JP6942313B2 - Ｃｍｖ由来改変ウイルス様粒子 - Google Patents

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アンドリス ツェルティンス，
アンドリス ツェルティンス，
ポール プンペンス，
ポール プンペンス，
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サイバ アーゲー
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Description

本発明は、植物ウイルスのキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス様粒子、特にＴｈ細胞エピトープ、特にユニバーサルＴｈ細胞エピトープを含むＣＭＶ由来改変ＶＬＰに関する。さらに、これらの改変ＶＬＰは、前記改変ＶＬＰに結合した抗原に対する免疫反応、特に抗体応答を引き起こすためのワクチンプラットホームとして機能するのが好ましい。Ｔｈ細胞エピトープ、特にユニバーサルＴｈ細胞エピトープの存在は、引き起こされる免疫反応のさらなる増加に繋がる。
関連技術
過去３０年間にわたり、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は発展し、特にワクチン開発の分野で受け入れられる技術になってきた（Ｚｅｌｔｉｎｓ Ａ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）５３：９２−１０７）。ますます大きくなるこれらのＶＬＰへの関心は、特に、それぞれＢ型肝炎およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）誘発子宮頸癌に対するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原およびＨＰＶカプシドタンパク質Ｌ１の市販ワクチンとしての開発と導入の成功により、高められた。さらに、ウイルス様粒子は、複合抗原に対して強力な免疫反応を誘発できる免疫キャリアとして特徴付けられてきた（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＧＴ ａｎｄ Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ（２００９）４９：３０３−２６、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＧＴ ａｎｄ Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００８）３８９：５２１−５３６、国際公開第２００２／０５６９０５号、同第２００３／０２４４８１号）。後者は、近い将来に、医学的および獣医学的目的のためのＶＬＰ系ワクチンを開発することを目的とした別の臨床的検討段階に入っている、いくつかのＶＬＰ系ワクチン候補をもたらした（Ｌｉｕ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）９３：５５３−５５９；Ｒｏｌｄａｏ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１０）９：１１４９−１１７６）。
これまで、微生物、植物、昆虫または哺乳動物ウイルス由来のＶＬＰが発展してきた。最近、主に、特有の翻訳後修飾をもたらす能力、対費用効果、産生速度および規模拡大性の観点から、植物がＶＬＰワクチンを産生するための経済的かつ迅速な代替プラットホームとなることを主な理由として、上記で参照したＶＬＰ系に加えて植物ウイルス由来のＶＬＰが注目を集めている（Ｃｈｅｎ Ｑ ａｎｄ Ｌａｉ Ｈ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１３）９：２６−４９；Ｚｅｌｔｉｎｓ Ａ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）５３：９２−１０７）。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ、ブロモウイルス科、ククモウイルス属）は、極めて広範囲の宿主を有する線形プラスセンス等軸植物ウイルスである。ウイルスゲノムは、３つの一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡおよびＲＮＡ３）からなり、コートタンパク質（ＣＰ）遺伝子は、ゲノムＲＮＡ３（約２２００ｎｔ）およびサブゲノムＲＮＡ４（約ｎｔ）の両方中に存在する。カプシドは、約２６ｋＤａの単一タンパク質種の１８０コピーを含む。宿主植物に関連する種々の症状に関連付けられるＣＭＶ由来の系統、例えば、ＣＭＶ−Ｂ系統、ＣＭＶ−Ｃ系統、ＣＭＶ−Ｄ系統、ＣＭＶ−Ｌ系統、ＣＭＶ−Ｓ系統、ＣＭＶ−Ｔ系統、ＣＭＶ−ＷＬ−系統、ＣＭＶ−Ｖ系統、ＣＭＶ−Ｆｎｙ系統、ＣＭＶ−Ｉｘ系統、ＣＭＶ−Ｑ系統、ＣＭＶ−Ｒ系統などの複数の異なる既知の系統が存在する（Ｃａｒｒｅｒｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（１９９９）１４４：１８４６−１８５７；Ｅｄｗａｒｄｓ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８１９８３、７３：１１１７−１１２０；ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ）。
近年、キメラ型のＣＭＶが提示系として機能するように、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のエピトープを外表面上に発現するように設計された。詳細に説明すると、ＣＭＶ疑似組換え型ＣＭＶ−Ｄ／ＳがＣＭＶ−Ｓ系統由来のゲノムＲＮＡ３ならびにＣＭＶ−Ｄ系統由来のＲＮＡ１およびＲＮＡ２を保持するように設計された。この系は、Ｘａｎｔｈｉタバコ植物での接種後に軽度のモザイクおよび葉脈透化などのウイルス症状を発症した。その後、ＣＰ遺伝子は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）エピトープをコードするように異なる位置に設計された。選択したペプチドはいわゆるＲ９ミモトープ、すなわち、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ２の多くの高頻度可変領域１（ＨＶＲ１）配列由来の合成ペプチドであった。慢性Ｃ型肝炎の患者由来の血清試料は、選択した遺伝子操作疑組換え体キメラ型ＣＭＶの１つに感染した粗製植物抽出物に対し大きな免疫反応性を示した。したがって、このような系が、有望な経口免疫戦略の開発を可能とする好適なキャリアとなり得るということが示唆された。セロリ、レタス、キュウリ、トマト、ニンジン、胡椒およびバナナはＣＭＶの宿主であるので、それらが能動的に植物中で複製し、したがって、食用ワクチンとして使用されることが想定できることから、後者は、いわゆる栄養補助食品の実現可能なバイオリアクタとしての植物の概念と一致するであろう。（Ｎａｔｉｌｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００４）１４９：１３７−１５４；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）２５：１４２−１５２；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：９１５−９２８；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）１５５：１１８−１２１；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）１６５：２１１−２１５；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２：８６６−８７６）。
Ｒ９ミモトープの挿入は、ＣＭＶ−Ｓ ＲＮＡ３のＣＰ遺伝子内の種々の位置で実施されている（ＡＦ０６３６１０，ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ）。１つの単一Ｒ９ミモトープの前記ＣＰ遺伝子内への挿入のために、Ｒ９ミモトープヌクレオチド配列を前記ＣＰ遺伝子の２５３、４７５、５２９位に挿入し、一方、２つのＲ９ミモトープの挿入のために、Ｒ９ミモトープヌクレオチド配列を３９２および５２９位に挿入した。最終生成物は、それぞれのウイルス粒子に対し、外表面に１８０または３６０個のＲ９ミモトープのコピーを保持するＣＭＶキメラ粒子であった。（Ｎａｔｉｌｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００４）１４９：１３７−１５４；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）２５：１４２−１５２；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：９１５−９２８；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）１５５：１１８−１２１；Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）１６５：２１１−２１５；Ｐｉａｚｚｏｌｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２：８６６−８７６）。
Ｒ９ミモトープのＣＭＶ−Ｓ ＲＮＡ３への挿入位置の選択は、次のいくつかの不可欠な因子：ｉ）カプシド中での追加の安定化の役割を有する通常とは異なるＮ末端らせん体を特徴とするＣＭＶコートタンパク質（ＣＭＶを安定化するタンパク質−ＲＮＡ相互作用に関与する、内部Ｒ−ドメインとして知られる高濃度の塩基性アミノ酸を含む（Ｗｉｋｏｆｆ ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３２：９１−９７））のＮ末端領域を保護する必要性（Ｓｍｉｔｈ ＴＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４：７５７８−７６８６））；ｉｉ）推定される免疫原性能力を発揮する機会を高めるための、外来性エピトープの表面位置；ｉｉｉ）改変クローンを産生することができる変異誘発経路の利用可能性、を考慮することに基づいているといわれてきた。これらの考慮すべき点を基準にして、上で示したａａ領域７０〜１９２および対応するヌクレオチド領域での作業に的を絞った。そのようにして調製したキメラＣＭＶは、宿主植物中全体に広がる能力を保持していたが、これは、植物中の外来性遺伝子発現のための、実現可能な植物ウイルスキャリアの構築における不可欠の目標である。ＥＬＩＳＡおよびＩＥＭ試験は、計画したように正しい位置でＲ９ミモトープが暴露されたことを実証した（Ｎａｔｉｌｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００４）１４９：１３７−１５４）。
さらに、ブタサーコウイルス特異的ワクチンの産生のためのキュウリモザイクウイルス系の発現系が最近報告された（Ｇｅｌｌｅｒｔ Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１２）７（１２）：ｅ５２６８８）。詳細には、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）カプシドタンパク質エピトープが、アミノ酸位置１３１の後ろのキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）−Ｒ系統の植物ウイルスコートタンパク質中に組み込まれた。異なるニコチアナ種で、組換え体の感染性および安定性を試験し、安定な組換えウイルス粒子を精製した。粒子のＰＣＶ誘発ブタ抗体に結合する能力を試験し、マウスおよびブタにおいて特異的抗体の誘発のために使用した。結果は、ＣＭＶ表面上に発現したＰＣＶエピトープがブタ抗体により認識され、それらは、ＰＣＶ特異的抗体応答を誘発することができた。免疫されたブタで行ったＰＣＶ２による刺激実験は、感染に対する部分的保護を示した。
現在まで報告されたＣＭＶの３つの安定なエピトープ挿入位置で、ＰＣＶ２カプシドタンパク質エピトープをキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質中に組み込んだ（Ｎｕｚｚａｃｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００７）１５２：９１５−９２８；Ｖｉｔｔｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）１６９：３３２−３４０）。これらの位置での組み込みエピトープは、植物中でのＣＭＶの増殖および長距離移動を邪魔しなかった。それらの内の２つは、ビリオンの外面上に提示され、一方、３つ目は、ビリオンの内側に向けて突出している。ＣＭＶカプシドの内表面のＲＮＡ結合と干渉しない正電荷を有するエピトープの発現のみをうまく試みることができるので、エピトープをビリオンの内側に向けて発現するには、静電気的制約がある。詳細には、第１の挿入位置は、ａａ８３〜８４位で、ＣＭＶ ＣＰのβＢβＣループの末端にある。組み込みエピトープは、ＣＭＶビリオンの表面上に発現される。第２の挿入位置は、ａａ１３１〜１３２位で、ＣＭＶ ＣＰのβＥ−αＥＦループの中央にある。組み込みエピトープは同様に、ＣＭＶビリオンの表面上に発現される。第３の挿入位置は、ａａ１７６〜１７７位で、βＧ−βＨループの中央にある。この後者の場合には、挿入エピトープは、ＣＭＶビリオンの内表面上に発現される。
さらに、ＣＭＶに基づくキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成が報告されており、動物ワクチンとしてのその使用が示唆されている（Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００６）１５１：１３７３−１３８６；Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００８）５９：１１７−１２１）。しかし、広く使用されている従来の大腸菌発現系によるＣＭＶのウイルスカプシドタンパク質（ＣＰ）の発現は、不溶性の封入体または極めて低量の可溶性タンパク質をもたらしたに過ぎなかった（Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（２００８）４９−５１）。他方では、ＣＭＶ−ＦｎｙのジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）発現コートタンパク質（ＣＰ）はＶＬＰを形成し、これは、経済的に重要な家禽の病原体である、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の異なる中和エピトープの表面提示用のキャリアとして機能する。この目的のために、融合体（Ｆ）由来のエピトープ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＮＨ）タンパク質およびタンデム型Ｆ−ＮＨペプチドを、Ｆｎｙ−ＣＭＶ ＣＰ（そのアミノ酸１９４〜１９９に対応する）の内部βＨ−βＩ（モチーフ５）中に遺伝的に融合し、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物中のＰＶＸベクターを介して発現させた。得られたキメラＣＭＶ ＶＬＰは、野生型ＣＭＶ粒子とは形態学的に識別不能である。さらに、精製ＮＨ−ＣＭＶ ＶＬＰで免疫したニワトリは、抗原特異的抗体応答を発生させたが、しかし、このように免疫したニワトリは、ＮＤＶによる実験的刺激に対し保護を示さなかった（Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００６）１５１：１３７３−１３８６；Ｎａｔｉｌｌａ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００８）５９：１１７−１２１；Ｃｈｅｎ Ｑ ａｎｄ Ｌａｉ Ｈ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１３）９：２６−４９）。
上述のように、大腸菌中のＣＭＶのウイルスカプシドタンパク質（ＣＰ）の発現は、不溶性の封入体または極めて低量の可溶性タンパク質をもたらしたに過ぎなかった（Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（２００８）４９−５１）。他方では、Ｘｕらは、種々の長さの二本鎖ＤＮＡが誘引となって、遺伝的に組換えたＣＭＶのＣＰをインビトロで生物学的ナノチューブに組み上げることができた（Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（２００８）４９−５１）。しかし、この目的のために、Ｘｕらは、純粋な可溶性ＣＭＶ ＣＰを産生する必要があった。これは、大腸菌中でＣＰの発現後、組換え操作を行うことにより実現された。この手順は、２１８個のアミノ酸残基の完全長ＣＰ（ＩＤ ＡＢ００８７７７、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ）の発現後の封入体の分離および精製、続けて、変性を介した封入体の可溶化、および最後に、変性タンパク質に対するリフォールディング手順の適用を含む。
たとえＶＬＰ系ワクチンの開発の過程で進展がなされたとしても、さらに異なったＶＬＰ系に対する要求がまだ存在する。特に、ワクチンは、免疫された対象および個体の種々の抗体応答を誘発し、抗体応答は、１００倍の変化を超える範囲に及ぶことが多い。さらに、Ｂ型肝炎に対するワクチンなどのいくつかのワクチンは、一定数の非応答者が発生する。非応答性は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子と関連することが知られており、良好なヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞応答を誘発できないことが、これらの個体で認められる不十分な抗体応答の原因であると考えられている（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）３２６：２０−２８）。さらに、年配者および高齢者は、一般的に不十分な抗体応答を開始し、不十分なＴｈ細胞応答は、この場合も、非効率的な抗体応答の原因であると考えられる。したがって、実質的に全ての対象および個体において良好なＴｈ細胞応答を誘発するワクチンは、ワクチン開発の分野での重要な目標である。
我々は、意外にも、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質を、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープを組み込むように、好ましくはユニバーサルＴｈ細胞エピトープを組み込むように、改変できることを見出した。これらの強力なＴｈ細胞エピトープは、凝集を起こすことが知られており、したがって、ＶＬＰを生じる発現時に自己集合を妨害するであろうと予測されるので、後者は特に意外である。さらに、本発明は、Ｔｈ細胞エピトープ、好ましくはユニバーサルＴｈ細胞エピトープを含む改変ＣＭＶ ＶＬＰを提供するのみでなく、さらに、本発明の改変ＣＭＶ ＶＬＰならびに野性型ＣＭＶ ＶＬＰは、大腸菌中での発現により得られ、大腸菌中でＣＭＶ ＶＬＰを産生する以前の試みでは、ＶＬＰではなく凝集体を生じたので、これもまた以外である。さらに、本発明のＶＬＰは、キャリアプラットホーム、特にワクチンプラットホームとして機能し、それに対して免疫反応が引き起こされることが望まれる抗原が本発明のＶＬＰに結合される。本発明のＣＭＶの改変ＶＬＰ中に組み込まれた導入Ｔｈ細胞エピトープは、ＶＬＰの免疫原性をさらに高め、本発明の組成物により引き起こされる全体的免疫反応の増加、特に、抗体応答の増加をもたらす。
したがって、第１の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列および前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
別の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列および前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し；前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端に融合されるか；（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端に融合されるか；（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続アミノ酸の領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記連続したアミノ酸の置換された領域と、ヘルパーＴ細胞エピトープとの間の配列同一性が少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるか；または（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５連続アミノ酸からなる。
別の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、前記ＣＭＶ由来のＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むまたは好ましくはそれからなる、少なくとも１種のＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列および前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、前記ＣＭＶ由来のＶＬＰは前記ＣＭＶポリペプチドの大腸菌中での発現により得られ、好ましくは前記発現は、１０℃〜２５℃の温度、好ましくは２０℃の温度で行われる。
別の態様では、本発明は改変ウイルス様粒子を含む組成物を提供する。さらに、これらの改変ＶＬＰは、前記改変ＶＬＰに結合した抗原に対する特定の抗体応答における免疫反応を引き起こすためのワクチンプラットホームとして機能するのが好ましい。Ｔｈ細胞エピトープ、特にユニバーサルＴｈ細胞エピトープの存在は、引き起こされる免疫反応のさらなる増加に繋がる。
さらなる態様およびその好ましい実施形態は、本明細書でさらに詳細に記載される。
図４は、精製ＣＭＶ由来ＶＬＰの質量分析のチャートである。Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使ってマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。質量の決定には、タンパク質分子量（ＭＭ）較正標準ＩＩ（２２．３−６６．５ｋＤａ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を使用した。
ｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドマップ図である。全ての関連遺伝子および制限酵素部位の相対位置が示されている。 ＣＭＶｗｔタンパク質の発現およびショ糖勾配精製のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析の図である。Ｍ−タンパク質サイズマーカー；Ｓ−超音波処理後の可溶性タンパク質；Ｐ−超音波処理後の不溶性のタンパク質；Ｐｓ−硫酸アンモニウムペレット中の可溶性タンパク質（ショ糖勾配超遠心分離用の試料）；Ｐｐ−硫酸アンモニウムペレット中の不溶性のタンパク質；１、２、３、４、５、６−３５ｍｌ勾配管の底部からのショ糖勾配画分。 精製ＣＭＶｗｔ ＶＬＰの動的光散乱の図である。粒子のサイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使って検出した。 精製ＣＭＶｗｔ ＶＬＰの電子顕微鏡分析の写真である。ＶＬＰの形態学的分析に関しては、ＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。 ＣＭＶ野生型（「ｗｔ」；理論ＭＭ＝２４０６９；検出ＭＭ＝２４０５８） ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ；理論ＭＭ＝２４１６１（第１メチオニン不含）；検出ＭＭ＝２４１６０ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０；理論ＭＭ＝２４４８３（第１メチオニン不含）；検出ＭＭ＝２４４７７ 精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの動的光散乱の図である。粒子のサイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使って検出した。 精製ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの電子顕微鏡分析の写真である。ＶＬＰの形態学的分析に関しては、ＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。 精製ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの動的光散乱の図である。粒子のサイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使って検出した。 精製ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの電子顕微鏡分析の写真である。ＶＬＰの形態学的分析に関しては、ＪＥＭ−１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。 ＣＭＶ野生型ＶＬＰの免疫後の抗体応答を測定した。マウス群に対し、１０μｇ、１μｇまたは０．１μｇのＣＭＶ−ｗｔ ＶＬＰで、０日目および７日目に免疫した。０日目（免疫前）、７日目、１４および２８日目に特異的全ＩｇＧ力価を測定した。群当たりのマウス＝４匹。 ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの免疫後の抗体応答を測定した。マウス群を、１０μｇ、１μｇまたは０．１μｇのＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰで、０日目および７日目に免疫した。０日目（免疫前）、７日目、１４および２８日目に特異的全ＩｇＧ力価を測定した。群当たりのマウス＝４匹。 ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの免疫後の抗体応答を測定した。マウス群を、１０μｇ、１μｇまたは０．１μｇのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで、０日目および７日目に免疫した。０日目（免疫前）、７日目、１４および２８日目に特異的全ＩｇＧ力価を測定した。群当たりのマウス＝４匹。 マウスのアレルゲンＦｅｌ Ｄ１に対する体液性応答を検出した。主要ネコアレルゲンＦｅｌ Ｄ１をＣＭＶ Ｎｐａｄｒに結合させた。マウスを、５μｇのＦｅｌ Ｄ１−ＶＬＰで０日目および７日目に免疫した。示した時点でのＦｅｌ Ｄ１特異的抗体を測定した。群当たりのマウス＝５匹。 マウスのアレルゲンＦｅｌ Ｄ１に対する体液性応答を検出した。主要ネコアレルゲンＦｅｌ Ｄ１をＣＭＶ Ｎｔｔ８３０に結合させた。マウスを、５μｇのＦｅｌ Ｄ１−ＶＬＰで０日目および７日目に免疫した。示した時点でのＦｅｌ Ｄ１特異的抗体を測定した。群当たりのマウス＝５匹。 ペプチド由来α−シヌクレインに対する体液性応答の検出結果を示す。０日目および１４日目に２０μｇの、ＣＭＶ Ｎｔｔ８３０に結合したペプチド由来のα−シヌクレインでマウスを免疫した。示した時点でのペプチド特異的抗体力価を測定した。マウス数＝４匹。 マウスの自己タンパク質ＩＬ１７に対する抗体応答を検出した。サイトカインＩＬ１７をＣＭＶ Ｎｔｔ８３０に結合させた。０日目および１４日目に２０μｇのＩＬ１７−ＣＭＶ Ｎｔｔ８３０でマウスを免疫した。示した時点でのＩＬ１７特異的抗体を測定した。マウス数＝３匹。 大腸菌Ｃ２５６６細胞由来のＦ１２Ｈ６ＧＧＣタンパク質の発現および精製のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｍ−タンパク質サイズマーカー；Ｓ−可溶性タンパク質画分；Ｐ−壊死組織片；Ｆ−Ｎｉ−ＩＤＡカラムからの通過画分（非結合タンパク質）；Ｗ１、Ｗ２−洗浄画分（２ｘ２ｍｌ １ｘＬＥＷ緩衝液）Ｗ３、Ｗ４洗浄画分（２ｘ２ｍｌ １ｘＬＥＷ＋１０ｍＭイミダゾール）；Ｅ１、Ｅ２−溶出画分（２ｘ１．５ｍｌ Ｅ緩衝液 ２５０ｍＭイミダゾール）。 精製Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの質量分析のチャートである。Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの計算平均質量は、２００８９．８Ｄａに相当する。２０１０５．３の観察質量は、メチオニンの１個の硫黄がスルフォキシド基に酸化された場合のＦ１２Ｈ６ＧＧＣに相当する。 Ｆ１２ＧＧＣのクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の図である。（Ａ）ＡｍＳ−５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４後の溶解沈殿物。ＤＥＡＥカラム処理およびその後のモノＱによる精製由来の種々の画分：ＦＴ−通過画分、Ａ４〜Ａ７−増加ＮａＣｌ勾配による溶出画分、（Ｂ）ブチルＨＰカラム（ＨＩＣ）による最終精製。 Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから提供された、天然のＦｅｌ ｄ１対して産生されたｍＡｂを使ったサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。ｍＡｂはＦ１２Ｈ６ＧＧＣおよび天然のＦｅｌ ｄ１を等しく良好に認識する。 天然のＦｅｌ ｄ１に対する好塩基球活性化テスト（ＢＡＴ）の結果を示すグラフである。 Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣに対する好塩基球活性化テスト（ＢＡＴ）の結果を示すグラフである。Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣおよび天然のＦｅｌ ｄ１は、ＣＣＲ３＋好塩基球上のＣＤ６３の発現上昇により示されるネコアレルギー患者由来の血液中の類似の好塩基球活性化レベルを誘発する。 Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと単純に混合された１０μｇのＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ ＶＬＰ（Ｆｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰまたはＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰ）またはＣＭＶ−ＶＬＰ（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰまたはＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰ）の投与を０日目および１４日目に受けたマウスの抗体応答を示すグラフである。０、１４および２１日目に血清を集め、天然のＦｅｌ ｄ１特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡで分析した。Ｎ＝３。
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」という用語は、非複製性もしくは非感染性の、好ましくは非複製性および感染性ウイルス粒子を意味し、または非複製的または非感染性の、好ましくは非複製性および非感染性の、ウイルス粒子、好ましくはウイルスのカプシドに類似している構造体を意味する。本明細書で使用される場合、「非複製性」という用語は、ＶＬＰにより含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書で使用される場合、「非感染性」という用語は、宿主細胞に入ることができないことを意味する。本発明では、ウイルス様粒子は、それがウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠いているために、非複製性および非感染性である。本発明では、ウイルス様粒子は、それらのゲノムとは別の核酸を含んでよい。組換えで産生されたウイルス様粒子は通常、宿主細胞由来ＲＮＡを含む。本発明におけるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドから構成されるウイルスカプシドである。ウイルス様粒子は通常、典型的には、ウイルス様粒子当たり、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、または３６０個を超えるタンパク質サブユニットを含むコートタンパク質から構成される巨大分子集合体である。通常、好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復組織を有するウイルスカプシドまたはウイルスカプシド様構造体がもたらされる。ウイルス様粒子の１つの特徴は、高度秩序化および反復配置のそのサブユニットである。
ＣＭＶ由来のウイルス様粒子：「ＣＭＶ由来のウイルス様粒子」またはＣＭＶ ＶＬＰという用語は、少なくとも１種のＣＭＶポリペプチドを含む、または好ましくはそれから本質的になる、または好ましくはそれからなるウイルス様粒子を意味する。好ましくは、ＣＭＶ由来のウイルス様粒子は、前記ＣＭＶポリペプチドを、主タンパク質成分として、さらにより好ましくは、カプシド構造の唯一のタンパク質成分として含む。通常、好ましくは、ＣＭＶ由来のウイルス様粒子は、ＣＭＶのカプシドの構造に類似している。ＣＭＶ由来のウイルス様粒子は、非複製性および／または非感染性であり、ＣＭＶの複製機構をコードする少なくとも１種の遺伝子または複数の遺伝子を欠いており、また通常、ウイルスの宿主への結合または宿主への侵入の原因となるタンパク質（単一または複数）をコードする遺伝子（単一または複数）を欠いている。この定義はまた、上述の遺伝子（単一または複数）がまだ存在するが不活性であるウイルス様粒子も含む。ＣＭＶ由来のウイルス様粒子を非複製性および／または非感染性にする好ましい方法は、紫外線照射、ホルムアルデヒド処理などの物理的または化学的不活性化によるものである。好ましくは、ＣＭＶ由来のＶＬＰは、ＣＭＶの複製機構をコードする遺伝子（単一または複数）を欠いており、また、ウイルスの宿主への結合または宿主への侵入の原因となる、またはタンパク質（単一または複数）をコードする遺伝子（単一または複数）も欠いている。またより好ましくは、非複製性および／または非感染性ウイルス様粒子は、組み換え遺伝子技術により得られる。組換えにより産生した本発明によるＣＭＶ由来のウイルス様粒子は、通常、好ましくは、ウイルスゲノムを含まない。２つ以上のポリペプチド種を含むウイルス様粒子は、多くの場合モザイクＶＬＰと呼ばれるが、これも本発明に包含される。したがって、一実施形態では、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも２つの異なるポリペプチド種を含み、前記ポリペプチド種の少なくとも１つは、ＣＭＶポリペプチドである。好ましくは、ＣＭＶ由来のＶＬＰは、典型的にはＶＬＰ当たり１８０個のコートタンパク質サブユニットを含むＣＭＶコートタンパク質から構成される巨大分子集合体である。通常、好ましくは、本明細書で使用される場合、ＣＭＶ由来のＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる、少なくとも１種のＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
ペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により直線的に結合したアミノ酸モノマーから構成されるポリマーを意味する。ポリペプチドという用語は、アミノ酸の連続鎖を意味し、特定の長さの産物を意味しない。したがって、ペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）」という用語は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる、ポリペプチドを意味し、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列、すなわち、前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。通常、好ましくは、ＣＭＶポリペプチドは、発現時に自己集合によりＣＭＶ由来のウイルス様粒子を形成することができる。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）コートタンパク質（ＣＰ）：本明細書で使用される場合、「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）」という用語は、天然のキュウリモザイクウイルスのコートタンパク質を意味する。キュウリモザイクウイルスの極めて広い宿主範囲に起因して、多くの異なるＣＭＶの系統および分離株が知られており、前記系統および分離株のコートタンパク質の配列が決定されてきており、そのため、当業者には既知である。前記ＣＭＶのコートタンパク質（ＣＰ）の配列は、ジェンバンク、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ、またはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの既知のデータベースに記載されており、それらから検索可能である。記載されているＣＭＶのＣＰの例は、ＣＡＤ９２０３４．１、ＣＤＯ３３９６１．２、ＡＨＺ８９４０４．１、ＣＤＯ３３９６３．１、ＡＣＮ６００３６．１、ＣＡＣ１８６６０．１、ＣＡＣ１８６６１．１、ＣＡＣ１８６５８．１、ＣＡＣ１８６５７．１、ＣＡＣ１８６５９．１、ＡＦＳ６４３２１．１、ＡＦＳ６４３２０．１、ＡＢＧ７６７９２．１、ＣＡＩ６８０１５．１、ＡＡＱ２２９９２．１、ＡＥＭ３６０５１．１、ＡＥＭ３６０４８．１、ＡＤＡ７７１３４．１、ＡＩＳ２２６９０．１、ＡＧＴ１５７０６．１、ＡＦＲ４４５５５．１、ＡＨＹ２２５７４．１、ＡＣＭ８９０９７．１、ＡＡＢ０７１３７．１、ＡＡＤ１７９２７．１、ＡＡＭ８１３７１．１、ＡＡＭ８１３６５．１、ＡＡＭ８１３７４．１、ＡＡＭ８１３７２．１、ＡＡＭ８１３６８．１、ＡＢＣ１８３１８．１、ＡＡＸ７０９６６．１、ＡＡＵ１４８６４．１、ＡＨＪ１１２３０．１、ＡＨＪ１１２２９．１、ＡＨＪ１１２２８．１、Ｏ４０９８０．１、ＣＡＢ４３５１０．１、Ｑ６６１４３．１、ＣＡＡ７７０６５．１、ＣＡＢ７７３９０．１、ＣＡＣ１８６６６．１、ＮＰ＿０４０７７７．１、Ｐ１６４８９．１、ＡＧＶ３９２１６．１、ＡＧＷ５１６００．１、ＡＧＮ５６０７４．１、ＡＧＮ５６０５０．１、ＡＧＧ１６１５９．１、ＡＧＧ１６１４５．１、ＡＧＧ１６１４３．１、ＡＦＺ９９０１１．１、１４０７１３１Ａ、ＣＡＡ７１８３４．１、ＣＡＡ０７４１１．１、ＣＡＣ１８６６５．１、Ｑ６６１３５．１、１Ｆ１５＿Ａ、Ｏ４０９８３．１、Ｑ００２５９．１、ＡＥＲ２５３５０．１、ＡＥＲ２５３４８．１、ＡＤＮ８４９２２．１、ＡＢＵ９５６１１．１、ＢＡＦ９３９１６．１、ＢＡＦ９３９１４．１、ＡＡＹ４６２３９．１、ＡＡＹ４６２３３．１、ＡＡＹ４６２３５．１、ＡＡＹ４６２３１．１、ＡＡＹ４６２３０．１、ＡＡＹ４６２３７．１、ＢＡＦ４５１３０．１、ＡＢＭ４６６１１．１、ＡＢＣ００９２５．１、ＡＡＹ４２６２５．１、ＣＡＨ２５５３３．１、ＣＡＨ２５５４１．１、ＣＡＨ２５５３９．１、ＡＡＶ６３９８０．１、ＡＡＱ８９５９６．１、ＡＡＱ８９５７１．１、ＡＡＱ８９５７０．１、ＡＡＱ８３６９７．１、ＡＡＱ８３６８９．１、ＡＡＫ５２４２３．１、ＣＣＮ２７４４９．１、ＣＥＦ３９５１６．１、ＣＡＥ５１９２６．１、ＣＡＣ１３１４６．１、ＢＡＭ１５８４０．１、ＡＥＫ３３３９６．１、ＡＢＹ２１４１７．１、ＡＢＭ８９１５６．１、ＣＡＩ８４６２９．１、ＡＧＡ２０６１７．１、ＡＡＯ１７７２５．１、ＣＡＤ４２３３８．１、ＡＢＯ１８５８５．１、ＣＤＦ７７３３７．１、ＣＡＧ２５７１０．１、ＣＡＧ２５４３０．１、ＣＡＥ３０３３６．１、ＢＡＦ４５３７８．１、ＡＡＤ１７９２５．１、ＡＧＶ３９２１１．１、ＢＡＡ０７８５８．１、Ｑ６６１４１．１、Ｏ４０９８１．１、ＡＣＢ８７２１０．１、ＣＡＩ７７６２６．１、ＣＡＨ２５５２１．１、ＡＢＧ８９１３８．１、ＡＧＴ１５７１２．１、ＡＧＴ１５７０３．１、ＡＩＩ０１１３４．１、ＡＩＣ７６５７９．１、ＡＩＣ７６５７６．１、ＡＩＣ７６５７４．１、ＡＩＣ７６５７３．１、ＡＩＢ０９１７３．１、ＡＩＢ０９１７２．１、ＡＤＦ８１０４３．１、ＡＣＱ９９３４９．１、ＡＣＱ９９３４８．１、ＣＢＦ０３４０３．１、ＣＢＦ０３４０５．１、ＣＡＸ４５８７２．１、ＣＡＸ４５８７１．１、ＡＣＨ４８０４８．１、ＡＡＧ０１４５１．１、ＡＡＡ４６４０９．１、ＡＡＤ４５２４９．１、ＡＡＧ２５０５３．１、ＡＡＡ４６４１０．１、ＡＡＡ４６４１１．１、ＡＡＡ４６４１２．１、ＡＢＢ８９０５２．１、ＡＡＹ１９２８５．１、ＡＡＷ２１９８１．１、ＡＡＷ２１９８３．１、ＡＡＡ７４４８３．１、ＡＨＬ３０１９５．１、ＢＡＡ９５６０１．１、Ｑ００２６１．１、ＣＡＢ８９７９９．１、ＡＧＺ６３８８７．１、ＢＡＮ６７６６６．１、ＡＦＺ６２４９８．１、ＡＦＺ６２４９５．１、ＡＦＺ６２４９４．１、ＡＧＮ５６０９８．１、ＡＧＮ５６０２８．１、ＡＧＧ１６１５５．１、ＡＧＧ１６１５１．１、ＡＣＳ８３８１４．１、ＡＣＳ８３８１０．１、ＡＣＳ８３８００．１、ＡＣＳ８３７９１．１、ＣＣＭ８０４１３．１、ＣＣＭ８０４１１．１、ＣＣＭ８０４０９．１、ＡＦＸ６８４３２．１、ＡＦＸ６８４２８．１、ＣＡＩ３９２３５．１、ＣＡＪ２００２１．１、ＣＡＥ５１９２４．１、ＡＡＳ５７９４６．１、Ｑ６６１５４．１、Ｑ００２６０．１、ＣＡＡ６１８０２．１、Ｐ２１３６８．１、ＢＡＢ１１６９３．１、ＡＦＶ９９５２３．１、ＡＦＶ９９５１５．１、ＡＥＲ２５３５１．１、ＡＦＭ５６０３７．１、ＡＦＪ９２０２２．１、ＡＦＨ８８６８７．１、ＡＦＣ４０２０７．１、ＢＡＬ６３１６６．１、ＡＦＡ５３１６９．１、ＡＦＡ５３１６７．１、ＢＡＬ６１１９４．１、ＡＥＵ１２５０５．１、ＡＥＲ３５１１９．１、ＡＥＫ８６５１３．１、ＡＥＫ６９５２５．１、ＡＥＫ６９５２４．１、ＡＥＫ３３３９５．１、ＡＥＫ３３３９３．１、ＡＥＧ７９９１１．１、ＡＤＺ５４７６７．１、ＡＤＺ５４１１１．１、ＡＤＸ８６７４６．１、ＡＤＮ８４９２３．１、ＡＣＲ１４８２８．１、ＡＣＲ１４８２７．１、ＡＢＵ６２５７８．１、ＡＣＡ１３２８１．１、ＡＢＺ８０８２６．１、ＡＢＹ４７９０３．１、ＡＢＹ２１４２４．１、ＡＢＹ２１４２０．１、ＡＢＹ２１４１９．１、ＡＢＹ２１４１８．１、ＡＢＹ２１４１３．１、ＡＢＸ３８９９２．１、ＡＢＶ５５３８９．１、ＡＢＶ４９６１８．１、ＡＢＯ１８５８８．１、ＡＢＯ１８５８９．１、ＡＢＮ７２５９０．１、ＡＢＮ７２５９１．１、ＡＢＮ１２３１９．１、ＡＢＮ１２３１６．１、ＢＡＦ４４９３９．１、ＡＢＭ４６６１２．１、ＣＡＪ１５１５８．１、ＡＢＣ００９２２．１、ＡＢＣ００９２１．１、ＡＢＣ００９２８．１、ＡＢＣ００９２３．１、ＡＢＩ９４１４５．１、ＡＢＩ９４１５１．１、ＡＢＩ９４１２９．１、ＡＢＩ９４１５０．１、ＢＡＦ３３３８４．１、ＡＢＩ９３１８１．１、ＡＢＥ６８９０５．１、ＡＢＣ００９２７．１、ＡＡＳ４８５４５．１、ＡＡＲ８９４７０．１、ＡＡＲ２３５２９．１、ＡＡＱ８２６９８．１、ＡＡＭ９５２４１．１、ＡＡＭ９７６７７．１、ＡＡＫ５２９７７．１、ＡＡＷ７１９６７．１、ＡＢＪ５５７８０．１、ＣＡＨ１７６９３．１、ＣＡＨ１７７００．１、ＣＡＨ１７６９２．１、Ｑ６６１４０．１、ＡＢＭ６３３７６．１、ＡＧＴ１５７０４．１、ＣＡＢ４１４９１．１、ＡＡＲ８９４７８．１、ＣＣＪ０９６３４．１、ＡＥＫ６９５２７．１、ＡＣＳ８３８０１．１、ＡＩＣ７６５８２．１、ＡＨＪ５８８８４．１、ＡＨＪ１１２３１．１、ＡＧＪ９４７０７．１、ＡＣＳ８３７９８．１、ＡＣＳ８３７９３．１、ＡＢＫ８１６５２．１、ＡＡＳ５７９４５．１、ＡＡＮ０４４８３．１、ＡＤＯ６６６５９．１、ＡＡＮ１７７７７．１、ＡＤＧ２６７５４．１、ＡＦＶ９９５２０．１、ＡＢＤ７３００６．１、ＡＣＥ０７０２４．１、ＡＢＤ６４２２０．１、ＡＢＤ７２５７５．１、ＡＢＰ８７９７８．１、ＡＢＮ１３９６１．１、ＡＡＹ８５６２７．１、ＡＧＧ１６１３９．１、ＡＣＳ８３８１１．１、ＣＡＨ１７６９９．１、ＣＡＨ１７６９４．１、ＡＦＶ６９２４０．１、ＡＣＢ５６６０２．１、ＡＤＪ１０６３７．１、ＡＢＭ４６６１４．１、ＡＡＹ４５７４９．１、ＡＡＡ７４４８４．１、ＣＡＨ１７６９７．１、ＡＤＡ６３４８４．１、ＡＤＡ６３４８２．１、ＡＤＡ６３４８０．１、Ｑ８３２５１．１、ＡＩＣ７６５８４．１、ＡＩＣ７６５８３．１、ＡＡＫ２７１６９．１、ＡＢＣ００９２４．１、ＡＣＤ６２５２０．１、ＡＢＯ１８５９１．１、ＡＡＯ６２５７５．１、ＡＡＬ４８２２３．１、ＡＩＡ９９５２５．１、ＣＡＨ１７６９８．１、ＡＡＺ３８７２５．１、ＡＡＦ０９２４６．２、ＣＡＨ１７７０１．１、ＡＣＢ５８３０５．１、ＡＧＧ１６１５８．１、ＣＡＨ１７６９５．１、ＡＨＪ５８８８３．１、ＡＥＺ０３８３６．１、ＢＡＢ６３９５９．１、ＡＣＤ６２５１９．１、ＢＡＦ９３９１２．１、ＡＡＺ７８３５４．１、ＡＣＮ３８３２６．１、ＡＦＶ９９５２２．１、ＡＤＺ５４１０９．１、ＣＡＡ４６１５１．１、ＡＧＶ３９２１３．１である。ＣＭＶコートタンパク質のさらなる例は、配列番号１〜３に示されている。
これらの系統および分離株が、コートタンパク質のＮ末端を含む異なるタンパク質ドメインで極めて類似したコートタンパク質配列を有することは注目に値する。特に、完全に配列決定された全てのＣＭＶ分離株の９８．１％は、それらのコートタンパク質配列中の最初の２８個のアミノ酸内に８５％を超える配列同一性を共有している。さらに、完全に配列決定された全てのＣＭＶ分離株の７９．５％は、それらのコートタンパク質配列中の最初の２８個のアミノ酸内に９０％を超える配列同一性を共有している。
通常、好ましくは、本発明で使われるＣＭＶのコートタンパク質は、発現時に自己集合によりＣＭＶ由来のウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、本発明で使われるＣＭＶのコートタンパク質は、大腸菌中での発現時に自己集合によりＣＭＶ由来のウイルス様粒子を形成することができる。
配列番号１は、ラトビアのリガの個人庭園から収集されたＣＭＶ感染ユリの葉から単離され、クローン化されたＣＰのアミノ酸配列に相当する。したがって、好ましくは、本明細書で使用される場合、「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質」という用語は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を意味し、前記アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む、または好ましくはそれからなる。
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶのコートタンパク質は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列は、配列番号１の連続アミノ酸２〜２７である配列番号２１を含むか、またはアミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有する。Ｔｈ細胞エピトープが、本発明のＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域に置き換わるのが好ましいので、このことは特に好ましい。ＣＭＶのＣＰのＮ末端は実施例で好ましいものとして使用されている配列に対して配列同一性が高いことにより、凝集を生じさせることが多いＴｈ細胞エピトープによる前記Ｎ末端領域の置換に関係なく、ＣＰの発現時に適切に集合させることが確実に可能となる。
またさらなる極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶのコートタンパク質は、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列は、配列番号１、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなり；（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、配列番号１の連続アミノ酸２〜２７である配列番号２１を含むか、または（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有する。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」という用語は、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含む、または好ましくはそれから本質的になる、または好ましくはそれからなるように改変されたＣＭＶ由来のＶＬＰを意味し、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶポリペプチド、およびヘルパーＴ細胞エピトープを含む、または好ましくはそれらからなる。通常好ましくは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端に融合されるか、（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端に融合されるか、（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続アミノ酸の領域を置換し、この場合、前記ＣＭＶポリペプチドの前記連続アミノ酸の置換された領域と、ヘルパーＴ細胞エピトープとの間の配列同一性が少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるか、または（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸からなる。好ましくは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸、および最も好ましくは１１、１２または１３個の連続アミノ酸、からなる。好ましくは本発明の前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、ＣＭＶ由来の組換え型改変ＶＬＰである。
改変ＣＭＶポリペプチド：本明細書で使用される場合、「改変ＣＭＶポリペプチド」という用語は、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶポリペプチド、およびヘルパーＴ細胞エピトープを含む、または好ましくはそれらからなるように改変されたＣＭＶポリペプチドを意味する。通常、改変ＣＭＶポリペプチドは、発現時に自己集合によりＣＭＶ由来のウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、改変ＣＭＶポリペプチドは、組換え型改変ＣＭＶポリペプチドであり、大腸菌中で発現時に自己集合によりＣＭＶ由来のウイルス様粒子を形成することができる。
ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域：本明細書で使用される場合、「ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域」という用語は、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端、特に前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端、または前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記ＣＭＶのコートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合は、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の領域であるが、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の２つ目のアミノ酸から始まるＮ末端の領域を意味する。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合には、実用的な観点から、メチオニンをコードする開始コドンが通常、除去され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加されるであろう。さらに、好ましくは、１つ、２つまたは３つの追加のアミノ酸、好ましくは１つのアミノ酸が、必要に応じて、クローニングを目的として、最初のメチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入されてよい。本明細書で使用される場合、「ＣＭＶポリペプチドまたはＣＭＶコートタンパク質の変異アミノ酸配列のＮ末端領域」という用語は、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列、または前記変異アミノ酸配列がＮ末端メチオニン残基を含む場合は、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の領域であるが、前記ＣＭＶポリペプチドもしくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の２つ目のアミノ酸から始まるＮ末端の領域を意味する。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合には、実用的な観点から、メチオニンをコードする開始コドンが通常、除去され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加されるであろう。さらに、好ましくは、１つ、２つまたは３つの追加のアミノ酸、好ましくは１つのアミノ酸が、必要に応じて、クローニングを目的として、最初のメチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入されてよい。
組換え型ポリペプチド：本発明においては、「組換え型ポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つのステップを含むプロセスにより得られるポリペプチドを意味する。通常好ましくは、組換え型ポリペプチドは、原核生物発現系で産生される。当業者なら、大腸菌などの原核生物発現系で発現される組換えにより産生されたポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得ることは明らかである。Ｎ末端メチオニン残基は通常、組換え型ポリペプチドの成熟中に、発現宿主中で組換え型ポリペプチドから切断される。しかし、Ｎ末端メチオニンの切断は、不完全な場合が多い。したがって、組換え型ポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有するポリペプチドまたは有さないポリペプチド（この点以外は同一）の混合物を含んでよい。通常好ましくは、組換え型ポリペプチドの調製物は、１０％未満、より好ましくは５％未満、およびさらにより好ましくは１％未満のＮ末端メチオニン残基を有する組換え型ポリペプチドを含む。
組換え型ＣＭＶポリペプチド：「組換え型ＣＭＶポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つのステップを含むプロセスにより得られる上記で定義のＣＭＶポリペプチドを意味する。通常好ましくは、組換え型ＣＭＶポリペプチドの調製物は、１０％未満、より好ましくは５％未満、およびさらにより好ましくは１％未満のＮ末端メチオニン残基を有する組換え型ＣＭＶポリペプチドを含む。したがって、本発明の組換え型ウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基を有するポリペプチドまたは有さないポリペプチド（この点以外は同一）を含んでよい。
組換え型改変ＣＭＶポリペプチド：「組換え型改変ＣＭＶポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つのステップを含むプロセスにより得られる上記で定義の改変ＣＭＶポリペプチドを意味する。通常好ましくは、組換え型改変ＣＭＶポリペプチドの調製物は、１０％未満、より好ましくは５％未満、およびさらにより好ましくは１％未満のＮ末端メチオニン残基を有する組換え型改変ＣＭＶポリペプチドを含む。したがって、本発明の組換え型ウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基を有するポリペプチドまたは有さないポリペプチド（この点以外は同一）を含んでよい。
組換え型ウイルス様粒子：本発明においては、「組換え型ウイルス様粒子」という用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つのステップを含むプロセスにより得られるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を意味する。通常好ましくは、組換え型ウイルス様粒子は、少なくとも１種の組換え型ポリペプチド、好ましくは組換え型ＣＭＶポリペプチドまたは組換え型改変ＣＭＶポリペプチドを含む。最も好ましくは、組換え型ウイルス様粒子は、組換え型ＣＭＶポリペプチドまたは組換え型改変ＣＭＶポリペプチドから構成されるまたはそれらからなる。結果として、本発明において、本発明の組換え型ＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列に関連して影響を受ける場合には、これらの本発明の組換え型ＶＬＰの範囲は、前記Ｎ末端メチオニン残基を有さない前記特定のアミノ酸配列により形成されたＶＬＰを包含するが、加えて、通常本明細書で示すように少量であるが、前記Ｎ末端メチオニンを有する前記特定のアミノ酸配列により形成されたＶＬＰも包含する。さらに、本発明の組換え型ＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列に関連して影響を受ける場合には、依然として前記Ｎ末端メチオニン残基を含むアミノ酸配列と、Ｎ末端メチオニン残基を欠いているアミノ酸配列との両方を含むＶＬＰが包含される場合も本発明の範囲内にある。
変異アミノ酸配列：「変異アミノ酸配列」という用語は、所定組み合わせの変異を、変異を受けるアミノ酸配列中に導入することにより得られるアミノ酸配列を意味する。本発明においては、前記変異を受けるアミノ酸配列は、通常好ましくは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である。したがって、変異アミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基において、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列とは異なり、前記変異アミノ酸配列および前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９０％の配列同一性を示す。通常好ましくは、前記変異アミノ酸配列および前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。好ましくは前記変異アミノ酸配列および前記変異を受ける配列は、最大で１１、１０、９、８、７、６、４、３、２または１個のアミノ酸残基において異なり、さらに好ましくは、前記差異は、挿入、欠失およびアミノ酸置換から選択される。好ましくは、変異アミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸において、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列とは異なり、好ましくは前記差異はアミノ酸置換である。
残基に対応する位置：別のアミノ酸配列の所定の残基に対応するアミノ酸配列の位置は、通常好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使って、最も好ましくは標準的設定を使って、配列アラインメントにより特定することができる。典型的で、好ましい標準的設定は、期待値の閾値（ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０；ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：３；クエリ幅内でマッチする数の制限（ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ）：０；マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト（ｇａｐ ｃｏｓｔｓ）：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ１；ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ、である。
配列同一性：２つの所与のアミノ酸配列の配列同一性は、両方の配列のアラインメントに基づいて決定される。配列同一性の決定用アルゴリズムは当業者なら利用可能である。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、公的に入手可能なコンピューター相同性プログラム「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）または「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を使って決定されるのが好ましく、また、ここでは、ＮＣＢＩホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムにより、そこに提供されるデフォルト設定を使って決定されるのが好ましい。典型的で、好ましい標準的設定は、期待値の閾値（ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：１０；ワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）：３；クエリ幅内でマッチする数の制限（ｍａｘ ｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ａ ｑｕｅｒｙ ｒａｎｇｅ）：０；マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト（ｇａｐ ｃｏｓｔｓ）：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ１；ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ、である。
アミノ酸置換：アミノ酸置換という用語は、アミノ酸配列中の所定のアミノ酸残基の、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による置換、好ましくは別のタンパク質を構成するアミノ酸残基による置換を意味する。したがって、アミノ酸の挿入または欠失と対照的に、アミノ酸置換は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の合計数を変えない。本発明において、極めて好ましいのは、リジン残基またはシステイン残基による、変異を受ける前記アミノ酸配列のアミノ酸残基の置換である。
エピトープ：「エピトープ」という用語は、抗原、好ましくはポリペプチドの連続したまたは不連続な部分を意味し、前記部分は、ＭＨＣ分子の枠組みの中で、抗体により、またはＴ細胞受容体により特異的に結合され得る。抗体に関しては、特異的結合に非特異的結合は含まれないが、交差反応性も排除されるとは限らない。エピトープは通常、抗原性部位に特有の空間的配置の５〜２０個のアミノ酸を含む。
ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ：本明細書で使用される場合、「ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ」という用語は、ヘルパーＴｈ細胞により認識できるエピトープを意味する。
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ：本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」という用語は、少なくとも１種の、好ましくは２種以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるＴｈ細胞エピトープを意味する。ペプチド配列がユニバーサルＴｈ細胞エピトープであるかどうかを判定する最も簡単な方法は、ペプチドの個々のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を測定することである。これは、既知のＴｈ細胞エピトープペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子に対する結合と、競合するペプチドの能力により測定し得る。ＨＬＡ−ＤＲ分子の代表的選択は、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１に記載されている。Ｔｈ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子に対する親和性は、少なくとも１０−５Ｍである必要がある。Ｔｈ細胞エピトープの「普遍性」を測定する、別の、より長時間を要するがより適切な方法は、より多くの比率の人（＞３０％）が、ＩＦＡ中に配合されるＴｈ細胞エピトープを含むタンパク質で、免疫時および１ヶ月後の追加免疫時に、測定できるほどのＴ細胞応答を引き起こすことを実証することである。異なる個体に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の代表的収集は、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２に示されている。結果として、本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」という用語は、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２に記載のように、免疫および追加免疫時に（１ヶ月後に、ＩＦＡ中に配合したＴｈ細胞エピトープを含むタンパク質で）、選択した集団の３０％を超えるメンバーが、測定できるほどのＴ細胞応答を引き起こすＴｈ細胞エピトープを意味する。さらに、またさらに好ましい表現方法では、本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」という用語は、少なくとも５００ｎＭの親和性を有する、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ３、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲ５２ａ、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択され；好ましくは、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、およびさらにより好ましくは少なくとも３種のＤＲアレルに結合することができるＴｈ細胞エピトープを意味する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１および本明細書で引用した文献に記載のように）；前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５−４０に記載されるアッセイである。またさらにより好ましくは、本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」という用語は、少なくとも５００ｎＭの親和性を有する、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、およびさらにより好ましくは少なくとも３種のＤＲアレルに結合することができるＴｈ細胞エピトープを意味する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１および本明細書で引用した文献に記載のように）；前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５−４０により記載されるアッセイである。
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１，Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２，Ｃａｌｖｏ−Ｃａｌｌｅ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５９：１３６２−１３７３，ａｎｄ Ｖａｌｍｏｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７−７２１よる文献などに記載され、当業者に知られている。
本発明の好ましい実施形態では、Ｔｈ細胞エピトープは、ＨＡ３０７−３１９（配列番号２６）、ＨＢＶｎｃ５０−６９（配列番号２７）、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）、ＣＳ３７８−３９８（配列番号２８）、ＭＴ１７−３１（配列番号２９）、ＴＴ９４７−９６７（配列番号３０）およびＰＡＤＲＥ（配列番号５）から選択される。本発明の別の好ましい実施形態では、ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、ＨＡ３０７−３１９（配列番号２６）、ＨＢＶｎｃ５０−６９（配列番号２７）、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）、ＣＳ３７８−３９８（配列番号２８）、ＭＴ１７−３１（配列番号２９）、ＴＴ９４７−９６７（配列番号３０）およびＰＡＤＲＥ（配列番号５）から選択される。本発明の極めて好ましい実施形態では、Ｔｈ細胞エピトープは、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）またはＰＡＤＲＥ（配列番号５）である。本発明の別の極めて好ましい実施形態では、ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）またはＰＡＤＲＥ（配列番号５）である。したがって、極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）である。本発明の別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ（配列番号５）である。別の極めて好ましい実施形態では、前記ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、ＴＴ８３０−８４３（配列番号４）である。本発明の別の極めて好ましい実施形態では、前記ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ（配列番号５）である。配列番号４および配列番号５のエピトープは既知であり、その用途についても記載されてきた。（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１−７６１；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７−２２４２；Ｖａｌｍｏｒｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７−７２１；Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８３）１３：７３３−７３８；Ｊｅｍｏｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８（６）：ｅ６６８６６；Ｊａｇｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１２）８（１）：ｅ５５５３８）。
カップリング効率：ウイルス様粒子の特異的抗原とのカップリング効率をカップリング反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。カップリング反応の成分に対応するクーマシーブルー染色バンドの強度をデンシトメトリーにより測定し、カップリング効率の計算に使用した。カップリング効率は、前記抗原に結合したＶＬＰポリペプチドの、ＶＬＰポリペプチドの合計量に対する比率として定義される。
アジュバント：本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫反応または物質の非特異的刺激剤を意味し、アジュバントは、宿主中に貯蔵庫の生成を可能とし、それぞれ、本発明のワクチンおよび医薬組成物と組み合わせた場合にさらに向上した免疫反応をもたらし得る。好ましいアジュバントは、完全フロインドアジュバントおよび不完全フロインドアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム、ならびに修飾ムラミルジペプチドである。さらに、好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲランウシ型結核菌）およびコリネバクテリウムパルブムである。このようなアジュバントも当該技術分野において周知である。本発明の組成物と一緒に投与可能なさらなるアジュバントとしては、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、およびビロソームアジュバント技術が挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含んでもよい。ウイルス様粒子は一般に、アジュバントと呼ばれてきた。しかし、本出願の枠組みで使用される「アジュバント」という用語は、本発明のウイルス様粒子ではないアジュバントを意味する。むしろ、「アジュバント」は、本発明の組成物、ワクチンまたは医薬組成物に対する付加的な、別の成分に関連する。
抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子により提示される場合、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合され得る分子を意味する。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも同様に意味する。抗原は、さらに免疫系により認識されることができ、および／またはＢリンパ球および／またはＴリンパ球の活性化に繋がる液性免疫反応および／または細胞免疫反応を誘発することができる。しかし、これは、少なくとも、場合に応じて、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかまたはそれに結合し、アジュバント中に送り込まれることを必要とすることがある。抗原は、１種または複数のエピトープ（Ｂ−およびＴ−エピトープ）を持つことができる。上記で言及した特異的反応は、抗原が、好ましくは、典型的には極めて選択的方式で、その対応する抗体またはＴＣＲと反応し、その他の抗原により誘発され得る数多くのその他の抗体またはＴＣＲと反応しないことを意味する。本明細書で使用される場合、抗原はまた、いくつかの個別抗原の混合物であってもよい。本発明のウイルス様粒子を形成する本発明のポリペプチドは、抗原を含んでよい。特に、本発明のポリペプチドは、抗原を含む融合生成物であってよい。しかし、抗原という用語は、前記ポリペプチドに含まれる前記変異アミノ酸配列を包含しない。通常好ましくは、本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、本発明によるウイルス様粒子を包含しない。通常好ましくは、「抗原」という用語は、むしろ、抗原特性を有する本発明の組成物のワクチンおよび医薬組成物の追加の成分を意味し、抗原は、本明細書で記載の任意の手段により、ウイルス様粒子と会合、結合、混合または連結されてよい。
会合した：本明細書で使用される場合、「会合した」または「会合」という用語は、２つの分子が一緒につなぎ合わされる全ての可能な方法、好ましくは化学的相互作用を意味する。化学的相互作用には、共有結合および非共有結合相互作用が含まれる。非共有結合相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、一方、共有結合相互作用は、例えば、共有結合に基づく、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、炭素−リン結合、チオエーテルなどの炭素−イオウ結合、またはイミド結合である。
結合部位、第１：本明細書で使用される場合、「第１結合部位」という語句は、ウイルス様粒子と一緒に天然に生じるエレメントまたはウイルス様粒子に人為的に付加されるエレメントを意味し、このエレメントに対し第２結合部位が結合し得る。第１結合部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化フェニルメチルスルホニル）、またはアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基などの化学的反応性基、またはこれらの組み合わせである。第１結合部位である化学的反応性基の好ましい実施形態は、アミノ酸残基、好ましくはリジン残基のアミノ基である。第１結合部位は通常、表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。複数の第１結合部位が、表面上に存在し、好ましくはＶＬＰの外表面上の、通常は反復配置中に存在する。好ましい実施形態では、第１結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して、ＶＬＰに会合する。さらなる好ましい実施形態では、第１結合部位は、ＶＬＰと一緒に天然で生じる。あるいは、好ましい実施形態では、第１結合部位は、人為的にＶＬＰに付加される。極めて好ましい実施形態では、前記第１結合部位は、前記ＶＬＰポリペプチドのアミノ酸配列のリジン残基のアミノ基である。
結合部位、第２：本明細書で使用される場合、「第２結合部位」という語句は、抗原と一緒に天然で生じるエレメントまたは抗原に人為的に付加されるエレメントを意味し、このエレメントに対し第１結合部位が結合し得る。抗原の第２結合部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フッ化フェニルメチルスルホニル）、またはアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基などの化学的反応性基、またはこれらの組み合わせである。第２結合部位である化学的反応性基の好ましい実施形態は、スルフヒドリル基、好ましくはアミノ酸システインのスルフヒドリル基、最も好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも１つの第２結合部位を有する抗原」という用語は、抗原および少なくとも１つの第２結合部位を含むコンストラクトを意味する。しかし、特に抗原内で天然に生じない第２結合部位に対しては、このようなコンストラクトは、通常好ましくは、「リンカー」をさらに含む。別の好ましい実施形態では、第２結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して、抗原に会合する。さらなる実施形態では、第２結合部位は、抗原内に天然に生じる。別のさらに好ましい実施形態では、第２結合部位は、リンカーを介して抗原に人為的に付加され、前記リンカーは、システインを含むか、あるいはシステインからなる。好ましくは、リンカーはペプチド結合により抗原に融合される。
結合した：本明細書で使用される場合、「結合した」または「結合」という用語は、少なくとも１つの第１結合部位と、少なくとも１つの第２結合部位が一緒に結合される全ての可能な方法、好ましくは化学的相互作用を意味する。化学的相互作用には、共有結合相互作用および非共有結合相互作用が含まれる。非共有結合相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、一方、共有結合相互作用は、例えば、共有結合に基づく、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、炭素−リン結合、チオエーテルなどの炭素−イオウ結合、またはイミド結合である。特定の好ましい実施形態では、第１結合部位と第２結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、さらにより好ましくは非ペプチド結合（単一または複数）のみを介して、結合される。しかし、本明細書で使用される場合、「結合した」という用語は、少なくとも１つの第１結合部位および少なくとも１つの第２結合部位の直接結合のみを意味しないで、代わりにおよび好ましくは、少なくとも１つの第１結合部位および少なくとも１つの第２結合部位の介在分子（単一または複数）を介した、およびこれによる、通常好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは１つのヘテロ二機能性架橋剤の使用による間接的結合も同様に意味するものとする。その他の好ましい実施形態では、第１結合部位と第２結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して、さらにより好ましくはペプチド結合（単一または複数）のみを介して、結合される。
リンカー：本明細書で使用される場合、「リンカー」は、第２結合部位を抗原と会合させるか、または第２結合部位を既に含む、本質的に第２結合部位からなる、もしくは第２結合部位からなる。本明細書で使用される場合、「リンカー」は、通常好ましくは、必須ではないが、１つのアミノ酸残基、好ましくはシステイン残基として、既に第２結合部位を含むのが好ましい。好ましいリンカーは、アミノ酸リンカー、すなわち、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むリンカーである。アミノ酸リンカーという用語は、アミノ酸残基のみからなるリンカーを意味するものではない。しかし、アミノ酸残基のみからなるリンカーは、本発明の好ましい実施形態である。リンカーのアミノ酸残基は、天然アミノ酸または当該技術分野において既知の非天然アミノ酸、全Ｌまたは全Ｄもしくはこれらの混合物から構成されるのが好ましい。本発明によるリンカーのさらに好ましい実施形態は、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む分子であり、したがって、このような分子も本発明に包含される。本発明に有用なさらなるリンカーは、Ｃ１−Ｃ６アルキル部分、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルなどのシクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリール部分を含む分子である。さらに、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル部分、シクロアルキル部分、（Ｃ５、Ｃ６）部分、アリールまたはヘテロアリール部分および追加のアミノ酸（単一または複数）を含むリンカーはまた、本発明用のリンカーとして使用でき、本発明の範囲内に包含されるものとする。リンカーの抗原との会合は、好ましくは、１つの共有結合を介して、より好ましくは、少なくとも１つのペプチド結合を介して行われる。
秩序化反復抗原配列：本明細書で使用される場合、「秩序化反復抗原配列」という用語は、通常好ましくは、ＶＬＰに対する抗原の空間配置の高次均一性により特徴付けられる抗原の反復パターンを意味する。本発明の一実施形態では、反復パターンは、幾何学的パターンであってよい。本発明のＶＬＰと結合した抗原などの本発明の特定の実施形態は、１〜３０ナノメートル、好ましくは２〜１５ナノメートル、さらにより好ましくは２〜１０ナノメートル、さらにまたより好ましくは２〜８ナノメートル、およびさらにより好ましくは１．６〜７ナノメートルの間隔を有するのが好ましい、厳密に反復性の準結晶秩序の抗原をさらに有する、通常、好適な秩序化および反復抗原配列の好ましい例である。
Ｆｅｌ ｄ１タンパク質：本明細書で使用される場合、「Ｆｅｌ ｄ１タンパク質」という用語は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２を含むあるいはそれからなるタンパク質を意味する。好ましくは、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２は、共有結合される。好ましい一実施形態では、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２は、少なくとも１つのジスルフィド結合により結合される。別の好ましい実施形態では、鎖１および鎖２は、直接にまたはスペーサーを介して融合され、この場合、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、スペーサーをさらに含むか、あるいはスペーサーからなる。本明細書中に定義されているように、好ましくはＦｅｌ ｄ１タンパク質は、全体で、最大３００個、さらにより好ましくは、最大２００個のアミノ酸からなる。通常好ましくは、本発明によるＦｅｌ ｄ１タンパク質は、本発明の実施例８により産生されるように、天然Ｆｅｌ ｄ１または組換え型Ｆｅｌ ｄ１に特異的に結合する抗体のインビボ産生を誘導することができる。
Ｆｅｌ ｄ１の鎖１：本明細書で使用される場合、「Ｆｅｌ ｄ１の鎖１」という用語は、配列番号３７またはその相同配列のアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、「配列番号３７の相同配列」という用語は、配列番号３７に対する８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、およびさらにより好ましくは９５％を超える同一性を有するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｆｅｌ ｄ１の鎖１」という用語は、限定されないが、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１の、本明細書中に定義されているような、少なくとも１つのグリコシル化を含む、少なくとも１つの翻訳後修飾を含むポリペプチドも同様に意味すべきである。本明細書中に定義されているように、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１は、全体で、最大１３０個、さらにより好ましくは、最大１００個のアミノ酸からなるのが好ましい。
Ｆｅｌ ｄ１の鎖２：本明細書で使用される場合、「Ｆｅｌ ｄ１の鎖２」という用語は、配列番号３８、配列番号３９もしくは配列番号４０またはその相同配列のアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、「配列番号３８、配列番号３９または配列番号４０の相同配列」という用語は、配列番号３８、配列番号３９または配列番号４０に対する８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、およびさらにより好ましくは９５％を超える同一性を有するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｆｅｌ ｄ１の鎖２」という用語は、限定されないが、Ｆｅｌ ｄ１の鎖２の、本明細書中に定義されているような、少なくとも１つのグリコシル化を含む、少なくとも１つの翻訳後修飾を含むポリペプチドも同様に意味すべきである。本明細書中に定義されているように、Ｆｅｌ ｄ１の鎖２は、全体で、最大１５０、さらにより好ましくは、最大１３０個、さらにより好ましくは最大１００個のアミノ酸からなるのが好ましい。
免疫賦活物質：本明細書で使用される場合、「免疫賦活物質」という用語は、免疫反応を誘導および／または促進することができる物質を意味する。本明細書で使用される場合、免疫賦活物質としては、トール様受容体活性化物質およびサイトカイン分泌を誘導する物質が挙げられるが、これらに限定されない。トール様受容体活性化物質としては、免疫賦活核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖類、リポテイコ酸、イミダゾキノリン配合物、フラゲリン、リポタンパク質、およびタキソールなどの免疫賦活有機物質が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫賦活核酸：本明細書で使用される場合、免疫賦活核酸という用語は、免疫反応を誘導および／または促進することができる核酸を意味する。免疫賦活核酸は、リボ核酸および特に、デオキシリボ核酸を含み、リボ核酸およびデオキシリボ核酸の両方は、二本鎖または一本鎖であってよい。好ましいＩＳＳ−ＮＡ（免疫賦活核酸）は、デオキシリボ核酸であり、さらに好ましくは、前記デオキシリボ核酸は一本鎖である。好ましくは免疫賦活核酸は非メチル化Ｃを含む少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。極めて好ましい免疫賦活核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含み、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチド、好ましくは１つのＣＧジヌクレオチドを含む、または好ましくはそれからなる（Ｃはメチル化されていない）。必須ではないが、好ましくは、前記ＣＧジヌクレオチドは、回文配列の一部である。免疫賦活核酸という用語はまた、修飾塩基、好ましくは４−ブロモシトシンを含む核酸を意味する。本発明において特に好ましいのは、樹状細胞中でＩＦＮα産生を刺激することができるＩＳＳ−ＮＡである。本発明の目的に有用な免疫賦活核酸は、例えば、国際公開第２００７／０６８７４７Ａ１号に記載されている。
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜約１００ヌクレオチド、および最も好ましくは２０〜４０ヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。極めて好ましくはオリゴヌクレオチドは約３０ヌクレオチド、より好ましくは正確に３０ヌクレオチドを含み、最も好ましくはオリゴヌクレオチドは正確に３０ヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは（ａ）非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、および（ｂ）修飾ＲＮＡまたはＤＮＡから選択される。修飾は、主鎖またはヌクレオチド類似体を含めてよい。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（ａ）一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、（ｂ）一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、（ｃ）一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、（ｄ）一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、および（ｅ）一本鎖または、より好ましくは二本鎖または一本鎖と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、からなる群より選択される。好ましいヌクレオチド修飾体／類似体は、（ａ）ペプチド核酸、（ｂ）イノシン、（ｃ）トリチル化塩基、（ｄ）ホスホロチオエート，（ｅ）アルキルホスホロチオエート、（ｆ）５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、（ｇ）５−メチルデオキシシトシン、および（ｈ）５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジン、からなる群より選択される。ホスホチオエート化ヌクレオチドは、細胞中または生物中での分解から保護されるため、好ましいヌクレオチド修飾である。リン酸ジエステル結合ヌクレオチドのみからなる非修飾オリゴヌクレオチドは通常、修飾ヌクレオチドより活性であり、したがって、本発明においては、一般に好ましい。最も好ましいのは、リン酸ジエステル結合デオキシヌクレオチドのみからなるオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは一本鎖である。さらに、細胞中、好ましくは樹状細胞中でＩＦＮα産生を刺激することができるオリゴヌクレオチドが好ましい。細胞中でＩＦＮαの産生を刺激することができる極めて好ましいオリゴヌクレオチドは、Ａ型ＣｐＧおよびＣ型ＣｐＧから選択される。さらに好ましいのは、キャップを含まないＲＮＡ分子である。
ＣｐＧモチーフ：本明細書で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」という用語は、非メチル化中心ＣｐＧ、すなわち非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドで、Ｃがメチル化されておらず、少なくとも１つの塩基、好ましくは１つまたは２つの、中心ＣｐＧに隣接する（中心ＣｐＧの３’および５’側に）ヌクレオチドを含むヌクレオチドのパターンを意味する。通常好ましくは、本明細書で使用される場合、ＣｐＧモチーフは、非メチル化メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよびその５’および３’末端に２つのヌクレオチドを含む、あるいはそれからなる。理論に束縛されるものではないが、ＣｐＧに隣接する塩基は、活性のかなりの部分をＣｐＧオリゴヌクレオチドにもたらす。
非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧ」という用語は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチドを意味する。したがって、ＣｐＧは、少なくとも１つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含む。好ましいＣｐＧは、脊椎動物骨髄由来細胞を、刺激する／活性化する、例えば、その細胞に分裂促進的作用を及ぼす、またはそれによりサイトカイン発現を誘導するもしくは増加させる。例えば、ＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞、単球およびマクロファージなどの抗原提示細胞の活性化に有用となり得る。好ましくは、ＣｐＧは、非メチル化シトシン、その３’側に続けて、グアノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに関連し、前記非メチル化シトシンおよび前記グアノシンは、リン酸結合により結合され、好ましくは前記リン酸結合は、リン酸ジエステル結合またはホスホチオエート結合であり、さらに、好ましくは前記リン酸結合は、リン酸ジエステル結合である。ＣｐＧは、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などのヌクレオチド類似体を含めることができ、二本鎖または一本鎖とすることができる。通常、二本鎖分子は、インビボでより安定であるが、一本鎖分子は高められた免疫活性を有する。本明細書で使用される場合、好ましくは、ＣｐＧは、少なくとも約１０ヌクレオチドの長さで、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは前記ＣｐＧは、１０〜６０、より好ましくは１５〜５０、さらにより好ましくは２０〜４０、さらにより好ましくは約３０、および最も好ましくは正確に３０ヌクレオチドの長さである。ＣｐＧはメチル化および／または非メチル化ヌクレオチドをからなるものでもよく、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、Ｃはメチル化されていない。ＣｐＧはまた、メチル化および非メチル化配列を含んでよく、前記少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、Ｃはメチル化されていない。極めて好ましくは、ＣｐＧは、非メチル化シトシン、その３’側に続けて、グアノシンを含む一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに関連し、前記非メチル化シトシンおよび前記グアノシンは、リン酸ジエステル結合により結合される。ＣｐＧには、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などのヌクレオチド類似体を含めることができ、二本鎖または一本鎖とすることができる。一般に、リン酸ジエステルＣｐＧは、下記に示すようなＡ型ＣｐＧであるが、ホスホチオエステル安定化ＣｐＧは、Ｂ型ＣｐＧである。本発明において好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ａ型ＣｐＧである。
Ａ型ＣｐＧ：本明細書で使用される場合、「Ａ型ＣｐＧ」または「Ｄ型ＣｐＧ」という用語は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を意味する。Ａ型ＣｐＧは、選択的にＴ細胞の活性化および樹状細胞の成熟化を刺激し、また、ＩＦＮα産生を刺激することができる。Ａ型ＣｐＧでは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフのヌクレオチドが少なくとも１つのリン酸ジエステル結合により結合される。Ａ型ＣｐＧは、少なくとも１つのリン酸ジエステル結合ＣｐＧモチーフを含み、これは、ホスホロチオエート結合ヌクレオチドにより、その５’末端、および／または好ましくはその３’末端に隣接してよい。好ましくは、ＣｐＧモチーフ、およびそれによる、好ましくはＣＧジヌクレオチドおよびそのすぐ近くの少なくとも１つの、好ましくは２つのヌクレオチドを含むフランキング領域は、リン酸ジエステルヌクレオチドから構成される。好ましいＡ型ＣｐＧは、リン酸ジエステル（ＰＯ）結合ヌクレオチドのみからなる。通常好ましくは、ポリＧモチーフは、少なくとも１個の、好ましくは少なくとも３個の、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のＧ（グアノシン）、最も好ましくは少なくとも１０個のＧを含む、あるいはそれらからなる。好ましくは、本発明のＡ型ＣｐＧは、回文配列を含む、あるいは回文配列からなる。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、ウイルス様粒子という用語は、非複製性もしくは非感染性の、好ましくは非複製性かつ感染性ウイルス粒子を意味し、または非複製的または非感染性の、好ましくは非複製性かつ非感染性の、ウイルス粒子（好ましくはウイルスのカプシド）に類似している構造体を意味する。本明細書で使用される場合、「非複製性」という用語は、ＶＬＰにより含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書で使用される場合、「非感染性」という用語は、宿主細胞に入ることができないことを意味する。本発明によるウイルス様粒子は、それがウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠いているために、非複製性かつ非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムとは別の核酸を含んでよい。組換えで産生されたウイルス様粒子は通常、宿主細胞由来ＲＮＡを含む。本発明におけるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドから構成されるウイルスカプシドである。ウイルス様粒子は、典型的には、ウイルス様粒子当たり、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、または３６０個を超えるタンパク質サブユニットを含むウイルスコートタンパク質から構成される巨大分子集合体である。通常、好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復組織を有するウイルスカプシドまたはウイルスカプシド様構造体が形成される。ウイルス様粒子の１つの特徴は、高度秩序化および反復配置のそのサブユニットである。２つ以上のポリペプチド種のウイルス様粒子は、多くの場合モザイクＶＬＰと呼ばれるが、これも本発明に包含される。したがって、一実施形態では、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも２つの異なるポリペプチド種を含み、前記ポリペプチド種の少なくとも１つは、ｐａｎ Ｔｈ細胞エピトープを含むＶＬＰポリペプチドである。
パッケージ化：本明細書で使用される場合、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係における、ポリアニオン性高分子または免疫賦活物質の状態を意味する。本明細書で使用される場合、「パッケージ化」という用語は、共有結合、例えば、化学的カップリングによる、または非共有結合、例えば、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合などによるものであってよい結合を含む。この用語はまた、ポリアニオン性高分子の封入、または部分的封入を含む。したがって、ポリアニオン性高分子または免疫賦活物質を、実際の結合、特に共有結合による結合を行うことなく、ＶＬＰにより封入することができる。好ましい実施態様では、少なくとも１つのポリアニオン性高分子または免疫賦活物質がＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有結合方式で、パッケージ化される。前記免疫賦活物質が核酸、好ましくはＤＮＡである場合には、パッケージ化という用語は、前記核酸がヌクレアーゼ加水分解にアクセスできない、好ましくはＤＮアーゼ加水分解（例えば、ＤＮアーゼＩまたはベンゾナーゼ）にアクセスできないことを意味し、好ましくは前記アクセシビリティは、国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号の実施例１１〜１７に記載のようにしてアッセイされる。
本発明は、植物ウイルスのキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス様粒子、特にＴｈ細胞エピトープ、特にユニバーサルＴｈ細胞エピトープを含むＣＭＶ由来改変ＶＬＰを提供する。
したがって、第１の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列および前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。代替的実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、好ましくは前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも１個、最大で１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個のアミノ酸残基が異なり、さらに好ましくは、これらの差異は、（ｉ）挿入、（ｉｉ）欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸置換、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、から選択される。変異は、ウイルス様粒子の安定性および／またはカップリング効率などの特定の特徴を改変するために、変異を受けるアミノ酸配列中に導入してよい。システイン残基の導入は、サブユニット間で形成されるシステイン架橋の安定性を高め得る。また、ＶＬＰの表面へのリシンの導入は、カップリング効率を高め得る。
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、およびより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、もしくは好ましくはそれからなる。
極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は配列番号１を含む、または好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む、または好ましくはそれからなる。
別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）アミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、およびより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、もしくは好ましくはそれからなる。
別の極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が、配列番号２１を含むアミノ酸配列、または（ｂ）アミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列領域が、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、もしくは好ましくはそれからなる。
また別の好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、かつこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列が、配列番号２１を含み、またはこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有し；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列はこの請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む、もしくは好ましくはそれからなる。
また別の極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、かつこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含み、またはこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも９０％の配列番号２１との配列同一性を有する。
通常好ましくは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端に融合されるか、（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端に融合されるか、（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続アミノ酸の領域を置換し、この場合、前記ＣＭＶポリペプチドの前記連続アミノ酸の置換された領域と、ヘルパーＴ細胞エピトープとの間の配列同一性は少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるか、または（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸からなる。
好ましい実施形態では、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは、置換された前記Ｎ末端領域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。換言すれば、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、アミノ酸の第１の数からなり、Ｔｈ細胞エピトープは第２の数のアミノ酸からなり、好ましい実施形態では、前記アミノ酸の第１の数は、アミノ酸の第２の数以下である。
さらに好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸からなる。極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、およびより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは前記置換されたＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、およびより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸からなる。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異を受けるアミノ酸配列は、この請求項の（ｉ）で定められた前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記変異を受けるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、およびより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が配列番号１を含む、または好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列、を含み、または好ましくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは前記置換されたＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸からなる。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が配列番号２１を含む、または好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）アミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％、なおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは前記置換されたＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含むアミノ酸配列、または（ｂ）アミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸からなる。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含むアミノ酸配列、または（ｂ）アミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、またより好ましくは少なくとも９５％、なおさらに好ましくは少なくとも９８％およびなおまたさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列番号２１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなり、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、かつこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含み、またはこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも９０％の配列番号２１との配列同一性を有し、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、好ましくは前記置換されたＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記ヘルパーＴ細胞を構成するアミノ酸の数以下である。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、かつこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含み、またはこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも９０％の配列番号２１との配列同一性を有し、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５〜１５個の連続アミノ酸、好ましくは９〜１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１〜１３個の連続アミノ酸からなる。
したがって、極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、もしくは好ましくはそれからなるアミノ酸配列、または（ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、かつこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含み、またはこの請求項の（ａ）もしくは（ｂ）で定められた前記アミノ酸は、アミノ酸配列領域を含み、前記アミノ酸配列領域は、少なくとも９０％の配列番号２１との配列同一性を有し、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
極めて好ましくは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープであり、好ましくは、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、最大で２０個のアミノ酸からなる。
さらに好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ配列である。またさらに好ましい実施形態では、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
別の好ましい実施形態では、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、ヒトワクチン由来である。好ましくは前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素由来である。また好ましくは、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、好ましくはそれからなる。
本発明の極めて好ましい実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、配列番号１、または少なくとも９５％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、もしくは好ましくはそれからなり、また、前記アミノ酸配列は、配列番号２１を含み、前記ヘルパーＴ細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、１１〜１３個の連続アミノ酸、好ましくは１１個の連続アミノ酸からなり、さらに好ましくは前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１のアミノ酸２〜１２に相当する。
別の極めて好ましい実施形態では、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。さらに極めて好ましい実施形態では、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
本発明のＶＬＰは、原核生物または真核生物の発現系で発現されてよい。好ましい系は、大腸菌、酵母、昆虫細胞ならびに哺乳動物細胞株である。極めて好ましい前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰまたは前記ＣＭＶ由来のＶＬＰは、大腸菌中での前記改変ＣＭＶポリペプチドまたは前記ＣＭＶポリペプチドの発現により得られ、好ましくは前記発現は、１０℃〜２５℃の温度、好ましくは２０℃の温度で行われる。上記で示したように、組換えにより産生されたポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含んでよい。したがって、一実施形態では、前記ＣＭＶポリペプチドまたは改変ＣＭＶポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含む。しかし、通常好ましくは、前記Ｎ末端メチオニン残基は、前記ＣＭＶポリペプチドまたは前記改変ＣＭＶポリペプチドから切断される。
したがって、別の態様では、本発明は、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、前記ＣＭＶ由来のＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むまたは好ましくはそれからなる、少なくとも１種のＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、変異を受けるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列および前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％およびまたより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、前記ＣＭＶ由来のＶＬＰが前記ＣＭＶポリペプチドの大腸菌中での発現により得られ、好ましくは前記発現は、１０℃〜２５℃の温度、好ましくは２０℃の温度で行われる。
本発明は、前記本発明のＶＬＰが、いずれか１つの本明細書に記載の技術的特徴を単独でまたはいずれかの可能な組み合わせで含む組成物を包含する。
さらなる態様では、本発明は改変ウイルス様粒子を含む組成物を提供する。さらに、これらの改変ＶＬＰは、前記改変ＶＬＰに結合した抗原に対する特定の抗体応答における免疫反応を引き起こすためのワクチンプラットホームとして機能するのが好ましい。Ｔｈ細胞エピトープ、特にユニバーサルＴｈ細胞エピトープの存在は、引き起こされる免疫反応のさらなる増加に繋がる。
したがって、さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、（ａ）少なくとも１つの本発明の改変ウイルス様粒子であって、少なくとも１つの第１結合部位を含む改変ウイルス様粒子；および（ｂ）少なくとも１種の抗原であって、少なくとも１つの第２結合部位を含む抗原を含み、（ａ）および（ｂ）は前記少なくとも１つの第１の結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合される。前記改変ウイルス様粒子および前記抗原を前記第１および前記第２結合部位を介して結合する方法は、例えば、国際公開第２００２／０５６９０５Ａ２号および同第２００４／０８４９４０Ａ１号に記載されている。
さらに好ましい実施形態では、前記第１結合部位は、少なくとも１つの共有結合を介して前記第２結合部位に結合される。さらに好ましい実施形態では、前記第１結合部位および前記第２結合部位は、少なくとも１つの共有結合性ペプチド結合を介して結合される。さらに好ましい実施形態では、前記共有結合は、非ペプチド結合である。したがって、また別の好ましい実施形態では、前記第１結合部位および前記第２結合部位は、少なくとも１つの共有結合性非ペプチド結合を介して結合される。さらに好ましい実施形態では、前記第１結合部位はアミノ基、好ましくはリシンのアミノ基である。
改変ウイルス様粒子と抗原との間のジスルフィド結合を介した結合は、特にスルフヒドリル部分含有分子に対して不安定であり、さらに、血清中では、例えば、チオエーテル結合より安定性が低い（Ｍａｒｔｉｎ ＦＪ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８）。したがって、さらに極めて好ましい本発明の実施形態では、改変ＶＬＰと少なくとも１種の抗原との会合または結合は、ジスルフィド結合を含まない。これによりさらに好ましくは、少なくとも１つの第２の結合は、スルフヒドリル基を含む、または好ましくはスルフヒドリル基である。さらに、改変ＶＬＰと少なくとも１種の抗原との会合または結合は、好ましくは、硫黄−硫黄結合を含まない。これによりさらに好ましくは、少なくとも１つの第２の結合は、スルフヒドリル基を含む、または好ましくはスルフヒドリル基である。さらに極めて好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの第１結合部位は、スルフヒドリル基ではないか、またはスルフヒドリル基を含まない。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの第１結合部位は、システインのスルフヒドリル基でないか、システインのスルフヒドリル基を含まない。さらに好ましい実施形態では、前記第２結合部位はスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基である。
極めて好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１結合部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも１つの第２結合部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基であるか、または抗原に化学的に結合したスルフヒドリル基である。さらに好ましい実施形態では、前記第２結合部位の内の１個のみが非ペプチド共有結合を介して前記第１結合部位に会合し、前記抗原の前記改変ウイルス様粒子への単一で均一なタイプの結合をもたらし、前記第１結合部位と会合する前記１個のみの第２結合部位が、スルフヒドリル基であり、前記抗原と前記改変ウイルス様粒子が、前記会合を介して相互作用し、秩序化および反復抗原配列を形成する。
本発明の好ましい一実施形態では、抗原は、通常好ましくは、ヘテロ二機能性架橋剤を使って化学架橋により改変ＶＬＰに結合される。好ましい実施態様では、ヘテロ二機能性架橋剤は、好ましい第１結合部位、好ましくはアミノ基、より好ましくは改変ＶＬＰのリジン残基（単一または複数）のアミノ基と反応できる官能基、ならびに好ましい第２結合部位、すなわち、スルフヒドリル基、好ましくは抗原固有のまたは抗原に人為的に付加され、さらに必要に応じて還元による反応に利用可能にされたシステイン（単一または複数）残基のスルフヒドリル基と反応できるさらなる官能基を含む。ヘテロ二機能性架橋剤は当該技術分野で既知である。これらには、好ましい架橋剤のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、およびその他の例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから市販されている架橋剤、ならびにアミノ基に対して反応性の１つの官能基およびスルフヒドリル基に対して反応性の１つの官能基を有する架橋剤が挙げられる。上述の架橋剤は全て、アミノ基と反応後にアミド結合を形成し、スルフヒドリル基と反応後にチオエーテル結合を形成する。本発明の実施に好適な別のクラスの架橋剤は、カップリング時に抗原と改変ＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することを特徴とする。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が挙げられる。
上記の好ましい方法によるヘテロ二機能性架橋剤を使った抗原の改変ＶＬＰへの結合により、抗原の改変ＶＬＰへの優先的カップリングが可能となる。抗原を改変ＶＬＰに結合する他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使って、抗原が改変ＶＬＰに架橋される方法が挙げられる。抗原はまた、例えば、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはイミノチオランとの反応を介して、最初にチオール化してもよい。必要に応じ脱保護後に、抗原と改変ＶＬＰとを次のように結合してもよい。過剰チオール化試薬の分離後、抗原を改変ＶＬＰと反応させる。この改変ＶＬＰは、システイン反応性部分を含むヘテロ二機能性架橋剤であらかじめ活性化されており、したがって、システイン残基と反応する少なくとも１つのまたはいくつかの官能基を提示しており、これに対し、上記のようなチオール化抗原が反応できる。必要に応じて、少量の還元剤が反応混合物中に含められる。さらなる方法では、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３、（Ｐｉｅｒｃｅ）または改変ＶＬＰのアミン基もしくはカルボキシル基と反応する官能基を有する既知のホモ二官能性架橋剤などのホモ二官能性架橋剤を使って、抗原が改変ＶＬＰに結合される。
本発明の極めて好ましい実施形態では、抗原は、Ｎ末端またはＣ末端に付加されているシステイン残基、または抗原内の天然システイン残基を介して、改変ウイルス様粒子のリジン残基に結合される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、リンカーをさらに含み、前記リンカーは、前記第２結合部位を有する前記抗原と会合し、好ましくは前記リンカーは前記第２結合部位を含むか、あるいはそれからなる。
第２結合部位の抗原上への導入は、リンカー、好ましくは、本発明の開示に従って第２結合部位として好適な少なくとも１つのアミノ酸を含むリンカーの会合により実現される。したがって、本発明の好ましい実施形態では、リンカーが、少なくとも１つの共有結合、好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは１つの、ペプチド結合により抗原に会合される。好ましくは、リンカーは、第２結合部位を含む、あるいはそれからなる。さらに好ましい実施形態では、リンカーは、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーはシステイン残基である。
リンカーの選択は、抗原の性質、等電点、電荷分布およびグリコシル化などのその生化学的特性に依存するであろう。一般に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好ましい。本発明のさらに好ましい実施形態では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは少なくとも１個および最大で２５個の、好ましくは最大で２０個、より好ましくは最大で１５個のアミノ酸からなる。本発明のまた好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは１〜１０個のアミノ酸を含む。さらに好ましい実施形態では、前記リンカーは、前記第２結合部位を含む、あるいはそれからなる。
さらに好ましい実施形態では、前記リンカーはアミノ酸リンカーであり、好ましくは前記アミノ酸リンカーは、（ａ）ＣＧＧ；（ｂ）Ｎ末端γ１−リンカー；（ｃ）Ｎ末端γ３−リンカー；（ｄ）Ｉｇヒンジ部；（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー；（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ（ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５）；（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー；（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝０〜３、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２）；（ｉ）ＧＧＣ；（ｊ）ＧＧＣ−ＮＨ２；（ｋ）Ｃ末端γ１−リンカー；（ｌ）Ｃ末端γ３−リンカー；（ｍ）Ｃ末端グリシンリンカー；（ｎ）（Ｇ）ｎＣＤ（Ｇ）ｋ（ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜２）；（ｏ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー；（ｐ）（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｌ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋ（ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、１＝０〜２、およびｏ＝０〜８）からなる群から選択される。一般に、グリシン残基は、カップリング反応におけるより嵩高いアミノ酸の立体障害の可能性を回避するために、嵩高いアミノ酸と、第２結合部位として使用されるシステインとの間に挿入されることになる。
さらに好ましい実施形態では、リンカーは抗原のＮ末端に付加される。本発明の別の好ましい実施形態では、リンカーは抗原のＣ末端に付加される。本発明のその他の実施形態では、組成物は、化学的相互作用を介して、抗原に結合したウイルス様粒子を含むか、あるいはそれから本質的になり、これらの相互作用の少なくとも１つは、共有結合ではない。改変ＶＬＰの抗原への結合は、改変ＶＬＰをビオチン化し、抗原をストレプトアビジン融合タンパク質として発現させることにより行うことができる。本発明のその他の実施形態では、リシンへの化学的カップリングに使用されるスルフヒドリル基は、化学的修飾により改変ＶＬＰまたは抗原に結合される。
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの免疫賦活物質をさらに含む。極めて好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は本発明の改変ＶＬＰ中にパッケージングされる。別の好ましい実施形態では、免疫賦活物質は本発明の改変ＶＬＰと混合される。本発明に有益な免疫賦活物質は通常、当該技術分野において既知であり、特に国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号で開示されている。
本発明の別の実施形態では、前記免疫賦活物質は、非真核生物起源のＤＮＡまたはＲＮＡからなる。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は、（ａ）免疫賦活核酸；（ｂ）ペプチドグリカン；（ｃ）リポ多糖類；（ｄ）リポテイコ酸；（ｅ）イミダゾキノリン配合物；（ｆ）フラゲリン；（ｇ）リポタンパク質；および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の内の少なくとも１つの物質の任意の混合物、からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は、免疫賦活核酸であり、前記免疫賦活核酸は、（ａ）リボ核酸；（ｂ）デオキシリボ核酸；（ｃ）キメラ核酸；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の任意の混合物、からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活核酸は、リボ核酸であり、前記リボ核酸はＲＮＡ由来細菌である。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活核酸は、ポリ−（ＬＣ）またはその誘導体である。さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活核酸は、デオキシリボ核酸であり、前記デオキシリボ核酸は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
極めて好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。さらに好ましい実施形態では、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、Ａ型ＣｐＧである。さらに好ましい実施形態では、前記Ａ型ＣｐＧは、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３１）を含む。さらに好ましい実施形態では、前記回文配列は、グアノシン実体により、その５’−末端およびその３’−末端に隣接される。さらに好ましい実施形態では、前記回文配列は、少なくとも３個、最大で１５個のグアノシン実体により、その５’−末端に隣接され、前記回文配列は、少なくとも３個、最大で１５個のグアノシン実体により、その３’−末端に隣接される。
別の好ましい実施形態では、前記免疫賦活物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは回文配列を含み、さらに好ましくは、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフは回文配列の一部であり、またさらに好ましくは、前記回文配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号３１）である。
さらに好ましい実施形態では、前記免疫賦活核酸は、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３６）からなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合ヌクレオチドのみからなる。
本発明の目的に有用な抗原は、例えば、国際公開第２００２／０５６９０５Ａ２号、同第２００４／００７５３８Ａ２号、同第２００６／０３７７８７Ａ２号、同第２００４／０８４９４０Ａ１号、および同第２００６／０３２６７４Ａ１号に開示されている。一実施形態では、前記抗原は、（ａ）ウイルス；（ｂ）細菌；（ｃ）寄生生物；（ｄ）腫瘍；（ｅ）自己分子；（ｆ）非ペプチドハプテン分子；（ｇ）アレルゲン；（ｈ）ホルモン；（ｉ）サイトカイン；（ｋ）ケモカイン；（ｌ）生物学的に活性なペプチド、からなる群より選択される入手源から得られる。別の好ましい実施形態では、前記抗原は、腫瘍抗原、自己抗原、病原体のポリペプチド、アレルゲンまたはハプテンである。さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）である。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原であり、好ましくは前記腫瘍抗原は、（ａ）乳癌細胞のポリペプチド；（ｂ）腎臓癌のポリペプチド；（ｃ）前立腺癌細胞のポリペプチド；（ｄ）皮膚癌細胞のポリペプチド；（ｅ）脳癌細胞のポリペプチド；および（ｆ）白血病細胞のポリペプチド、からなる群から選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は、（ａ）Ｈｅｒ２；（ｂ）ガングリオシドＧＤ２；（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ；（ｄ）癌胎児抗原（ＣＥＡ）；（ｅ）ＣＤ５２；（ｆ）ＣＤ２１；（ｇ）ヒト黒色腫ｇｐｌＯＯ；（ｈ）ヒト黒色腫ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１；（ｉ）ヒト黒色腫ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１類似体；（ｊ）チロシナーゼ；（ｋ）ＮＡ１７−Ａ ｎｔ；（ｌ）ＭＡＧＥ３；（ｍ）ｐ５３タンパク質；および（ｎ）（ａ）〜（ｍ）のいずれかの腫瘍抗原の抗原フラグメント、からなる群より選択される腫瘍抗原である。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は、次記からなる群より選択されるポリペプチドである。（ａ）ＩｇＥ；（ｂ）ＩＬ−６；（ｃ）核内因子ｋＢ配位子の受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）；（ｄ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；（ｅ）血管内皮細胞増殖因子レセプター（ＶＥＧＦ−Ｒ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ｆ）インターロイキン−１α；（ｇ）インターロイキン−１β；（ｈ）インターロイキン−５；（ｉ）インターロイキン−８；（ｊ）インターロイキン−１３；（ｋ）インターロイキン−１５；（ｌ）インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）；（ｍ）ＩＬ−２３；（ｎ）グレリン；（ｏ）アンギオテンシン；（ｐ）ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）（ＣＣＬ２１）；（ｑ）ケモカイン（Ｃ−Ｘモチーフ）（ＣＸＣＬ１２）；（ｒ）間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）；（ｓ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；（ｔ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−Ｉ）；（ｕ）エンドグリン；（ｖ）レジスチン；（ｗ）ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；（ｘ）成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）；（ｙ）黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；（ｚ）サイレオトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）；（ａａ）マクロファージ移動阻害性因子（ＭＩＦ）；（ｂｂ）ブドウ糖依存性インシュリン分泌ペプチド（ＧＩＰ）；（ｃｃ）エオタキシン；（ｄｄ）ブラジキニン；（ｅｅ）Ｄｅｓ−Ａｒｇブラジキニン；（ｆｆ）Ｂ−リンパ球化学誘引物質（ＢＬＣ）；（ｇｇ）マクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦ；（ｈｈ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；（ｉｉ）アミロイドベータペプチド（ＡＢｌ−４２）；（ｊｊ）アミロイドペプチド（ＡＢｌ−６）；（ｋｋ）ヒトＩｇＥ；（ｌｌ）ＣＣＲ５細胞外ドメイン；（ｍｍ）ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；（ｎｎ）ガストリン；（ｏｏ）ＣＥＴＰ；（ｐｐ）Ｃ５ａ；（ｑｑ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；（ｒｒ）ＣＧＲＰ；（ｓｓ）α−シヌクレイン；（ｔｔ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）；（ｕｕ）アミリンまたは（ｖｖ）ポリペプチド（ａ）〜（ｕｕ）のいずれかのフラグメント；および（ｘｘ）ポリペプチド（ａ）〜（ｕｕ）のいずれか１つの抗原変異体またはフラグメント。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は、自己抗原であり、前記自己抗原は、次記からなる群より選択されるポリペプチドである。（ａ）ＩｇＥ；（ｂ）ＩＬ−６；（ｃ）核内因子ｋＢ配位子の受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）；（ｄ）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；（ｅ）血管内皮細胞増殖因子レセプター（ＶＥＧＦ−Ｒ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ｆ）インターロイキン−１α；（ｇ）インターロイキン−１β；（ｈ）インターロイキン−５；（ｉ）インターロイキン−８；（ｊ）インターロイキン−１３；（ｋ）インターロイキン−１５；（ｌ）インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）；（ｍ）ＩＬ−２３；（ｎ）グレリン；（ｏ）アンギオテンシン；（ｐ）ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）（ＣＣＬ２１）；（ｑ）ケモカイン（Ｃ−Ｘモチーフ）（ＣＸＣＬ１２）；（ｒ）間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）；（ｓ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；（ｔ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−Ｉ）；（ｕ）エンドグリン；（ｖ）レジスチン；（ｗ）ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；（ｘ）成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）；（ｙ）黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；（ｚ）サイレオトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）；（ａａ）マクロファージ移動阻害性因子（ＭＩＦ）；（ｂｂ）ブドウ糖依存性インシュリン分泌ペプチド（ＧＩＰ）；（ｃｃ）エオタキシン；（ｄｄ）ブラジキニン；（ｅｅ）Ｄｅｓ−Ａｒｇブラジキニン；（ｆｆ）Ｂ−リンパ球化学誘引物質（ＢＬＣ）；（ｇｇ）マクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦ；（ｈｈ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；（ｉｉ）アミロイドベータペプチド（ＡＢｌ−４２）；（ｊｊ）アミロイドペプチド（ＡＢｌ−６）；（ｋｋ）ヒトＩｇＥ；（ｌｌ）ＣＣＲ５細胞外ドメイン；（ｍｍ）ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；（ｎｎ）ガストリン；（ｏｏ）ＣＥＴＰ；（ｐｐ）Ｃ５ａ；（ｑｑ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）；（ｒｒ）ＣＧＲＰ；（ｓｓ）α−シヌクレイン；（ｔｔ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）；（ｕｕ）アミリンまたは（ｖｖ）ポリペプチド（ａ）〜（ｕｕ）のいずれかのフラグメント；および（ｘｘ）ポリペプチド（ａ）〜（ｕｕ）のいずれか１つの抗原変異体またはフラグメント。
極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）である。インターロイキン１７は、広範囲の細胞型で炎症性メディエータの放出を誘発するＴ細胞由来サイトカインである。異常Ｔｈ１７応答およびＩＬ−１７の過剰発現は、関節リウマチおよび多発性硬化症を含む多くの自己免疫障害に結びつけられてきた。ＩＬ−１７を遮断するＩＬ−１７特異的モノクローナル抗体などの分子は、動物モデルで、疾患を回復させるのに効果的であることがわかった。さらに、最近、組換え型ＩＬ−１７コンジュゲートウイルス様粒子を使ったＩＬ−１７を標的とする能動免疫獲得が提唱されている（Ｒｏｈｎ ＴＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３６：１−１１）。ＩＬ−１７−ＶＬＰによる免疫化は、高レベルの抗ＩＬ−１７抗体を誘導し、それにより、アジュバントの添加がない場合でも、天然の抵抗性を克服した。ＩＬ−１７−ＶＬＰで免疫されたマウスは、コラーゲン誘発関節炎および実験的自己免疫性脳脊髄炎の両方で、より低い疾患発生率、疾患へのより遅い進行および低い疾患重症度スコアを示した。
したがって、さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４２を含む、または好ましくはそれからなる。さらに、改変ＶＬＰを含む本発明の組成物は、動物またはヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患の処置方法に使用される。好ましくは、前記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択され、また好ましくは前記炎症性疾患はＭＳである。さらに好ましくは、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号４２を含む、または好ましくはそれからなる。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＩＬ−５である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４１を含む、または好ましくはそれからなる。さらに、改変ＶＬＰを含む本発明の組成物は、動物またはヒトの炎症性疾患、好ましくは慢性炎症性疾患の処置方法に使用される。好ましくは、前記炎症性疾患は、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される。さらに好ましくは、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号４１を含む、または好ましくはそれからなる。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、イヌのＩＬ−５である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号６１または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる。好ましくは、前記抗原は、配列番号６１を含む、または好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号６１を含む、または好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、本発明の組成物は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の、少なくとも１つの第１結合部位を有する改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含む、好ましくはそれからなる、改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの第２結合部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記抗原はイヌＩＬ−５であり；前記ＣＭＶ由来のＶＬＰおよび前記イヌＩＬ−５は、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、前記イヌＩＬ−５は、配列番号６１または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６１との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはそれからなり、また好ましくは前記イヌＩＬ−５は、配列番号６１を含む、または好ましくはそれからなる抗原、とを含む。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＩＬ−４である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４５を含む、または好ましくはそれからなる。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、イヌのＩＬ−４である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号６２または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６２との配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる。好ましくは、前記抗原は、配列番号６２を含む、または好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号６２を含む、または好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、本発明の組成物は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の、少なくとも１つの第１結合部位を有する改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含む、好ましくはそれからなる、改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの第２結合部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記抗原はイヌＩＬ−４であり；前記ＣＭＶ由来のＶＬＰおよび前記イヌＩＬ−４は、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、前記イヌＩＬ−４は、配列番号６２または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６２との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはそれからなり、また好ましくは前記イヌＩＬ−４は、配列番号６２を含む、または好ましくはそれからなる抗原と、を含む。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＩＬ−１３である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４６を含む、または好ましくはそれからなる。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、イヌのＩＬ−１３である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号６３または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６３との配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる。好ましくは、前記抗原は、配列番号６３を含む、または好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号６３を含む、または好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、本発明の組成物は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の、少なくとも１つの第１結合部位を有する改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含む、好ましくはそれからなる、改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの第２結合部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記抗原はイヌＩＬ−１３であり；前記ＣＭＶ由来のＶＬＰおよび前記イヌＩＬ−１３は、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、前記イヌＩＬ−１３は、配列番号６３または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号６３との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはそれからなり、また好ましくは前記イヌＩＬ−１３は、配列番号６３を含む、または好ましくはそれからなる抗原、とを含む。
さらなる極めて好ましい実施形態では、前記抗原はＴＮＦαである。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記抗原はＩＬ−１αである。
またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＩＬ−１βである。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号６０を含む、または好ましくはそれからなる。
またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、Ａβ−１−４２に由来のペプチドである。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＩｇＥまたはＩｇＥに含まれるペプチドまたはドメインである。
さらに別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ヒト、ネコまたはイヌのＩＬ−３１である。別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４３または配列番号４４を含む、または好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、イヌのＩＬ−３１である。またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号４３または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号４３との配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または好ましくはそれからなる。好ましくは、前記抗原は、配列番号４３を含む、または好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態では、前記本発明の組成物の前記抗原は、配列番号４３を含む、または好ましくはそれからなる。さらに好ましくは、本発明の組成物は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の、少なくとも１つの第１結合部位を有する改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含む、好ましくはそれからなる、改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの第２結合部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記抗原はイヌＩＬ−３１であり；前記ＣＭＶ由来のＶＬＰおよび前記イヌＩＬ−３１は、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、前記イヌＩＬ−３１は、配列番号４３または少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列番号４３との配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または好ましくはそれからなり、また好ましくは前記イヌＩＬ−３１は、配列番号４３を含む、または好ましくはそれからなる抗原、とを含む。
別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、α−シヌクレインまたはα−シヌクレインに由来するペプチドであり、好ましくは前記ペプチドは、６〜１４アミノ酸からなり、さらに好ましくは前記抗原は、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４のいずれか１つから選択される、α−シヌクレインに由来するペプチドである。α−シヌクレインに由来するさらに好ましいペプチドは、国際公開第２０１１／０２０１３３号に開示されている。この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
複数の生理学的および病理学的機能を有する小さいタンパク質である、α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）は、パーキンソン病（ＰＤ）を含むレビー小体病の病理学的に顕著な特徴であるレビー小体で見出された主要タンパク質の１つである。さらに最近、α−Ｓｙｎは、血液および脳脊髄液を含む体液中に発見され、末梢組織および中枢神経系の両方により産生されている可能性がある。脳と末梢組織との間のα−Ｓｙｎの置換は、重要な病態生理学的および治療的な意味を有するであろう（Ｇａｒｄａｉ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８（８）：ｅ７１６３４）。パーキンソン病（ＰＤ）の病態形成において、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）を関係づける証拠は、決定的である。しかし、α−ｓｙｎが、ＰＤおよび他のシヌクレイン病における病状に至る過程に関しては、明確な一致は得られていない。
α−シヌクレインは、レビー小体（ＬＢ）の主要な成分であり、α−ｓｙｎ過剰発現が凝集に繋がるという説明は多く存在する。ヒトの遺伝的データは、ミスセンス変異およびα−ｓｙｎ遺伝子の多重化が家族性ＰＤを引き起こすことを示している。遺伝子多重化の場合には、α−ｓｙｎタンパク質のレベルの増加により、病状に繋がる優性機能獲得を生じると推定される。α−ｓｙｎの増加したレベルは、凝集および毒性に繋がり得るが、過去数年にわたる研究はまた、上昇したα−ｓｙｎは、小胞プールの生成、局在化、および／または維持と干渉する場合があることを明らかにした（Ｇａｒｄａｉ ＳＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１３）８（８）：ｅ７１６３４；およびそこに引用された文献）。
またさらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、アミリンである。極めて好ましい実施形態では、前記抗原はアンギオテンシンＩまたはアンギオテンシンＩ由来のペプチドである。別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原はアンギオテンシンＩＩまたはアンギオテンシンＩＩ由来のペプチドである。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＧｎＲＨである。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、エオタキシンである。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は寄生生物のポリペプチドであり、好ましくは前記病原体は、（ａ）トキソプラズマ属菌種；（ｂ）熱帯熱マラリア原虫；（ｃ）三日熱マラリア原虫；（ｄ）卵形マラリア原虫；（ｅ）四日熱マラリア原虫；（ｆ）リーシュマニア；（ｇ）住血吸虫および（ｈ）線虫、からなる群から選択される。好ましくは前記抗原は、熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫由来である。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は細菌のポリペプチドであり、好ましくは前記細菌は、（ａ）クラミジア；（ｂ）連鎖球菌；（ｃ）肺炎球菌；（ｄ）ブドウ球菌；（ｅ）サルモネラ；（ｆ）マイコバクテリア；（ｇ）クロストリジウム；（ｈ）ビブリオ；（ｉ）エルシニア；（ｋ）髄膜炎菌；（ｌ）ボレリア、からなる群から選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は、ウイルス抗原であり、好ましくは前記ウイルス抗原は、（ａ）ＨＩＶおよびその他のレトロウイルス；（ｂ）インフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザＡ Ｍ２細胞外ドメインまたはＨＡもしくはＨＡ球状ドメイン；（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスのポリペプチド、好ましくはｐｒｅＳ１；（ｄ）Ｃ型肝炎ウイルス；（ｅ）ＨＰＶ、好ましくはＨＰＶ１６Ｅ７；（ｆ）ＲＳＶ；（ｇ）ＳＡＲＳおよびその他のコロナウイルス；（ｈ）デング熱およびアルファウイルス、例えば、ウエストナイルウイルスおよび手足口病ウイルス；（ｉ）チクングンヤ熱およびその他のアルファウイルス；（ｋ）ＣＭＶおよびその他のヘルペスウイルス；（ｌ）ロタウイルス、からなる群より選択されるポリペプチドである。さらなる極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ＲＳＶ由来である。
好ましい実施形態では、前記抗原は、インフルエンザＡウイルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインまたはその抗原性フラグメントである。極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、インフルエンザＡウイルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインを含む、または好ましくはそれからなり、好ましくはインフルエンザＡウイルスＭ２タンパク質の前記細胞外ドメインは、配列番号２４である。別の好ましい実施形態では、前記抗原は、インフルエンザウイルスの球状ドメインである。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原はアレルゲンであり、好ましくは前記アレルゲンは、（ａ）花粉エキス；（ｂ）ダスト抽出物；（ｃ）チリダニ抽出物；（ｄ）真菌抽出物；（ｅ）哺乳動物表皮抽出物；（ｆ）羽毛抽出物；（ｇ）昆虫抽出物；（ｈ）食物抽出物；（ｉ）毛髪抽出物；（ｊ）唾液抽出物；（ｋ）血清抽出物、からなる群から誘導される。さらに好ましい実施形態では、前記抗原はアレルゲンであり、前記アレルゲンは、（ａ）木；（ｂ）草；（ｃ）ハウスダスト；（ｄ）チリダニ；（ｅ）アスペルギルス；（ｆ）動物の毛；（ｇ）動物の羽毛；（ｈ）ハチ毒；（ｉ）畜産物；（ｊ）植物性産物；（ｋ）動物の鱗屑；（ｌ）ピーナッツアレルゲン、からなる群から選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記抗原は組換え型アレルゲンであり、前記アレルゲンは、（ａ）ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １；（ｃ）カバノキ花粉Ｂｅｔ Ｉ；（ｄ）米国産クロスズメバチ毒液５ ＤｏＩ ｍ Ｖ；（ｅ）チリダニＤｅｒ ｐ １；（ｆ）チリダニＤｅｒ ｆ ２；（ｇ）チリダニＤｅｒ ｐ ２；（ｈ）チリダニＬｅｐ ｄ；（ｉ）真菌アレルゲンＡｌｔ ａ １；（ｊ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １；（ｋ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；（ｌ）ピーナッツアレルゲン；（ｍ）ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１；（ｎ）イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１、Ｃａｎ ｆ２；（ｏ）ピーナッツ由来アレルゲン；または（ｐ）スギアレルゲンＣｒｙ Ｊ２、からなる群から選択される。本発明の別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１またはＣａｎ ｆ２である。
さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ピーナッツアレルゲンである。好ましくは前記抗原は、配列番号５７、配列番号６４または配列番号６５から選択されるアミノ酸配列を含むピーナッツアレルゲンである。
さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、スギＣｒｙ Ｊ ２由来のアレルゲンである。好ましくは、前記抗原は、スギＣｒｙ Ｊ ２由来のであり、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １由来アレルゲンである。好ましくは、前記抗原は、ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １由来であり、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
本発明の極めて好ましい実施形態では、前記抗原はネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１である。イエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）は、室内アレルゲンの重要な入手源である（Ｌａｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５６，１３９２−１３９７）。実際に、ネコは、西欧諸国の家庭の約２５％で認められ、ネコに対するアレルギーは、集団の大部分で認められる。症状の重症度は、比較的軽度の鼻炎および結膜炎から命に関わる喘息性の悪化までの範囲にわたる。患者は場合により、ネコのフケおよび毛皮中のいくつかの異なる分子に感作されるが、主要なアレルゲンはＦｅｌ ｄ１である。このアレルゲンの重要性は、多数の調査で強調されてきた。実際に、８０％を超えるネコアレルギー患者が、この強力なアレルゲンに対しＩｇＥ抗体を提示する（ｖａｎ Ｒｅｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４，１２２３−１２３０）。
Ｆｅｌ ｄ１は、１０〜２０％のＮ結合型炭水化物を含む３５〜３９ｋＤａの酸性糖タンパク質であり、ネコの毛皮、唾液および涙腺中で認められている。それは、２つの非共有結合したヘテロダイマーにより形成される。それぞれのヘテロダイマーは、１つの７０残基ペプチド（「鎖１」として知られる）および１つの７８、８５、９０または９２残基ペプチド（「鎖２」として知られる）からなり、これらは、別々の遺伝子によりコードされる（Ｄｕｆｆｏｒｔ，Ｏ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，３０１−３０９；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ；（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，９６９０−９６９４およびＧｒｉｆｆｉｔｈ，Ｉ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １１３，２６３−２６８、を参照されたい）。
いくつかのＦｅｌ ｄ１の組換え型コンストラクトが報告されている（Ｖａｉｌｅｓ ＬＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）１１０：７５７−７６２；Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００３）２７８：４０１４４−４０１５１；２００３Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００９）２０６：１９４１−１９５５；国際公開第２００６／０９７５３０号）。
したがって、さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、ｒＦｅｌ ｄ１である。さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質であり、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２を含む融合タンパク質であり、Ｆｅｌ ｄ１の前記鎖２は、そのＣ末端を介してＦｅｌ ｄ１の前記鎖１のＮ末端に、１つのペプチド結合を介して直接にまたはスペーサーを介して融合され、前記スペーサーは１〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、好ましくは前記スペーサーは１０〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる。極めて好ましくは、前記スペーサーは、１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、さらに好ましくは前記スペーサーは、配列番号４７のアミノ酸配列を有する。さらに極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質であり、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２を含む融合タンパク質であり、Ｆｅｌ ｄ１の前記鎖１は、そのＣ末端を介してＦｅｌ ｄ１の前記鎖２のＮ末端に、１つのペプチド結合を介して直接にまたはスペーサーを介して融合され、前記スペーサーは１〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、好ましくは前記スペーサーは１０〜２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｆｅｌ ｄ１の前記鎖１は、配列番号３７の配列またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３７に対し９０％を超える、またはさらにより好ましくは９５％を超える同一性を有する。さらに好ましくは、Ｆｅｌ ｄ１の前記鎖２は、配列番号３８、配列番号３９もしくは配列番号４０の配列、またはその相同配列を含み、前記相同配列は、配列番号３８、配列番号３９または配列番号４０に対し９０％を超える、さらにより好ましくは９５％を超える同一性を有する。
極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号１７を含む、または好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号１８を含む、または好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、配列番号５２を含む、または好ましくはそれからなる。極めて好ましい実施形態では、前記抗原は、Ｆｅｌ ｄ１であり、（ａ）配列番号１７；（ｂ）配列番号１８；（ｃ）配列番号５０；（ｄ）配列番号５６；（ｅ）配列番号５９；または配列番号５２、から選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号５０；（ｂ）配列番号５６；（ｃ）配列番号５９；または（ｄ）配列番号５２、から選択されるアミノ酸配列を含む。さらに極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号５０；（ｂ）配列番号５６；または（ｃ）配列番号５９、から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。別の極めて好ましい実施形態では、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる。
極めて好ましい実施形態では、本発明の組成物は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の、少なくとも１つの第１結合部位を有する改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、本質的にそれからなり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、および（ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープを含み、好ましくはそれらからなり；かつ前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号６または配列番号７を含む、好ましくはそれからなる、改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの第２結合部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記抗原はＦｅｌ ｄ１タンパク質であり；前記ＣＭＶ由来のＶＬＰおよび前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号５０；（ｂ）配列番号５６；（ｃ）配列番号５９；または（ｄ）配列番号５２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ好ましくは前記Ｆｅｌ ｄ１タンパク質は、（ａ）配列番号５０；（ｂ）配列番号５６または（ｃ）配列番号５９から選択されるアミノ酸配列を含む抗原、とを含む。
さらなる好ましい実施形態では、前記抗原は、動物毒素である。好ましい実施形態では、抗原は不活化ヘビ毒である。さらなる好ましい実施形態では、前記抗原は、ハプテンである。さらに好ましい実施形態では、前記ハプテンは薬物であり、好ましくは前記薬物は、（ａ）コデイン；（ｂ）フェンタニール；（ｃ）ヘロイン；（ｄ）モルヒネ；（ｅ）アンフェタミン；（ｆ）コカイン；（ｇ）メチレンジオキシメタンフェタミン；（ｈ）メタンフェタミン；（ｉ）メチルフェニデート；（ｊ）ニコチン；（ｋ）ＬＳＤ；（ｌ）メスカリン；（ｍ）シロシビン；（ｎ）テトラヒドロカンナビノール；および（ｏ）ニコチン、からなる群から選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記ハプテンはホルモンであり、好ましくは前記ホルモンは、（ａ）プロゲステロン；（ｂ）エストロゲン；（ｃ）テストステロン；（ｄ）卵胞刺激ホルモン；（ｅ）メラニン色素刺激ホルモン；（ｆ）アドレナリン；および（ｇ）ノルアドレナリン、からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記ハプテンは毒素であり、好ましくは前記毒素は、（ａ）アフラトキシン；（ｂ）シガテラ毒；（ｃ）テトロドトキシン；および（ｄ）抗生物質、からなる群から選択される。さらなる好ましい実施形態では、前記ハプテンは病原体由来炭水化物である。
さらなる態様では、本発明は、本発明の改変ウイルス様粒子または本発明の組成物を含む、あるいはそれからなるワクチンを提供する。包含されるのは、前記改変ＶＬＰ、および／または前記組成物が本明細書で開示の技術的特徴のいずれか１つを、単独で、または任意の可能な組み合わせで含むワクチンである。一実施形態では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。さらなる実施形態では、ワクチンはアジュバントを欠いている。好ましい実施形態では、前記ワクチンは、有効量の本発明の組成物を含む。「有効量」は、検出可能な生理学的効果を達成するために対象に投与が必要な量を意味する。
さらなる態様では、本発明は、（ａ）本発明の改変ＶＬＰ、本発明の組成物、または本発明のワクチン、および（ｂ）薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物に関する。前記希釈剤には、無菌水性（例えば、生理食塩水）または水溶液および懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルである。キャリアまたは密封包帯を使って皮膚透過性を高め、抗原吸収を向上させることができる。本発明の医薬組成物は、コンジュゲートの効力を向上させるのに望ましい、塩、緩衝液、アジュバント、またはその他の物質を含む形態にしてよい。医薬組成物の調製での使用に好適する材料の例に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（１９９０））を含む多くの情報源が提供されている。一実施形態では、前記医薬組成物は、有効量の本発明のワクチンを含む。「有効量」は、検出可能な生理学的効果を達成するために対象に投与が必要な量を意味する。
さらなる本発明の態様は、本発明の改変ＶＬＰ、本発明の組成物、本発明のワクチン、または本発明の医薬組成物を動物またはヒトに投与することを含む免疫方法である。好ましい実施形態では、前記方法は、本発明の組成物、本発明のワクチン、または本発明の医薬組成物を動物もしくはヒトに投与することを含む。
さらなる本発明の態様は、動物の疾患、障害もしくは生理的状態の処置または予防方法であり、前記方法は、本発明の改変ＶＬＰ、本発明の組成物、本発明のワクチン、または本発明の医薬組成物を動物に投与することを含み、好ましくは前記動物はヒトとすることができる。さらに好ましい実施形態では、前記改変ＶＬＰ、前記組成物、前記ワクチン、または前記医薬組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、鼻腔内に、経口で、結節内に、または経皮で、前記動物に投与される。
実施例
実施例１
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の単離とクローニング
ラトビアのリガの個人庭園から収集したＣＭＶ感染ユリ葉由来の総ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を使い、製造業者の推奨条件に従って単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した。ＣＭＶ ＣＰ遺伝子の増幅のために、ジェンバンク由来のＣＭＶ配列の解析後、次のプライマー配列を選択した。ＣＭｃｐＦ（ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡ ＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴ）（配列番号８）およびＣＭｃｐＲ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡ ＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡ）（配列番号９）；ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にアンダーラインをした。対応するＰＣＲ産物をｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）に挿入した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞をクローニングおよびプラスミド増幅用の宿主として使用した。ＲＴ−ＰＣＲエラーを避けるために、ＢｉｇＤｙｅサイクルシークエンシングキットおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使って、いくつかのＣＰ遺伝子含有ｐＴＺＡ５７プラスミドクローンの配列を決定した。配列決定後、配列番号１のＣＭＶコートタンパク質をコードする、配列エラーのないＣＭＶ ＣＰ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１０）をｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブクローニングし、発現プラスミドｐＥＴ−ＣＭＶｗｔ（図１）を生成した。
実施例２
ＣＭＶ由来のＶＬＰをもたらす大腸菌中の配列番号１のＣＰの発現
ＣＭＶ ＶＬＰを得るために、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）をＣＭＶ ＣＰ遺伝子含有プラスミドｐＥＴ−ＣＭＶｗｔで形質転換した。最高の発現レベルの標的タンパク質を有するクローンを選択した後、大腸菌培養液を回転振盪機（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有２ｘＴＹ培地中、３０℃で０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させたその後、細胞を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、培地を５ｍＭのＭｇＣｌ２で補充した。回転振盪機を使って、２０℃で１８時間、インキュベーションを継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離により集め、−２０℃で凍結した。氷上で解凍後、細胞を５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのメルカプトエタノール含有緩衝液（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）中に懸濁し、超音波処置により粉砕した。不溶性タンパク質および壊死組織片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分）により除去した。透明化したライセート中の可溶性ＣＭＶ ＣＰタンパク質を、飽和硫酸アンモニウム（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を＋４℃で一晩使用してペレット化した。沈殿したタンパク質を同じ緩衝液Ａ（メルカプトエタノール不含）中、＋４℃で４時間可溶化した。不溶性タンパク質を低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分）により除去した。ショ糖勾配（緩衝液Ａ中の２０〜６０％のショ糖、メルカプトエタノール不含、０．５％トリトンＸ−１００を補充）中の超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により可溶性ＣＭＶ ＣＰ含有タンパク質溶液を細胞タンパク質から分離した。勾配液の底部から開始して、勾配液を６つの画分に分割し、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２）。組換え型ＣＭＶ ＣＰを含む画分Ｎｏ．２およびＮｏ．３を合わせて、２００倍量の緩衝液（５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）に対して透析し、ショ糖およびトリトンＸ−１００を除去した。透析後、０．２μｍフィルタを通した濾過によりＣＭＶ ＣＰ溶液を滅菌した。次に、無菌条件下で２０％ショ糖「クッション」を通すＴｙｐｅ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、＋５℃、４時間）を使って、ＣＭＶ ＣＰを濃縮した。精製されたＣＭＶｗｔの濃度は、製造業者推奨条件（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に従ってＱｕＢｉｔ蛍光光度計を使って推定した。濃縮ＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を４℃で５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）中に貯蔵した。ＶＬＰの発現および精製に関する全ステップを１２．５％ゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターした。
図２に示すように、ＣＭＶコートタンパク質は、大腸菌細胞中で成功裏に発現させることができ、得られたかなりの部分を可溶性画分とすることができる。さらに、ショ糖勾配分析（図３Ａ）、動的光散乱および電子顕微鏡解析（図３Ｂ）により示されるように、これらのタンパク質は、大腸菌細胞抽出物中で等軸ＶＬＰの形態で直接見つけ出せる。
実施例３
破傷風トキソイドエピトープ含有ＣＭＶ（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０）の改変コートタンパク質のクローニング
配列番号１のＣＭＶ ＣＰのＮ末端の元のアミノ酸を外来性エピトープ配列で置き換えるために、ＰＣＲ増幅および変異誘発のテンプレートとして、ｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドを使用した。ＣＭＶｗｔ遺伝子の内部に位置するにＳａｌＩ部位（図１）をＰＣＲ産物に対応するクローニングのために使用した。
ＣＭＶｗｔ遺伝子に破傷風トキソイドエピトープコード配列を導入するために、２ステップＰＣＲ変異誘発が必要であった。第１ステップ増幅のために、次のプライマーをＰＣＲに使用した：ｐＥＴ−２２０（ａｇｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃａａｇｇａａ（配列番号１１）−ポリリンカーの上流、増幅領域はＢｇｌＩＩ部位を含む）およびＣＭＶ−ｔｔ８３−１Ｒ（ＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴ ＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴ）（配列番号１２）。第２ラウンドのために、第１ラウンド由来のＰＣＲ産物を１：５０に希釈し、プライマーｐＥＴ−２２０（配列番号１１）およびＣＭＶ−ｔｔ８３Ｓａｌ−Ｒ２（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＡＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧ ＧＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＣＴＧ（配列番号１３））で再増幅した。得られたＰＣＲ産物（配列番号６のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０をコードする配列番号１４のｃＤＮＡ）をｐＥＴ−ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａＬＩ部位中にサブクローン化した。正確なクローンを配列決定により特定し、ｐＥＴ−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と表記した。
実施例４
ＣＭＶ由来改変ＶＬＰをもたらす大腸菌中でのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の発現
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の発現および精製の手順は、実質的にＣＭＶｗｔに対する物と同じとし、これは実施例２に記載されている。ＣＭＶ ＶＬＰ中の破傷風エピトープの存在を示すために、精製されたＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの質量分析を使用した。図４Ｃに示すように、第１メチオニンが大腸菌細胞でのタンパク質合成中に除去される場合には、得られる主ピークは、タンパク質の理論的分子量に相当する。動的光散乱および電子顕微鏡分析により、ＣＭＶｗｔ ＶＬＰに類似の等軸粒子形態が確認される（図５）。
実施例５
ＰＡＤＲＥエピトープ含有ＣＭＶ（ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ）の改変コートタンパク質のクローニング
ＣＭＶｗｔ遺伝子中にＰＡＤＲＥエピトープコード配列を導入するために、増幅およびサブクローニングのテンプレートとしてｐＥＴ−ＣＭＶｗｔプラスミドを使用してＰＣＲ変異誘発を実施した（実施例３も参照されたい）。増幅用として、次のプライマーを使用した：ｐＥＴ−２２０（配列番号１１）およびＣＭＶ−ｐａｄｒＳａｌ−Ｒ（ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴ ＣＧＣＣＡＴＧＧＴ）（配列番号１５）。得られたＰＣＲ産物（配列番号７のＣＭＶ−Ｎｐａｄｒをコードする配列番号１６のｃＤＮＡ）をｐＥＴ−ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位中に再度サブクローン化した。正確なクローンを配列決定により特定し、ｐＥＴ−ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒと表記した。
実施例６
ＣＭＶ由来改変ＶＬＰをもたらす大腸菌中でのＣＭＶ−Ｎｐａｄｒの発現
ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒの発現および精製の手順は、実質的にＣＭＶｗｔに対するものと同じとし、これは実施例２に記載されている。ＣＭＶ ＶＬＰ中のＰＡＤＲＥエピトープの存在を示すために、精製されたＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの質量分析を使用した。図４Ｂに示すように、第１メチオニンが大腸菌細胞でのタンパク質合成中に除去される場合には、得られる主ピークは、タンパク質の理論的分子量に相当する。動的光散乱および電子顕微鏡分析により、ＣＭＶｗｔおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰとは少し異なる等軸粒子形態が確認される（図６）。
実施例７
ＣＭＶｗｔ、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒによるマウスの免疫化
４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスからなる群を、ＣＭＶｗｔ、ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰのいずれかで免疫化した。ＶＬＰを１５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に配合し、１５０μｌを０日目および７日目にｉ．ｖ．注射した。ＣＭＶｗｔ、ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを次の３種の量：１０、１または０．１μｇで注射した。マウスから、０日目（免疫前）、７日目、１４日目、および２５日目に採血し、ＣＭＶｗｔ ＶＬＰ、ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。全ての免疫血清を、免疫化に使用したそれぞれのＶＬＰに対して試験した。
ＥＬＩＳＡ
示した時間でのマウス血清の抗体応答を分析した。ＣＭＶｗｔ、ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ特異的抗体力価の決定のために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）をコーティング緩衝液（０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６）中の１００μｌの対応するＶＬＰ（１μｇ／ｍＬ）を使って、４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を回避するために、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴ中２％ＢＳＡでブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。血清試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈した。予め希釈された血清をコーティングしたプレートに移し、さらに系列希釈して、ＯＤ５０の計算による抗体力価を得た。室温で２時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。血清抗体の結合を西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、試料当たり１００μｌの体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを以前に述べたように洗浄した。洗浄前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）および９μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍのクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解した。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペットで採取し、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止液（Ｈ２Ｏ中の５％Ｈ２ＳＯ４）をプレートにピペットで直接加えた。１，２−フェニレンジアミンジヒドロクロリドカラー反応の４５０ｎｍでの吸光度読み値を解析した。図７は、ＣＭＶｗｔ（図７Ａ）、ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ（図７Ｂ）およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８８０（図７Ｃ）特異的抗体を用量依存的様式で示す。
実施例８
組換え型Ｆｅｌ ｄ１コンストラクトのＶＬＰ ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応
ｒＦｅｌ ｄ１（配列番号１７）の共有結合融合を以前記載したように生成した（Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００９）２０６：１９４１−１９５５）。手短に言えば、鎖２および鎖１の共有結合ダイマーをコードした相補的なＤＮＡであって、Ｆｅｌ ｄ１の鎖２がそのＣ末端を介して、１５ａａリンカー（ＧＧＧＧＳ）３の間隔を置いて、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１のＮ末端に融合される相補的なＤＮＡが、一連のオーバーラップしているＤＮＡプライマーを使って、ＰＣＲ増幅により得られた（このコンストラクトを「ｒＦｅｌ−２−Ｇ３−１−コンストラクト」と命名する）。この相補的ＤＮＡをインフレームで改変バージョンのｐＥＴ−４２ａ（＋）（ＥＭＤ）中に挿入し、ｒＦｅｌ−２−Ｇ３−１−コンストラクトのＣ末端に、ＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号３５）のコード配列を付加した。付加配列は、精製用のヒスチジンタグ、続けて、このＦｅｌ ｄ１融合タンパク質のＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングに使用されるＧＧＣリンカーを含む。
同様にして、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１およびＦｅｌ ｄ１の鎖２を含むｒＦｅｌ ｄ１融合タンパク質に対応する、ｒＦｅｌ ｄ１（配列番号１８）の別の共有結合の融合体を、以前記載（国際公開第２００６／０９７５３０号）したように生成し、この場合、Ｆｅｌ ｄ１の鎖１がそのＣ末端を介して、１５ａａリンカー（ＧＧＧＧＳ）３により、Ｆｅｌ ｄ１の鎖２のＮ末端に融合される（「ｒＦｅｌ−１−Ｇ３−２−コンストラクト」）。
２ｍｇ／ｍｌ（７１μＭ）の濃度の２．５ｍｌの体積のウイルス様粒子ＶＬＰ ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０を、２７μｌの５０ｍＭのヘテロ二機能性化学架橋剤スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）と室温（ＲＴ）で１時間反応させた。リンカーはＮＨＳエステルを含み、これは、ＶＬＰの表面上のリシンと反応する。ＳＭＰＨの量は、１つのＶＬＰモノマー、すなわち１つのＣＭＶポリペプチドについて、７．５倍モル過剰を意味する。未反応架橋剤は、１５０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４対して、透析により除去された。ｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０組成物を産生するために、２．７ｍｇ／ｍｌ（１５０μＭ）の濃度のｒＦｅｌ ｄ１のタンパク質溶液の２００μｌを、５倍モル過剰の還元剤トリス−２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。モル過剰は、タンパク質Ｆｅｌ ｄ１の量に関連した。ＴＣＥＰは、ＶＬＰを誘導体化するカップリング反応への２つのタンパク質分子の２つのシステイン残基の利用可能性を保証するために、システイン残基の間のジスルフィド架橋を還元する。前処理したタンパク質Ｆｅｌ ｄ１を、１：１のモル比で、７．５ｘのＳＭＰＨ誘導体化ＶＬＰ ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と、振盪しながら室温で３時間反応させる。還元されたタンパク質のシステインは、ＶＬＰに結合した架橋剤ＳＭＰＨのマレイミドと反応した。共有結合カップリング後、非カップリングｒＦｅｌ ｄ１を、１５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのゲル濾過により除去した。前記組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングにより分析し、カップリングバンドを観察し、確認した。この目的のために、ＳＭＰＨ誘導体化ＶＬＰ ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の試料、組成物ｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＦｅｌ ｄ１タンパク質を同時にゲルにアプライした。タンパク質Ｆｅｌ ｄ１のヒスチジンタグに結合した抗ペンタＨｉｓタグ抗体を使ったイムノブロッティングによりカップリングを観察した。可視バンドは、Ｆｅｌ ｄ１タンパク質ならびにＳＭＰＨ誘導体化ＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ、ＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０、および組成物ｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の全てが容易にそれらのサイズで区別されることを示した。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクーマシーブルーで染色し、カップリングを観察し、確認した。
ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に結合したｒＦｅｌ ｄ１によるマウスの免疫化
５匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスからなる群を、ＳＭＰＨを介してｒＦｅｌ ｄ１に結合したＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰおよびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰのいずれかで免疫化した。５μｇの量のｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−ＮｐａｄｒおよびｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０を、それぞれ１５０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１５０μｌに希釈し、０日目および７日目に静脈内に注射した。マウスから、０日目（免疫前）、７日目、１４日目、および２５日目に採血し、Ｆｅｌ ｄ１特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡ
示した時間でのマウス血清の抗体応答を分析した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１μｇ／ｍＬの濃度の１００μｌを使って、４℃下、一晩コーティングすることにより、Ｆｅｌ ｄ１に特異的な抗体を分析した。０．０５％のツイーン２０を含む２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２、ＰＢＳＴ）でＥＬＩＳＡプレートを５回洗浄した。非特異的結合を回避するために、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴ中２％ＢＳＡでブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。血清試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈した。予め希釈された血清をコーティングしたプレートに移し、さらに系列希釈して、ＯＤ５０の計算による抗体力価を得た。室温で２時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した。血清抗体の結合を西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出した。検出抗体を２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、試料当たり１００μｌの体積を移した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを以前に述べたように洗浄した。洗浄前に、基質溶液を調製した。この目的のために、１錠（１０ｍｇ）のＯＰＤ（１，２−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）および９μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を２５ｍｌのクエン酸緩衝液（０．０６６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍのクエン酸、ｐＨ５．０）に溶解した。１００μｌの体積の基質溶液をプレートにピペットで採取し、室温で７分間正確にインキュベートした。反応を停止させるために、５０μｌの停止液（Ｈ２Ｏ中の５％Ｈ２ＳＯ４）をプレートにピペットで直接加えた。１，２−フェニレンジアミンジヒドロクロリドカラー反応の４５０ｎｍでの吸光度読み値を解析した。図８は、本発明の組成物ｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ（図８Ａ）およびｒＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０（図８Ｂ）により、Ｆｅｌ ｄ１特異的抗体がマウス中で誘導されたことを示す。
実施例９
α−シヌクレインのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
配列番号２２のα−シヌクレインペプチドの、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０（配列番号６）から形成されたＶＬＰへのカップリングを次のように行った。２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３中の１ｍｇ／ｍｌのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の１ｍｌの溶液を、室温で、７９．３ｍｌのＳＭＰＨ溶液（ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ）と６０分間反応させた。同様に、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中の１ｍｇ／ｍｌのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０の１ｍｌの溶液を、室温で、７９．３ｍｌのＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ溶液（２０ｍＭのヘペス中の１０ｍＭ、ｐＨ７．４）と６０分間反応させた。反応物を３倍の２Ｌの２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３に対し、２時間、１４時間および１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット中で２時間、４℃で透析を行った。８００μｌの誘導体化および透析ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０溶液を、２１．５μｌのα−シヌクレインペプチド（２２．３２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、化学架橋のために、５００ｒｐｍの振盪Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使って、室温で３時間インキュベートした。カップリング反応物を４℃、２００００ｘｇで１０分間の遠心分離により清澄化した。誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コートタンパク質およびカップリング生成物を、還元条件下、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリスゲルを使ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。その後、クマシー染色したゲル剤の濃度分析を実施した。ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コーティングモノマーに比較して、増加した分子量を示すいくつかのバンドが認められ、α−シヌクレインペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０への架橋に成功したことを明確に示している（クマシー染色したＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、図示せず）。結合密度は、１．０を超え、カップリング効率は約６０％であった。誘導体化およびカップリング後のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの健全性を試験するために、誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびカップリング生成物を、１ｘＴＡＥを使って、続けて、クマシー染色および臭化エチジウム染色を使って、１％アガロースゲル電気泳動により分析した。誘導体化およびカップリングＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰのタンパク質バンドおよび核酸バンドは、それぞれ、同時移動し、非誘導体化および非カップリングＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と類似の移動挙動を示す。コートタンパク質と核酸との同時移動は、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰがまだ無傷であり、核酸がＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰから放出されなかったことを明確に示した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コートタンパク質に結合したα−シヌクレイン由来ペプチドによるマウスの免疫化
４匹の雌Ｃ５７Ｂ／６マウスの群を、ＳＭＰＨを介してα−シヌクレインペプチド（配列番号２２）に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化した。２５０μｇの量の総タンパク質を、１５０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１５０μｌに希釈し、０日目および１４日目にｉ．ｖ．注射した。マウスから、０日目（免疫前）、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および３４日目に採血し、α−シヌクレイン特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡ
化学架橋剤ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＰを使って、α−シヌクレインペプチドをウシＲＮアーゼＡに結合した。ＥＬＩＳＡプレートを５μｇ／ｍｌの濃度のα−シヌクレインペプチド結合ＲＮアーゼ配合物でコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧで検出した。対照として、同じマウスの免疫前血清を同様に試験した。全マウスは、図９に見られるように、α−シヌクレイン由来ペプチドに対し明確で強力なＩｇＧ応答をした。
実施例１０
ＩＬ−１７ＡペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
マウスＩＬ１７Ａタンパク質（配列番号２０）のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コートタンパク質（配列番号６）へのカップリングを行った。ｍＩＬ−１７タンパク質は、２ステップ法により、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に共有結合した。第１ステップでは、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４中２ｍｇ／ｍｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）を、室温で、等モル量のヘテロ二機能性化学架橋剤スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）と６０分間反応させた。おなじ緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）を使って、ＰＤ−１０脱塩カラムを備えたゲル濾過により未反応の架橋剤を除去した。コンジュゲーションステップの前に、精製ｍＩＬ−１７タンパク質を室温で５分間、１０倍過剰のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）と共にインキュベートし、リンカー中の全てのシステイン残基を還元した。その後、等モル量のｍＩＬ−１７タンパク質とＶＬＰを室温で３時間反応させることにより、ｍＩＬ−１７タンパク質を誘導体化ＶＬＰに共有結合させた。ワクチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続けて、クマシー染色および抗Ｈｉｓタグ抗体とのイムノブロッティングにより分析した。カップリング反応の種々の成分に対応するクーマシーブルー染色バンドの強度をデンシトメトリーにより測定し、カップリング効率の計算に使用した。モノマーの誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０は、離れた２８ｋＤａバンドとして移動し、一方、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ｍＩＬ−１７コンジュゲートは、４５ｋＤａ（２８ｋＤａのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０モノマー＋１７ｋＤａのｍＩＬ−１７タンパク質）に移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色による解析により、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コートタンパク質と比較していくつかの増加した分子量のバンドが認められ、ＩＬ−１７タンパク質のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへの架橋に成功したことを示している。カップリング効率は、ｍＩＬ−１７に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０モノマー（４５ｋＤａバンド）の、総ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０モノマー（２８と４５ｋＤａバンドの合計）に対する比として定義される。カップリング効率は、少なくとも１５．３％と決定され、６．５分子ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０当たり１分子のｍＩＬ−１７に相当する。この方式で計算されたカップリング効率は、カップリングの程度の最小推定である。理由は、この方式が、２つ以上のｍＩＬ−１７分子に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０モノマーを考慮していないためである。したがって、ＩＬ−１７Ａなどの目的のタンパク質は、効率的にＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰに結合できる。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰに結合したマウスＩＬ１７Ａタンパク質によるマウスの免疫化
３匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、マウスＩＬ１７Ａタンパク質に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０コートタンパク質で免疫化した。２０μｇの量の総タンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１５０μｌに希釈し、０日目および１４日目に静脈内に注射した。マウスから、０日目（免疫前）、７日目、１４日目、２１日目、および３４日目に採血し、マウスＩＬ１７Ａ特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの濃度のマウスＩＬ１７Ａでコーティングした。プレートをブロッキングした後、０日目、４日目、１４日目、２１日目および３４日目に採取した系列希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。４５０ｎｍで最大半減光学密度に達するそれらの希釈液の平均として、マウス血清の抗体力価を計算した。ＩＬ１７Ａに結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化したマウスは、ＩＬ１７タンパク質に対し強力な免疫反応を開始した（図１０）。
中和抗体の検出
上述のようにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に結合したマウスＩＬ１７で免疫したマウスの血清を、マウスＩＬ１７Ａタンパク質のＩＬ−１７レセプターに対する結合を阻害するそれらの能力に関して試験する。したがって、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌの濃度のマウスＩＬ−１７レセプターＡタンパク質でコーティングした。３５日目に採取した系列希釈のマウス血清を１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化マウスＩＬ−１７Ａと１時間プレインキュベートした後、ＩＬ−１７レセプターＡをコーティングしたプレートに加えた。ＩＬ−１７のレセプターへの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで検出する。４５０ｎｍで最大半減光学密度に達するそれらの血清希釈液の平均として、中和抗体価を計算する。
多発性硬化症用のマウスモデルにおける実験的自己免疫脳炎の改善に基づくＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ｍＩＬ１７Ａの効力
雌ＳＪＬマウスを上述のようにして免疫化し、最後の免疫化の１週間後に完全フロインドアジュバントと混合した１００μｇのＰＬＰペプチドを皮下に注射した。同じ日に、全マウスに４００ｎｇの百日咳毒素を腹腔内に注射した。次のスキームに従って、神経学的症状の発症に対し、毎日マウスをスコア化した。０，臨床的疾患なし；０．５、尾端のひきずり；１、尾完全ひきずり；１．５、尾ひきずりおよび後肢脱力（後肢の不安定歩行および不十分なにぎり）；２、片側性部分的後肢運動麻痺；２．５、両側性部分的後肢運動麻痺；３、完全な両側性後肢運動麻痺；３．５、完全な両側性後肢運動麻痺および片側性前肢運動麻痺；４、後肢および前肢の全体運動麻痺。上述のようにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ｍＩＬ１７ＡまたはＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０で免疫化したマウスの平均臨床的スコアを評価する。ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ｍＩＬ１７Ａ免疫化マウスは、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０免疫化マウスに比べて、５３日目と６１日目との間で臨床症状を大きく低減した。これは、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ｍＩＬ１７Ａでの免疫化により生成した抗ＩＬ−１７抗体が多発性硬化症のマウスモデルの臨床症状を改善できることを示している。
実施例１１
マウスＩＬ−５のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
記載のようにＩＬ−５を発現させ、精製した（Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２−３２００）。ｍＩＬ−５（配列番号２３）の配列番号６の改変ＣＰを有するＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングを次のように行った。ＩＬ−５に結合させるために、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、最初に３０倍過剰のヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）で誘導体化した。非結合ＳＭＰＨをＰＢＳに対する透析により除去した。ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の等モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を使ってｒＩＬ−５を１時間還元した。還元したｒＩＬ−５（８０μＭ）を、４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と共に２２℃で４時間インキュベートした。反応物をＰＢＳ ｐＨ８．０に対し１２時間透析した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０改変コートタンパク質のＶＬＰに結合したＩＬ−５由来ペプチドによるマウスの免疫化
４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を、ＳＭＰＨを介してＩＬ−５（配列番号２３）に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰのいずれかで免疫化した。５０μｇの総タンパク質を、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で２００μｌに希釈し、０日目および１４日目に皮下に注射した（両腹側に２箇所に１００μｌ）。マウスから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、ＩＬ−５およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−５または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰでコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧで検出した。対照として、同じマウスの免疫前血清を同様に試験した（デーは示さず）。全マウスは、ペプチドならびにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に対し明確で強力なＩｇＧ応答をした。
アレルギー性気道炎症のＯＶＡ系モデル
アレルギー性気道炎症を誘導するために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たり５匹）に、２ｍｇのミョウバン（水酸化アルミニウムゲルアジュバント、Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合した１０μｇのＯＶＡ（Ｇｒａｄｅ Ｖ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射（ｉ．ｐ．）した。１０日後、１００μｇのＯＶＡを４日間、マウスに鼻腔内投与した。最後の投与の２４時間後、気管支肺胞洗浄を行い、肺を組織学検査に供した。ＯＶＡおよびミョウバンをｉ．ｐ．注射したが、ＯＶＡを鼻腔内投与しなかったマウスは、これらの実験の疾患誘導のための陰性対照としての役割を持たせた。
このモデルを使って、１００μｇのＩＬ−５に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰまたはＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで２回（０日目、１４日目）マウスを免疫化した。２１日目に、ＯＶＡでマウスを感作し、３１日目にＯＶＡを鼻腔内投与した。ＩＬ−５免疫化マウスは、気管支肺胞液中の好酸球数が劇的に低減した。
実施例１２
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ウイルス様粒子へのＭ２ペプチドのカップリング
ＰＢＳ／１０％グリセロール（ｐＨ７．２）中の１ｍｇ／ｍｌの配列番号６の改変ＣＰを有するＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの２ｍｌの溶液を、室温で、４２．６μｌのＳＭＰＨ溶液（ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ）と６０分間反応させた。反応溶液を、２回の２ １交換の２０ｍＭのヘペス／１０％グリセロール（ｐＨ７．２）に対して、４℃で、１２時間および４時間にわたり透析した。０．６ｍｌの誘導体化および透析ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０溶液を、２１．４５μｌの１０ｍＭのインフルエンザペプチドＭ２（配列番号２４）のＤＭＳＯ溶液と混合し、化学架橋させるために室温で４時間インキュベートし、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ｍ２コンジュゲートワクチンを得た。２０ｍＭのヘペス／１０％グリセロール、ｐＨ７．２に対し、１２時間および４時間透析することによりカップリングしていないペプチドを除去した。カップリングした生成物を還元条件下、１２％ビス−トリス−ポリアクリルアミドゲルで分析した。ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドモノマーに比較して、増加した分子量のいくつかのバンドが認められ、インフルエンザＭ２ペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドへの架橋に成功したことを明確に示している。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドに結合したＭ２ペプチド（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ｍ２）によるマウスの免疫化
群当たり４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを２００μｌのＰＢＳ中に配合された４０μｇのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ｍ２ワクチンで免疫化するために０日目および２０日目に皮下に注射した。マウスから、３４日目に採血し、Ｍ２特異的およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡによる抗Ｍ２抗体の検出
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のＭ２ペプチド（配列番号２４）または１０μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ウイルス様粒子でコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。マウス血清の抗体力価は、飽和時測定ＯＤの５０％（ＯＤ５０）になる希釈の逆数として、定義される。３４日目のマウスの平均抗Ｍ２抗体力価および抗ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０力価は、１：１００００超であった。Ｍ２ペプチド単独では免疫原性がないことから、このデータは、Ｍ２ペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドへのカップリングがＭ２ペプチドの免疫原性を強力に高めることを示す。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ｍ２免疫化の効力をインフルエンザ感染症のマウスモデルで試験した。マウスに致死用量の４ｘＬＤ５０のマウス順化インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスを投与した。ウイルスをＰＢＳ中で希釈し、イソフランによる軽い麻酔下、鼻経由で投与した（２ｘ５０μｌ）。３０％を超えて体重を減少させたマウス、または３０℃以下の体温を示したマウスを安楽死させた。両群のマウスの生存は以下の通り：ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ｍ２で免疫化した全マウスは生存したが、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０単独で免疫化した全マウスは死亡した。結果は、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に結合したＭ２ペプチドでの免疫化は、Ｍ２特異的抗体を誘導し、この抗体はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる致死感染に対しマウスを保護することを示している。
実施例１３
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ウイルス様粒子へのＡβ１−６ペプチドのカップリング
ＰＢＳ／１０％グリセロール（ｐＨ７．２）中の１ｍｇ／ｍｌの配列番号６の改変ＣＰを有するＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの２ｍｌの溶液を、室温で、４２．６μｌのＳＭＰＨ溶液（ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭ）と６０分間反応させた。反応溶液を、２回の２ １交換の２０ｍＭのヘペス／１０％グリセロール（ｐＨ７．２）に対して、４℃で、１２時間および４時間にわたり透析した。０．６ｍｌの誘導体化および透析ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０溶液を、２１．４５μｌの１０ｍＭのＡβ１−６（配列番号２５）のＤＭＳＯ溶液と混合し、化学架橋するために室温で４時間インキュベートし、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ａβ１−６コンジュゲートワクチンを得た。２０ｍＭのヘペス／１０％グリセロール、ｐＨ７．２に対し、１２時間および４時間透析することによりカップリングしていないペプチドを除去した。カップリングした生成物を還元条件下、１２％ビス−トリス−ポリアクリルアミドゲルで分析した。ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドモノマーに比較して、増加した分子量のいくつかのバンドが認められ、Ａβ１−６ペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０への架橋に成功したことを明確に示している。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドに結合したＡβ１−６（ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ａβ１−６）によるマウスの免疫化
群当たり４匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを２００μｌのＰＢＳ中に配合された４０μｇのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−Ａβ１−６ワクチンで免疫化するために０日目および２０日目に皮下に注射した。マウスから、３４日目に採血し、Ａβ１−６特異的およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡによる抗Ａβ１−６抗体の検出
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼに結合したＡβ１−６または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ウイルス様粒子でコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。マウス血清の抗体力価は、飽和時測定ＯＤの５０％（ＯＤ５０）になる希釈の逆数として、定義される。３４日目のマウスの平均抗Ａβ１−６抗体力価および抗ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０力価は、１：１００００超であった。Ａβ１−６ペプチド単独では免疫原性がないことから、このデータは、Ａβ１−６ペプチドのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０カプシドへのカップリングがＡβ１−６ペプチドの免疫原性を強力に高めることを示す。ヒトアルツハイマー患者の脳切片をマウス血清で染色し、プラークが明瞭に見えるようになった。
実施例１４
Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質のクローニング
１５個のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号４７）を介してＦｅｌ ｄ１の鎖２のＮ末端に融合したＦｅｌ ｄ１鎖１からなり、Ｆｅｌ ｄ１の鎖２のＣ末端に融合したＨＨＨＨＨＨＧＧＣ配列（配列番号４８）を組み込んだＦｅｌ ｄ１融合タンパク質（Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと命名）を、オリゴヌクレオチド特異的遺伝子合成により産生した。対応するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号４９の配列を有し、Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣのタンパク質配列は、配列番号５０：ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＨＨＨＨＨＨＧＧＣの配列を有する。
遺伝子の解析後、そのヘルパープラスミドから切り取り、プラスミドｐＥＴ４２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）のＮｄｅｌ／ＸｈｏＩ部位にインフレームでサブクローン化し、発現ベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを得た。
ヘキサヒスチジン配列（Ｆ１２ＧＧＣと命名）不含のＦｅｌ ｄ１融合タンパク質を、プラスミドｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ変異誘発により産生した。これらの融合タンパク質を産生するためにＰＣＲで使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通り。Ｆ１２ＧＧＣに対しては、順方向プライマーは、Ｆｅｌ＿ＢｇｌＦ（配列番号５１）および逆方向プライマーは、Ｆｅｌｄ−ｄＨＲ（配列番号５３）とした。
全ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで切断し、サブクローン化によりベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの同じ切除部位に戻した。プラスミドＤＮＡの単離後、ＢｉｇＤｙｅサイクルシークエンシングキットおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使って、導入された変化を確認した。得られた発現ベクターをｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣと命名した。これは、対応するＦｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２ＧＧＣ（配列番号５６）をコードする。
ＭＥＩＣＰＡＶＫＲＤＶＤＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶＤＡＫＭＴＥＥＤＫＥＮＡＬＳＶＬＤＫＩＹＴＳＰＬＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＫＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＮＧＮＥＬＬＬＤＬＳＬＴＫＶＮＡＴＥＰＥＲＴＡＭＫＫＩＱＤＣＹＶＥＮＧＬＩＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴＩＳＳＳＫＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＶＥＤＬＫＬＮＴＬＧＲＧＧＣ（配列番号５６）
ヘキサヒスチジン配列は、金属キレート親和性クロマトグラフィーによる精製を可能とし、ＧＧＣまたはＧＧＣＧ（配列番号５８）を含むＣ末端配列は、Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒへのカップリングを可能とする。
実施例１５
Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質の発現と精製
大腸菌中のＦｅｌ ｄ１融合タンパク質の発現
Ｆｅｌ ｄ１発現ベクターｐＥＴ４２−Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣおよびｐＥＴ４２−Ｆ１２ＧＧＣを、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）中に形質転換した。標的タンパク質の発現が最も高レベルであるクローンを選択し、さらに実験に使用した。種々の組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質の発現を次の方法により実施した。発現プラスミド含有大腸菌の培養液を回転振盪機（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有２ｘＴＹ培地中、３０℃で０．８〜１．０のＯＤ６００まで増殖させた。次に、０．２ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより、Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質遺伝子の発現を誘導した。培地を５ｍＭのＭｇＣｌ２で補充した。回転振盪機を使って、２０℃で１８時間、インキュベーションを継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離により集め、精製まで−２０℃で凍結した。
ヘキサヒスチジンタグＦｅｌ ｄ１融合タンパク質の精製
Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣ融合タンパク質の精製のために、製造業者のインストラクションに従って、ＵＳＢ ＰｒｅｐＥａｓｅキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ，ＵＫ）を使用した。氷上で解凍後、１００ｍｌの培養液由来の大腸菌細胞（約０．７５ｇ）を５ｍＭのＤＴＴ含有１ｘＬＥＷ緩衝液中に懸濁させた後、超音波処理により粉砕した。不溶性タンパク質および壊死組織片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分）により除去した。清澄化ライセートをＮｉ−ＩＤＡカラムにアプライし、同じ緩衝液（ＤＴＴ不含）で２回洗浄し、２ｘ１．５ｍｌのイミダゾール含有１ｘＥ緩衝液で溶出した。Ｆｅｌ ｄ１含有画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより特定し（図１１Ａ）、２００倍量の緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に対し２回透析した。透析後、製造業者のインストラクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に従いＱｕＢｉｔ蛍光光度計を使って、または２８０ｎｍでのＵＶ分光光度測定によりタンパク質濃度を推定した。精製タンパク質の同定は、質量分析（図１１Ｂ）および抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０−３；データは示さず）を使ってウェスタンブロットにより確認した。
ヘキサヒスチジンタグ不含Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質の精製
Ｆ１２ＧＧＣ融合タンパク質の精製のために、アニオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した。３ｇのＩＰＴＧ誘導大腸菌を、２０ｍｌのリシスバッファーＬＢ（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ）中での超音波処理により粉砕した。超音波処理後、溶液を１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を集めた。一定撹拌下で硫酸アンモニウムを３０％飽和の達成まで添加した後、室温で５分間インキュベートした。遠心分離後、回収した上清に固体硫酸アンモニウムを５０％飽和まで加えた。遠心分離後、タンパク質ペレットを集め、２ｍｌのＬＢに溶解し、過剰塩をＬＢで平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で除去した。脱塩したタンパク質溶出液をＬＢで平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）Ｃａｐｔｏ（商標）ＤＥＡＥカラムにロードした。結合Ｆ１２ＧＧＣを増加濃度勾配のＮａＣｌで溶出した。Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質含有画分を集め、プールした。得られた溶液を４倍量の２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴで希釈し、ＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラムのＬＢ中にロードし、増加ＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質含有画分を集め、プールした。５ＭのＮａＣｌを２．５Ｍの濃度になるまで加え、ＤＴＴをその溶液に添加して５ｍＭの濃度を維持した。その後、１ｍｌＨｉＴｒａｐ（商標）Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラムの２．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ中にＦｅｌ ｄ１含有溶液をロードし、連続して減少するＮａＣｌ濃度で溶出した。Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質含有画分を集め、プールした。全精製工程をクマシー染色したＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルでモニターした（図１１Ｃ）。精製タンパク質の同定は、組換え型Ｆｅｌ ｄ１に対し産生したポリクローナル抗体を使ってウェスタンブロットにより確認した（データは示さず）。
実施例１６
組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質（単一または複数）の信頼性
Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質は、Ｆｅｌ ｄ１特異的モノクローナル抗体により同様に認識される。Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣおよび天然のＦｅｌ ｄ１（ｎＦｅｌ ｄ１）のＦｅｌ ｄ１特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）への結合を、Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）のサンドイッチＥＬＩＳＡのＦｅｌ ｄ１ ＥＬＩＳＡキット（６Ｆ９／３Ｅ４）を使って比較した。この目的のために、Ｎｕｎｃ ＥＬＩＳＡプレートを抗Ｆｅｌ ｄ１ ｍＡｂ ６Ｆ９（１μｇ／ｍｌ）で、４℃下、一晩コーティングした。プレートを０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。天然Ｆｅｌ ｄ１ならびにＦ１２Ｈ６ＧＧＣ（１μｇ／ｍｌ）を１：３で系列希釈し、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ビオチン化抗Ｆｅｌ ｄ１ ｍＡｂ ３Ｅ４（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間インキュベートした。検出には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識ストレプトアビジンを利用した。この目的のために、プレートをＰＢＳＴで洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、１：１０００希釈）をプレートに室温で３０分間加えた。検出はＯＰＤ基質溶液および停止液としての５％Ｈ２ＳＯ４を使って実施した。吸光度は、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使って測定した。
天然Ｆｅｌ ｄ１およびＦ１２Ｈ６ＧＧＣは、ＥＬＩＳＡによる類似した力価を与え、それらがＦｅｌ ｄ１特異的ｍＡｂにより同様に認識され、したがって、組換え型Ｆｅｌ ｄ１ Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣの信頼性が確認されたことを示す（図１２）。
組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質は、ネコアレルギー患者の全血中の好塩基球を活性化する。ネコアレルギー患者の血液は、Ｆｅｌ ｄ１特異的ＩｇＥ抗体をその表面に保持する好塩基球を含み、これがアレルゲン曝露時に、ＦｃεＲＩを架橋し、脱顆粒を引き起こす。組換え型Ｆｅｌ ｄ１の脱顆粒を引き起こす能力を調べるために、Ｆｅｌ ｄ１アレルギー患者から全血を収集し、組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと組み合わせて、Ｂｕｈｌｍａｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｌｏｗ Ｃａｓｔ（登録商標），ＦＫ ＣＣＲ）のＢａｓｏｐｈｉｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔキットで使用した。このアッセイは、ＣＣＲ３＋好塩基球上の専用脱顆粒マーカーＣＤ６３の発現上昇を測定する。簡単に説明すると、１００μｌの刺激緩衝液を５０μｌのＥＤＴＡ処理全血と混合した。さらに、５０μｌの種々の希釈度の天然Ｆｅｌ ｄ１または組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを加えた。ＦｃεＲＩに対するｍＡｂならびに非特異的細胞活性化剤（ｆＭＬＰ）を含む陽性対照溶液も同様にこのアッセイで試験した。ＰＥ標識抗ＣＣＲ３抗体およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ６３抗体を含む染色染料（試料当たり２０μｌ）を加え、３７℃で２５分間インキュベートした。その後、リシスバッファーを加えて赤血球を溶解した。１０分のインキュベーション後、試料を５００ｘｇで５分間遠心分離し、洗浄緩衝液（２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ）で洗浄した。第２の遠心分離ステップ後に、細胞ペレットを２００μｌの洗浄緩衝液中に懸濁させ、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）を使って捕捉した。試料をＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使って解析した。ＣＣＲ３＋好塩基球上でのＣＤ６３発現の割合を解析した。
組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質は、ネコアレルギー患者由来の好塩基球の脱顆粒を容易に誘発することがわかった。さらに、Ｆｅｌ ｄ１と比較した場合、類似のレベルの脱顆粒が得られ、したがって、組換えにより産生したＦｅｌ ｄ１融合タンパク質の信頼性を示す。（図１３Ａ／図１３Ｂ）。
実施例１７
Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−ＶＬＰへのカップリング
ヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）を使って、以下の方法で、Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰに共有結合させた。
５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）中に貯蔵されたＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒウイルス様粒子を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、３０％ショ糖および２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウムによる緩衝液交換を行った。ＣＭＶ−ＮｐａｄｒまたはＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの溶液を、室温で６０分間、７．５倍モル過剰のヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＰＨと反応させた。ＰＤ１０カラムを用いて、未反応ＳＭＰＨを３０％のショ糖および２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム中に取り除いた。
Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣを１０倍モル過剰のＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理した。誘導体化したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰを、１倍または２倍モル過剰の組換え型Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと２３℃で３時間反応させた。クーマシーブルーで染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリスゲル）によりカップリング反応を解析した。化学的コンジュゲーション反応後、約４４．５ｋＤａおよび６９ｋＤａの質量のタンパク質バンドが明らかであった（データは示さず）。これらのバンドは、Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣ（２０ｋＤａ）と共有結合したＣＭＶコートタンパク質（２４．５ｋＤａ）および１つのＦｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと共有結合した２つのＣＭＶコートタンパク質分子（４９ｋＤａ）に相当し、これらはそれぞれ、Ｆｅｌ ｄ１−ＣＭＶ ＶＬＰの形成を示している。
実施例１８
マウスにおけるＦｅｌ ｄ１−ＣＭＶ ＶＬＰに対する免疫反応
３匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群を、実施例１０に記載のように調製した、Ｆｅｌ ｄ１−ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰ、またはＦｅｌ ｄ１融合タンパク質Ｆ１２Ｈ６ＧＧＣと単純に混合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０−ＶＬＰで免疫化した。両組成物は、同じ量のＦｅｌ ｄ１融合タンパク質を含む。１０μｇのそれぞれの組成物を、１５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製し、１５０μｌを０日目および１４日目に静脈内に注射した。マウスから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、天然Ｆｅｌ ｄ１特異的ＩｇＧ抗体に対し、ＥＬＩＳＡにより血清を分析した。
ＮＵＮＣ ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬの濃度の天然Ｆｅｌ ｄ１（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、４℃で、一晩コーティングした。プレートをＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロッキングした。ＯＤ５０を検出するために、血清の系列希釈を実施した。ＯＤ５０は、最大ＯＤ値の半分に達する希釈の逆数を表す。ＩｇＧ抗体に特異的なＦｅｌ ｄ１を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）で直接標識した抗マウスＩｇＧで検出した。ＨＲＰＯによるｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）の変換を４５０ｎｍでのカラー反応として測定した。この反応は、７分のインキュベーション後、５％硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を添加することにより停止された。
単回免疫化後にのみ、Ｆｅｌ ｄ１特異的ＩｇＧ抗体をマウス中で検出した（１４日目に）。反応を第２回目の注射により、ブーストした。混合組成物に比べて、Ｆｅｌ ｄ１−ＣＭＶ ＶＬＰは、Ｆｅｌ ｄ１特異的ＩｇＧ抗体の誘導を大きく増加させた。これは、Ｆｅｌ ｄ１融合タンパク質のＶＬＰに対する化学的コンジュゲーションの免疫増強効果を示している（図１４）。
実施例１９
ヒトＩＬ−１βのＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−ＶＬＰへのカップリング
ヘテロ二機能性化学架橋剤スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）を使って、次の方法で、ヒトＩＬ−１β成熟タンパク質（配列番号６０）を、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ ＶＬＰに共有結合させた。
５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９．０）中に貯蔵されたＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒウイルス様粒子を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、３０％ショ糖および２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウムによる緩衝液交換を行った。ＣＭＶ−ＮｐａｄｒまたはＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの溶液を、室温で６０分間、７．５倍モル過剰のヘテロ二機能性架橋剤ＳＭＰＨと反応させた。ＰＤ１０カラムを用いて、未反応ＳＭＰＨを３０％のショ糖および２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウム中に取り除いた。
ＩＬ−１βタンパク質を５倍モル過剰のＴＣＥＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理した。誘導体化したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０およびＣＭＶ−Ｎｐａｄｒ−ＶＬＰを、１倍または２倍モル過剰のヒトＩＬ１βを用いて、２３℃で３時間処理した。クーマシーブルーで染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％ビス−トリスゲル）によりカップリング反応を解析した。化学的コンジュゲーション反応後、約４１．５ｋＤａおよび６６ｋＤａの質量のタンパク質バンドが明らかであった（データは示さず）。これらのバンドは、ＩＬ１βタンパク質（１７ｋＤａ）と共有結合したＣＭＶコートタンパク質（２４．５ｋＤａ）および１つのＩＬ１βタンパク質と共有結合した２つのＣＭＶコートタンパク質分子（４９ｋＤａ）に相当し、これらはそれぞれ、ＩＬ１β−ＣＭＶ ＶＬＰの形成を示している。
実施例２０
イヌＩＬ−５のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
イヌＩＬ−５（ｃＩＬ−５）（配列番号６１）は、Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２−３２００におけるマウスＩＬ−５に関する記載と同様にして発現した、遊離Ｃｙｓを含むように改変される。そのように改変されたｃＩＬ−５のＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングを以下のように行った。ｃＩＬ−５に結合させるために、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰが、最初に３０倍過剰のヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）で誘導体化される。非結合ＳＭＰＨがＰＢＳに対する透析により除去される。ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の等モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を使ってｃＩＬ−５を１時間還元した。還元したｃＩＬ−５（８０μＭ）を、４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と共に２２℃で４時間インキュベートした。反応物をＰＢＳ、ｐＨ８．０に対し１２時間透析した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０のＶＬＰに結合したｃＩＬ−５によるイヌの免疫化
４匹の雌異系交配イヌ群は、上述のように、ＳＭＰＨを介してｃＩＬ−５に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化される。５０μｇの組成物を、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で５００μｌに希釈し、０日目および１４日目に皮下に注射する。イヌから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、ｃＩＬ−５およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析する。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のｃＩＬ−５または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰでコーティングする。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートする。結合抗体が酵素標識抗イヌＩｇＧで検出される。対照として、同じイヌの免疫前血清を同様に試験する（データは示さず）。全イヌは、ｃＩＬ−５ならびにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に対し明確で強力なＩｇＧ応答示す。
実施例２１
イヌＩＬ−４のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
イヌＩＬ−４（ｃＩＬ−４）（配列番号６２）は、Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２−３２００におけるマウスＩＬ−５に関する記載と同様にして発現した、遊離Ｃｙｓを含むように改変される。そのように改変されたｃＩＬ−４のＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングが以下のように行われる。ｃＩＬ−４に結合させるために、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰが、最初に３０倍過剰のヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）で誘導体化される。非結合ＳＭＰＨがＰＢＳに対する透析により除去される。ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の等モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を使ってｃＩＬ−４を１時間還元した。還元したｃＩＬ−４（８０μＭ）を、４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と共に２２℃で４時間インキュベートした。反応物をＰＢＳ、ｐＨ８．０に対し１２時間透析した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０のＶＬＰに結合したｃＩＬ−４によるイヌの免疫化
４匹の雌異系交配イヌ群は、上述のように、ＳＭＰＨを介してｃＩＬ−４に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化される。５０μｇの組成物を、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で５００μｌに希釈し、０日目および１４日目に皮下に注射する。イヌから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、ｃＩＬ−４およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析する。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、１０μｇ／ｍｌの濃度のｃＩＬ−４または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰでコーティングされる。プレートをブロッキングした後、系列希釈イヌ血清と共にインキュベートされる。結合抗体が酵素標識抗イヌＩｇＧで検出される。対照として、同じイヌの免疫前血清を同様に試験する（データは示さず）。全イヌは、ｃＩＬ−４ならびにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に対し明確で強力なＩｇＧ応答示す。
実施例２２
イヌＩＬ−１３のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
イヌＩＬ−１３（ｃＩＬ−１３）（配列番号６３）は、Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２−３２００におけるマウスＩＬ−５に関する記載と同様にして発現した、遊離Ｃｙｓを含むように改変される。そのように改変されたｃＩＬ−１３のＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングを以下のように行った。ｃＩＬ−１３に結合させるために、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰが、最初に３０倍過剰のヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）で誘導体化される。非結合ＳＭＰＨがＰＢＳに対する透析により除去される。ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の等モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を使ってｃＩＬ−１３を１時間還元した。還元したｃＩＬ−１３（８０μＭ）を、４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と共に２２℃で４時間インキュベートした。反応物をＰＢＳ、ｐＨ８．０に対し１２時間透析した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０のＶＬＰに結合したｃＩＬ−１３によるイヌの免疫化
４匹の雌異系交配イヌ群が、上述のように、ＳＭＰＨを介してｃＩＬ−１３に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化される。５０μｇの組成物を、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で５００μｌに希釈し、０日目および１１３日目に皮下に注射する。イヌから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、ｃＩＬ−１３およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清を分析した。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のｃＩＬ−１３または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰでコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈イヌ血清と共にインキュベートされる。結合抗体が酵素標識抗イヌＩｇＧで検出される。対照として、同じイヌの免疫前血清を同様に試験する（データは示さず）。全イヌは、ｃＩＬ−１３ならびにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に対し明確で強力なＩｇＧ応答示す。
実施例２３
ヒトＩＬ−３１のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングおよび免疫反応の誘導
ヒトＩＬ−３１（ｈＩＬ−３１）（配列番号４３）は、Ｚｏｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２−３２００におけるマウスＩＬ−５に関する記載と同様にして発現した、遊離Ｃｙｓを含むように改変される。そのように改変されたｈＩＬ−３１のＶＬＰ ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０へのカップリングが以下のように行われる。ｈＩＬ−３１に結合させるために、ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰが、最初に３０倍過剰のヘテロ二機能性化学架橋剤、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）で誘導体化される。非結合ＳＭＰＨがＰＢＳに対する透析により除去される。ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中の等モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を使ってｈＩＬ−３１が１時間還元される。還元したｈＩＬ−３１（８０μＭ）が、４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０と共に２２℃で４時間インキュベートされる。反応物をＰＢＳ、ｐＨ８．０に対し１２時間透析した。
ＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０のＶＬＰに結合したｈＩＬ−３１によるマウスの免疫化
４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群が、上述のように、ＳＭＰＨを介してＩＬ−３１に結合したＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰで免疫化される。５０μｇの組成物を、２０ｍＭのヘペス、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中で５００μｌに希釈し、０日目および１１３日目に皮下に注射する。イヌから、０日目（免疫前）、１４日目、および２１日目に採血し、ｈＩＬ−３１およびＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０特異的ＥＬＩＳＡを使って、血清が分析される。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌの濃度のｈＩＬ−３１または２μｇ／ｍｌの濃度のＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰでコーティングした。プレートをブロッキングした後、系列希釈マウス血清と共にインキュベートする。結合抗体が酵素標識抗抗マウスＩｇＧで検出される。対照として、同じマウスの免疫前血清が同様に試験される（データは示さず）。全マウスは、ｈＩＬ−３１ならびにＣＭＶ−Ｎｔｔ８３０に対し明確で強力なＩｇＧ応答示す。

Claims (15)

  1. キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰは、少なくとも１種の改変ＣＭＶポリペプチドを含み、またはそれから本質的になり、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、
    （Ａ）ＣＭＶポリペプチド、
    ここで、前記ＣＭＶポリペプチドは、
    （ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；または
    （ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、変異を受けるアミノ酸配列が、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列と、前記ＣＭＶのコートタンパク質とが、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列を含む、
    および
    （Ｂ）ヘルパーＴ細胞エピトープ、
    ここで、前記ヘルパーＴ細胞エピトープが前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、かつ前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域が配列番号１のアミノ酸２〜１２位に対応する、
    を含む、ＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  2. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープが、ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープである；および／または
    前記ＣＭＶポリペプチドは、
    （ａ）配列番号１を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、
    （ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む（ｂ）のアミノ酸配列、または
    （ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む（ｂ）のアミノ酸配列、
    を含む、
    請求項１に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  3. 前記ＣＭＶポリペプチドが、
    （ａ）配列番号１を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、または
    （ｂ）少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有するアミノ酸配列
    を含み、
    この請求項の（ｂ）で定められた前記アミノ酸配列が配列番号２１を含む、
    請求項１または２に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  4. 置換される前記Ｎ末端領域のアミノ酸の数が、前記ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸の数以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  5. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープが最大で２０アミノ酸からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  6. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープがＰＡＤＲＥ配列である、
    前記ヘルパーＴ細胞エピトープが配列番号５のアミノ酸配列を含むＰＡＤＲＥ配列である、または
    前記ヘルパーＴ細胞エピトープが配列番号５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  7. 前記ヘルパーＴ細胞エピトープがヒトワクチン由来である、
    前記ヘルパーＴ細胞エピトープがヒトワクチン由来であり、かつ破傷風毒素由来である、
    前記ヘルパーＴ細胞エピトープが配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトワクチン由来である、または
    前記ヘルパーＴ細胞エピトープが配列番号４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  8. 前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、または
    前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載のＣＭＶ由来の改変ＶＬＰ。
  9. （ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変ウイルス様粒子であって、少なくとも１つの第１結合部位を含む改変ウイルス様粒子；および
    （ｂ）少なくとも１つの抗原であって、少なくとも１つの第２結合部位を含む抗原
    を含む組成物であって、
    （ａ）および（ｂ）が、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合される、
    （ａ）および（ｂ）が、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、ここで前記第１結合部位および前記第２結合部位が、少なくとも１つの共有結合性非ペプチド結合を介して結合される、または
    （ａ）および（ｂ）が、前記少なくとも１つの第１結合部位および前記少なくとも１つの第２結合部位を介して結合され、ここで前記第１結合部位および前記第２結合部位が、少なくとも１つの共有結合性非ペプチド結合を介して結合され、前記第１結合部位が、リジン残基のアミノ基であり、かつ前記第２結合部位が、システイン残基のスルフヒドリル基である、
    組成物。
  10. 前記抗原が、腫瘍抗原、自己抗原、病原体のポリペプチド、アレルゲンまたはハプテンである、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記抗原が、
    （ａ）ＩＬ−１７；
    （ｂ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む、ＩＬ−１７；
    （ｃ）ＩＬ−５；
    （ｄ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＩＬ−５；
    （ｅ）ＴＮＦα；
    （ｆ）ＩＬ−１α；
    （ｇ）ＩＬ−１３；
    （ｈ）配列番号４６のアミノ酸を含む、ＩＬ−１３；
    （ｉ）Ａβ−１−４２由来ペプチド；
    （ｊ）ＩｇＥまたはＩｇＥに含まれるペプチドもしくはドメイン；
    （ｋ）α−シヌクレイン、またはα−シヌクレイン由来ペプチド；
    （ｌ）６〜１４アミノ酸からなるα−シヌクレイン由来ペプチド；
    （ｍ）配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４のいずれか１つから選択される、α−シヌクレイン由来ペプチド；
    （ｎ）ＩＬ−４；
    （о）配列番号４５のアミノ酸を含むＩＬ−４；
    （ｐ）ＧｎＲＨ；
    （ｑ）エオタキシン；
    （ｒ）インフルエンザＡウイルスＭ２タンパク質の細胞外ドメイン、またはその抗原性フラグメント；
    （ｓ）ＩＬ−３１；
    （ｔ）配列番号４３または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＩＬ−３１；
    （ｕ）熱帯熱マラリア原虫もしくは三日熱マラリア原虫由来抗原、またはＲＳＶ由来抗原；
    （ｖ）ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ１または組換え型Ｆｅｌ ｄ１（ｒＦｅｌ ｄ１）；
    （ｗ）配列番号１７または配列番号１８を含む、抗原；
    （ｘ）イヌアレルゲンＣａｎ ｆ１またはＣａｎ ｆ２；
    （ｙ）カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）；および
    （ｚ）アミリン
    からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. （ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変ウイルス様粒子、または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物と；
    （ｂ）薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤および／または賦形剤と
    を含む、組成物。
  13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変ウイルス様粒子を含む、動物またはヒトの疾患、障害もしくは状態を治療するための医薬。
  14. 請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物を含む、動物またはヒトの疾患、障害もしくは状態を治療するための医薬。
  15. （Ａ）前記組成物は、前記抗原が（ａ）〜（ｈ）、（ｎ）、及び（о）から選択される請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトの炎症性疾患である；
    （Ｂ）前記組成物は、前記抗原が（ａ）〜（ｈ）、（ｎ）、及び（о）から選択される請求項１１に記載の組成物であり、前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトの炎症性疾患であり、かつ前記炎症性疾患が、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、喘息、クローン病、大腸炎、ＣＯＰＤ、糖尿病、神経皮膚炎（アレルギー性皮膚炎）から選択される；
    （Ｃ）前記組成物は、前記抗原が（ｉ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトのアルツハイマー病である；
    （Ｄ）前記組成物は、前記抗原が（ｊ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトのアレルギーである；
    （Ｅ）前記組成物は、前記抗原が（ｋ）、（ｌ）または（ｍ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトのパーキンソン病である；
    （Ｆ）前記組成物は、前記抗原が（ｐ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトのテストステロンレベル低下である；
    （Ｇ）前記組成物は、動物またはヒトのインフルエンザＡウイルス感染症を治療する、または予防するための、前記抗原が（ｒ）、（ｓ）、または（ｔ）である請求項１１に記載の組成物である；
    （Ｈ）前記組成物は、マラリアを予防する、または治療するための、前記抗原が（ｕ）である請求項１１に記載の組成物である；
    （Ｉ）前記組成物は、ＲＳＶ感染症を予防する、または治療するための、前記抗原が（ｕ）である請求項１１に記載の組成物である；
    （Ｊ）前記組成物は、ヒトのネコアレルギーを予防する、または治療するための、前記抗原が（ｖ）または（ｗ）である、請求項１１に記載の組成物である；
    （Ｋ）前記組成物は、ヒトのイヌアレルギーを予防する、または治療するための、前記抗原が（ｘ）である請求項１１に記載の組成物である；
    （Ｌ）前記組成物は、前記抗原が（ｙ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトの偏頭痛である；または
    （Ｍ）前記組成物は、前記抗原が（ｚ）である請求項１１に記載の組成物であり、かつ前記疾患、障害もしくは状態は、動物またはヒトのＩＩ型糖尿病である；
    請求項１４に記載の医薬。
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