CN109562156B - 犬特应性皮炎的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预防或治疗犬特应性皮炎(CAD)的组合物、免疫原性或疫苗组合物和药物组合物。此外,本发明提供了用于预防或治疗CAD的方法。本发明的组合物在狗中诱导有效的免疫应答,特别是抗体应答,并因此可用于治疗和/或预防CAD。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗犬特应性皮炎(CAD)的组合物、免疫原性或疫苗组合物和药物组合物。此外,本发明提供了用于预防或治疗CAD的方法。本发明的组合物在狗中诱导有效的免疫应答,特别是抗体应答,并因此可用于治疗和/或预防CAD。
背景技术
犬特应性皮炎(CAD)被定义为由遗传与环境因素之间的相互作用引起的炎性和瘙痒性过敏性皮肤病,并且影响所有犬的高达10%(Hensel P等,(2015)BMC VeterinaryResearch 11:196-209;Meury S等,(2011)Vet Dermatol 22:327-334;Nodtvedt A等,(2007)Prev Vet Med 78:210-222)。它是犬科动物(特别是家犬)中第二常见的过敏性皮肤病状,仅次于跳蚤过敏。过敏症状表现为湿疹性皮肤和犬科动物(诸如患有特应性皮炎的家犬)经常患有瘙痒症,或严重的瘙痒、毛发损失、皮肤因深度刮伤而脱落,频繁舔爪子和产生过多的泪液。二次皮肤问题也很常见,包括皮肤感染和皮脂分泌过多。
临床体征通常在年轻时发展,并且发病的高峰年龄通常在六个月与三年之间。面部、耳朵、爪子、四肢、胸腹部和弯曲区域通常受瘙痒症和红斑的影响(Griffin CE,DeBoerDJ(2001)Veterinary Immunology and Immunopathology 81:255-269)。它通常是慢性复发病状,并且大多数狗将需要持续的,通常是终生的治疗(Nuttall T.等,VeterinaryRecord(2014)174(suppl 2),3-12)。
已描述了用于CAD和瘙痒症的几种治疗,包括使用抗组胺药(诸如非索非那定),或药物(如环孢菌素)。最近批准的称为Janus激酶或JAK抑制剂的产品也可用于治疗CAD(Nuttall T.等,Veterinary Record(2014)174(suppl 2),3-12);WO 2015/042596)。
虽然这些药物似乎是有效的,但它们具有可能防止它们长期使用的显著副作用。例如,这些药物抑制犬科动物(诸如家犬)的免疫系统,这可能导致感染。皮质类固醇还可能导致犬科动物和家犬的骨质疏松症、内分泌问题和白内障。此外,皮质类固醇倾向于导致犬科动物(诸如家犬)频繁进食、饮水和排尿,这被宠物主人认为是不期望的。此外,许多药物必须口服和每日给予,这使得它们的使用非常不方便。由于CAD经常是慢性病状,因此这些安全性和副作用问题对安全和有效的长期治疗产生了重大的未满足的医疗需求。此外,不仅仅是安全性,还有顺从性仍是另一个值得关注的问题。因此,仍需要用于CAD的治疗选择。本发明满足了这种需求。
发明内容
本发明提供了用于预防和治疗犬科动物(包括并优选家犬(Canis lupusfamiliaris或Canis familiaris)和所述家族的其它成员)的特应性皮炎的组合物。具体地,本发明提供了用于预防和治疗犬特应性皮炎(CAD)的组合物及其用途,其中优选的本发明组合物包含犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其显示在通过掺入Th细胞表位,特别是通用Th细胞表位而修饰的植物病毒黄瓜花叶病毒(CMV)的病毒样颗粒上。此外,这些修饰的VLP用作生成针对cIL-31的免疫应答,特别是抗体应答的疫苗。Th细胞表位,特别是通用Th细胞表位的存在导致生成的免疫应答进一步增加,并因此导致预防和治疗CAD的有益效果。
因此,向犬科动物,特别是家犬施用本发明的组合物导致有效降低CAD疾病参数和症状。具体地,向犬科动物,特别是家犬施用本发明的组合物不仅导致犬科动物,特别是家犬的血液和皮肤中自身抗体的诱导和白细胞介素31水平的降低,且此外所述cIL-31水平的降低与CAD疾病症状的减少相关。此外,向犬科动物,特别是家犬施用本发明的组合物导致减少瘙痒,并有效降低受CAD影响的狗的皮肤损伤严重程度。
根据本发明的治疗导致特应性皮炎损伤指数或ADLI和瘙痒症视觉模拟评分或PVAS在治疗的犬科动物,特别是家犬中降低。ADLI评分是在五个特定身体区域中评估的与犬特应性皮炎相关的六种临床症状的有效综合指数。在每个指定的身体区域处,记分员从0至5对每个参数进行评分,其中评分为0定义为无损伤,并且评分为5定义为严重/广泛损伤。PVAS由记分员使用0至10的模拟评分进行评分,其中评分为0表示没有瘙痒症/咀嚼,并且评分为10相当于不断和强烈的瘙痒症/咀嚼。
不受所述解释的束缚,据信本发明影响CAD,其被认为是多方面疾病。据信,在CAD中,Th2极化和微生物存在的组合可导致cIL-31介导的由免疫细胞、角质细胞和导致瘙痒的直接神经元刺激引起炎症和瘙痒症的作用。通过本发明的组合物和方法在犬科动物(诸如且特别是家犬)中诱导针对cIL-31的自身抗体,因此降低cIL-31的水平,并因此通过减少瘙痒和因而狗的刮伤,从而抑制所有下游的刮伤事件,包括炎症和感染,对CAD产生积极影响。
因此,在第一方面,本发明提供了在预防或治疗犬科动物,优选家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法中使用的组合物,其中向所述犬科动物,优选地向所述家犬施用有效量的所述组合物,并且其中所述组合物包含:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在优选的实施方式中,所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP),优选重组VLP。在进一步优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽、基本上由其组成或可替代地由其组成,其中所述修饰的CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV多肽,和(b)T辅助细胞表位;并且其中所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。在另一个非常优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少90%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含SEQ ID NO:23;或者其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少90%的序列同一性。在另一个非常优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ IDNo:22;或(d)SEQ ID NO:25-30。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25或(e)SEQ ID NO:26。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
在另一方面,本发明提供了一种免疫原性或疫苗组合物,其包含有效量的所述本发明组合物,其中优选地所述免疫原性或疫苗组合物还包含佐剂。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含:(a)本发明组合物或本发明免疫原性或疫苗组合物;和(b)药学上可接受的载体。
在另一方面,本发明提供了一种免疫方法,其中所述方法包括向人施用本发明组合物、本发明免疫原性或疫苗组合物或本发明药物组合物。
在另一方面,本发明提供了用作药物的本发明组合物、本发明免疫原性或疫苗组合物或本发明药物组合物。
在另一方面,本发明提供了本发明组合物、本发明免疫原性或疫苗组合物或本发明药物组合物,其在预防或治疗家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法中使用,其中向所述家犬施用有效量的所述本发明组合物、所述本发明免疫原性或疫苗组合物或所述本发明药物组合物。优选地,当与所述施用前的至少一种症状相比时,所述本发明组合物、所述本发明免疫原性或疫苗组合物或所述本发明药物组合物的所述施用减少了所述犬特应性皮炎(CAD)的至少一种症状。
在另一方面,本发明提供了一种预防或治疗家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法,其中所述方法包括向所述家犬施用有效量的所述本发明组合物、所述本发明免疫原性或疫苗组合物或所述本发明药物组合物。
在另一方面,本发明提供了所述本发明组合物、所述本发明免疫原性或疫苗组合物或所述本发明药物组合物用于制造预防或治疗家犬的犬特应性皮炎(CAD)的药物的用途,其中通常且优选地向所述家犬施用有效量的所述本发明组合物、所述本发明免疫原性或疫苗组合物或所述本发明药物组合物。
在另一方面,本发明提供了在预防或治疗家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法中使用的组合物,其中向所述家犬施用有效量的所述组合物,并且其中所述组合物包含:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒,其中所述核心颗粒优选地是病毒样颗粒(VLP),进一步优选重组VLP;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在另一方面,本发明提供了一种组合物,其包含:(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成,并且再进一步优选地,所述抗原包含具有SEQ ID No:22的氨基序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在另一个非常优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ IDNo:22;或(d)SEQ ID NO:25-30。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25或(e)SEQ ID NO:26。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
本发明的其它方面和实施方式将随着所述描述的继续而变得显而易见。
附图说明
图1 pET-CMVwt质粒图谱。表示相关基因和限制性酶位点的相对位置。
图2A纯化的CMVwt VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的粒度。
图2B纯化的CMVwt VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图3纯化的源自CMV的VLP的质谱分析。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)-TOF MS分析在Autoflex MS(Bruker Daltonik,Germany)上进行。将蛋白质分子量(MM)校准标准II(22.3–66.5kDa;Bruker Daltonik)用于质量测定。
图3A CMV野生型(“wt”);理论MM=24069;测量MM=24058
图3B CMV-Npadr;理论MM=24161(没有首次满足);测量MM=24160
图3C CMV-Ntt830;理论MM=24483(没有首次满足);测量MM=24477
图4A纯化的CMV-Ntt830 VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的粒度。
图4B纯化的CMV-Ntt830 VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图5A纯化的CMV-Npadr VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的粒度。
图5B纯化的CMV-Npadr VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图6在大肠杆菌中产生具有6xHis标签和C-末端半胱氨酸的cIL-31。泳道1-诱导前的总细胞裂解物,泳道2-诱导后的总细胞裂解物,泳道3-标记物。用箭头指示cIL-31蛋白的位置。
图7用6xHis标签和C-末端半胱氨酸纯化cIL-31。泳道1-标记物,泳道2-细胞裂解物(可溶性级份),泳道2-用洗涤缓冲液WB1进行沉淀提取,泳道2-用洗涤缓冲液WB2进行沉淀提取,泳道3-用含有8M尿素的洗脱缓冲液EB进行沉淀提取。
图8A用6xHis标签和C-末端半胱氨酸重折叠cIL-31。泳道1-标记物,泳道2-重折叠后的不溶性级分,泳道3-重折叠后的可溶性级分。
图8B具有6xHis标签和C-末端半胱氨酸的重折叠cIL-31的凝胶过滤曲线。峰对应于柱的空隙体积,表明材料聚集。
图9生产天然重组犬cIL-31。泳道1-诱导前的总细胞裂解物,泳道2-诱导后的总细胞裂解物,泳道3-标记物。用箭头指示cIL-31蛋白的位置。
图10A在凝胶过滤柱上纯化重折叠的天然重组cIL-31。蛋白质的洗脱远晚于柱空隙体积,表明材料没有聚集。
图10B在SDS-PAGE上分析峰级分
图11与CMV VLP偶联的cIL-31的SDS-PAGE电泳分析。泳道1-标记物,泳道2-CMVVLP,泳道3-CMV VLP,用SMPH处理,泳道4-cIL31,泳道5-与CMV VLP偶联的cIL-31。泳道5上的偶联产物用箭头表示。
图12 CMV-Ntt830 VLP和具有偶联cIL-31的相同VLP的电子显微镜检查。
图13A针对cIL-31的疫苗接种强烈地减少了免疫过敏狗中的刮伤。在接种疫苗之前和之后用屋尘螨提取物攻击6小时后刮伤。
图13B缺乏刮伤与cIL-31特异性抗体诱导的相关性。
具体实施方式
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
病毒样颗粒(VLP):如本文所用的术语“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性或非感染性,优选非复制性和非感染性病毒颗粒,或是指非复制性或非感染性,优选非复制性和非感染性类似于病毒颗粒的结构,优选病毒衣壳。如本文所用,术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。如本文所用,术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的,因为其缺乏全部或部分病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。重组产生的病毒样颗粒通常含有源自宿主细胞的RNA。根据本发明的病毒样颗粒的典型和优选实施方式是由本发明的多肽构成的病毒衣壳。病毒样颗粒通常是由病毒外壳蛋白构成的大分子组装体,其通常每病毒样颗粒包含60、120、180、240、300、360或多于360个蛋白质亚基。通常且优选地,这些亚基的相互作用导致形成具有固有重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构。病毒样颗粒的一个特征是其亚基的高度有序和重复排列。
CMV的病毒样颗粒:术语“CMV的病毒样颗粒”或CMV VLP是指包含、或优选地基本上由或优选地由至少一种CMV多肽组成的病毒样颗粒。优选地,CMV的病毒样颗粒包含所述CMV多肽作为主要组分,并且甚至更优选地作为衣壳结构的唯一蛋白质组分。通常且优选地,CMV的病毒样颗粒类似于CMV衣壳的结构。CMV的病毒样颗粒是非复制性和/或非感染性的,并且至少缺乏一个或多个编码CMV复制机制的基因,并且通常还缺乏一个或多个编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的基因。此定义还包括其中前述一个或多个基因仍存在但无活性的病毒样颗粒。使CMV的病毒样颗粒非复制性和/或非感染性的优选方法是通过物理或化学灭活,诸如UV照射、甲醛处理。优选地,CMV的VLP缺乏一个或多个编码CMV复制机制的基因,并且还缺乏一个或多个编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的基因。再更优选地,通过重组基因技术获得非复制性和/或非感染性病毒样颗粒。根据本发明重组产生的CMV病毒样颗粒通常且优选地不包含病毒基因组。本发明还涵盖包含多于一种多肽的病毒样颗粒,其经常称为嵌合VLP。因此,在一个实施方式中,根据本发明的病毒样颗粒包含至少两种不同种类的多肽,其中至少一种所述多肽种类是CMV多肽。优选地,CMV的VLP是由CMV外壳蛋白构成的大分子组装体,其通常每VLP包含180个外壳蛋白亚基。通常且优选地,如本文所用的CMV的VLP包含至少一种CMV多肽、基本上由其组成或可替代地由其组成,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。
多肽:如本文所用的术语“多肽”是指由通过肽键(也称为酰胺键)线性连接的氨基酸单体构成的聚合物。术语多肽是指连续的氨基酸链,并且不指代特定长度的产物。因此,肽和蛋白质均包括在多肽的定义内。
黄瓜花叶病毒(CMV)多肽:如本文所用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)多肽”是指包含以下或优选地由以下组成的多肽:(i)黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白的氨基酸序列,或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列(即所述CMV外壳蛋白)显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。通常且优选地,CMV多肽能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP):如本文所用,术语“黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)”是指存在于自然界中的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围极宽,已知许多不同的CMV菌株和分离株,并且所述菌株和分离株的外壳蛋白的序列已被确定,并且因此也是本领域技术人员已知的。所述CMV外壳蛋白(CP)的序列描述于已知数据库诸如Genbank,www.dpvweb.net或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/中并且可从其检索。实例描述于EP申请号14189897.3中。CMV外壳蛋白的其它实例提供于SEQ ID NO1-3中。值得注意的是,这些菌株和分离株在不同蛋白质结构域(包括外壳蛋白的N-末端)处具有高度相似的外壳蛋白序列。具体地,98.1%的所有完全测序的CMV分离株在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过85%的序列同一性,并且仍有79.5%的所有完全测序的CMV分离株在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过90%的序列同一性。
通常且优选地,用于本发明的CMV外壳蛋白能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。优选地,用于本发明的CMV外壳蛋白能够在大肠杆菌中通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP):如本文所用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP)”是指CMV的VLP,其是诸如包含、或优选地基本上由或优选地由至少一种修饰的CMV多肽组成的修饰的VLP,其中所述修饰的CMV多肽包含CMV多肽和T辅助细胞表位或优选地由其组成。通常且优选地,所述T辅助细胞表位:(i)与所述CMV多肽的N-末端融合,(ii)与所述CMV多肽的C-末端融合,(iii)替换所述CMV多肽的连续氨基酸区域,其中所述CMV多肽的所述替换的连续氨基酸区域与T辅助细胞表位之间的序列同一性是至少15%,优选至少20%,或(iv)替换所述CMV多肽的N-末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述替换的N-末端区域由5至15个连续氨基酸组成。优选地,所述T辅助细胞表位替换所述CMV多肽的N-末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述替换的N-末端区域由5至15个连续氨基酸、优选9至14个连续氨基酸、更优选11至13个连续氨基酸并且最优选11、12或13个连续氨基酸组成。优选地,本发明CMV的所述修饰的VLP是CMV的重组修饰的VLP。
修饰的CMV多肽:如本文所用的术语“修饰的CMV多肽”是指如本文所定义修饰的CMV多肽,所述修饰的CMV多肽包含CMV多肽和T辅助细胞表位或优选地由其组成。通常,修饰的CMV多肽能够在通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。优选地,修饰的CMV多肽是重组修饰的CMV多肽,并且能够在大肠杆菌中通过自组装表达时形成CMV的病毒样颗粒。
CMV多肽的N-末端区域:如本文所用的术语“CMV多肽的N-末端区域”是指所述CMV多肽的N-末端,并且特别是指CMV外壳蛋白的N末端,或者在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下,是指所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的N-末端区域,但以所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的N-末端的第二氨基酸开始。优选地,在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下,从实际观点来看,编码起始密码子的甲硫氨酸通常将缺失并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地,一种、两种或三种另外的氨基酸,优选一种氨基酸,可任选地插入起始甲硫氨酸与Th细胞表位之间用于克隆目的。如本文所用的术语“CMV多肽或CMV外壳蛋白的突变氨基酸序列的N-末端区域”是指所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N-末端,或者在所述突变氨基酸序列包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下,是指所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N-末端区域,但以所述CMV多肽或所述CMV外壳蛋白的所述突变氨基酸序列的N-末端的第二氨基酸开始。优选地,在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N-末端甲硫氨酸残基的情况下,从实际观点来看,编码起始密码子的甲硫氨酸通常将缺失并添加到Th细胞表位的N-末端。进一步优选地,一种、两种或三种另外的氨基酸,优选一种氨基酸,可任选地插入起始甲硫氨酸与Th细胞表位之间用于克隆目的。
重组多肽:在本发明的上下文中,术语“重组多肽”是指通过包括至少一步重组DNA技术的方法获得的多肽。通常且优选地,重组多肽在原核表达系统中产生。对于技术人员显而易见的是,在原核表达系统诸如大肠杆菌中表达的重组产生的多肽可包含N-末端甲硫氨酸残基。在重组多肽成熟期间,N-末端甲硫氨酸残基通常从表达宿主中的重组多肽上被裂解下来。然而,N-末端甲硫氨酸的裂解可能是不完全的。因此,重组多肽的制剂可包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其它相同的多肽的混合物。通常且优选地,重组多肽的制剂包含小于10%、更优选小于5%、并且仍更优选小于1%的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组多肽。
重组CMV多肽:术语“重组CMV多肽”是指如上定义的CMV多肽,其通过包括至少一步重组DNA技术的方法获得。通常且优选地,重组CMV多肽的制剂包含小于10%、更优选小于5%、并且仍更优选小于1%的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组CMV多肽。因此,本发明的重组病毒样颗粒可包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其它相同的重组多肽。
重组修饰的CMV多肽:术语“重组修饰的CMV多肽”是指如上定义的修饰的CMV多肽,其通过包括至少一步重组DNA技术的方法获得。通常且优选地,重组修饰的CMV多肽的制剂包含小于10%、更优选小于5%、并且仍更优选小于1%的具有N-末端甲硫氨酸残基的重组修饰的CMV多肽。因此,本发明的重组病毒样颗粒可包含具有和不具有N-末端甲硫氨酸残基的其它相同的重组多肽。
重组病毒样颗粒:在本发明的上下文中,术语“重组病毒样颗粒”是指通过包括至少一步重组DNA技术的方法获得的病毒样颗粒(VLP)。通常且优选地,重组病毒样颗粒包含至少一种重组多肽,优选重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽。最优选地,重组病毒样颗粒由重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽构成或由其组成。因此,如果在本发明的上下文中,本发明重组VLP的定义是参考包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列实现的,则这些本发明重组VLP的范围涵盖由没有所述N-末端甲硫氨酸残基的所述特定氨基酸序列形成的VLP,但也涵盖由具有所述N-末端甲硫氨酸(即使是通常如本文所示的微量)的所述特定氨基酸序列形成的VLP。此外,如果本发明重组VLP的定义是参考包含N-末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列实现的,则本发明的范围内涵盖包含仍含有所述N-末端甲硫氨酸残基的氨基酸序列和缺乏N-末端甲硫氨酸残基的氨基酸序列两者的VLP。
突变氨基酸序列:术语“突变氨基酸序列”是指通过将一组限定的突变引入待突变的氨基酸序列中而获得的氨基酸序列。在本发明的上下文中,所述待突变的氨基酸序列通常且优选地是CMV外壳蛋白的氨基酸序列。因此,突变氨基酸序列与CMV外壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸残基中不同,其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90%的序列同一性。通常且优选地,所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。优选地,所述突变氨基酸序列和所述待突变的序列在至多11、10、9、8、7、6、4、3、2或1个氨基酸残基中不同,其中进一步优选地,所述差异选自插入、缺失和氨基酸置换。优选地,突变氨基酸序列与CMV外壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸中不同,其中优选地所述差异是氨基酸置换。
对应于残基...的位置:氨基酸序列上对应于另一种氨基酸序列的给定残基的位置可通过序列比对,通常且优选地通过使用BLASTP算法,最优选地使用标准设置来鉴定。典型和优选标准设置为:期望阈值:10;字号:3;查询范围内的最大匹配:0;矩阵:BLOSUM62;缺口成本:存在11,扩展1;组成调整:条件组成得分矩阵调整。
序列同一性:基于两个序列的比对确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。用于确定序列同一性的算法可供技术人员使用。优选地,使用公众可获得的计算机同源程序,诸如“BLAST”程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或“CLUSTALW”(http://www.genome.jp/tools/clustalw/),并且特此优选地通过NCBI主页http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上提供的“BLAST”程序,使用其中提供的默认设置确定两个氨基酸序列的序列同一性。典型和优选标准设置为:期望阈值:10;字号:3;查询范围内的最大匹配:0;矩阵:BLOSUM62;缺口成本:存在11,扩展1;组成调整:条件组成得分矩阵调整。
氨基酸置换:术语氨基酸置换是指氨基酸序列中的给定氨基酸残基被具有不同化学结构的任何其它氨基酸残基,优选地被另一种蛋白原性氨基酸残基置换。因此,与氨基酸的插入或缺失相反,氨基酸置换不改变所述氨基酸序列的氨基酸的总数。在本发明的上下文中非常优选的是所述氨基酸序列的氨基酸残基被赖氨酸残基或半胱氨酸残基突变。
表位:术语表位是指抗原,优选多肽的连续或不连续部分,其中所述部分可在MHC分子的背景下由抗体或T细胞受体特异性结合。关于抗体,特异性结合排除非特异性结合,但不一定排除交叉反应性。表位通常在空间构象中包含5-20个氨基酸,其对于抗原位点是独特的。
T辅助(Th)细胞表位:如本文所用的术语“T辅助(Th)细胞表位”是指能够被辅助Th细胞识别的表位。在另一个优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位是通用T辅助细胞表位。
通用Th细胞表位:如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指Th细胞表位,其能够结合至少一种,优选多于一种MHC II类分子。确定肽序列是否是通用Th细胞表位的最简单方式是测量所述肽与单个MHC II类分子结合的能力。这可通过所述肽与已知Th细胞表位肽与MHC II类分子的结合竞争的能力来测量。HLA-DR分子的代表性选择描述于例如Alexander J等,Immunity(1994)1:751-761中。对于MHC II类分子,Th细胞表位的亲和力应为至少10-5M。确定Th细胞表位“普遍性”的可替代的更繁琐但也更相关的方式是证明大部分人(>30%)在免疫并在一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质加强后生成可测量的T细胞应答。存在于不同个体中的MHC II类分子的代表性集合在Panina-BordignonP等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中给出。因此,如本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选地是指在超过30%的个体选定组中,在免疫和(在一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质)加强后生成可测量的T细胞应答的Th细胞表位,如Panina-BordignonP等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中所述。此外,并且再进一步优选的,如本文所用的术语“通用Th细胞表位”优选地是指能够结合至少一个、优选至少两个并且甚至更优选至少三个DR等位基因的Th细胞表位,所述DR等位基因选自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a;并且优选地选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a,其中亲和力为至少500nM(如Alexander J等,Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中所述);用于评价所述亲和力的优选结合测定是由Sette A等,JImmunol(1989)142:35-40所述的结合测定。在甚至再更优选的方式中,如本文所用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一个、优选至少两个并且甚至更优选至少三个DR等位基因的Th细胞表位,所述DR等位基因选自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a,其中亲和力为至少500nM(如Alexander J等,Immunity(1994)1:751-761和本文引用的参考文献中所述);用于评价所述亲和力的优选结合测定是由Sette A等,J Immunol(1989)142:35-40所述的结合测定。
通用Th细胞表位被描述并且是本领域技术人员已知的,诸如Alexander J等,Immunity(1994)1:751-761,Panina-Bordignon P等,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242,Calvo-Calle JM等,J Immunol(1997)159:1362-1373以及Valmori D等,J Immunol(1992)149:717-721。
佐剂:如本文所用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物或允许在宿主中生成贮库的物质,当分别与本发明的疫苗和药物组合物组合时,其可提供甚至更强的免疫应答。优选的佐剂是完全和不完全弗氏佐剂、含铝佐剂,优选氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂是矿物凝胶,诸如氢氧化铝、表面活性物质,诸如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和人佐剂,诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些佐剂也是本领域中熟知的。可与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包含这些物质的混合物。病毒样颗粒已通常被描述为佐剂。然而,在本申请的上下文中使用的术语“佐剂”是指并非本发明病毒样颗粒的佐剂。相反,“佐剂”涉及本发明组合物、疫苗或药物组合物的另外不同组分。
有效量:如本文所用,术语“有效量”是指实现所需生物效应所必需或足够的量。组合物或可替代的药物组合物的有效量将是实现此选择结果的量,并且这种量可由本领域技术人员按常规确定。优选地,如本文所用,术语“有效量”是指必要或足以有效将cIL-31水平降低至引起狗瘙痒减少并改善CAD的水平。优选地,如本文所用,术语“有效量”是指必要或足以有效中和炎症部位处的cIL-31活性的量。有效量可根据所施用的具体组合物和受试者的大小而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定本发明的特定组合物的有效量,而无需过多的实验。
治疗:如本文所用,术语“治疗”是指预防和/或治疗。在一个实施方式中,术语“治疗”是指治疗性治疗。在另一个实施方式中,术语“治疗”是指预防性治疗。
附着位点,第一:如本文所用,短语“第一附着位点”是指病毒样颗粒天然存在的元件或人工添加到病毒样颗粒中的元件,并且第二附着位点可与之连接。第一附着位点优选地是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯甲基磺酰氟)或化学反应性基团,诸如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应性基团的优选实施方式是氨基酸残基,优选赖氨酸残基的氨基。第一附着位点通常位于表面上,并且优选地位于VLP的外表面上。多个第一附着位点通常以重复配置存在于表面上,优选地存在于VLP的外表面上。在优选的实施方式中,第一附着位点通过至少一个共价键,优选地通过至少一个肽键与VLP缔合。在进一步优选的实施方式中,第一附着位点是VLP天然存在的。可替代地,在优选的实施方式中,第一附着位点被人工添加到VLP中。在非常优选的实施方式中,所述第一附着位点是所述VLP多肽的氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。
附着位点,第二:如本文所用,短语“第二附着位点”是指cIL-31抗原天然存在的元件或人工添加到cIL-31抗原中的元件,并且第一附着位点可与之连接。cIL-31抗原的第二附着位点优选地是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯甲基磺酰氟)或化学反应性基团,诸如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第二附着位点的化学反应性基团的优选实施方式是巯基,优选氨基酸半胱氨酸的巯基,最优选半胱氨酸残基的巯基。因此,术语“具有至少一个第二附着位点的抗原”或“具有至少一个第二附着位点的cIL-31抗原”是指包含cIL-31抗原和至少一个第二附着位点的构建体。然而,特别是对于非天然存在于cIL-31抗原内的第二附着位点,这种构建体通常且优选地还包含“接头”。在另一个优选的实施方式中,第二附着位点通过至少一个共价键,优选地通过至少一个肽键与cIL-31抗原缔合。在另一个实施方式中,第二附着位点天然存在于cIL-31抗原内。在另一个非常优选的实施方式中,第二附着位点通过接头人工添加到cIL-31抗原中,其中所述接头包含半胱氨酸或可替代地由半胱氨酸组成。优选地,接头通过肽键与cIL-31抗原融合或通过化学连接添加。
连接:如本文所用的术语“连接”是指所有可能的方式,优选化学相互作用,通过所述方式,至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的典型实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键,而共价相互作用例如基于共价键,诸如酯、醚、磷酸酯、碳-磷键、碳-硫键,诸如硫醚或酰亚胺键。在某些优选的实施方式中,第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键,优选地通过至少一个非肽键并且甚至更优选地仅通过非肽键连接。然而,如本文所用的术语“连接”不仅应指至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接,而且还可替代且优选地,指至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子并且由此通常且优选地通过使用至少一个,优选一个异双功能交联剂的间接连接。在其它优选的实施方式中,第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键,优选地通过至少一个肽键,并且甚至更优选地仅通过肽键连接。
接头:如本文所用,“接头”或者将第二附着位点与cIL-31抗原缔合,或者已经包含,基本上由第二附着位点组成,或由第二附着位点组成。优选地,如本文所用,“接头”已包含第二附着位点,通常且优选地-但不是必须地-作为一个氨基酸残基,优选地作为半胱氨酸残基。优选的接头是氨基酸接头,即含有至少一个氨基酸残基的接头。术语氨基酸接头并不意味着这种接头仅由氨基酸残基组成。然而,仅由氨基酸残基组成的接头是本发明的优选实施方式。接头的氨基酸残基优选地构成本领域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸,全-L或全-D或其混合物。根据本发明的接头的进一步优选的实施方式是包含巯基或半胱氨酸残基的分子,并且因此,此类分子也涵盖在本发明内。接头与cIL-31抗原的缔合优选地通过至少一个共价键,更优选地通过至少一个肽键。
有序和重复抗原阵列:如本文所用,术语“有序和重复抗原阵列”是指cIL-31抗原的重复模式,其通常且优选地特征在于所述抗原分别相对于核心颗粒和VLP的空间排列的高阶均匀性。在本发明的一个实施方式中,重复模式可以是几何模式。此外,优选的有序和重复抗原阵列具有cIL-31抗原的严格重复的次晶序,优选地间隔为1至30纳米、优选2至15纳米、甚至更优选2至10纳米、甚至再更优选2至8纳米、并且进一步更优选1.6至7纳米。
免疫刺激物质:如本文所用,术语“免疫刺激物质”是指能够诱导和/或增强免疫应答的物质。如本文所用,免疫刺激物质包括但不限于toll样受体活化物质和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体活化物质包括但不限于免疫刺激核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激有机物质诸如紫杉醇。
免疫刺激核酸(ISS-NA):如本文所用,术语免疫刺激核酸是指能够诱导和/或增强免疫应答的核酸。免疫刺激核酸包含核糖核酸并且特别是脱氧核糖核酸,其中,核糖核酸和脱氧核糖核酸两者均可以是双链或单链的。优选的ISS-NA是脱氧核糖核酸,其中进一步优选地,所述脱氧核糖核酸是单链的。优选地,免疫刺激核酸含有至少一个包含未甲基化C的CpG基序。非常优选的免疫刺激核酸包含至少一个CpG基序,其中所述至少一个CpG基序包含至少一个、优选一个CG二核苷酸或优选地由其组成,其中C是未甲基化的。优选地,但不是必须地,所述CG二核苷酸是回文序列的一部分。术语免疫刺激核酸还指含有修饰碱基(优选4-溴-胞嘧啶)的核酸。在本发明的上下文中特别优选的是ISS-NA,其能够刺激树突细胞中的IFN-α产生。可用于本发明目的的免疫刺激核酸描述于例如WO2007/068747A1中。
寡核苷酸:如本文所用,术语“寡核苷酸”是指包含2个或更多个核苷酸,优选约6至约200个核苷酸,并且更优选20至约100个核苷酸,并且最优选20至40个核苷酸的核酸序列。非常优选地,寡核苷酸包含约30个核苷酸,更优选地,寡核苷酸恰好包含30个核苷酸,并且最优选地,寡核苷酸恰好由30个核苷酸组成。寡核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸,并且优选地选自:(a)未修饰的RNA或DNA,和(b)修饰的RNA或DNA。修饰可包含主链或核苷酸类似物。寡核苷酸优选地选自由以下组成的组:(a)单链和双链DNA,(b)作为单链和双链区域的混合物的DNA,(c)单链和双链RNA,(d)作为单链和双链区域的混合物的RNA,和(e)包含作为单链或更优选双链或者单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂合分子。优选的核苷酸修饰/类似物选自由以下组成的组:(a)肽核酸,(b)肌苷,(c)三苯甲基化的碱,(d)硫代磷酸酯,(e)烷基硫代磷酸酯,(f)5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基,(g)5-甲基脱氧胞嘧啶,和(h)5,6-二氢-5,6-二羟基脱氧胸苷。硫代磷酸化核苷酸在细胞或生物体中受到保护免于降解,并且因此是优选的核苷酸修饰。仅由磷酸二酯结合的核苷酸组成的未修饰的寡核苷酸通常比修饰的核苷酸更具活性,并且因此在本发明的上下文中通常是优选的。最优选的是仅由磷酸二酯结合的脱氧核苷酸组成的寡核苷酸,其中进一步优选地,所述寡核苷酸是单链的。进一步优选的是能够刺激细胞,优选树突细胞中IFN-α产生的寡核苷酸。能够刺激细胞中IFN-α产生的非常优选的寡核苷酸选自A型CpG和C型CpG。进一步优选的是没有Cap的RNA分子。
CpG基序:如本文所用,术语“CpG基序”是指包括未甲基化中心CpG(即未甲基化CpG二核苷酸,其中C未被甲基化),被侧接中心CpG(的3'和5'侧)的至少一个碱基,优选一个或两个核苷酸包围的核苷酸模式。通常且优选地,如本文使用的CpG基序包含或可替代地由未甲基化CpG二核苷酸和在其5'和3'末端上的两个核苷酸组成。不受理论束缚,侧接CpG的碱基赋予CpG寡核苷酸活性的显著部分。
未甲基化含CpG的寡核苷酸:如本文所用,术语“未甲基化含CpG的寡核苷酸”或“CpG”是指寡核苷酸,优选含有至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸。因此,CpG含有至少一个未甲基化胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸。优选的CpG刺激/活化,例如,对脊椎动物骨髓来源的细胞具有促有丝分裂作用,或诱导或增加其细胞因子表达。例如,CpG可用于活化B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞,诸如树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。优选地,CpG涉及寡脱氧核苷酸,优选地涉及单链寡脱氧核苷酸,其含有未甲基化胞嘧啶,随后3'是鸟苷,其中所述未甲基化胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸键连接,其中优选地所述磷酸酯结合是磷酸二酯结合或硫代磷酸酯结合,并且其中进一步优选地,所述磷酸键是磷酸二酯结合。CpG可包括核苷酸类似物,诸如含有硫代磷酸酯键的类似物,并且可以是双链或单链的。通常,双链分子在体内更稳定,而单链分子具有增加的免疫活性。优选地,如本文所用,CpG是寡核苷酸,其长度为至少约10个核苷酸并且包含至少一个CpG基序,其中进一步优选地,所述CpG长度为10至60、更优选15至50、仍更优选20至40、仍更优选约30、并且最优选恰好30个核苷酸。CpG可由甲基化和/或未甲基化核苷酸组成,其中所述至少一个CpG基序包含至少一个其中C未被甲基化的CG二核苷酸。CpG还可包含甲基化和未甲基化序列链段,其中所述至少一个CpG基序包含至少一个其中C未被甲基化的CG二核苷酸。非常优选地,CpG涉及含有未甲基化胞嘧啶,随后3'是鸟苷的单链寡脱氧核苷酸,其中所述未甲基化胞嘧啶和所述鸟苷通过磷酸二酯结合连接。CpG可包括核苷酸类似物,诸如含有硫代磷酸酯键的类似物,并且可以是双链或单链的。通常,磷酸二酯CpG是如下所示的A型CpG,而磷酸硫酯稳定的CpG是B型CpG。在本发明的上下文中,优选的CpG寡核苷酸是A型CpG。
A型CpG:如本文所用,术语“A型CpG”或“D型CpG”是指包含至少一个CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)。A型CpG优先地刺激T细胞的活化和树突细胞的成熟,并且能够刺激IFN-α的产生。在A型CpG中,至少一个CpG基序的核苷酸通过至少一个磷酸二酯键连接。A型CpG包含至少一个磷酸二酯键CpG基序,其可在其5'末端处和/或优选地并且在其3'末端处侧接硫代磷酸酯结合的核苷酸。优选地,CpG基序,并且由此优选CG二核苷酸及其包含至少一个,优选两个核苷酸的直接侧接区构成磷酸二酯核苷酸。优选的A型CpG仅由磷酸二酯(PO)键核苷酸组成。通常且优选地,多G基序包含或可替代地由至少一个,优选至少三个,至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G(鸟苷),最优选至少10个G组成。优选地,本发明的A型CpG包含或可替代地由回文序列组成。
包装:如本文所用的术语“包装”是指分别与核心颗粒和VLP相关的聚阴离子大分子或免疫刺激物质的状态。如本文所用的术语“包装”包括可以是共价(例如通过化学偶联)的结合,或非共价(例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等)的结合。所述术语还包括聚阴离子大分子的封闭或部分封闭。因此,聚阴离子大分子或免疫刺激物质可被VLP包围而不存在实际结合,特别是共价结合。在优选的实施方式中,至少一种聚阴离子大分子或免疫刺激物质最优选地以非共价方式被包装在VLP内。在所述免疫刺激物质是核酸,优选DNA的情况下,术语包装意味着所述核酸不能被核酸酶水解,优选地不能被DNAse水解(例如DNaseI或Benzonase),其中优选地所述可能性如WO2003/024481A2的实施例11-17中所述地测定。
因此,在第一方面,本发明提供了在预防或治疗犬科动物,优选家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法中使用的组合物,其中向所述犬科动物,优选地向所述家犬施用有效量的所述组合物,并且其中所述组合物包含:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在优选的实施方式中,所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP),优选重组VLP。在进一步优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽、基本上由其组成或可替代地由其组成,其中所述修饰的CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV多肽和(b)T辅助细胞表位;并且其中所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。在另一个非常优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少90%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含SEQ ID NO:23;或者其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少90%的序列同一性。在另一个非常优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ IDNo:22;(d)SEQ ID NO:25-30。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25;或(e)SEQ ID NO:26。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
在另一方面,本发明提供了在预防或治疗家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法中使用的组合物,其中向所述家犬施用有效量的所述组合物,并且其中所述组合物包含:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒,其中所述核心颗粒优选地是病毒样颗粒(VLP),进一步优选重组VLP;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在优选的实施方式中,所述病毒样颗粒(VLP)来源于植物病毒。在另一个优选的实施方式中,所述VLP是重组VLP,并且其中优选地所述重组VLP来源于植物病毒。在另一个优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的VLP。
在优选的实施方式中,所述VLP是修饰的VLP,其包含至少一种修饰的CMV多肽、基本上由其组成或可替代地由其组成,其中所述修饰的VLP多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)VLP多肽和(b)T辅助细胞表位,其中所述VLP多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)病毒外壳蛋白的氨基酸序列,优选植物病毒外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是所述病毒外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述病毒外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。
在优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽、基本上由其组成或可替代地由其组成,其中所述修饰的CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV多肽和(b)T辅助细胞表位;并且其中所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)CMV外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。
在优选的实施方式中,所述CMV多肽包含CMV外壳蛋白的氨基酸序列、优选地由其组成。在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含突变氨基酸序列、优选地由其组成,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述CMV外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、并且再更优选至少99%的序列同一性。通常且优选地,所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列在至少一个并且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基中不同,并且其中优选地,这些差异选自(i)插入,(ii)缺失,(iii)氨基酸置换,和(iv)(i)至(iii)的任何组合。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%、并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性的氨基酸序列;或(ii)突变氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如本权利要求的(i)中定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少95%、优选至少98%、并且更优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%、并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:23,或(b)包含氨基酸序列区的CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%、并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性;或(ii)突变氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如本权利要求的(i)中定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少95%、优选至少98%、并且更优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:23,或(b)包含氨基酸序列区的CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%、并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(i)(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%、并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性的氨基酸序列,并且其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含SEQID NO:23;或者其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、再进一步优选至少90%、再更优选至少95%、仍进一步优选至少98%并且仍再进一步更优选至少99%的序列同一性;或(ii)突变氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如本权利要求的(i)中定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少95%、优选至少98%并且更优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或优选地由以下组成:(a)CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选地由其组成;或(b)具有SEQ ID NO:1的至少90%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含SEQ ID NO:23;或者其中如本权利要求中(a)或(b)中定义的所述氨基序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:23具有至少90%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位替换所述CMV多肽的N-末端区域。在另一个优选的实施方式中,所述N-末端区域被替换的氨基酸数等于或低于所述T辅助细胞表位所包含的氨基酸数。
在另一个非常优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位替换所述CMV多肽的N-末端区域,并且其中所述N-末端区域被替换的氨基酸数等于或低于所述T辅助细胞表位所包含的氨基酸数。通常且优选地,所述CMV多肽的所述替换的N-末端区域由5至15个连续氨基酸、优选9至14个连续氨基酸、更优选11至13个连续氨基酸组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ IDNO:1的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位是通用T辅助细胞表位。在另一个优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位由至多20个氨基酸组成。
在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列。在进一步非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列,并且其中所述Th细胞表位包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列、优选地由其组成。
在另一个优选的实施方式中,所述T辅助细胞表位来源于人疫苗。在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位来源于破伤风毒素。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位来源于破伤风毒素,并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选地由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列,并且其中所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、优选地由其组成;或者其中所述Th细胞表位来源于破伤风毒素,并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选地由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述CMV多肽包含以下或由以下组成:CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或优选由其组成;或具有SEQ ID NO:1的至少95%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:23,并且其中所述T辅助细胞表位替换所述CMV多肽的N-末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述替换的N-末端区域由11至13个连续氨基酸、优选11个连续氨基酸组成,并且其中进一步优选地所述CMV多肽的所述N-末端区域对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方式中,所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述修饰的CMV多肽包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。根据权利要求6至8中任一项所述的组合物的用途,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述第一附着位点和所述第二附着位点经由至少一个共价非肽键连接。在另一个非常优选的实施方式中,所述第一附着位点包含或优选地是氨基,优选赖氨酸的氨基。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点包含或优选地是巯基,优选半胱氨酸的巯基。
在非常优选的实施方式中,至少一个第一附着位点是氨基,优选赖氨酸残基的氨基,并且至少一个第二附着位点是巯基,优选半胱氨酸残基的巯基或已化学附着至cIL-31抗原的巯基。在进一步优选的实施方式中,所述第二附着位点中仅一个通过至少一个非肽共价键与所述第一附着位点缔合,从而导致所述cIL-31抗原与所述修饰的病毒样颗粒的单一且均一型结合,其中与所述第一附着位点缔合的所述仅一个第二附着位点是巯基,并且其中所述cIL-31抗原和所述修饰的病毒样颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序和重复的抗原阵列,即有序和重复的cIL-31抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方式中,cIL-31抗原通过化学交联,通常且优选地通过使用异双功能交联剂与修饰的VLP连接。在优选的实施方式中,异双功能交联剂含有可与优选的第一附着位点、优选地与氨基、更优选地与修饰的VLP的赖氨酸残基的氨基反应的官能团,以及可与优选的第二附着位点(即巯基,优选为固有的或人工添加到cIL-31抗原中的半胱氨酸残基的巯基,以及任选地还通过还原反应可得的巯基)反应的另外的官能团。几种异双功能交联剂是本领域已知的。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、Sulfo-KMUS SVSB、SIA以及例如来自Pierce Chemical Company,并且具有一个对氨基具有反应性的官能团和一个对巯基具有反应性的官能团的其它可用交联剂。上述交联剂在与氨基反应后均导致形成酰胺键并与巯基形成硫醚键。适用于本发明实践的另一类交联剂的特征在于在偶联时在cIL-31抗原与修饰的VLP之间引入二硫键。属于此类的优选交联剂包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。在非常优选的实施方式中,所述异双功能交联剂是SMPH。
通过使用根据上述优选方法的异双功能交联剂将cIL-31抗原与修饰的VLP连接,允许以定向方式将cIL-31抗原与修饰的VLP偶联。将cIL-31抗原与修饰的VLP连接的其它方法包括其中使用碳二亚胺EDC和NHS将cIL-31抗原交联至修饰的VLP的方法。cIL-31抗原也可首先通过反应硫醇化,例如用SATA、SATP或亚氨基四氢噻吩。在去保护后,如果需要,则cIL-31抗原可如下与修饰的VLP偶联。在分离过量的硫醇化试剂后,将cIL-31抗原与修饰的VLP反应,所述修饰的VLP预先用包含半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化,并且因此展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团,硫醇化的cIL-31抗原可如上所述与其反应。任选地,在反应混合物中包含少量还原剂。在进一步的方法中,使用同双功能交联剂诸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3、(Pierce)或具有对修饰的VLP的胺基或羧基具有反应性的官能团的其它已知同双功能交联剂将cIL-31抗原附着至修饰的VLP。
在进一步优选的实施方式中,所述组合物还包含至少一种免疫刺激物质。在非常优选的实施方式中,将所述免疫刺激物质包装到本发明的修饰的VLP中。在另一个优选的实施方式中,将免疫刺激物质与本发明的修饰的VLP混合。可用于本发明的免疫刺激物质通常是本领域已知的,并且尤其在WO2003/024481A2中公开。
在本发明的另一个实施方式中,所述免疫刺激物质由非真核起源的DNA或RNA组成。在进一步优选的实施方式中,所述免疫刺激物质选自由以下组成的组:(a)免疫刺激核酸;(b)肽聚糖;(c)脂多糖;(d)脂磷壁酸;(e)咪唑喹啉化合物;(f)鞭毛蛋白;(g)脂蛋白;和(h)(a)至(g)的至少一种物质的任何混合物。在进一步优选的实施方式中,所述免疫刺激物质是免疫刺激核酸,其中所述免疫刺激核酸选自由以下组成的组:(a)核糖核酸;(b)脱氧核糖核酸;(c)嵌合核酸;(d)(a)、(b)和/或(c)的任何混合物。在进一步优选的实施方式中,所述免疫刺激核酸是核糖核酸,其中所述核糖核酸是源自细菌的RNA。在进一步优选的实施方式中,所述免疫刺激核酸是聚-(LC)或其衍生物。在进一步优选的实施方式中,所述免疫刺激核酸是脱氧核糖核酸,其中所述脱氧核糖核酸是未甲基化含CpG的寡核苷酸。
在非常优选的实施方式中,所述免疫刺激物质是未甲基化含CpG的寡核苷酸。在进一步优选的实施方式中,所述未甲基化含CpG的寡核苷酸是A型CpG。在进一步优选的实施方式中,所述A型CpG包含序列GACGATCGTC(SEQ ID NO:24)。在另一个优选的实施方式中,所述回文序列在其5'-末端并且在其3'-末端处侧接鸟苷实体。在另一个优选的实施方式中,所述回文序列在其5'-末端处侧接至少3个且至多15个鸟苷实体,并且其中所述回文序列在其3'-末端处侧接至少3个且至多15个鸟苷实体。
在另一个优选的实施方式中,所述免疫刺激物质是未甲基化含CpG的寡核苷酸,并且其中优选地所述未甲基化含CpG的寡核苷酸包含回文序列,并且其中进一步优选地所述未甲基化含CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分,并且其中再进一步优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO:24)。
在非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原通过巯基与所述核心颗粒、优选地与所述VLP、再进一步优选地与所述修饰的CMV VLP连接,其中优选地所述巯基由所述第二附着位点构成,并且其中所述巯基不是所述cIL-31抗原天然存在的,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)或亚氨基四氢噻吩的反应,进一步优选地其中所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
在本发明的其它优选实施方式中,cIL-31抗原通过已被添加到cIL-31抗原的N-末端或C-末端中的半胱氨酸残基或cIL-31抗原中的天然半胱氨酸残基与修饰的病毒样颗粒的赖氨酸残基连接。在优选的实施方式中,本发明的组合物还包含接头,其中所述接头将所述cIL-31抗原与所述第二附着位点缔合,并且其中优选地所述接头包含或可替代地由所述第二附着位点组成。
在优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQ ID NO:22具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQ ID NO:22具有至少92%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在进一步优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQID NO:22具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在非常优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQ ID NO:22具有至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在进一步非常优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
在另一方面,本发明提供了一种组合物,其包含:(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成,并且再进一步优选地,所述抗原包含具有SEQ ID No:22的氨基序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
在另一个非常优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选地由其组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ IDNo:22;(d)SEQ ID NO:25-30。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有选自以下的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25;或(e)SEQ ID NO:26。在进一步优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQ ID NO:22具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在非常优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有与SEQ ID NO:22具有至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在进一步非常优选的实施方式中,所述cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述至少一种cIL-31抗原包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)的反应。在另一个非常优选的实施方式中,所述第二附着位点是巯基,并且其中优选地所述巯基来源于所述cIL-31抗原的赖氨酸残基的反应。
在另一方面,本发明提供了一种预防或治疗犬科动物,优选家犬的犬特应性皮炎(CAD)的方法,其包括向所述犬科动物,优选地向所述家犬施用有效量的组合物,并且其中所述组合物包含(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接,其中优选地所述方法或所述组合物如本文所述进一步定义。
在另一方面,本发明提供了包含以下的组合物的用途:(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒;和(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原(cIL-31抗原),其中所述cIL-31抗原包含具有选自SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质或具有与SEQ ID NO:22至少90%、优选至少92%、进一步优选至少95%、并且再进一步优选至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或优选地由其组成;其中(a)和(b)通过所述至少一个第一和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接;其用于制造预防或治疗犬科动物,优选家犬的犬特应性皮炎(CAD)的药物,其中向所述犬科动物,优选地向所述家犬施用有效量的所述组合物,并且其中优选地所述方法或所述组合物如本文所述进一步定义。
实施例
实施例1
黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)的分离和克隆
使用TRI试剂(Sigma,Saint Louis,USA)根据制造商的说明分离来自CMV感染的百合叶的总RNA。对于cDNA合成,使用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen,Venlo,Netherlands)。为了扩增CMV CP基因,在分析来自GenBank的CMV序列后选择引物序列:CMcpF(CACCATGGACAAATCTGAATCAACCAGTGCTGGT)(SEQ ID NO:8)和CMcpR(CAAAGCTTATCAAACTGGGAGCACCCCAGATGTGGGA)(SEQ ID NO:9);NcoI和HindIII位点标有下划线。将相应的PCR产物克隆到pTZ57R/T载体(Fermentas,Vilnius,Lithuania)中。将大肠杆菌XL1-Blue细胞用作克隆和质粒扩增的宿主。为了避免选择含有PCR错误的克隆,使用BigDye循环测序试剂盒和ABIPrism 3100遗传分析仪(Applied Biosystems,Carlsbad,USA)对几个含CP基因的pTZ57质粒克隆进行测序。在测序后,将编码SEQ ID NO:1的CMV外壳蛋白的CMV CP基因(无序列错误(SEQ ID NO:10))的cDNA亚克隆到pET28a(+)表达载体(Novagen,San Diego,USA)的NcoI/HindIII位点中,从而导致表达质粒pET-CMVwt(图1)。
实施例2
SEQ ID NO:1的CP在大肠杆菌中的表达导致CMV的VLP
为了获得CMV VLP,用含CMV CP基因的质粒pET-CMVwt转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs,Ipswich,USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后,将大肠杆菌培养物在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中在旋转振荡器(200转/分钟;Infors,Bottmingen,Switzerland)上于30℃下生长至OD600为0.8-1.0。然后,用0.2mMIPTG诱导细胞,并用5mM MgCl2补充培养基。在旋转振荡器上于20℃下继续温育18h。通过低速离心收集所得生物质,并在-20℃下冷冻。在冰上融化后,将细胞悬浮在含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇(pH 9.0,缓冲液A)的缓冲液中,并通过超声处理破碎。通过离心(13000rpm,在5℃下30min)除去不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1:1,体积/体积)将澄清裂解物中的可溶性CMV CP蛋白质在+4℃下沉淀过夜。将析出的蛋白质在+4℃下溶解于相同的缓冲液A(不含巯基乙醇)中4h。通过低速离心(13000rpm,在4℃下15min)除去不溶性蛋白质。通过超速离心(SW28转子,Beckman,Palo Alto,USA;在25000rpm下,6h,5℃)在蔗糖梯度(在缓冲液A中的20-60%蔗糖,不含巯基乙醇,补充有0.5%Triton X-100)中将可溶性含CMV CP的蛋白质溶液与细胞蛋白分离。从梯度的底部处开始将梯度分成六个级分,并且通过SDS-PAGE分析级分(数据未示出)。合并含有重组CMVCP的级分2号和3号,并用200体积的缓冲液(5mM硼酸钠,2mM EDTA,pH 9.0)透析以除去蔗糖和Triton X-100。在透析后,通过0.2μ过滤器过滤灭菌CMV CP溶液。接下来,使用Type70转子(Beckman,Palo Alto,USA)通过20%蔗糖“垫”在无菌条件(50000rpm,4h,+5℃)下超速离心浓缩CMV CP。使用QuBit荧光计根据制造商的推荐(Invitrogen,Eugene,USA)估计纯化CMVwt的浓度。将浓缩的VLP溶液(大约3mg/ml)在+4℃下储存在5mM硼酸钠,2mM EDTA,缓冲液(pH 9.0)中。通过使用12.5%凝胶的SDS-PAGE监测涉及VLP表达和纯化的所有步骤。
CMV外壳蛋白可在大肠杆菌细胞中成功表达,并且获得的显著部分可在可溶性级分中。此外,如通过蔗糖梯度分析(图2A)、动态光散射和电子显微镜分析(图2B)所证明,这些蛋白质以等长VLP的形式直接存在于大肠杆菌细胞提取物中。
实施例3
克隆含有破伤风类毒素的CMV的修饰的外壳蛋白
(CMV-Ntt830)
为了用破伤风类毒素表位编码序列替换SEQ ID NO:1的CMV CP的N-末端处的原始氨基酸,将pET-CMVwt质粒用于PCR扩增和诱变。将位于CMVwt基因内的SalI位点(图1)用于克隆相应的PCR产物。
为了将破伤风类毒素表位编码序列引入CMVwt基因中,使用两步PCR诱变。对于第一步扩增,使用以下引物:pET-220(AGCACCGCCGCCGCAAGGAA(SEQ ID NO:11)-来自多接头的上游,扩增区域包括BglII位点)和CMV-tt83-1R(ATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTGGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT)(SEQ ID NO:12)。对于第二轮,将来自第一次扩增的PCR产物1:50稀释,并用引物pET-220(SEQ ID NO:11)和CMV-tt83Sal-R2(GACGTCGACGCTCGGTAATCCCGATAAATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTG)(SEQ ID NO:13)再扩增。将所得PCR产物(编码SEQ ID NO:6的CMV-Ntt830的SEQ ID NO:14的cDNA)亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SaLI位点中。通过测序鉴定正确的克隆并命名为pET-CMV-Ntt830。
实施例4
CMV-Ntt830在大肠杆菌中的表达导致CMV的修饰的VLP
为了获得CMV-Ntt830 VLP,用含CMV-Ntt830基因的质粒pET-CMV-Ntt830转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs,Ipswich,USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后,将大肠杆菌培养物在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中在旋转振荡器(200转/分钟;Infors,Bottmingen,Switzerland)中于30℃下生长至OD600为0.8-1.0。然后,用0.2mM IPTG诱导细胞,并用5mM MgCl2补充培养基。在旋转振荡器上于20℃下继续温育18h。通过低速离心收集所得生物质,并在-20℃下冷冻。在冰上融化后,将细胞悬浮在含有50mM柠檬酸钠、5mM硼酸钠、5mM EDTA、5mM巯基乙醇(pH 9.0,缓冲液A)的缓冲液中,并通过超声破碎。通过离心(13000rpm,在5℃下30min)除去不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1:1,体积/体积)将澄清裂解物中的可溶性CMV-Ntt830蛋白质在+4℃下沉淀过夜。将析出的蛋白质在+4℃下溶解于缓冲液A(不含巯基乙醇)中4h。通过低速离心(13000rpm,在4℃下15min)除去不溶性蛋白质。通过超速离心(SW28转子,Beckman,Palo Alto,USA;在25000rpm下,6h,5℃)在蔗糖梯度(在缓冲液A中的20-60%蔗糖,不含巯基乙醇,补充有0.5%TritonX-100)中将可溶性含CMV-Ntt830的蛋白质溶液与细胞蛋白分离。从梯度的底部处开始将梯度分成六个级分。合并含有重组CMV-Ntt830的级分,并用200体积的5mM硼酸钠,2mM EDTA(pH 9.0)透析以除去蔗糖和Triton X-100。在透析后,通过0.2μ过滤器过滤灭菌CMV-Ntt830溶液。接下来,使用Type70转子(Beckman,Palo Alto,USA)通过20%蔗糖“垫”在无菌条件(50000rpm,4h,+5℃)下超速离心浓缩CMV-Ntt830。使用QuBit荧光计根据制造商的推荐(Invitrogen,Eugene,USA)估计纯化CMV-Ntt830的浓度。将浓缩的VLP溶液(大约3mg/ml)在+4℃下储存在5mM硼酸钠,2mM EDTA,缓冲液(pH 9.0)中。通过使用12.5%凝胶的SDS-PAGE监测涉及VLP表达和纯化的所有步骤。为了证明CMV VLP中存在破伤风类毒素表位,使用纯化CMV-Ntt830 VLP的质谱分析。如图3C所示,如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生第一甲硫氨酸的除去,则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微镜证实了与CMVwt VLP类似的等长颗粒形态(图4A和4B)。
实施例5
克隆含有PADRE表位的CMV的修饰的外壳蛋白
(CMV-Npadr)
为了在CMVwt基因中引入PADRE表位编码序列,使用作为扩增和亚克隆pET-CMVwt质粒的模板进行PCR诱变(也参见实施例2和3)。对于随后的扩增,使用引物:pET-220(SEQID NO:11)和CMV-padrSal-R(GACGTCGACGCGCGGCCGCCTTGAGGGTCCACGCGGCCACAAATTTCGCCATGGT)(SEQ ID NO:15)。将所得PCR产物(编码SEQ ID NO:7的CMV-Npadr的SEQ ID NO:16的cDNA)再亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SalI位点中。通过测序鉴定正确的克隆并命名为pET-CMV-Npadr。
实施例6
CMV-Npadr在大肠杆菌中的表达导致CMV的修饰的VLP
CMV-Npadr的表达和纯化的方法基本上与用于CMV-Ntt830并在实施例4中描述的方法相同。为了证明CMV VLP中存在PADRE表位,使用纯化CMV-Npadr VLP的质谱分析。如图3B所示,如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生第一甲硫氨酸的除去,则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微镜分析证实了等长颗粒形态(图5A和5B)。
实施例7
克隆和生产具有6xHis标签和C-末端半胱氨酸的犬IL-31
具有大肠杆菌优化密码子、N-末端6xHis标签、TEV蛋白酶切割位点、C-末端半胱氨酸以及侧接NcoI和PstI限制性位点(SEQ ID NO:17)的犬IL31cDNA序列在IDT公司中制造。此外,将NcoI/PstI片段连接到载体pET42的相应位点中。将构建体转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细胞中,并将菌落接种在含有氨苄青霉素的LB琼脂板上。通过Sanger测序验证所得克隆的序列。将所得构建体pET42_6HcIL31C进一步转化到化学感受态大肠杆菌BL21-DE3细胞中。
通过将IL31-pET42转化的BL31-DE3细胞接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并在+37℃下温育过夜来制备接种材料原液。然后将原液以1:20的体积比加入到2TY培养基中。使细胞在+37℃下在振荡下生长,直至540nm处的光密度达到0.7个单位。然后用1mM IPTG诱导蛋白质(SEQ ID NO:18)表达,并使细胞在+37℃下在振荡下生长另外4小时。通过在SDS-PAGE上装载总细胞裂解物来确认蛋白质产生(图6)。
离心收集生物质并悬浮在含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)、200mM NaCl、20mMMgSO4、0.1mg/ml DNaseI、1mM PMSF和1%Triton X-100的冰冷裂解缓冲液中,保持比例为每5ml裂解缓冲液中1g湿细胞。在冰上用超声波超声裂解细胞,将获得的裂解物以15000g离心40min并弃去上清液。将含有20mM Tris HCl,pH=8.0和1M NaCl的洗涤缓冲液WB1加入到沉淀中,保持比例为每1g初始湿细胞质量3ml WB1。通过涡旋将沉淀重悬浮并在旋转振荡器上在室温下温育1h并以15000g离心15min。用含有20mM Tris HCl,pH=8.0,200mM NaCl和1M尿素的洗涤缓冲液WB2再一次重复洗涤沉淀。靶蛋白位于沉淀级分中。然后将沉淀重悬浮于含有8M尿素、20mM tris HCl,pH=8和100mM NaH2PO4的洗脱缓冲液EB1中,保持比例为每1g初始湿细胞质量3ml EB1,并在室温下在旋转振荡器上温育过夜。在离心后,上清液含有纯度为大约90%的蛋白质(图7)。将1ml获得的上清液滴加到20mL含有20mM Tris-HCl,pH=8.0,50mM NaCl,1M甘氨酸和5mMβ-巯基乙醇的重折叠缓冲液RB中,并在室温下在搅拌下温育2h。然后通过Amicon过滤单元(MWCO 10kDa)将上清液浓缩至1ml,并在+4℃下用1000mlPBS透析48h。然后,将样品离心并装载到PBS中的SuperdexTM 200 10/300GL柱上。柱谱表明靶蛋白在空隙体积中洗脱,并且因此可能形成可溶性聚集体(图8)。
实施例8
克隆和生产重组天然犬IL-31
使用含有PstI和NcoI位点的引物cIL31NATf(TACACCATGGCCTCCCACATGGCTCCAACG,SEQ ID NO:19)和cIL31NATr(CATACTGCAGTTACTGCGGTCCACTGTTTAAG,SEQ ID NO:20),用PCR从含有SEQ ID NO:17的质粒扩增犬IL-31。将获得的cIL-31PCR片段用PstI和NcoI限制性酶消化,并连接到pET42载体的相应位点中。将构建体转化到化学感受态大肠杆菌DH5α细胞中,并将菌落接种在含有氨苄青霉素的LB琼脂板上。通过Sanger测序鉴定阳性克隆。然后将cIL31-pET42构建体转化到化学感受态大肠杆菌BL21-DE3细胞中。
通过将cIL31-pET42转化的BL31-DE3细胞接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并在+37℃下温育过夜来制备接种材料原液。然后将原液以1:20的体积比加入到2TY培养基中。使细胞在+37℃下在振荡下生长,直至540nm处的光密度达到0.7个单位。然后用1mM IPTG诱导蛋白质(SEQ ID NO:21)表达,并使细胞在+37℃下在振荡下生长另外4小时。通过在SDS-PAGE上装载总细胞裂解物来确认蛋白质产生(图9)。
通过离心收集生物质并悬浮于含有40mM Tris-HCl(pH 8.0)、200mM NaCl、20mMMgSO4、0.1mg/ml DNaseI、1mM PMSF和1%Triton X-100的冰冷裂解缓冲液中,保持比例为每5ml裂解缓冲液中1g细胞。在冰上用超声波超声裂解细胞,并且将15000g获得的裂解物离心40min。弃去上清液,并且向沉淀中加入裂解缓冲液,保持1.5ml裂解缓冲液与1g初始湿细胞质量的比例。通过超声波超声将沉淀悬浮在溶液中,并将溶液以15000g离心20min。弃去上清液,并且如上所述用裂解缓冲液将沉淀洗涤5次以上。在洗涤步骤后,通过超声波超声将沉淀重新悬浮在6.86M尿素和20mM二硫苏糖醇中。将溶液以15000g离心20min,并将上清液在含有50mM Tris-HCl、1M甘氨酸、1mM EDTA和5mMβ-巯基乙醇的重折叠缓冲液中稀释,保持比例为每1ml尿素-二硫醇溶液75ml重折叠缓冲液。在+4℃下在搅拌下过夜进行重折叠。然后使用22μm过滤器过滤溶液,并使用10kDa装置(Amicon)从200ml至4ml超滤浓缩。然后将溶液以15000g离心10分钟以除去残留的析出物。将溶液装载到预先在重折叠缓冲液中平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(16x600mm)上,并分级分离(每个级分2ml,流速2ml/min)。用SDS-PAGE电泳鉴定含有cIL-31蛋白的级分、合并并使用10kDa装置(Amicon)超滤浓缩至体积为3ml。如前所述,在相同的Superdex 200凝胶过滤柱上进行重新色谱法。将重新色谱法步骤中的柱在PBS缓冲液(0.1M磷酸钠,pH 7.2和0.15M NaCl)中平衡。用SDS-PAGE电泳分析级分(图10),并且合并含有最纯cIL-31蛋白(SEQ ID No:21)的四个级分,通过在10kDa装置(Amicon)上超滤浓缩至4mg/ml并进一步用于与CMV VLP偶联实验。
实施例9
重组犬IL-31构建体与CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830 VLP的偶联以及小鼠和狗的免疫
A.cIL-31与VLP的偶联
将100μl如在实施例8中获得的cIL-31蛋白质溶液(在PBS缓冲液中4mg/ml)(SEQID NO:21)与4.8μl 55mM N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA,Thermo FisherScientific)在DMSO中混合并在室温(RT)下温育30min。通过用Amicon Ultra-0.53K过滤单元(Merck-Millipore)将PBS(0.1M磷酸钠缓冲液,pH 7.2和0.15M NaCl)进行4x缓冲液交换除去未反应的SATA,并将最终体积调节至100μl。通过加入10μL脱乙酰化溶液(0.5M羟胺和25mM EDTA的PBS溶液)将巯基基团脱保护,并在RT下温育2h。通过用Amicon Ultra-0.53K过滤单元(Merck-Millipore)将PBS进行4x缓冲液交换除去脱乙酰溶液,并将最终体积调节至100μl。
将体积为250μl,浓度为在5mM NaHPO4pH 7.5,2mM EDTA中的1.5mg/ml的CMV-Ntt830 VLP与3μl 50mM琥珀酰亚胺基-6-(b-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯(SMPH)溶液在DMSO中混合并在RT下温育1小时。对于一种VLP单体,即一种CMV多肽,SMPH的量是指7.5倍摩尔过量。通过用Amicon Ultra-0.53K过滤单元(Merck-Millipore)将5mM NaHPO4 pH 7.5,2mMEDTA pH 8.0进行4x缓冲液交换除去未反应的SMPH,并将最终体积调节至250μl。
对于偶联反应,将100μl SMPH处理的VLP与43μl SATA处理和脱乙酰化的SEQ IDNO:21的cIL-31混合,并在RT下温育3h。通过SDS-PAGE(图11)和电子显微镜(图12)检查所得产物。SDS凝胶分析证实存在预期分子量的化学偶联产物,并通过EM分析证实存在完整的VLP。
B.用cIL-31与CMV-Npadr和CMV-Ntt830 VLP偶联免疫小鼠
在第0天和第14天,用50μg通过SATA偶联至在PBS中配制的SEQ ID NO:21的cIL-31的CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830 VLP皮下免疫5只雌性Balb/c小鼠的组。在第0天(免疫前)、第14天和第28天对小鼠采血,并使用cIL-31特异性ELISA分析血清。
ELISA。在指定的时间分析小鼠血清中的抗体应答。通过用浓度为5μg/ml的重组cIL-31以100μl的体积在4℃下在PBS(pH7.2)中将ELISA板包被过夜来分析特异于cIL-31的抗体。用200μl含有0.05%Tween20(pH 7.2,PBST)的PBS将ELISA板洗涤5次。为了避免非特异性结合,用200μl在TBST中的2%BSA封闭ELISA板,并在RT下温育2小时。将血清样品稀释于2%BSA/PBST中。将预稀释的血清转移到包被的板上,并进一步连续稀释以基于OD50计算获得抗体滴度。在RT下温育2小时后,用200μl PBST洗涤ELISA板5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2%BSA/PBST中1:1000稀释,并转移每个样品100μl的体积。将板在RT下温育1小时。如前所述洗涤ELISA板。在洗涤之前,制备底物溶液。为此,将1片(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30%H2O2溶解在25ml柠檬酸缓冲液(0.066M Na2HPO4,0.035M柠檬酸,pH 5.0)中。将100μl体积的底物溶液移液到板上并在RT下恰好温育7分钟。为了终止反应,将50μl终止溶液(在H2O中的5%H2SO4)直接移液到板上。分析了在450nm处的1,2-苯二胺二盐酸盐显色反应的吸光度读数。
C.用cIL-31与CMV-Npadr和CMV-Ntt830 VLP偶联免疫狗
在第0天和第14天、第28天和第42天,用50μg通过SATA偶联至在PBS中配制的SEQID NO:21的cIL-31的CMV-Npadr VLP和CMV-Ntt830VLP皮下免疫5只狗的组。在第0天(免疫前)、第14天、第28天、第42天和第56天对狗采血,并使用cIL-31特异性ELISA分析血清。
ELISA。在指定的时间分析狗血清中的抗体应答。通过用浓度为5μg/ml的重组cIL-31以100μl的体积在4℃下在PBS(pH7.2)中将ELISA板包被过夜来分析特异于cIL-31的抗体。用200μl含有0.05%Tween20(pH 7.2,PBST)的PBS将ELISA板洗涤5次。为了避免非特异性结合,用200μl在TBST中的2%BSA封闭ELISA板,并在RT下温育2小时。将血清样品稀释于2%BSA/PBST中。将预稀释的血清转移到包被的板上,并进一步连续稀释以基于OD50计算获得抗体滴度。在RT下温育2小时后,用200μl PBST洗涤ELISA板5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗狗IgG(Jackson ImmunoResearch)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2%BSA/PBST中1:1000稀释,并转移每个样品100μl的体积。将板在RT下温育1小时。如前所述洗涤ELISA板。在洗涤之前,制备底物溶液。为此,将1片(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl30%H2O2溶解在25ml柠檬酸缓冲液(0.066M Na2HPO4,0.035M柠檬酸,pH 5.0)中。将100μl体积的底物溶液移液到板上并在RT下恰好温育7分钟。为了终止反应,将50μl终止溶液(在H2O中的5%H2SO4)直接移液到板上。分析了在450nm处的1,2-苯二胺二盐酸盐显色反应的吸光度读数。
实施例10
用重组犬IL-31构建体与CMV-Ntt830 VLP偶联治疗性免疫狗以便治疗犬特应性皮炎
在第0天和第14天、第28天、第56天和第80天,用50μg通过SATA偶联至仅在明矾中配制的SEQ ID NO:21的cIL-31或CMV-Ntt830的CMV-Ntt830 VLP皮下免疫15只狗的组。在免疫前和第28天、第56天、第80天和第120天通过目视检查测量疾病严重性。
实施例11
CAD评分
对于CAD症状评分,将特应性皮炎损伤指数(ADLI)和瘙痒症视觉模拟评分(PVAS)用于实验狗。ADLI评分是在五个特定身体区域中评估的与犬特应性皮炎相关的六种临床症状的有效综合指数。在每个指定的身体区域处,记分员从0至5对每个参数进行评分,其中评分为0定义为无损伤,并且评分为5定义为严重/广泛损伤。PVAS由记分员使用0至10的模拟评分进行评分,其中评分为0表示没有瘙痒症/咀嚼,并且评分为10相当于不断和强烈的瘙痒症/咀嚼。将治疗的狗的CAD评分与基线以及用安慰剂治疗的狗的评分进行比较。
实施例12
用cIL-31-CMV-Ntt830 VLP对屋尘螨过敏的狗接种,并且然后进行攻击
用100ug在明矾中配制的cIL-31-CMV-Ntt830 VLP免疫六条过敏性狗,并且用安慰剂(明矾)治疗六条过敏性狗。在三周后,用300ug疫苗或安慰剂加强狗。在第28天采血样。在第28天,通过胶带剥离从腹部皮肤上除去毛发,并且每天一次进行屋尘螨攻击10分钟,持续连续5天。通过对狗进行6小时/天的临床检查录像,对12只狗进行皮肤损伤和瘙痒症评分。
图13A示出了在疫苗接种之前和之后,狗的刮伤行为。存在刮伤的强烈减少,5/6免疫的狗基本上停止了刮伤,而安慰剂治疗的动物的行为没有改变。
cIL-31特异性IgG滴度的测定。在第28天分析狗血清中的抗体应答。通过用浓度为3μg/ml的重组cIL-31以100μl的体积在4℃下在PBS(pH7.2)中将ELISA板包被过夜来分析特异于cIL-31的抗体。用200μl含有0.05%Tween20(pH 7.2,PBST)的PBS将ELISA板洗涤5次。为了避免非特异性结合,用200μl在TBST中的2%BSA封闭ELISA板,并在RT下温育2小时。将血清样品稀释于2%BSA/PBST中。将预稀释的血清(10倍)转移到包被的板上,并进一步连续稀释(3倍步骤)以基于OD50计算获得抗体滴度。在RT下温育2小时后,用200μl PBST洗涤ELISA板5次。通过辣根过氧化物酶缀合的山羊抗狗IgG(Jackson ImmunoResearch)检测血清抗体的结合。将检测抗体在2%BSA/PBST中1:1000稀释,并转移每个样品100μl的体积。将板在RT下温育1小时。如前所述洗涤ELISA板。在洗涤之前,制备5种底物溶液。为此,将1片(10mg)OPD(1,2-苯二胺二盐酸盐)和9μl 30%H2O2溶解在25ml柠檬酸缓冲液(0.066MNa2HPO4,0.035M柠檬酸,pH 5.0)中。将100μl体积的底物溶液移液到板上并在RT下恰好温育7分钟。为了终止反应,将50μl终止溶液(在H2O中的5%H2SO4)直接移液到板上。分析了在450nm处的1,2-苯二胺二盐酸盐显色反应的吸光度读数,并表示为10倍预稀释血清的log3(图13B)。图13B示出了IL-31特异性抗体滴度与刮擦强度之间的相关性。仍刮伤的一只狗具有最低的抗体应答,并且发现<1/300的指示性滴度是保护性的。
Claims (5)
1.组合物在制备用于预防或治疗犬科动物的犬特应性皮炎CAD的药物中的用途,其中所述组合物包含:
(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒,其为黄瓜花叶病毒CMV的修饰的病毒样颗粒VLP,其中所述CMV的修饰的VLP由至少一种修饰的CMV多肽组成,其中所述修饰的CMV多肽由以下组成:
(1) CMV多肽,和
(2) T辅助细胞表位;并且
其中所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7;和
(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原即cIL-31抗原,其中所述至少一种cIL-31抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO: 21;
其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述犬科动物的犬特应性皮炎CAD为家犬的犬特应性皮炎CAD。
3.一种组合物,其包含:
(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒VLP,其为黄瓜花叶病毒CMV的修饰的病毒样颗粒VLP,其中所述CMV的修饰的VLP由至少一种修饰的CMV多肽组成,其中所述修饰的CMV多肽由以下组成:
(1) CMV多肽,和
(2) T辅助细胞表位;并且
其中所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7;
(b)至少一种具有至少一个第二附着位点的犬白细胞介素-31抗原即cIL-31抗原,其中所述至少一种cIL-31抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO: 21;
其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点经由至少一个非肽共价键连接。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述第二附着位点是巯基。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中所述巯基来源于所述cIL-31抗原与N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯的反应。
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