KR102469478B1 - 개 아토피성 피부염의 치료 - Google Patents

개 아토피성 피부염의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개 아토피성 피부염(CAD)의 예방 또는 치료를 위한 조성물, 면역원성 또는 백신 조성물, 그리고 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 CAD의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 개에서 효율적인 면역 반응, 구체적으로 항체 반응을 유도하므로, CAD의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

Description

개 아토피성 피부염의 치료
본 발명은 개 아토피성 피부염(Canine Atopic Dermatitis; CAD)의 예방 또는 치료를 위한 조성물, 면역원성 또는 백신 조성물, 그리고 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 CAD의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 개에서 효율적인 면역 반응, 구체적으로 항체 반응을 유도하므로, CAD의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
개 아토피성 피부염(CAD)은, 유전 요인과 환경 요인 간 상호작용에 의해 유발되는 염증성 및 소양성 알레르기 피부 질환으로서 정의되며, 전체 개의 10% 이하에서 발병한다[Hensel P et al., (2015) BMC Veterinary Research 11:196-209; Meury S et al., (2011) Vet Dermatol 22: 327-334; Nodtvedt A, et al., (2007) Prev Vet Med 78: 210-222]. 이는, 개과 동물, 특히 반려견에서 오로지 벼룩 알레르기 다음으로 두 번째로 가장 널리 알려진 알레르기성 피부 병태이다. 알레르기 증상은 습진성 피부로서 발현되고, 아토피성 피부염을 가지는 반려견과 같은 개과 동물은 종종 소양증, 중증 가려움증, 탈모, 심하게 긁음으로 인한 피부 표피박리, 잦은 발 핥기, 그리고 과도한 눈물 생성으로 고통을 받는다. 피부 감염 및 과도한 피지 분비를 비롯하여 피부의 속발적인 문제들도 또한 흔히 발생한다.
임상 증상들은 보통 어린 시기에도 나타나지만, 통상 6월령 내지 3세의 나이에 가장 많이 발병한다. 얼굴, 귀, 발, 신체 극단부, 복부, 그리고 오금 및 관절(flex-zone)에는, 통상 소양증과 부종이 발생한다[Griffin CE, DeBoer DJ (2001) Veterinary Immunology and Immunopathology 81: 255-269]. 이는, 통상적으로 만성 재발성 병태이며, 대부분의 개는 지속적으로, 보통은 평생 동안 치료를 필요로 할 것이다[Nuttall T., et al., Veterinary Record (2014) 174 (suppl 2), 3-12].
펙소페나딘과 같은 항히스타민제, 또는 사이클로스포린과 같은 약물을 사용하는 것과 같이, CAD 및 소양증을 치료하는 방법 몇 가지가 이미 알려져 있다. 최근 승인된 제품으로서, 야누스 키나아제 억제제 또는 JAK 억제제로 공지되어 있는 제품도 또한 CAD를 치료하는데 사용될 수 있다[Nuttall T., et al., Veterinary Record (2014) 174 (suppl 2), 3-12); WO 2015/042596].
이러한 약물들은 유효한 것으로 보이지만, 이 약물들은 이것들의 장기 사용을 꺼려지게 만들 수 있는 유의미한 부작용이 있다. 예를 들어 이러한 약물들은 개과 동물, 예컨대 반려견의 면역계를 억제하여 감염을 유발시킬 수 있다. 코르티코스테로이드는 또한 개과 동물 및 반려견에 있어서 골다공증, 내분비계 문제 및 백내장을 일으킬 수 있다. 게다가, 코르티코스테로이드는 반려견과 같은 개과 동물이 자주 먹고, 마시고 소변을 보게 만드는 경향이 있는데, 이는 반려동물 주인들에게는 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 뿐만 아니라, 다수의 약물은 매일 경구 섭취되어야 하는데, 이러한 점은 약물 복용을 매우 불편하게 만든다. CAD는 종종 만성으로 가는 병태이므로, 약물의 안전성과 부작용에 관한 문제는 안전하고 유효한 장기 치료에 대한 의료상의 요구를 상당히 만족스럽지 못하게 만든다. 더욱이 안전성뿐만 아니라, 순응성 또한 염려해야 할 또 다른 문제이다. 그러므로 CAD의 치료상 선택에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 이러한 요구를 충족시켜준다.
본 발명은 개과 동물, 예를 들어, 그리고 바람직하게 반려견[카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) 또는 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)] 및 개과 기타 일원의 아토피성 피부염의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 개 아토피성 피부염(CAD)의 예방 및 치료를 위한 조성물과, 이 조성물의 용도를 제공하는데, 바람직한 본 발명의 조성물은, Th 세포 에피토프, 구체적으로 보편적 Th 세포 에피토프의 혼입으로 인해 변형된 식물 바이러스인 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 바이러스 유사 입자 상에 제시되는, 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원)을 포함한다. 더욱이, 이처럼 변형된 VLP들은 cIL-31에 대한 면역 반응, 구체적으로 항체 반응을 일으키기 위한 백신으로서 사용된다. Th 세포 에피토프, 구체적으로 보편적 Th 세포 에피토프의 존재는, 일어난 면역 반응을 한층 더 증가시키고, 이로써 CAD의 예방 및 치료에 대한 유리한 효과를 달성해 낸다.
따라서, 본 발명의 조성물을 개과 동물, 구체적으로 반려견에 투여하는 것은, CAD 질환 매개변수 및 증상의 효율적 감소를 유도한다. 구체적으로 본 발명의 조성물을 개과 동물, 구체적으로 반려견에 투여하는 것은, 개과 동물, 구체적으로 반려견에서 인터루킨 31의 혈액 및 피부 중 수준의 감소뿐만 아니라, 자가항체의 유도를 달성하기도 하지만, 덧붙여서 상기 cIL-31 수준의 감소는 CAD 질환 증상의 감소와 상관되어 있기도 하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물을 개과 동물, 구체적으로 반려견에 투여하는 것은, CAD가 발병한 개의 가려움증을 완화하고, 이러한 개의 피부 병변에 관한 중증도 등급을 효율적으로 낮춘다.
본 발명에 따른 치료는, 치료된 개과 동물, 구체적으로 반려견에 있어서 아토피성 피부염 병변 지수(Atopic Dermatitis Lesion Index), 즉 ADLI와, 소양증 시각 아날로스 스코어(Pruritus Visual Analog Score), 즉 PVAS의 강하를 초래한다. ADLI 스코어는, 5군데의 지정 신체 부위를 대상으로 평가되는, 개 아토피성 피부염 관련 임상 증상 6가지로 이루어진 유효 복합 지수이다. 각각의 지정된 신체 부위에서 0에서부터 5에 이르기까지의 기록원에 의해 각각의 매개 변수에 스코어가 매겨지는데, 다만, 스코어 0은 병변이 없는 경우로서 정의되고, 스코어 5는 중증/광범위 병변이 나타난 경우로서 정의된다. PVAS는 0에서부터 10에 이르기까지의 아날로그 스케일을 이용하는 기록원에 의해 스코어가 매겨지되, 다만 스코어 0은 소양증/물어뜯기 행동을 보이지 않는 경우를 나타내고, 스코어 10은 끊임없으면서 심한 소양증/물어뜯기 행동을 보이는 경우에 해당한다.
이러한 설명에 의해 제한되지 않을 때, 본 발명은 다면적 질환인 것으로 간주되는 CAD에 영향을 미칠 것으로 생각된다. CAD에 있어서, Th2 편재화와 미생물의 존재가 모두 갖추어지면 면역 세포, 케라틴세포, 그리고 가려움증을 일으키는 직접적인 신경 자극에 의해 가동되는 cIL-31 매개 현상, 즉 염증 및 소양증을 유도할 수 있다. 그러므로 개과 동물, 구체적 예를 들어 반려견에 있어서 본 발명의 조성물과 방법에 의하여 cIL-31에 대해 유도된 자가항체는 cIL-31의 수준을 낮추고, 이에 따라 개의 가려움증을 줄여줌으로써 결과적으로는 긁는 행동도 줄여주며, 긁는 행동으로 인한 모든 속발성 증상, 예컨대 염증 및 감염을 억제하는 것과 같은 긍정적인 영향을 CAD에 대해 보인다.
그러므로 제1 양태에서, 본 발명은 개과 동물, 바람직하게는 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물 유효량이 상기 개과 동물, 바람직하게는 상기 반려견에 투여되고, 상기 조성물은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 코어 입자와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하며, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 코어 입자는 바이러스 유사 입자(Virus-Like Particle; VLP), 바람직하게 재조합 VLP이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형된 VLP인데, 상기 CMV의 변형 VLP는 적어도 하나의 변형 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어져 있거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있고, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 폴리펩티드와, (b) T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV의 코트 단백질 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어져 있되, 다만 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열이고, CMV의 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어짐], 또는 (b) 적어도 90%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산을 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어져 있고; 본 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함하거나; 또는 본 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열 영역을 포함하되, 다만 상기 아미노산 서열 영역은 적어도 90%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 보인다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP로서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; 또는 (d) 서열 번호 25 내지 서열 번호 30으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것들로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25 또는 (e) 서열 번호 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것들로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응으로부터 유래한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물 유효량만큼을 포함하는 면역원성 또는 백신 조성물을 제공하는데, 바람직하게 상기 면역원성 또는 백신 조성물은 보조제를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물과; (b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 면역화 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물 또는 본 발명의 약학 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 의약품으로 사용될, 본 발명의 조성물, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 본 발명의 약학 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)의 에방 또는 치료 방법에 사용될, 본 발명의 조성물, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 본 발명의 약학 조성물을 제공하는데, 상기 본 발명의 조성물, 상기 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 상기 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼이 상기 반려견에 투여된다. 바람직하게 상기 본 발명의 조성물, 상기 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 상기 본 발명의 약학 조성물의 상기 투여는, 이러한 투여가 수행되기 전에 보이는 개 아토피성 피부염(CAD)의 적어도 하나의 증상에 비하여, 상기 개 아토피성 피부염의 적어도 하나의 증상을 완화한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)의 에방 또는 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 본 발명의 조성물, 상기 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 상기 본 발명의 약학 조성물 유효량만큼을 상기 반려견에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 본 발명의 조성물, 상기 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 상기 본 발명의 약학 조성물의, 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD) 예방 또는 치료를 위한 의약품을 제조하기 위한 용도를 제공하는데, 통상적으로, 그리고 바람직하게 상기 본 발명의 조성물, 상기 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물, 또는 상기 본 발명의 약학 조성물의 유효량만큼이 상기 반려견에 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명은 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물 유효량만큼이 상기 반려견에 투여되고, 상기 조성물은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 코어 입자[다만 상기 코어 입자는, 바람직하게 바이러스 유사 입자(VLP), 더욱 바람직하게 재조합 VLP임]와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하되, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 바이러스 유사 입자(VLP)와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하되, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고, 또한 추가로 바람직하게 상기 항원은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP이고, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; 또는 (d) 서열 번호 25 내지 서열 번호 30으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것들로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25 또는 (e) 서열 번호 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응으로부터 유래한다.
본 발명의 추가의 양태들과 구현예들은 이러한 기재가 이어짐에 따라 명백해질 것이다.
도 1: pET-CMVwt 플라스미드 맵. 유관 유전자들과 제한 효소 부위의 상대적 위치들이 표시되어 있다.
도 2a: 정제된 CMVwt VLP의 동적 광 산란. 입자 크기는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., United Kingdom)를 사용함으로써 검출되었다.
도 2b: 정제된 CMVwt VLP의 전자현미경 분석. VLP의 형태 분석을 위해 JEM-1230 전자현미경(Jeol Ltd., Tokyo, Japan)이 사용되었다.
도 3: 정제된 CMV 유래 VLP의 질량분광분석. Autoflex MS(Bruker Daltonik, Germany) 상에서 매트릭스 지원 레이저 탈착/이온화(MALDI)-TOF MS 분석이 수행되었다. 질량 측정을 위하여 단백질 분자 질량(MM) 교정 기준 II(22.3 ~ 66.5 kDa; Bruker Daltonik)가 사용되었다.
도 3a: CMV야생형("wt"); 이론상 MM = 24069; 실측 MM = 24058.
도 3b: CMV-Npadr; 이론상 MM = 24161(첫 번째 Met 부재); 실측 MM = 24160.
도 3c: CMV-Ntt830; 이론상 MM = 24483(첫 번째 Met 부재); 실측 MM = 24477.
도 4a: 정제된 CMV-Ntt830 VLP의 동적 광산란. 입자 크기는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., United Kingdom)를 사용함으로써 검출되었다.
도 4b: 정제된 CMV-Ntt830 VLP의 전자현미경 분석. VLP의 형태 분석을 위해 JEM-1230 전자현미경(Jeol Ltd., Tokyo, Japan)이 사용되었다.
도 5a: 정제된 CMV-Npadr VLP의 동적 광산란. 입자 크기는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd., United Kingdom)를 사용함으로써 측정되었다.
도 5b: 정제된 CMV-Npadr VLP의 전자 현미경 분석. VLP의 형태 분석을 위해 JEM-1230 전자현미경(Jeol Ltd., Tokyo, Japan)이 사용되었다.
도 6: 이.콜라이(E.coli) 내 6xHis 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하는 cIL-31의 생산. 레인 1 - 유도 전 총 세포 용해물. 레인 2 - 유도 후 총 세포 용해물. 레인 3 - 마커. cIL-31 단백질의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 7: 6xHis 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하는 cIL-31의 생산. 레인 1 - 마커, 레인 2 - 세포 용해물(가용성 분획), 레인 2 - 세정 완충제 WB1을 이용한 펠렛 추출, 레인 2 - 세정 완충제 WB2를 이용한 펠렛 추출, 레인 3 - 8M 우레아를 함유하는 용리 완충제 EB를 이용한 펠렛 추출.
도 8a: 6xHis 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하는 cIL-31의 리폴딩(refolding). 레인 1 - 마커, 레인 2 - 리폴딩 후의 불용성 분획, 레인 3 - 리폴딩 후의 가용성 분획.
도 8b: 6xHis 태그 및 C-말단 시스테인을 포함하여 리폴딩된 cIL-31의 겔 여과 프로필. 피크는 컬럼의 허공 용적(void volume)(이는 재료가 응집되었음을 나타냄)에 해당한다.
도 9: 재조합 개 cIL-31의 생산. 레인 1 - 유도 전 총 세포 용해물. 레인 2 - 유도 후 총 세포 용해물. 레인 3 - 마커. cIL-31 단백질의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 10a: 리폴딩된 원산 재조합 cIL-31의 겔 여과 컬럼상 정제. 단백질은 컬럼 허공 용적이 생성되고 나서 훨씬 이후에 용리되는데, 이는 곧 재료가 응집되지 않았음을 나타낸다.
도 10b: SDS-PAGE상 피크 분획들의 분석 결과.
도 11: CMV VLP와 커플링(coupling)된 cIL-31의 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과. 레인 1 - 마커, 레인 2 - CMV VLP, 레인 3 - SMPH 처리된 CMV VLP, 레인 4 - cIL31, 레인 5 - CMV VLP에 결합한 cIL-31. 레인 5상의 커플링 생성물은 화살표로 표시되어 있다.
도 12: CMV-Ntt830 VLP와, cIL-31와 커플링된 CMV-Ntt830 VLP의 전자현미경사진.
도 13a: cIL-31에 대한 백신화는 면역화된 알레르기성 개에 있어서 긁기행동을 상당히 줄여준다. 백신화 전과 후, 집 먼지 진드기 추출물로 면역 자극되고 나서 6 시간 동안의 긁기행동.
도 13b: cIL-31 특이적 항체 유도와 긁기행동 비표출의 상관관계.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당 업자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
바이러스 유사 입자(VLP): 본원에 사용된 바와 같은 "바이러스 유사 입자(VLP)"란 용어는, 비 복제성 또는 비 감염성 바이러스 입자, 바람직하게는 비 복제성 및 비 감염성 바이러스 입자를 지칭하거나, 또는 바이러스 입자와 닮은 비 복제성 또는 비 감염성 구조, 바람직하게는 비 복제성 및 비 감염성 구조, 바람직하게는 바이러스 캡시드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비 복제성"이란 용어는, VLP에 포함된 게놈을 복제시킬 수 없는 경우를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비 감염성"이란 용어는, 숙주 세포에 도입될 수 없는 경우를 지칭한다. 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자는, 바이러스 게놈 또는 게놈 기능 전부 또는 일부가 결여되어 있으므로, 비 복제성 및 비 감염성이다. 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자는 자체의 게놈과 구별되는 핵산을 함유할 수 있다. 재조합 생산된 바이러스 유사 입자는, 통상 숙주 세포 유래 RNA를 함유한다. 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자에 관한 통상의, 그리고 바람직한 구현예는 본 발명의 폴리펩티드로 구성된 바이러스 캡시드이다. 바이러스 유사 입자는, 통상 바이러스 유사 입자 당 통상 60개, 120개, 180개, 240개, 300개, 360개 또는 360개를 초과하는 단백질 서브유닛을 포함하는 바이러스 코트 단백질로 구성된 거대분자 조립체이다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 이러한 서브유닛의 상호작용은 고유의 반복 조직을 가지는 바이러스 캡시드 또는 바이러스 캡시드 유사 구조의 형성을 유도한다. 바이러스 유사 입자의 한가지 특징은, 자체의 서브유닛들이 반복적으로 매우 질서정연하게 정렬되어 있다는 점이다.
CMV의 바이러스 유사 입자: "CMV의 바이러스 유사 입자" 또는 CMV VLP란 용어는, CMV 폴리펩티드 적어도 하나를 포함하거나, 또는 바람직하게 CMV 폴리펩티드 적어도 하나로 본질적으로 이루어져 있거나, 바람직하게 CMV 폴리펩티드 적어도 하나로 이루어진 바이러스 유사 입자를 지칭한다. CMV의 바이러스 유사 입자는, 바람직하게 캡시드 구조의 주요 성분, 더욱더 바람직하게는 유일한 단백질 성분으로서 상기 CMV 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 CMV의 바이러스 유사 입자는 CMV의 캡시드 구조와 닮았다. CMV의 바이러스 유사 입자는 비 복제성이고/비 복제성이거나 비 감염성으로서, 적어도 CMV의 복제 기구를 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 결여되어 있고, 통상적으로는 바이러스의 숙주로의 부착 또는 도입에 관여하는 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들도 또한 결여되어 있다. 이 정의는 또한, 전술된 유전자 또는 유전자들이 여전히 존재하되, 불활성인 바이러스 유사 입자도 포함한다. CMV의 바이러스 유사 입자를 비복제성 및/또는 비 감염성으로 만드는 바람직한 방법으로서는, 물리적 또는 화학적 불활성화 방법, 예컨대 UV 조사, 포름알데히드 처리법이 있다. 바람직하게 CMV의 VLP는 CMV의 복제 기구를 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 결여되어 있을 뿐만 아니라, 바이러스의 숙주로의 부착 또는 도입에 관여하는 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 결여되어 있다. 더욱더 바람직하게 비 복제성 및/또는 비 감염성 바이러스 유사 입자는 재조합 유전자 기술에 의해 수득된다. 재조합 생산된, 본 발명에 따른 CMV의 바이러스 유사 입자는, 통상적으로, 그리고 바람직하게 바이러스 게놈을 포함하지 않는다. 1종을 초과하는 폴리펩티드를 포함하는 바이러스 유사 입자(종종 모자이크 VLP라고도 칭하여짐)도 또한 본 발명에 포함된다. 그러므로 일 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자는 적어도 2종의 상이한 폴리펩티드를 포함하는데, 여기서 상기 폴리펩티드 적어도 1종은 CMV 폴리펩티드이다. 바람직하게 CMV의 VLP는, 통상 VLP당 180개의 코트 단백질 서브유닛을 포함하는 CMV 코트 단백질로 구성된 거대분자 조립체이다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 CMV의 VLP는, (i) CMV의 코트 단백질 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어져 있거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있는데, 여기서 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다.
폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"란 용어는, 펩티드 결합(아미드 결합으로도 알려짐)에 의해 길이로 연결되어 있는 아미노산 단량체들로 구성된 중합체를 지칭한다. 이 "폴리펩티드"란 용어는, 아미노산들의 연속 사슬을 지칭하는 것이지, 특정 길이를 가지는 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 그러므로 펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다.
오이 모자이크 바이러스(CMV) 폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같은 "오이 모자이크 바이러스(CMV)"란 용어는, (i) 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 코트 단백질의 아미노산 서열, 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어진 폴리펩티드를 지칭하는데, 여기서 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열, 즉 CMV의 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 자가 조립에 의하여 발현될 때 CMV의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다.
오이 모자이크 바이러스(CMV)의 코트 단백질(CP): 본원에 사용된 바와 같은 "오이 모자이크 바이러스(CMV)의 코트 단백질(CP)"이란 용어는, 자연 발생하는 오이 모자이크 바이러스의 코트 단백질을 지칭한다. 오이 모자이크 바이러스의 극히 넓은 숙주 범위로 말미암아, 다수의 상이한 CMV 균주 및 분리주가 공지되어 있으며, 이러한 균주 및 분리주의 코트 단백질의 서열이 결정되어 있으므로, 역시 당 업자에게 공지되어 있다. 이러한 CMV의 코트 단백질(CP)의 서열은, 유전자 은행, www.dpvweb.net, 또는 www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/와 같은 공지의 데이터베이스에 업로드되어 있어서 여기에서 검색이 가능하다. 그 예들은 유럽 특허출원 제14189897.3호에 기재되어 있다. CMV 코트 단백질에 관한 추가의 예들은 서열 번호 1 내지 서열 번호 3에 제공되어 있다. 이와 같은 균주 및 분리주는 코트 단백질의 N-말단을 비롯하여 상이한 단백질 도메인에 매우 유사한 코트 단백질 서열을 가지고 있음은 주목할만하다. 구체적으로 완전히 서열결정된 모든 CMV 분리주 중 98.1%는 자체의 코트 단백질 서열의 처음 28개 아미노산과 85%를 초과하는 서열 동일성을 공유하고, 또한 완전히 서열결정된 모든 CMV 분리주 중 79.5%는 자체의 코트 단백질 서열의 처음 28개 아미노산과 90%를 초과하는 서열 동일성을 공유한다.
통상적으로, 그리고 바람직하게 본 발명에 사용되는 CMV의 코트 단백질은 자가조립에 의해 발현될 때 CMV의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용되는 CMV의 코트 단백질은 이.콜라이 내에서 자가조립에 의해 발현될 때 CMV의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다.
오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 바이러스 유사 입자(VLP): 본원에 사용된 바와 같은"오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 바이러스 유사 입자(VLP)"란 용어는, 변형된 CMV 폴리펩티드 적어도 하나를 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 본질적으로 이루어져 있거나, 바람직하게 이것으로 이루어지도록 변형된, CMV의 VLP를 지칭하는데, 여기서 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 CMV 폴리펩티드와 T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 또는 바람직하게 이것들로 이루어져 있다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 상기 T 조력자 세포 에피토프는 (i) 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 CMV 폴리펩티드의 C-말단에 융합되거나, (iii) 상기 CMV 폴리펩티드의 연속 아미노산 영역을 대체하거나[다만 이 경우 상기 CMV 폴리펩티드의 연속 아미노산의 대체된 영역과 T 조력자 세포 에피토프 간 서열 동일성은 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%임], 또는 (iv) 상기 CMV 폴리페티드의 N-말단 영역을 대체하되, 다만 이 경우 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 대체된 N-말단 영역은 5개 내지 15개의 연속 아미노산으로 이루어져 있다. 바람직하게 상기 T 조력자 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 대체된 N-말단 영역은 5개 내지 15개의 연속 아미노산, 바람직하게는 9개 내지 14개의 연속 아미노산, 더욱 바람직하게 11개 내지 13개의 연속 아미노산, 그리고 가장 바람직하게 11개, 12개 또는 13개의 연속 아미노산으로 이루어져 있다. 바람직하게 본 발명의 CMV의 상기 변형 VLP는 CMV의 재조합 변형 VLP이다.
변형 CMV 폴리펩티드: 본원에 사용된 바와 같은 "변형 CMV 폴리펩티드"란 용어는, 본원에 정의된 바와 같이 변형된 CMV 폴리펩티드를 지칭하며, 이 변형 CMV 폴리펩티드는 CMV 폴리펩티드 및 T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 또는 바람직하게 이것들로 이루어져 있다. 통상적으로 변형 CMV 폴리펩티드는 자가조립에 의해 발현될 때 CMV의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다. 바람직하게 변형 CMV 폴리펩티드는 재조합 변형 CMV 폴리펩티드로서, 이.콜라이 내에서 자가조립에 의해 발현될 때 CMV의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 있다.
CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역: 본원에 사용된 바와 같은 "CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역"이란 용어는, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단, 구체적으로 CMV 코트 단백질의 N-말단을 지칭하거나, 또는 상기 CMV 폴리펩티드, 또는 (상기 CMV 폴리펩티드 N-말단의 두 번째 아미노산으로 개시되는) CMV의 상기 코트 단백질, 또는 (만일 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 코트 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다면) CMV의 상기 코트 단백질의 N-말단 영역을 지칭한다. 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 코트 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우, 실질적 관점에서 메티오닌을 암호화하는 개시 코돈은 보통 결실될 것이고, Th 세포 에피토프의 N-말단에 부가될 것이다. 더욱 바람직하게, 1개, 2개 또는 3개의 추가 아미노산, 바람직하게 1개의 아미노산은 클로닝을 위하여, 선택적으로 개시 메티오닌과 Th 세포 에피토프 사이에 삽입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "CMV 폴리펩티드 또는 CMV 코트 단백질의 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단 영역"이란 용어는, 상기 CMV 폴리펩티드 또는 CMV의 상기 코트 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단을 지칭하거나, 또는 상기 CMV 폴리펩티드, 또는 (상기 CMV 폴리펩티드의 상기 돌연변이된 아미노산 서열 N-말단의 두 번째 아미노산으로 개시되는) CMV의 상기 코트 단백질, 또는 (만일 상기 돌연변이된 아미노산 서열이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다면) CMV의 상기 코트 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단 영역을 지칭한다. 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 코트 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우, 실질적 관점에서 메티오닌을 암호화하는 개시 코돈은 보통 결실될 것이고, Th 세포 에피토프의 N-말단에 부가될 것이다. 더욱 바람직하게, 1개, 2개 또는 3개의 추가 아미노산, 바람직하게 1개의 아미노산은 클로닝을 위하여, 선택적으로는 개시 메티오닌과 Th 세포 에피토프 사이에 삽입될 수 있다.
재조합 폴리펩티드: 본 발명의 내용 중 "재조합 폴리펩티드"란 용어는, 재조합 DNA 기술 단계 적어도 하나를 포함하는 방법에 의해 수득된 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 재조합 폴리펩티드는 원핵생물 발현계에서 생산된다. 이.콜라이와 같은 원핵생물 발현계에서 발현되어 재조합 생산된 폴리펩티드가 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있음은 당 업자에게 명백하다. 재조합 폴리펩티드의 성숙이 진행되는 동안 발현 숙주 내에서 N-말단 메티오닌 잔기는, 통상적으로 재조합 폴리펩티드로부터 잘려 나가게 된다. 그러나 N-말단 메티오닌의 절단은 불완전할 수 있다. 그러므로 제조합 폴리펩티드 제제는, 각각 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다는 점과 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 동일한, 또 다른 폴리펩티드들의 조합을 포함할 수 있다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 재조합 폴리펩티드 제제는 N-말단 메티오닌 잔기를 가지는 재조합 폴리펩티드를 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 더욱더 바람직하게는 1% 미만 포함한다.
재조합 CMV 폴리펩티드: "재조합 CMV 폴리펩티드"란 용어는, 재조합 DNA 기술 단계 적어도 하나를 포함하는 방법에 의해 수득된, 상기 정의된 바와 같은 CMV 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 재조합 CMV 폴리펩티드의 제제는 N-말단 메티오닌 잔기를 가지는 재조합 CMV 폴리펩티드를 10% 미만, 더욱 바람직하게 5% 미만, 더욱더 바람직하게 1% 미만 포함한다. 결과적으로 본 발명의 재조합 바이러스 유사 입자는, 각각 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다는 점과 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 동일한, 또 다른 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
재조합 변형 CMV 폴리펩티드: "재조합 변형 CMV 폴리펩티드"란 용어는, 재조합 DNA 기술 단계 적어도 하나를 포함하는 방법에 의해 수득된, 상기 정의된 바와 같은 변형 CMV 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 재조합 변형 CMV 폴리펩티드의 제제는 N-말단 메티오닌 잔기를 가지는 재조합 변형 CMV 폴리펩티드를 10% 미만, 더욱 바람직하게 5% 미만, 더욱더 바람직하게 1% 미만 포함한다. 결과적으로 본 발명의 재조합 바이러스 유사 입자는, 각각 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다는 점과 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 동일한, 또 다른 재조합 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
재조합 바이러스 유사 입자: 본 발명의 내용 중 "재조합 바이러스 유사 입자"란 용어는, 재조합 DNA 기술 단계 적어도 하나를 포함하는 방법에 의해 수득된 바이러스 유사 입자(VLP)를 지칭한다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 재조합 바이러스 유사 입자는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드, 바람직하게 재조합 CMV 폴리펩티드 또는 재조합 변형 CMV 폴리펩티드를 포함한다. 가장 바람직하게 재조합 바이러스 유사 입자는 재조합 CMV 폴리펩티드 또는 재조합 변형 CMV 폴리펩티드로 구성되거나 이루어져 있다. 결과적으로 만일 본 발명의 내용 중 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 특정 아미노산 서열에 대하여 본 발명의 재조합 VLP에 관한 정의가 내려진다면, 본 발명의 재조합 VLP의 범위는, 상기 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하지 않거나, 심지어는 통상 본원에 명시된 바와 같이 소량으로 포함하는 상기 특정 아미노산 서열에 의해 형성되는 VLP, 상기 N-말단 메티오닌을 포함하는 상기 특정 아미노산 서열에 의해 형성되는 VLP를 포함한다. 더욱이 만일 본 발명의 재조합 VLP에 관한 정의가 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 특정의 아미노산 서열에 대하여 내려진다면, 상기 N-말단 메티오닌 잔기를 여전히 포함하는 아미노산 서열과, N-말단 메티오닌 잔기가 결실된 아미노산 서열 둘 다를 포함하는 VLP는 본 발명의 범위 내에 속한다.
돌연변이된 아미노산 서열: "돌연변이된 아미노산 서열"이란 용어는, 한정된 돌연변이 세트를 돌연변이될 아미노산 서열에 도입함으로써 수득되는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 내용 중, 상기 돌연변이될 아미노산 서열은, 통상적으로, 그리고 바람직하게 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열이다. 그러므로 돌연변이된 아미노산 서열은 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 차이가 나 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열과 상이하고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 90%의 서열 동일성을 보인다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보인다. 바람직하게 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 서열은 많아야 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기만큼 차이가 나 상이하고, 더욱 바람직하게 상기 차이는 아미노산의 삽입, 결실 및 치환으로부터 선택된 것에 의한다. 바람직하게 돌연변이된 아미노산 서열은, 적어도 하나의 아미노산만큼 차이가 나 CMV 코트 단백질 아미노산 서열과 상이하고, 바람직하게 상기 차이는 아미노산 치환에 의한다.
~번 잔기에 상응하는 위치: 다른 아미노산 서열의 소정 잔기들에 상응하는 아미노산 서열상의 위치는, 통상적으로, 그리고 바람직하게 BLASTP 알고리즘을 이용하는 서열 정렬, 가장 바람직하게 표준 환경을 적용하는 서열 정렬에 의해 동정될 수 있다. 통상적이고 바람직한 표준 환경은 다음과 같다: 예상 역치값: 10; 문자 크기: 3; 질의 범위 내 최대 매칭값: 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 실존 11, 연장 1; 조성 조정: 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정.
서열 동일성: 2개의 소정 아미노산 서열들의 서열 동일성은 두 서열의 정렬을 기반으로 결정된다. 서열 동일성 측정을 위한 알고리즘은 당 업자가 입수 가능하다. 바람직하게 아미노산 서열 2개의 서열 동일성은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 상동성 프로그램, 예컨대 "BLAST"프로그램(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 또는"CLUSTALW" (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)를 이용하여 측정되는데, 본원에서는 바람직하게 NCBI 홈페이지(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 제공된 "BLAST" 프로그램에 의해 이에 제공된 디폴트 환경을 적용하여 측정된다. 통상적이고 바람직한 표준 환경은 다음과 같다: 예상 역치값: 10; 문자 크기: 3; 질의 범위 내 최대 매칭값: 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 실존 11, 연장 1; 조성 조정: 조건부 조성 스코어 매트릭스 조정.
아미노산 치환: 아미노산 치환이란 용어는, 한 아미노산 서열 내 소정의 아미노산 잔기의, 화학 구조가 상이한 임의의 다른 아미노산 잔기, 바람직하게 다른 단백질성 아미노산 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 그러므로 아미노산의 삽입 또는 결실과는 대조적으로, 아미노산 치환에서는 상기 아미노산 서열의 아미노산의 총 개수가 바뀌지 않는다. 본 발명의 내용에 있어서, 돌연변이될 상기 아미노산 서열의 아미노산 잔기의, 리신 잔기 또는 시스테인 잔기로의 치환이 매우 바람직하다.
에피토프: 에피토프란 용어는, 항원, 바람직하게 폴리펩티드의 연속 부분 또는 불연속 부분을 지칭하는데, 상기 부분들은 MHC 분자의 환경 내에서 항체나 T 세포 수용체와 특이적으로 결합할 수 있다. 항체와 관련하여, 특이적 결합은 비특이적 결합을 배제하지만, 반드시 교차 반응성을 배제하는 것은 아니다. 에피토프는, 통상 항원성 부위에 유일무이한 공간적 형태에 5개 내지 20개의 아미노산을 포함한다.
T 조력자(Th) 세포 에피토프: 본원에 사용된 바와 같은"T 조력자(Th) 세포 에피토프"란 용어는, 조력자 Th 세포에 의해 인지될 수 있는 에피토프를 지칭한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 보편적 T 조력자 세포 에피토프이다.
보편적 Th 세포 에피토프: 본원에 사용된 바와 같은 "보편적 Th 세포 에피토프"란 용어는, 적어도 하나, 바람직하게는 하나를 초과하는 제II군 MHC 분자에 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 지칭한다. 펩티드 서열이 보편적 Th 세포 에피토프의 것인지 여부를 확인하기 위한 가장 간단한 방법은, 펩티드가 개별 제II군 MHC 분자에 결합하는 능력을 측정하는 것이다. 이는, 펩티드가 공지의 Th 세포 에피토프 펩티드와 제II군 MHC 분자에 대해 경쟁하는 능력으로써 측정될 수 있다. HLA-DR 분자들의 대표적인 선택 방법은, 예컨대 문헌[Alexander J, et al., Immunity (1994) 1:751-761]에 기술되어 있다. 제II군 MHC 분자에 대한 Th 세포 에피토프의 친화성은 적어도 10-5 M이어야 한다. Th 세포 에피토프의 "보편성"을 확인하기 위한 방법으로서 대안적이면서 더욱 까다롭되, 더욱 관련성이 많은 방법은, 더 많은 비율(30% 초과)의 사람들이 면역화된 후 이로부터 1개월 후에 1FA 중에 제제화된 Th 세포 에피토프 함유 단백질로 면역 증강될 때, 측정 가능한 T 세포 반응을 보이는지를 입증하는 것이다. 상이한 개체에 존재하는 제II군 MHC 분자의 대표적인 수집 방법은 문헌[Panina-Bordignon P, et al., Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242]에 제공되어 있다. 결과적으로, 본원에 사용된 바와 같은 "보편적 Th 세포 에피토프"라는 용어는, 바람직하게 문헌[Panina-Bordignon P, et al., Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242]에 기술된 바와 같이, 면역화 및 (이로부터 1개월 후 1FA 중에 제제화된 Th 세포 에피토프 함유 단백질로) 면역 증강될 때, 선택된 군을 이루는 개체들 중 30%를 초과하는 개체에서 측정 가능한 T 세포 반응을 보이는 T 세포 에피토프를 지칭한다. 더욱이, 그리고 더욱 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 "보편적 Th 세포 에피토프"라는 용어는, DR1, DR2w2b, DR3, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DR52a, DRw53, DR2w2a로부터 선택되는 DR 대립형질; 바람직하게는 DR1, DR2w2b, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DRw53, DR2w2a로부터 선택되는 DR 대립형질 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개와, (문헌(Alexander J, et al., Immunity (1994) 1:751-761)과 본원에 인용된 참고문헌들에 기술된 바와 같이) 적어도 500 nM의 친화도로 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 지칭하는데; 상기 친화도를 평가하기 위한 결합 검정법으로서 바람직한 것은, 문헌[Sette A, et al., J Immunol (1989) 142:35-40]에 기술되어 있다. 심지어 더욱더 바람직한 방식으로, 본원에 사용된 바와 같은 "보편적 Th 세포 에피토프"라는 용어는, DR1, DR2w2b, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DRw53, DR2w2a로부터 선택되는 DR 대립형질 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개와, (문헌(Alexander J, et al., Immunity (1994) 1:751-761)과 본원에 인용된 참고문헌들에 기술된 바와 같이) 적어도 500 nM의 친화도로 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 지칭하는데; 상기 친화도를 평가하기 위한 결합 검정법으로서 바람직한 것은, 문헌[Sette A, et al., J Immunol (1989) 142:35-40]에 기술되어 있다.
보편적 Th 세포 에피토프는, 예컨대 문헌들(Alexander J, et al., Immunity (1994) 1:751-761, Panina-Bordignon P, et al., Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242, Calvo-Calle JM, et al., J Immunol (1997) 159:1362-1373, 및 Valmori D, et al., J Immunol (1992) 149:717-721)에 기술되어 있으며, 당 업자에게 공지되어 있다.
보조제: 본원에 사용된 바와 같은 "보조제"란 용어는, 면역 반응의 비특이적 자극제 또는 본 발명의 백신 및 약학 조성물 각각과 합하여질 때 더욱더 증강된 면역 반응을 제공할 수 있는, 숙주 내 데포(depot)의 생성을 허용하는 물질을 지칭한다. 바람직한 보조제로서는, 완전 및 불완전 프룬트(Freund) 보조제, 알루미늄 함유 보조제, 바람직하게 수산화알루미늄, 그리고 변형 뮤라밀디펩티드가 있다. 추가의 바람직한 보조제로서는 무기 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성물질, 예컨대 리소 레시틴, 플루론 폴리올, 다 음이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀전, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 인간 보조제, 예컨대 BCG(바실레 칼메트 게랑; Bacille Calmette Guerin) 및 코린박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)이 있다. 이와 같은 보조제는 또한 당 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 추가의 보조제로서는 모노포스포릴 지질 면역조절제, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, 알루미늄 염(Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294, 그리고 바이러좀 보조제 기술(Virosomal adjuvant technology)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보조제는 또한 이러한 물질들의 혼합물을 포함할 수도 있다. 바이러스 유사 입자는, 일반적으로 보조제로서 기재되어 왔다. 그러나 본 출원의 내용 중에 사용된 바와 같은 "보조제"라는 용어는, 본 발명의 바이러스 유사 입자가 아닌 보조제를 지칭한다. 오히려 "보조제"는 본 발명의 조성물, 백신 또는 약학 조성물의 추가 변별적 성분과 관련되어 있다.
유효량: 본원에 사용된 바와 같은 "유효량"이란 용어는, 원하는 생물 효과를 실현시키는 데에 필요하거나 이에 충분한 양을 지칭한다. 조성물, 또는 대안적으로 약학 조성물의 유효량은 이처럼 선택된 결과를 달성하는 양일 것이고, 이러한 양은 당 업자에게 통상적인 바와 같이 결정될 수 있었다. 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 "유효량"이란 용어는, cIL-31의 수준의, 개에 있어서 가려움증의 감소를 유도하고 CAD를 개선하는 수준으로의 감소를 실현하는데 필요하거나 충분한 양을 지칭한다. 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 "유효량"이란 용어는, 염증 부위에서 cIL-31 활성의 중화를 실현하는데 필요하거나 이에 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 투여되는 특정의 조성물과 대상체의 크기에 따라서 달라질 수 있다. 당 업자는 과도한 실험을 필요로 하지 않고 본 발명의 특정 조성물의 유효량을 실험에 의해 결정할 수 있다.
치료: 본원에 사용된 바와 같이, "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는 것"이란 용어는 예방법 및/또는 치료법을 지칭한다. 일 구현예에서, "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는 것"이란 용어는 치료적 치료를 지칭한다. 다른 구현예에서, "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는 것"이란 용어는 예방적 치료를 지칭한다.
제1 부착 부위: 본원에 사용된 바와 같이 "제1 부착 부위"란 어구는, 바이러스 유사 입자와 함께 자연 발생하거나, 또는 바이러스 유사 입자에 인위적으로 부가되어, 제2 부착 부위와 연결될 수 있는 요소를 지칭한다. 제1 부착 부위는, 바람직하게 단백질, 폴리펩티드, 아미노산, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 중합체, 2차 대사산물 또는 화합물(바이오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드) 또는 화학 반응성 기, 예컨대 아미노기, 카복실기, 설프히드릴기, 하이드록실기, 구아니디닐기, 히스티디닐기 또는 이것들의 조합이다. 제1 부착 부위인 화학 반응성 기의 바람직한 구현예는, 아미노산 잔기, 바람직하게 리신 잔기의 아미노기이다. 제1 부착 부위는, 통상적으로 표면, 바람직하게는 VLP의 외 표면상에 위치한다. 다수의 제1 부착 부위들은 표면, 바람직하게는 VLP의 외 표면상에, 통상적으로는 반복적 입체배열로 존재한다. 바람직한 구현예에서, 제1 부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합, 바람직하게는 적어도 하나의 펩티드 결합을 통하여 VLP와 결합되어 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 제1 부착 부위는 VLP와 함께 자연 발생된다. 대안적으로 바람직한 구현예에서, 제1 부착 부위는 VLP에 인위적으로 부가된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제1 부착 부위는 상기 VLP 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 리신 잔기의 아미노기이다.
제2 부착 부위: 본원에 사용된 바와 같이 "제2 부착 부위"란 어구는, cIL-31 항원과 함께 자연 발생하거나, 또는 cIL-31 항원에 인위적으로 부가되어, 제1 부착 부위와 연결될 수 있는 요소를 지칭한다. cIL-31 항원의 제2 부착 부위는, 바람직하게 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 중합체, 2차 대사산물 또는 화합물(바이오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드) 또는 화학 반응성 기, 예컨대 아미노기, 카복실기, 설프히드릴기, 하이드록실기, 구아니디닐기, 히스티디닐기 또는 이것들의 조합이다. 제2 부착 부위인 화학 반응성 기의 바람직한 구현예는, 설프히드릴기, 바람직하게 아미노산 시스테인의 설프히드릴기, 가장 바람직하게 시스테인 잔기의 설프히드릴기이다. 그러므로 "적어도 하나의 제2 부착 부위를 가지는 항원"또는 "적어도 하나의 제2 부착 부위를 가지는 cIL-31 항원"이란 용어는, 적어도 하나의 제2 부착 부위와 cIL-31 항원을 포함하는 구조체를 지칭한다. 그러나, 구체적으로 cIL-31 항원 내에 자연 발생되지 않는 제2 부착 부위에 있어서, 이러한 구조체는, 통상적으로, 그리고 바람직하게 "링커"를 추가로 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제2 부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합, 바람직하게는 적어도 하나의 펩티드 결합을 통해 cIL-31 항원과 결합된다. 추가의 구현예에서, 제2 부착 부위는 cIL-31 항원 내에 자연 발생한다. 또 다른 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 제2 부착 부위는 링커를 통해 cIL-31 항원에 인위적으로 부가되는데, 이 경우 상기 링커는 시스테인을 포함하거나, 또는 대안적으로 시스테인으로 이루어져 있다. 바람직하게 링커는 펩티드 결합에 의해 cIL-31 항원에 융합되거나, 또는 화학 결합에 의해 부가된다.
~에 연결된: 본원에 사용된 바와 같이 "~에 연결된" 또는 "연결"이란 용어는, 적어도 하나의 제1 부착 부위와 적어도 하나의 제2 부착 부위가 서로 연결되는 모든 가능한 방법, 바람직하게는 화학 상호작용을 지칭한다. 화학 상호작용은 공유 상호작용 및 비 공유 상호작용을 포함한다. 비 공유 상호작용에 대한 통상의 예로서는, 이온 상호작용, 소수성 상호작용 또는 수소 결합이 있는 한편, 공유 상호작용은, 예를 들어 공유 결합, 예컨대 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 탄소-인 결합, 탄소-황 결합, 예컨대 티오에테르, 또는 이미드 결합을 기반으로 한다. 임의의 바람직한 구현예들에서, 제1 부착 부위와 제2 부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합, 바람직하게 적어도 하나의 비펩티드성 결합, 그리고 더욱 바람직하게는 오로지 비펩티드성 결합(들)을 통해 결합된다. 그러나 본원에 사용된 바와 같은 "연결된"이란 용어는, 적어도 하나의 제1 부착 부위와 적어도 하나의 제2 부착 부위의 직접적인 연결뿐만 아니라, 대안적으로, 그리고 바람직하게는 적어도 하나의 제1 부착 부위와 적어도 하나의 제2 부착 부위의, 중간 분자(들)를 통한 간접적 연결, 본원에서는 통상적으로, 그리고 바람직하게 적어도 하나, 바람직하게는 하나의 이종 이작용성 가교 링커를 이용함에 의한 간접적 연결을 지칭하는 것이기도 할 것이다. 또 다른 바람직한 구현예들에서, 제1 부착 부위와 제2 부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합, 바람직하게 적어도 하나의 펩티드 결합, 그리고 더욱 바람직하게는 오로지 펩티드 결합(들)을 통해 연결된다.
링커: 본원에 사용된 바와 같은 "링커"는, cIL-31 항원과 제2 부착 부위를 결합시키거나, 이 제2 결합 부위를 이미 포함하고 있거나, 이 제2 결합부위로 본질적으로 이루어져 있거나 또는 이루어져 있다. 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 "링커"는 제2 부착 부위를, 통상적으로, 그리고 바람직하게 하나의 아미노산 잔기, 바람직하게 시스테인 잔기로서 이미 포함하고 있다(그러나 반드시 그러한 것은 아니다). 바람직한 링커는 아미노산 링커, 즉 적어도 하나의 아미노산 잔기를 함유하는 링커이다. 아미노산 링커란 용어는 이러한 링커가 오로지 아미노산 잔기들로만 이루어져 있음을 암시하는 것은 아니다. 그러나, 오로지 아미노산 잔기들로만 이루어져 있는 링커는 본 발명의 바람직한 구현예이다. 링커의 아미노산 잔기들은, 바람직하게 당 분야에 공지된 자연 발생 아미노산 또는 비 자연 발생 아미노산(모든 L-형 또는 모든 D-형) 또는 이것들의 조합으로 이루어져 있다. 본 발명에 따른 링커의 바람직한 추가 구현예는 설프히드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함하는 분자이므로, 이러한 분자도 또한 본 발명에 포함된다. 링커와 cIL-31 항원의 결합은, 바람직하게 적어도 하나의 공유 결합, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 펩티드 결합에 의한다.
질서정연한 반복적 항원 어레이: 본원에 사용된 바와 같은 "질서정연한 반복적 항원 어레이"란 용어는, 통상적으로, 그리고 바람직하게 코어 입자와 VLP 각각에 대해 항원의 공간 정렬상 균일성이 매우 큰 것을 특징으로 하는, cIL-31 항원의 반복적인 패턴을 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 반복되는 패턴은 기하학적 패턴일 수 있다. 더욱이 질서정연한 반복적 항원 어레이로서 바람직한 것은, 바람직하게 1 내지 30 나노미터, 바람직하게 2 내지 15 나노미터, 더욱 바람직하게 2 내지 10 나노미터, 더욱더 바람직하게 2 내지 8 나노미터, 그리고 추가로 더욱 바람직하게 1.6 내지 7 나노미터의 간격으로, cIL-31 항원의 엄격하게 반복적인 파라-결정질 질서를 갖는다.
면역자극성 물질: 본원에 사용된 바와 같은 "면역자극성 물질"이란 용어는 면역 반응을 유도 및/또는 증강시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 면역억제물질로서는 toll 유사 수용체 활성화 물질 및 시토카인 분비를 유도하는 물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. toll 유사 수용체 활성화 물질로서는 면역자극성 핵산, 펩티도글리칸, 리포다당체, 리포테이코산, 이미다조퀴놀린 화합물, 플라젤린, 리포단백 및 면역자극성 유기 물질, 예컨대 탁솔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
면역자극성 핵산(ISS-NA): 본원에 사용된 바와 같은 면역자극성 핵산이란 용어는, 면역 반응을 유도 및/또는 증강시킬 수 있는 핵산을 지칭한다. 면역억제 핵산은 리보핵산 및, 구체적으로 데속시리보핵산을 포함하는데, 이 경우 리보핵산과 데속시리보핵산 둘 다는 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다. 바람직한 ISS-NA는 디속시리보핵산인데, 이 경우 추가로 바람직하게 상기 데속시리보핵산은 단일 가닥이다. 바람직하게 면역자극성 핵산은, 메틸화되지 않은 C를 포함하는 CpG 모티프 적어도 하나를 함유한다. 매우 바람직한 면역자극성 핵산은 CpG 모티프 적어도 하나를 함유하는데, 이 경우 상기 CpG 모티프 적어도 하나는 적어도 하나, 바람직하게 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있되, 이 경우 C는 메틸화되지 않은 것이다. 바람직하게 상기 CG 디뉴클레오티드는 회문구조 서열의 일부이지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 면역자극성 핵산이라는 용어는 또한 변형 염기, 바람직하게 4-브로모-시토신을 함유하는 핵산을 지칭한다. 본 발명의 내용 중 특히 바람직한 것은, 수지상 세포 내 IFN-알파 생성을 자극할 수 있는 ISS-NA이다. 본 발명의 목적에 유용한 면역자극성 핵산은, 예컨대 WO 2007/068747 A1에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드: 본원에 시용된 바와 같은 "올리고뉴클레오티드"란 용어는, 2개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 약 6개 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 20개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 20개 내지 40개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 매우 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 약 30개의 뉴클레오티드를 포함하고, 더욱 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 정확히 30개의 뉴클레오티드를 포함하며, 가장 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 정확히 30개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 올리고뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드이고, 바람직하게는 (a) 비변형 RNA 또는 DNA와, (b) 변형 RNA 또는 DNA로부터 선택된다. 변형은 주쇄 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 바람직하게 (a) 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, (b) 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 조합인 DNA, (c) 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, (d) 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역의 조합인 RNA, 그리고 (e) 단일 가닥이거나, 또는 더욱 바람직하게 이중 가닥이거나, 또는 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역들의 조합인 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로부터 선택된다. 바람직한 뉴클레오티드 변형/유사체는 (a) 펩티드 핵산, (b) 이노신, (c) 트리틸화된 염기, (d) 포스포로티오에이트, (e) 알킬포스포로티오에이트, (f) 5-니트로인돌 데속시리보플리라노실, (g) 5-메틸데속시시토신, 그리고 (h) 5,6-디하이드로-5,6-디하이드록시데속시티미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 포스포티오에이트화된 뉴클레오티드는 세포나 유기체 내 분해로부터 보호되므로, 바람직한 뉴클레오티드 변형이다. 오로지 포스포디에스테르 결합된 뉴클레오티드들로만 이루어진 비변형 올리고뉴클레오티드는, 통상 변형 뉴클레오티드보다 더욱 활성이 크므로, 일반적으로 본 발명의 상황에 바람직하다. 오로지 포스포디에스테르 결합 데옥시뉴클레오티드만으로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 가장 바람직하고, 추가로 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 세포, 바람직하게 수지상 세포 내에서 IFN-알파 생성을 자극할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 추가로 바람직하다. 세포 내에서 IFN-알파 생성을 자극할 수 있는, 매우 바람직한 올리고뉴클레오티드는 A형 CpG 및 C형 CpG로부터 선택된다. 캡(Cap)을 가지지 않는 RNA 분자가 추가로 바람직하다.
CpG 모티프: 본원에 사용된 바와 같이, "CpG 모티프"란 용어는, 메틸화되지 않은 중앙 CpG, 즉 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 패턴을 지칭하되, 다만 여기서 C는 메틸화되지 않은 것이고, 적어도 하나의 염기, 바람직하게는 중앙 CpG와 (이 중앙 CpG의 3'측과 5'측으로) 측접하는 뉴클레오티드 1개 또는 2개에 의해 둘러싸여 있다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 본원에 사용된 바와 같은 CpG 모티프는 자체의 5'말단과 3'말단에 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드와 2개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 대안적으로 이것들로 이루어져 있다. 이론에 국한되기 바라지 않을 때, CpG에 측접하고 있는 염기들은 활성의 유의미한 일부를 CpG 올리고뉴클레오티드에 공여한다.
메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바와 같이, "메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드" 또는 "CpG"란 용어는, 적어도 하나의 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 올리고데속시뉴클레오티드를 지칭한다. 그러므로 CpG는 메틸화되지 않은 시토신, 구아닌 디뉴클레오티드 적어도 하나를 함유한다. 바람직한 CpG는 척추동물 골수 유래 세포를 자극/활성화(예컨대 유사분열촉진 효과를 발휘)하거나, 또는 이러한 척추동물 골수 유래 세포에 의한 시토카인의 발현을 유도 또는 증가시킨다. 예를 들어 CpG는 B 세포, NK 세포 및 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포를 활성화하는데 유용할 수 있다. 바람직하게 CpG는 메틸화되지 않은 시토신 → 구아노신의(5' → 3') 순서로 이것들을 함유하는 올리고데속시뉴클레오티드, 바람직하게는 단일 가닥 올리고데속시뉴클레오티드와 관련되어 있는데, 이 경우 상기 메틸화되지 않은 시토신과 상기 구아노신은 포스페이트 결합에 의해 연결되며, 바람직하게 상기 포스페이트 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포티오에이트 결합이고, 추가로 바람직하게 상기 포스페이트 결합은 포스포디에스테르 결합이다. CpG는 포스포로티오에스테르 결합을 함유하는 유사체와 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 일반적으로 이중 가닥 분자는 생체 내에서 더욱 안정적인 반면에, 단일 가닥 분자는 증가한 면역 활성을 보인다. 바람직하게 본원에 사용된 바와 같이, CpG는 길이가 적어도 약 10개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드로서, 적어도 하나의 CpG 모티프를 포함하고, 추가로 바람직하게 상기 CpG의 길이는 10개 내지 60개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 15개 내지 50개 뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게 20개 내지 40개 뉴클레오티드, 더욱더 바람직하게 약 30개 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 정확히 30개 뉴클레오티드이다. CpG는 메틸화되었고/메틸화되었거나 메틸화되지 않은 뉴클레오티드로 이루어져 있을 수 있고, 상기 적어도 하나의 CpG 모티프는 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하되, 다만 C는 메틸화되어 있지 않다. CpG는 또한 메틸화된 서열 확장부와 메틸화되지 않은 서열 확장부를 포함할 수도 있는데, 상기 적어도 하나의 CpG 모티프는 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하되, 다만 C는 메틸화되어 있지 않다. 매우 바람직하게 CpG는 메틸화되지 않은 시토신 → 구아노신의(5' → 3') 순서로 이것들을 함유하는 단일 가닥 올리고데속시뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 메틸화되지 않은 시토신과 상기 구아노신은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 있다. CpG는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에스테르 결합을 함유하는 유사체를 포함할 수 있고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 일반적으로 포스포디에스테르 CpG는 이하에 명시된 바와 같이 A형 CpG인 한편, 포스포티오에스테르 안정화 CpG는 B형 CpG이다. 본 발명의 내용에 있어서 바람직한 CpG 올리고뉴클레오티드는 A형 CpG이다.
A형 CpG: 본원에 사용된 바와 같이 "A형 CpG" 또는 "D형 CpG"란 용어는, CpG 모티프 적어도 하나를 포함하는 올리고데속시뉴클레오티드(ODN)를 지칭한다. A형 CpG는 T 세포의 활성화와, 수지상 세포의 성숙을 우선적으로 자극하고, IFN-알파의 생성을 자극할 수 있다. A형 CpG에 있어서, 적어도 하나의 CpG 모티프의 뉴클레오티드들은 적어도 하나의 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 있다. A형 CpG는, 자체의 5'말단 및/또는 바람직하게 자체의 3'말단에서 포스포로티오에이트 결합 뉴클레오티드들과 측접할 수 있는 포스포디에스테르 결합 CpG 모티프 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게 CpG 모티프와, 본원에서 바람직하게 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 CG 디뉴클레오티드 및 이에 바로 측접하는 영역들은 포스포디에스테르 뉴클레오티드로 구성된다. 바람직한 A형 CpG는 오로지 포스포디에스테르(PO) 결합 뉴클레오티드들만으로 이루어져 있다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 폴리G 모티프는 적어도 하나, 바람직하게 적어도 3개, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 G(구아노신), 가장 바람직하게는 적어도 10개의 G를 포함하거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다. 바람직하게 본 발명의 A형 CpG는 회문구조 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다.
팩키징된(Packaged): 본원에 사용된 바와 같은 "팩키징된"이란 용어는, 코어 입자와 VLP 각각에 대한 다 음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질들의 상태를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "팩키징된"이란 용어는, 예를 들어 화학 커플링에 의한 공유 결합, 또는, 예를 들어 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합과 같은 비 공유 결합일 수 있는 결합을 포함한다. 이 용어는 또한 다 음이온성 거대분자가 둘러싸인 상태 또는 부분적으로 둘러싸인 상태를 포함하기도 한다. 그러므로 다 음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질은 실제 결합, 구체적으로 공유 결합이 존재하지 않을 때에도 VLP에 의해 둘러싸일 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 적어도 하나의 다 음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질은 VLP 내부에, 가장 바람직하게는 비 공유 방식으로 팩키징된다. 상기 면역자극성 물질이 핵산, 바람직하게 DNA인 경우, "팩키징된"이란 용어는, 상기 핵산이 뉴클레아제에 의한 가수분해에 노출될 수 없음, 바람직하게 DNase 가수분해(예컨대 DNaseI 또는 벤조나아제)에 노출될 수 없음을 암시하고, 이 경우 바람직하게 상기 노출가능성은 WO 2003/024481A2의 실시예 11 ~ 17에 기재되어 있는 바와 같이 검정된다.
그러므로 제1 양태에서, 본 발명은 개과 동물, 바람직하게 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 이 경우 상기 조성물 유효량만큼이 상기 개과 동물, 바람직하게 상기 반려견에 투여되고, 상기 조성물은 (a) 제1 부착 부위 적어도 하나를 가지는 코어 입자와; (b) 제2 부착 부위 적어도 하나를 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하되, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 코어 입자는 바이러스 유사 입자(VLP), 바람직하게 재조합 VLP이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP인데, 상기 CMV의 변형 VLP는 적어도 하나의 변형 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어져 있거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있고, 상기 변형 CMV 폴리페티드는 (a) CMV 폴리펩티드와, (b) T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV의 코트 단백질 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어져 있되, 다만 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열이고, CMV의 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 돌일성을 보인다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어짐], 또는 (b) 적어도 90%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있고; 본 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함하거나; 또는 본 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열 영역을 포함하되, 다만 상기 아미노산 서열 영역은 적어도 90%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 가진다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP로서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25 내지 서열 번호 30으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25 또는 (e) 서열 번호 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응으로부터 유래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물 유효량만큼이 상기 반려견에 투여되고, 상기 조성물은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 코어 입자[다만 상기 코어 입자는, 바람직하게 바이러스 유사 입자(VLP), 추가로 바람직하게 재조합 VLP임]와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하되, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 바이러스 유사 입자(VLP)는 식물 바이러스로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 재조합 VLP이고, 바람직하게 상기 재조합 VLP는 식물 바이러스로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 VLP이다.
바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 적어도 하나의 변형 VLP 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어져 있거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있고, 상기 변형 VLP 폴리페티드는 (a) VLP 폴리펩티드와, (b) T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; 상기 VLP 폴리펩티드는 (i) 바이러스의 코트 단백질 아미노산 서열, 바람직하게 식물 바이러스의 코트 단백질 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있되, 다만 돌연변이될 아미노산 서열은 바이러스의 상기 코트 단백질의 아미노산 서열이고, 바이러스의 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다.
바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP로서, CMV의 상기 변형 VLP는 적어도 하나의 변형 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어져 있거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있되, 다만 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 폴리펩티드와, (b) T 조력자 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV의 코트 단백질 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있되, 다만 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열이고, CMV의 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 코트 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있는데, 돌연변이될 아미노산 서열은 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열이고, CMV의 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 코트 단백질은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 보인다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은, 적어도 하나, 그리고 많아야 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 아미노산 잔기만큼 차이가 나고, 바람직하게 이러한 차이는 (i) 삽입, (ii) 결실, (iii) 아미노산 치환, 그리고 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로부터 선택된 것에 의한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i)(a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있음] 또는 (b) 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열[다만 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 본 청구항의 (i)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 95%, 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 보임]을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있음], 또는 (b) 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i)(a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함함] 또는 (b) 아미노산 서열 영역을 포함하는 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 상기 아미노산 서열 영역은 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 가딤]; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열[다만 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 본 청구항의 (i)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 95%, 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 보임]을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함함], 또는 (b) 아미노산 서열 영역을 포함하는 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 사기 아미노산 서열 영역은 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 가짐]을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i)(a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있음] 또는 (b) 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열[다만, 이 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함하거나; 또는 이 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열 영역을 포함하되, 다만 상기 아미노산 서열 영역은 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 98%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 99%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 가짐]; 또는 (ii) 돌연변이된 아미노산 서열[다만 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 본 청구항의 (i)에 정의된 바와 같은 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 상기 돌연변이될 아미노산 서열은 적어도 98%, 그리고 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 보임]을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (a) CMV 코트 단백질의 아미노산 서열[다만 이 아미노산 서열은 서열 번호 1을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있음], 또는 (b) 적어도 90%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열[다만 이 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함하거나; 또는 이 청구항에서 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열 영역을 포함하되, 다만 이 아미노산 서열 영역은 적어도 90%의, 서열 번호 23과의 서열 동일성을 가짐]을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 대체된 N-말단 영역의 아미노산 수는, 상기 T 조력자 세포 에피토프를 이루는 아미노산의 수와 동일하거나 이보다 적다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하는데, 이 경우 대체된 상기 N-말단 영역의 아미노산 수는, 상기 T 조력자 세포 에피토프를 이루는 아미노산의 수와 동일하거나 이보다 적다. 통상적으로, 그리고 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 대체된 N-말단 영역은 5개 내지 15개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 9개 내지 14개의 연속적 아미노산, 더욱 바람직하게는 11개 내지 13개의 연속적 아미노산으로 이루어져 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열 번호 1의 2번 내지 12번 아미노산에 상응한다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 보편적 T 조력자 세포 에피토프이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 많아야 20개의 아미노산으로 이루어져 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 PADRE 서열이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 PADRE 서열이고, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 인간 백신으로부터 유래한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래하고, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 PADRE 서열로서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있거나; 또는 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래하며, 상기 Th 세포 에피토프는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV 코트 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 바람직하게 이것으로 이루어져 있되, 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1, 또는 적어도 95%의, 서열 번호 1과의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있으며; 상기 아미노산 서열은 서열 번호 23을 포함하고, 상기 T 조력자 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하며, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 대체된 N-말단 영역은 11개 내지 13개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 11개의 연속적 아미노산 영역으로 이루어져 있고, 추가로 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열 번호 1의 2번 내지 12번 아미노산에 상응한다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 청구항 6 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 조성물의 용도에 있어서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 제1 부착 부위와 상기 제2 부착 부위는 적어도 하나의 공유 비펩티드성 결합을 통해 연결되어 있다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제1 부착 부위는 아미노기, 바람직하게 리신의 아미노기를 포함하거나, 또는 바람직하게 이것이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기, 바람직하게 시스테인의 설프히드릴기를 포함하거나, 또는 바람직하게 이것이다.
매우 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 제1 부착 부위는 아미노기, 바람직하게는 리신 잔기의 아미노기이고, 적어도 하나의 제2 부착 부위는 설프히드릴기, 바람직하게 시스테인 잔기의 설프히드릴기이거나, 또는 cIL-31 항원에 화학적으로 부착된 설프히드릴기이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위들 중 오로지 하나만이 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합을 통해 상기 제1 부착 부위와 결합하게 되고, 이로써 상기 cIL-31 항원과 상기 변형 바이러스 유사 입자의 균일형 결합 하나가 형성되며, 상기 제1 부착 부위와 결합하는 상기 제2 부착 부위 오로지 하나만이 설프히드릴기이고, 상기 cIL-31 항원과 상기 변형 바이러스 유사 입자는 상기 결합을 통해 상호작용을 하는 결과, 질서정연하고 반복적인 항원 어레이, 즉 질서정연하고 반복적인 cIL-31 항원 어레이가 형성된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, cIL-31 항원은 화학적 가교를 통해, 통상적이고 바람직하게는 이종 이작용성 가교 링커를 사용하여 변형 VLP에 연결된다. 바람직한 구현예들에서, 이종 이작용성 가교 링커는, 변형 VLP의 바람직한 제1 부착 부위, 바람직하게 아미노기, 더욱 바람직하게 리신 잔기(들)의 아미노기와 반응할 수 있는 작용기, 그리고 cIL-31 항원의 바람직한 제2 부착 부위와 반응할 수 있는 추가의 작용기, 즉 바람직하게 cIL-31 항원 고유의 것이거나 이에 인위적으로 부가되고, 선택적으로는 환원에 의한 반응에 이용 가능하게 된 시스테인(들) 잔기의 설프히드릴기와 반응할 수 있는 추가의 작용기를 함유한다. 몇몇 이종 이작용성 가교 링커는 당 분야에 공지되어 있다. 그 예로서는 바람직한 가교 링커 SMPH(Pierce), 설포-MBS, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-SIAB, 설포-SMPB, 설포-SMCC, 설포-KMUS SVSB, SIA, 그리고, 예컨대 Pierce Chemical Company로부터 입수 가능한 기타 가교 링커를 포함하며, 이것들은 아미노기에 반응성인 작용기 하나와, 설프히드릴기에 반응성인 작용기 하나를 갖는다. 상기 언급된 가교 링커 모두는 아미노기와의 반응 후 아미드 결합의 형성을 유도하고, 설프히드릴기와의 티오에테르 결합의 형성을 유도한다. 본 발명의 실시에 적합한 또 다른 가교 링커 군은, 커플링시 cIL-31 항원과 변형 VLP 사이에 이황화 결합을 도입시키는 것을 특징으로 한다. 이 군에 속하는 가교 링커로서, 바람직한 것으로는, 예를 들어 SPDP 및 설포-LC-SPDP(Pierce)를 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 이종 이작용성 가교 링커는 SMPH이다.
전술된 바람직한 방법에 따라 이종 이작용성 가교 링커를 사용하여 cIL-31 항원을 변형 VLP에 연결시키는 것은, cIL-31 항원과 변형 VLP의 배향된 형태로의 커플링을 허용한다. cIL-31 항원을 변형 VLP에 연결시키는 또 다른 방법으로서는, 카보디이미드 EDC 및 NHS를 사용하여 cIL-31 항원을 변형 VLP에 가교시키는 방법을 포함한다. cIL-31 항원은 또한, 예를 들어 SATA, SATP 또는 이미노티올란과의 반응을 통하여 먼저 티올화될 수도 있다. 이후, 필요하다면 탈보호 후 cIL-31 항원은 하기와 같이 변형 VLP에 커플링될 수 있다. 과량의 티올화 시약이 분리된 후, cIL-31 항원은 시스테인 반응성 기를 포함하는 이종 이작용성 가교 링커로 미리 활성화된 변형 VLP와 반응하므로, 전술된 바와 같이 티올화된 cIL-31 항원과 반응할 수 있는, 시스테인 잔기들에 대해 반응성인 작용기 적어도 하나 또는 수 개를 보이게 된다. 선택적으로 소량의 환원제가 반응 혼합물에 포함된다. 추가의 방법에서, cIL-31 항원은, 동종 이작용성 가교 링커, 예컨대 글루타르알데히드, DSG, BM[PEO]4, BS3(Pierce), 또는 변형 VLP의 아민기 또는 카복실기에 대해 반응성인 작용기를 가지는 기타 공지된 동종 이작용성 가교 링커를 이용하여 변형 VLP에 부착된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 면역자극성 물질을 추가로 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 본 발명의 변형 VLP로 팩키징된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 면역자극성 물질은 본 발명의 변형 VLP와 혼합된다. 본 발명에 유용한 면역자극성 물질은, 일반적으로 당 분야에 공지되어 있고, 그 자체는 WO 2003/024481A1에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 비 진핵생물 기원의 DNA 또는 RNA로 이루어져 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 (a) 면역자극성 핵산; (b) 펩티도글리칸; (c) 리포다당체; (d) 리포테이코산; (e) 이미다조퀴놀린 화합물; (f) 플라젤린; (g) 리포단백; 및 (h) 상기 (a) 내지 (g) 중 적어도 하나의 물질의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 면역자극성 핵산이되, 상기 면역자극성 핵산은 (a) 리보핵산; (b) 데옥시리보핵산; (c) 키메라 핵산; 그리고 (d) 상기 (a), (b) 및/또는 (c)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 리보핵산이고, 상기 리보핵산은 세균 유래 RNA이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 폴리-(LC) 또는 이의 유도체이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 데옥시리보핵산이되, 이 데옥시리보핵산은 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 A형 CpG이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 A형 CpG는 서열 GACGATCGTC(서열 번호 24)을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 회문구조 서열은 자체의 5'말단과 자체의 3'말단에서 구아노신 독립체와 측접하고 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 회문구조 서열은 자체의 5'말단에서 적어도 3개 및 많아야 15개의 구아노신 독립체와 측접하고 있고, 상기 회문구조 서열은 자체의 3'말단에서 적어도 3개 및 많아야 15개의 구아노신 독립체와 측접하고 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이고, 바람직하게 상기 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 회문구조 서열을 포함하며, 추가로 바람직하게 상기 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드의 CpG 모티프는 회문구조 서열의 일부이고, 또한 추가로 바람직하게 상기 회문구조 서열은 GACGATCGTC(서열 번호 24)이다.
매우 바람직한 구현예들에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 설프히드릴기를 통하여 상기 코어 입자, 바람직하게 상기 VLP와 연결되어 있고, 또한 추가로 바람직하게 상기 변형 CMV VLP와 연결되어 있으며, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 제2 부착 부위에 포함되고, 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원에 자연 발생하는 것이 아니며, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과, N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜 S-아세틸티오프로피오네이트(SATP) 또는 이미노티올란의 반응으로부터 유래하며, 추가로 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응으로부터 유래한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예들에서, cIL-31 항원은 시스테인 잔기, 즉 cIL-31 항원의 N-말단 또는 C-말단에 부가된 시스테인 잔기, 또는 cIL-31 항원 내 자연 발생 시스테인 잔기를 통하여 변형 바이러스 유사 입자의 리신 잔기에 연결된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 링커를 추가로 포함하는데, 상기 링커는 상기 cIL-31 항원과 상기 제2 부착 부위를 결합시키고, 바람직하게 상기 링커는 상기 제2 부착 부위를 포함하거나, 또는 대안적으로 이것으로 이루어져 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 92%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응으로부터 유래한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 제1 부착 부위를 가지는 바이러스 유사 입자(VLP); (b) 적어도 하나의 제2 부착 부위를 가지는 적어도 하나의 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원)을 포함하는 조성물을 제공하는데, 다만 이 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있고, 또한 추가로 바람직하게 상기 항원은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있으며; 다만 상기 (a) 및 (b)는 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합을 통하여 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 연결되어 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 VLP는 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP로서, 상기 변형 CMV 폴리펩티드는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25 내지 서열 반호 30으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 (a) 서열 번호 18; (b) 서열 번호 21; (c) 서열 번호 22; (d) 서열 번호 25; 또는 (e) 서열 번호 26으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성이 적어도 98%인 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 cIL-31 항원은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원과 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA)의 반응으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 제2 부착 부위는 설프히드릴기이고, 바람직하게 상기 설프히드릴기는 상기 cIL-31 항원의 리신 잔기의 반응로부터 유래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개과 동물, 바람직하게 반려견에 조성물 유효량만큼을 투여하는 단계를 포함하는, 개과 동물, 바람직하게 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 이 조성물은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 코어 입자와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하며, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있으며, 바람직하게 상기 방법 또는 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 추가로 정의된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 제1 부착 부위를 적어도 하나 가지는 코어 입자와; (b) 제2 부착 부위를 적어도 하나 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원) 적어도 하나를 포함하며, 상기 cIL-31 항원은 서열 번호 22로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 98%의, 서열 번호 22와의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어져 있고; (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와, 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있는 조성물의, 개과 동물, 바람직하게는 반려견의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 제조를 위한 용도를 제공하는데, 이 경우 상기 조성물 유효량만큼이 상기 개과 동물, 바람직하게는 반려견에 투여되고, 바람직하게 상기 방법 또는 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 추가로 정의되어 있다.
실시예
실시예 1
오이 모자이크 바이러스( CMV )의 코트 단백질(CP) 분리 및 클로닝
제조자의 지시에 따라 TRI 시약(Sigma, Saint Louis, USA)을 사용하여 CMV 감염된 백합 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성을 위해 OneStep RT-PCR 키트(Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하였다. CMV CP 유전자를 증폭시키기 위해 CMV 서열들을 분석하고 나서 GenBank로부터 프라이머 서열을 선택하였다: CMcpF(CACCATGGACAAATCTGAATCAACCAGTGCTGGT)(서열 번호 8) 및 CMcpR(CAAAGCTTATCAAACTGGGAGCACCCCAGATGTGGGA)(서열 번호 9)[여기서, NcoI 및 HindIII 부위들은 밑줄 쳐 놓음]. 상응하는 PCR 생성물들을 pTZ57R/T 벡터(Fermentas, Vilnius, Lithuania)에 클로닝하였다. 이.콜라이 XL1-Blue 세포를 클로닝 및 플라스미드 증폭용 숙주로 사용하였다. PCR 오류를 함유하는 클론이 선택되는 것을 막기 위해, 몇몇 CP 유전자 함유 pTZ57 플라스미드 클론을 대상으로, BigDye 순환 서열결정 키트 및 ABI Prism 3100 유전자 분석기(Applied Biosystems, Carlsbad, USA)를 사용하여 서열결정하였다. 서열결정 후 서열 오류를 함유하지 않는 CMV CP 유전자의 cDNA로서(서열 번호 10), 서열 번호 1의 CMV 코트 단백질을 암호화하는 cDNA를 pET28a(+) 발현 벡터(Novagen, San Diego, USA)의 NcoI/HindIII 부위에 서브클로닝한 결과, 발현 플라스미드 pET-CMVwt가 생성되었다(도 1).
실시예 2
CMV의 VLP 생산을 유도하는, 이.콜라이 내 서열 번호 1의 CP 발현
CMV VLP를 수득하기 위해, 이.콜라이 C2566 세포(New England Biolabs, Ipswich, USA)를 CMV CP 유전자 함유 플라스미드 pET-CMVwt로 형질전환시켰다. 목표 단백질의 발현 수준이 가장 높은 클론을 선택한 후, 이.콜라이 배양액을, 30℃에서 회전 진탕기(200 rev/분; Infors, Bottmingen, Switzerland) 상 카나마이신(25 mg/l) 함유 2xTY 배지에서 OD600이 0.8 ~ 1.0이 될 때까지 생장시켰다. 그 다음, 세포를 대상으로 0.2 mM IPTG 유도를 실시하였고, 이때 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 20℃에서 회전 진탕기 상에서 18 시간 동안 항온처리를 계속 수행하였다. 이로부터 생성된 바이오매스를 저속 원심분리하여 수집하고 나서, -20℃로 동결시켰다. 얼음 상에서 해동한 후, 50 mM 시트르산나트륨, 5 mM 붕산나트륨, 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올 함유 완충제(pH 9.0, 완충제 A)에 세포를 현탁한 다음, 초음파 처리에 의해 세포를 파괴하였다. 불용성 단백질과 세포 파편을 원심분리(13,000 rpm, 5℃에서 30 분)에 의해 제거하였다. 투명해진 용해물 중 가용성 CMV CP 단백질을 4℃에서 포화 황산암모늄(1:1, vol/vol)을 사용하여 밤새도록 펠렛화하였다. 침전된 단백질을 동일한 완충제 A(다만 머캅토에탄올 불포함) 중 4℃에서 4 시간 동안 용해시켰다. 저속 원심분리(13,000 rpm, 4℃에서 15 분)에 의해 불용성 단백질을 제거하였다. 수크로스 구배(머캅토에탄올은 포함하지 않되 0.5% Triton X-100이 보충된 완충제 A 중 20% → 60%) 하에, 초원심분리(SW28 로터, Beckman, Palo Alto, USA; 25,000 rpm, 6 시간, 5℃)에 의해 가용성 CMV CP 함유 단백질 용액을 세포 단백질들로부터 분리하였다. 구배는, 구배의 가장 낮은 구간으로부터 시작해 6개의 구간으로 나누었으며, 구간의 분획들을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(데이터는 보이지 않음). 재조합 CMV CP를 함유하는 2번 및 3번 분획을 합하고 나서, 이를 완충제(5 mM 붕산나트륨, 2 mM EDTA, pH 9.0) 200 용적에 대해 투석하여, 수크로스와 Triton X-100을 제거하였다. 투석 후, 0.2μ 필터를 통한 여과에 의하여 CMV CP 용액을 멸균시켰다. 그 다음, 멸균 조건 하에 20% 수크로스 "완충작용(cushion)"을 통한 Type70 로터(Beckman, Palo Alto, USA) 초원심분리(50,000 rpm, 4 시간, 5℃)를 이용하여 CMV CP를 농축하였다. 제조자의 권고에 따라 QuBit 형광측정기(Invitrogen, Eugene, USA)를 사용하여, 정제된 CMVwt의 농도를 추산하였다. 농축 VLP 용액(대략 3 mg/ml)을 5 mM 붕산나트륨, 2 mM EDTA, 완충제(pH 9.0) 중 4℃에 보관하였다. VLP 발현 및 정제에 수반되는 모든 단계들을 12.5% 겔을 사용하는 SDS-PAGE로 모니터링하였다.
이.콜라이 세포 내에서 CMV 코트 단백질을 성공적으로 발현시킬 수 있었으며, 이때 수득된 유의미한 부분은 가용성 분획 중에 있을 수 있었다. 게다가 이 단백질은, 수크로스 구배 분석(도 2a), 동적 광 산란 및 전자현미경 분석(도 2b)에 의해 입증되는 바와 같이, 이.콜라이 세포 추출물 중에서 등척성 VLP의 형태로서 직접 발견되었다.
실시예 3
파상풍 변성독소 에피토프 함유 CMV(CMV-Ntt830)의 변형 코트 단백질 클로닝
서열 번호 1의 CMV CP N-말단에 있는 원래 아미노산을 파상풍 변성독소 에피토프 함유 서열로 치환하기 위해, pET-CMVwt 플라스미드를 PCR 증폭 및 돌연변이유발을 위해 사용하였다. CMVwt 유전자 내부에 위치하는 SalI 부위(도 1)를 사용하여, 상응 PCR 생성물을 클로닝하였다.
파상풍 변성독소 에피토프 암호화 서열을 CMVwt 유전자에 도입하기 위하여, 2단계 PCR 돌연변이유발법을 사용하였다. 제1 단계 증폭을 위해, 하기 프라미어들을 사용하였다:
pET-220 (agcaccgccgccgcaaggaa (서열 번호 11) - 폴리링커의 상류, 증폭된 영역은 BglII 부위를 포함함) 및 CMV-tt83-1R (ATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTGGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT) (서열 번호 12). 제2 라운드를 위하여, 1차 증폭으로부터 유래한 PCR 생성물을 1:50으로 희석한 다음, 프라이머 pET-220 (서열 번호 11) 및 CMV-tt83Sal-R2 (GACGTCGACGCTCGGTAATCCCGATAAATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTG) (서열 번호 13)로 다시 증폭시켰다. 이로부터 생성된 PCR 생성물(서열 번호 6의 CMV-Ntt830을 암호화하는, 서열 번호 14의 cDNA)을, pET-CMVwt의 BglII/SaLI 부위에 서브클로닝하였다. 지정된 pET-CMV-Ntt830을 서열결정하여 올바른 클론을 동정하였다.
실시예 4
CMV의 변형 VLP를 생산하는, 이.콜라이 내 CMV - Ntt830의 발현
CMV-Ntt830 VLP를 수득하기 위해, 이.콜라이 C2566 세포(New England Biolabs, Ipswich, USA)를 CMV-Ntt830 유전자 함유 플라스미드 pET-CMV-Ntt830으로 형질전환시켰다. 목표 단백질의 발현 수준이 가장 높은 클론을 선택한 후, 이.콜라이 배양액을, 30℃에서 회전 진탕기(200 rev/분; Infors, Bottmingen, Switzerland) 상 카나마이신(25 mg/l) 함유 2xTY 배지에서 OD600이 0.8 ~ 1.0이 될 때까지 생장시켰다. 그 다음, 세포를 대상으로 0.2 mM IPTG 유도를 실시하였고, 이때 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 20℃에서 회전 진탕기 상에서 18 시간 동안 항온처리를 계속 수행하였다. 이로부터 생성된 바이오매스를 저속 원심분리에 의해 수집하고 나서, -20℃로 동결시켰다. 얼음 상에서 해동한 후, 50 mM 시트르산나트륨, 5 mM 붕산나트륨, 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올 함유 완충제(pH 9.0, 완충제 A)에 세포를 현탁한 다음, 초음파 처리에 의해 세포를 파괴하였다. 불용성 단백질과 세포 파편을 원심분리(13,000 rpm, 5℃에서 30 분)에 의해 제거하였다. 투명해진 용해물 중 가용성 CMV-Ntt830 단백질을 4℃에서 포화 황산암모늄(1:1, vol/vol)을 사용하여 밤새도록 펠렛화하였다. 침전된 단백질을 완충제 A(다만 머캅토에탄올 불포함) 중 4℃에서 4 시간 동안 용해시켰다. 저속 원심분리(13,000 rpm, 4℃에서 15 분)에 의해 불용성 단백질을 제거하였다. 수크로스 구배(머캅토에탄올은 포함하지 않되 0.5% Triton X-100이 보충된 완충제 A 중 20% → 60%) 하에, 초원심분리(SW28 로터, Beckman, Palo Alto, USA; 25,000 rpm, 6 시간, 5℃)에 의해 가용성 CMV-Ntt830 함유 단백질 용액을 세포 단백질들로부터 분리하였다. 구배는, 구배의 가장 낮은 구간으로부터 시작해 6개의 구간으로 나누었다. 재조합 CMV-Ntt830을 함유하는 구간의 분획들을 합하고 나서, 이를 5 mM 붕산나트륨, 2 mM EDTA, pH 9.0) 200 용적에 대해 투석하여, 수크로스와 Triton X-100을 제거하였다. 투석 후, 0.2μ 필터를 통한 여과에 의하여 CMV-Ntt830 용액을 멸균시켰다. 그 다음, 멸균 조건 하에 20% 수크로스 "완충작용"을 통한 Type70 로터(Beckman, Palo Alto, USA) 초원심분리(50,000 rpm, 4 시간, 5℃)를 이용하여 CMV-Ntt830을 농축하였다. 제조자의 권고에 따라 QuBi 형광측정기(Invitrogen, Eugene, USA)를 사용하여, 정제된 CMV-Ntt830의 농도를 추산하였다. 농축 VLP 용액(대략 3 mg/ml)을 5 mM 붕산나트륨, 2 mM EDTA, 완충제(pH 9.0) 중 4℃에 보관하였다. VLP 발현 및 정제에 수반되는 모든 단계들을 12.5% 겔을 사용하는 SDS-PAGE로 모니터링하였다. CMV VLP 내 파상풍 변성독소 에피토의 존재를 입증하기 위하여, 정제된 CMV-Ntt830 VLP의 질량 분광분석을 이용하였다. 도 3c에 보인 바와 같이, 만일 이.콜라이 세포 내 단백질 합성이 진행되는 동안 발생하는 첫 번째 메티오닌이 제거되었다면, 수득된 주 피크는 단백질의 이론상 분자 질량에 상응하는 것이다. 동적 광 산란 및 전자현미경을 통하여, 생산된 단백질은 CMVwt VLP의 형태와 유사한 등척성 입자 형태임을 확인하였다(도 4a 및 도 4b).
실시예 5
PADRE 에피토프 함유 CMV(CMV-Npadr)의 변형 코트 단백질 클로닝
PADRE 에피토프 암호화 서열을 CMVwt 유전자에 도입하기 위해, pET-CMVwt 플라스미드를 증폭 및 서브클로닝하기 위한 주형으로 사용하여 PCR 돌연변이유발을 수행하였다(실시예 2 및 실시예 3 참조). 증폭을 위해 하기 프라이머들을 사용하였다: pET-220 (서열 번호 11) 및 CMV-padrSal-R (GACGTCGACGCGCGGCCGCCTTGAGGGTCCACGC GGCCACAAATTTCGCCATGGT) (서열 번호 15). 이로부터 생성된 PCR 생성물(서열 번호 7의 CMV-Npadr을 암호화하는, 서열 번호 16의 cDNA)을 pET-CMVwt의 BglII/SalI 부위에 다시 서브클로닝하였다. 지정된 pET-CMV-Npadr을 서열결정함으로써 올바른 클론을 동정하였다.
실시예 6
CMV의 변형 VLP를 생산하는, 이.콜라이 내 CMV - Npadr의 발현
CMV-Npadr의 발현 및 정제를 위한 방법은, 본질적으로 실시예 4에 기술된 CMV-Ntt830의 발현 및 정제를 위한 방법과 동일하였다. CMV VLP에 PADRE 에피토프가 존재하는지를 입증하기 위하여, 정제된 CMV-Npadr VLP의 질량 분광분석법을 이용하였다. 도 3b에 보인 바와 같이, 만일 이.콜라이 세포 내 단백질 합성이 진행되는 동안 발생하는 첫 번째 메티오닌이 제거되었다면, 수득된 주 피크는 단백질의 이론상 분자 질량에 상응하는 것이다. 동적 광 산란 및 전자현미경분석을 통하여, 생산된 단백질은 등척성 입자 형태임을 확인하였다(도 5a 및 도 5b).
실시예 7
6xHis 태그 및 C-말단 시스테인을 이용한, 개 IL-31의 클로닝 및 생산
이.콜라이 최적화 코돈, N-말단 6xHis 태그, TEV 프로테아제 절단 부위, C-말단 시스테인 및 측접 NcoI 및 PstI 제한 부위를 가지는 개 IL31 cDNA 서열(서열 번호 17)은 IDT사에 의해 제작되었다. 또한, NcoI/PstI 단편을 벡터 pET42의 상응하는 부위들에 결찰시켰다. 구조체를 화학 수용성 이.콜라이 DH5α세포에 도입하여 이 세포를 형질전환시킨 다음, 콜로니를 암피실린 함유 LB 아가 평판상에 접종하였다. 이로부터 생성된 클론의 서열을 생거(Sanger) 서열결정에 의해 확인하였다. 이로부터 생성된 구조체 pET42_6HcIL31C를 화학 수용성 이.콜라이 BL21-DE3 세포에 도입하여 이 세포를 더 형질전환시켰다.
IL31-pET42로 형질전환된 BL31-DE3 세포를, 암피실린(50 μg/ml) 함유 LB 아가 배지에 접종하고, 37℃에서 밤새도록 항온처리함으로써 접종 물질 스톡을 준비하였다. 그 다음, 스톡을 2TY 배지에 용적 비율 1:20으로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 진탕하면서 540 nm에서의 광학 밀도가 0.7 유닛에 이를 때까지 생장시켰다. 그 다음, 1 mM IPTG로 단백질(서열 번호 18) 발현을 유도하고 나서, 세포를 37℃에서 진탕하면서 4 시간 더 생장시켰다. SDS-PAGE 상에 총 세포 용해물을 로딩(loading)함으로써 단백질이 생성되었음을 확인하였다(도 6).
원심분리로 바이오매스를 수집하고 나서, 이를 40 mM Tris-HCl(pH 8.0), 200 mM NaCl, 20 mM MgSO4, 0.1 mg/ml DNaseI, 1mM PMSF 및 1% Triton X-100를 함유하는 얼음 냉각 용해 완충제 중에 현탁하였는데, 이때 비율은 용해 완충제 5 ml당 습윤 세포 1 g으로 유지시켰다. 세포를 얼음상 초음파 파쇄로 용해하였으며, 이때 수득된 용해물을 15000g에서 40 분 동안 원심분리하였고, 이로부터 생성된 상청액은 폐기하였다. 20 mM Tris HCl, pH=8.0 및 1M NaCl을 함유하는 세척용 완충제 WB1을 펠렛에 첨가하였는데, 이때 비율은 초기 습윤 세포 질량 1g당 WB1 3 ml로 유지시켰다. 펠렛을 와류에 의해 재현탁하고 나서, 회전 진탕기에서 1 시간 동안 항온처리(실온)한 다음, 15000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 세척 완충제 WB2(20 mM Tris HCl, pH=8.0, 200 mM NaCl 및 1M 우레아 함유)를 사용하여 펠렛 세척을 1회 더 반복하였다. 목표 단백질은 펠렛 분획 중에 존재하였다. 그 다음, 펠렛을 8M 우레아, 20 mM Tris HCl, pH=8.0 및 100 mM NaH2PO4 함유용리 완충제 EB1 중에 재현탁하였는데, 이때 비율은 초기 습윤 세포 질량 1g당 EB1 3 ml로 유지시켰고, 이를 실온에서 밤새도록 회전 진탕기 상에서 항온처리하였다. 원심분리 후, 상청액은 순도가 대략 90%인 단백질을 함유하였다(도 7). 수득된 상청액 1 ml를, 20 mM Tris-HCl, pH = 8.0, 50 mM NaCl, 1M 글리신, 그리고 5 mM β-머캅토에탄올을 함유하는 리폴딩 완충제 RB 20 mL에 적가하고 나서, 실온에서 2 시간 동안 진탕하며 항온처리하였다. 이후, 상청액을 Amicon 필터 유닛(MWCO 10kDa)으로 1 ml로 농축하였으며, PBS 1000 ml에 대해 4℃에서 48 시간 동안 투석하였다. 그 다음, 시료를 원심분리하고 나서, PBS 중 SuperdexTM 200 10/300 GL 컬럼에 로딩하였다. 목표 단백질을 보였던 컬럼 프로필은 허공 용적으로 용리되었던 것으로 보아, 아마도 가용성 응집체가 생성된 것으로 보였다(도 8).
실시예 8
재조합 원산 개 IL-31의 클로닝 및 제조
프라이머 cIL31NATf (TACACCATGGCCTCCCACATGGCTCCAACG, 서열 번호 19) 및 cIL31NATr (CATACTGCAGTTACTGCGGTCCACTGTTTAAG, 서열 번호 20)(PstI 및 NcoI 부위 함유)를 사용하여 PCR을 통해, 서열 번호 17을 함유하는 플라스미드로부터 개 IL-31을 증폭시켰다. 수득된 cIL-31 PCR 단편을 PstI 및 NcoI 제한 효소로 분해하고 나서, pET42 벡터의 상응하는 부위에 결찰시켰다. 구조체로, 화학 수용성 이.콜라이 DH5α세포를 형질전환시키고 나서, 콜로니를 암피실린을 함유하는 LB 아가 평판 상에 접종하였다. 생거 서열결정에 의해 양성 클론을 동정하였다. 그 다음, cIL31-pET42 구조체로, 화학 수용성 이.콜라이 BL21-DE3 세포를 형질전환시켰다.
cIL31-pET42로 형질전환된 BL31-DE3 세포를, 암피실린(50 μg/ml) 함유 LB 아가 배지에 접종하고, 37℃에서 밤새도록 항온처리함으로써 접종 물질 스톡을 준비하였다. 그 다음, 스톡을 2TY 배지에 용적 비율 1:20으로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 진탕하면서 540 nm에서의 광학 밀도가 0.7 유닛에 이를 때까지 생장시켰다. 그 다음, 1 mM IPTG로 단백질(서열 번호 21) 발현을 유도하고 나서, 세포를 37℃에서 진탕하면서 4 시간 더 생장시켰다. SDS-PAGE 상에 총 세포 용해물을 로딩함으로써 단백질이 생성되었음을 확인하였다(도 9).
원심분리로 바이오매스를 수집하고 나서, 이를 40 mM Tris-HCl(pH 8.0), 200 mM NaCl, 20 mM MgSO4, 0.1 mg/ml DNaseI, 1mM PMSF 및 1% Triton X-100를 함유하는 얼음 냉각 용해 완충제 중에 현탁하였는데, 이때 비율은 용해 완충제 5 ml당 세포 1 g으로 유지시켰다. 세포를 얼음상 초음파 파쇄로 용해하였으며, 이때 수득된 용해물을 15000g에서 40 분 동안 원심분리하였다. 상청액은 폐기하였고, 초기 습윤 세포 질량 1 g에 대한 용해 완충제 1.5 ml 비율을 유지하며 용해 완충제를 펠렛에 첨가하였다. 펠렛을 초음파 분쇄에 의해 용액 중에 현탁시킨 다음, 용액을 15000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 전술된 바와 같이, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 용해 완충제로 5회 더 세척하였다. 세척 단계 후, 펠렛을 6.86 M 우레아 및 20 mM 디티오트레이톨 중에 초음파 분쇄로 재현탁하였다. 용액을 15000g에서 20분 동안 원심분리하였으며, 상청액을, 50 mM Tris-HCl, 1 M 글리신, 1 mM EDTA 및 5 mM β-머캅토에탄올 함유 리폴딩 완충제로 희석하였는데, 이때 우레아-디티오트레이톨 용액 1 ml 당 리폴딩 완충제 75 ml의 비율을 유지시켰다. 4℃에서 진탕하면서 밤새도록 리폴딩을 수행하였다. 그 다음, 용액을 22 μm 필터를 사용하여 여과하였고, 10 kDa 장치(Amicon)를 사용하는 한외여과로 200 ml에서 4 ml까지 농축하였다. 그 다음, 용액을 15000 g에서 10 분 동안 원심분리하여, 남아있던 침전물을 제거하였다. 용액을, 리폴딩 완충제로 미리 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(16 x 600 mm) 상에 로딩하고 나서, 분획화하였다(분획당 2 ml씩, 유속 2 ml/분). SDS-PAGE 전기영동으로 cIL-31 단백질 함유 분획들을 동정하여, 풀링(pooling)한 다음, 10 kDa 장치(Amicon)를 사용하는 한외여과로 농축하여, 용적을 3 ml로 만들었다. 이전과 같이 Superdex 200 겔 여과 컬럼상에서 2회차 크로마토그래피를 수행하였다. 2회차 크로마토그래피 단계에 있어서 컬럼을 PBS 완충제(0.1 M 인산나트륨, pH 7.2 및 0.15 M NaCl)로 평형화하였다. 분획들을 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였으며(도 10), 가장 순수한 cIL-31 항원(서열 번호 21)을 함유하는 분획 4개를 풀링한 다음, 10 kDa 장치(Amicon)를 사용하는 한외여과를 통해 4 mg/ml로 농축하여, 추후 CMV VLP와의 커플링 실험을 위해 사용하였다.
실시예 9
재조합 개 IL-31 구조체와, CMV - Npadr VLP 및 CMV - Ntt830 VLP의 커플링, 그리고 마우스 및 개의 면역화
A. cIL-31과 VLP의 커플링
실시예 8에서 수득된 바와 같은 cIL-31 단백질(서열 번호 21)의 용액(PBS 완충제 중 4 mg/ml) 100 μl를, DMSO 중 55 mM N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA, Thermo Fisher Scientific) 4.8 μl와 혼합한 다음, 이를 실온(RT)에서 30 분 동안 항온처리하였다. Amicon Ultra-0.5 3K 여과 유닛(Merck-Millipore)으로 4x 완충제를 PBS(0.1 M 인산나트륨 완충제, pH 7.2 및 0.15 M NaCl)로 교환함으로써 미반응 SATA를 제거하여, 최종 용적을 100 μl로 조정하였다. 여기에 탈아세틸화 용액(PBS 중 0.5 M 하이드록실아민 및 25 mM EDTA) 10 μl를 첨가하여 설프히드릴기를 탈보호하고 나서, 이를 RT에서 2 시간 동안 항온처리하였다. Amicon Ultra-0.5 3K 여과 유닛(Merck-Millipore) 내에서 4x 완충제를 PBS로 교환하여 탈아세틸화 용액을 제거하여, 최종 용적을 100 μl로 조정하였다.
용적 250 μl만큼의 CMV-Ntt830 VLP(농도: 5 mM NaHPO4 pH 7.5, 2 mM EDTA 중 1.5 mg/ml)를, DMSO 중 50 mM 숙신이미딜-6-(b-말레이미도프로피론아미드) 헥사노에이트(SMPH) 용액 3 μl와 혼합한 다음, RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. SMPH 양은, 하나의 VLP 단량체, 즉 하나의 CMV 폴리펩티드에 대한 7.5x 몰 과량을 지칭한다. Amicon Ultra-0.5 3K 여과 유닛(Merck-Millipore)으로, 4x 완충제를 5 mM NaHPO4(pH 7.5) 및 2 mM EDTA(pH 8.0)와 교환함으로써 미반응 SMPH를 제거하여, 최종 용적을 250 μl로 조정하였다.
커플링 반응을 위하여, SMPH 처리된 VLP 100 μl를, SATA 처리 및 탈아세틸화 cIL-31(서열 번호 21) 43 μl와 혼합한 다음, RT에서 3 시간 동안 항온처리하였다. 이로부터 생성된 생성물을 SDS-PAGE로 검사하였으며(도 11), 전자현미경으로 관찰하였다(도 12). SDS 겔 상 분석은, 예상 분자량을 가지는 화학 커플링 생성물의 존재를 확인시켜 주었고, EM에 의한 분석은 비변형 VLP의 존재를 확인시켜 주었다.
B. CMV-Npadr 및 CMV-Ntt830 VLP와 커플링된 cIL-31에 의한 마우스 면역화
당일과 제14일에, 암컷 Balb/c 마우스 5 마리로 이루어진 군에, SATA를 통해 cIL-31(서열 번호 21)에 커플링된 CMV-Npadr VLP 및 CMV-Ntt830 VLP 50 ug(PBS 중 제제화됨)를 피하 주사하여 이 동물들을 면역화하였다. 당일(면역화 전), 제14일 및 제28일에 마우스로부터 채혈하여, cIL-31 특이적 ELISA를 통해 혈청을 분석하였다.
ELISA. 지정된 시간에 마우스 혈청 중 항체 반응을 분석하였다. ELISA 평판을 재조합 cIL-31(농도 5 μg/ml, PBS(pH 7.2) 중 용적 100 μl)로 코팅하여(4℃, 밤새도록) cIL-31에 특이적인 항체를 분석하였다. ELISA 평판을, 0.05% Tween20을 함유하는 PBS(pH 7.2, PBST) 200 μl로 5회 세척하였다. 비특이적 결합을 막기 위하여, ELISA 평판을 PBST 중 2% BSA 200 μl로 차단한 다음, RT에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 예비 희석한 혈청을 코팅된 평판에 옮긴 후, 추가로 연속 희석하여, OD50 산정을 기반으로 항체 역가를 구하였다. RT에서 2 시간 동안 항온처리한 후, ELISA 평판을 PBST 200 μl로 5회 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합 염소 항마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch)에 의해 혈청 항체의 결합을 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST로 1:1000 희석한 다음, 시료당 용적 100 μl씩을 옮겼다. 평판을 RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. ELISA 평판을 전술된 바와 같이 세척하였다. 세척하기에 앞서서, 기질 용액을 준비하였다. 이를 위해, OPD(1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 1정(10 mg)과, 30% H2O2 9 μl를 시트르산 완충제(0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0) 25 ml 중에 용해하였다. 기질 용액 용적 100 μl만큼을 평판 위에 피펫팅(pipetting)한 다음, RT에서 정확히 7분 동안 항온처리하였다. 반응을 중지시키기 위하여, 중지 용액(H2O 중 5% H2SO4) 50 μl를 평판상에 직접 피펫팅하였다. 450 nm에서 1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 발색 반응의 흡광도 판독 결과를 분석하였다.
C. CMV-Npadr 및 CMV-Ntt830 VLP에 커플링된 cIL-31에 의한 개 면역화
당일, 제14일, 제28일 및 제42일에, 개 5 마리로 이루어진 군에, SATA를 통해 cIL-31(서열 번호 21)에 커플링된 CMV-Npadr VLP 및 CMV-Ntt830 VLP 50 ug(PBS 중 제제화됨)를 피하 주사하여 면역화하였다. 당일(면역화 전), 제14일, 제28일, 제42일 및 제56일에 개로부터 채혈하여, cIL-31 특이적 ELISA를 통해 혈청을 분석하였다.
ELISA. 지정된 시간에 개 혈청 중 항체 반응을 분석하였다. ELISA 평판을 재조합 cIL-31(농도 5 μg/ml, PBS(pH 7.2) 중 용적 100 μl)로 코팅하여(4℃, 밤새도록) cIL-31에 특이적인 항체를 분석하였다. ELISA 평판을, 0.05% Tween20을 함유하는 PBS(pH 7.2, PBST) 200 μl로 5회 세척하였다. 비특이적 결합을 막기 위하여, ELISA 평판을 PBST 중 2% BSA 200 μl로 차단한 다음, RT에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 예비 희석한 혈청을 코팅된 평판에 옮긴 후, 추가로 연속 희석하여, OD50 산정을 기반으로 항체 역가를 구하였다. RT에서 2 시간 동안 항온처리한 후, ELISA 평판을 PBST 200 μl로 5회 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합 염소 항개 IgG(Jackson ImmunoResearch)에 의해 혈청 항체의 결합을 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST로 1:1000 희석한 다음, 시료당 용적 100 μl씩을 옮겼다. 평판을 RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. ELISA 평판을 전술된 바와 같이 세척하였다. 세척하기에 앞서서, 기질 용액을 준비하였다. 이를 위해, OPD(1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 1정(10 mg)과, 30% H2O2 9 μl를 시트르산 완충제(0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0) 25 ml 중에 용해하였다. 기질 용액 용적 100 μl만큼을 평판 위에 피펫팅한 다음, RT에서 정확히 7분 동안 항온처리하였다. 반응을 중지시키기 위하여, 중지 용액(H2O 중 5% H2SO4) 50 μl를 평판상에 직접 피펫팅하였다. 450 nm에서 1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 발색 반응의 흡광도 판독 결과를 분석하였다.
실시예 10
개 아토피성 피부염의 치료를 위해 CMV - Ntt830 VLP에 커플링된 재조합 개 IL-31 구조체를 사용하는, 개의 치료를 위한 면역화
당일, 제14일, 제28일, 제56일 및 제80일에, 아토피성 피부염을 앓고있는 개 15 마리로 이루어진 군에, SATA를 통해 cIL-31(서열 번호 21)에 커플링된 CMV-Npadr VLP 또는 CMV-Ntt830 단독(둘 다 백반 중 제제화됨) 50 ug씩을 피하 주사하여 동물들을 면역화하였다. 면역화 전, 제28일, 제56일, 제80일 및 제120일에 질환의 중증도를 눈으로 관찰하여 측정하였다.
실시예 11
CAD 스코어 매기기
실험용 개를 대상으로 CAD 증상에 대해 스코어를 매기기 위해, 아토피성 피부염 병변 지수(ADLI)와 소양증 시각 아날로스 스코어(PVAS)를 이용하였다. ADLI 스코어는, 5군데의 지정 신체 부위를 대상으로 평가되는, 개 아토피성 피부염 관련 임상 증상 6가지로 이루어진 유효 복합 지수이다. 각각의 지정된 신체 부위에서 0에서부터 5에 이르기까지의 기록원에 의해 각각의 매개 변수에 대하여 스코어가 매겨지는데, 다만, 스코어 0은 병변이 없는 경우로서 정의되고, 스코어 5는 중증/광범위 병변이 나타난 경우로서 정의된다. PVAS는 0에서부터 10에 이르기까지의 아날로그 스케일을 이용한 기록원에 의해 스코어가 매겨지되, 다만 스코어 0은 소양증/물어뜯기 행동을 보이지 않는 경우를 나타내고, 스코어 10은 끊임없으면서 심한 소양증/물어뜯기 행동을 보이는 경우에 해당한다. 처리된 개들의 CAD 스코어는, 기준치뿐만 아니라 위약 처리된 개들의 스코어와도 비교된다.
실시예 12
집 먼지 진드기에 대해 알레르기를 보이는 개의 cIL -31- CMV - Ntt830 VLP에 의한 백신화 및 백신화 이후의 면역원 공격
알레르기성 개 6 마리는 백반 중에 제제화한 cIL-31-CMV-Ntt830 VLP 100 ug으로 면역화하였으며, 또 다른 알레르기성 개 6 마리는 위약(백반)으로 처리하였다. 3주 후, 백신 300 ug으로 개를 면역증강시키거나 또는 개에 위약을 투여하였다. 제28일에 혈액 시료를 채취하였다. 제28일에 테이프 제모(tape stripping)에 의해 개의 복부 피부에 난 털을 깍고 나서, 매일 10분간 총 5 연속일 동안 집 먼지 진드기로 면역원 공격을 실시하였다. 매일 6 시간 동안 개들을 임상 검사 비디오 촬영하여 개 12 마리 피부의 병변과 소양증에 스코어를 매겼다.
도 13a는, 백신화 전과 후 개들의 긁기행동을 보여준다. 긁기행동에 상당한 감소가 있었는데, 면역화된 개 6 마리 중 5 마리는 긁기행동을 본질적으로 멈추었던 반면, 위약 처리된 동물들의 행동에는 변화가 없었다.
cIL -31 특이적 IgG 역가의 측정. 제28일에 개 혈청 중 항체 반응을 분석하였다. ELISA 평판을 재조합 cIL-31(농도 3 μg/ml, PBS(pH 7.2) 중 용적 100 μl)로 코팅하여(4℃, 밤새도록) cIL-31에 특이적인 항체를 분석하였다. ELISA 평판을, 0.05% Tween20을 함유하는 PBS(pH 7.2, PBST) 200 μl로 5회 세척하였다. 비특이적 결합을 막기 위하여, ELISA 평판을 PBST 중 2% BSA 200 μl로 차단한 다음, RT에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 예비 희석한(10배) 혈청을 코팅된 평판에 옮긴 후, 추가로 (3배씩) 연속 희석하여, OD50 산정을 기반으로 항체 역가를 구하였다. RT에서 2 시간 동안 항온처리한 후, ELISA 평판을 PBST 200 μl로 5회 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다아제 접합 염소 항개 IgG(Jackson ImmunoResearch)에 의해 혈청 항체의 결합을 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST로 1:1000 희석한 다음, 시료당 용적 100 μl씩을 옮겼다. 평판을 RT에서 1 시간 동안 항온처리하였다. ELISA 평판을 전술된 바와 같이 세척하였다. 세척하기에 앞서서, 기질 용액 5가지를 준비하였다. 이를 위해, OPD(1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 1정(10 mg)과, 30% H2O2 9 μl를 시트르산 완충제(0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0) 25 ml 중에 용해하였다. 기질 용액 용적 100 μl만큼을 평판 위에 피펫팅한 다음, RT에서 정확히 7분 동안 항온처리하였다. 반응을 중지시키기 위하여, 중지 용액(H2O 중 5% H2SO4) 50 μl를 평판상에 직접 피펫팅하였다. 450 nm에서 1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 발색 반응의 흡광도 판독 결과를 분석하여, 10배 예비 희석된 혈청의 log3으로 표시하였다(도 13b). 도 13b는, IL-31 특이적 항체 역가와 긁기행동의 강도 간 상관관계를 보여준다. 여전히 긁기행동을 보이는 개 1마리는 처음에는 최저 항체 반응을 보이다가 항체 반응이 점점 증가하였고, 이때 보이는 1/300 미만의 지표 역가(indicative titer)는 예방적 수준인 것으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Benchmark Animal Health Ltd Tars, Kaspars <120> Treatment of Canine Atopic Dermatitis <130> P5139PC00 <150> EP16167264.7 <151> 2016-04-27 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> cucumber mosaic virus <400> 1 Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala Asp Ala Asn Phe 20 25 30 Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn Lys Thr Leu Ala Ala 35 40 45 Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly Ser Glu Arg Cys 50 55 60 Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys Pro Pro Lys Ile 65 70 75 80 Asp Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu Leu Leu Pro Asp Ser Val 85 90 95 Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln Ile Arg Val Asn 100 105 110 Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Val Trp Val Thr Val Arg Lys Val 115 120 125 Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Ala Ala Ile Ser Ala Met Phe Ala 130 135 140 Asp Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala Ser Gly Val 145 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Phe Ala Asp 130 135 140 Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala Ser Gly Val Gln 145 150 155 160 Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp Ile 165 170 175 Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp Ala 180 185 190 Leu Glu Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gln Arg 195 200 205 Ile Pro Thr Ser Gly Val Leu Pro Val 210 215 <210> 3 <211> 218 <212> PRT <213> cucumber mosaic virus <400> 3 Met Asp Lys Ser Glu Ser Pro Asn Ala Ser Arg Thr Ser Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Ser Gly Ala Asp Ala Gly Leu 20 25 30 Arg Ala Leu Thr Gln Gln Met Leu Lys Leu Asn Lys Thr Leu Ala Ile 35 40 45 Gly Arg Pro Thr Leu Asn His Pro Thr Phe Val Gly Ser Ala Ser Cys 50 55 60 Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys Pro Pro Glu Ile 65 70 75 80 Glu Lys Gly Ser Tyr Phe Gly Arg Arg Leu Ser Leu Pro Asp Ser Val 85 90 95 Thr Asp Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln Ile Arg Ile Asn 100 105 110 Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Val Trp 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ccgtcctcgt gtattcaaaa gacgatgcac tcgagacaga cgagttagta 600 cttcatgttg acgtcgagca ccaacgtatt cccacatctg gggtgctccc agtttgataa 660 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer pET-220 <400> 11 agcaccgccg ccgcaaggaa 20 <210> 12 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer CMV-tt83-1R <400> 12 atttggagtt ggccttaata tactggccca tggtatatct ccttcttaaa gt 52 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer CMV-tt83Sal-R2 <400> 13 gacgtcgacg ctcggtaatc ccgataaatt tggagttggc cttaatatac tg 52 <210> 14 <211> 672 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cDNA coding for CMV-Ntt830 <400> 14 atgggccagt atattaaggc caactccaaa tttatcggga ttaccgagcg tcgacgtcgt 60 ccgcgtcgtg gttcccgctc cgccccctcc tccgcggatg ctaactttag agtcttgtcg 120 cagcagcttt cgcgacttaa taagacgtta gcagctggtc gtccaactat taaccaccca 180 acctttgtag ggagtgaacg ctgtaaacct gggtacacgt tcacatctat caccctaaag 240 ccaccaaaaa tagaccgtgg gtcttattat ggtaaaaggt tgttattacc tgattcagtc 300 acggaatatg ataagaaact tgtttcgcgc attcaaattc gagttaatcc tttgccgaaa 360 tttgattcaa ccgtgtgggt gacagtccgt aaagttcctg cctcttcgga cttatccgtt 420 gccgccattt ctgctatgtt tgcggacgga gcctcaccgg tactggttta tcagtacgct 480 gcatctggag tccaagctaa caacaaactg ttgtatgatc tttcggcgat gcgcgctgat 540 ataggcgaca tgagaaagta cgccgtcctc gtgtattcaa aagacgatgc actcgagaca 600 gacgagttag tacttcatgt tgacgtcgag caccaacgta ttcccacatc tggggtgctc 660 ccagtttgat aa 672 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer CMV-padrSal-R <400> 15 gacgtcgacg cgcggccgcc ttgagggtcc acgcggccac aaatttcgcc atggt 55 <210> 16 <211> 666 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cDNA coding for CMV-Npadr <400> 16 atggcgaaat ttgtggccgc gtggaccctc aaggcggccg cgcgtcgacg tcgtccgcgt 60 cgtggttccc gctccgcccc ctcctccgcg gatgctaact ttagagtctt gtcgcagcag 120 ctttcgcgac ttaataagac gttagcagct ggtcgtccaa ctattaacca cccaaccttt 180 gtagggagtg aacgctgtaa acctgggtac acgttcacat ctatcaccct aaagccacca 240 aaaatagacc gtgggtctta ttatggtaaa aggttgttat tacctgattc agtcacggaa 300 tatgataaga aacttgtttc gcgcattcaa attcgagtta atcctttgcc gaaatttgat 360 tcaaccgtgt gggtgacagt ccgtaaagtt cctgcctctt cggacttatc cgttgccgcc 420 atttctgcta tgtttgcgga cggagcctca ccggtactgg tttatcagta cgctgcatct 480 ggagtccaag ctaacaacaa actgttgtat gatctttcgg cgatgcgcgc tgatataggc 540 gacatgagaa agtacgccgt cctcgtgtat tcaaaagacg atgcactcga gacagacgag 600 ttagtacttc atgttgacgt cgagcaccaa cgtattccca catctggggt gctcccagtt 660 tgataa 666 <210> 17 <211> 464 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> cDNA His6/TEV/C <400> 17 ccatggccca tcatcaccat catcacgaaa acctgtactt tcaatcccac atggctccaa 60 cgcatcagct gcctccatcc gatgtgcgca agatcattct ggaactccag ccgctcagcc 120 gtggactgtt agaagactac cagaagaaag aaacgggggt cccagaatct aaccgtacgc 180 tgctgctgtg cctgacgagc gatagccagc ctcctcgtct gaacagctcc gcgatcttac 240 cctactttcg tgccatccgc cctctgtccg ataagaatat tattgacaaa atcattgagc 300 aactggataa gctgaaattt cagcacgaac ctgagacgga gattagtgtc ccggcggata 360 cgtttgaatg taagagtttt atcctcacaa ttctccagca attttctgcg tgcttggaat 420 cagtatttaa gtccttaaac agtggaccgc agtgctaact gcag 464 <210> 18 <211> 151 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> cIL-31-His6/TEV/C <400> 18 Met Ala His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser His 1 5 10 15 Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys Ile Ile 20 25 30 Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr Gln Lys 35 40 45 Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu Cys Leu 50 55 60 Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile Leu Pro 65 70 75 80 Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile Asp Lys 85 90 95 Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro Glu Thr 100 105 110 Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe Ile Leu 115 120 125 Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe Lys Ser 130 135 140 Leu Asn Ser Gly Pro Gln Cys 145 150 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer cIL31NATf <400> 19 tacaccatgg cctcccacat ggctccaacg 30 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer cIL31NATr <400> 20 catactgcag ttactgcggt ccactgttta ag 32 <210> 21 <211> 138 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> cIL-31/A <400> 21 Met Ala Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val 1 5 10 15 Arg Lys Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu 20 25 30 Asp Tyr Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu 35 40 45 Leu Leu Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser 50 55 60 Ala Ile Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn 65 70 75 80 Ile Ile Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His 85 90 95 Glu Pro Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys 100 105 110 Ser Phe Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser 115 120 125 Val Phe Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln 130 135 <210> 22 <211> 136 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> cIL31 <400> 22 Ser His Met Ala Pro Thr His Gln Leu Pro Pro Ser Asp Val Arg Lys 1 5 10 15 Ile Ile Leu Glu Leu Gln Pro Leu Ser Arg Gly Leu Leu Glu Asp Tyr 20 25 30 Gln Lys Lys Glu Thr Gly Val Pro Glu Ser Asn Arg Thr Leu Leu Leu 35 40 45 Cys Leu Thr Ser Asp Ser Gln Pro Pro Arg Leu Asn Ser Ser Ala Ile 50 55 60 Leu Pro Tyr Phe Arg Ala Ile Arg Pro Leu Ser Asp Lys Asn Ile Ile 65 70 75 80 Asp Lys Ile Ile Glu Gln Leu Asp Lys Leu Lys Phe Gln His Glu Pro 85 90 95 Glu Thr Glu Ile Ser Val Pro Ala Asp Thr Phe Glu Cys Lys Ser Phe 100 105 110 Ile Leu Thr Ile Leu Gln Gln Phe Ser Ala Cys Leu Glu Ser Val Phe 115 120 125 Lys Ser Leu Asn Ser Gly Pro Gln 130 135 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> artificial Sequence <220> <223> aa 2-28 of SEQ ID NO:1 <400> 23 Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg Arg Arg Pro 1 5 10 15 Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala 20 25 <210> 24 <211> 10 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> palindromic CpG <400> 24 gacgatcgtc 10 <210> 25 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Claims (15)

  1. 개과 동물의 개 아토피성 피부염(CAD)을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물의 유효량이 상기 개과 동물에 투여되고, 상기 조성물은
    (a) 적어도 하나의 제1 부착 부위를 가지는 코어 입자로서, 상기 코어 입자가 바이러스 유사 입자(VLP) 또는 재조합 VLP이고, 상기 VLP가 오이 모자이크 바이러스(CMV)의 변형 VLP이고, 상기 CMV의 변형 VLP가 적어도 하나의 변형 CMV 폴리펩티드를 포함하고, 상기 변형 CMV 폴리펩티드가 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코어입자; 및
    (b) 적어도 하나의 제2 부착 부위를 가지는 개 인터루킨-31 항원(cIL-31 항원)으로서, 상기 cIL-31 항원이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함하는 것인, 적어도 하나의 개 인터루킨-31 항원
    을 포함하고,
    (a) 및 (b)가 상기 적어도 하나의 제1 부착 부위와 상기 적어도 하나의 제2 부착 부위를 통해 적어도 하나의 비펩티드성 공유 결합으로 연결되어 있는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 개과 동물이 반려견인 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물의 상기 투여가 적어도 하나의 CAD 매개변수 또는 증상을 상기 투여 전의 적어도 하나의 CAD 매개변수 또는 증상에 비하여 감소시키는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 적어도 하나의 CAD 매개변수 또는 증상이 피부 병변 또는 가려움증의 수준 또는 중증도 등급인 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피부 병변의 수준 또는 중증도 등급의 감소가 증상 및 병변 스코어 매기기 실험에 의해 결정되는 것인 조성물.
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