JP2022078254A - イヌアトピー性皮膚炎の治療 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/14011—Bromoviridae
- C12N2770/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/14011—Bromoviridae
- C12N2770/14023—Virus like particles [VLP]
Abstract
Description
性もしくはワクチン組成物および医薬組成物に関する。さらに、本発明は、CADを防止
または治療するための方法を提供する。本発明の組成物は、イヌにおいて効率的な免疫応
答、特に抗体応答を誘導し、そのため、CADの治療および/または防止のために有用で
ある。
こされる炎症性、かつそう痒性のアレルギー性皮膚疾患として規定され、全てのイヌの最
大10%までに影響する(Hensel P et al., (2015) BMC
Veterinary Research 11:196-209; Meury S
et al., (2011) Vet Dermatol 22: 327-334;
Nodtvedt A, et al., (2007) Prev Vet Med
78: 210-222)。それは、ノミアレルギーのみが超える、イヌ科、特に飼い
イヌにおける2番目に最も一般的なアレルギー性皮膚病状である。アレルギー性症状は湿
疹性皮膚として現れ、アトピー性皮膚炎を有する飼いイヌなどのイヌ科はしばしば、そう
痒、または激しいかゆみ、脱毛、極端なひっかきからの皮膚の擦りむき、それらの足を頻
繁になめること、および過剰な涙液産生に苦しむ。二次的な皮膚の問題も一般的であり、
皮膚感染および過剰な皮脂分泌が挙げられる。
ある。顔、耳、足、四肢、腹部(ventrum)および屈曲ゾーンが典型的にはそう痒
および紅斑に影響される(Griffin CE, DeBoer DJ (2001)
Veterinary Immunology and Immunopatholo
gy 81: 255-269)。それは典型的には慢性再発性病状であり、ほとんどの
イヌが継続的な、通常一生の療法を必要とする(Nuttall T., et al.
, Veterinary Record (2014) 174 (suppl 2)
, 3-12)。
ジンなどの抗ヒスタミン薬、またはシクロスポリンのような薬物の使用が挙げられる。ヤ
ヌスキナーゼ、またはJAK、阻害剤として知られている最近承認された製品もまた、C
ADに使用可能である(Nuttall T., et al., Veterinar
y Record (2014) 174 (suppl 2), 3-12); WO
2015/042596号)。
性のある著しい副作用を有する。例えば、これらの薬物はイヌ科、例えば飼いイヌの免疫
系を抑制し、それにより、感染に至らしめることがある。コルチコステロイドはまた、イ
ヌ科および飼いイヌにおいて骨粗鬆症、内分泌の問題および白内障を引き起こす可能性が
ある。加えて、コルチコステロイドにより、飼いイヌなどのイヌ科は頻繁に食べ、飲み、
かつ、排尿するようになる傾向があり、これは、ペット所有者により望ましくないと考え
られる。その上、薬物の多くは経口的にかつ毎日与えられなければならず、このため、そ
れらの使用は非常に不便なものとなる。CADはしばしば慢性病状であるので、これらの
安全性および副作用の問題は、安全で有効な長期治療に対する重要な未だ対処されていな
い医学的必要性を作り出す。その上、安全性だけでなく服薬遵守が依然として、さらなる
懸案事項となっている。よって、CADに対する治療選択肢が必要とされたままである。
本発明はこの要求を満たす。
またはカニス・ファミリアーリス)、およびそのファミリーの他のメンバーにおけるアト
ピー性皮膚炎の防止および治療のための組成物を提供する。特に、本発明は、イヌアトピ
ー性皮膚炎(CAD)の防止および治療のための組成物およびその使用を提供し、ここで
、好ましい発明の組成物は、Th細胞エピトープ、特にユニバーサルTh細胞エピトープ
の組み込みにより改変された植物ウイルスキュウリモザイクウイルス(CMV)のウイル
ス様粒子上で提示されるイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含む。
さらに、これらの改変VLPは、cIL-31に対する免疫応答、特に抗体応答を生成さ
せるためのワクチンとして機能する。Th細胞エピトープ、特にユニバーサルTh細胞エ
ピトープの存在は、生成された免疫応答におけるさらなる増加、よって、CADの防止お
よび治療のための有益な効果につながる。
よび症状の効率的な低減につながる。特に、本発明の組成物のイヌ科、特に飼いイヌへの
投与は、イヌ科、特に飼いイヌの血液および皮膚における自己抗体の誘導およびインター
ロイキン31レベルの低減につながるだけでなく、さらに、cIL-31レベルの前記低
減はCAD疾患症状の低減と相関する。その上、本発明の組成物のイヌ科、特に飼いイヌ
への投与はCADに罹患したイヌのかゆみの低減および皮膚病変の重症度グレードの効率
的な低減につながる。
数(Atopic Dermatitis Lesion Index)、またはADL
I、およびそう痒ビジュアルアナログスケール、またはPVASの低下が得られる。AD
LIスコアは、5つの特定の身体領域において評価されたイヌアトピー性皮膚炎と関連す
る6つの臨床症状の検証された複合指数である。各特定された身体領域で、各パラメータ
がスコアラーにより0から5までスコア化され、0のスコアは、病変なしとして規定され
、5のスコアは重篤/広範な病変として規定される。PVASはスコアラーにより、0~
10アナログスケールを用いてスコア化され、0のスコアはそう痒/咀嚼なしを表し、1
0のスコアは絶え間ないおよび激烈なそう痒/咀嚼に相当する。
与えると考えられる。CADでは、Th2極性化および微生物の存在の組み合わせが、免
疫細胞、ケラチノサイトによる炎症およびそう痒、およびかゆみを引き起こす直接神経刺
激を駆動するcIL-31媒介効果につながる可能性があると考えられる。イヌ科、例え
ば、特に飼いイヌにおける本発明の組成物および方法によるcIL-31に対して誘導さ
れた自己抗体は、よって、cIL-31のレベルを低減させ、よって、かゆみ、その結果
として、イヌのひっかきを低減させ、ひっかきの下流イベント(炎症および感染を含む)
を全て阻止することにより、CADに対してプラスの影響を有する。
膚炎(CAD)を防止または治療する方法において使用するための組成物を提供し、ここ
で、有効量の前記組成物が前記イヌ科、好ましくは前記飼いイヌに投与され、ここで、前
記組成物は(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するコア粒子;および(b)少な
くとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原
(cIL-31抗原)を含み、ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:
22から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22
と少なくとも90%、好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%
、重ねてさらに好ましくは少なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有する
タンパク質を含み、または好ましくは、これから構成され;ここで、(a)および(b)
は、前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、
少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される。
VLPである。さらに好ましい実施形態では、前記VLPはキュウリモザイクウイルス(
CMV)の改変VLPであり、ここで、CMVの前記改変VLPは、少なくとも1つの改
変CMVポリペプチドを含み、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成され、
ここで、前記改変CMVポリペプチドは、(a)CMVポリペプチド、および(b)ヘル
パーT細胞エピトープを含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、前記CMV
ポリペプチドは、(i)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列;または(ii)変異
アミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、変異されるアミノ酸
配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、ここで、前記変異アミノ酸配列
およびCMVの前記コートタンパク質は少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%
、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同
一性を示す。さらに非常に好ましい実施形態では、前記CMVポリペプチドは、(a)C
MVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID
NO:1を含み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または(b)S
EQ ID NO:1の少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ま
たは好ましくはこれから構成され;ならびにここで、この請求項で(a)または(b)に
おいて規定される前記アミノ配列はSEQ ID NO:23を含み;またはここで、こ
の請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はアミノ酸配列領域を
含み、ここで、前記アミノ酸配列領域はSEQ ID NO:23と少なくとも90%の
配列同一性を有する。さらに非常に好ましい実施形態では、前記VLPはキュウリモザイ
クウイルス(CMV)の改変VLPであり、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、S
EQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ま
しくはこれから構成される。
から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成さ
れる:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SE
Q ID NO:22;または(d)SEQ ID NO:25-30。さらに非常に好
ましい実施形態では、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるア
ミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される:(a)SE
Q ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ ID NO:
22;(d)SEQ ID NO:25または(e)SEQ ID NO:26。さらに
非常に好ましい実施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、
好ましくは前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-
アセチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好ましい実
施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは前記ス
ルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
ワクチン組成物を提供し、ここで、好ましくは前記免疫原性もしくはワクチン組成物は、
アジュバントをさらに含む。
または発明の免疫原性もしくはワクチン組成物;および(b)薬学的に許容される担体。
成物、発明の免疫原性もしくはワクチン組成物または発明の医薬組成物をヒトに投与する
ことを含む。
原性もしくはワクチン組成物、または発明の医薬組成物を提供する。
は治療の方法において使用するための、発明の組成物、発明の免疫原性もしくはワクチン
組成物、または発明の医薬組成物を提供し、ここで、有効量の、前記発明の組成物、前記
発明の免疫原性もしくはワクチン組成物、または前記発明の医薬組成物が前記飼いイヌに
投与される。好ましくは、前記発明の組成物、前記発明の免疫原性もしくはワクチン組成
物、または前記発明の医薬組成物の前記投与は、前記投与前の少なくとも1つの症状と比
較すると、前記イヌアトピー性皮膚炎(CAD)の少なくとも1つの症状を低減させる。
は治療の方法を提供し、ここで、前記方法は、有効量の、前記発明の組成物、前記発明の
免疫原性もしくはワクチン組成物、または前記発明の医薬組成物を前記飼いイヌに投与す
ることを含む。
療のための薬剤の製造のための、前記発明の組成物、前記発明の免疫原性もしくはワクチ
ン組成物、または前記発明の医薬組成物の使用を提供し、ここで、典型的にかつ好ましく
は、有効量の、前記発明の組成物、前記発明の免疫原性もしくはワクチン組成物、または
前記発明の医薬組成物が前記飼いイヌに投与される。
療する方法において使用するための組成物を提供し、ここで、有効量の前記組成物が前記
飼いイヌに投与され、ここで、前記組成物は(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有
するコア粒子であって、前記コア粒子は好ましくはウイルス様粒子(VLP)、さらに好
ましくは組換えVLPである、コア粒子;および(b)少なくとも1つの第2の付着部位
を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含み
、ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配
列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好まし
くは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少
なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好
ましくはこれから構成され;ここで、(a)および(b)は、前記少なくとも1つの第1
のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、少なくとも1つの非ペプチド共
有結合を介して連結される。
ス様粒子(VLP);(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つの
イヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含む組成物を提供し、ここで、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有する
タンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少なく
とも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも9
8%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこ
れから構成され、重ねてさらに好ましくは、前記抗原は、SEQ ID NO:22のア
ミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、(a
)および(b)は、前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着
部位によって、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される。
)の改変VLPであり、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:
6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成
される。
から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成さ
れる:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SE
Q ID NO:22;または(d)SEQ ID NO:25-30。さらに非常に好
ましい実施形態では、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるア
ミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される:(a)SE
Q ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ ID NO:
22;(d)SEQ ID NO:25または(e)SEQ ID NO:26。さらに
非常に好ましい実施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、
好ましくは前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-
アセチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好ましい実
施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは前記ス
ルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
う。
明が属する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
は、非複製的なもしくは非感染性の、好ましくは非複製的なかつ非感染性のウイルス粒子
を示し、または、非複製的なもしくは非感染性の、好ましくはウイルス粒子に似ている非
複製的なかつ非感染性の構造、好ましくはウイルスのカプシドを示す。「非複製的な」と
いう用語は、本明細書では、VLPにより含まれるゲノムを複製することができないこと
を示す。「非感染性」という用語は、本明細書では、宿主細胞に入ることができないこと
を示す。発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全てまたは一
部を欠いているので、非複製的かつ非感染性である。発明によるウイルス様粒子は、それ
らのゲノムとは異なる核酸を含み得る。組換えにより生成されたウイルス様粒子は典型的
には、宿主細胞由来RNAを含む。本発明によるウイルス様粒子の典型的な、かつ好まし
い実施形態は、発明のポリペプチドからなるウイルスカプシドである。ウイルス様粒子は
、典型的には、1つのウイルス様粒子あたり、60、120、180、240、300、
360、または360超のタンパク質サブユニットを含むウイルスコートタンパク質から
なる、典型的には、巨大分子集合体である。典型的にかつ好ましくは、これらのサブユニ
ットの相互作用は、固有の繰り返し組織を有するウイルスカプシドまたはウイルス-カプ
シド様構造の形成につながる。ウイルス様粒子の1つの特徴は、そのサブユニットのその
高度に秩序化された反復配列である。
語は、少なくとも1つのCMVポリペプチドを含む、または好ましくはこれから本質的に
構成される、または好ましくはこれから構成されるウイルス様粒子を示す。好ましくは、
CMVのウイルス様粒子は、カプシド構造の主要タンパク質成分として、さらにいっそう
好ましくは単独タンパク質成分として前記CMVポリペプチドを含む。典型的にかつ好ま
しくは、CMVのウイルス様粒子はCMVのカプシドの構造に類似する。CMVのウイル
ス様粒子は、非複製的および/または非感染性であり、少なくともCMVの複製機構をコ
ードする1つまたは複数の遺伝子を欠き、典型的には、宿主へのウイルス付着またはこの
中への侵入に関与する1つまたは複数のタンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子
も欠く。この定義はまた、前記1つまたは複数の遺伝子が依然として存在するが、不活性
であるウイルス様粒子を含む。CMVのウイルス様粒子を非複製的および/または非感染
性にする好ましい方法は、物理的または化学的不活性化によるものであり、例えばUV照
射、ホルムアルデヒド処理である。好ましくは、CMVのVLPは、CMVの複製機構を
コードする1つまたは複数の遺伝子を欠き、また、宿主へのウイルス付着またはこの中へ
の侵入に関与する1つまたは複数のタンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子を欠
く。重ねてより好ましくは、非複製的および/または非感染性ウイルス様粒子は、組換え
遺伝子技術により得られる。本発明による、組換えにより生成されたCMVのウイルス様
粒子は、典型的にかつ好ましくはウイルスゲノムを含まない。しばしばモザイクVLPと
呼ばれる、1を超える種のポリペプチドを含むウイルス様粒子もまた、本発明により包含
される。よって、1つの実施形態では、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも2つ
の異なる種のポリペプチドを含み、ここで、ポリペプチドの前記種の少なくとも1つはC
MVポリペプチドである。好ましくは、CMVのVLPは、典型的には1VLPあたり1
80のコートタンパク質サブユニットを含むCMVコートタンパク質からなる巨大分子集
合体である。典型的にかつ好ましくは、CMVのVLPは、本明細書では、下記を含む、
または好ましくはこれから構成される少なくとも1つのCMVポリペプチドを含み、これ
から本質的に構成され、あるいはこれから構成され:(i)CMVのコートタンパク質の
アミノ酸配列;または(ii)変異アミノ酸配列、ここで、変異されるアミノ酸配列はC
MVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、ここで、前記変異アミノ酸配列および前
記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに
好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示
す。
結合としても知られている)により直線連結されたアミノ酸モノマからなるポリマを示す
。ポリペプチドという用語は、アミノ酸の連続した鎖を示し、生成物の特定の長さは示さ
ない。よって、ペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含められる。
MV)ポリペプチド」という用語は、本明細書では、下記を含む、または好ましくはこれ
から構成されるポリペプチドを示し:(i)キュウリモザイクウイルス(CMV)のコー
トタンパク質のアミノ酸配列、または(ii)変異アミノ酸配列、ここで、変異されるア
ミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、ここで、前記変異アミノ
酸配列および前記変異されるアミノ酸配列、すなわちCMVの前記コートタンパク質は、
少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、
重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す。典型的にかつ好ましくは、
CMVポリペプチドは、自己組織化により発現で、CMVのウイルス様粒子を形成するこ
とができる。
クウイルス(CMV)のコートタンパク質(CP)」という用語は、本明細書では、本質
的に起こるキュウリモザイクウイルスのコートタンパク質を示す。キュウリモザイクウイ
ルスの非常に広い宿主範囲のために、CMVの多くの異なる株および分離株が知られてお
り、前記株および分離株のコートタンパク質の配列は決定されており、よって、同様に当
業者に知られている。CMVの前記コートタンパク質(CP)の配列は公知のデータベー
ス、例えば、Genbank、www.dpvweb.net、またはwww.ncbi
.nlm.nih.gov/protein/に記載されており、そこから検索すること
ができる。例はEP出願番号第14189897.3号に記載される。CMVコートタン
パク質のさらなる例がSEQ ID NO1-3で提供される。これらの株および分離株
はコートタンパク質のN末端を含む異なるタンパク質ドメインで、高度に類似するコート
タンパク質配列を有することは注目すべきである。特に、全ての完全に配列決定されたC
MV分離株の98.1%がそれらのコートタンパク質配列の最初の28アミノ酸内で85
%を超える配列同一性を共有し、全ての完全に配列決定されたCMV分離株のさらに79
.5%がそれらのコートタンパク質配列の最初の28アミノ酸内で90%を超える配列同
一性を共有する。
己組織化により発現で、CMVのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、
本発明のために使用されるCMVのコートタンパク質は、大腸菌における自己組織化によ
り発現で、CMVのウイルス様粒子を形成することができる。
ザイクウイルス(CMV)の改変ウイルス様粒子(VLP)」という用語は、本明細書で
は、少なくとも1つの改変CMVポリペプチドを含む、または好ましくはこれから本質的
に構成される、または好ましくはこれから構成されるような改変物であるCMVのVLP
を示し、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、CMVポリペプチド、およびヘルパー
T細胞エピトープを含み、または好ましくはこれから構成される。典型的にかつ好ましく
は、前記ヘルパーT細胞エピトープは、(i)前記CMVポリペプチドのN末端に融合さ
れ、(ii)前記CMVポリペプチドのC末端に融合され、(iii)前記CMVポリペ
プチドの連続アミノ酸の領域にとって代わり、ここで、前記CMVポリペプチドの連続ア
ミノ酸の前記置き換えられた領域とヘルパーT細胞エピトープの間の配列同一性は少なく
とも15%、好ましくは少なくとも20%であり、または(iv)前記CMVポリペプチ
ドのN末端領域にとって代わり、ここで、前記CMVポリペプチドの前記置き換えられた
N末端領域は5~15の連続アミノ酸から構成される。好ましくは、前記ヘルパーT細胞
エピトープは前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって代わり、ここで、前記CMV
ポリペプチドの前記置き換えられたN末端領域は5~15の連続アミノ酸、好ましくは9
~14の連続アミノ酸、より好ましくは11~13の連続アミノ酸、最も好ましくは11
、12または13の連続アミノ酸から構成される。好ましくは本発明のCMVの前記改変
VLPは、CMVの組換え改変VLPである。
本明細書で規定されるように、前記改変CMVポリペプチドは、CMVポリペプチド、お
よびヘルパーT細胞エピトープを含み、または好ましくはこれから構成されるように改変
されたCMVポリペプチドを示す。典型的には、改変CMVポリペプチドは、自己組織化
により発現で、CMVのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、改変CM
Vポリペプチドは組換え改変CMVポリペプチドであり、大腸菌における自己組織化によ
り発現で、CMVのウイルス様粒子を形成することができる。
、本明細書では、前記CMVポリペプチドのN末端、特にCMVのコートタンパク質のN
末端、または前記CMVポリペプチドまたはCMVの前記コートタンパク質のN末端であ
るが、前記CMVポリペプチドまたは前記コートタンパク質がN末端メチオニン残基を含
む場合、前記CMVポリペプチドまたはCMVの前記コートタンパク質のN末端の第2の
アミノ酸で始まる領域のいずれかを示す。好ましくは、前記CMVポリペプチドまたは前
記コートタンパク質がN末端メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、メチオニン
をコードする開始コドンは通常欠失され、Th細胞エピトープのN末端に付加される。さ
らに好ましくは、1、2または3つの追加のアミノ酸、好ましくは1つのアミノ酸が、ク
ローニング目的のために、任意で、開始メチオニンとTh細胞エピトープの間に挿入され
得る。「CMVポリペプチドまたはCMVコートタンパク質の変異アミノ酸配列のN末端
領域」という用語は、本明細書では、前記CMVポリペプチドまたはCMVの前記コート
タンパク質の前記変異アミノ酸配列のN末端、または、前記CMVポリペプチドまたはC
MVの前記コートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のN末端であるが、前記変異アミノ
酸配列がN末端メチオニン残基を含む場合、前記CMVポリペプチドまたはCMVの前記
コートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のN末端の第2のアミノ酸で始まる領域のいず
れかを示す。好ましくは、前記CMVポリペプチドまたは前記コートタンパク質がN末端
メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、メチオニンをコードする開始コドンは通
常欠失され、Th細胞エピトープのN末端に付加される。さらに好ましくは、1、2また
は3つの追加のアミノ酸、好ましくは1つのアミノ酸が、クローニング目的のために、任
意で開始メチオニンとTh細胞エピトープの間に挿入され得る。
NA技術の少なくとも1つのステップを含むプロセスにより得られるポリペプチドを示す
。典型的にかつ好ましくは、組換えポリペプチドは原核生物発現系において生成される。
大腸菌などの原核生物発現系において発現される組換えにより生成されたポリペプチドは
、N末端メチオニン残基を含み得ることは当業者には明らかである。N末端メチオニン残
基は典型的には、発現宿主において、組換えポリペプチドの成熟中に組換えポリペプチド
から切断される。しかしながら、N末端メチオニンの切断は不完全である可能性がある。
よって、組換えポリペプチドの調製物は、N末端メチオニン残基を有する、および有さな
い、他の部分は同一であるポリペプチドの混合物を含み得る。典型的にかつ好ましくは、
組換えポリペプチドの調製物は、10%未満、より好ましくは5%未満、さらにより好ま
しくは1%未満の、N末端メチオニン残基を有する組換えポリペプチドを含む。
A技術の少なくとも1つのステップを含むプロセスにより得られる、以上で規定されるC
MVポリペプチドを示す。典型的にかつ好ましくは、組換えCMVポリペプチドの調製物
は、10%未満、より好ましくは5%未満、さらにより好ましくは1%未満の、N末端メ
チオニン残基を有する組換えCMVポリペプチドを含む。その結果として、発明の組換え
ウイルス様粒子は、N末端メチオニン残基を有する、および有さない、他の部分は同一で
ある組換えポリペプチドを含み得る。
換えDNA技術の少なくとも1つのステップを含むプロセスにより得られる、以上で規定
される改変CMVポリペプチドを示す。典型的にかつ好ましくは、組換え改変CMVポリ
ペプチドの調製物は、10%未満、より好ましくは5%未満、さらにより好ましくは1%
未満の、N末端メチオニン残基を有する組換え改変CMVポリペプチドを含む。その結果
として、発明の組換えウイルス様粒子は、N末端メチオニン残基を有する、および有さな
い、他の部分は同一である組換えポリペプチドを含み得る。
換えDNA技術の少なくとも1つのステップを含むプロセスにより得られるウイルス様粒
子(VLP)を示す。典型的にかつ好ましくは、組換えウイルス様粒子は、少なくとも1
つの組換えポリペプチド、好ましくは組換えCMVポリペプチドまたは組換え改変CMV
ポリペプチドを含む。最も好ましくは、組換えウイルス様粒子は、組換えCMVポリペプ
チドまたは組換え改変CMVポリペプチドからなり、またはこれから構成される。結果と
して、本発明との関連で、発明の組換えVLPの定義がN末端メチオニン残基を含む特定
のアミノ酸配列に関連して達成される場合、これらの発明の組換えVLPの範囲は、前記
N末端メチオニン残基を有さない前記特定のアミノ酸配列により形成されるVLP、同様
に、典型的には、本明細書で示される少量であっても、前記N末端メチオニンを有する前
記特定のアミノ酸配列により形成されるVLPを包含する。さらに、発明の組換えVLP
の定義がN末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列に関連して達成される場合、依
然として前記N末端メチオニン残基を含むアミノ酸配列およびN末端メチオニン残基を欠
くアミノ酸配列の両方を含むVLPが包含される。
異されるアミノ酸配列に導入することにより得られるアミノ酸配列を示す。発明との関連
で、前記変異されるアミノ酸配列は、典型的にかつ好ましくはCMVのコートタンパク質
のアミノ酸配列である。よって、変異アミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ
酸配列と、少なくとも1つのアミノ酸残基が異なり、ここで、前記変異アミノ酸配列およ
び前記変異されるアミノ酸配列は少なくとも90%の配列同一性を示す。典型的にかつ好
ましくは、前記変異アミノ酸配列および前記変異されるアミノ酸配列は少なくとも91%
、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一
性を示す。好ましくは、前記変異アミノ酸配列および前記変異される配列は、せいぜい1
1、10、9、8、7、6、4、3、2、または1つのアミノ酸残基が異なり、ここで、
さらに好ましくは前記違いは挿入、欠失およびアミノ酸交換から選択される。好ましくは
、変異アミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも1つのア
ミノ酸が異なり、ここで、好ましくは前記違いはアミノ酸交換である。
の位置は、配列アライメントにより、典型的にかつ好ましくは、BLASTPアルゴリズ
ムを使用する、最も好ましくは標準設定を使用することにより同定することができる。典
型的かつ好ましい標準設定は下記である:予想閾値(expect threshold
):10;ワードサイズ(word size):3;クエリーレンジにおける最大一致
(max matches in a query range):0;マトリックス:
BLOSUM62;ギャップコスト:存在11、拡張1;組成調節:条件的組成スコアマ
トリックス調節。
基づき決定される。配列同一性を決定するためのアルゴリズムは当業者に入手可能である
。好ましくは、2つのアミノ酸配列の配列同一性は公的に入手可能なコンピュータ相同性
プログラム、例えば、「BLAST」プログラム(http://blast.ncbi
.nlm.nih.gov/Blast.cgi)または「CLUSTALW」(htt
p://www.genome.jp/tools/clustalw/)を用いて、こ
こでは、好ましくはhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/B
last.cgiのNCBIホームページで提供される「BLAST」プログラムにより
、その中で提供されるデフォルト設定を用いて決定される。典型的かつ好ましい標準設定
は下記である:予想閾値(expect threshold):10;ワードサイズ(
word size):3;クエリーレンジにおける最大一致:0;マトリックス:BL
OSUM62;ギャップコスト:存在11、拡張1;組成調節:条件的組成スコアマトリ
ックス調節。
の、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による、好ましくは、別のタンパク
質原性アミノ酸残基による交換を示す。よって、アミノ酸の挿入または欠失と対照的に、
アミノ酸交換は前記アミノ酸配列のアミノ酸の総数を変化させない。発明との関連で、前
記変異されるアミノ酸配列の、リジン残基またはシステイン残基によるアミノ酸残基の交
換が非常に好ましい。
連続部分を示し、ここで、前記部分はMHC分子という関係の中で、抗体により、または
T-細胞受容体により特異的に結合させることができる。抗体に関しては、特異的結合は
非特異的結合を排除するが、必ずしも交差反応性を排除しない。エピトープは典型的には
、抗原部位に独特である空間的立体構造で5-20のアミノ酸を含む。
語は、本明細書では、ヘルパーTh細胞により認識できるエピトープを示す。別の好まし
い実施形態では、前記ヘルパーT細胞エピトープはユニバーサルヘルパーT細胞エピトー
プである。
、本明細書では、少なくとも1つ、好ましくは1を超えるMHCクラスII分子に結合す
ることができるTh細胞エピトープを示す。ペプチド配列がユニバーサルTh細胞エピト
ープであるかどうかを決定する最も簡単な方法は、ペプチドの個々のMHCクラスII分
子に結合する能力を測定することである。ペプチドが、公知のTh細胞エピトープペプチ
ドのMHCクラスII分子への結合と競合する能力により測定され得る。HLA-DR分
子の代表的な選択が、例えばAlexander J, et al., Immuni
ty (1994) 1:751-761に記載される。MHCクラスII分子に対する
Th細胞エピトープの親和性は少なくとも10-5Mでなければならない。Th細胞エピ
トープの「ユニバーサリティ」を決定する、他の、より退屈であるが、より関連性もある
方法は、より大きな割合の人々(>30%)が、IFAで製剤化されたTh細胞エピトー
プを含むタンパク質を用いた1ヶ月後の、免疫化およびブースティングで、測定可能なT
細胞応答を生成させるという証明である。異なる個体中に存在するMHCクラスII分子
の代表集団は、Panina-Bordignon P, et al., Eur J
Immunol (1989) 19:2237-2242において与えられる。結果
として、「ユニバーサルTh細胞エピトープ」という用語は、本明細書では、好ましくは
、Panina-Bordignon P, et al., Eur J Immun
ol (1989) 19:2237-2242において記載されるように、個体の選択
された群の30%超において、免疫化およびブースティング(1ヶ月後、IFAで製剤化
されたTh細胞エピトープを含むタンパク質を用いて)で測定可能なT細胞応答を生成さ
せるTh細胞エピトープを示す。その上、かつ重ねてさらに好ましくは、「ユニバーサル
Th細胞エピトープ」という用語は、本明細書では、好ましくは、DR1、DR2w2b
、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR
2w2aから選択される;好ましくはDR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14
、DR5、DR7、DRw53、DR2w2aから選択される、少なくとも1つ、好まし
くは少なくとも2つ、さらにいっそう好ましくは少なくとも3つのDRアレルに、少なく
とも500nMの親和性で結合することができるTh細胞エピトープを示し(Alexa
nder J, et al., Immunity (1994) 1:751-76
1および本明細書で引用される参考文献において記載される);前記親和性を評価するた
めの好ましい結合アッセイはSette A, et al., J Immunol
(1989) 142:35-40により記載されるものである。さらに重ねてより好ま
しい様式では、「ユニバーサルTh細胞エピトープ」という用語は、本明細書では、DR
1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w
2aから選択される少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、さらにいっそう好まし
くは少なくとも3つのDRアレルに、少なくとも500nMの親和性で結合することがで
きるTh細胞エピトープを示し(Alexander J, et al., Immu
nity (1994) 1:751-761および本明細書で引用される参考文献にお
いて記載される);前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイはSette A
, et al., J Immunol (1989) 142:35-40により記
載されるものである。
., Immunity (1994) 1:751-761、Panina-Bord
ignon P, et al., Eur J Immunol (1989) 19
:2237-2242、Calvo-Calle JM, et al., J Imm
unol (1997) 159:1362-1373、およびValmori D,
et al., J Immunol (1992) 149:717-721により記
載され、当業者に公知である。
激剤または宿主においてデポーの生成を可能にする物質を示し、それは、本発明の、それ
ぞれ、ワクチンおよび医薬組成物と組み合わせると、さらにいっそう増強された免疫応答
を提供することができる。好ましいアジュバントはフロイント完全および不完全アジュバ
ント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム、および改変ムラ
ミルジペプチドである。さらに好ましいアジュバントは、ミネラルゲル、例えば水酸化ア
ルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオ
ン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノー
ル、およびヒトアジュバント、例えばBCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバ
クテリウム・パルバムである。そのようなアジュバントはまた当技術分野でよく知られて
いる。本発明の組成物と共に投与することができるさらなるアジュバントとしては、モノ
ホスホリルリピド免疫調節物質、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、C
RL1005、アルミニウム塩(Alum)、MF-59、OM-174、OM-197
、OM-294、およびVirosomalアジュバント技術が挙げられるが、それらに
限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含む。ウイルス様粒子は、
一般にアジュバントとして記載されてきた。しかしながら、「アジュバント」という用語
は、本出願の関係の中で使用されるように、発明のウイルス様粒子ではないアジュバント
を示す。むしろ、「アジュバント」は、発明の組成物、ワクチンまたは医薬組成物の追加
の異なる成分を示す。
必要な、または十分な量を示す。組成物、あるいは医薬組成物の有効量は、この選択され
た結果を達成する量であり、そのような量は当業者によりルーチンとして決定することが
できる。好ましくは、「有効量」という用語は、本明細書では、cIL-31のレベルを
イヌにおいてかゆみの低減を引き起こし、CADを改善するレベルまで低減させるのに有
効となるのに必要な、または十分な量を示す。好ましくは、「有効量」という用語は、本
明細書では、炎症の部位で、cIL-31の活性を中和するのに有効となるのに必要な、
または十分な量を示す。有効量は、投与される特定の組成物および被験体のサイズによっ
て変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく本発明の特定の組成物の有効
量を経験的に決定することができる。
」という用語は、予防および/または療法を示す。1つの実施形態では、「治療」、「治
療する」、「治療された」または「治療している」という用語は、治療的処置を示す。別
の実施形態では、「治療」、「治療する」、「治療された」または「治療している」とい
う用語は、予防的処置を示す。
に天然に生じ、またはウイルス様粒子に人工的に付加された要素を示し、これに、第2の
付着部位が連結され得る。第1の付着部位は好ましくはタンパク質、ポリペプチド、アミ
ノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然もしくは合成ポリマ、二次代謝産物または
化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化
フェニルメチルスルホニル)、または化学的反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、
スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、またはそれらの
組み合わせである。第1の付着部位である化学的反応基の好ましい実施形態は、アミノ酸
残基、好ましくは、リジン残基のアミノ基である。第1の付着部位は、典型的には、表面
上、好ましくはVLPの外面上に位置する。複数の第1の付着部位が表面、好ましくはV
LPの外面上に、典型的には反復配置で存在する。好ましい実施形態では、第1の付着部
位は、少なくとも1つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも1つのペプチド結合を
介して、VLPと結合される。さらに好ましい実施形態では、第1の付着部位はVLPと
共に天然に生じる。あるいは、好ましい実施形態では、第1の付着部位は、VLPに人工
的に付加される。非常に好ましい実施形態では、前記第1の付着部位は、前記VLPポリ
ペプチドのアミノ酸配列のリジン残基のアミノ基である。
共に天然に生じ、またはこれに人工的に付加される要素を示し、これに、第1の付着部位
が連結され得る。cIL-31抗原の第2の付着部位は好ましくはタンパク質、ポリペプ
チド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然もしくは合成ポリマ、二次代謝
産物または化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオ
ン、フッ化フェニルメチルスルホニル)、または化学的反応基、例えばアミノ基、カルボ
キシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、また
はそれらの組み合わせである。第2の付着部位である化学的反応基の好ましい実施形態は
スルフヒドリル基であり、好ましくはアミノ酸システインのスルフヒドリル基であり、最
も好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。そのため、「少なくとも1つの
第2の付着部位を有する抗原」または「少なくとも1つの第2の付着部位を有するcIL
-31抗原」という用語は、cIL-31抗原および少なくとも1つの第2の付着部位を
含むコンストラクトを示す。しかしながら、特に、cIL-31抗原内の天然起源ではな
い第2の付着部位では、そのようなコンストラクトは、典型的にかつ好ましくは、「リン
カー」をさらに含む。別の好ましい実施形態では、第2の付着部位は、少なくとも1つの
共有結合を介して、好ましくは少なくとも1つのペプチド結合を介して、cIL-31抗
原と結合される。さらなる実施形態では、第2の付着部位はcIL-31抗原内で天然に
生じる。別のさらに非常に好ましい実施形態では、第2の付着部位は、cIL-31抗原
にリンカーを介して人工的に付加され、ここで、前記リンカーは、システインを含み、あ
るいはこれから構成される。好ましくは、リンカーは、ペプチド結合によりcIL-31
抗原に融合され、または化学結合により付加される。
、少なくとも1つの第1の付着部位および少なくとも1つの第2の付着部位が一緒にされ
る、全ての可能な様式、好ましくは化学的相互作用を示す。化学的相互作用としては、共
有および非共有結合性相互作用が挙げられる。非共有結合性相互作用の典型的な例は、イ
オン性相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、一方、共有結合性相互作用は、
例として、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、炭素-リン結合、炭
素-硫黄結合、例えばチオエーテル、またはイミド結合に基づく。ある一定の好ましい実
施形態では、第1の付着部位および第2の付着部位は、少なくとも1つの共有結合を介し
て、好ましくは少なくとも1つの非ペプチド結合を介して、さらにいっそう好ましくは、
排他的に非ペプチド結合(複数可)を介して連結される。しかしながら、「連結された」
という用語は、本明細書では、少なくとも1つの第1の付着部位および少なくとも1つの
第2の付着部位の直接連結を示すだけでなく、その代わりに、かつ好ましくは、少なくと
も1つの第1の付着部位および少なくとも1つの第2の付着部位の、中間分子(複数可)
を介する、これによって、典型的にかつ好ましくは、少なくとも1つの、好ましくは1つ
の、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによる間接連結を示す。他の好ましい実施形態
では、第1の付着部位および第2の付着部位は、少なくとも1つの共有結合を介して、好
ましくは少なくとも1つのペプチド結合を介して、さらにいっそう好ましくは、排他的に
ペプチド結合(複数可)を介して連結される。
させるか、または、すでに、第2の付着部位を含んでいる、これから本質的に構成される
、またはこれから構成される。好ましくは、「リンカー」は、本明細書では、すでに第2
の付着部位を、典型的にかつ好ましくは-必ずしもではないが-1つのアミノ酸残基とし
て、好ましくはシステイン残基として含む。好ましいリンカーはアミノ酸リンカー、すな
わち少なくとも1つのアミノ酸残基を含むリンカーである。アミノ酸リンカーという用語
は、そのようなリンカーが排他的にアミノ酸残基から構成されることを意味しない。しか
しながら、排他的にアミノ酸残基から構成されるリンカーは発明の好ましい実施形態であ
る。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは、当技術分野で知られている天然アミノ酸ま
たは非天然アミノ酸、全て-Lまたは全て-Dまたはそれらの混合物からなる。この発明
によるリンカーのさらに好ましい実施形態はスルフヒドリル基またはシステイン残基を含
む分子であり、そのため、そのような分子もまた、この発明内に包含される。リンカーと
cIL-31抗原との結合は好ましくは少なくとも1つの共有結合による、より好ましく
は少なくとも1つのペプチド結合による。
かつ好ましくは、それぞれ、コア粒子およびVLPに関する前記抗原の空間配置における
高次の均一性により特徴付けられるcIL-31抗原の反復パターンを示す。発明の1つ
の実施形態では、反復パターンは幾何的パターンであってもよい。好ましい秩序反復抗原
アレイは、その上、cIL-31抗原の厳密反復準結晶秩序を有し、好ましくは、間隔は
1~30ナノメートル、好ましくは2~15ナノメートル、さらにいっそう好ましくは2
~10ナノメートル、さらに重ねてより好ましくは2~8ナノメートル、さらにより好ま
しくは1.6~7ナノメートルである。
および/または増強することができる物質を示す。免疫賦活物質としては、本明細書では
、トール様受容体活性化物質およびサイトカイン分泌を誘導する物質が挙げられるが、そ
れらに限定されない。トール様受容体活性化物質としては、免疫賦活性核酸、ペプチドグ
リカン、リポ多糖、リポテイコ酸(lipoteichonic acid)、イミダゾ
キノリン化合物、フラゲリン、リポタンパク質、および免疫賦活性有機物質、例えばタキ
ソールが挙げられるが、それらに限定されない。
応答を誘導する、および/または増強することができる核酸を示す。免疫賦活性核酸はリ
ボ核酸、特にデスオキシリボ核酸を含み、ここで、リボ核酸およびデスオキシリボ核酸は
どちらも、二本鎖または一本鎖のいずれかであってもよい。好ましいISS-NAはデス
オキシリボ核酸であり、ここで、さらに好ましくは前記デスオキシリボ核酸は一本鎖であ
る。好ましくは、免疫賦活性核酸は、非メチル化Cを含む、少なくとも1つのCpGモチ
ーフを含む。非常に好ましい免疫賦活性核酸は少なくとも1つのCpGモチーフを含み、
ここで、前記少なくとも1つのCpGモチーフは、少なくとも1つの、好ましくは1つの
、CGジヌクレオチドを含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、Cはメチル
化されていない。好ましくは、必ずしもではないが、前記CGジヌクレオチドは、パリン
ドローム配列の一部である。免疫賦活性核酸という用語はまた、修飾塩基、好ましくは4
-ブロモ-シトシンを含む核酸を示す。発明との関連で特に好ましいのは、樹状細胞にお
けるIFN-α産生を刺激することができるISS-NAである。発明の目的のために有
用な免疫賦活性核酸は、例えば、WO2007/068747A1号において記載される
。
のヌクレオチド、好ましくは約6~約200のヌクレオチド、より好ましくは20~約1
00のヌクレオチド、最も好ましくは20~40のヌクレオチドを含む核酸配列を示す。
非常に好ましくは、オリゴヌクレオチドは約30のヌクレオチドを含み、より好ましくは
オリゴヌクレオチドは、正確に30のヌクレオチドを含み、最も好ましくはオリゴヌクレ
オチドは正確に30のヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはポリリボヌク
レオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは下記から選択される:
(a)未修飾RNAまたはDNA、および(b)修飾RNAまたはDNA。修飾物は、バ
ックボーンまたはヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドは好ましくは下記
からなる群より選択される:(a)一本鎖および二本鎖DNA、(b)一本鎖および二本
鎖領域の混合物であるDNA、(c)一本鎖および二本鎖RNA、(d)一本鎖および二
本鎖領域の混合物であるRNA、および(e)一本鎖、より好ましくは、二本鎖または一
本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子。好ま
しいヌクレオチド修飾物/類似体は下記からなる群より選択される:(a)ペプチド核酸
、(b)イノシン、(c)トリチル化塩基、(d)ホスホロチオエート、(e)アルキル
ホスホロチオエート、(f)5-ニトロインドールデスオキシリボフラノシル(deso
xyribofliranosyl)、(g)5-メチルデスオキシシトシン、および(
h)5,6-ジヒドロ-5,6-ジヒドロキシデスオキシチミジン。ホスホチオエート化
ヌクレオチドは細胞または生物における分解に対して保護され、そのため、好ましいヌク
レオチド修飾物となる。ホスホジエステル結合されたヌクレオチドから排他的に構成され
る未修飾オリゴヌクレオチドは、典型的には修飾ヌクレオチドより活性であり、そのため
、発明との関連で一般に好ましい。最も好ましいのはホスホジエステル結合されたデオキ
シヌクレオチドから排他的に構成されるオリゴヌクレオチドであり、ここで、さらに好ま
しくは、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖である。さらに好ましいのは、細胞、好ましく
は樹状細胞におけるIFN-α産生を刺激することができるオリゴヌクレオチドである。
細胞におけるIFN-α産生を刺激することができる非常に好ましいオリゴヌクレオチド
は、A型CpGsおよびC型CpGsから選択される。さらに好ましいのは、キャップを
有さないRNA-分子である。
pG、すなわち非メチル化CpGジヌクレオチドを含むヌクレオチドのパターンを示し、
ここで、Cはメチル化されておらず、中心CpGに隣接している(その3’および5’側
で)少なくとも1つの塩基、好ましくは1または2つのヌクレオチドにより囲まれている
。典型的にかつ好ましくは、CpGモチーフは本明細書では、非メチル化CpGジヌクレ
オチドおよびその5’および3’端上の2つのヌクレオチドを含む、あるいはこれから構
成される。理論に縛られないが、CpGに隣接している塩基は活性のかなりの部分をCp
Gオリゴヌクレオチドに与える。
リゴヌクレオチド」または「CpG」という用語は、少なくとも1つのCpGモチーフを
含むオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチドを示す。よって、C
pGは少なくとも1つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含む。好ましい
CpGは脊椎動物骨髄由来細胞を刺激/活性化する、例えば、これに対して分裂促進効果
を有する、またはこれによるサイトカイン発現を誘導する、もしくは増加させる。例えば
、CpGは、B細胞、NK細胞および抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球およびマクロ
ファージを活性化するのに有用となり得る。好ましくは、CpGは、非メチル化シトシン
、続いて3’グアノシンを含む、オリゴデスオキシヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリ
ゴデスオキシヌクレオチドに関連し、前記非メチル化シトシンおよび前記グアノシンはリ
ン酸結合により連結され、ここで、好ましくは結合された前記リン酸は、結合されたホス
ホジエステル、または、結合されたホスホチオエートであり、ここで、さらに好ましくは
前記リン酸結合は結合されたホスホジエステルである。CpGは、ヌクレオチド類似体、
例えばホスホロチオエステル結合を含む類似体を含むことができ、二本鎖または一本鎖と
することができる。一般に、二本鎖分子はインビボでより安定であり、一方、一本鎖分子
は増加した免疫活性を有する。好ましくは、本明細書では、CpGは、少なくとも約10
ヌクレオチドの長さであり、少なくとも1つのCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド
であり、ここで、さらに好ましくは前記CpGは10~60、より好ましくは15~50
、さらにより好ましくは20~40、さらにより好ましくは約30、最も好ましくは正確
に30ヌクレオチドの長さである。CpGは、メチル化および/または非メチル化ヌクレ
オチドから構成され得、ここで、前記少なくとも1つのCpGモチーフは少なくとも1つ
のCGジヌクレオチドを含み、ここで、Cはメチル化されていない。CpGはまた、メチ
ル化および非メチル化配列区間を含むことができ、ここで、前記少なくとも1つのCpG
モチーフは少なくとも1つのCGジヌクレオチドを含み、ここで、Cはメチル化されてい
ない。非常に好ましくは、CpGは非メチル化シトシン、続いて3’グアノシンを含む一
本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関連し、ここで、前記非メチル化シトシンおよび前
記グアノシンは結合されたホスホジエステルにより連結される。CpGはヌクレオチド類
似体、例えばホスホロチオエステル結合を含む類似体を含むことができ、二本鎖または一
本鎖とすることができる。一般に、ホスホジエステルCpGは以下で示されるA型CpG
であり、ホスホチオエステル安定化CpGはB型CpGである。発明との関連で好ましい
CpGオリゴヌクレオチドはA型CpGである。
くとも1つのCpGモチーフを含むオリゴデスオキシヌクレオチド(ODN)を示す。A
型CpGは優先的にT細胞の活性化および樹状細胞の成熟を刺激し、IFN-α産生を刺
激することができる。A型CpGでは、少なくとも1つのCpGモチーフのヌクレオチド
は、少なくとも1つのホスホジエステル結合により連結される。A型CpGは少なくとも
1つのホスホジエステル結合CpGモチーフを含み、それは、その5’端および/または
、好ましくは、その3’端でホスホロチオエート結合ヌクレオチドにより隣接され得る。
好ましくは、CpGモチーフ、ここでは好ましくはCGジヌクレオチド、および少なくと
も1つの、好ましくは2つのヌクレオチドを含むその直近の隣接領域は、ホスホジエステ
ルヌクレオチドからなる。好ましいA型CpGは、ホスホジエステル(PO)結合ヌクレ
オチドから排他的に構成される。典型的にかつ好ましくは、ポリGモチーフは少なくとも
1つ、好ましくは少なくとも3、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、または15のG(グアノシン)、最も好ましくは少なくとも10のGを含
む、あるいはこれから構成される。好ましくは、発明のA型CpGはパリンドローム配列
を含む、あるいはこれから構成される。
ぞれ、コア粒子およびVLPとの関連でのポリアニオン性巨大分子または免疫賦活物質の
状態を示す。「パッケージングされた」という用語は、本明細書では、例えば、化学的カ
ップリングによる共有結合、または非共有結合、例えば、イオン性相互作用、疎水性相互
作用、水素結合、などであってもよい結合を含む。その用語はまた、ポリアニオン性巨大
分子の封入、または部分封入を含む。よって、ポリアニオン性巨大分子または免疫賦活物
質はVLPにより、実際の結合、特に共有結合の存在なしで、封入させることができる。
好ましい実施形態では、少なくとも1つのポリアニオン性巨大分子または免疫賦活物質は
、VLPの内側に、最も好ましくは非共有結合様式でパッケージングされる。前記免疫賦
活物質が核酸、好ましくはDNAである場合、パッケージングされたという用語は、前記
核酸はヌクレアーゼ加水分解に到達できない、好ましくはDNAse加水分解(例えばD
NaseIまたはベンゾナーゼ)に到達できないことを意味し、ここで、好ましくは前記
到達性はWO2003/024481A2号の実施例11-17において記載されるよう
にアッセイされる。
膚炎(CAD)を防止または治療する方法において使用するための組成物を提供し、ここ
で、有効量の前記組成物が前記イヌ科、好ましくは前記飼いイヌに投与され、ここで、前
記組成物は(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するコア粒子;および(b)少な
くとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原
(cIL-31抗原)を含み、ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:
22から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22
と少なくとも90%、好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%
、重ねてさらに好ましくは少なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有する
タンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、(a)および(b)は
、前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、少
なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される。
VLPである。さらに好ましい実施形態では、前記VLPはキュウリモザイクウイルス(
CMV)の改変VLPであり、ここで、CMVの前記改変VLPは、少なくとも1つの改
変CMVポリペプチドを含み、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成され、
ここで、前記改変CMVポリペプチドは、(a)CMVポリペプチド、および(b)ヘル
パーT細胞エピトープを含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、前記CMV
ポリペプチドは、(i)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列;または(ii)変異
アミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、変異されるアミノ酸
配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、ここで前記変異アミノ酸配列お
よびCMVの前記コートタンパク質は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%
、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同
一性を示す。さらに非常に好ましい実施形態では、前記CMVポリペプチドは、(a)C
MVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID
NO:1を含み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または(b)S
EQ ID NO:1の少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ま
たは好ましくはこれから構成され;ならびにここで、この請求項で(a)または(b)に
おいて規定される前記アミノ配列はSEQ ID NO:23を含み;または、ここで、
この請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はアミノ酸配列領域
を含み、ここで、前記アミノ酸配列領域はSEQ ID NO:23と少なくとも90%
の配列同一性を有する。さらに非常に好ましい実施形態では、前記VLPはキュウリモザ
イクウイルス(CMV)の改変VLPであり、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、
SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好
ましくはこれから構成される。
から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成さ
れる:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SE
Q ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25-30。さらに非常に好ましい
実施形態では、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるアミノ配
列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される:(a)SEQ I
D NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;
(d)SEQ ID NO:25;または(e)SEQ ID NO:26。さらに非常
に好ましい実施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ま
しくは、前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-ア
セチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好ましい実施
形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは、前記ス
ルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
療する方法において使用するための組成物を提供し、ここで、有効量の前記組成物が前記
飼いイヌに投与され、ここで、前記組成物は(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有
するコア粒子であって、前記コア粒子は好ましくはウイルス様粒子(VLP)、さらに好
ましくは組換えVLPである、コア粒子;および(b)少なくとも1つの第2の付着部位
を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含み
、ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配
列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好まし
くは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少
なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好
ましくはこれから構成され;ここで、(a)および(b)は、前記少なくとも1つの第1
のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、少なくとも1つの非ペプチド共
有結合を介して連結される。
の好ましい実施形態では、前記VLPは組換えVLPであり、ここで、好ましくは前記組
換えVLPは植物ウイルスに由来する。別の好ましい実施形態では、前記VLPはキュウ
リモザイクウイルス(CMV)のVLPである。
、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成される改変VLPであり、ここで、
前記改変VLPポリペプチドは、(a)VLPポリペプチド、および(b)ヘルパーT細
胞エピトープを含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、前記VLPポリペプ
チドは、(i)ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは植物ウイルスの
コートタンパク質のアミノ酸配列;または(ii)変異アミノ酸配列を含み、または好ま
しくはこれから構成され、ここで、変異されるアミノ酸配列はウイルスの前記コートタン
パク質のアミノ酸配列であり、ここで、前記変異アミノ酸配列およびウイルスの前記コー
トタンパク質は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少
なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す。
Pであり、ここで、CMVの前記改変VLPは、少なくとも1つの改変CMVポリペプチ
ドを含み、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成され、ここで、前記改変C
MVポリペプチドは、(a)CMVポリペプチド、および(b)ヘルパーT細胞エピトー
プを含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、前記CMVポリペプチドは、(
i)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列;または(ii)変異アミノ酸配列を含み
、または好ましくはこれから構成され、ここで、変異されるアミノ酸配列はCMVのコー
トタンパク質のアミノ酸配列であり、ここで、前記変異アミノ酸配列およびCMVの前記
コートタンパク質は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましく
は少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す。
ノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される。別の好ましい実施形態では、前
記CMVポリペプチドは変異アミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、
ここで、変異されるアミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、こ
こで、前記変異アミノ酸配列およびCMVの前記コートタンパク質は、少なくとも90%
、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好まし
くは少なくとも99%の配列同一性を示す。典型的にかつ好ましくは、前記変異アミノ酸
配列および前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも1つ、かつせいぜい11、10、
9、8、7、6、5、4、3、または2つのアミノ酸残基が異なり、ここで、好ましくは
これらの違いは(i)挿入、(ii)欠失、(iii)アミノ酸交換、および(iv)(
i)~(iii)の任意の組み合わせから選択される。
タンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1を含
み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または(b)SEQ ID
NO:1の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも
85%、重ねてさらに好ましくは少なくとも90%、重ねてより好ましくは少なくとも9
5%、いっそうさらに好ましくは少なくとも98%、いっそう重ねてさらにより好ましく
は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列;あるいは(ii)変異アミノ酸
配列であって、前記変異されるアミノ酸配列はこの請求項の(i)で規定される前記アミ
ノ酸配列である、アミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、前
記変異アミノ酸配列および前記変異されるアミノ酸配列は少なくとも95%、好ましくは
少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す。
はこれから構成される:(a)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記
アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1を含み、または好ましくはこれから構成される
、アミノ酸配列、または(b)SEQ ID NO:1の少なくとも75%、好ましくは
少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、重ねてさらに好ましくは少なくと
も90%、重ねてより好ましくは少なくとも95%、いっそうさらに好ましくは少なくと
も98%、いっそう重ねてさらにより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する
アミノ酸配列。
タンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列はSEQ ID NO:23を含
む、アミノ酸配列、または(b)アミノ酸配列領域を含むCMVのコートタンパク質のア
ミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列領域は、SEQ ID NO:23と少なくとも
75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、重ねてさらに
好ましくは少なくとも90%、重ねてより好ましくは少なくとも95%、いっそうさらに
好ましくは少なくとも98%、いっそう重ねてさらにより好ましくは少なくとも99%の
配列同一性を有する、アミノ酸配列;あるいは(ii)変異アミノ酸配列であって、前記
変異されるアミノ酸配列はこの請求項の(i)で規定される前記アミノ酸配列である、ア
ミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、前記変異アミノ酸配列
および前記変異されるアミノ酸配列は少なくとも95%、好ましくは少なくとも98%、
より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す。
くはこれから構成される:(a)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前
記アミノ酸配列はSEQ ID NO:23を含む、アミノ酸配列、または(b)アミノ
酸配列領域を含む、CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配
列領域は、SEQ ID NO:23と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%
、より好ましくは少なくとも85%、重ねてさらに好ましくは少なくとも90%、重ねて
より好ましくは少なくとも95%、いっそうさらに好ましくは少なくとも98%、いっそ
う重ねてさらにより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する、アミノ酸配列。
タンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1を含
み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または(b)SEQ ID
NO:1の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも
85%、重ねてさらに好ましくは少なくとも90%、重ねてより好ましくは少なくとも9
5%、いっそうさらに好ましくは少なくとも98%、いっそう重ねてさらにより好ましく
は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列;ここで、この請求項で(a)ま
たは(b)において規定される前記アミノ配列はSEQ ID NO:23を含み;ある
いは、ここで、この請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はア
ミノ酸配列領域を含み、ここで、前記アミノ酸配列領域は、SEQ ID NO:23と
少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、重
ねてさらに好ましくは少なくとも90%、重ねてより好ましくは少なくとも95%、いっ
そうさらに好ましくは少なくとも98%、いっそう重ねてさらにより好ましくは少なくと
も99%の配列同一性を有する;または(ii)変異アミノ酸配列であって、前記変異さ
れるアミノ酸配列はこの請求項の(i)で規定される前記アミノ酸配列である、変異アミ
ノ酸配列、を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、前記変異アミノ酸配列
および前記変異されるアミノ酸配列は少なくとも98%好ましくは少なくとも99%の配
列同一性を示す。
ク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1を含み、好
ましくはこれから構成さる、アミノ酸配列、または(b)SEQ ID NO:1の少な
くとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成
され;ここで、この請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はS
EQ ID NO:23を含み;あるいはこの請求項で(a)または(b)において規定
される前記アミノ配列はアミノ酸配列領域を含み、ここで、前記アミノ酸配列領域はSE
Q ID NO:23と少なくとも90%の配列同一性を有する。
のN末端領域にとって代わる。別の好ましい実施形態では、置き換えられた前記N末端領
域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である
。
ペプチドのN末端領域にとって代わり、ここで、置き換えられた前記N末端領域のアミノ
酸の数は、前記ヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。典型的に
かつ好ましくは、前記CMVポリペプチドの前記置き換えられたN末端領域は、5~15
の連続アミノ酸、好ましくは9~14の連続アミノ酸、より好ましくは11~13の連続
アミノ酸から構成される。
Q ID NO:1のアミノ酸2-12に対応する。
パーT細胞エピトープである。別の好ましい実施形態では、前記ヘルパーT細胞エピトー
プはせいぜい20のアミノ酸から構成される。
に非常に好ましい実施形態では、前記Th細胞エピトープは、SEQ ID NO:5の
アミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される。別の非常に好ましい実施形
態では、前記Th細胞エピトープはPADRE配列であり、ここで、前記Th細胞エピト
ープは、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成
される。
る。非常に好ましい実施形態では、前記Th細胞エピトープは、破傷風毒素に由来する。
さらに非常に好ましい実施形態では、前記Th細胞エピトープは、SEQ ID NO:
4のアミノ酸配列を有し、好ましくはこれから構成される。別の非常に好ましい実施形態
では、前記Th細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、ここで、前記Th細胞エピトー
プは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有し、好ましくはこれから構成される。
で、前記Th細胞エピトープは、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、または
好ましくはこれから構成され;あるいはここで、前記Th細胞エピトープは、破傷風毒素
に由来し、ここで、前記Th細胞エピトープは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列
を有し、好ましくはこれから構成される。
のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、ここで、前記アミノ酸配列
は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:1の少なくとも95%の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、前記ア
ミノ配列はSEQ ID NO:23を含み、ここで、前記ヘルパーT細胞エピトープは
前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって代わり、ここで、前記CMVポリペプチド
の前記置き換えられたN末端領域は11~13の連続アミノ酸、好ましくは11の連続ア
ミノ酸から構成され、ここで、さらに好ましくは前記CMVポリペプチドの前記N末端領
域はSEQ ID NO:1のアミノ酸2-12に対応する。
:6のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される。別の非常に好ましい
実施形態では、前記改変CMVポリペプチドはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を
含み、または好ましくはこれから構成される。請求項6~8のいずれか一項に記載の組成
物の使用、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSE
Q ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される。
とも1つの共有非ペプチド結合を介して連結される。別の非常に好ましい実施形態では、
前記第1の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含み、好ましくはこれ
である。さらに非常に好ましい実施形態では、前記第2の付着部位は、スルフヒドリル基
、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含み、好ましくはこれである。
くはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも1つの第2の付着部位はスルフヒドリル基
、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基またはcIL-31抗原に化学的に付着
されたスルフヒドリル基である。さらに好ましい実施形態では、前記第2の付着部位のた
った1つが前記第1の付着部位と、少なくとも1つの非ペプチド共有結合により結合し、
前記cIL-31抗原の前記改変ウイルス様粒子への単一の均一な型の結合につながり、
ここで、前記第1の付着部位と結合する前記たった1つの第2の付着部位はスルフヒドリ
ル基であり、ここで、前記cIL-31抗原および前記改変ウイルス様粒子は前記結合に
より相互作用し、秩序反復抗原アレイ、すなわちcIL-31抗原の秩序反復アレイを形
成する。
ヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより、化学架橋により改変VLP連結される。好
ましい実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましい第1の付着部位と、好ましくは
アミノ基と、より好ましくは改変VLPのリジン残基(複数可)のアミノ基と反応するこ
とができる官能基、および、cIL-31抗原に固有の、またはこれに付加された、およ
び、任意で還元により反応に使用可能とされる、好ましい第2の付着部位、すなわち、好
ましくはシステイン(複数可)残基のスルフヒドリル基と反応することができる、さらな
る官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤は当技術分野で知られている。これら
としては、好ましい架橋剤SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo
-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、S
ulfo-SMCC、Sulfo-KMUS SVSB、SIA、および、例えばPie
rce Chemical Companyから入手可能であり、アミノ基に対して反応
性である1つの官能基およびスルフヒドリル基に対して反応性である1つの官能基を有す
る他の架橋剤が挙げられる。上記架橋剤は全て、アミノ基との反応後のアミド結合および
スルフヒドリル基とのチオエーテル結合の形成に至らしめる。発明の実施において好適な
架橋剤の別のクラスは、カップリングでの、cIL-31抗原と改変VLPの間のジスル
フィド連結の導入により特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤としては、
例えば、SPDPおよびSulfo-LC-SPDP(Pierce)が挙げられる。非
常に好ましい実施形態では、前記ヘテロ二官能性架橋剤はSMPHである。
IL-31抗原の改変VLPへの連結により、配向様式でのcIL-31抗原の改変VL
Pへのカップリングが可能になる。cIL-31抗原を改変VLPに連結させる方法は、
cIL-31抗原が改変VLPに、カルボジイミドEDC、およびNHSを使用して架橋
される方法を含む。cIL-31抗原はまた、例えばSATA、SATPまたはイミノチ
オランとの反応により、最初にチオール化されてもよい。cIL-31抗原は、必要なら
脱保護後、下記の通り、その後、改変VLPにカップリングされてもよい。過剰のチオー
ル化試薬の分離後、cIL-31抗原は、システイン反応性部分を含むヘテロ二官能性架
橋剤で前に活性化され、そのため、システイン残基に対して反応性の少なくとも1つまた
は複数の官能基を提示する改変VLPと反応させられ、チオール化されたcIL-31抗
原は、それに対して、例えば以上で記載されるように反応することができる。任意で、低
量の還元剤が反応混合物中に含められる。さらなる方法では、cIL-31抗原はホモ二
官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、DSG、BM[PEO]4、BS3、(Pi
erce)または、改変VLPのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性である官
能基を有する他の公知のホモ二官能性架橋剤を用いて、改変VLPに付着される。
含む。非常に好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は、発明の改変VLPにパッケー
ジングされる。別の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は、発明の改変VLPと混合さ
れる。発明に有用な免疫賦活物質は、一般に当技術分野で知られており、とりわけ、WO
2003/024481A2号で開示される。
Aから構成される。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は下記からなる群よ
り選択される:(a)免疫賦活性核酸;(b)ペプチドグリカン;(c)リポ多糖;(d
)リポテイコ酸(lipoteichonic acid);(e)イミダゾキノリン化
合物;(f)フラゲリン;(g)リポタンパク質;および(h)(a)~(g)の少なく
とも1つの物質の任意の混合物。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は免疫
賦活性核酸であり、ここで、前記免疫賦活性核酸は下記からなる群より選択される:(a
)リボ核酸;(b)デオキシリボ核酸;(c)キメラ核酸;および(d)(a)、(b)
および/または(c)の任意の混合物。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活性核
酸はリボ核酸であり、ここで、前記リボ核酸は細菌由来RNAである。さらに好ましい実
施形態では、前記免疫賦活性核酸は、ポリ-(LC)またはその誘導体である。さらに好
ましい実施形態では、前記免疫賦活性核酸はデオキシリボ核酸であり、ここで、前記デオ
キシリボ核酸は非メチル化CpG-含有オリゴヌクレオチドである。
オチドである。さらに好ましい実施形態では、前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオ
チドはA型CpGである。さらに好ましい実施形態では、前記A型CpGは、配列GAC
GATCGTC(SEQ ID NO:24)を含む。さらに好ましい実施形態では、前
記パリンドローム配列はその5’末端およびその3’末端でグアノシンエンティティによ
り隣接される。さらに好ましい実施形態では前記パリンドローム配列はその5’末端で少
なくとも3つ、かつせいぜい15のグアノシンエンティティにより隣接され、ここで、前
記パリンドローム配列は、その3’末端で少なくとも3つかつせいぜい15グアノシンエ
ンティティにより隣接される。
チドであり、ここで、好ましくは前記非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチドはパリン
ドローム配列を含み、ここで、さらに好ましくは、前記非メチル化CpG含有オリゴヌク
レオチドのCpGモチーフは、パリンドロームの一部であり、ここで、重ねてさらに好ま
しくは前記パリンドローム配列はGACGATCGTC(SEQ ID NO:24)で
ある。
ル基を介して前記コア粒子、好ましくは前記VLP、重ねてさらに好ましくは前記改変C
MV VLPに連結され、ここで、好ましくは前記スルフヒドリル基は、前記第2の付着
部位に含まれ、ここで、前記スルフヒドリル基は前記cIL-31抗原と共に天然に生じ
ず、ここで、好ましくは前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシン
イミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジルS-アセチル
チオプロピオナート(SATP)またはイミノチオランとの反応から誘導され、さらに好
ましくは、ここで、前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミ
ジルS-アセチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好
ましい実施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましく
は前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
たはC末端のいずれかに付加されたシステイン残基、またはこれ内の天然システイン残基
を介して、改変ウイルス様粒子のリジン残基に連結される。好ましい実施形態では、発明
の組成物はリンカーをさらに含み、前記リンカーは前記cIL-31抗原を前記第2の付
着部位と結合させ、ここで、好ましくは前記リンカーは前記第2の付着部位を含む、ある
いはこれから構成される。
とも90%のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ま
しくはこれから構成される。別の好ましい実施形態では、前記cIL-31抗原は、SE
Q ID NO:22と少なくとも92%のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有する
タンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに好ましい実施形態では
、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22と少なくとも95%のアミノ酸配
列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され
る。非常に好ましい実施形態では、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22
と少なくとも98%のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、ま
たは好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施形態では、前記cIL-
31抗原は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、また
は好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施形態では、前記少なくとも
1つのcIL-31抗原は、SEQ ID NO:18のアミノ配列を有するタンパク質
を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施形態では、前
記少なくとも1つのcIL-31抗原は、SEQ ID NO:21のアミノ配列を有す
るタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施
形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは前記スル
フヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテ
ート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好ましい実施形態では、前記第
2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは前記スルフヒドリル基は、
前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
ス様粒子(VLP);(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つの
イヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含む組成物を提供し、ここで、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有する
タンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少なく
とも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも9
8%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこ
れから構成され、重ねてさらに好ましくは、前記抗原は、SEQ ID NO:22のア
ミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;ここで、(a
)および(b)は、前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着
部位によって、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される。
)の改変VLPであり、ここで、前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:
6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成
される。
から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成さ
れる:(a)SEQ ID NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SE
Q ID NO:22;(d)SEQ ID NO:25-30。さらに非常に好ましい
実施形態では、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるアミノ配
列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される:(a)SEQ I
D NO:18;(b)SEQ ID NO:21;(c)SEQ ID NO:22;
(d)SEQ ID NO:25;または(e)SEQ ID NO:26。さらに好ま
しい実施形態では、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22と少なくとも9
5%のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくは
これから構成される。非常に好ましい実施形態では、前記cIL-31抗原は、SEQ
ID NO:22と少なくとも98%のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタン
パク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施形態で
は、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい実施形態では
、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、SEQ ID NO:18のアミノ配列を
有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非常に好ましい
実施形態では、前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、SEQ ID NO:21の
アミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される。さらに非
常に好ましい実施形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好
ましくは前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-ア
セチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導される。さらに非常に好ましい実施
形態では、前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、ここで、好ましくは前記スル
フヒドリル基は、前記cIL-31抗原のリジン残基の反応から誘導される。
D)を防止または治療する方法であって、有効量の組成物を前記イヌ科、好ましくは前記
飼いイヌに投与することを含む方法を提供し、ここで、前記組成物は(a)少なくとも1
つの第1の付着部位を有するコア粒子;および(b)少なくとも1つの第2の付着部位を
有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含み、
ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列
を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましく
は少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少な
くとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ま
しくはこれから構成され;ここで、(a)および(b)は、前記少なくとも1つの第1の
および前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、少なくとも1つの非ペプチド共有
結合を介して連結され、ここで、好ましくは前記方法または前記組成物は、本明細書で記
載されるようにさらに規定される。
D)を防止または治療するための薬剤の製造のための、(a)少なくとも1つの第1の付
着部位を有するコア粒子;および(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なく
とも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)を含む組成物の使用を
提供し、ここで、前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるア
ミノ配列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、
好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好まし
くは少なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、ま
たは好ましくはこれから構成され;ここで、(a)および(b)は、前記少なくとも1つ
の第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位によって、少なくとも1つの非ペプ
チド共有結合を介して連結され;ここで、有効量の前記組成物が前記イヌ科、好ましくは
前記飼いイヌに投与され、ここで、好ましくは前記方法または前記組成物は、本明細書で
記載されるようにさらに規定される。
実施例1
キュウリモザイクウイルス(CMV)のコートタンパク質(CP)の単離およびクローニ
ング
CMV感染ユリ葉由来の全RNAをTRI試薬(Sigma、Saint Louis
、USA)を使用して、製造者の指示にしたがい単離した。cDNA合成では、OneS
tep RT-PCRキット(Qiagen、Venlo、オランダ)を使用した。CM
V CP遺伝子の増幅では、プライマー配列をGenBankからのCMV配列の分析後
に選択した:CMcpF(CACCATGGACAAATCTGAATCAACCAGT
GCTGGT)(SEQ ID NO:8)およびCMcpR(CAAAGCTTATC
AAACTGGGAGCACCCCAGATGTGGGA)(SEQ ID NO:9)
;NcoIおよびHindIII部位には下線が付けられている。対応するPCR産物を
pTZ57R/Tベクター(Fermentas、Vilnius、リトアニア)にクロ
ーニングした。大腸菌XL1-Blue細胞をクローニングおよびプラスミド増幅のため
の宿主として使用した。PCRエラーを含むクローンの選択を回避するために、いくつか
のCP遺伝子含有pTZ57プラスミドクローンを、BigDyeサイクル配列決定キッ
トおよびABI Prism3100ジェネティックアナライザ(Applied Bi
osystems、Carlsbad、USA)を使用して、配列決定した。配列決定後
、SEQ ID NO:1のCMVコートタンパク質をコードする、配列エラーのないC
MV CP遺伝子のcDNA(SEQ ID NO:10)をその後、pET28a(+
)発現ベクターのNcoI/HindIII部位にサブクローニングし(Novagen
、San Diego、USA)、発現プラスミドpET-CMVwtを得た(図1)。
CMVのVLPにつながる、大腸菌におけるSEQ ID NO:1のCPの発現
CMV VLPを得るために、大腸菌C2566細胞(New England Bi
olabs、Ipswich、USA)を、CMV CP遺伝子含有プラスミドpET-
CMVwtで形質転換させた。最高発現レベルの標的タンパク質を有するクローンの選択
後、大腸菌培養物を、回転式振盪機(200rev/分;Infors、Bottmin
gen、スイス)上にて、カナマイシン(25mg/l)を含む2×TY培地中で、30
℃にて、0.8-1.0のOD600まで増殖させた。その後、細胞を、0.2mM I
PTGで誘導し、培地に5mM MgCl2を補充した。インキュベーションを回転式振
盪機上で20℃にて18時間の間続けた。得られたバイオマスを低速遠心分離により収集
し、-20℃で凍結させた。氷上での解凍後、細胞を、50mMクエン酸ナトリウム、5
mMホウ酸ナトリウム、5mM EDTA、5mMメルカプトエタノールを含むバッファ
ー(pH9.0、バッファーA)中に懸濁させ、超音波処理により破壊させた。不溶性タ
ンパク質および細胞デブリを遠心分離により除去した(13,000rpm、5℃で30
分)。清澄ライセート中の可溶性CMV CPタンパク質を、飽和硫酸アンモニウム(1
:1、vol/vol)を用いて、一晩+4℃でペレット化した。沈殿したタンパク質を
同じバッファーA(メルカプトエタノールなし)中で4時間の間+4℃で可溶化した。不
溶性タンパク質を低速遠心分離により除去した(13,000rpm、4℃で15分)。
可溶性CMV CP含有タンパク質溶液を細胞タンパク質から、超遠心分離法(SW28
ローター、Beckman、Palo Alto、USA;25,000rpmで6時間
、5℃)により、スクロース勾配中で分離した(バッファーA中20-60%スクロース
、メルカプトエタノールなし、0.5%トリトンX-100補充)。勾配を勾配の底部で
開始して、6つの画分に分割し、画分をSDS-PAGEにより分析した(データ示さず
)。組換えCMV CPを含む画分No.2およびNo.3を合わせ、200体積のバッ
ファー(5mMホウ酸ナトリウム、2mM EDTA、pH9.0)に対して透析し、ス
クロースおよびトリトンX-100を除去した。透析後、CMV CP溶液を0.2μフ
ィルタに通す濾過により滅菌した。次に、CMV CPを、Type70ローター(Be
ckman、Palo Alto、USA)超遠心分離法を用いて、20%スクロース「
クッション」により、無菌条件下で(50000rpm、4時間、+5℃)濃縮した。精
製CMVwtの濃度を、QuBit蛍光光度計を用いて、製造者の推奨にしたがい推定し
た(Invitrogen、Eugene、USA)。濃VLP溶液(approx.3
mg/ml)を、+4℃で、5mMホウ酸ナトリウム、2mM EDTA、バッファー(
pH9.0)中で保存した。VLPの発現および精製に関与する全てのステップをSDS
-PAGEにより12.5%ゲルを用いてモニタした。
たかなり部分は可溶画分中に存在することができる。その上、これらのタンパク質は、ス
クロース勾配分析(図2A)、動的光散乱および電子-顕微鏡分析(図2B)により証明
されるように、大腸菌細胞抽出物中で、等軸VLPの形態で直接見出される。
破傷風トキソイドエピトープを含むCMVの改変コートタンパク質のクローニング(CM
V-Ntt830)
SEQ ID NO:1のCMV CPのN末端の元のアミノ酸を破傷風トキソイドエ
ピトープコード配列で置き換えるために、pET-CMVwtプラスミドをPCR増幅お
よび変異誘発のために使用した。CMVwt遺伝子内に位置するSalI部位(図1)を
対応するPCR産物をクローニングするために使用した。
ステップPCR変異誘発を使用した。第1ステップ増幅では、下記プライマーを使用した
:pET-220(AGCACCGCCGCCGCAAGGAA(SEQ ID NO:
11)-ポリリンカーから上流、増幅領域はBglII部位を含む)およびCMV-tt
83-1R(ATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTGGCCCATGGT
ATATCTCCTTCTTAAAGT)(SEQ ID NO:12)。第2ラウンド
では、第1の増幅からのPCR産物を1:50で希釈し、プライマーpET-220(S
EQ ID NO:11)およびCMV-tt83Sal-R2(GACGTCGACG
CTCGGTAATCCCGATAAATTTGGAGTTGGCCTTAATATAC
TG)(SEQ ID NO:13)を用いて再増幅させた。得られたPCR産物(SE
Q ID NO:6のCMV-Ntt830をコードするSEQ ID NO:14のc
DNA)をpET-CMVwtのBglII/SaLI部位でサブクローニングさせた。
妥当なクローンを配列決定により同定し、pET-CMV-Ntt830と指定した。
CMVの改変VLPにいたる、大腸菌におけるCMV-Ntt830の発現
CMV-Ntt830 VLPを得るために、大腸菌C2566細胞(New Eng
land Biolabs、Ipswich、USA)を、CMV-Ntt830遺伝子
含有プラスミドpET-CMV-Ntt830で形質転換させた。最高発現レベルの標的
タンパク質を有するクローンの選択後、大腸菌培養物を、カナマイシン(25mg/l)
を含む2×TY培地中で、回転式振盪機(200rev/分;Infors、Bottm
ingen、スイス)において30℃で、0.8-1.0のOD600まで増殖させた。
細胞をその後、0.2mM IPTGで誘導し、培地に5mM MgCl2を補充した。
インキュベーションを回転式振盪機上で20℃で18時間の間続けた。得られたバイオマ
スを低速遠心分離により収集し、-20℃で凍結させた。氷上での解凍後、細胞を、50
mMクエン酸ナトリウム、5mMホウ酸ナトリウム、5mM EDTA、5mMメルカプ
トエタノールを含むバッファー中に懸濁させ(pH9.0、バッファーA)、超音波処理
により破壊した。不溶性タンパク質および細胞デブリを遠心分離により除去した(13,
000rpm、5℃で30分)。清澄ライセート中の可溶性CMV-Ntt830タンパ
ク質を、飽和硫酸アンモニウム(1:1、vol/vol)を一晩+4℃で用いてペレッ
ト化した。沈殿したタンパク質を、バッファーA(メルカプトエタノールなし)中で4時
間の間+4℃で可溶化した。不溶性タンパク質を低速遠心分離により除去した(13,0
00rpm、4℃で15分)。可溶性CMV-Ntt830含有タンパク質溶液を細胞タ
ンパク質から超遠心分離法(SW28ローター、Beckman、Palo Alto、
USA;25,000rpm、6時間、5℃)により、スクロース勾配中で(バッファー
A中20-60%スクロース、メルカプトエタノールなし、0.5%トリトンX-100
補充)分離した。勾配を、勾配の底部で開始して、6画分に分割した。組換えCMV-N
tt830を含む画分を合わせ、200体積の5mMホウ酸ナトリウム、2mM EDT
A(pH9.0)に対して透析し、スクロースおよびトリトンX-100を除去した。透
析後、CMV-Ntt830溶液を0.2μフィルタを通す濾過により滅菌した。次に、
CMV-Ntt830を、Type70ローター(Beckman、Palo Alto
、USA)超遠心分離法を用いて、20%スクロース「クッション」により、無菌条件下
で(50000rpm、4時間、+5℃)濃縮した。精製CMV-Ntt830の濃度を
、QuBit蛍光光度計を用いて、製造者の推奨にしたがい推定した(Invitrog
en、Eugene、USA)。濃VLP溶液(approx.3mg/ml)を、+4
℃で、5mMホウ酸ナトリウム、2mM EDTA、バッファー(pH9.0)中で保存
した。VLPの発現および精製に関与する全てのステップをSDS-PAGEにより12
.5%ゲルを用いてモニタした。CMV VLP中の破傷風トキソイドエピトープの存在
を証明するために、精製CMV-Ntt830VLPの質量分析を使用した。図3Cに示
されるように、得られた主ピークは、大腸菌細胞中のタンパク質合成中に生じる第1のメ
チオニンが除去される場合、タンパク質の理論分子質量に対応する。動的光散乱および電
子顕微鏡法により、CMVwt VLPに類似する等軸粒子形態が確認された(図4Aお
よび4B)。
PADREエピトープを含むCMVの改変コートタンパク質のクローニング
(CMV-Npadr)
PADREエピトープコード配列をCMVwt遺伝子に導入するために、PCR変異誘
発を、増幅およびサブクローニングのための鋳型としてpET-CMVwtプラスミドを
使用して実施した(実施例2および3も参照されたい)。増幅のために、下記プライマー
を使用した:pET-220(SEQ ID NO:11)およびCMV-padrSa
l-R(GACGTCGACGCGCGGCCGCCTTGAGGGTCCACGCGG
CCACAAATTTCGCCATGGT)(SEQ ID NO:15)。得られたP
CR産物(SEQ ID NO:7のCMV-NpadrをコードするSEQ ID N
O:16のcDNA)をpET-CMVwtのBglII/SalI部位で重ねてサブク
ローニングさせた。妥当なクローンを配列決定により同定し、pET-CMV-Npad
rと指定した。
CMVの改変VLPに至る大腸菌におけるCMV-Npadrの発現
CMV-Npadrの発現および精製についての手順は、CMV-Ntt830に対す
るものと本質的に同じであり、実施例4で記載される。CMV VLPにおけるPADR
Eエピトープの存在を証明するために、精製CMV-Npadr VLPの質量分析を使
用した。図3Bに示されるように、得られた主ピークは、大腸菌細胞中のタンパク質合成
中に生じる第1のメチオニンが除去される場合、タンパク質の理論分子質量に対応する。
動的光散乱および電子顕微鏡分析により等軸粒子形態が確認された(図5Aおよび図5B
)。
6×HisタグおよびC末端システインを有するイヌIL-31のクローニングおよび産
生
大腸菌最適化コドン、N末端6×Hisタグ、TEVプロテアーゼ切断部位、C末端シ
ステインおよび隣接しているNcoIおよびPstI制限部位を有するイヌIL31cD
NA配列(SEQ ID NO:17)をIDT社で製造した。さらに、NcoI/Ps
tI断片をベクターpET42の対応する部位中に連結させた。コンストラクトを化学的
コンピテント大腸菌DH5α細胞において形質転換させ、コロニーをアンピシリンを含む
LB寒天プレート上に播種した。得られたクローンの配列を、Sanger配列決定によ
り検証した。得られたコンストラクトpET42_6HcIL31Cを化学的コンピテン
ト大腸菌BL21-DE3細胞においてさらに形質転換させた。
mlアンピシリンを含むLB培地中に播種し、一晩+37℃でインキュベートすることに
より調製した。ストックをその後、2TY培地に体積比1:20で添加した。細胞を+3
7℃で振盪させながら、540nmでの光学密度が0.7単位に到達するまで増殖させた
。その後タンパク質(SEQ ID NO:18)発現を1mM IPTGで誘導し、細
胞をさらに4時間の間、+37℃で振盪させながら増殖させた。タンパク質産生を、総細
胞溶解物をSDS-PAGE上にロードすることにより確認した(図6)。
200mM NaCl、20mM MgSO4、0.1mg/ml DNaseI、1m
M PMSFおよび1%トリトンX-100を含む氷冷溶解バッファーに、1gウェット
細胞/5mlの溶解バッファーの比率を維持して、懸濁させた。細胞を氷上での超音波処
理により溶解させ、得られたライセートを40分間15000gで遠心分離し、上清を廃
棄した。20mM TrisHCl、pH=8.0および1M NaClを含む洗浄バッ
ファーWB1をペレットに、3mlWB1/1gの初期ウェット細胞質量の比率を維持し
て添加した。ペレットをボルテックスにより再懸濁させ、回転式振盪機上で1時間の間、
室温でインキュベートし、15分間15000gで遠心分離させた。ペレット洗浄をもう
1回、20mM TrisHCl、pH=8.0、200mM NaClおよび1M尿素
を含む洗浄バッファーWB2を用いて繰り返した。標的タンパク質はペレット画分中に位
置した。ペレットをその後、8M尿素、20mM trisHCl、pH=8、および1
00mM NaH2PO4を含む溶離バッファーEB1に、3mlEB1/1gの初期ウ
ェット細胞質量の比率を維持して再懸濁させ、回転式振盪機上、室温で一晩インキュベー
トした。遠心分離後、上清はおおよそ90%純度を有するタンパク質を含んだ(図7)。
1mlの得られた上清を、1滴ずつ、20mM tris-HCl、pH=8.0、50
mM NaCl、1Mグリシン、および5mM β-メルカプトエタノールを含む、20
mLのリフォールディングバッファーRBに添加し、2時間の間室温で撹拌しながらイン
キュベートした。上清をその後、Amiconフィルタユニットにより1mlまで濃縮し
(MWCO 10kDa)、48時間の間、+4℃で1000mlのPBSに対して透析
した。その後、試料を遠心分離し、SuperdexTM200 10/300GLカラ
ム上にPBS中でロードした。カラムプロファイルから、標的タンパク質は空隙容量中に
溶離され、そのため、おそらく、可溶性凝集体を形成することが示された(図8)。
組換え天然イヌIL-31のクローニングおよび産生
イヌIL-31を、SEQ ID NO:17を含むプラスミドから、PCRを用いて
、PstIおよびNcoI部位を含む、プライマーcIL31NATf(TACACCA
TGGCCTCCCACATGGCTCCAACG、SEQ ID NO:19)および
cIL31NATr(CATACTGCAGTTACTGCGGTCCACTGTTTA
AG、SEQ ID NO:20)を使用して増幅させた。得られたcIL-31PCR
断片を、PstIおよびNcoI制限酵素で消化させ、pET42ベクターの対応する部
位において連結させた。コンストラクトを化学的コンピテント大腸菌DH5α細胞におい
て形質転換させ、コロニーをアンピシリンを含むLB寒天プレート上に播種した。陽性ク
ローンを、Sanger配列決定により同定した。cIL31-pET42コンストラク
トをその後、化学的コンピテント大腸菌BL21-DE3細胞において形質転換させた。
g/mlアンピシリンを含むLB培地中に播種し、一晩、+37℃でインキュベートする
ことにより調製した。ストックをその後、2TY培地に体積比1:20で添加した。細胞
を+37℃で振盪させながら、540nmでの光学密度が0.7単位に到達するまで増殖
させた。その後、タンパク質(SEQ ID NO:21)発現を1mM IPTGで誘
導し、細胞をさらに4時間の間、+37℃で振盪させながら増殖させた。タンパク質産生
を、総細胞溶解物をSDS-PAGE上にロードすることにより確認した(図9)。
00mM NaCl、20mM MgSO4、0.1mg/ml DNaseI、1mM
PMSFおよび1%トリトンX-100を含む氷冷溶解バッファーに、1g細胞/5m
lの溶解バッファーの比率を維持して懸濁させた。細胞を氷上での超音波処理により溶解
させ、得られたライセートを40分間15000gで遠心分離した。上清を廃棄し、溶解
バッファーをペレットに、1.5mlの溶解バッファー対1gの初期ウェット細胞質量の
比率を維持して添加した。ペレットを、超音波処理により溶液に懸濁させ、溶液を20分
間15000gで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットをもう5回、以上で記載される
通りの溶解バッファーで洗浄した。洗浄ステップ後、ペレットを6.86M尿素および2
0mMジチオトレイトール(dithiotreitholに)超音波処理により再懸濁
させた。溶液を20分間15000gで遠心分離し、上清を、50mM tris-HC
l、1Mグリシン、1mM EDTAおよび5mM β-メルカプトエタノールを含むリ
フォールディングバッファー中で、75mlリフォールディングバッファー/1mlの尿
素-ジチオトレイトール(dithiotreithol)溶液の比率を維持して希釈し
た。リフォールディングを一晩+4℃で撹拌しながら実施した。溶液をその後、22μm
フィルタを使用して濾過し、限外濾過により10kDa装置(Amicon)を用いて2
00mlから4mlに濃縮した。溶液をその後、15000gで10分間遠心分離し、残
りの沈殿物を除去した。溶液を、リフォールディングバッファー中で前に平衡化させたS
uperdex200ゲル濾過カラム(16×600mm)上にロードし、分画した(2
ml/画分、流速2ml/分)。cIL-31タンパク質を含む画分をSDS-PAGE
電気泳動を用いて同定し、プールし、限外濾過により、10kDa装置(Amicon)
を用いて3mlの体積まで濃縮した。リクロマトグラフィーを前と同じSuperdex
200ゲル濾過カラム上で実施した。リクロマトグラフィーステップにおけるカラムは、
PBSバッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.2および0.15M NaCl
)中で平衡化させた。画分をSDS-PAGE電気泳動で分析し(図10)、最も純粋な
cIL-31タンパク質(SEQ ID NO:21)を含む4つの画分をプールし、4
mg/mlまで限外濾過により10kDa装置(Amicon)で濃縮し、CMV VL
Pへのカップリング実験のためにさらに使用した。
組換えイヌIL-31コンストラクトのCMV-Npadr VLPおよびCMV-Nt
t830 VLPへのカップリングならびにマウスおよびイヌの免疫化
A.cIL-31のVLPへのカップリング
実施例8で得られた、100μlの、cIL-31タンパク質(SEQ ID NO:
21)の溶液(PBSバッファー中4mg/ml)を、4.8μlの55mM N-スク
シンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA、Thermo Fisher S
cientific)を含むDMSOと混合し、30分間室温(RT)でインキュベート
した。未反応SATAをアミコンウルトラ-0.5 3K濾過ユニット(Merck-M
illipore)を用いたPBS(0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2およ
び0.15M NaCl)への4×バッファー交換により除去し、最終体積を100μl
に調整した。スルフヒドリル基を10μLの脱アセチル溶液(0.5Mヒドロキシルアミ
ンおよび25mM EDTAを含むPBS)の添加および2時間室温でのインキュベーシ
ョンにより脱保護した。脱アセチル溶液を、アミコンウルトラ-0.5 3K濾過ユニッ
ト(Merck-Millipore)を用いたPBSへの4×バッファー交換により除
去し、最終体積を100μlに調整した。
mg/mlの濃度を有するCMV-Ntt830 VLPを3μlの、DMSO中の50
mMスクシンイミジル-6-(b-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SM
PH)溶液と混合し、1時間の間室温でインキュベートした。SMPHの量は、1つのV
LPモノマ、すなわち1つのCMVポリペプチドに関して7.5×モル過剰を示す。未反
応SMPHを5mM NaHPO4 pH7.5、2mM EDTA pH8.0への4
×バッファー交換により、アミコンウルトラ-0.5 3K濾過ユニット(Merck-
Millipore)を用いて除去し、最終体積を250μlに調整した。
ID NO:21の、SATA処理かつ脱アセチル化cIL-31と混合し、3時間の
間室温でインキュベートした。得られた生成物をSDS-PAGE(図11)および電子
顕微鏡法(図12)により調査した。SDSゲル上での分析により予想される分子量の化
学カップリング生成物の存在が確認され、EMによる分析により無傷のVLPの存在が確
認された。
L-31によるマウスの免疫化
5匹の雌Balb/cマウスの群を第0日および第14日に、PBS中で製剤化された
、50μgの、SEQ ID NO:21のcIL-31に、SATAを介してカップリ
ングさせたCMV-Npadr VLPおよびCMV-Ntt830のいずれかを用いて
s.c.で免疫化する。マウスを第0日(免疫前)、第14日、および第28日に採血し
、血清をcIL-31特異的ELISAを用いて分析する。
に特異的な抗体を、ELISAプレートを5μg/mlの濃度の組換えcIL-31を含
む100μlの体積のPBS(pH7.2)で4℃にて一晩コートすることにより分析す
る。ELISAプレートを5×、0.05%Tween20を含む200μlのPBS(
pH7.2、PBST)を用いて洗浄する。非特異的結合を回避するために、ELISA
プレートを200μlの2%BSAを含むPBSTでブロックし、2時間の間室温でイン
キュベートする。血清試料を2%BSA/PBST中で希釈する。予備希釈された血清を
コートプレート上に移し、さらに段階希釈し、OD50計算に基づく抗体価を取得する。
室温での2時間のインキュベーション後、ELISAプレートを5×、200μlのPB
STを用いて洗浄する。血清抗体の結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
トヤギ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch)により検出す
る。検出抗体を2%BSA/PBST中で1:1000希釈し、100μlの体積/試料
を移した。プレートを1時間の間室温でインキュベートする。ELISAプレートを前に
記載されるように洗浄する。洗浄前に、基質溶液を調製する。この目的を達成するために
、1錠剤(10mg)のOPD(1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩)および9μlの
30%H2O2を25mlのクエン酸バッファー(0.066M Na2HPO4、0.
035Mクエン酸、pH5.0)に溶解する。100μlの体積の基質溶液をプレート上
にピペッティングし、7分間室温で正確にインキュベートする。反応を停止させるために
、50μlの停止液(5%H2SO4のH2O溶液)をプレート上に直接ピペッティング
する。1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の450nmでの吸光度測定値を分
析する。
L-31によるイヌの免疫化
5匹のイヌの群を、第0日および第14日、第28日および第42日に、PBS中で製
剤化された、50μgの、SATAを介してSEQ ID NO:21のcIL-31に
カップリングさせたCMV-Npadr VLPおよびCMV-Ntt830 VLPの
いずれかを用いてs.c.で免疫化する。イヌを第0日(免疫前)、第14日、第28日
、第42日および第56日に採血し、血清をcIL-31特異的ELISAを用いて分析
する。
特異的な抗体をELISAプレートを、5μg/mlの濃度の組換えcIL-31を含む
100μlの体積のPBS(pH7.2)で4℃にて一晩コートすることにより分析する
。ELISAプレートを5×、0.05%Tween20を含む200μlのPBS(p
H7.2、PBST)を用いて洗浄する。非特異的結合を回避するために、ELISAプ
レートを200μlの2%BSAを含むPBSTでブロックし、2時間の間室温でインキ
ュベートする。血清試料を2%BSA/PBST中で希釈する。予備希釈された血清をコ
ートプレート上に移し、さらに段階希釈し、OD50計算に基づく抗体価を取得する。室
温での2時間のインキュベーション後、ELISAプレートを5×、200μlのPBS
Tを用いて洗浄する。血清抗体の結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート
ヤギ抗イヌIgG(Jackson ImmunoResearch)により検出する。
検出抗体を2%BSA/PBST中で1:1000希釈し、100μlの体積/試料を移
した。プレートを1時間の間室温でインキュベートする。ELISAプレートを前に記載
されるように洗浄する。洗浄前に、基質溶液を調製する。この目的を達成するために、1
錠剤(10mg)のOPD(1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩)および9μlの30
%H2O2を25mlのクエン酸バッファー(0.066M Na2HPO4、0.03
5Mクエン酸、pH5.0)に溶解する。100μlの体積の基質溶液をプレート上にピ
ペッティングし、7分間室温で正確にインキュベートする。反応を停止させるために、5
0μlの停止液(5%H2SO4のH2O溶液)をプレート上に直接ピペッティングする
。1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の450nmでの吸光度測定値を分析す
る。
イヌアトピー性皮膚炎の治療のためのCMV-Ntt830 VLPにカップリングされ
た組換えイヌIL-31コンストラクトによるイヌの治療的免疫化
15匹のアトピー性皮膚炎を有するイヌの群を第0日および第14日、第28日、第5
6日よびおよび第80日に、Alum中で製剤化された、50μgの、SATAを介して
SEQ ID NO:21のcIL-31にカップリングさせたCMV-Ntt830
VLPまたはCMV-Ntt830単独を用いてs.c.で免疫化する。疾患重症度を免
疫化前ならびに第28日、第56日、第80日および第120日に目視検査により測定す
る。
CADスコアリング
CAD症状スコアリングでは、アトピー性皮膚炎病変指数(Atopic Derma
titis Lesion Index)(ADLI)およびそう痒ビジュアルアナログ
スケール(PVAS)を実験イヌにおいて使用する。ADLIスコアは、5つの特定の身
体領域において評価されるイヌアトピー性皮膚炎と関連する、6つの臨床症状の検証され
た複合指数である。各特定の身体領域で、各パラメータがスコアラーにより0から5まで
スコア化され、0のスコアは病変なしとして規定され、5のスコアは重篤/広範な病変と
して規定される。PVASはスコアラーにより0から10のアナログスケールによりスコ
ア化され、0のスコアはそう痒/咀嚼なしを表し、10のスコアは、絶え間ない、かつ激
烈なそう痒/咀嚼に等しい。処置したイヌのCADスコアリングをベースライン、ならび
にプラセボで処置したイヌのスコアと比較する。
屋内チリダニにアレルギー性のイヌのcIL-31-CMV-Ntt830 VLPを用
いたワクチン接種およびその後の誘発
6匹のアレルギーイヌをAlum中で製剤化された、100μgのcIL-31-CM
V-Ntt830 VLPを用いて免疫化し、6匹のアレルギーイヌをプラセボ(alu
m)で処置した。3週間後、イヌを300μgのワクチンまたはプラセボで追加免疫した
。血液を第28日に採取した。d-28日に、毛を腹部皮膚からテープストリッピングに
より除去し、屋内チリダニ誘発を1日1回10分間、連続5日間実施した。皮膚病変およ
びそう痒を12匹のイヌについて、6時間/日の間のイヌの臨床検査録画によりスコア化
した。
存在し、5/6免疫化イヌは本質的にひっかきをやめたが、プラセボ処置動物の挙動は変
化しなかった。
イヌ血清における抗体応答を第28日に分析した。cIL-31に特異的な抗体を、E
LISAプレートを、3μg/mlの濃度の組換えcIL-31を含む100μlの体積
のPBS(pH7.2)で4℃にて一晩コートすることにより分析した。ELISAプレ
ートを5×、0.05%Tween20を含む200μlのPBS(pH7.2、PBS
T)で洗浄した。非特異的結合を回避するために、ELISAプレートを200μlの2
%BSAを含むPBSTでブロックし、2時間の間室温でインキュベートした。血清試料
を2%BSA/PBST中で希釈する。予備希釈された血清(10倍)をコートプレート
上に移し、さらに段階希釈し(3倍ステップ)、OD50計算に基づく抗体力価を取得し
た。室温での2時間のインキュベーション後、ELISAプレートを5×、200μlの
PBSTで洗浄した。血清抗体の結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート
ヤギ抗イヌIgG(Jackson ImmunoResearch)により検出した。
検出抗体を2%BSA/PBST中で1:1000希釈し、100μlの体積/試料を移
した。プレートを1時間の間室温でインキュベートした。ELISAプレートを前に記載
されるように洗浄する。洗浄前に、5つの基質溶液を調製した。この目的を達成するため
に、1錠剤(10mg)のOPD(1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩)および9μl
の30%H2O2を25mlクエン酸バッファー(0.066M Na2HPO4、0.
035Mクエン酸、pH5.0)に溶解した。100μlの体積の基質溶液をプレート上
にピペッティングし、7分間室温で正確にインキュベートした。反応を停止させるために
、50μlの停止液(5%H2SO4のH2O溶液)をプレート上に直接ピペッティング
する。1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩呈色反応の450nmでの吸光度測定値を分
析し、10倍予備希釈血清のlog3として表した(図13B)。図13BはIL-31
特異抗体力価とひっかき強度の間の相関を示す。依然としてひっかいていた1匹のイヌは
最低抗体応答を開始し、<1/300の指示力価が保護的であることが見出された。
なお、本発明は以下の態様を含みうる。
[1]イヌ科、好ましくは飼いイヌのイヌアトピー性皮膚炎(CAD)を防止または治療する方法において使用するための組成物であって、有効量の前記組成物が前記イヌ科、好ましくは前記飼いイヌに投与され、前記組成物は
(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するコア粒子;および
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)
を含み、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;
(a)および(b)は前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位により、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される、組成物。
[2]前記コア粒子はウイルス様粒子(VLP)、好ましくは組換えVLPである、上記のいずれかに記載の使用するための組成物。
[3]前記VLPは植物ウイルスに由来する、上記[2]に記載の使用するための組成物。
[4]前記VLPは少なくとも1つの改変VLPポリペプチドを含み、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成される改変VLPであり、前記改変VLPポリペプチドは、
(a)VLPポリペプチド、および
(b)ヘルパーT細胞エピトープ、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記VLPポリペプチドは、
(i)ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは植物ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列;または
(ii)変異アミノ酸配列、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記変異されるアミノ酸配列はウイルスの前記コートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列およびウイルスの前記コートタンパク質は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す、上記[2]~[3]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[5]前記VLPはキュウリモザイクウイルス(CMV)の改変VLPであり、CMVの前記改変VLPは、少なくとも1つの改変CMVポリペプチドを含み、これから本質的に構成され、あるいはこれから構成され、前記改変CMVポリペプチドは、
(a)CMVポリペプチド、および
(b)ヘルパーT細胞エピトープ
を含み、または好ましくはこれから構成され;ならびに
前記CMVポリペプチドは、
(ii)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列;または
(ii)変異アミノ酸配列、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記変異されるアミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列およびCMVの前記コートタンパク質は、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を示す、上記[2]~[4]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[6]前記CMVポリペプチドは、
(a)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1を含み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または
(b)SEQ ID NO:1の少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され;ならびに
この項目で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はSEQ ID NO:23を含み;あるいは
この項目で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はアミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域はSEQ ID NO:23と少なくとも90%の配列同一性を有する、上記[5]に記載の使用するための組成物。
[7]前記ヘルパーT細胞エピトープは前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって代わり、前記CMVポリペプチドの前記N末端領域はSEQ ID NO:1のアミノ酸2-12に対応する、上記[5]~[6]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[8]前記Th細胞エピトープはPADRE配列であり、前記Th細胞エピトープはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され;あるいは、前記Th細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、前記Th細胞エピトープは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有し、好ましくはこれから構成される、上記[5]~[7]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[9]前記CMVポリペプチドは、CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:1の少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され;ならびに、前記アミノ配列はSEQ ID NO:23を含み、前記ヘルパーT細胞エピトープは前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって代わり、前記CMVポリペプチドの前記置き換えられたN末端領域は11~13の連続アミノ酸、好ましくは11の連続アミノ酸から構成され、さらに好ましくは、前記CMVポリペプチドの前記N末端領域はSEQ ID NO:1のアミノ酸2-12に対応する、上記[5]~[8]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[10]前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される、上記[5]~[9]のいずれかに記載の使用するための組成物。
[11]前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される、上記のいずれかに記載の使用するための組成物:
(a)SEQ ID NO:18;
(b)SEQ ID NO:21;
(c)SEQ ID NO:22;または
(d)SEQ ID NO:26。
[12]前記組成物の前記投与は少なくとも1つのCADパラメータまたは症状を、前記投与前の前記少なくとも1つのCADパラメータまたは症状と比べて低減させ、好ましくは前記少なくとも1つのCADパラメータまたは症状は皮膚病変またはかゆみのレベルまたは重症度グレードであり、さらに好ましくは皮膚病変の前記レベルまたは重症度グレードの前記低減は症状および病変スコアリング試験により決定される、上記のいずれかに記載の使用するための組成物。
[13](a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するウイルス様粒子(VLP);
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン-31抗原(cIL-31抗原)
を含む組成物であって、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有するタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され、重ねてさらに好ましくは前記抗原は、SEQ ID NO:22のアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;
(a)および(b)は前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の付着部位により、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される、組成物。
[14]前記VLPはキュウリモザイクウイルス(CMV)の改変VLPであり、前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される、上記[13]または[14]に記載の組成物。
[15]前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、好ましくは、前記スルフヒドリル基は、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA)との反応から誘導され、好ましくは前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される、上記[13]または[14]に記載の組成物:
(a)SEQ ID NO:18;
(b)SEQ ID NO:21;
(c)SEQ ID NO:22;または
(d)SEQ ID NO:26。
Claims (15)
- イヌ科、好ましくは飼いイヌのイヌアトピー性皮膚炎(CAD)を防止または治療する
方法において使用するための組成物であって、有効量の前記組成物が前記イヌ科、好まし
くは前記飼いイヌに投与され、前記組成物は
(a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するコア粒子;および
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキン
-31抗原(cIL-31抗原)
を含み、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有す
るタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少な
くとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも
98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくは
これから構成され;
(a)および(b)は前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の
付着部位により、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される、組成物。 - 前記コア粒子はウイルス様粒子(VLP)、好ましくは組換えVLPである、前記請求
項のいずれか一項に記載の使用するための組成物。 - 前記VLPは植物ウイルスに由来する、請求項2に記載の使用するための組成物。
- 前記VLPは少なくとも1つの改変VLPポリペプチドを含み、これから本質的に構成
され、あるいはこれから構成される改変VLPであり、前記改変VLPポリペプチドは、
(a)VLPポリペプチド、および
(b)ヘルパーT細胞エピトープ、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記VLPポリペプチドは、
(i)ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは植物ウイルスのコートタ
ンパク質のアミノ酸配列;または
(ii)変異アミノ酸配列、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記変異されるアミノ酸配列はウイルスの前記コートタンパク質のアミノ酸配列であり
、前記変異アミノ酸配列およびウイルスの前記コートタンパク質は、少なくとも90%、
好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましく
は少なくとも99%の配列同一性を示す、請求項2~3のいずれか一項に記載の使用する
ための組成物。 - 前記VLPはキュウリモザイクウイルス(CMV)の改変VLPであり、CMVの前記
改変VLPは、少なくとも1つの改変CMVポリペプチドを含み、これから本質的に構成
され、あるいはこれから構成され、前記改変CMVポリペプチドは、
(a)CMVポリペプチド、および
(b)ヘルパーT細胞エピトープ
を含み、または好ましくはこれから構成され;ならびに
前記CMVポリペプチドは、
(ii)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列;または
(ii)変異アミノ酸配列、
を含み、または好ましくはこれから構成され、
前記変異されるアミノ酸配列はCMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記
変異アミノ酸配列およびCMVの前記コートタンパク質は、少なくとも90%、好ましく
は少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%、重ねてより好ましくは少なく
とも99%の配列同一性を示す、請求項2~4のいずれか一項に記載の使用するための組
成物。 - 前記CMVポリペプチドは、
(a)CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、SEQ
ID NO:1を含み、または好ましくはこれから構成される、アミノ酸配列、または
(b)SEQ ID NO:1の少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、または好ましくはこれから構成され;ならびに
この請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はSEQ ID
NO:23を含み;あるいは
この請求項で(a)または(b)において規定される前記アミノ配列はアミノ酸配列領
域を含み、前記アミノ酸配列領域はSEQ ID NO:23と少なくとも90%の配列
同一性を有する、請求項5に記載の使用するための組成物。 - 前記ヘルパーT細胞エピトープは前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって代わり
、前記CMVポリペプチドの前記N末端領域はSEQ ID NO:1のアミノ酸2-1
2に対応する、請求項5~6のいずれか一項に記載の使用するための組成物。 - 前記Th細胞エピトープはPADRE配列であり、前記Th細胞エピトープはSEQ
ID NO:5のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成され;あるいは、
前記Th細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、前記Th細胞エピトープは、SEQ
ID NO:4のアミノ酸配列を有し、好ましくはこれから構成される、請求項5~7の
いずれか一項に記載の使用するための組成物。 - 前記CMVポリペプチドは、CMVのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、または
好ましくはこれから構成され、前記アミノ酸配列は、SEQ ID NO:1またはSE
Q ID NO:1の少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また
は好ましくはこれから構成され;ならびに、前記アミノ配列はSEQ ID NO:23
を含み、前記ヘルパーT細胞エピトープは前記CMVポリペプチドのN末端領域にとって
代わり、前記CMVポリペプチドの前記置き換えられたN末端領域は11~13の連続ア
ミノ酸、好ましくは11の連続アミノ酸から構成され、さらに好ましくは、前記CMVポ
リペプチドの前記N末端領域はSEQ ID NO:1のアミノ酸2-12に対応する、
請求項5~8のいずれか一項に記載の使用するための組成物。 - 前記改変CMVポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:
7のアミノ酸配列を含み、または好ましくはこれから構成される、請求項5~9のいずれ
か一項に記載の使用するための組成物。 - 前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記から選択されるアミノ配列を有するタ
ンパク質を含み、または好ましくはこれから構成される、前記請求項のいずれか一項に記
載の使用するための組成物:
(a)SEQ ID NO:18;
(b)SEQ ID NO:21;
(c)SEQ ID NO:22;または
(d)SEQ ID NO:26。 - 前記組成物の前記投与は少なくとも1つのCADパラメータまたは症状を、前記投与前
の前記少なくとも1つのCADパラメータまたは症状と比べて低減させ、好ましくは前記
少なくとも1つのCADパラメータまたは症状は皮膚病変またはかゆみのレベルまたは重
症度グレードであり、さらに好ましくは皮膚病変の前記レベルまたは重症度グレードの前
記低減は症状および病変スコアリング試験により決定される、前記請求項のいずれか一項
に記載の使用するための組成物。 - (a)少なくとも1つの第1の付着部位を有するウイルス様粒子(VLP);
(b)少なくとも1つの第2の付着部位を有する少なくとも1つのイヌインターロイキ
ン-31抗原(cIL-31抗原)
を含む組成物であって、
前記cIL-31抗原は、SEQ ID NO:22から選択されるアミノ配列を有す
るタンパク質、または、SEQ ID NO:22と少なくとも90%、好ましくは少な
くとも92%、さらに好ましくは少なくとも95%、重ねてさらに好ましくは少なくとも
98%アミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、または好ましくは
これから構成され、重ねてさらに好ましくは前記抗原は、SEQ ID NO:22のア
ミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され;
(a)および(b)は前記少なくとも1つの第1のおよび前記少なくとも1つの第2の
付着部位により、少なくとも1つの非ペプチド共有結合を介して連結される、組成物。 - 前記VLPはキュウリモザイクウイルス(CMV)の改変VLPであり、前記改変CM
Vポリペプチドは、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配
列を含み、または好ましくはこれから構成される、請求項13または14に記載の組成物
。 - 前記第2の付着部位はスルフヒドリル基であり、好ましくは、前記スルフヒドリル基は
、前記cIL-31抗原のN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA
)との反応から誘導され、好ましくは前記少なくとも1つのcIL-31抗原は、下記か
ら選択されるアミノ配列を有するタンパク質を含み、または好ましくはこれから構成され
る、請求項13または14に記載の組成物:
(a)SEQ ID NO:18;
(b)SEQ ID NO:21;
(c)SEQ ID NO:22;または
(d)SEQ ID NO:26。
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