 서열번호 1과 적어도 60% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고; ii) lpxL 유전자는 서열번호 2와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고; 및/또는 iii) lpxD 유전자는 서열번호 4와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 변형된 세균은 내인성 lpxA 유전자 및/또는 내인성 lpxD 유전자에 의해 암호화되는 LpxA 및/또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제의 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자 돌연변이를 추가로 포함한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 세균은 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되며, 여기에서 바람직하게는 상기 유전자 변형은 이종 lpxH 유전자의 발현을 도입시키고 바람직하게는 상기 lpxH 유전자는 서열번호 5와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 세균은 유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 또는 보르데텔라 브론키셉티카이며, 여기에서 바람직하게는 상기 유전자 변형된 세균은 유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스 및 가장 바람직하게는 보르데텔라 페르투씨스 B213 균주이다. 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균은 추가로 지질 A 3-O-데아실라제 활성을 증가시키는 유전자 변형을 갖는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 LPS는 본 명세서 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득될 수 있다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 OMV는 본 명세서 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득될 수 있다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다섯 번째 태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.
여섯 번째 태양에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 또는 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 면역 반응은 보르데텔라 감염, 바람직하게는 보르데텔라 페르투씨스 감염에 대해 유도되거나 자극된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 치료는 백일해의 예방 또는 치료이다. 바람직하게는, 본 명세서에 명시된 바와 같이 사용하기 위한 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물이다.
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 세균을 포함하는 전세포 백신이며, 여기에서 바람직하게는 상기 세균은 불활성화된다.
바람직하게는, 본 명세서에 명시된 바와 같이 사용하기 위한 조성물은 본 명세서에 명시된 바와 같은 보르데텔라 LPS 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 OMV를 포함하는 무세포 백신이다.
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 사용하기 위한 조성물은 적어도 하나의 비-보르데텔라 항원을 추가로 포함한다.
정의
"상동성", "서열 동일성" 등의 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 서열 동일성은 본 명세서에서, 서열 비교에 의해 밝혀진 바와 같은 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열간의 관계로서 정의된다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 아미노산 또는 핵산 서열의 스트링간의 합치에 의해 밝혀진 바와 같은, 상기 서열간의 서열 관련성(존재할 수 있는 경우) 정도를 의미한다. 2개의 아미노산 서열간의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환물을 제2 폴리펩티드의 서열에 비교함으로써 측정된다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 상기 두 서열의 길이에 따라, 전체적인 또는 국소적인 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 측정될 수 있다. 유사한 길이의 서열들을 바람직하게는, 전체 길이에 걸쳐 최적으로 상기 서열들을 정렬시키는 전체적인 정렬 알고리즘(예를 들어 니들맨 분취(Needleman Wunsch))을 사용하여 정렬시키는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열들은 바람직하게는 국소적인 정렬 알고리즘(예를 들어 스미스 워터맨(Smith Waterman))을 사용하여 정렬시킨다. 이어서 서열들(예를 들어 디폴트 매개변수를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬시킬 때)이 적어도 서열 동일성의 일정한 최소 백분율(하기에 정의되는 바와 같다)을 공유하는 경우 상기 서열들을 "실질적으로 동일성" 또는 "필수적으로 유사성"으로서 지칭할 수 있다. GAP는 니들맨과 분취의 전체적인 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 그들의 전체 길이(완전길이)에 걸쳐 정렬시켜, 합치의 수를 최대화시키고 끊김의 수를 최소화한다. 전체적인 정렬은 2개의 서열이 유사한 길이를 가질 때 서열 동일성을 측정하는데 적합하게 사용된다. 일반적으로, GAP 디폴트 매개변수가 사용되며, 이때 끊김 생성 벌점 = 50(뉴클레오티드)/8(단백질) 및 끊김 확장 벌점 = 3(뉴클레오티드)/2(단백질)이다. 뉴클레오티드의 경우 사용되는 디폴트 채점 행렬은 nwsgapdna이며 단백질의 경우 디폴트 채점 행렬은 Blosum62(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다. 서열 정렬 및 서열 동일성 백분율에 대한 점수를 상기 GAP의 경우와 동일한 매개변수를 사용하거나, 또는 디폴트 설정을 사용하여('니들' 및 '워터'의 경우 둘 다 및 단백질 및 DNA 정렬의 경우 둘 다, 디폴트 Gap 끊김 벌점은 10.0이고 디폴트 끊김 확장 벌점은 0.5이며; 디폴트 채점 행렬은 단백질의 경우 Blosum62 및 DNA의 경우 DNAFull이다), 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 악셀리스 인코포레이티드(Accelrys Inc.)(미국 캘리포니아주 92121-3752 샌디에고 스크랜톤 로드 9685 소재)로부터 입수할 수 있는 GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.3을 사용하거나, 또는 오픈 소스 소프트웨어, 예를 들어 EmbossWIN 버전 2.10.0에서 프로그램 "니들"(전체적인 니들맨 분취 알고리즘 사용) 또는 "워터"(국소적인 스미스 워터맨 알고리즘 사용)를 사용하여 측정할 수 있다. 서열이 실질적으로 상이한 전체적인 길이를 갖는 경우, 국소적인 정렬, 예를 들어 스미스 워터맨 알고리즘을 사용하는 것이 바람직하다.
한편으로 유사성 또는 동일성 백분율을 FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여, 공개 데이터베이스에 대해 검색함으로써 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 추가로, 예를 들어 다른 과 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "조회 서열"로서 사용될 수 있다. 상기와 같은 검색을 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403―10]의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12로 수행하여 본 발명의 아실 트랜스퍼라제 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 획득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTx 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 비교 목적의 끊긴 정렬을 획득하기 위해서, 끊긴 BLAST를 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 끊긴 BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램(예를 들어 BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. 국립 생물공학 정보 센터 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 참조하시오.
임의로, 아미노산 유사성 정도를 측정함에 있어서, 숙련가는 또한, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 쓰레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라진 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 아스파테이트-글루타메이트 및 아스파라진-글루타민이다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 치환 변체는 개시된 서열 중 적어도 하나의 잔기가 제거되고 대신에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 하기와 같다: Ala에서 ser; arg에서 lys; asn에서 gln 또는 his; asp에서 glu; cys에서 ser 또는 ala; gln에서 asn; glu에서 asp; gly에서 pro; his에서 asn 또는 gln; ile에서 leu 또는 val; leu에서 ile 또는 val; lys에서 arg; gln 또는 glu; met에서 leu 또는 ile; phe에서 met, leu 또는 tyr; ser에서 thr; thr에서 ser; trp에서 tyr; tyr에서 trp 또는 phe; 및, val에서 ile 또는 leu.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "선택적으로 하이브리드화하는", "선택적으로 하이브리드화하다"란 용어 및 유사한 용어는 서로에 대해서 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 보다 바람직하게는 적어도 99% 상동성인 뉴클레오티드 서열들이 전형적으로 서로 하이브리드화된 채로 유지되는 하이브리드화 및 세척 조건을 기재하고자 한다. 즉, 상기와 같은 하이브리드화 서열은 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 보다 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
상기와 같은 하이브리드화 조건의 바람직한 비제한적 예는 약 45 ℃에서 6x 염화 나트륨/나트륨 시트레이트(SSC)에서의 하이브리드화, 이어서 약 50 ℃, 바람직하게는 약 55 ℃, 바람직하게는 약 60 ℃ 및 훨씬 더 바람직하게는 약 65 ℃에서 1X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척이다.
고도로 엄격한 조건은 예를 들어 약 68 ℃에서 5x SSC/5x 덴하르트 용액/1.0% SDS에서의 하이브리드화 및 실온에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서의 세척을 포함한다. 한편으로, 세척을 42 ℃에서 수행할 수도 있다.
숙련가는 어느 조건이 엄격한 및 고도로 엄격한 하이브리드화 조건을 적용하는지를 알 것이다. 상기와 같은 조건에 관한 추가적인 안내는 당해 분야, 예를 들어 하기의 문헌에서 쉽게 입수할 수 있다: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al. (eds.), Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
물론, 오직 폴리 A 서열(예를 들어 mRNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙)에 또는 T(또는 U) 잔기의 상보성 신장부에만 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 특이적으로 하이브리드화하는데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 그 이유는 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 폴리(A) 신장부를 함유하는 임의의 핵산 분자 또는 그의 보체(예를 들어 실제로 임의의 이중 가닥 cDNA 클론)에 하이브리드화할 것이기 때문이다.
본 명세서에서 "핵산 구조물" 또는 "핵산 벡터"는 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 생성되는 인공 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서 핵산 구조물은 천연 핵산 분자(의 부분)를 포함할 수도 있지만 "핵산 구조물"이란 용어는 천연 핵산 분자를 포함하지 않는다. "발현 벡터" 또는 "발현 구조물"이란 용어는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 수행할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 상기와 같은 서열과 양립성인 숙주 유기체를 지칭한다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 전사 조절 서열 및 임의로 3' 전사 종결 신호를 포함한다. 발현 수행에 필요하거나 도움이 되는 추가적인 인자, 예를 들어 발현 인헨서 요소가 또한 존재할 수 있다. 발현 벡터는 적합한 숙주 세포내에 도입되어 상기 숙주 세포의 시험관내 세포 배양물 중에서 암호화 서열의 발현을 수행할 수 있을 것이다. 발현 벡터는 본 발명의 숙주 세포 또는 유기체에서의 복제에 적합할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"이란 용어는 하나 이상의 암호화 서열의 전사를 조절하는 기능을 갖고, 상기 암호화 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 관하여 상류에 위치하며, DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위 및 임의의 다른 DNA 서열, 예를 들어 비제한적으로 전사인자 결합 부위, 리프레서 및 활성자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터의 전사량을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는 작용을 하는 것으로 당해 분야의 숙련가에게 공지된 뉴클레오티드의 임의의 다른 서열의 존재에 의해 구조적으로 식별되는 핵산 단편을 지칭한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생적 조건 하에서 대부분의 세포, 바람직하게는 세균 세포에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 예를 들어 화학적 유도물질의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발생적으로 조절되는 프로모터이다.
"선택성 마커"란 용어는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 친숙한 용어로, 본 명세서에서, 발현시 상기 선택성 마커를 함유하는 세포 또는 세포들을 선택하는데 사용될 수 있는 임의의 유전자 개체를 기재하는데 사용된다. "리포터"란 용어는 마커와 호환 가능하게 사용될 수 있지만, 주로 시각성 마커, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)을 지칭하는데 사용된다. 선택성 마커는 우성 또는 열성이거나 또는 양방향성일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "작동적으로 연결된"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 요소들의 기능 관계의 연결을 지칭한다. 핵산은 상기가 또 다른 핵산 서열과 기능 관계로 놓일 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 전사 조절 서열은 상기가 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된은 연결되는 DNA 서열들이 전형적으로 연속적이며 필요한 경우 2개의 단백질 암호화 영역을 연속적으로 판독 프레임내에서 결합시킴을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "펩티드"란 용어는 대개 한정된 서열을 갖는 아미노산 잔기의 쇄로서 정의된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 펩티드란 용어는 "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어와 호환 가능하다. 본 발명과 관련하여, "펩티드"란 용어는 변형되거나 변형되지 않은 펩티드 결합에 의해 연결되는 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질인 것으로서 정의된다. "펩티드"란 용어는 단쇄 분자, 예를 들어 올리고펩티드 또는 올리고머, 또는 장쇄 분자, 예를 들어 단백질을 지칭한다. 단백질/펩티드는 선형, 분지된 또는 환상일 수 있다. 펩티드는 D 아미노산, L 아미노산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 또한 전사-후 변형과 같은 자연적인 과정에 의해서 또는 화학적 과정에 의해서 변형될 수 있다. 이들 변형의 일부 예는: 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈과의 공유 결합, 헴과의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체와의 공유 결합, 변형된 또는 변형되지 않은 탄수화물 부분에의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체와의 결합, 포스포티딜이노시톨과의 공유 결합, 가교결합, 환화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 분자 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 산화, 인산화, 라세미화 등이다. 따라서, 펩티드의 면역원성을 제거하는 효과를 갖지 않는 펩티드의 임의의 변형은 본 발명의 범위내에 포함된다.
"유전자"란 용어는 적합한 조절 영역(예를 들어 프로모터)에 작동적으로 연결된, 세포 중의 RNA 분자(예를 들어 mRNA)로 전사되는 영역(전사된 영역)을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 대개 다수의 작동적으로 연결된 단편, 예를 들어 프로모터, 5' 리더 서열, 암호화 영역 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3'-번역되지 않은 서열(3'-단부)을 포함할 것이다. "유전자의 발현"은 적합한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동적으로 연결되는 DNA 영역이, 생물학적으로 활성인, 즉 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있는 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. "상동성"이란 용어는 주어진(재조합) 핵산 또는 폴리펩티드 분자 및 주어진 숙주 유기체 또는 숙주 세포간의 관계를 가리키는데 사용되는 경우, 자연에서 상기 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 동일한 종의, 바람직하게는 동일한 변종 또는 균주의 숙주 세포 또는 유기체에 의해 생성됨을 의미하는 것으로 이해된다. 숙주 세포에 상동성인 경우, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로(반드시는 아니지만) 그의 자연 환경에서보다 또 다른(이종) 프로모터 서열 및 적용 가능한 경우 또 다른(이종) 분비 신호 서열 및/또는 종결자 서열에 작동적으로 연결될 것이다. 조절 서열, 신호 서열, 종결자 서열 등이 또한 숙주 세포에 상동성일 수 있는 것으로 생각된다.
"이종성" 및 "외인성"이란 용어는 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질에 관하여 사용될 때 존재하는 유기체, 세포, 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열의 부분으로서 자연적으로 발생하지 않거나, 또는 자연에서 발견되는 경우와 상이한 세포 또는 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열 중의 장소 또는 장소들에서 발견되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 이종 및 외인성 핵산 또는 단백질은 상기가 도입되는 세포에 대해 내인성이 아니고, 또 다른 세포로부터 수득되거나 또는 합성적으로 또는 재조합에 의해 생성되었다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 상기와 같은 핵산은 DNA가 전사되거나 발현되는 세포에 의해 통상적으로 생성되지 않는 단백질, 즉 외인성 단백질을 암호화한다. 유사하게 외인성 RNA는 상기 외인성 RNA가 존재하는 세포에서 통상적으로 발현되지 않는 단백질을 암호화한다. 이종/외인성 핵산 및 단백질을 또한 이질 핵산 또는 단백질이라 칭할 수 있다. 당해 분야의 숙련가가, 발현되는 세포에 대해 이물질로서 인식하는 임의의 핵산 또는 단백질은 본 명세서에서 이종 또는 외인성 핵산 또는 단백질이란 용어에 의해 포함된다. 이종성 및 외인성이란 용어를 또한 핵산 또는 아미노산 서열의 비-천연 조합, 즉 조합된 서열 중 적어도 2개가 서로에 대해 이질적인 조합에 적용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "면역 반응"이란 용어는 표면에서 항원 및/또는 항원성 에피토프를 운반 및/또는 발현하거나 제공하는 특정한 항원성 개체의 분해 및/또는 억제를 유도 및/또는 지원하는 항체 및/또는 세포(예를 들어 T 림프구)의 생성을 지칭한다. "유효 면역보호 반응", "면역보호"란 어구 및 유사한 용어들은 본 발명의 목적을 위해서 백신접종된 대상체에서 병원체에 의한 감염 또는 암에 대해 보호하기 위해서 병원체, 병원체-감염된 세포 또는 암세포의 하나 이상의 항원성 에피토프에 대해 유도되는 면역 반응을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 병원체에 의한 감염에 대한 보호 또는 암에 대한 보호는 감염 또는 암의 절대적인 예방뿐만 아니라, 예를 들어 백신접종되지 않은 감염된 대상체와 비교된, 백신접종된 대상체에서 병원체에 의한 감염 또는 암의 정도 또는 비율의 임의의 검출 가능한 감소, 또는 질병의 중증도 또는 병원체에 의한 감염 또는 암으로부터 생성되는 임의의 증상 또는 상태의 임의의 검출 가능한 감소를 포함한다. 암의 경우에 유효 면역보호 반응은 또한 암세포의 제거, 이에 의한 암크기의 감소 또는 심지어 암의 제거를 포함한다. 이를 성취하기 위한 백신접종을 또한 치료학적 백신접종이라 칭한다. 한편으로, 유효 면역보호 반응을 이전에 병원체로 감염되지 않았던 및/또는 백신접종 시기에 병원체로 감염되지 않거나 아직 암을 앓지 않는 대상체에서 유도할 수 있으며, 상기와 같은 백신접종을 예방학적 백신접종이라 칭할 수 있다.
본 발명에 따라, 본 명세서에서 "항원"이란 용어의 일반적인 사용은 항체에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 지칭한다. 상기 용어는 또한 MHC 분자에 의해 결합될 수 있고 T-세포 수용체에 제공될 수 있는 임의의 분자 또는 분자 단편을 지칭한다. 항원은 예를 들어, 임의로 비-단백질 그룹, 예를 들어 탄수화물 부분 및/또는 지질 부분을 포함하는 단백질성 분자, 즉 폴리아미노산 서열이거나, 또는 항원은 예를 들어 단백질성이 아닌 분자, 예를 들어 탄수화물일 수 있다. 항원은 예를 들어, 특정한 대상체에서 항원-특이성 면역 반응(체액 및/또는 세포 면역 반응)(상기 면역 반응은 바람직하게는 분석 또는 방법을 통해 측정될 수 있다)을 이끌어낼 수 있는 단백질(펩티드, 부분 단백질, 완전길이 단백질)의 임의의 부분(여기에서 상기 단백질은 천연이거나 합성적으로 유래된다), 세포 조성물(전세포, 세포 용해물 또는 붕괴된 세포), 유기체(전체 유기체, 용해물 또는 붕괴된 세포) 또는 탄수화물 또는 다른 분자, 또는 그의 일부일 수 있다.
"항원"이란 용어는 본 명세서에서 적응면역반응의 수용체에 대한 표적으로서 작용하는 구조 물질로서 이해된다. 따라서 항원은 TCR(T-세포 수용체) 또는 BCR(B-세포 수용체) 또는 BCR의 분비된 형태, 즉 항체에 대한 표적으로서 작용한다. 따라서 항원은 대개 보다 큰 구조, 예를 들어 세포 또는 비리온의 부분인 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 다른 합텐일 수 있다. 항원은 신체로부터("자기") 또는 외부 환경("비-자기")으로부터 기원할 수 있다. 면역계는 대개 흉선 중 T 세포의 음성 선택으로 인해 정상적인 조건 하에서 "자기" 항원에 대해 비-반응성이며 오직 외부 세계로부터의 "비-자기" 침입자 또는 예를 들어 질병 상태 하에서 신체 중에 존재하는 변형된/유해 물질만을 인식하고 공격하는 것으로 추정된다. 세포 면역 반응의 표적인 항원 구조물은 가공된 항원 펩티드의 형태로 항원 제공 세포(APC)에 의해 조직적합성 분자를 통해 적응면역계의 T 세포에 제공된다. 제공된 항원 및 조직적합성 분자의 유형에 따라, 다수 유형의 T 세포가 활성화되게될 수 있다. T-세포 수용체(TCR) 인식의 경우, 항원은 세포내부의 작은 펩티드 단편으로 가공되고 주조직적합성 복합체(MHC)에 의해 T-세포 수용체에 제공된다.
"면역원"이란 용어는 본 명세서에서, 바람직하게는 적합한 항원보강제와 함께 대상체에게 투여시, 상기 대상체에서 에피토프 및 상기 에피토프를 포함하는 항원에 대한 특정한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 이끌어내도록 하는 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하거나 암호화하는 개체를 기재하는데 사용된다. 면역원은 항원과 동일하거나 또는 적어도 항원의 일부, 예를 들어 상기 항원의 에피토프를 포함하는 일부를 포함한다. 따라서, 대상체를 특정한 항원에 대해 백신접종하는 것은, 하나의 실시태양에서, 상기 항원의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 면역원의 투여 결과로서, 상기 항원 또는 그의 면역원성 부분에 대해 면역 반응을 이끌어냄을 의미한다. 백신접종은 바람직하게는 보호 또는 치료 효과를 생성시키며, 여기에서 항원(또는 항원의 공급원)에의 후속 노출은 대상체에서 질병 또는 상태를 감소시키거나 예방하는 상기 항원(또는 공급원)에 대한 면역 반응을 이끌어낸다. 백신접종의 개념은 당해 분야에 주지되어 있다. 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 조성물의 투여에 의해 유도되는 면역 반응은 백신 투여 부재에 비해 면역 상태의 임의의 측면(예를 들어 세포 반응, 체액 반응, 사이토킨 생성)의 임의의 검출 가능한 변화일 수 있다.
"에피토프"는 본 명세서에서, 대상체에서 면역 반응을 끌어내기에 충분한 주어진 항원내 단일 면역원 부위로서 정의된다. 당해 분야의 숙련가들은 T 세포 에피토프가 크기 및 조성에 있어서 B 세포 에피토프와 상이하고 I부류 MHC 경로를 통해 제공된 T 세포 에피토프가 II부류 MHC 경로를 통해 제공된 에피토프와 상이함을 인식할 것이다. 에피토프는 면역 반응의 유형에 따라 선형 서열 또는 입체형태적 에피토프(보존된 결합 영역)일 수 있다. 항원은 단일 에피토프만큼 작거나 더 클 수 있으며 다수의 에피토프를 포함할 수 있다. 이와 같이, 항원의 크기는 약 5-12 아미노산(예를 들어 펩티드)만큼 작고 완전길이 단백질, 예를 들어 다량체성 단백질, 단백질 복합체, 비리온, 입자, 전세포, 전체 미생물, 또는 이들의 부분(예를 들어 전세포의 용해물 또는 미생물의 추출물)만큼 클 수 있다.
항원보강제는 본 명세서에서 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 인간 또는 동물 대상체에게 항원과 함께 투여될 때 면역계를 자극하여, 바람직하게는 상기 항원보강제 자체에 대한 특정한 면역 반응을 반드시 생성시키지는 않으면서, 상기 항원에 대한 면역 반응을 유발하거나, 증대시키거나 촉진하는 개체인 것으로 이해된다. 바람직한 항원보강제는 주어진 항원에 대한 면역 반응을, 동일한 조건 하에서 그러나 상기 항원보강제의 부재 하에서 상기 항원에 대해 발생하는 면역 반응에 비해, 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20의 인자까지 증대시킨다. 상응하는 대조용 그룹에 대해 동물 또는 인간 대상체의 그룹에서 항원보강제에 의해 생성되는 바와 같은 주어진 항원에 대한 면역 반응의 통계학적 평균 증대를 측정하기 위한 시험을 당해 분야에서 입수할 수 있다. 항원보강제는 바람직하게는 적어도 2개의 상이한 항원에 대해 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
OMV(또한 "bleb"라 지칭된다)는 그람 음성 세균의 외막으로부터 이탈되는, 20-250 ㎚(때때로 10-500 ㎚) 범위의 직경을 갖는 2층으로 된, 대개는 구형인 막 구조이다. OMV 막은 내부에 인지질(PL), 및 외부에, 다양한 위치에서 막 단백질과 혼합된 리포폴리사카라이드(LPS) 및 PL을 함유하며, 이는 주로 상기가 이탈된 세균 외막의 구조에 영향을 미친다. OMV의 내강은 주변 세포질 또는 세포질로부터의 다양한 화합물, 예를 들어 단백질, RNA/DNA, 및 펩티도글리칸(PG)을 함유할 수 있으나, 세균 세포와 달리, OMV는 자기-복제 능력이 없다. 본 발명과 관련하여 3가지 유형의 OMV가 그들의 생성 방법에 따라 구별될 수 있다. sOMV는 이미 형성된 OMV로부터 온전한 세포를 분리시킴으로써, 배양 상등액으로부터 정제되고 농축되는 자발적인 또는 천연 OMV이다. 세제 OMV, dOMV는 세제, 예를 들어 데옥시콜레이트에 의해 세포로부터 추출되며, 상기 세제는 반응원성 LPS의 함량을 또한 감소시킨다. 세제 추출후에 dOMV는 세포 및 세포 찌꺼기로부터 분리되며 추가로 정제되고 농축된다. 최종적으로, 고유 nOMV란 용어는 본 명세서에서 비-세제 세포 붕괴 기법에 의해 농축된 죽은 세포로부터 생성되거나, 또는 다른(비-붕괴성) 무세제 방법에 의해(예를 들어 킬레이트제, 예를 들어 EDTA를 사용하여)(이는 상기를 야생형 자발적인 OMV 및 세제-추출된 dOMV와 명백하게 구별될 수 있게 한다) 세포로부터 추출되는 OMV에 대해 사용된다.
본 명세서에서 공개 서열 데이터베이스에서 입수할 수 있는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 임의의 참고문헌은 본 문서의 출원일에 입수할 수 있는 바와 같은 서열 엔트리의 버전을 지칭한다.
보르데텔라 LPS의 변형된 지질 A 부분의 아실 쇄 길이
본 발명은 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄의 길이의 감소가 LPS 내독성을 감소시킨다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 발명은 또한 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이의 증가가 보르데텔라 종에 치명적이라는 뜻밖의 발견을 개시한다. 따라서, 본 발명은 아실 트랜스퍼라제의 특정한 부분집합을 보르데텔라 종에 사용하여 아실 쇄의 길이를 감소시킬 수 있고 이렇게 하여 보르데텔라 LPS의 내독성을 감소시킬 수 있음을 개시한다.
따라서, 첫 번째 태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 아실 쇄 길이의 상기와 같은 변형은 보조 분자, 예를 들어 CD14의 결합에 영향을 미칠 수 있었다. 보조 분자는 상이한 세균의 LPS에 대해 현저하게 상이한 결합 친화성을 가지며[23], 이는 아실 쇄 길이에 의해 잠재적으로 영향을 받을 수 있었다.
야생형 보르데텔라 리포폴리사카라이드(LPS)는 5-아실화되는 지질 A 부분을 함유한다. 야생형 보르데텔라 페르투씨스 LPS의 지질 A 부분을 도 1에 도시한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 보르데텔라 페르투씨스의 지질 A 부분은 4개의 1차 아실 쇄 및 하나의 2차 아실 쇄를 함유한다. 2차 아실 쇄는 1차 아실 쇄에 2'(2 프라임)번 위치에서 연결되며 상기 2차 아실 쇄의 야생형 길이는 C14이다. 더욱 또한 2차 아실 쇄와 대조적으로, 1차 아실 쇄는 항상 그의 3'-단부(3-OH)에서 하이드록실화된다.
1차 아실 쇄는 각각 지질 A 부분의 2 및 3번 위치 및 2'(2 프라임) 및 3'(3 프라임)번 위치에 있다. 1차 아실 쇄의 아실 쇄의 야생형 길이는 2, 2' 및 3'번 위치에서 C14이고 야생형 아실 쇄의 길이는 3번 위치에서 C10이다.
또한, "2, 3, 2' 또는 3'번 위치의 아실 쇄" 및 "2, 3, 2' 또는 3'번 위치의 1차 아실 쇄"란 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 생각된다.
더욱 또한, 본 명세서에서 지질 A 부분에서 "프라임" 위치의 아실 쇄에 대해 언급할 때, 비-환원 단부상의 글루코스아민의 위치를 의도하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 3'번 위치의 아실 쇄는 비-환원 단부상의 글루코스아민의 3번 위치에 부착되는 아실 쇄이다.
또한, 본 명세서에서 지질 A 부분에서 특정한(즉 프라임이 아닌) 위치의 아실 쇄에 대해 언급할 때, 환원 단부상의 글루코스아민의 위치를 의도하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 3번 위치의 아실 쇄는 환원 단부상의 글루코스아민의 3번 위치에 부착되는 아실 쇄이다. 유사하게, "보다 큰 아실 쇄" 및 "보다 긴 아실 쇄"란 어구는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 수 있다.
"보다 짧은 아실 쇄" 및 "보다 작은 아실 쇄"란 어구는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 보다 짧은 아실 쇄는 아실 쇄의 완전한 부재를 포함하지 않는 것으로 생각된다. 따라서, 보다 짧은 아실 쇄는, 야생형 지질 A 부분의 동일 위치의 아실 쇄의 길이보다 짧기는 하지만, 아실 쇄의 존재를 나타낸다. 바람직하게는, 아실 쇄는 3-하이드록시프로피온산, 또는 프로피온산(C3) 이상이다.
본문에서 야생형 지질 A 부분(또는 변형되지 않은 지질 A 부분)을 언급하는 경우, 달리 표시되지 않는 한, 최소한 도 1에 예시된 바와 같은 야생형 보르데텔라 페르투씨스 LPS의 지질 A 부분을 의도한다. 유사하게, 다른 보르데텔라 종의 야생형 지질 A 부분은 개시된 발명의 부분이다. 보르데텔라 지질 A 부분은 예를 들어 문헌[Caroff et al., Microbes and Infection 4 (2002):915-926](본 명세서에 참고로 인용된다)의 도 2에 개시되어 있다. 야생형 지질 A 부분은 5- 또는 6-아실화될 수 있다. 야생형 LPS의 지질 A 부분이 6-아실화되는 경우, 2개의 2차 아실 쇄(하나는 2'번 위치에 및 하나는 3'번 위치에)가 존재한다. 지질 A 부분의 보르데텔라 야생형 아실 쇄가 6-아실화되는 경우, 2차 아실 쇄에 대해 이루어진 본문의 임의의 언급은 2'번 위치 및/또는 3'번 위치의 2차 아실 쇄로서 해석되어야 한다.
바람직한 실시태양에서, 단지 하나의 아실 쇄의 길이가 동일한 위치의 야생형 지질 A 부분의 아실 쇄보다 짧다. 바람직하게는, 하나의 1차 아실 쇄의 길이가 더 짧다. 보다 바람직하게는, 오직 2, 3, 2' 또는 3'번 위치의 1차 아실 쇄의 길이만이 각각 2, 3, 2' 또는 3'번 위치의 야생형 보르데텔라 아실 쇄의 길이보다 짧다. 한편으로, 오직 2차 아실 쇄의 길이만이 야생형 보르데텔라 2차 아실 쇄의 길이보다 짧다.
또 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다. 특히, 적어도 2번 위치의 아실 쇄의 길이가 2번 위치의 야생형 길이보다 짧으며, 따라서 C14보다 짧다. 한편으로, 적어도 3번 위치 또는 2'번 위치의 아실 쇄가 각각 3 또는 2'번 위치의 야생형 길이보다 짧으며, 따라서 각각 C10 또는 C14보다 짧다. 또 다른 실시태양에서, 적어도 3'번 위치의 아실 쇄의 길이가 3'번 위치의 아실 쇄의 야생형 길이보다 짧으며, 따라서 C14보다 짧다. 한편으로, 적어도 2차 아실 쇄의 아실 쇄의 길이가 야생형 2차 아실 쇄의 길이보다 짧으며, 따라서 C14보다 짧다.
따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 더 짧은 아실 쇄는
i) 지질 A 부분의 3'번 위치의 아실 쇄;
ii) 지질 A 부분의 2'번 위치의 1차 아실 쇄;
iii) 지질 A 부분의 2'번 위치의 2차 아실 쇄; 및
iv) 지질 A 부분의 2번 위치의 아실 쇄
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 지질 A 부분의 적어도 2, 3, 4 또는 (모든)5 아실 쇄의 길이는 동일한 위치의 야생형 길이보다 짧다. 바람직하게는 (적어도) 2 및 2'번 위치의 아실 쇄의 길이는 각각 2 및 2'번 위치의 야생형 아실 쇄의 아실 쇄의 길이보다 짧다.
따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 아실 쇄는 적어도 2, 4 또는 6 C 원자 더 짧다. 상기 적어도 하나의 더 짧은 아실 쇄는 상기에 명시된 바와 같은 아실 쇄 중 어느 하나일 수 있다. 상기 적어도 하나의 더 짧은 아실 쇄는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 동일한 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 C 원자 더 짧다. 보다 바람직하게는, 상기 아실 쇄는 적어도 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧고, 보다 바람직하게는 적어도 4 또는 2 C 원자 더 짧고, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 2 C 원자 더 짧다. 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 변형된 아실 쇄는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 동일한 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 2 C 원자 더 짧다.
바람직한 실시태양에서, 2번 위치의 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 2번 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 C 원자 더 짧다. 따라서, 변형된 지질 A 부분의 2번 위치의 아실 쇄의 길이는 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12이다.
한편으로 또는 또한, 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 14, 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 C 원자 더 짧다. 따라서, 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10, C12 또는 C14, 및 보다 바람직하게는 C2, C4, C6 또는 C8이다.
한편으로 또는 또한, 2'번 위치의 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 2'번 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 C 원자 더 짧다. 따라서, 변형된 지질 A 부분의 2'번 위치의 아실 쇄의 길이는 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12이다.
한편으로 또는 또한, 3'번 위치의 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 3'번 위치의 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 C 원자 더 짧다. 따라서, 변형된 지질 A 부분의 3'번 위치의 아실 쇄의 길이는 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12이다.
최종적으로, 한편으로 또는 또한, 2차 아실 쇄의 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분의 2차 아실 쇄의 길이에 비해 바람직하게는 적어도 12, 10, 8, 6, 4 또는 2 C 원자 더 짧다. 한편으로, 상기 더 짧은 아실 쇄는 바람직하게는 기껏해야 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 C 원자 더 짧다. 따라서, 변형된 지질 A 부분의 2차 아실 쇄의 길이는 바람직하게는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12이다.
또한, 야생형 아실 쇄의 길이보다 짧지 않은 변형된 지질 A 부분의 1, 2, 3 또는 4 아실 쇄의 길이는 야생형 지질 A 부분의 동일한 위치의 아실 쇄보다 더 큰 길이를 가질 수 있다. 따라서, 추가의 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 적어도 하나의 아실 쇄의 길이는, 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 길이가 더 짧은 동일한 변형된 지질 A 부분 중의 또 다른 아실 쇄 외에, 지질 A 부분 중의 동일한 위치의 야생형 아실 쇄의 길이보다 더 크다. 바람직하게는, 적어도 2, 3, 2' 및/또는 3'번 위치, 보다 바람직하게는 2, 2' 및/또는 3'번 위치의 1차 아실 쇄의 길이는 지질 A 부분 중의 동일한 위치의 야생형 아실 쇄의 길이보다 더 크다. 한편으로 또는 또한, 2차 아실 쇄의 길이는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 2차 아실 쇄의 길이보다 크다.
그러나 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 동일한 3번 위치의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄보다 더 큰 길이를 갖지 않는다.
따라서, 3번 위치의 아실 쇄는 상술한 바와 같이, 바람직하게는 C16 이하(야생형 보르데텔라의 지질 A 부분이 예를 들어 비 파라페르투씨스(B. parapertussis)인 경우에), C12 이하(야생형 보르데텔라의 지질 A 부분이 예를 들어 비 브론키셉티카(B. bronchiseptica) 또는 비 힌지이(B. hinzii)인 경우에), 또는 C10 이하(야생형 보르데텔라의 지질 A 부분이 예를 들어 비 페르투씨스인 경우에)이다. 특히, 본 발명은 하기에 예시되는 바와 같이 3번 위치의 아실 쇄의 길이를 동일한 3번 위치의 야생형 아실 쇄의 길이 이상으로 증가시키는 것이 보르데텔라 종에 치명적일 수 있음을 교시한다. 따라서, 가장 바람직한 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 C10을 초과하지 않는다.
유사하게, 바람직한 실시태양에서 변형된 지질 A의 2, 2' 또는 3'번 위치의 1차 아실 쇄의 길이는 C14를 초과하지 않고/않거나, 2차 아실 쇄의 길이는 C14를 초과하지 않는다.
한편으로 또는 또한, 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 3'번 위치의 아실 쇄의 길이와 같다. 따라서 3번 위치의 아실 쇄뿐만 아니라 3'번 위치의 아실 쇄는 모두 C2, C4, C6, C10, C12, C14 또는 C16이다. 바람직하게는 상기 두 아실 쇄는 모두 C10 또는 C12이고, 가장 바람직하게는 상기 두 아실 쇄는 모두 C10이다.
상기에 개략한 바와 같이, 변형된 지질 A 부분의 하나 이상의 아실 쇄의 길이는 지질 A 부분의 동일한 위치의 야생형 아실 쇄의 길이보다 짧다. 야생형 길이에 비해 더 짧지 않은 아실 쇄는 야생형 아실 쇄의 길이와 동일한 길이를 갖거나 더 길 수도 있다. 바람직하게는, 야생형 길이에 비해 더 짧지 않은 아실 쇄는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄와 동일한 길이로 남아있는다, 예를 들어 변경되지 않은 채로 남아있는다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 동일한 3번 위치의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄와 동일한 길이를 갖는다. 따라서, 변형된 보르데텔라 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이는 C10 이다. 또한 또는 한편으로, 변형된 지질 A 부분의 2, 2' 및 3'번 위치 중 적어도 하나의 아실 쇄는 각각 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 2, 2' 또는 3'번 위치의 아실 쇄와 동일한 길이를 가질 수 있다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 2, 2' 또는 3'번 위치 중 적어도 하나의 아실 쇄의 길이는 C14이다. 유사하게, 2'번 위치의 2차 아실 쇄의 길이는 야생형 2차 아실 쇄와 동일한 길이이다, 즉 C14이다.
따라서, 본 발명의 변형된 보르데텔라 지질 A 부분은 야생형 보르데텔라 지질 A 부분 중 동일한 위치(들)의 아실 쇄(들)보다 짧은 하나 이상의 아실 쇄 및/또는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분 중 동일한 위치(들)의 아실 쇄(들)보다 긴 하나 이상의 아실 쇄 및/또는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분 중 동일한 위치(들)의 아실 쇄(들)와 동일한 길이를 갖는 하나 이상의 아실 쇄를 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, 변형된 지질 A 부분은 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 동일한 위치의 아실 쇄의 길이보다 짧은 적어도 하나의 아실 쇄를 갖는다.
또 다른 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C-원자의 총수는: 상술한 바와 같이 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C-원자의 총수와 같다. 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C-원자의 총수는 총 66 C 원자에서 C14(2번 위치) + C10(3번 위치) + C14(2'번 위치) + C14(2차 아실 쇄) + C14(3'번 위치)이다. 바람직한 실시태양에서, 변형된 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C 원자의 총수는 따라서 66 C 원자이다.
한편으로, 변형된 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C 원자의 총수는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C 원자의 총수보다 크다, 따라서 66 C 원자 초과, 바람직하게는 68, 70, 72 또는 74 C 원자 초과이다.
그러나, 바람직하게는 변형된 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C 원자의 총수는 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄 중 C 원자의 총수보다 낮다, 따라서 66 C 원자 미만, 바람직하게는 총 64, 62, 60, 58, 56, 54, 52, 50, 48, 46, 44, 42 또는 40 C 원자이다.
특히, 하기에 예시되는 바와 같은 본 발명은 독성에 대한 효과가 보다 짧은 아실 쇄의 위치와 별개로 획득됨을 보인다. 따라서, 지질 A 분자의 소수성 부분의 총 부피는 명백하게 hTLR4 복합체에 대한 적합한 결합 및 상기 복합체의 활성화에 중요하다. 추정상, 보다 짧은 아실 쇄는 LPS와 그의 수용체와의 상호작용에 영향을 미친다. 막 상에서, TLR4는 MD-2와 복합체를 형성한다[21]. MD-2는 LPS에 결합하고 소수성 포켓 중에 6-아실화된 지질 A의 6개의 아실 쇄 중 5개를 수용하는 한편, 하나의 쇄는 외부에 놓이고 두 번째 TLR4-MD-2 복합체와의 결합을 통해 TLR4 이량체화를 자극한다. 또한 지질 A의 포스페이트기는 상기 두 번째 TLR4 분자상의 양으로 하전된 잔기와 상호작용함으로써 수용체 이량체화에 기여한다. 4-아실화된 지질 A 종에서, 아실 쇄는 MD-2 리간드-결합 포켓 중에 묻히며 수용체 이량체화를 자극할 수 없는 반면, 아실 쇄의 전시는 5-아실화된 LPS에서 가변적이다[22]. 따라서 아실 쇄의 수, 길이 및 위치에 의해 결정되는 바와 같은 리간드의 전체 아실-쇄 부피는 TLR4 이량체화를 촉발하는 아실 쇄의 전시를 결정할 수 있다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 보르데텔라 지질 A 중의 아실 쇄의 길이의 감소는 상기 아실 쇄의 부피를 감소시키고, 이는 MD-2 결합 포켓내 그의 전체 수용을 허용할 수 있으며 이에 의해 수용체 이량체화에 필요한 아실 쇄의 노출을 방지할 수 있다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 보르데텔라 LPS는 상기에 정의된 바와 같은 변형된 지질 A 부분을 갖는다. 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 본 발명의 보르데텔라 LPS는 달리, 보르데텔라 속의 세균으로부터 수득되거나 수득될 수 있는 리포폴리사카라이드의 구조를 갖는다. 보르데텔라 속은 그람 음성 세균의 9개 종을 포함한다. 이들 중 가장 광범위하게 연구된 것은 호흡기 병원체 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 및 보르데텔라 브론키셉티카이다. 비 페르투씨스는 오직 인간만을 감염시키며 유아의 백일해 및 성인의 지속적인 호흡기 감염의 원인 인자이다. 비 파라페르투씨스는 2개의 별도의 계통으로서 존재한다. 하나는 인간 숙주에 적응되어 백일해를 일으키며; 다른 하나는 양 숙주에 적응되어 만성 폐렴을 야기할 수 있다. 대조적으로, 비 브론키셉티카는 다수의 동물의 기도에서 콜로니화하며, 일부 농장 동물, 반려 동물 및 야생 동물에서 호흡기 감염을 야기하지만, 대부분의 비 브론키셉티카 감염은 무증상성이며 만성적이다. 비 브론키셉티카는 때때로 인간의 기도에서 단리되고 감염된 동물과의 접촉을 통해 획득되는 듯하다(Preston et al, J. of Biol. Chem, 2006, 281(26):18135-18144).
예를 들어 비 페르투씨스, 비 파라페르투씨스, 비 힌지이 및 비 브론키셉티카의 지질 A 부분은 문헌[Caroff et al., Microbes and Infection 4 (2002):915-926](본 명세서에 참고로 인용된다)의 도 2에 개시되어 있다. 비 브론키셉티카 및 비 파라페르투씨스의 LPS와 대조적으로, 비 페르투씨스의 LPS는 O-항원 도메인을 결코 함유하지 않는다(Peppler, 1984; Di Fabio et al., 1992). 따라서, 비 페르투씨스 LPS를 종종 리포올리고사카라이드(LOS)라 칭한다. 본 발명과 관련하여, "LOS" 및 "LPS"란 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 일관성을 이유로, 본 발명자들은 차후에 LPS라 칭할 것이다. 비 페르투씨스는 2개의 우성 LPS 형태인 밴드 A 및 밴드 B LPS를 생성시킨다(Peppler, 1984). 밴드 B LPS는 지질 A 및 9개의 탄수화물로 이루어지는 코어 올리고사카라이드로 구성된다(Caroff et al., 2000). 밴드 B LPS에, N-아세틸 글루코스아민, 2,3-디아세트아미도-2,3-디데옥시-만뉴론산, 및 2-아세트아미도-4-N-메틸-2,4-디데옥시-퓨코스로 이루어지는 말단 트리사카라이드의 부가는 밴드 A라 지칭되는 LPS를 형성시킨다.
따라서 바람직하게는, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 상기 LPS는 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 또는 보르데텔라 브론키셉티카, 또는 예를 들어 본 명세서에서 하기에 기재되는 바와 같은 유전자 변형을 갖는 상기 종의 균주의 구조를 갖는다. 바람직하게는 보르데텔라 LPS는 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 보르데텔라 페르투씨스 또는 보르데텔라 파라페르투씨스의 구조를 가지며, 이 중에서 보르데텔라 페르투씨스가 가장 바람직하다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS에 관한 것이며, 여기에서 상기 변형된 지질 A 부분은 하기 화학식 I의 구조를 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00002
상기 식에서, X2, X3, X2', X3', R2, R3, R2', 및 R3'은 각각 독립적으로 -H, -OH, -Y, -O-(C=O)-CH(OH)-Y, 및 -O-(C=O)-Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고,
Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택되는 정수이다.
바람직하게는, X2, X3, X2', X3', R2, R3, R2', 및 R3'은 각각 독립적으로 -H, -OH, -Y, 및 -O-(C=O)-Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택되는 정수이다.
화학식 I의 바람직한 화합물에서, X2, X3, X2', 및 X3'은 각각 독립적으로 -H, -OH, -O-(C=O)-CH(OH)-Y, 및 -O-(C=O)-Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 독립적으로 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중에서 선택된다.
화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2, R3, R2', 및 R3'은 각각 -Y이고, 여기에서 Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 독립적으로 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중에서 선택된다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, Y는 각각의 X2, X3, X2', X3', R2, R3, R2', 및 R3'에 대해서 상이할 수 있으며, 따라서 Y의 다수의 상이한 경우가 화학식 I의 단일 화합물 내에서 발생할 수 있다. 상응하게, 화학식 I의 바람직한 화합물에서,
X2는 -H, -OH, -YX2, -O-YX2, -O-(C=O)-CH(OH)-YX2, 및 -O-(C=O)-YX2로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YX2는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는 X2는 -OH 또는 -O-(C=O)-YX2이고, 가장 바람직하게는 X2는 -OH이고;
X3은 -H, -OH, -YX3, -O-YX3, -O-(C=O)-CH(OH)-YX3, 및 -O-(C=O)-YX3로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YX3은 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는 X3 은 -OH 또는 -H이고, 가장 바람직하게는 X3 은 -OH이고;
X2'는 -H, -OH, -YX2', -O-YX2', -O-(C=O)-CH(OH)-YX2', 및 -O-(C=O)-YX2'로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YX2'는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는, X2'는 -OH, -O-(C=O)-CH(OH)-YX2', 또는 -O-(C=O)-YX2'이고, 여기에서 X2'가 -O-(C=O)-YX2'일 때, n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 11, 또는 13 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 11 또는 13이고 가장 바람직하게는 n은 13이며, 여기에서 X2'가 -O-(C=O)-CH(OH)-YX2'일 때, n은 바람직하게는 2, 4, 6, 8, 10, 또는 12 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 10 또는 12이고, 가장 바람직하게는 n은 12이고; 가장 바람직하게는, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이고, 여기에서 n은 13이고;
X3'는 -H, -OH, -YX3', -O-YX3', -O-(C=O)-CH(OH)-YX3', 및 -O-(C=O)-YX3'로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YX3'는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는, X3'는 -OH 또는 -O-(C=O)-YX3'이고, 여기에서 X3'가 -O-(C=O)-YX3'일 때 n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 보다 바람직하게는 n은 13 또는 15이고 가장 바람직하게는 n은 15이고; 가장 바람직하게는 X3'은 -OH이고;
R2는 -H, -OH, -YR2, -O-YR2, -O-(C=O)-CH(OH)-YR2, 및 -O-(C=O)-YR2로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YR2는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는, R2 는 YR2이고; 여기에서 n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 9 또는 11이고, 가장 바람직하게는 n은 11이고, 가장 바람직하게는 R2 는 YR2이고, 여기에서 n은 11이고;
R3은 -H, -OH, -YR3, -O-YR3, -O-(C=O)-CH(OH)-YR3, 및 -O-(C=O)-YR3로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YR3은 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는 R3은 YR3이고, 여기에서 n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 11, 또는 13 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 7, 9, 또는 13 중에서 선택된 정수이고, 가장 바람직하게는 n은 7이고; 가장 바람직하게는 R3 은 YR3이고, 여기에서 n은 7이고;
R2'은 -H, -OH, -YR2', -O-YR2', -O-(C=O)-CH(OH)-YR2', 및 -O-(C=O)-YR2'로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YR2'는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는, R2'는 YR2'이고, 여기에서 n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 9 또는 11이고 가장 바람직하게는 n은 11이고; 가장 바람직하게는, R2'는 YR2'이고, 여기에서 n은 11이고;
R3'은 -H, -OH, -YR3', -O-YR3', -O-(C=O)-CH(OH)-YR3', 및 -O-(C=O)-YR3'로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 YR3'은 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택된 정수이고; 바람직하게는, R3'은 YR3'이고, 여기에서 n은 바람직하게는 1, 3, 5, 7, 9, 또는 11 중에서 선택된 정수이고, 보다 바람직하게는 n은 7 또는 11이고, 가장 바람직하게는 n은 11이고; 가장 바람직하게는, R3'은 YR3'이고, 여기에서 n은 11이고;
화학식 I의 화합물이 -YX2, -YX3, -YX2', 또는 -YX3'을 포함하는 경우, n은 바람직하게는 홀수, 보다 바람직하게는 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15, 가장 바람직하게는 11 또는 13이다. 화학식 I의 화합물이 -YR2, -YR3, -YR2', 또는 -YR3'을 포함하는 경우, n은 바람직하게는 홀수, 보다 바람직하게는 3, 5, 7, 9, 11, 또는 13, 가장 바람직하게는 7 또는 11이다.
화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2는 YR2이고, 이때 n은 9 또는 11이다. 상응하게, 화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2는 -(CH2)9-H이거나 R2는 -(CH2)11-H이다. 화학식 I의 더욱 바람직한 화합물에서, X2는 -OH이다. 화학식 I의 보다 바람직한 화합물에서, R2는 -(CH2)9-H 또는 -(CH2)11-H이고 X2는 -OH이다. 화학식 I의 가장 바람직한 화합물에서, R2는 -(CH2)11-H이고 X2는 -OH이다.
화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2'는 YR2'이고 이때 n은 9 또는 11이다. 상응하게, 화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2'는 -(CH2)9-H이거나 또는 R2'는 -(CH2)11-H이다. 화학식 I의 더욱 바람직한 화합물에서, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다. 화학식 I의 보다 바람직한 화합물에서, R2'는 -(CH2)9-H이거나 또는 R2'는 -(CH2)11-H이고 X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다. 화학식 I의 가장 바람직한 화합물에서, R2'는 -(CH2)11-H이고 X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다.
화학식 I의 보다 바람직한 화합물에서, R2는 YR2이고, 이때 n은 9 또는 11이고 R2'는 YR2'이고, 이때 n은 9 또는 11이다. 상응하게, 화학식 I의 바람직한 화합물에서, R2 및 R2'는 -(CH2)9-H 또는 -(CH2)11-H이다. 화학식 I의 더욱 바람직한 화합물에서, X2는 -OH이고 X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다. 화학식 I의 훨씬 더 바람직한 화합물에서, R2 및 R2'는 -(CH2)9-H 또는 -(CH2)11-H이고, X2는 -OH이고, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다. 보다 바람직하게, R2 및 R2'는 모두 -(CH2)9-H이거나 또는 모두 -(CH2)11-H이고, 훨씬 더 바람직하게는 R2 및 R2'는 -(CH2)11-H이다. 화학식 I의 가장 바람직한 화합물에서, R2 및 R2'는 -(CH2)11-H이고, X2는 -OH이고, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이다.
화학식 I의 바람직한 화합물에서, R3은 YR3이다. 화학식 I의 더욱 바람직한 화합물에서, R3'은 YR3'이다. 화학식 I의 더욱 바람직한 화합물에서, R3은 YR3이고 R3'은 YR3'이다. 화학식 I의 훨씬 더 바람직한 화합물에서, R3은 YR3이고, R3'은 YR3'이고, X3은 -H 또는 -OH이다.
화학식 I의 가장 바람직한 화합물들의 한 세트에서, R2 및 R2'는 -(CH2)9-H이고, X2는 -OH이고, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이고, R3은 YR3이고, R3'은 YR3'이고 X3은 -H 또는 -OH이다. 상기와 같은 화합물은 화학식 II12를 갖는다. 화학식 II12는 하기에 묘사된다.
화학식 I의 가장 바람직한 화합물들의 또 다른 세트에서, R2 및 R2'는 -(CH2)11-H이고, X2는 -OH이고, X2'는 -O-(C=O)-YX2'이고, R3은 YR3이고, R3'은 YR3'이고 X3은 -H 또는 -OH이다. 상기와 같은 화합물은 화학식 II14를 갖는다. 화학식 II14는 하기에 묘사된다. 화학식 II12 또는 II14의 화합물을 화학식 II의 화합물로서 지칭할 수 있다. 상기와 같은 경우에, 화학식 II12 및 II14 모두 독립적으로 지칭된다.
[화학식 II12]
Figure pct00003
[화학식 II14]
Figure pct00004
화학식 II의 바람직한 화합물에서, X3은 -OH이다. 화학식 II의 다른 바람직한 화합물에서, X3'은 -OH이다. 화학식 II의 보다 바람직한 화합물에서, X3 및 X3'은 -OH이다.
화학식 II의 바람직한 화합물에서, YR3은 -(CH2)7-H이다. 화학식 II의 보다 바람직한 화합물에서, YR3은 -(CH2)7-H이고, X3 및 X3'은 -OH이다. 상기와 같은 화합물은 화학식 III12 또는 화학식 III14를 갖는다. 화학식 III12 및 화학식 III14는 하기에 묘사된다. 화학식 III12 또는 III14의 화합물을 화학식 III의 화합물로서 지칭할 수 있다. 상기와 같은 경우에, 화학식 III12 및 III14 모두 독립적으로 지칭된다.
[화학식 III12]
Figure pct00005
[화학식 III14]
Figure pct00006
화학식 II의 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11이고; 보다 바람직하게, n은 YR3'의 경우 5, 7, 또는 9이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7 또는 9이고; 가장 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7이다. 화학식 III의 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11이고; 보다 바람직하게, n은 YR3'의 경우 5, 7, 또는 9이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7 또는 9이고; 가장 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7이다.
화학식 II의 바람직한 화합물에서, n은 YX2'의 경우 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13이고; 보다 바람직하게, n은 YX2'의 경우 7, 9, 11, 또는 13이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YX2'의 경우 9, 11, 또는 13이고; 가장 바람직하게, n은 YX2'의 경우 11 또는 13이다. 화학식 III의 바람직한 화합물에서, n은 YX2'의 경우 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13이고; 보다 바람직하게, n은 YX2'의 경우 7, 9, 11, 또는 13이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YX2'의 경우 9, 11, 또는 13이고; 가장 바람직하게, n은 YX2'의 경우 11 또는 13이다.
화학식 II의 보다 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 5, 7, 9, 또는 11이고 n은 YX2'의 경우 7, 9, 11, 또는 13이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7 또는 9이고 n은 YX2'의 경우 9, 11, 또는 13이고; 가장 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 11 또는 13이다. 화학식 II의 매우 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 11이다. 화학식 II의 또 다른 매우 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 13이다. 화학식 III의 보다 바람직한 화합물에서, n은 YR3'의 경우 5, 7, 9, 또는 11이고 n은 YX2'의 경우 7, 9, 11, 또는 13이고; 훨씬 더 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7 또는 9이고 n은 YX2'의 경우 9, 11, 또는 13이고; 가장 바람직하게, n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 11 또는 13이다.
화학식 III의 매우 바람직한 화합물에서, 상기 화합물은 화학식 III14를 갖고 n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 11이다. 화학식 III의 또 다른 매우 바람직한 화합물에서, 상기 화합물은 화학식 III14를 갖고 n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 13이다. 화학식 III의 매우 바람직한 화합물에서, 상기 화합물은 화학식 III12를 갖고 n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 11이다. 화학식 III의 또 다른 매우 바람직한 화합물에서, 상기 화합물은 화학식 III12를 갖고 n은 YR3'의 경우 7이고 n은 YX2'의 경우 13이다.
추가의 실시태양에서, 상기 정의된 바와 같은 LPS는 본 명세서에서 하기에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득되거나 수득될 수 있다.
유전자 변형된 세균
두 번째 태양에서, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이다. 상기 세균은 바람직하게는 상기에 정의된 바와 같은 변형된 지질 A 부분을 갖는 LPS를 포함한다. 상기 유전자 변형된 세균은 그의 전체 LPS의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%가 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 지질 A 부분을 갖는 LPS를 포함할 수 있다. 한편으로, 전체 LPS의 100%가 본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 지질 A 부분을 갖는다.
바람직한 실시태양에서, 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형된다. 바람직하게, 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형은 세포에 이종 LpxA, LpxL 또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제 활성 중 적어도 하나를 부여한다.
이종 아실 트랜스퍼라제 활성의 도입을 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을, 내인성 야생형 보르데텔라 아실 트랜스퍼라제 유전자를 변형시킴으로써, 바람직하게는 내인성 lpxA, lpxL, 및 lpxD 아실 트랜스퍼라제 유전자 중 적어도 하나를 변형시킴으로써 도입시킬 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 내인성 아실 트랜스퍼라제의 분자 자(molecular ruler)의 구조를 변형시킨다. 이를 위해서, 아실 트랜스퍼라제가 아실 쇄 길이에 대한 특이성을 결정하는 엄격한 분자(탄화수소) 자를 가짐은 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서 상기와 같은 탄화수소 자의 구조를 변형시키는 것은 아실 쇄 길이에 대한 특이성을 변화시킬 것이다. 아실 트랜스퍼라제 탄화수소 자의 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있거나(예를 들어 문헌[Wyckoff TJ et al, J Biol Chem. 1998 273(49):32369-72] 및 문헌[Williams AH et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 ;104(34):13543-50]을 참조하시오) 또는 예를 들어 공지된 탄화수소 자를 갖는 아실 트랜스퍼라제와의 인실리코 정렬을 사용하여 간단히 검색할 수 있다.
내인성 아실 트랜스퍼라제를, 아실 쇄 길이의 특이성을 변화시키기 위해서 당해 분야에 통상적으로 공지된 임의의 방법, 예를 들어 특정 뉴클레오티드 또는 코돈의 치환, 부가 또는 결실을 사용하여 변형시킬 수 있다.
아실 트랜스퍼라제 활성을 바람직하게는 보르데텔라 속의 세균 내로 적어도 하나의 이종 유전자의 발현에 의해, 예를 들어 이종 아실 트랜스퍼라제를 발현시킴으로써 도입시킨다. 이를 위해서, 단일 또는 다양한 이종 아실 트랜스퍼라제를 세균내에 도입시켜 본 명세서에 개시된 바와 같은 변형된 LPS를 수득할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기와 같은 아실 트랜스퍼라제는 일정한(보다 짧은) 길이의 아실 쇄를 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 전달할 수 있으며, 이에 의해 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 획득할 수 있다. 이종 아실 트랜스퍼라제의 발현을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 성취할 수 있다.
특히 바람직한 실시태양에서, 이종 아실 트랜스퍼라제 활성의 도입을, LpxA, LpxD 및 LpxL 중 적어도 하나인 이종 아실 트랜스퍼라제를 도입시킴으로써 수행한다. 한편으로 또는 또한, 상기 도입된 이종 아실 트랜스퍼라제는 LpxM이다. 상기와 같은 아실 트랜스퍼라제는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 정의된 바와 같은 야생형 보르데텔라 세균이 아닌 임의의 그람 음성 세균으로부터 수득되거나 수득될 수 있다. 더욱 또한, 상기 이종 아실 트랜스퍼라제를 야생형 보르데텔라 세균과 상이한 종의 보르데텔라로부터 수득하거나 수득할 수 있다.
아실 쇄 길이의 변화는 아실 트랜스퍼라제 중의 분자 자(상이한 세균 종의 상기 효소마다 다를 수 있다)에 의해 결정된다. 따라서 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 이종 LpxA 아실 트랜스퍼라제는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12의 길이를 갖는 아실 쇄를 전달할 수 있다. 유사하게, 이종 LpxD 아실 트랜스퍼라제는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12의 길이를 갖는 아실 쇄를 전달할 수 있고, 이종 LpxL 아실 트랜스퍼라제는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12의 길이를 갖는 아실 쇄를 전달할 수 있고, 및/또는 이종 LpxM 아실 트랜스퍼라제는 C2, C4, C6, C8, C10 또는 C12의 길이를 갖는 아실 쇄를 전달할 수 있다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 아실 트랜스퍼라제를 네이세리아(Neisseria) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속으로부터 수득하거나 또는 수득할 수 있다. 따라서, 아실 트랜스퍼라제 LpxA를 네이세리아 속, 포르피로모나스 속 또는 슈도모나스 속으로부터 수득하거나 또는 수득할 수 있고, 아실 트랜스퍼라제 LpxD를 네이세리아 속, 포르피로모나스 속 또는 슈도모나스 속으로부터 수득하거나 또는 수득할 수 있고, 및/또는 아실 트랜스퍼라제 LpxL을 네이세리아 속, 포르피로모나스 속 또는 슈도모나스 속으로부터 수득하거나 또는 수득할 수 있다. 그러나, 다른 아실 트랜스퍼라제들이 본 발명에 사용하기에 균등하게 적합할 수 있음은 숙련가에게 명백하다.
네이세리아 속의 바람직한 종은 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica)를 포함하며, 이때 네이세리아 메닌지티니스 종이 가장 바람직하다.
포르피로모나스 속의 바람직한 종은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 포르피로모나스 아사카로리티카(Porphyromonas asaccharolytica), 포르피로모나스 칸진지발리스(Porphyromonas cangingivalis), 포르피로모나스 카노리스(Porphyromonas canoris), 포르피로모나스 칸술치(Porphyromonas cansulci), 포르피로모나스 카토니아에(Porphyromonas catoniae), 포르피로모나스 시르쿰덴타리아(Porphyromonas circumdentaria), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 포르피로모나스 엔도돈탈리스(Porphyromonas endodontalis), 포르피로모나스 진지비카니스(Porphyromonas gingivicanis), 포르피로모나스 굴라에(Porphyromonas gulae), 포르피로모나스 레비이(Porphyromonas levii), 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae) 및 포르피로모나스 살리보사(Porphyromonas salivosa)를 포함하며, 여기에서 포르피로모나스 진지발리스가 가장 바람직하다.
슈도모나스 속의 바람직한 종은 슈도모나스 아에루기노사(Pesudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pesudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스(Pesudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 시린가에(Pesudomonas syringae)를 포함하며, 이때 슈도모나스 아에루기노사 종이 가장 바람직하다.
특히 바람직한 실시태양에서, 보르데텔라 속의 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 가지며, 여기에서 상기 유전자 변형은 lpxA 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 i) lpxA 유전자가 슈도모나스 아에루기노사 종으로부터 수득되거나 수득될 수 있고, ii) lpxD 유전자가 슈도모나스 아에루기노사 종으로부터 수득되거나 수득될 수 있고, iii) lpxL 유전자가 네이세리아 메닌지티디스 종으로부터 수득되거나 수득될 수 있는 것 중 적어도 하나이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxA 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxA 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 6의 서열을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 1 또는 서열번호 6과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 여기에서 바람직하게는 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxA 유전자의 발현을 도입시키며, 여기에서 lpxA 유전자는 서열번호 1의 서열을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 1과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
한편으로 또는 또한, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxL 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxL 유전자는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 32의 서열을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 32와 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 여기에서 lpxL 유전자는 서열번호 2의 서열을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 2와 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
한편으로 또는 또한, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxD 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxD 유전자는 서열번호 4의 서열을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열번호 4와 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 서열번호 1, 6, 2, 3, 32 또는 4와 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 서열들은 각각 LxpA(Pa), LpxA(Nm), LpxL (Nm), LpxL(Pg), LpxL(Pa) 또는 LpxD(Pa) 아실 트랜스퍼라제 활성을 유지한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxA 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxA 유전자는 진뱅크(GenBank) WP_003092373.1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 진뱅크 WP_003092373.1에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
한편으로 또는 또한, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxL 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxL 유전자는 진뱅크 WP_002222305.1에 정의된 바와 같은 또는 진뱅크 WP_043876343.1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 진뱅크 WP_002222305.1에 정의된 바와 같은 또는 진뱅크 WP_043876343.1에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
한편으로 또는 또한, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고, 여기에서 상기 유전자 변형은 적어도 하나의 이종 lpxD 유전자의 발현을 도입시키고, 여기에서 lpxD 유전자는 진뱅크 WP_003098585.1에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는 진뱅크 WP_003098585.1에 정의된 바와 같은 서열과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균에 관한 것이며, 여기에서 상기 변형된 세균은 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS를 포함하고, 여기에서 상기 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성 및 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성 중 적어도 하나를 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형된다. 바람직하게, 상기 유전자 변형된 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성 및 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다.
바람직하게, 상기와 같은 유전자 변형된 세균은 변형된 지질 A 부분의 3번 위치의 아실 쇄의 길이가 동일한 3번 위치의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄보다 큰 길이를 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는다.
이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성의 도입을 바람직하게는 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제를 도입시킴으로써 수행한다. 상기와 같은 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 정의된 바와 같은 야생형 보르데텔라 세균이 아닌 임의의 그람 음성 세균으로부터 수득되거나 수득될 수 있다. 더욱 또한, 상기 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제를 야생형 보르데텔라 세균과 상이한 종의 보르데텔라로부터 수득하거나 수득할 수 있음이 또한 고려된다.
바람직한 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제는 LpxH이다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 유전자 변형은 이종 lpxH 유전자의 발현을 도입시킨다. 따라서 이종 lpxH 유전자의 발현은 세포 중에 이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성을 도입시킨다.
lpxH 유전자를 바람직하게는 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 네이세리아 속, 포르피로모나스 속 또는 슈도모나스 속으로부터 수득하거나 수득할 수 있다. 보다 바람직한 실시태양에서, IpxH 유전자를 네이세리아로부터 수득하거나 수득할 수 있고, 보다 바람직하게는 lpxH 유전자를 네이세리아 메닌지티디스로부터 수득하거나 수득할 수 있다. 가장 바람직하게, lpxH 유전자는 서열번호 5와 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 서열번호 5와 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 서열은 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성을 유지한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, lpxH 유전자는 진뱅크 WP_002222897.1과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 내인성 lpxH 유전자, 즉 내인성 LpxH(UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제)를 발현하는 유전자를 추가로 포함하거나 또는 상기 유전자 변형된 세균은 단독으로 이종 LpxH 활성을 포함한다, 예를 들어 내인성 LpxH 활성을 갖는다. 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 유전자 변형된 세균은 서열번호 30과 적어도 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 내인성 LpxH를 발현하지 않는다.
LpxH에 대한 또 다른 실시태양에서, 유전자 변형된 세균은 오직 내인성 lpxH 유전자만을 포함한다, 즉 오직 내인성 LpxH만을 발현한다. 따라서, 특히, 상기 유전자 변형된 세균은 이종 LpxH를 발현하는 유전자를 포함하지 않는다. 보다 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균은 이종 네이세리아 LpxH를 발현하지 않으며 가장 바람직하게는 이종 네이세리아 메닌지티디스 LpxH를 발현하지 않는다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 유전자 변형된 세균은 오직 이종 lpxA, lpxL 및 lpxD 유전자 중 적어도 하나의 발현을 도입시키는 유전자 변형만을 포함한다.
본 발명의 유전자 변형된 세균은 상이한 유형의 LPS의 혼합물을 함유할 수 있다. 특히, 변형된 세균은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 보다 짧은 아실 쇄를 갖는 지질 A 부분을 갖는 LPS 외에 야생형 LPS를 함유할 수 있다. 한편으로, 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 우세하게 또는 단독으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 보다 짧은 아실 쇄를 갖는 LPS를 함유한다. 따라서, 상기 변형된 세균은 야생형 LPS를 함유하지 않거나 또는 단지 미량으로 함유한다. 야생형 LPS를 포함하지 않거나 또는 단지 미량으로 포함하는 보르데텔라 속의 세균을 수득하기 위해서, 상기 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균을 추가로 변형시킬 수 있다. 이를 위해서 바람직한 실시태양에서, 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 각각 내인성 lpxA, lpxD 또는 내인성 lpxL 유전자에 의해 암호화된 LpxA, LpxD 및 LpxL 아실 트랜스퍼라제 중 적어도 하나의 활성을 감소시키거나 제거하는 유전자 돌연변이를 추가로 포함한다.
따라서, 상기와 같은 유전자 변형된 세균은 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 돌연변이 및 상응하는 내인성 LpxA 및/또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 추가의 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서 상기 유전자 변형된 세균의 전체적인 LpxA 및/또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제 활성을 야생형 보르데텔라 세균에 비해 증가시키거나, 유사하게 하거나 또는 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 서열번호 28의 서열, 또는 서열번호 28과 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 내인성 유전자 중의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다.
한편으로 또는 또한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 서열번호 29의 서열, 또는 서열번호 29와 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 내인성 유전자 중의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다.
한편으로 또는 또한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 서열번호 31의 서열, 또는 서열번호 31과 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 내인성 유전자 중의 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 내인성 lpxA 유전자, 내인성 lpxD 유전자의 발현 및/또는 내인성 lpxL 유전자의 발현을 상기 유전자의 불활성화에 의해, 예를 들어 당해 분야에 그 자체로서 공지된 방법에 의한 상기 유전자의 붕괴 또는 결실에 의해 제거한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 또는 보르데텔라 브론키셉티카이다. 바람직하게, 상기 유전자 변형된 세균은 유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스이다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 유전자 변형된 세균은 비 페르투씨스 토하마(Tohama) I 균주 또는 그의 유도체이다. 바람직하게, 토하마 I 균주 유도체는 상기 토하마 I 균주의 스트렙토마이신-내성 유도체이고 가장 바람직하게는 상기 유전자 변형된 세균은 균주 B213 또는 그의 유도체로부터 유래된다. 한편으로, 상기 유전자 변형된 세균은 비 페르투씨스 B1917 또는 B1920 균주 또는 그의 유도체이다.
또한, 본 발명의 유전자 변형된 세균은 하나 또는 다수의 추가의 변형, 예를 들어 LPS 내독성을 감소시키는 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 보르데텔라 LPS는 자가면역 반응을 유발하고/하거나 수지상 세포에의 결합 및 항원보강제 활성을 증가시키는 것으로 의심이 되는 가능한 에피토프를 제거하기 위해 변형된 올리고사카라이드 구조를 가질 수 있다. 더욱 또한, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 유전자 변형된 세균은 지질 A 3-O-데아실라제 활성을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에서 보다 짧은 아실 쇄는 아실 쇄의 완전한 부재를 포함하지 않는 것으로 이해된다. 따라서, 보다 짧은 아실 쇄는 아실 쇄의 존재를 나타낸다. 그럼에도 불구하고 상기 변형된 지질 A 부분은, 보다 짧은 아실 쇄 외에, 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄의 수에 비해 적은 아실 쇄를 또한 가질 수 있다. 예를 들어, 적어도 부분적으로 3-O-탈아실화된 LPS 및/또는 지질 A의 존재는 LPS 독성을 추가로 감소시킬 수 있으며 대상체에서 부작용의 수 및 중증도를 감소시킬 수 있다.
따라서, 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 LPS 분자들의 혼합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 LPS 분자는 i) 야생형 LPS 및/또는 ii) 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라 LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS 및/또는 iii) 탈아실화된, 예를 들어 3-O-탈아실화된 LPS의 믹스일 수 있다. 한편으로 또는 또한, 본 발명의 유전자 변형된 세균은 적어도 하나의 보다 짧은 아실 쇄를 갖고 또한 3-O-탈아실화된 지질 A 부분을 갖는 LPS 분자를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득된 LPS에 관한 것이다.
바람직하게, 본 명세서에 정의된 바와 같은 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균은 서열번호 25(보르데텔라 브론키셉티카 및 보르데텔라 파라페르투씨스의 PagL 단백질, 진뱅크 WP_003813842.1)를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 서열번호 25와 적어도 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99 % 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드는 지질 A 3-O-데아실라제 활성을 나타낸다.
본 발명의 LPS를 포함하는 OMV
세 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의되는 바와 같은 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV에 관한 것이다. OMV(또한 "bleb"로서 공지됨)는, 예를 들어 백신에 사용하기 위해, 세제 추출(dOMV 정제 공정)에 의해 전통적으로 제조되었으며, 여기에서 세제, 예를 들어 데옥시콜레이트가 LPS를 제거하고 소포 방출을 증가시키는데 사용된다. 세포의 초음파 처리 및 DOC에 의한 처리에 의해 제조된, 알룸 항원보강제와 병용된 OMV 제제는 마우스 모델[Roberts, R., Vaccine 2008, 26, 4639-4646]에서 페르투씨스 공격에 대해 보호를 제공하였으며, 이는 전-세포 백신의 효과에 필적하였다. PagL-탈아실화된 변형된 LPS를 함유하는 OMV의 또 다른 버전은 보호 및 보다 낮은 반응원성을 모두 나타내었으며, 후자는 생체내에서 체중 증가 및 사이토킨 유도 모두에 의해 판정되었다[Asensio, C. J., Vaccine 2011, 29, 1649-1656]. 비 파라페르투씨스 OMV에 대한 또 다른 흥미로운 발견은 페르투씨스 및 파라페르투씨스 모두에 대한 그의 교차-보호였다[Bottero, D. Vaccine 2013, 31, 5262-5268].
대부분의 그람 음성 세균, 예를 들어 보르데텔라의 LPS는 독성이다. 그러나, 본 발명의 보르데텔라 LPS는 OMV 중에 독성의 야생형 LPS보다 훨씬 더 큰 정도로 남아있을 수 있다. 따라서 세제 추출 공정을 세제의 존재가 필요하지 않은 공정으로 교체할 수도 있다. 따라서 본 발명에 따른 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV는 세제-추출된 OMV일 필요는 없다. 그러나, 세제-추출된 OMV가 아닌 OMV의 제조 공정은 임의의 세제의 사용을 배제하지 않는 것으로 이해된다. 저농도 세제의 사용 및/또는 순한 세제의 사용은 본 발명에 따른 변형된 보르데텔라 LPS의 대부분, 즉 변형된 보르데텔라 LPS의 적어도 5, 10, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99%가, 예를 들어 동량의 동일한 배양물로부터 자발적인 또는 상등액 OMV 중에 존재하는 보르데텔라 LPS의 양에 비해 유지되는 한 배제되지 않는다.
본 발명의 보르데텔라 LPS를 포함하는 바람직한 OMV는 상등액 또는 자발적인 OMV, 즉 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 sOMV, 또는 고유 OMV, 즉 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 nOMV이다. 한편으로, 본 발명의 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV는 세제-추출된 OMV이다. dOMV, sOMV 및 nOMV의 제조 방법은 하기의 문헌들에 기재되어 있다: van de Waterbeemd et al (2010) 및 van de Waterbeemd et al (2013)(van de Waterbeemd B et al, Vaccine. 2010;28(30):4810-6 및 van de Waterbeemd B ,.PLoS One. 2013 31;8(5):e65157) 및 WO2013/006055(이들은 모두 본 명세서에 참고로 인용된다).
바람직한 실시태양에서, 변형된 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV를 상기 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득하거나 수득할 수 있다.
조성물
네 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 조성물은 약학 조성물이다. 보다 바람직하게, 약학 조성물은 당해 분야에 통상적으로 공지된 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 배지 또는 전달 비히클(예를 들어 문헌[. "Handbook of Pharmaceutical Excipients", Rowe et al eds. 7th edition, 2012, www.pharmpress.com]을 참조하시오)을 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 안정화제, 삼투제, 완충제, 분산제 등을 또한 상기 약학 조성물에 통합시킬 수 있다. 바람직한 형태는 목적하는 투여 방식 및 치료 용도에 따라 변한다. 약학 담체는 환자에의 전달에 적합한 임의의 상용성, 무독성 물질일 수 있다. 본 명세서에서 "본 발명의 활성 성분"은 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 또는 OMV 중 하나 이상인 것으로 이해된다.
비경구 전달을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체는 20% 알부민이 임의로 보충된 염수 완충된 0.9% NaCl 또는 5% 글루코스에 의해 예시된다. 한편으로, 본 발명의 활성 성분을 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중에 현탁시킬 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균성이어야 한다. 본 발명의 활성 성분의 투여를 위한 비경구 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 및 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입에 따른다. 한편으로, 조성물을 흡입에 의해 투여할 수도 있다. 조성물을 주입에 의해 연속적으로 또는 일시 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게, 조성물을 일시 주사에 의해 투여한다. 근육내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 예를 들어 유효 투여량의 본 발명의 활성 성분을 포함하는 1 내지 10 ㎖의 포스페이트 완충된 염수를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구 투여 가능한 조성물의 제조 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며 다양한 출처에, 예를 들어 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (Ed. Allen, L. V. 22nd edition, 2012, www.pharmpress.com]에 보다 상세히 기재되어 있다.
의학적 용도
다섯 번째 태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명은 본 발명의 보르데텔라 LPS, 본 발명의 유전자 변형된 세균, 본 발명의 OMV, 및 본 발명의 약학 조성물 중 적어도 하나의 약제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
여섯 번째 태양에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한편으로, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 백신접종 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시태양에서, 면역 반응은 보르데텔라 감염에 대해 유도되거나 자극된다. 이를 위해서, 3개의 보르데텔라 종(비 페르투씨스, 비 파라페르투씨스 및 비 브론키셉티카)은 공지된 인간 병원체이다. 따라서, 특히 바람직한 실시태양에서, 면역 반응은 비 페르투씨스, 비 파라페르투씨스 또는 비 브론키셉티카 감염에 대해 유도되거나 자극된다.
비 페르투씨스 및 때때로 비 파라페르투씨스는 인간에서 백일해 또는 심한 기침을 일으키며, 일부 비 파라페르투씨스 균주는 양에서 대량 서식할 수 있다. 비 브론키셉티카는 면역타협된 환자의 질병이 보고되었지만, 드물게는 건강한 인간을 감염시킨다. 비 브론키셉티카는 다른 포유동물에서 다수의 질병, 예를 들어 개 및 돼지에서 각각 컨넬 코프 및 위축 비염을 일으킨다. 상기 유전자의 다른 구성원(비 힌지이, 비 아비움)은 다른 포유동물 및 조류에서 유사한 질병을 일으킨다.
가장 바람직하게, 면역 반응은 보르데텔라 페르투씨스 감염에 대해 유도되거나 자극된다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 치료는 백일해의 치료이다. 이를 위해서, 상기 대상체는 백신접종되지 않거나 또는 이전에 보르데텔라에 대해 백신접종되지 않았다. 또한 또는 한편으로, 상기 치료는 백일해의 예방이다. "심한 기침", "백일해" 및 "100-일 기침"이란 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용됨을 또한 유의한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 백신이다. 백신은 바람직하게는 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 무세포 백신일 수 있다. 보다 바람직하게, 백신은 적어도 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 세균을 포함하는 전세포 백신이다.
따라서 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 및 바람직하게는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 (약학) 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조성물은 상기에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균을 포함하는 전세포 백신이다. 본 발명의 유전자 변형된 세균은 생 세균 또는 생 감독 세균 또는 생육불능 세균일 수 있다. 바람직하게, 세균은 당해 분야에 그 자체로서 공지된 수단을 사용하여 불활성화되거나 사멸된다. 예를 들어, 유전자 변형된 세균은 동결, 열처리, 기계적 붕괴, 화학 처리 또는 약학 및 백신접종 분야에 공지된 다른 방법에 의해 불활성화되었을 수 있다(예를 들어 문헌[J.L. Pace, H.A. Rossi, V.M. Esposito, S.M. Frey, K.D. Tucker, R.I. Walker. Inactivated whole-cell bacterial vaccines: current status and novel strategies. Vaccine 16: 1563-1574 (1998)]을 참조하시오). 바람직하게는 세균은 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 또는 보르데텔라 브론키셉티카 및 가장 바람직하게는 보르데텔라 페르투씨스이다.
한편으로 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 (약학) 조성물은 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS 또는 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 OMV를 포함하는 무세포 백신이다.
본 발명의 (무세포) 백신은 보르데텔라 속의 세균의 1, 2, 3 또는 그 이상의 면역원성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 (무세포) 백신은 불활성화된 보르데텔라 독소를 단독으로 또는 다른 보르데텔라 성분, 예를 들어 섬유상 헤마글루티닌, 술모양 항원 및 페르탁틴과 함께 추가로 포함한다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 변형된 LPS 또는 OMV를 상기를 생성시키는 보르데텔라 세균에 대해 보호 면역 반응을 끌어내는데 사용할 수 있으나, 한편으로 또한 다른 조성물에 사용하여 혼합할 수도 있다. 따라서, 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 또는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한 상기에 정의된 바와 같은 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 조성물은 적어도 하나의 비-보르데텔라 항원을 추가로 포함한다. 항원은 상기 정의된 바와 같은 임의의 항원이다. 특히, 보르데텔라 백신을 당해 분야에 공지된 다른 백신과 병용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서 보르데텔라 백신, 및 가장 바람직하게는 전세포 보르데텔라 백신을 디프테리아 및 파상풍 백신 중 적어도 하나와 병용한다. 가장 바람직한 실시태양에서, (전세포) 보르데텔라 백신을 디프테리아뿐만 아니라 파상풍 백신과 병용한다.
일곱 번째 태양에서, 본 발명의 LPS는 적합한 항원보강제 물질로서 사용하기 위한 것이다. LPS는 백신접종, 톨형 수용체의 활성화 및 선천적 면역 반응의 자극에 적합한 항원보강제인 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 부분적으로 해독된 LPS 및/또는 지질 A는 독성 관련 부작용, 예를 들어 국소적인 팽창, 발적, 통증 및 발열을 적게 일으키면서 상기 면역 자극(항원보강제) 활성을 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 조성물 및 백신을 병원성, 그람 음성 세균 감염, 바람직하게는 보르데텔라 감염을 앓고 있거나 상기 감염을 획득할 위험이 있는 대상체의 치료 방법에 사용할 수 있으며, 상기 방법은 본 발명에 따른 약학 조성물, 전세포 또는 무세포 백신을 투여함을 포함한다. 투여를 위한 조성물 및 용량 섭생에서 특정한 항원보강제의 사용, 물질의 상대적인 및 절대적인 양은 공지되어 있거나 또는 숙련가에 의해 측정될 수 있으며 특정한 병원성 감염 또는 치료하고자 하는 특정한 대상체의 상태와 같은 상황에 맞춰질 수 있다. 용량 섭생은 단일 용량을 포함할 수 있지만, 또한 수회 용량, 예를 들어 촉진 용량을 포함할 수 있고 경구, 비내 또는 비경구로 투여될 수 있다. 백신접종을 위한 다양한 용량 섭생은 당해 분야에 공지되어 있으며 숙련가에 의해 적합하게 맞춰질 수 있다.
여덟 번째 태양에서, 본 발명은 톨-형 수용체 4(TLR4) 길항물질로서 사용하기 위한 본 발명의 변형된 보르데텔라 LPS에 관한 것이다. 바람직하게, 상기와 같은 길항물질을 패혈증의 치료 또는 감소에 또는 대량 면역 반응, 예를 들어 사이토킨 폭풍에 대해 사용할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명의 변형된 LPS를 인플루엔자 감염 중 발생하는 사이토킨 폭풍의 치료에 사용할 수 있다.
아홉 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명의 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균, 보르데텔라 LPS 또는 OMV의 생성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 a) 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균을 배양하고; 임의로 b) 상기 유전자 변형된 세균의 정제 및 불활성화 중 적어도 하나의 단계들을 포함한다. 또한, 또는 단계 b) 대신에, LPS 또는 OMV를 추출하고/하거나 정제할 수 있다. 보르데텔라의 정제 및 불활성화 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 유사하게, LPS 또는 OMV의 정제/추출을 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
열 번째 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 불활성화된 변형된 보르데텔라 세균, OMV 및 LPS 중 적어도 하나를 포함하는 백신 제형의 생성에 관한 것이다. 상기 공정은 바람직하게는 a) 본 명세서에서 상기에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균을 배양하고; b) 상기 유전자 변형된 세균의 정제 및 불활성화 중 적어도 하나, 및 c) 보르데텔라 세균, OMV 및 LPS 중 적어도 하나를 임의로 추가적인 백신 성분과 함께 백신 제형으로 제형화하는 단계들을 포함한다. 또한, 또는 단계 b) 대신에, LPS 또는 OMV를 추출하고/하거나 정제할 수 있다.
상기에 명시된 바와 같은 의학적 상태의 치료에서 조성물의 용도는 또한 상응하는 의학적 치료를 위한 약제의 제조를 위한 조성물의 용도뿐만 아니라 상기와 같은 의학적 상태를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 상기 조성물을 투여함으로써 상기 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
본 문서 및 청구항에서, "포함하는"이란 동사 및 그의 활용형은 비제한적인 의미로, 상기 단어 다음에 오는 항목들을 포함하지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목도 제외하지 않음을 의미하는데 사용된다. 또한, 부정관사 "하나의"에 의한 하나의 요소의 언급은 문맥상 상기 요소가 하나 및 단지 하나만 존재할 것을 명백히 요하지 않는 한, 상기 요소가 하나를 초과하여 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "하나의"는 대개 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 그들의 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
하기의 실시예를 단지 예시를 목적으로 제공하며, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하는 것은 아니다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. 야생형 및 유전자 변형된 비 페르투씨스의 지질 A 구조. (A) 야생형 비 페르투씨스의 지질 A 구조. B) LpxA(Nm)ΔlpxA를 발현하는 비 페르투씨스의 예측된 지질 A 구조. C) LpxA(Pa)ΔlpxA를 발현하는 비 페르투씨스의 지질 A 구조. D) LpxL(Nm)ΔlpxL을 발현하는 비 페르투씨스의 지질 A 구조 및 E) LpxL(Pg)ΔlpxL을 발현하는 비 페르투씨스의 지질 A 구조 및 F) LpxD(Pa)ΔlpxD를 발현하는 비 페르투씨스의 지질 A 구조, 및 ΔlpxA, ΔlpxL 및 ΔlpxD는 각각 염색체 lpxA, lpxL 및 ΔlpxD 의 불활성화를 가리킨다.
도 2. 증식에 대한 이종 효소의 발현의 영향. A) 1 mM IPTG의 존재 하에서 페르베이(Verweij) 배지에서 18h 증식 후, pMMB67EH 플라스미드로부터 LpxL(Nm), LpxA(Pa), 또는 LpxL(Pg)를 발현하는 B213 및 유도체의 배양물의 OD590을 도시한다. 출발 OD590은 0.05였다. 데이터는 중복 수행된 하나의 전형적인 실험으로부터의 것이며 평균 및 표준 편차를 제공한다. LpxL(Nm)을 발현하는 균주의 증식 결함이 2개의 추가적인 실험에서 재현되었다. B) 1 mM IPTG의 존재 하에서 액체 페르베이 배지에서 12 및 24h 증식후 B213 및 B213-pLpxDPg 클론 4(cl4) 및 클론 5(cl5)의 배양물의 590 ㎚에서의 LpxD(Pa) OD(OD590)를 도시한다. 출발 OD590은 0.05였다.
도 3. 지질 A의 ESI-MS에 의한 구조 분석. 음이온 지질 A 질량 스펙트럼이 B213, LpxA(Pa)(B213-pLpxA(Pa))를 발현하는 B213, LpxA(Pa)(B213ΔlpxA-pLpxA(Pa)) 배경을 발현하는 B213의 ΔlpxA 돌연변이체, LpxL(Nm)(B213-pLpxL(Nm))를 발현하는 B213, LpxL(Pg) (B213-pLpxL(Pg))를 발현하는 B213 및 LpxD(Pa)(B213-pLpxD(Pa))(클론 4 및 5)을 발현하는 B213의 세포들로부터 단리된 온전한 LPS의 인-소스 충돌-유도된 해리 나노-ESI-FT-MS에 의해 획득되었다. 세균을 1 mM의 IPTG의 존재 하에서 액체 페르베이 배지에서 12h 동안 증식시켰다. m/z 1557.97에서 주요 단일-탈양자화된 이온은 전형적인 비 페르투씨스 지질 A 구조: 도 1에 예시된 바와 같이 2개의 포스페이트 잔기(2 P)를 갖는 5-아실화된(3개의 3OH-C14, 하나의 3OH-C10 및 하나의 C14) 디글루코스아민(2 GlcN)으로서 해석되었다. 추가적인 단일-탈양자화된 지질 A 이온이 상이한 유도체에서 검출되었으며 그의 해석을 또한 나타낸다. 오직 지질 A 이온을 포함하는 m/z 범위만을 도시한다.
도 4. 정제된 LPS(A,B) 또는 B213 및 LPS 돌연변이 유도체의 전-세포 제제(C,D)에 의한 hTLR4(A,C) 또는 mTLR4(B,D)를 발현하는 HEK293 세포의 자극. 0.1의 OD590으로 조절된, LPS 제제 및 세균 현탁액을 연속 희석하였다. mTLR4를 발현하는 HEK293 세포와 2h 또는 hTLR4를 발현하는 HEK293 세포와 4h 동안 배양후, 알칼리성 포스파타제 활성을, 기질을 첨가하고 630 ㎚에서 OD를 측정함으로써 측정하였다. 하나의 전형적인 실험을 도시한다.
도 5. B213, B213Δ lpxA -pLpxA (pa) 및 B213-pLpxD (Pa) cl4 및 cl5로부터 정제된 LPS에 의한 hTLR4를 발현하는 HEK293 세포의 자극. 2 ㎍/㎖ 농도의 정제된 LPS를 연속해서 희석하고, 배양된 세포에 가하고 4h 동안 배양하였다. SEAP 활성으로부터 생성되는 630 ㎚에서의 OD를 제공한다.
도 6. 생체내 발열원성. lpxA (Pa) 돌연변이체 및 lpxD (Pa) 돌연변이체로부터 정제된 돌연변이 보르데텔라 페르투씨스 LPS와 lpxD (Pa) 돌연변이체로부터 추출된 OMV에 의해 유도된 토끼에서의 발열원성이며, 모두 비 페르투씨스 야생형 LPS 및 OMV와 비교되었다. 발열원성을 0-48h 및 0-8h 구간에 대한 곡선아래면적으로서 나타낸다.
실시예
실시예 1
물질 및 방법
플라스미드, 균주 및 생육 조건
표 1은 본 연구에 사용된 모든 플라스미드 및 균주를 나열한다. 비 페르투씨스 균주를 35 ℃에서 48h 동안 15% 피브린제거된 양 혈액(바이오트래이딩(Biotrading))이 보충된 보르데 장구(Bordet-Gengou) 아가(디프코(Difco)) 상에서 배양하였다. 액체 배양물 중에서 세균을 증식시키기 위해서, 세균을 고체 배지로부터 수집하고 페르베이 배지[16]에서 0.05의 OD590으로 희석하고 125 ㎖ 사각 배지 보틀에서 175 rpm에서 일정하게 진탕시키면서 배양하였다. 일부 분석에서, 세균을 60 ℃에서 1h 동안 배양에 의해 불활성화하고, PBS 중에 재현탁시키고, 0.5의 OD590으로 조절하였다. 이 콜라이 균주를 37 ℃에서 용원성 브로쓰(LB) 또는 LB 아가에서 증식시켰다.
모든 균주에 대해서, 필요한 경우 배지에 카나마이신(100 ㎍㎖-1), 젠타마이신(10 ㎍㎖-1), 암피실린(100 ㎍㎖-1), 날리딕신산(50 ㎍㎖-1), 또는 스트렙토마이신(300 ㎍㎖-1), 및 이 콜라이 또는 비 페르투씨스에 대해서 각각 0.1 또는 1 mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 보충하여 단백질 발현을 유도하였다.
[표 1] 사용된 플라스미드 및 균주
Figure pct00007
AmpR, 암피실린 내성; GmR, 젠타마이신 내성, KanR, 카나마이신 내성; StR, 스트렙토마이신 내성
유전자 조작
PCR을 고 충실도 폴리머라제(롯슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics) GmbH, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. PCR 믹스는 1 ㎕의 주형 DNA, 200 μM dNTP(페르멘타스(Permentas)), 0.25 μM의 상이한 프라이머 조합(서열번호 7-24, 표 2 참조), 0.5 U DNA 폴리머라제, 및 PCR 완충제로 이루어졌다. 상기 혼합물을 DNA 변성을 위해 95 ℃에서 10분, 이어서 30 주기의 95 ℃ 1분, 58 ℃ 0.5분간 배양하고 예상되는 앰플리콘 크기 kbp당 72 ℃에서 1분간 신장시켰다. 72 ℃에서 10분간 연장된 신장으로 상기 반응을 종료시켰다. 생성되는 생성물을 전기영동에 의해 1% 아가로스 상에서 분리하고 에티디움 브로마이드를 사용하여 시각화하였다.
상이한 세균의 LPS 생합성 효소를 암호화하는 유전자를 세균 모액으로부터 PCR에 의해 증폭시키고 넓은 숙주-범위 발현 벡터 pMMB67EH 내로 클로닝하였다. 이를 위해서, PCR 생성물 및 플라스미드 pMMB67EH-PagL(Pa) 를 각각 클린업 시스템 및 플라스미드 추출 키트를 사용하여 정제하였다(둘 다 프로메가에 의해 제공됨). 정제된 플라스미드 및 PCR 생성물을 제한 효소(페르멘타스, 네덜란드 소재)(상기에 대한 부위는 프라이머(서열번호 7-24, 26 및 27, 표 2 참조) 중에 포함되었다)로 절단하고 후속적으로 함께 결찰시켰다. 염색체 lpxA 및 lpxL 유전자를 녹아웃시키기 위해서, 상기 플라스미드를 사용하였다.
이 콜라이 DH5α를 표준 프로토콜에 따라 결찰 생성물 또는 플라스미드로 형질전환시켰다. 정확한 클론을 PCR에 의해 선택하고, 플라스미드를 정제하고 마크로겐(Macrogen) 서열분석 서비스(암스테르담 소재)에서 서열분석하였다. 이어서, 플라스미드를 형질전환에 의해 이 콜라이 균주 SM10λpir로 전달하고 후속적으로, 선택 및 대항선택을 위해 각각 암피실린 및 날리딕신을 사용하여 접합에 의해 비 페르투씨스 균주 B213으로 전달하였다. 염색체 돌연변이를 생성시키기 위해서, 녹아웃 플라스미드(스트렙토마이신 감수성을 부여하는 rpsL 유전자를 함유하였다)(Skorupsky and Taylor, 1996)를 카나마이신- 또는 젠타마이신-내성 트랜스접합체 선택에 의한 단일 크로스오버에 의해 염색체내에 통합시켰으며; 생성되는 세균은 스트렙토마이신 내성을 상실하였다. 후속적으로, 2차 크로스오버에 의해 플라스미드 손실을 선택하기 위해서, 세균을 액체 배지에서 배양하고 돌연변이체를 스트렙토마이신 및 카나마이신 또는 젠타마이신이 있는 플레이트 상에서 선택하였다. 비 페르투씨스 트랜스접합체 중의 플라스미드의 존재 및 녹아웃 돌연변이체의 적합한 생성을 PCR에 의해 확인하였다.
비 페르투씨스 중의 표적 효소 LpxDPa를 발현시키기 위해서, 벡터 pMMB67EH를 사용하였다. lpxD를 프라이머 LpxD-Fw Pa Ndel(서열번호 26을 갖는다) 및 LpxD-rev-His Pa HindIII(서열번호 27을 갖는다)와 함께 교정 효소(고 충실도 폴리머라제, 롯슈 다이아그노스틱스 GmbH)를 사용하여 피 아에루기노사(P. aeruginosa) 균주 PAO1로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 두 프라이머는 모두 클로닝을 촉진하기 위한 제한 효소에 대한 서열을 함유하며 역프라이머는 또한 웨스턴 블럿팅을 통한 재조합 단백질의 검출을 촉진하기 위한 His6-태그를 암호화하는 서열을 함유한다. pMMB67EH상의 tac 프로모터 뒤에 PCR 생성물을 클로닝한 후에, 삽입물의 정확한 서열을 확인하였다.
RNA 추출 및 RT-PCR
RNA를 획득하기 위해서, 지수 증식 배양물로부터 세포를, 에펜도르프 원심분리기 5424에서 5000 rpm에서 10분간 원심분리에 의해 수집하고, 4의 OD550으로 조절하고, 트리졸(인비트로젠(Invitrogen), 영국 소재)에 재현탁시켰다. 이어서 트리졸 ㎖당 200 ㎕의 클로로포름을 가한 다음 5000 rpm에서 30분간 원심분리시켰다. 생성된 상부층을 동량의 빙냉 75% 에탄올과 혼합하였다. 이어서, RNA를 제조사의 설명에 따라 뉴클레오스핀(Nucleospin) RNA 키트(마슈레 나겔(Macherey-Nagel), 미국 소재)를 사용하여 단리하였다. 생성 용액을 37 ℃에서 1h 동안 터보(Turbo) DNA 프리(앰비온(Ambion), 독일 소재)로 처리하여 게놈 DNA를 제거한 다음 제조사의 권장에 따라 DNase 불활성화시켜 순수한 RNA를 생성시켰다. 이를 바로 트랜스크립터 하이 피델리티(Transcriptor High Fidelity) cDNA 합성 키트(롯슈, 네덜란드 소재)를 사용하여 cDNA를 생성시키는데 사용하였다. RNA, cDNA 및 염색체 DNA를 프라이머(표 2, 서열번호 7-24, 26 및 27 참조)와 함께 PCR에서 주형으로서 사용하여 특정 전사물의 생성을 밝혔다.
전기영동 기법
전세포 용해물을 5.0의 OD600으로 조절하고 이중-농도 샘플 완충제에 1:1 용해시키고 100 ℃에서 10분간 가열하였다. LPS 시각화를 위해, 비등 후에, 전세포 용해물을 37 ℃에서 1h 동안 프로테이나제 K로 처리하였다. 단백질 및 LPS를 각각 14% 및 16% 아크릴아미드젤 상에서 분리시키고, 그 후에 각각 쿠마씨 브릴리언트 블루 G250 또는 은 염료로 염색하였다.
LPS 정제 및 분석
LPS를 고온 페놀-수(Westphal, 1965)로 세균으로부터 추출하고 C8 역상 카트리지 상에서 고체 상 추출(SPE)에 의해 추가로 정제하였다. 간단히, 세균을 원심분리에 의해 세포 현탁액으로부터 수집하고, 70 ℃에서 물로 현탁시키고 동일 온도에서 0.8 부피의 페놀과 혼합하였다. 수성 및 페놀상을 원심분리에 의해 분리시킨 후에, 수성상을 SPE를 위해 1 부피의 0.356 M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA) pH 7(용매 A) 및 1/3 부피의 2-프로판올:수:트리에틸아민:아세트산(70:30:0.03:0.01, v/v) pH 8.9(용매 B)를 가하여 제조하였다. LPS 추출물을 20번 위치 진공 매니폴드(워터스(Waters))를 사용하여 역상 Sep-Pak C8 카트리지(3 ㎖ 주사기-배럴-형 Vac 카트리지, 200 ㎎의 C8 수지, 워터스) 상에서 SPE에 의해 동시에 정제하였다. 카트리지를 SPE를 위해 진공 하에서 3 x 1 ㎖의 용매 B, 2-프로판올:수:트리에틸아민:아세트산(10:90:0.03:0.01, v/v) pH 8.9(용매 C), 0.07 mM TEAA pH 7(용매 D) 및 용매 A를 적용시켜 컨디셔닝하였다. 이어서, 샘플을 카트리지에 로딩하고 각 카트리지를 3 x 1 ㎖의 용매 A, D 및 C로 순서대로 세척하였다. LPS를 2 x 0.3 ㎖의 용매 B를 적용시켜 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출물을 원심분리 진공 농축기에서 건조시키고 물에 현탁시켰다. 정제된 샘플의 순도 및 완전성을 LPS 은 및 쿠마씨 염색과 병용된 트리신-SDS-PAGE에 의해 판정하였다. 지질 A 구조의 분석을 위해서, 정제된 LPS의 음이온 나노-전기분무 이온화-푸리에 변환-질량 분광분석(나노-ESI-FT-MS)을 LTQ 오르비트랩(Orbitrap) XL 장비(써모 피셔) 상에서 수행하였다. LPS 샘플을 2-프로판올, 수 및 트리에틸아민(50:50:0.001, vol/vol/vol) pH 8.5의 혼합물에 용해시키고 앞서 기재된 바와 같이(Pupo et al, 2014) 금-코팅된 풀드 유리 모세관을 사용하여 나노-ESI에 의해 질량 분광계에 주입하였다(Kondakov, A., and Lindner, B. (2005) Structural characterization of complex bacterial glycolipids by Fourier transform mass spectrometry. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng) 11, 535-546). 분무 전압을 -1.2 kV로 설정하고 가열된 모세관의 온도를 250 ℃로 설정하였다. 이러한 이온화 조건 하에서 LPS의 인식할 수 없는 단편화가 생성되었다. 지질 A 질량 스펙트럼을 기록하기 위해서, LPS의 나노-ESI-FT-MS를 100 V의 전위차에서 인소스 충돌-유도된 해리(CID)로 수행하였다. 상기 설정하의 인소스 CID는 야생형 B213 균주의 지질 A의 질량 스펙트럼에서 도시된 바와 같이(도 3a), 최소의 지질 A 단편화와 함께 완전한 지질 A 도메인에 상응하는 강한 단편 이온을 생성시켰으며, 이는 비-환원 지질 A 글루코스아민과 Kdo 간의 불안정한 결합의 붕괴로부터 기원한다.
진핵생물 세포주 배양 및 자극
MD-2 및 CD14와 함께 인간 또는 마우스 TLR4로 형질감염된 인간 NF-κB/SEAP 리포터 HEK293 세포를 인비보젠(InvivoGen)으로부터 구입하였다. 상기 두 세포주는 모두 NF-κB-유도 분비된 배아 알칼리 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자(상기는 TLR 신호전달후 발현된다)를 함유한다. 세포를 앞서 기재한 바와 같이[19] HEK-블루 배양 배지에서 증식시켰다. 기질 콴티-블루(Quanti-Blue)(인비보젠) 첨가후에 SEAP가 배양 상등액 중에서 검출되었다. 인간 단핵구 세포주 MonoMac6(MM6; DSMZ)을 10% 열-불활성화된 FCS, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 아이스코베의 변형된 둘베코 배지(IMDM; 깁코(Gibco))에서 증식시켰다. 모든 세포주를 37 ℃에서 5% 포화된 CO2 분위기 하에서 배양하였다.
TLR4 신호전달을 위해서, HEK-블루 세포주(2.5 x 104)를 96-웰 플레이트에서 정제된 LPS 또는 열-불활성화된 전세포 제제의 연속 희석물과 함께 배양하였다. 37 ℃에서 2, 4 또는 6h 배양후에, 상등액을 수집하고 콴티-블루 기질과 함께 2h 동안 배양하고 OD630을 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 판독기를 사용하여 측정하였다.
결과
비 페르투씨스에서 이종 LpxL 및 LpxA의 발현
비 페르투씨스 지질 A의 3 및 3'번 위치의 1차 아실 쇄 및 오직 2차 아실 쇄만의 길이를 변형시키기 위해서, 본 발명자들은 다른 세균으로부터의 LpxA 및 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 사용하였다. 비 페르투씨스 지질 A는 각각 3 및 3'번 위치에 3OH-C10 및 3OH-C14 쇄를 함유한다(도 1a). 본 발명자들은 네이세리아 메닌지티디스(LpxA(Nm)) 또는 슈도모나스 아에루기노사(LpxA(Pa))로부터의 상응하는 효소에 의한 LpxA의 교체가 아실 쇄의 변형을 생성시킬 것인지를 조사하였다. 유사하게, 본 발명자들은 포르피로모나스 진지발리스(LpxL(Pg)) 또는 엔 메닌지티디스(N. meningitidis)(LpxL(Nm))로부터의 상응하는 효소에 의한 비 페르투씨스의 LpxL의 치환이 아실 쇄의 변형을 생성시키는지를 조사하였다.
이종 효소에 대한 유전자를 tac 프로모터의 조절 하에서 넓은 숙주-범위 발현 벡터 pMMB67EH내에 클로닝하였다. 재조합 효소 LpxA 및 LpxL의 발현을 먼저 RT-PCR(데이터 도시 안 됨)에 의해 클로닝 숙주 이 콜라이 BL21(DE3)에서 평가하였다. 상기 분석은 세균을 IPTG와 함께 증식시킬 때 관심 유전자의 전사물의 존재를 입증하는 반면 상기 세균을 IPTG의 부재 하에서 증식시킨 경우에는 상기 전사물이 훨씬 덜 풍부하거나 검출될 수 없었다. 단백질 발현을 또한 SDS-PAGE에 의해 검출하였으며; LpxA 단백질이 LpxL 단백질보다 더 큰 풍부성으로 발현되었다(데이터 도시 안 됨).
이어서 플라스미드를 토하마 I 균주의 유도체인 비 페르투씨스 균주 B213으로 전달하였다(표 1). 놀랍게도, pMMB67EH-LpxA(Nm)는 PCR에 의해 입증된 바와 같이 비 페르투씨스에 성공적으로 도입되었지만, 트랜스접합체는 플라스미드 유지를 위한 암피실린을 함유하고 IPTG가 없는 플레이트상에 재도말후에 증식하지 못했다. 따라서, 명백하게, 엔 메닌지티디스로부터의 심지어 유도되지 않은 발현 수준의 LpxA조차 비 페르투씨스에서 치명적이지만, 이 콜라이의 경우에는 그렇지 않다. Lpx(Nm) 효소의 도입에 의해 생성되는 것으로 예측되는 LPS를 도 1B에 묘사한다. 본 발명자들은 또한 LpxL(Nm)의 발현이 증식을 손상시킴을 알았다(도 S1C). 모든 다른 재조합 균주는 야생형과 같이 증식하였다(도 2(S1C)).
재조합 단백질 LpxD(Pa)의 발현을 먼저 에스케리키아 콜라이 균주 BL21(DE3)에서 시험하였으며, 여기에 플라스미드를 전달하였다. 생성 균주를 BL21-pLpxDPa라 칭한다. 배양물에의 IPTG의 첨가는 증식에 영향을 미치지 않았다(데이터 도시 안 됨). 단백질의 발현은 정규의 쿠마씨 블루-염색된 젤(상기 상에서 BL21(DE3) 및 BL21-pLpxDPa의 전세포 용해물을 분석하였다) 상에서 검출되지 않았다. 그러나, 웨스턴 블럿팅 분석은 BL21-pLpxDPa 중의 LpxDPa(36.4 kDa)의 예상된 크기의 밴드(데이터 도시 안 됨)(BL21(DE3)의 샘플 중에는 존재하지 않았다)와 항-His6-태그 항체와의 반응을 도시하였다. 이어서, 상기 플라스미드를 공여체로서 이 콜라이 균주 SM10λpir을 사용하여 접합에 의해 비 페르투씨스 B213으로 전달하였으며, 2개의 트랜스접합체를 모았다. 1 mM IPTG의 존재 하에서, 2개의 클론은 모두 부모에 비해 증식 결함을 보였으며(도 2B), 이는 클론 5의 경우 더 현저하였다. 웨스턴 블럿팅 분석은 2개의 클론 모두에서 효소의 발현을 입증하였지만(데이터 도시 안 됨), 발현 수준의 차이는 관찰되지 않았다.
재조합 지질 A 구조의 분석
이어서 지질 A 구조를 1 mM IPTG의 존재 하에서 12h 동안 증식시킨(대수 증식) 전세포로부터 추출한 정제된 LPS를 사용하여 나노-ESI-MS에 의해 분석하였다. 야생형 균주의 경우, 주요 피크는 m/z 1557.9(예상된 비스-인산화된 5-아세틸화된 지질 A에 상응한다)(도 3A)에서 관찰되었다. LpxA(Pa)를 발현하는 균주에서, 스펙트럼은 m/z 1557.97에서의 이온 외에, m/z 1501.91 및 1529.94에서의 2개의 추가적인 이온을 나타내었다(도 3B). m/z 1501.91에서의 이온은 3'번 위치에서의 1차 3OH-C14 아실 쇄의 3OH-C10에 의한 치환에 상응하는 반면(도 1C), m/z 1529.94는 중간 C12 쇄 길이를 갖는 하이드록실화된 지방산의 존재를 가리킨다. 2개의 새로운 종의 상대적인 풍부성은 m/z 1557.9에서의 야생형 구조에 비해 단지 48 및 75%였으며, 이는 염색체상의 내인성 lpxA의 발현에 기인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 앰색체 lpxA 사본을 녹아웃시키기로 하였다. 생성되는 균주의 MS 분석은 m/z 1557.97 이온의 완전한 상실 및 m/z 1529.94 이온의 풍부성의 극적인 감소가 치환에 상응하는 m/z 1501.91의 주요 피크를 남김을 입증하였다(도 1C 및 도 3C).
BL213-LpxL(Nm)의 MS 분석은 부수적인 종으로서 야생형 m/z 1557.97 이온을 검출한 반면, m/z 1529.94의 주요 피크는 C12에 의한 2차 C14 아실 쇄의 치환에 상응하였다(도 1D 및 도 3D). 염색체 lpxL을 검출하려는 시도는 실패하였다. 비 페르투씨스는 염색체상에 2개의 인접한 lpxL 상동체를 함유하지만, lpxL2라 칭하는 단지 하나만이 실험 증식 조건[20] 하에서 활성이다. 상이한 구조물을 사용하여 lpxL2 유전자를 부분적으로 또는 완전히 검출하였으나; 상당한 노력에도 불구하고, 본 발명자들은 목적하는 녹아웃을 획득할 수 없었다.
명백하게, 효소보다는 lpxL2 유전자 서열이, 야생형 균주에서의 LpxL(Nm)의 발현이 이미 지질 A 구조의 약 65%를 변경시켰음을 고려할 때, 비 페르투씨스에 필수적이다. 이는 L,L-디아미노피멜레이트(DAP)를 메소-DAP로 촉매화하는 L,L-DAP 에피머라제를 암호화하는 하류 유전자 dapF의 발현에 대한 lpxL2 붕괴의 극성 효과에 기인할 수 있었다. 메소-DAP는 세포벽 합성 및 리신 생합성에 대단히 중요하다. 그러나, 또한 메소-DAP의 존재 하에서 lpxL 2 유전자를 불활성화시키려는 시도는 실패하였다. B213-LpxL(Pg)의 MS 분석은 m/z 1557.98 이온의 풍부성의 극적인 감소 및 m/z 1586.01의 새로운 피크의 출현(C16 쇄에 의한 C14의 치환에 상응한다)을 입증하였다(도 1E 및 도 2e). 요약하면, 비 페르투씨스에서 LpxA(Pa), LpxL(Nm), 및 LpxL(Pg)의 이종 발현은 도 1에 묘사된 바와 같이 LPS 변경을 생성시켰다.
B213-pLpxD(Pa) 클론 4 및 5의 분석은 상기 두 돌연변이체 모두에서, m/z 1557.97에서의 이온이 야생형에서 발견된 바와 같은 표준 5-아실화된 지질 A에 상응함을 밝혔다(도 3F 및 3G). 또한, m/z 1529.94 및 1501.91에서 풍부한 이온은 각각 3OH-C14에서 3OH-C12로의 하나 또는 2개의 아실 쇄의 길이의 감소에 상응하는 것으로 밝혀졌다(도 3F 및 3G). 이들 추가적인 주요 이온의 풍부성은 상기 두 클론간에 변하였으며; m/z 1529.94에서의 피크의 풍부성은 클론 4에서보다 클론 5에서 더 낮았고, m/z 1501.91에서의 피크의 경우는 이와 역이었다. 따라서, 클론 5는 클론 4보다 지질 A 중의 2개의 아실 쇄 모두의 길이의 전체적인 변형과 함께 더 많은 양의 지질 A 분자를 가졌으나, 상기 두 경우 모두에서 상당량의 변경되지 않은 지질 A가 남았다. 이들 결과는 LpxDPa의 발현이 도 1에 도시된 바와 같은 지질 A의 구조를 변형시켰음을 보인다.
LPS 변체에 의한 TLR4의 차별적 활성화
이어서 본 발명자들은 변경된 구조가 LPS의 독성에 영향을 미치는지를 조사하였다. 이를 위해서, 정제된 LPS 제제를 인간 또는 마우스 TLR4 복합체(각각 hTLR4 및 mTLR4)를 발현하는 HEK293 세포의 배양물에 가하였다. 노출 후에, 수용체의 활성화를 리포터 유전자의 발현에 의해 평가하였다(도 4). 흥미롭게, B213-pLpxA(Pa)로부터의 LPS는 야생형 균주로부터의 LPS보다 hTLR4를 훨씬 덜 자극하였다(도 4A). 여전히 검출된 잔류 활성화는 염색체 lpxA 유전자의 발현에 기인하였는데, 그 이유는 상기가 상기 유전자의 불활성화 후에 완전히 제거되었기 때문이다(도 4A). 따라서, 3'번 위치에서 1차 아실 쇄의 길이는 페르투씨스 LPS에 의한 hTLR4의 활성화와 관련된다. B213-pLpxL(Nm) 및 B213-pLpxL(Pg)로부터의 LPS는 각각 hTLR4 활성화를 감소 및 증가시켰다(도 4A). 따라서, hTLR4의 자극은 C16>C14>C12의 순으로 2차 아실 쇄의 길이와 상관있다.
LpxD(Pa)를 발현하는 균주의 변경된 LPS의 독성을 평가하기 위해서, 상기 두 돌연변이체 및 야생형으로부터 정제된 LPS의 제제를 인간 TLR4 수용체(hTLR4)(인비보젠)를 발현하는 HEK-블루 세포의 배양물에 가하였다. 음성 대조용으로서, 본 발명자들은 균주 B213ΔlpxA-pLpxA(Pa)(3'번 위치에 3OH-C14 대신에 3OH-C10 아실 쇄를 함유하며 hTLR4를 활성화하지 않았다)로부터 정제된 LPS를 사용하였다. 수용체의 활성화를 노출 4h 후에 SEAP 리포터 유전자의 발현에 의해 평가하였으며, 결과를 도 5에 나타낸다. B213-pLpxD(Pa) 클론 4 및 클론 5로부터의 LPS는 야생형 LPS보다 상당히 더 낮은 활성을 보였다. 클론 5로부터의 LPS로 자극된 세포의 SEAP 활성은 비-자극된 세포의 경우만큼 낮은 반면, 클론 4로부터의 LPS로 자극된 세포는 낮은 잔류 활성을 나타내었고, 이는 아마도 상기 클론 중 아실 쇄의 다소 덜 효율적인 변형과 일치하는 듯하다(도 3). B213ΔlpxA-pLpxA(Pa)로부터의 LPS로 자극된 세포는 비-자극된 세포보다 훨씬 더 낮은 SEAP 활성을 보였다.
mTLR4를 발현하는 HEK293 세포의, 야생형 균주 B213으로부터의 LPS 제제에 의한 자극은 hTLR4를 자극하는 세포에서 관찰된 경우보다 더 강한 반응을 생성시켰다(도 4A 및 B 비교). 이종 효소를 발현하는 B213 세포로부터의 LPS 제제는 상기 세포를 자극함에 있어서 약간 덜 유효하였다(도 4B). 그러나 염색체 lpxA 유전자가 LpxA(Pa)를 발현하는 B213에서 불활성화될 때, 생성되는 LPS는 mTLR4를 전혀 활성화하지 않았다(도 4B). 따라서, 인간 및 마우스 TLR4는 변형된 페르투씨스 LPS에 의해 상이하게 활성화되지만, 3'번 위치의 1차 아실 쇄의 길이는 상기 두 경우 모두에서 중요하다. 3번 위치의 1차 아실 쇄를 상실한 비 페루투씨스 LPS의 감소된 독성이 막으로부터의 그의 증가된 방출에 의해 전-세포 제제에서 무효화되는 것은 앞서 보고되었다[2]. 이를 고려하여, 본 발명자들은 전세포 제제의 생물 활성을 측정하고자 하였다. 균주 B213에서 이종 LPS 효소의 발현은 전세포 및 정제된 LPS 제제에서 유사하게 hTLR4를 발현하는 HEK293 세포의 자극에 영향을 미쳤다(도 4A 및 C 비교). 전세포 제제에 의한 mTLR4를 발현하는 HEK293 세포의 자극은 B213에서 이종 효소의 발현에 의해 거의 영향을 받지 않았다(도 4D). 그러나, LpxA(Pa)를 발현하는 B213의 ΔlpxA 돌연변이체의 전세포 제제는 상기 세포를 활성화하지 못하였다(도 4D).
논의
이들의 반응원성은 서브유닛 백신에 의한 전세포 페르투씨스 백신의 교체를 도출하였으나, 이는 만족스러운 보호를 제공하지 않는다. 신규의 덜 반응원성인 전세포 백신의 개발이 해법을 제공할 수 있었다. LPS는 상당한 정도로 세포 페르투씨스 백신의 독성을 담당한다[2]. 본 연구에서, 본 발명자들은 비 페르투씨스 지질 A에서 아실 쇄 길이의 변형이 감소된 독성을 생성시킬 수 있는지를 조사하였다. 본 발명자들은 3'번 위치의 1차 아실 쇄 및 2'번 위치의 2차 아실 쇄의 길이를 이종 LpxA 및 LpxL 아실트랜스퍼라제의 발현에 의해 변경시켰다. 본 발명자들은 상기 두 아실 쇄의 길이의 감소가 LPS 독성의 극적인 감소를 생성시킴을 발견하였다(도 4).
보다 정확하게, 지질 A의 3'번 위치에 존재하는 3OH-C14에 대한 3OH-C10 아실 쇄의 치환이 내독성을 없앴다. 또한, C12에 의한 2'번 위치의 1차 아실 쇄에 부착된 2차 C14 쇄의 치환이 내독성을 감소시켰다. 일치되게, 상기 내독성은 상기 쇄를 C16에 의해 치환시킬 때 증가하였다.
비 페르투씨스 지질 A의 2 및 2'번 위치의 아실 쇄의 길이의 감소는 hTLR4의 활성화에 큰 영향을 미치는 것을 추가로 관찰하였다. 독성에 대한 효과가 보다 짧은 아실 쇄의 위치와 별개로 획득됨을 고려하여, 지질 A 분자의 소수성 부분의 총 부피가 명백하게 hTLR4 복합체에의 적합한 결합 및 활성화에 중요하다. 생성된 신규의 LPS 종은 상기가 상당량의 야생형 LPS의 존재 하에서조차(도 3) 임의의 hTLR4 반응을 결실시킬 수 있었으므로(도 5) hTLR4 길항물질로서 기능하는 듯하다. 이는 B213-pLpxL(Nm)으로부터의 LPS가 LpxA(Pa) 또는 LpxD(Pa)를 발현하는 균주로부터의 정제된 LPS 제제보다 더 낮은 양의 야생형 LPS를 함유한다 하더라도 hTLR4의 활성화에서 잔류 활성을 보였기 때문에 보다 짧은 2차 아실 쇄를 갖는 LPS에 대한 경우는 아닐 수 있다. 비 페르투씨스에서 LpxD(Pa)의 발현이 증식 결함을 일으켰음에 유의해야 한다. 유사하게, 본 발명자들의 선행 결과는 LpxL(Nm)을 발현하는 비 페르투씨스의 증식 결함을 나타내었다.
요약하면, 본 발명자들의 결과는 면역계의 활성화 및 비 페르투씨스 LPS의 내독성에 대한 아실 쇄 길이의 중요성을 입증한다.
본 발명자들의 결과는 또한 마우스 및 인간 TLR4의 활성화에 대한 LPS 변형의 상이한 영향을 밝혔으며, 이때 대부분의 경우에 mTLR4가 상기 변형에 대해 덜 민감하였다. 선행의 연구는 TLR4 활성화에 관한 종-의존적인 차이를 보고하였다[24;25]. 이러한 차이는 MD-2 및 TLR4에서 종간 변화에 의해 설명될 수 있다. 이러한 차이는 백신 시험에서 실험 동물로부터 인간으로의 데이터의 외삽을 제한한다[25]. 그러나, 중요하게, LpxA(Pa)를 발현하는 균주 B213의 lpxA 녹아웃 돌연변이체의 LPS는 시험관내에서 mTLR4 및 hTLR4를 모두 활성화하지 못하였으며 이는 마우스에서 인간으로의 계획된 실험의 외삽을 허용하였다.
비 페르투씨스 지질 A의 3 및 3'번 위치의 아실 쇄의 길이가 상이함은 현저하다[4]. LpxA는 UDP-GlcNAc 중 GlcNAc의 3번 위치상에 특정 길이의 아실 쇄를 전달함으로써 지질 A 생합성 경로에서 첫 번째 반응을 촉매화한다. 상기 아실 쇄의 정확한 길이는 LpxA 중 탄화수소 자에 의해 한정된다[26]. 나중에 상기 경로에서, LpxH는 지질 X를 생성시키는 UDP-디아실글루코스아민(UDP-DAG) 전구체 집단의 일부에서 UMP를 제거하며, 그 후에 LpxB는 UDP-DAG 및 지질 X 분자를 연결하여 모노-인산화된, 4-아실화된 글루코스아민 디사카라이드를 생성시키고, 여기에서 3 및 3'번 위치의 아실 쇄는 모두 LpxA에 의한 원래의 아실화로부터 유래되며, 따라서 대개는 동일하다. 단지 드물게, 3 및 3'번 위치에 상이한 아실 쇄 길이를 갖는 LPS 종들은 자연에서 발견된다. 상이한 아실 쇄 길이와 일치되게, 이 콜라이에서의 발현 연구는 비 페르투씨스 LpxA가 감소된 쇄길이 특이성을 갖지만 다양한 길이의 아실 쇄가 3 및 3'번 위치 모두에 통합됨을 보였다[27]. 따라서, 비 페르투씨스 지질 A에서 완전무결한 비대칭은 상기 경로 하류 효소(이를 본 발명자들은 LpxH라 가정한다)의 쇄길이 특이성에 의해 설명될 것임이 틀림없다. 본 발명자들의 연구에서, LpxA(Pa)의 발현은 3 및 3'번 위치에 2개의 3OH-C10 쇄를 생성시켰으며, 이는 허용되었다. 그러나 LpxA(Nm)의 발현(상기 위치에서 2개의 1차 3OH-C12 쇄를 생성시킬 것이다(도 1))은 치명적인 것으로 나타났다. 이는 비 페르투씨스의 LpxH가 오직 3번 위치에 짧은 3OH-C10 쇄를 함유하는 UDP-DAG 분자로부터 UMP를 제거할 수 있는지를 설명할 수 있다. 실제로, 본 발명자들이 비 페르투씨스에서 LpxH(Nm)를 발현시켰을 때, 비대칭이 사라졌으며, 이는 본 발명자들의 LpxH 가설을 입증한다(데이터 도시 안 됨). 유사하게, LpxA(Nm) 및 LpxH(Nm)의 이종 발현은 생육 가능한 세포를 생성시켰다(데이터 도시 안 됨). 따라서 3OH-C10보다 긴 3번 위치의 아실 쇄를 갖는 변형된 보르데텔라 지질 A 부분을 획득하기 위해서, (변형된 아실 트랜스퍼라제 외에) 변형된 LpxH, 예를 들어 LpxH(Nm)의 존재가 필요할 수 있다.
결론적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 지질 A 조작에 의해 전세포 비 페르투씨스 백신의 독성을 감소시키는 본 발명자들의 접근법은 유효하였다. 본 발명자들의 결과는 비 페르투씨스 LPS의 내독성 활성이 주로 그의 지방 아실 쇄의 길이에 의해 결정됨을 보인다. 최초로, 본 발명자들은 시험관내 분석에서 내독성 활성이 완전히 없는 균주를 조작하는데 성공하였다. 중요하게, 상기 LPS는 또한 시험관내에서 mTLR4를 활성화하지 않았으며 이는 계획된 동물 연구에서 획득된 데이터의 인간으로의 외삽을 허용한다. 따라서, 본 발명자들의 발견은 비 페르투씨스 및 다른 병원체에 대한 신규의 세포 백신의 생성을 허용할 것이다.
[표 2A] 서열번호 및 상응하는 단백질 및 유기체
Figure pct00008
*Pa = 슈도모나스 아에루기노사, Nm = 네이세리아 메닌지티디스, Pg = 포르피로모나스 진지발리스, Bb = 비 브론키셉티카, Bp = 보르데텔라 파라페르투씨스, Bpe = 보르데텔라 페르투씨스
[표 2B] 서열번호 및 프라이머 명칭
Figure pct00009
실시예 2
lpxD (Pa) 및 lpxA (Pa) LPS 돌연변이체는 토끼에서 감소된 발열원성을 나타낸다
보르데텔라 페르투씨스 돌연변이체를 슈도모나스 아에루기노사로부터 lpxA 및 lpxD 유전자의 이종 발현을 통해 그의 LPS에서 변경된 지질 A 부분을 갖도록 구성하였다. 구체적으로, 비 페르투씨스 B1917 균주를 구성하였으며, 여기에서 염색체 lpxA 유전자 또는 lpxD 유전자는 상응하는 피 아에루기노사 버전으로 교체되었다. 상기 두 경우 모두에서, 질량 분광분석에 의해 입증된 바와 같이, 상기는 예상된 단축된 아실 쇄를 갖는 LPS의 합성을 생성시켰다.
생체내에서 상기 변경의 효과를 시험하기 위해서, 토끼 발열원성 시험을 lpxA 돌연변이체로부터 및 lpxD 돌연변이체로부터 정제된 LPS 및 lpxD 돌연변이체로부터 추출된 OMV로 수행하였으며, 모두 야생형에 대해 비교되었다. OMV(nOMV)를 필수적으로 문헌[van de Waterbeemd et al., 2010, Vaccine, 28(30):4810-6]에 기재된 바와 같이, 킬레이트제로서 EDTA에 의한 세균 바이오매스의 무세제 추출에 의해 추출하였다.
뉴질랜드 흰토끼에게 nOMV(50 ㎍의 단백질) 또는 정제된 LPS(10 ㎍), 및 무세포 페르투씨스 백신을 함유하는 0.5 ㎖의 용액 및 대조용으로서 염수를 근육내 주사하였다. 하기의 그룹들을 사용하였다(그룹당 5마리의 동물):
1. 비히클 대조용(염수)
2. 참조 백신(acP)
3. 백신 1: B1917 nOMV ompA prn
4. 백신 2: B1917 nOMV ompA prn lpxD
5. 백신 3: B1917 LPS lpxD
6. 백신 4: B1917 LPS lpxA
7. 백신 5: B1917 LPS 야생형
주사후 0.5, 1, 2, 4, 6, 24 및 48시간째에 피하 주입된 응답기로부터 외부 스캐너를 사용하여 체온을 측정하였다. 결과를 표 3 및 도 6에 나타낸다.
결과
통계학적으로 유의수준인 체온 상승이 백신 1(주사후 1, 2 및 4h째) 및 백신 5(주사후 4h째)에 의해 나타난다. 정제된 LPS의 경우, 야생형에 의해 유도된 분명한 발열 피크가 존재하지만, lpxD 및 lpxA 돌연변이체에 의해서는 존재하지 않는다. OMV의 경우, 야생형 및 lpxD 돌연변이체 모두에 대해 보다 연장된 발열 기간이 존재하지만, 후자의 경우 더 낮다. 이는 OMV가 LPS 외에 다른 발열원성 성분을 함유하므로 예상된 대로이다.
결론
데이터는 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 야생형 보르데텔라의 지질 A 부분에 비해 더 짧은 지질 A 부분을 갖는 돌연변이 보르데텔라 LPS가 토끼에서 명백히 감소된 발열원성을 보임을 입증한다. 따라서 TLR4를 발현하는 HEK 세포에 대해 상기에서 관찰된 시험관내 데이터는 상기 생체내 데이터에 의해 확증된다.
[표 3] 토끼에서 발열원성 연구의 데이터
Figure pct00010
참고문헌
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport <120> BORDETELLA VACCINES COMPRISING LPS WITH REDUCED REACTOGENICITY <130> IPA191086-NL <150> EP 17160604.9 <151> 2017-03-13 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 258 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Met Ser Leu Ile Asp Pro Arg Ala Ile Ile Asp Pro Ser Ala Arg Leu 1 5 10 15 Ala Ala Asp Val Gln Val Gly Pro Trp Ser Ile Val Gly Ala Glu Val 20 25 30 Glu Ile Gly Glu Gly Thr Val Ile Gly Pro His Val Val Leu Lys Gly 35 40 45 Pro Thr Lys Ile Gly Lys His Asn Arg Ile Tyr Gln Phe Ser Ser Val 50 55 60 Gly Glu Asp Thr Pro Asp Leu Lys Tyr Lys Gly Glu Pro Thr Arg Leu 65 70 75 80 Val Ile Gly Asp His Asn Val Ile Arg Glu Gly Val Thr Ile His Arg 85 90 95 Gly Thr Val Gln Asp Arg Ala Glu Thr Thr Ile Gly Asp His Asn Leu 100 105 110 Ile Met Ala Tyr Ala His Ile Gly His Asp Ser Val Ile Gly Asn His 115 120 125 Cys Ile Leu Val Asn Asn Thr Ala Leu Ala Gly His Val His Val Asp 130 135 140 Asp Trp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Thr Leu Val His Gln Tyr Cys Arg 145 150 155 160 Ile Gly Ala His Ser Phe Ser Gly Met Gly Ser Ala Ile Gly Lys Asp 165 170 175 Val Pro Ala Tyr Val Thr Val Phe Gly Asn Pro Ala Glu Ala Arg Ser 180 185 190 Met Asn Phe Glu Gly Met Arg Arg Arg Gly Phe Ser Ser Glu Ala Ile 195 200 205 His Ala Leu Arg Arg Ala Tyr Lys Val Val Tyr Arg Gln Gly His Thr 210 215 220 Val Glu Glu Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Ser Ala Ala Gln Phe Pro 225 230 235 240 Glu Val Ala Val Phe Arg Asp Ser Ile Gln Ser Ala Thr Arg Gly Ile 245 250 255 Thr Arg <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2 Met Lys Phe Ile Phe Phe Val Leu Tyr Val Leu Gln Phe Leu Pro Phe 1 5 10 15 Ala Leu Leu His Lys Ile Ala Asp Leu Thr Gly Leu Leu Ala Tyr Leu 20 25 30 Leu Val Lys Pro Arg Arg Arg Ile Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Cys 35 40 45 Phe Ser Glu Trp Ser Glu Glu Lys Arg Lys Thr Val Leu Lys Gln His 50 55 60 Phe Lys His Met Ala Lys Leu Met Leu Glu Tyr Gly Leu Tyr Trp Tyr 65 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285 Tyr <210> 3 <211> 288 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 3 Met Gln Ala Val Leu Pro Leu Trp Met Val Arg Leu Gln Ser Arg Ile 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Leu His Thr Val Val Arg Tyr Arg Arg Lys Val Val 20 25 30 Arg Asp Asn Leu Thr Arg Cys Phe Pro Glu Lys Ser Leu Gln Glu Ile 35 40 45 Arg Arg Ile Glu Arg Arg Phe Tyr Tyr Asn Phe Thr Tyr Gln Ile Leu 50 55 60 Ser Ser Phe Lys Leu Leu Thr Tyr Ser Gln Thr Gln Leu Arg Arg His 65 70 75 80 Ile Ser Phe Glu Asn Leu Asp Val Leu Ile Arg Leu Arg Ala Glu Gly 85 90 95 His Pro Ala Ile Leu Leu Met Met Gly His Phe Gly Asn Trp Glu Tyr 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gln Ala Ile Ile Lys Asp Leu Gly Leu Gln Ile Tyr 115 120 125 Gln Ile Phe Arg Pro Leu Lys Ser Thr Ser Ser Asp Arg Leu Met His 130 135 140 Arg Ile Arg Glu Arg Phe Gly Ser Arg Gly Ile Ala Lys His Asp Val 145 150 155 160 Pro Arg Glu Leu Leu Arg Leu Val Arg Asn Pro Ile Pro Thr Glu Thr 165 170 175 Pro Leu Val Ile Phe Ile Ala Asp Gln Ser Pro Ala Tyr Ala Gly Ser 180 185 190 Tyr Trp Thr Thr Phe Phe Gly Arg Glu Thr Ala Phe Phe Asn Gly Thr 195 200 205 Glu Lys Leu Gly His Lys Phe Ser Leu Pro Val Val Tyr Met Asp Val 210 215 220 Glu Lys Thr Gly His Asp Val Phe Thr Gly Thr Ile Lys Leu Leu His 225 230 235 240 His Pro Gln Asp Asp Ser Pro Glu Gly Ser Ile Thr Glu Glu Tyr Val 245 250 255 Arg Leu Met Glu Ala Thr Ile Arg Arg Asp Pro Ser Gln Trp Leu Trp 260 265 270 Ser His Arg Arg Trp Lys Arg Pro Arg Leu His Asn Thr Arg Gln Pro 275 280 285 <210> 4 <211> 353 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 Met Met Ser Thr Leu Ser Tyr Thr Leu Gly Gln Leu Ala Ala His Val 1 5 10 15 Gly Ala Glu Val Arg Gly Asp Ala Asp Leu Pro Ile Gln Gly Leu Ala 20 25 30 Thr Leu Gln Glu Ala Gly Pro Ala Gln Leu Ser Phe Leu Ala Asn Pro 35 40 45 Gln Tyr Arg Lys Tyr Leu Pro Glu Ser Arg Ala Gly Ala Val Leu Leu 50 55 60 Thr Ala Ala Asp Ala Asp Gly Phe Ala Gly Thr Ala Leu Val Val Ala 65 70 75 80 Asn Pro Tyr Leu Ala Tyr Ala Ser Leu Ser His Leu Phe Asp Arg Lys 85 90 95 Pro Lys Ala Ala Ala Gly Ile His Pro Thr Ala Ile Val Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Glu Val Asp Pro Ser Ala Ser Val Gly Ala Tyr Ala Val Ile Glu 115 120 125 Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ala Gly Val Ser Ile Gly Ala His Cys Val 130 135 140 Ile Gly Ala Arg Ser Val Ile Gly Glu Gly Gly Trp Leu Ala Pro Arg 145 150 155 160 Val Thr Leu Tyr His Asp Val Thr Ile Gly Ala Arg Val Ser Ile Gln 165 170 175 Ser Gly Ala Val Ile Gly Gly Glu Gly Phe Gly Phe Ala Asn Glu Lys 180 185 190 Gly Val Trp Gln Lys Ile Ala Gln Ile Gly Gly Val Thr Ile Gly Asp 195 200 205 Asp Val Glu Ile Gly Ala Asn Thr Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Ser 210 215 220 Asp Thr Leu Ile Gly Asn Gly Val Lys Leu Asp Asn Gln Ile Met Ile 225 230 235 240 Ala His Asn Val Gln Ile Gly Asp His Thr Ala Met Ala Ala Cys Val 245 250 255 Gly Ile Ser Gly Ser Ala Lys Ile Gly Arg His Cys Met Leu Ala Gly 260 265 270 Gly Val Gly Leu Val Gly His Ile Glu Ile Cys Asp Asn Val Phe Val 275 280 285 Thr Gly Met Thr Met Val Thr Arg Ser Ile Thr Glu Pro Gly Ser Tyr 290 295 300 Ser Ser Gly Thr Ala Met Gln Pro Ala Ala Glu Trp Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Ala Arg Ile Arg Gln Leu Asp Asp Met Ala Arg Arg Leu Gln Gln Leu 325 330 335 Glu Lys Arg Leu Ala Ala Val Thr Ser Ser Gly Asp Ala Ser Ser Asp 340 345 350 Ala <210> 5 <211> 240 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 5 Met Lys Pro Ala Tyr Phe Ile Ser Asp Leu His Leu Ser Glu Lys Gln 1 5 10 15 Pro Glu Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Arg Gln Ala Arg Ala Val Tyr Ile Leu Gly Asp Leu Phe Asp Phe Trp 35 40 45 Val Gly Asp Asp Glu Val Ser Glu Leu Asn Thr Ser Val Ala Arg Glu 50 55 60 Ile Arg Lys Leu Ser Asp Lys Gly Val Ala Val Phe Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 Asn Arg Asp Phe Leu Ile Gly Gln Asn Phe Cys Arg Gln Ala Gly Met 85 90 95 Thr Leu Leu Pro Asp Tyr Ser Val Leu Asp Leu Phe Gly Cys Lys Thr 100 105 110 Leu Ile Cys His Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asp Asp Arg Ala Tyr Gln 115 120 125 Arg Phe Arg Lys Ile Val His Arg Lys Arg Leu Gln Lys Leu Phe Leu 130 135 140 Met Leu Pro Leu Lys Trp Arg Thr Arg Leu Ala Thr Lys Ile Arg Arg 145 150 155 160 Val Ser Lys Met Glu Lys Gln Val Lys Pro Ala Asp Ile Met Asp Val 165 170 175 Asn Ala Ala Phe Thr Ala Arg Gln Val Arg Ala Phe Gly Ala Glu Arg 180 185 190 Leu Ile His Gly His Thr His Arg Glu His Ile His His Glu Asn Gly 195 200 205 Phe Thr Arg Ile Val Leu Gly Asp Trp His Asn Asp Tyr Ala Ser Ile 210 215 220 Leu Arg Val Asp Gly Asp Gly Ala Val Phe Val Pro Leu Glu Lys Tyr 225 230 235 240 <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 6 Met Thr Leu Ile His Pro Thr Ala Val Ile Asp Pro Lys Ala Glu Leu 1 5 10 15 Asp Ser Gly Val Lys Val Gly Ala Tyr Thr Val Ile Gly Pro Asn Val 20 25 30 Gln Ile Gly Ala Asn Thr Glu Ile Gly Pro His Ala Val Ile Asn Gly 35 40 45 His Thr Ser Ile Gly Glu Asn Asn Arg Ile Phe Gln Phe Ala Ser Leu 50 55 60 Gly Glu Ile Pro Gln Asp Lys Lys Tyr Arg Asp Glu Pro Thr Lys Leu 65 70 75 80 Ile Ile Gly Asn Gly Asn Thr Ile Arg Glu Phe Thr Thr Phe Asn Leu 85 90 95 Gly Thr Val Thr Gly Ile Gly Glu Thr Arg Ile Gly Asp Asp Asn Trp 100 105 110 Ile Met Ala Tyr Cys His Leu Ala His Asp 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<210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 10 aagcgcgaag cttatcagcg ggtgatgccg cgggttgcgc t 41 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 11 aacgcgcgca tatgaaattt atattttttg tact 34 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 12 aagcgcgcaa gctttcagta aaaatcgggg ctgccttccg 40 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 13 aagcgcgcca tatgaaagcg acactttccc t 31 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 14 aagcgcgcaa gctttcatag ttgtcgggta ttatgca 37 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 15 gtccaaatcg gcgcgaatac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 16 ctttgacggc ggaaatctgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 17 ccattggcga ccacaacctg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 18 tgccgaagac cgtcacgtag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 19 tgaaatcgct ggtgcgctac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 20 atcgggcaga tacagaaacg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 21 gtgctaccgc tatggatggt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 22 ctataccacg cgaaccgaat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 23 ctatgtggcg cggtattatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 24 caactttatc cgcctccatc 20 <210> 25 <211> 178 <212> PRT <213> Bordetella parapertussis <400> 25 Met Gln Phe Leu Lys Lys Asn Lys Pro Leu Phe Gly Ile Val Thr Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Cys Ala Thr Ala Gln Ala Gln Pro Thr Gln Gly Gly Val 20 25 30 Ser Leu His Tyr Gly Ile Gly Asp His Tyr Gln Arg Val Thr Leu Asn 35 40 45 Tyr Glu Thr Pro Thr Leu Trp Ser His Gln Phe Gly Gly Asn Trp Gly 50 55 60 Arg Leu Asp Leu Thr Pro Glu Leu Gly Ala Ser Tyr Trp Trp Ala Asp 65 70 75 80 Gly Ser Arg Ser Pro Gly His Val Trp Gln Ala Ser Ala Ile Pro Met 85 90 95 Phe Arg Trp Trp Thr Gly Glu Arg Phe Tyr Ile Glu Ala Gly Ile Gly 100 105 110 Ala Thr Val Phe Ser Ser Thr Ser Phe Ala Asp Lys Arg Ile Gly Ser 115 120 125 Ala Phe Gln Phe Gly Asp His Ile Gly Leu Gly Phe Leu Leu Thr Pro 130 135 140 Ser Asn Arg Ile Gly Leu Arg Tyr Ser His Phe Ser Asn Ala Gly Ile 145 150 155 160 Lys Glu Pro Asn Pro Gly Leu Asp Ile Val Gln Leu Thr Tyr Thr Tyr 165 170 175 Gln Phe <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 26 cgcgcgcata tgatgagtac cttgtccta 29 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 27 gcgcgcaagc ttttaatgat gatgatgatg atgatgatgg ccgccgcccg catcagatga 60 <210> 28 <211> 264 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 28 Met Ser Gly Asn Ile His Pro Thr Ala Val Val Asp Pro Ala Ala Gln 1 5 10 15 Ile Asp Ser Ser Val Val Ile Gly Pro Tyr Ser Val Val Gly Pro Gly 20 25 30 Val Ser Ile Ala Ala Gly Thr Glu Val Gly Ala His Cys Val Leu Asp 35 40 45 Gly Val Thr Ser Ile Gly Arg Asp Asn Arg Phe Tyr Arg Phe Cys Ser 50 55 60 Ile Gly Gly Met Pro Gln Asp Lys Lys Tyr Ser Gly Glu Pro Thr Arg 65 70 75 80 Leu Val Ile Gly Asp Arg Asn Thr Val Arg Glu Phe Thr Thr Phe Asn 85 90 95 Thr Gly Thr Val Gln Asp Gly Gly Val Thr Ser Ile Gly Asp Asp Asn 100 105 110 Trp Ile Met Ala Tyr Val His Ile Ala His Asp Cys His Ile Gly Asn 115 120 125 Asn Thr Ile Leu Ala Asn Ser Val Gln Leu Gly Gly His Val Gln Val 130 135 140 Gly Asp Trp Ala Ile Val Gly Gly Leu Thr Gly Val His Gln Phe Ala 145 150 155 160 Lys Ile Gly Ala His Ser Met Thr Gly Gly Asn Ser Ser Leu Met Gln 165 170 175 Asp Ala Pro Pro Phe Val Leu Ala Ala Gly Asn Pro Cys Arg Pro Val 180 185 190 Gly Val Asn Val Glu Gly Leu Lys Arg Arg Gly Phe Ser Ala Ala Ala 195 200 205 Ile Ser Ala Leu Arg Asp Ala Tyr Lys Ser Ile Tyr Arg Arg Gly Leu 210 215 220 Ser Leu Asp Glu Gly Arg Ala Glu Leu Arg Ala Arg Gln Gln Ala Glu 225 230 235 240 Pro Asp Val Ala Glu His Leu Gln Thr Met Leu Asp Phe Leu Asp Ala 245 250 255 Ser Thr Arg Gly Ile Ile Arg Pro 260 <210> 29 <211> 363 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 29 Met Pro Val Leu Leu Asp Pro Glu Asn Ala Leu Ala Leu Asp Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Gly Ile Asp Ala Gln Gly Leu Asp Trp His Leu Ser Ala Pro 20 25 30 Asp Ala Ala Asp Leu Pro Arg Ile Arg Gly Ile Gly Thr Leu Ser Ser 35 40 45 Ala Gly Asn Glu Glu Ile Ser Phe Leu Ser Asn Pro Arg Tyr Gln Asn 50 55 60 Gln Leu Ala Thr Thr Arg Ala Ala Ala Val Ile Val Thr Pro Asp Val 65 70 75 80 Ala Gln Ala Arg Gln Glu Gln Gly Ala Ser Gly His Val Leu Val Val 85 90 95 Cys Lys His Pro Tyr Leu Leu Tyr Ala Arg Leu Ala Gln Trp Phe Glu 100 105 110 Arg Ala Ser Arg Pro Ala Gly Pro Ala Gly Val His Pro Ser Ala Val 115 120 125 Val Asp Pro Ser Ala Glu Ile Asp Ala Asp Val Arg Val Gly Ala Gln 130 135 140 Cys Val Ile Glu Ala Gly Ala Arg Ile Gly Arg Gly Ala Arg Leu Gly 145 150 155 160 Pro Gly Cys Val Ile Gly Ala Gly Ser Thr Val Gly Ala Asp Ser Leu 165 170 175 Leu His Pro Arg Val Thr Leu Tyr Ala Gly Val His Val Gly Glu Arg 180 185 190 Ala Ile Ile His Ser Gly Ala Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe 195 200 205 Ala Pro Asp Pro Thr Leu Gly Arg Gly Ala Trp Gly Lys Ile Pro Gln 210 215 220 Leu Gly Glu Val Arg Val Gly Asn Asp Val Glu Ile Gly Ala Asn Thr 225 230 235 240 Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Asp Asp Thr Ile Val Gly Asp Gly Val 245 250 255 Lys Leu Asp Asn Gln Ile Met Val Ala His Asn Val Arg Ile Gly Ala 260 265 270 His Thr Ala Ile Ala Ala Cys Val Gly Ile Ala Gly Ser Thr Thr Ile 275 280 285 Gly Glu Arg Cys Thr Ile Gly Gly Ala Ser Met Leu Ser Gly His Leu 290 295 300 Ala Ile Ala Asp Asp Val Asn Ile Ser Gly Gly Thr Ala Val Thr Ser 305 310 315 320 Asn Ile Ala Lys Ala Gly Arg Tyr Thr Gly Val Tyr Pro Tyr Ala Glu 325 330 335 His Ser Glu Trp Gln Arg Asn Ala Ala Val Ile Gln Gln Leu Ala Leu 340 345 350 Leu Arg Arg Arg Leu Arg Ala Leu Glu Arg Glu 355 360 <210> 30 <211> 249 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 30 Met Trp Leu Ala Ser Asp Leu His Leu Gly Pro Ala Thr Pro Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Gln Ala Ala Ala Asp Glu Ala Ser 20 25 30 Ala Leu Leu Leu Pro Gly Asp Ile Phe Asp Ala Trp Ile Gly Asp Asp 35 40 45 Val Ile Arg Ala Ala Pro Pro Trp Leu Ala Ala Val Leu His Gly Ile 50 55 60 Arg Ala Ala Ala Gly Arg Ile Pro Val Tyr Leu Gly Arg Gly Asn Arg 65 70 75 80 Asp Phe Leu Ile Gly Gln Glu Leu Ala Asp Ala Leu Gly Ala His Leu 85 90 95 Leu Pro Glu Pro Val Leu Leu Glu Thr Asp Tyr Gly Arg Ile Leu Leu 100 105 110 Thr His Gly Asp Glu Tyr Cys Thr Asp Asp Ser Ala Tyr Gln Gln Phe 115 120 125 Arg Ala Met Val Arg Asn Pro Gln Trp Gln Ala Gln Phe Leu Ala Lys 130 135 140 Ser Ile Pro Glu Arg Leu Ala Met Ala Glu Gln Ala Arg Gly Glu Ser 145 150 155 160 Gln Ala Ala Asn Gln Ala Lys Ser Met Glu Ile Met Asp Val Asn Pro 165 170 175 Ala Ala Val Glu Ala Ala Leu Arg Glu Ala Asp Val Asp Val Leu Val 180 185 190 His Gly His Thr His Arg Pro Ala Arg His Val Leu Ser Val Asp Gly 195 200 205 Arg Lys Arg Glu Arg Trp Val Leu Pro Asp Trp Asp Cys Asp His Ala 210 215 220 Asp Pro Pro Arg Gly Gly Trp Leu Val Ile Asp Arg Asp Gly Leu Gln 225 230 235 240 Cys Phe Asp Leu Val Glu Asp Glu Asp 245 <210> 31 <211> 296 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 31 Met Ser Gln Phe Lys Thr Arg Ala Leu Thr Ala Met Leu Arg Gly Phe 1 5 10 15 Ala Arg Met Arg Pro Ala Thr Arg Gln Arg Ala Gly Ala Leu Val Gly 20 25 30 Trp Leu Ser Tyr Arg Leu Ala Arg Ser Arg Val Arg Ile Val Arg Arg 35 40 45 Asn Leu Glu Leu Cys Phe Pro Gly Gln Pro Glu Ala Val Arg Glu Arg 50 55 60 Trp Thr Arg Glu His Phe Arg Ala Leu Gly Gln Ser Ile Val Asp Arg 65 70 75 80 Gly Val Leu Trp Tyr Gly Ser Pro Glu Ala Val Arg Glu Met Val Thr 85 90 95 Gln Thr Gly Ala Glu Arg Ile Asn Ala Leu Ile Ala Ala Gly Arg Pro 100 105 110 Val Ile Leu Leu Ala Pro His Phe Val Ala Leu Asp Ala Ala Ala Thr 115 120 125 Arg Leu Thr Met Glu Val Pro Ser Gly Ala Thr Met Tyr Thr Pro Gln 130 135 140 Ser Asp Pro Ala Val Asp Ala Ile Val Arg Ala Gly Arg Ala Arg Phe 145 150 155 160 Asn Glu Val Phe Leu Val Ser Arg Lys Asp Gly Val Arg Asp Leu Val 165 170 175 Arg His Leu Arg Glu Pro Arg Pro Val Tyr Tyr Leu Pro Asp Met Asp 180 185 190 Phe Gly Arg Ala Gly Ser Ile Phe Val Pro Phe Phe Gly Val Pro Ala 195 200 205 Ala Thr Leu Leu Ala Thr Ala Gln Leu Ala Arg Lys Trp Asn Ala Ala 210 215 220 Val Leu Pro Ile Leu Asp Phe Trp Asp Pro Arg Thr Gly Arg Tyr His 225 230 235 240 Val Glu Val Leu Pro Glu Leu Pro Asp Phe Pro Gly Asp Gly Ser Leu 245 250 255 Glu Asp Ala Thr Thr Arg Leu Asn Arg Glu Leu Glu Ser Trp Val Leu 260 265 270 Arg Cys Pro Ser Gln Tyr Tyr Trp Val His Arg Arg Phe Lys Thr Arg 275 280 285 Pro Leu Gly Lys Pro Lys Leu Tyr 290 295 <210> 32 <211> 468 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 32 Met Ser Ala Trp Arg His Leu Ser Leu Trp Met Asn Gln Leu Asp Asp 1 5 10 15 Pro Leu Glu Ala Arg Pro Ser Leu Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Val 20 25 30 Ala Ile Val Gly Ala Gly Tyr Thr Gly Leu Trp Thr Ala Tyr Tyr Leu 35 40 45 Lys Arg Arg Ala Pro Gln Leu Arg Val Ala Ile Val Glu Ala Glu Thr 50 55 60 Ala Gly Phe Gly Ala Ser Gly Arg Asn Gly Gly Trp Leu Met Gly Asn 65 70 75 80 Leu Leu Gly Glu Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu Pro Pro Glu Arg Arg 85 90 95 Arg Ala Gly Tyr Asp Leu Leu His Gly Ile Pro Asp Glu Val Ala Arg 100 105 110 Val Leu Gln Glu Glu Gly Ile Asp Cys Asp Tyr Arg Lys Gly Gly Val 115 120 125 Leu Tyr Cys Ala Ala Arg Tyr Pro Glu Gln Glu Arg Arg Leu Arg Ala 130 135 140 Tyr Leu His Asp Leu Tyr Ala Glu Gly Leu Asp Glu Ser Asp Tyr Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr Pro Gln Glu Leu Asp Gln Gln Leu Arg Ile Pro Gly Ser 165 170 175 Tyr Gly Ala Ile His Ser Pro His Cys Ala Thr Ile Gln Pro Ala Arg 180 185 190 Leu Ala Arg Gly Leu Ala Arg Ala Val Glu Arg Leu Gly Val Arg Leu 195 200 205 Phe Glu Lys Ser Arg Val Leu His Trp Gln Arg Gly Leu Leu Arg Thr 210 215 220 Glu Arg Gly Glu Leu Arg Ala Glu Trp Ile Val Pro Ala Val Glu Gly 225 230 235 240 Tyr Ala Ala Ser Leu Pro Pro Leu Gly His Tyr Gln Leu Pro Val Gln 245 250 255 Ser Leu Leu Val Ala Thr Glu Pro Leu Pro Ser Ser Val Trp Ala Glu 260 265 270 Ile Gly Leu Glu Arg Gly Gln Ala Phe Ser Glu Phe Ser Arg Gln Val 275 280 285 Thr Tyr Gly Gln Arg Thr Ala Asp Asp Arg Leu Ala Phe Gly Ala Arg 290 295 300 Gly Gly Tyr Arg Phe Gly Gly Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Leu Asp 305 310 315 320 Asp Glu Glu Val Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Phe Gly Glu Leu Phe Pro 325 330 335 Leu Leu Lys Asp Ala Arg Ile Ser His Thr Trp Gly Gly Asn Leu Gly 340 345 350 Met Ala Arg Arg Phe Arg Pro His Met Leu Leu Asp Arg Ala Ser Gly 355 360 365 Ile Ala Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Glu Gly Val Gly Ala Ser Asn 370 375 380 Leu Gly Gly Arg Thr Leu Ala Ala Leu Ile Leu Gly Glu Asp Ser Glu 385 390 395 400 Leu Leu Arg Gln Pro Trp Val Leu Gly Glu Arg Pro Leu Asp Ser Leu 405 410 415 Ala Arg Trp Glu Pro Glu Pro Cys Arg Trp Leu Gly Tyr Asn Ala Ile 420 425 430 Ile Arg Ser Phe Val His Glu Asp Arg Val Leu Ala Asp Pro His Ser 435 440 445 Ala Pro Trp Arg Arg Ser Leu Ala Gln Thr Leu Ala Ala Gly Met Glu 450 455 460 Ser Leu Met Arg 465

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 아실 쇄의 길이가 더 짧다는 점에서 야생형 보르데텔라(Bordetella) LPS의 지질 A 부분에 비해 변형된 지질 A 부분을 갖는 보르데텔라 LPS.
  2. 제1항에 있어서,
    변형된 지질 A 부분(moiety)의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이가 동일한 3번 위치에서의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄보다 더 큰 길이를 갖지 않으며, 바람직하게는 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이가 C10 이하이고, 보다 바람직하게는 상기 변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이가 동일한 3번 위치에서의 야생형 보르데텔라 지질 A 부분의 아실 쇄와 동일한 길이를 가지며, 바람직하게는 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이가 C10인 보르데텔라 LPS.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    변형된 지질 A 부분의 3번 위치에서의 아실 쇄의 길이가 3'번 위치에서의 아실 쇄의 길이와 동일한 보르데텔라 LPS.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    보다 짧은 아실 쇄가
    i) 지질 A 부분의 3'번 위치에서의 아실 쇄;
    ii) 지질 A 부분의 2'번 위치에서의 1차 아실 쇄;
    iii) 지질 A 부분의 2'번 위치에서의 2차 아실 쇄; 및
    iv) 지질 A 부분의 2번 위치에서의 아실 쇄
    로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 보르데텔라 LPS.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    아실 쇄가 적어도 2, 4 또는 6 C 원자 더 짧고, 및/또는
    변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 보르데텔라 페르투씨스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투씨스(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)의 구조를 가지며, 바람직하게는 변형된 지질 A 부분을 제외하고는, 보르데텔라 페르투씨스의 구조를 갖고, 및/또는
    상기 변형된 지질 A 부분이 하기 화학식 I의 구조를 갖는
    보르데텔라 LPS:
    [화학식 I]
    Figure pct00013

    상기 식에서, X2, X3, X2', X3', R2, R3, R2', 및 R3'은 각각 독립적으로 -H, -OH, -Y, -O-(C=O)-CH(OH)-Y, 및 -O-(C=O)-Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, Y는 화학식 -(CH2)n-H의 알킬 부분이고, n은 Y의 각각의 경우에 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중에서 선택되는 정수이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 LPS를 포함하는, 보르데텔라 속의 유전자 변형된 세균.
  7. 제6항에 있어서,
    이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되고,
    바람직하게는 상기 이종 아실 트랜스퍼라제 활성을 도입시키는 유전자 변형이 세포에 이종 LpxA, LpxL 및 LpxD 아실 트랜스퍼라제 활성 중 적어도 하나를 부여하며, 보다 바람직하게는 상기 유전자 변형이 이종 lpxA, lpxL, 및 lpxD 유전자 중 적어도 하나의 발현을 도입시키고,
    i) lpxA 유전자가 서열번호 1과 적어도 60% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는 LpxA 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고;
    ii) lpxL 유전자가 서열번호 2와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxL 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고; 및/또는
    iii) lpxD 유전자가 서열번호 4와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxD 아실 트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 및/또는
    내인성 lpxA 유전자 및/또는 내인성 lpxD 유전자에 의해 암호화되는 LpxA 및/또는 LpxD 아실 트랜스퍼라제의 활성을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자 돌연변이를 추가로 포함하는 유전자 변형된 세균.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    이종 UDP-2,3-디아실글루코스아민 피로포스파타제 활성을 도입시키는 유전자 변형을 갖는다는 점에서 야생형 보르데텔라 세균에 비해 변형되며, 바람직하게는 상기 유전자 변형이 이종 lpxH 유전자의 발현을 도입시키고 보다 바람직하게는 상기 lpxH 유전자가 서열번호 5와 적어도 60% 아미노산 서열 동일성을 갖는 LpxH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖고, 및/또는
    유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스, 보르데텔라 파라페르투씨스 또는 보르데텔라 브론키셉티카이고, 바람직하게는 유전자 변형된 보르데텔라 페르투씨스 및 가장 바람직하게는 보르데텔라 페르투씨스 B213 균주이고, 및/또는
    지질 A 3-O-데아실라제 활성을 증가시키는 유전자 변형을 갖는
    유전자 변형된 세균.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 유전자 변형된 세균으로부터 수득될 수 있는 보르데텔라 LPS.
  10. 제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 보르데텔라 LPS를 포함하는 OMV로서, 바람직하게는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 변형된 세균으로부터 수득될 수 있는 OMV.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 보르데텔라 LPS, 유전자 변형된 세균 및 OMV 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  12. 약제로서 사용하기 위한, 제11항에 따른 조성물.
  13. 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 또는 자극함을 포함하는 치료에 사용하기 위한, 제11항에 따른 조성물로서, 바람직하게는 상기 면역 반응이 보르데텔라 감염, 바람직하게는 보르데텔라 페르투씨스 감염에 대해 유도되거나 또는 자극되고, 및/또는 바람직하게는 상기 치료가 백일해의 예방 또는 치료이고, 및/또는 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물인 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세균을 포함하는 전세포 백신(whole cell vaccine)이며, 바람직하게는 상기 세균이 불활성화된 조성물.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    제1항 내지 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 보르데텔라 LPS, 또는 제10항에 정의된 바와 같은 OMV를 포함하는 무세포 백신이고, 및/또는 적어도 하나의 비-보르데텔라 항원을 추가로 포함하는 조성물.
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