JPWO2018162577A5 - - Google Patents
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本発明は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療のための組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物及び医薬組成物に関する。さらに、本発明は、掻痒、好ましくは、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー性皮膚炎などのアレルギー状態に関連する掻痒を予防又は治療する方法を提供する。
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掻痒状態及びアレルギー状態は、一般的に、馬に見られる（Ｓ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｑｕｉｎｅ ｖｅｔ．Ｅｄｕｃ．（２０１５）２７（３）１５６－１６６）。皮膚の掻痒媒介性の痒みは、例えば、臨床的に皮膚炎の表現型に現れ、アレルギー起源のものであり得る。アレルギー性皮膚炎の発症については、あまり理解されていない。関連する潜在的な要因は数多くある。潜在的な原因はアレルゲンであるが、抗ヒスタミン薬は、ほとんど影響を及ぼさず、掻痒及び皮膚炎を治癒せず、軽減もしない（Ｓ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｑｕｉｎｅ ｖｅｔ．Ｅｄｕｃ．（２０１５）２７（３）１５６－１６６）。根本的なアレルギーの原因は、木、草、花粉、カビ、菌類、塵ダニ、埃、鱗屑、飼料（ｆｅｅｄ（飼料（ｐｒｏｖｅｎｄｅｒ））ダニ、及び昆虫からだけでなく、食品中の成分からのアレルゲンなどの環境起源のものであり得る。さらに、遺伝的素因は、掻痒誘発性アレルギー性皮膚炎を支持すると考えられている（Ｙｕ ＆ Ｒｏｓｙｃｈｕｋ ２０１３，Ｅｑｕｉｎｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｌｉｎｃｉｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ：Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）。
掻痒状態及びアレルギー状態は、一般的に、馬に見られる（Ｓ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｑｕｉｎｅ ｖｅｔ．Ｅｄｕｃ．（２０１５）２７（３）１５６－１６６）。皮膚の掻痒媒介性の痒みは、例えば、臨床的に皮膚炎の表現型に現れ、アレルギー起源のものであり得る。アレルギー性皮膚炎の発症については、あまり理解されていない。関連する潜在的な要因は数多くある。潜在的な原因はアレルゲンであるが、抗ヒスタミン薬は、ほとんど影響を及ぼさず、掻痒及び皮膚炎を治癒せず、軽減もしない（Ｓ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｑｕｉｎｅ ｖｅｔ．Ｅｄｕｃ．（２０１５）２７（３）１５６－１６６）。根本的なアレルギーの原因は、木、草、花粉、カビ、菌類、塵ダニ、埃、鱗屑、飼料（ｆｅｅｄ（飼料（ｐｒｏｖｅｎｄｅｒ））ダニ、及び昆虫からだけでなく、食品中の成分からのアレルゲンなどの環境起源のものであり得る。さらに、遺伝的素因は、掻痒誘発性アレルギー性皮膚炎を支持すると考えられている（Ｙｕ ＆ Ｒｏｓｙｃｈｕｋ ２０１３，Ｅｑｕｉｎｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｌｉｎｃｉｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ：Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）。
アレルギー性皮膚炎と組み合わさった掻痒の特徴を示す馬において最もよく特徴付けられている疾患は、虫刺され過敏症（ＩＢＨ）と呼ばれ、「皮膚掻痒（ｓｗｅｅｔ ｉｔｃｈ：甘い痒み）」又は「夏湿疹」としても知られている。それは、ウマ科（equine）哺乳動物、特に馬の最も一般的なアレルギー性皮膚疾患であり、世界の様々な地域にみられるサシバエ属昆虫の咬傷によって引き起こされ、慢性的に再発する季節性アレルギー性皮膚炎として現れる。様々な研究により、ＩＢＨがサシバエからの唾液腺タンパク質に対するＩｇＥ媒介性反応に関連することが示唆された。ＩＢＨの臨床徴候は、吸血昆虫の咬傷に対する過敏性反応によって引き起こされる強烈な掻痒から生じる。この疾患は、最初に、多くの丘疹、房状毛髪、知覚過敏、及び皮膚感作によって特徴付けられ、その後に引っ掻き傷及び擦れが続く。この自己外傷は、局所的な脱毛及び二次感染の永続化に関わる掻破痕につながる。疾患が進行し、慢性化すると、線維症、表皮組織の肥大、並びに顕著な過角化及び苔癬化、皮膚の肥厚の可視化、鱗屑、横方向の隆線及びしわの形成につながり得る（Ｓｃｈａｆｆａｒｔｚｉｋ Ａ．ら，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１４７：１１３－１２６）。一般的に、他のアレルゲンによって引き起こされるアレルギーは、皮膚炎の同様の臨床徴候に現れる（Ｙｕ ＆ Ｒｏｓｙｃｈｕｋ ２０１３，Ｅｑｕｉｎｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｌｉｎｃｉｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ：Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）。
インターロイキン３１（ＩＬ－３１）は、活性化されたＴｈ２ ＣＤ４＋細胞によってだけでなく、肥満細胞及びマクロファージからも優先的に分泌される（Ｄｉｌｌｏｎら，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；５：７５２－６０）。Ｔｈ２細胞は、Ｉ型アレルギー反応に重要な役割を果たしているだけでなく、最近では、連結して、免疫細胞と痒みの感覚神経の間の神経免疫クロストーク中の「ミッシングリンク」を現す。ＩＬ－３１は、ｐｇ１３０／ＩＬ－６サイトカインファミリーに属し、ＩＬ－３１受容体Ａ（ＩＬ－３１ＲＡ）及びオンコスタチンＭ受容体ベータ（ＯＳＭＲβ）サブユニットで構成されるヘテロ二量体受容体複合体に結合する（Ｄｉｌｌｏｎら，２００４ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；５：７５２－６０；Ｂｉｌｓｂｏｒｏｕｇｈら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ １１７（２）；４１８－２５）。リガンド結合時に、ＩＬ－３１受容体複合体は、ヤヌスキナーゼシグナル伝達因子及び転写活性化因子（ＪＡＫ－ＳＴＡＴ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、並びにホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路（Ｚｈａｎｇら、２００８）を活性化する。ＩＬ－３１は、後根神経節（ＤＲＧ）の小型侵害受容ニューロンの小さなサブセットが発現するその受容体上に直接結合することができ、このサイトカインが、末梢神経における起痒性シグナルを直接活性化し得ることを示唆する（Ｍｉｚｕｎｏら、２００９；Ｓｏｎｋｏｌｙら、２００６）。さらに、該受容体は、ケラチノサイト、マクロファージ、及び好酸球などの様々な他の細胞上に見られる（Ｋａｓｒａｉｅら、２０１１；Ｋａｓｒａｉｅら、２０１０；Ｚｈａｎｇら、２００８）。
ＩＬ－３１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、皮膚への炎症細胞浸潤の増加を伴う重篤な掻痒、脱毛症、及び皮膚病変を発症した（Ｄｉｌｌｏｎら、２００４）。ＩＬ－３１の皮内注射は、マウス皮膚において痒み（引っ掻くこと）を誘導することが知られている（Ｚｈａｎｇら、２００８，Ｃｅｖｉｋｂａ ２０１３）。アトピー性皮膚炎（ＡＤ）を有する患者は、ＩＬ－３１を発現する皮膚ホーミングＣＤ４５ＲＯ＋記憶皮膚リンパ球関連抗原（ＣＬＡ）陽性Ｔ細胞を有し、Ｔｈ２細胞は、真皮においてほぼ独占的に見出された。Ｔｈ２細胞の約６０％はＩＬ－３１陽性である一方で、ＩＬ－３１ ｍＲＮＡは、ケラチノサイト、内皮細胞、及び線維芽細胞などの他の免疫細胞又は常駐皮膚細胞に見出されなかった。ＩＬ－３１のＴｈ２細胞以外の他の唯一の供給源は、成熟樹状細胞であるが、Ｔｈ２細胞と比較して著しく低いレベルで生成された（約１００倍）（Ｆｅｒｄａｃ Ｃｅｖｉｋｂａｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ ２０１３）。ＡＤ患者からの皮膚病変におけるＩＬ－３１ ｍＲＮＡのレベルは、健康な患者の病変よりもかなり高い（Ｓｏｎｋｏｌｙら，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１１７：４１１－７）。ＡＤヒト患者における痒みの治療用のヒトＩＬ－３１に対する抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｒｅｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は２０１２年に臨床試験に入り（ｗｗｗ．ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０１６１４７５６）、最近、イヌのＡＤの治療用モノクローナル抗イヌＩＬ－３１抗体が市場に参入した（Ｇｏｎｚａｌｅｓら，Ｖｅｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２０１３；２４：４８－ｅ１２；Ｍｉｃｈｅｌｓら，Ｖｅｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２０１６；２７：４７８－ｅ１２９）。
ＩＬ－３１誘発性掻痒は、マスト細胞又は好塩基球脱顆粒又はプロテイナーゼ活性化受容体－２（ＰＡＲ－２）媒介性の痒みとは無関係である。そのため、ＩＬ－３１媒介性掻痒は、Ｉ型メカニズムに直接関連していないように思われるが、ＩＬ－４及びＩＬ－１３ ｍＲＮＡ発現が、ヒト及びイヌのＡＤ病変におけるＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベルに相関しているので、Ｉ型アレルギー事象は、さらに掻痒を増加させることができる（Ｎｅｉら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１１８，９３０－９３７）。それに伴い、ＩＬ－３１がアレルギー性炎症を促進している可能性が示唆された（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００７；２８２：３０１４－２６；Ｗａｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７；１２２，５３２－５４１）。
ウマ科（equine）哺乳動物、特に、馬の掻痒又はアレルギーの状態及び掻痒及びアレルギーの障害に対処するための現在の治療法は、例えば、グルココルチコステロイド又は他の全身投与されるステロイドを含む。特に、長期治療におけるこれらのグルココルチコステロイドの毒性副作用などの不都合により、ウマ科（equine）哺乳動物、及び特に、馬における前記状態及び障害の代替治療選択肢の必要性がまだ満たされていない。
驚くべきことに、皮膚炎になった馬の皮膚病変の皮膚生検から、馬のＩＬ－３１ ｍＲＮＡが、掻痒を伴う皮膚炎を有する部位からの皮膚病変で発現しているが、健全な馬の皮膚試料には全く存在しなかったことが示されている。これが、典型的には前記病変に存在する好酸球以外に、馬ＩＬ－３１が馬の掻痒性皮膚病変で検出された最初であり、そのため、馬におけるアレルギー性掻痒の病理における馬ＩＬ－３１の主要な役割を示唆する最初である。また、驚くべきことに、コア粒子、好ましくはウイルス様粒子に連結されたウマ（equine）インターロイキン３１抗原を含む本発明の組成物の馬への投与は、自己抗体の強力な誘導をもたらすだけでなく、さらに、本発明の組成物は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防及び治療に有効であり、特に、掻痒及び掻痒関連皮膚炎の予防及び治療に有効であることが判明した。後者は、掻痒性アレルギー性皮膚炎になったアイスランド馬で行われたインビボ研究によって証明された。本発明の組成物の有効性は、驚くべきことに、木、草、花粉、塵ダニ、又は昆虫などからのアレルゲンである、前記掻痒又は掻痒関連皮膚炎を引き起こす可能性のあるアレルギー誘発因子とは無関係である。
そのため、複数のアレルゲンによって引き起こされる掻痒又は掻痒関連皮膚炎になった馬に、ＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－３１抗原を含む本発明の組成物をワクチン接種すると、本発明の組成物を用いる治療の前のシーズンに決定されたスコアと比較して、平均皮膚病変スコアが著しく減少するだけでなく、特に、平均掻痒スコアが非常に強力に減少した。本発明による好ましい組み合わせワクチン、すなわち、ＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－３１抗原を含む組成物とＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－５抗原を含む組成物を用いて、複数のアレルゲンによって引き起こされる掻痒又は掻痒関連皮膚炎になった馬を治療した場合に、同じ驚くべき結果が見出された。多くの馬は、典型的には単一アレルゲンに対してアレルギーがあるのではなく、むしろ複数のアレルゲンに対して反応するので（また、異なるアレルゲンの交差反応性にもよるので）、前記アレルギー状態又は障害によって引き起こされる一般的な掻痒表現型を効果的に消散するために、アレルゲンに依存しない療法が非常に望ましい。
したがって、第１の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原を含む組成物であって、前記少なくとも１つの抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、有効量の前記組成物が前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。
好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない。さらに好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原を含む組成物であって、前記少なくとも１つの抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、前記掻痒は、掻痒状態又はアレルギー状態と関連し、再び、さらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、有効量の前記組成物が、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である。別の好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、アトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
再びさらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含む組成物であって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物は、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；必要に応じて、前記第１又は前記第２の組成物がさらにアジュバントを含む、組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、医薬品として使用するための、前記本発明の組成物を提供する。
再びさらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含むキットであって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物が、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；必要に応じて、前記第１又は前記第２の組成物がさらにアジュバントを含む、キットを提供する。さらなる態様において、本発明は、医薬品として使用するための、前記本発明のキットを提供する。
再びさらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含む組成物であって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物が、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、有効量の前記組成物が前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、及び再発性蕁麻疹から選択され、さらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択される。
再びさらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含む組成物であって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物が、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、前記掻痒は、掻痒状態又はアレルギー状態と関連し、再びさらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）及び再発性蕁麻疹から選択され、さらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、有効量の前記組成物が、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
再びさらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含むキットであって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物が、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、キットを提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、前記掻痒は、掻痒状態又はアレルギー状態と関連し、再びさらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）及び再発性蕁麻疹から選択され、さらに好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択され、好ましくは、有効量の前記組成物が、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
本発明のキットは、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬への前記第１の組成物及び前記第２の組成物の別々の投与を可能にし、好ましくは、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の前記別々の投与は、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の異なる時点での投与であり、すなわち、同時ではなく順次行われ；かつ／又は前記第１の組成物及び前記第２の組成物の前記別々の投与は、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬の異なるリンパ節などの異なる位置での、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の投与であり、かつ／又は前記第１の組成物及び前記第２の組成物の前記別々の投与は、異なる量、典型的には、異なる有効量の前記第１の組成物及び前記第２の組成物での、前記第１の組成物及び前記第２の組成物の投与である。そのため、典型的には、かつ好ましくは、前記本発明のキットは、本発明に従って併用治療のために使用される。
さらなる態様において、本発明は、前記第１の組成物及び前記第２の組成物、並びに医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、前記第１の組成物及び前記第２の組成物、並びに医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、前記掻痒は、掻痒状態又はアレルギー状態と関連している。
さらなる態様において、本発明は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療の方法であって、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬に、本発明の組成物又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療の方法であって、好ましくは、前記掻痒は、掻痒状態又はアレルギー状態と関連し、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬に、本発明の組成物又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物又は前記本発明の医薬組成物の使用を提供し、典型的には、かつ好ましくは、有効量の前記本発明の組成物又は前記本発明の医薬組成物が、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬に投与される。
別の態様において、本発明は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒の予防又は治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物又は前記本発明の医薬組成物の使用を提供し、好ましくは、前記掻痒は掻痒状態又はアレルギー状態と関連し、典型的には、かつ好ましくは、有効量の前記本発明の組成物又は前記本発明の医薬組成物が、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬に投与される。
本発明のさらなる態様及び実施形態は、この記述が続くに連れて、明らかになる。
発明の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、非複製性若しくは非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに似た非複製性若しくは非感染性、好ましくは、非複製性かつ非感染性の構造体を指す。本明細書で使用する用語「非複製性」は、ＶＬＰが含むゲノムを複製することができないことを指す。本明細書で使用する用語「非感染性」は、宿主細胞に入ることができないことを指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノム若しくはゲノム機能の全部又は一部を欠いているので、非複製性かつ非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含有し得る。組換え産生したウイルス様粒子は、典型的には、宿主細胞由来のＲＮＡを含有する。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドで構成されるウイルスキャプシドである。ウイルス様粒子は、典型的には、ウイルス様粒子あたり６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、又は３６０超のタンパク質サブユニットを含む、典型的には、ウイルスコートタンパク質で構成される巨大分子集合体である。典型的には、かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、固有の反復組織を有するウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造の形成をもたらす。ウイルス様粒子の１つの特徴は、そのサブユニットのその非常に規則正しい反復配置である。
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用する用語「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体若しくは断片を含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又はそれからなるウイルス様粒子を指す。加えて、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの構造に似ており、非複製性かつ／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも１つの遺伝子又は複数の遺伝子を欠き、典型的には、宿主へのウイルスの付着若しくは侵入に関与するタンパク質又は複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。また、含まれるのは、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子であり、その中の前述の遺伝子又は複数の遺伝子は依然として存在するが、不活性であり、したがって、また、ＲＮＡバクテリオファージの非複製性かつ／又は非感染性ウイルス様粒子をもたらす。ＲＮＡバクテリオファージに由来する好ましいＶＬＰは、正二十面体対称性を示し、１８０個のサブユニット（単量体）からなる。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を非複製性かつ／又は非感染性にさせるための好ましい方法は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理、典型的には、かつ好ましくは、遺伝子操作などによる物理的、化学的不活性化によるものである。
ＣＭＶのウイルス様粒子：用語「ＣＭＶのウイルス様粒子」又はＣＭＶ ＶＬＰは、少なくとも１つのＣＭＶポリペプチドを含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又は好ましくはそれからなるウイルス様粒子を指す。好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、主として、さらにより好ましくは、キャプシド構造の唯一のタンパク質成分として、前記ＣＭＶポリペプチドを含む。典型的には、かつ好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、ＣＭＶのキャプシドの構造に似ている。ＣＭＶのウイルス様粒子は、非複製性かつ／又は非感染性であり、ＣＭＶの複製機構をコードする少なくとも１つの遺伝子又は複数の遺伝子を欠き、典型的には、宿主へのウイルスの付着若しくは侵入に関与するタンパク質又は複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。この定義には、前述の遺伝子又は複数の遺伝子は依然として存在するが不活性であるウイルス様粒子も含まれる。ＣＭＶのウイルス様粒子を非複製性かつ／又は非感染性にさせるための好ましい方法は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理的又は化学的な不活性化によるものである。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、ＣＭＶの複製機構をコードする遺伝子又は複数の遺伝子を欠き、かつ宿主へのウイルスの付着若しくは侵入に関与するタンパク質又は複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。再び、より好ましくは、非複製性かつ／又は非感染性ウイルス様粒子は、遺伝子組換え技術により得られる。本発明によるＣＭＶの組換え生成されるウイルス様粒子は、典型的には、かつ好ましくは、ウイルスゲノムを含まない。モザイクＶＬＰと呼ばれる場合が多い２種以上のポリペプチドを含むウイルス様粒子も本発明に包含される。そのため、一実施形態において、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも２種の異なるポリペプチドを含み、前記ポリペプチド種の少なくとも１種はＣＭＶポリペプチドである。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、典型的には、ＶＬＰあたり１８０個のコートタンパク質サブユニットを含むＣＭＶコートタンパク質で構成される巨大分子の集合体である。典型的には、かつ好ましくは、本明細書で使用するＣＭＶのＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなる少なくとも１種のＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、及び再びより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す。
抗原：本明細書で使用する用語「抗原」は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合することが可能な分子を指す。本明細書で使用する用語「抗原」はまた、Ｔ細胞エピトープを指す。さらに、抗原は、免疫系が認識することができ、かつ／又はＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答並びに／又は細胞性免疫応答を誘導することが可能である。しかしながら、これは、少なくともいくつかの場合において、該抗原は、Ｔｈ細胞エピトープを含有するか、又はＴｈ細胞エピトープに連結され、かつ／又はアジュバントで与えられることが必要とされ得る。抗原は、１以上のエピトープ（Ｂエピトープ及びＴエピトープ）を有することができる。上記で言及する特異的反応は、抗原が、好ましくは、典型的には高度に選択的な方法でその対応する抗体又はＴＣＲと反応するが、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意味する。特に示されない場合、本明細書で使用する用語「抗原」は、本発明の組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物及び／又は医薬組成物に含有されるコア粒子又はウイルス様粒子を指すものではない。
コートタンパク質：用語「コートタンパク質」は、ウイルスキャプシド若しくはＶＬＰに組み込めるウイルスタンパク質、好ましくは、ウイルス、好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージ又は植物ウイルスの天然キャプシドのサブユニットを指す。コートタンパク質という用語は、天然のコートタンパク質、並びに組換え発現コートタンパク質を包含する。さらに包含されるのは、コートタンパク質の変異体及び断片であり、前記変異体及び断片はＶＬＰを形成する能力を保持する。
ポリペプチド：本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（アミド結合としても知られる）によって直鎖状に連結されているアミノ酸単量体で構成されるポリマーを指す。ポリペプチドという用語は、アミノ酸の連続鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。そのため、ペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド」は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくは、それからなるポリペプチドを指し、変異されるアミノ酸配列はＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列、すなわち、前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す。典型的には、かつ好ましくは、ＣＭＶポリペプチドは、自己アセンブリによって発現時にＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）」は、天然に存在するキュウリモザイクウイルスのコートタンパク質を指す。キュウリモザイクウイルスの非常に広い宿主範囲により、ＣＭＶの多くの異なる株及び分離株が知られており、前記株及び分離株のコートタンパク質の配列が決定され、そのため、当業者にも知られている。ＣＭＶの前記コートタンパク質（ＣＰ）の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ、又はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの公知のデータベースに記載されており、そこから検索可能である。例は、ＥＰ出願番号１４１８９８９７．３に記載されている。ＣＭＶコートタンパク質のさらなる例を、配列番号１５～１７に提供する。これらの株及び分離株がコートタンパク質のＮ末端を含む異なるタンパク質ドメインに非常に類似したコートタンパク質配列を有することは、注目に値する。特に、全て完全に配列決定されたＣＭＶ分離株の９８．１％が、それらのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸内に８５％超の配列同一性を共有しており、全て完全に配列決定されたＣＭＶ分離株のなお７９．５％が、それらのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸内に９０％超の配列同一性を共有している。
典型的には、かつ好ましくは、本発明に使用されるＣＭＶのコートタンパク質は、自己アセンブリによって発現時に、ＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、本発明に使用されるＣＭＶのコートタンパク質は、大腸菌内で自己アセンブリによって発現時に、ＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又は好ましくはそれからなるように改変されたものであるＣＭＶのＶＬＰを指し、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶポリペプチド、及びＴヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなる。典型的には、かつ好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端に融合されるか、（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端に融合されるか、（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続アミノ酸の領域と置換され、前記ＣＭＶポリペプチドの連続アミノ酸の前記置換された領域とＴヘルパー細胞エピトープの間の配列同一性が、少なくとも１５％、好ましくは、少なくとも２０％であるか、又は（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換され、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は５～１５個の連続アミノ酸からなる。好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換され、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５～１５個の連続アミノ酸、好ましくは９～１４個の連続アミノ酸、より好ましくは、１１～１３個の連続アミノ酸、最も好ましくは、１１、１２又は１３個の連続アミノ酸からなる。好ましくは、本発明のＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、ＣＭＶの組換え改変ＶＬＰである。
改変ＣＭＶポリペプチド：本明細書で使用する用語「改変ＣＭＶポリペプチド」は、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶポリペプチド、及びＴヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなると本明細書で定義されるように改変されたＣＭＶポリペプチドを指す。典型的には、改変ＣＭＶポリペプチドは、自己アセンブリによって発現時に、ＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、改変ＣＭＶポリペプチドは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドであり、大腸菌において自己アセンブリによって発現時に、ＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域：本明細書で使用する用語「ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域」は、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端、特に、ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端、又は前記ＣＭＶポリペプチド若しくは前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の領域のいずれかを指すが、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合は、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端の第２のアミノ酸から始まる。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基を含む場合は、実用的な観点から、開始コドンをコードするメチオニンは、通常除去され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１個、２個又は３個の追加のアミノ酸、好ましくは、１個のアミノ酸は、必要に応じて、クローニング目的のために、出発メチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入され得る。本明細書で使用する用語「ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶコートタンパク質の変異アミノ酸配列のＮ末端領域」は、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端、又は前記ＣＭＶポリペプチド又は前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端領域のいずれかを指すが、前記変異アミノ酸配列がＮ末端メチオニン残基を含む場合は、前記ＣＭＶポリペプチド若しくは前記ＣＭＶのコートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の第２のアミノ酸から始まる。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合には、実用的な観点から、開始コドンをコードするメチオニンは、通常、除去され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１個、２個又は３個の追加のアミノ酸、好ましくは、１個のアミノ酸は、必要に応じて、クローニング目的のために、出発メチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入され得る。
組換えポリペプチド：本発明の文脈において、用語「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスにより得られるポリペプチドを指す。典型的には、かつ好ましくは、組換えポリペプチドは、原核生物発現系で生成される。大腸菌などの原核生物発現系で発現される組換え生成ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含み得ることは、当業者には明らかである。Ｎ末端メチオニン残基は、典型的には、組換えポリペプチドの成熟中に、発現宿主において組換えポリペプチドから切断される。しかしながら、Ｎ末端メチオニンの切断は不完全であり得る。そのため、組換えポリペプチドの調製物は、他の点では同一であるが、Ｎ末端メチオニン残基を含むポリペプチドと含まないポリペプチドの混合物を含み得る。典型的には、かつ好ましくは、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満の組換えポリペプチドを含む。
組換えＣＭＶポリペプチド：用語「組換えＣＭＶポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスによって得られる、上記で定義したＣＭＶポリペプチドを指す。典型的には、かつ好ましくは、組換えＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する、１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満の組換えＣＭＶポリペプチドを含む。結果として、本発明の組換えウイルス様粒子は、他の点では同一であるが、Ｎ末端メチオニン残基を含む組換えポリペプチド及び含まない組換えポリペプチドを含み得る。
組換え改変ＣＭＶポリペプチド：用語「組換え改変ＣＭＶポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスによって得られる、上記で定義した改変ＣＭＶポリペプチドを指す。典型的には、かつ好ましくは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する、１０％未満、より好ましくは、５％未満、さらにより好ましくは、１％未満の組換え改変ＣＭＶポリペプチドを含む。結果として、本発明の組換えウイルス様粒子は、他の点では同一であるが、Ｎ末端メチオニン残基を含む組換えポリペプチド及び含まない組換えポリペプチドを含み得る。
組換えウイルス様粒子：本発明の文脈において、用語「組換えウイルス様粒子」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１つの工程を含むプロセスによって得られるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。典型的には、かつ好ましくは、組換えＶＬＰは、宿主内で、好ましくは、細菌細胞内で組換えウイルスコートタンパク質の発現により得られる。典型的には、かつ好ましくは、組換えウイルス様粒子は、少なくとも１つの組換えポリペプチド、好ましくは、組換えＣＭＶポリペプチド又は組換え改変ＣＭＶポリペプチドを含む。最も好ましくは、組換えウイルス様粒子は、組換えＣＭＶポリペプチド又は組換え改変ＣＭＶポリペプチドで構成されるか、又はそれからなる。その結果、本発明の文脈において、本発明の組換えＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列を参照して行われる場合には、これらの本発明の組換えＶＬＰの範囲は、前記Ｎ末端メチオニン残基を含まない前記特定のアミノ酸配列によって形成されるＶＬＰを包含するが、同様に、本明細書に示されるように、典型的には少量ではあるが、該ＶＬＰは、前記Ｎ末端メチオニンを有する前記特定のアミノ酸配列によって形成される。さらに、本発明の組換えＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列を参照して行われる場合、依然として、前記Ｎ末端メチオニン残基を含むアミノ酸配列及びＮ末端メチオニン残基を欠くアミノ酸配列の両方を含むＶＬＰが包含されることは本発明の範囲内である。
変異アミノ酸配列：用語「変異アミノ酸配列」は、変異されるアミノ酸配列に定義された変異のセットを導入することによって得られるアミノ酸配列を指す。本発明の文脈において、前記変異されるアミノ酸配列は、典型的には、かつ好ましくは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である。そのため、変異アミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸残基がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列とは異なり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９０％の配列同一性を示す。典型的には、かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を示す。好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異される配列は、最大で１１、１０、９、８、７、６、４、３、２、又は１個のアミノ酸残基が異なり、さらに好ましくは、前記違いは、挿入、欠失及びアミノ酸交換から選択される。好ましくは、該変異アミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と異なり、好ましくは、前記違いはアミノ酸交換である。
…残基に対応する位置：別のアミノ酸配列の所定の残基に相当するアミノ酸配列上の位置は、配列アライメントによって、典型的には、かつ好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いることによって、最も好ましくは、標準的な設定を用いて同定することができる。典型的かつ好ましい標準設定は、期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲で最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；組成の調整：条件付きの組成スコアマトリックス調整である。
配列同一性：２つの所定のアミノ酸配列の配列同一性は、両方の配列のアライメントに基づいて決定される。配列同一性の決定のためのアルゴリズムは、当業者に利用可能である。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）又は「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）などの公に利用可能なコンピューター相同性プログラムを使用して、かつ本明細書では、好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉのＮＣＢＩのホームページ上で提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムにより、そこに提供されるデフォルト設定を用いて決定される。典型的かつ好ましい標準設定は、期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリの範囲の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；組成の調整：条件付きの組成スコアマトリックス調整である。
アミノ酸交換：アミノ酸交換という用語は、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による、好ましくは、別のタンパク質原性アミノ酸残基による、アミノ酸配列中の所定のアミノ酸残基の交換を指す。そのため、アミノ酸の挿入又は欠失とは対照的に、該アミノ酸交換は、前記アミノ酸配列のアミノ酸の総数を変えない。本発明の文脈において非常に好ましいのは、リジン残基による、又はシステイン残基による前記変異されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の交換である。
エピトープ：エピトープという用語は、抗原、好ましくは、ポリペプチドの連続部分又は不連続部分を指し、前記部分は、抗体によって、又はＭＨＣ分子の文脈内ではＴ細胞受容体によって特異的に結合させることができる。抗体に関して、特異的結合は、非特異的結合を排除するが、必ずしも交差反応性を排除するものではない。エピトープは、典型的には、抗原部位に固有の空間的立体構造中に５～２０個のアミノ酸を含む。
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ：本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ」は、ヘルパーＴｈ細胞が認識できるエピトープを指す。別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープである。
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ：本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、少なくとも１つ、好ましくは、２以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＴｈ細胞エピトープを指す。ペプチド配列が、ユニバーサルＴｈ細胞エピトープであるかどうかを判断する最も簡単な方法は、個々のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力を測定することである。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への、公知のＴｈ細胞エピトープペプチドの結合と競合するペプチドの能力によって測定され得る。ＨＬＡ－ＤＲ分子の代表的な選択は、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１に記載されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子のＴｈ細胞エピトープの親和性は、少なくとも１０－５Ｍでなければならない。Ｔｈ細胞エピトープの「普遍性」を決定するために、より面倒であるがより適切な代替の方法は、より大きな人々の集団（３０％超）が、ＩＦＡに製剤化されたＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質での免疫時及び１ヶ月後の追加免疫時に、測定可能なＴ細胞応答をもたらすことを実証することである。異なる個体中に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の代表的なコレクションは、Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２に与えられている。結果として、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２に記載されているように、好ましくは、（ＩＦＡに製剤化されたＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質での）免疫時及び（１ヶ月後の）追加免疫時に、選択された個体のグループの３０％超において、測定可能なＴ細胞応答をもたらすＴｈ細胞エピトープを指す。また、再びさらに好ましくは、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、好ましくは、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ３、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲ５２ａ、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される；並びに好ましくは、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、さらにより好ましくは、少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に、少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することができるＴｈ細胞エピトープを指し（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１及び本明細書で引用される参考文献に記載されるように）、前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０によって記載されているものである。さらに再びより好ましい方法で、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、さらにより好ましくは、少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に、少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することができるＴｈ細胞エピトープを指し（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１及び本明細書で引用される参考文献に記載されるように）、前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａ，ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０によって記載されているものである。
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ，ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１，Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐ，ら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２，Ｃａｌｖｏ－Ｃａｌｌｅ ＪＭ，ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５９：１３６２－１３７３，及びＶａｌｍｏｒｉ Ｄ，ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７－７２１などによって記載されており、当業者に公知である。
アジュバント：本明細書で使用する用語「アジュバント」は、宿主内でデポーの発生を可能にし、本発明のワクチン及び医薬組成物とそれぞれ組み合わせた場合に、さらにより増強した免疫応答を提供し得る免疫応答の非特異的刺激因子又は物質を指す。好ましいアジュバントは、完全及び不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは、水酸化アルミニウム、及び改変ムラミルジペプチドである。さらに好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのヒトアジュバントである。そのようなアジュバントも当技術分野で周知である。本発明の組成物と共に投与することができるさらなるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫改変物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ－２１、ＱＳ－１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ－５９、ＯＭ－ １７４、ＯＭ－ １９７、ＯＭ－２９４、及びビロソームアジュバント技術が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含み得る。ウイルス様粒子は、一般的に、アジュバントとして記載されている。しかしながら、本出願の文脈内で使用される用語「アジュバント」は、本発明のウイルス様粒子ではないアジュバントを指す。むしろ、「アジュバント」は、本発明の組成物、ワクチン又は医薬組成物の追加の明確に異なる成分に関する。
用語「アレルギー状態」は、免疫系と身体にとって外来の物質の間の相互作用によって引き起こされる障害又は疾患として本明細書で定義される。この異物は、「アレルゲン」と呼ばれる。一般的なアレルゲンには、花粉、埃、カビ、塵ダニタンパク質などの空気アレルゲン、虫刺されからの注入唾液などが含まれる。アレルギー状態の例には、以下のもの：アレルギー性皮膚炎、夏湿疹、再発性蕁麻疹、掻痒、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）などの自己免疫から生じる炎症プロセスが含まれるが、これらに限定されない。
用語「掻痒状態」は、緩和を得るために、皮膚を擦る又は傷つける衝動をもたらす激しい痒みの感覚によって特徴付けられる疾患又は障害として本明細書で定義される。掻痒状態の例としては、以下のもの：アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹が含まれるが、これらに限定されない。
有効量：本明細書で使用する用語「有効量」は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬に投与した場合に、有益な又は所望の結果を達成するのに十分な活性成分、典型的には、かつ好ましくは、本発明による組成物の量を指す。有効量は、１以上の投与、適用又は投薬で投与することができる。該組成物、或いは該医薬組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は当業者によって日常的な問題として決定することができる。好ましくは、本明細書で使用する用語「有効量」は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療に関連する１以上のパラメータに客観的に測定される変化を生じさせる量を指す。再びさらに好ましくは、掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療に関連する前記１以上のパラメータは、皮膚病変のレベル若しくは重症度グレード又は掻痒のレベルである。再びさらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、症状病変スコアリング試験によって決定され、前記掻痒のレベルの前記低下は、掻痒スコアリング試験によって決定される。有効量は、特定のウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬、及び治療される状態、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の体重及び年齢、疾患状態の重症度、選択された特定の組成物、従うべき投与計画、投与のタイミング、並びに投与様式などに応じて変えることができ、それらの全ては、過度の実験を必要とすることなく、当業者によって容易に決定することができる。
併用治療：本明細書で使用する用語「併用治療」又は本明細書において互換的に使用される「併用ワクチン接種」は、少なくとも２つ、典型的には、かつ好ましくは、正確には２つの異なる本発明の組成物が使用される本発明による治療を指し、前記異なる本発明の組成物は、別々の実体として適用され、１つの組み合わされた、典型的には、かつ好ましくは、前記少なくとも２つの異なる本発明の組成物を含む医薬組成物として適用されない。しかしながら、前記少なくとも２つ、典型的には、かつ好ましくは、正確には２つの異なる本発明の組成物の別々の実体としての使用は、同じ時間及び／又は同じ場所、典型的には、かつ好ましくは、同じ投与部位及び注射部位での、前記少なくとも２つ、典型的には、かつ好ましくは、正確には２つの異なる本発明の組成物の適用、典型的には、かつ好ましくは、投与を排除するものではない。
組み合わせ治療：本明細書で使用する用語「組み合わせ治療」又は本明細書において互換的に使用される「組み合わせワクチン接種」は、少なくとも２つ、典型的には、かつ好ましくは、正確には２つの異なる本発明の組成物が使用される本発明による治療を指し、前記異なる本発明の組成物は、１つの実体として適用され、典型的には、かつ好ましくは、本発明による前記少なくとも２つの異なる本発明の組成物を含む１つの医薬組成物の中に及び１つの医薬組成物として含まれ、組み合わされている。
治療：本明細書で使用する用語「処置」、「処置する」、「処置される」又は「処置すること」は、予防及び／又は治療を指す。一実施形態において、用語「処置」、「処置する」、「処置される」又は「処置すること」は、治療的処置を指す。別の実施形態において、用語「処置」、「処置する」、「処置される」又は「処置すること」は、予防的処置を指す。典型的には、かつ好ましくは、治療を必要とするウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬には、既に障害を有するもの、並びに障害が予防される予定のものが含まれる。そのため、好ましくは、本発明による疾患、状態又は障害の用語「処置」、「処置する」、「処置される」又は「処置すること」は、疾患、状態若しくは障害に対して予防又は保護すること（すなわち、症状を発症しないようにさせること）；疾患、状態又は障害を阻害すること（すなわち、症状の発症を阻止又は抑制すること）；並びに／又は疾患、状態又は障害を軽減すること（すなわち、症状の退行を引き起こすこと）を含む。理解されるように、最終的な誘導事象又は複数の事象は未知であるか、又は潜在的であり得るので、疾患、状態又は障害を「予防すること」と「抑制すること」を区別することは必ずしも可能ではない。したがって、用語「予防」は、「予防」と「抑制」の両方を包含する「処置」の種類を構成することが理解される。そのため、用語「治療」は、「予防」を含む。
本明細書で使用する用語「予防」は、疾患若しくは状態の発症並びに／又は疾患若しくは状態に起因する症状を予防又は遅延させる手段を指す。
付着部位、第１：本明細書で使用する語句「第１の付着部位」は、ウイルス様粒子と共に天然に存在するか、又はウイルス様粒子に人工的に付加され、第２の付着部位が連結され得る要素を指す。第１の付着部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成のポリマー、二次代謝生成物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、又はそれらの組み合わせなどの化学反応基である。第１の付着部位である化学反応基の好ましい実施形態は、アミノ酸残基、好ましくは、リジン残基のアミノ基である。第１の付着部位は、典型的には、表面上、好ましくは、ＶＬＰの外表面上に配置されている。複数の第１の付着部位は、表面上、好ましくは、ＶＬＰの外表面上に、典型的には反復形状で存在する。好ましい実施形態において、第１の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは、少なくとも１つのペプチド結合を介してＶＬＰと結合している。さらに好ましい実施形態において、第１の付着部位は、ＶＬＰと共に天然に存在する。或いは、好ましい実施形態において、第１の付着部位は、人工的にＶＬＰに付加される。非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位は、前記ＶＬＰポリペプチドのアミノ酸配列のリジン残基のアミノ基である。
付着部位、第２：本明細書で使用する語句「第２の付着部位」は、抗原と共に天然に存在するか、又は抗原に人工的に付加され、第１の付着部位が連結され得る要素を指す。抗原の第２の付着部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成のポリマー、二次代謝生成物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、又はそれらの組み合わせなどの化学反応基である。第２の付着部位である化学反応基の好ましい実施形態は、スルフヒドリル基、好ましくは、アミノ酸のシステインのスルフヒドリル基、最も好ましくは、システイン残基のスルフヒドリル基である。用語「少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原」は、したがって、抗原及び少なくとも１つの第２の付着部位を含む構築物を指す。しかしながら、特に、抗原内に天然に存在しない第２の付着部位について、そのような構築物は、典型的には、かつ好ましくは、さらに「リンカー」を含む。別の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは、少なくとも１つのペプチド結合を介して抗原と結合している。さらなる実施形態において、第２の付着部位は、抗原内に天然に存在する。別のさらに好ましい実施形態において、第２の付着部位は、リンカーを介して抗原に人工的に付加され、前記リンカーは、システインを含むか、或いは、それからなる。好ましくは、該リンカーは、ペプチド結合によって抗原に融合される。
連結される：本明細書で使用する用語「連結される」又は「連結」は、少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも１つの第２の付着部位が互いに結合する全ての可能な方法、好ましくは、化学的相互作用を指す。化学的相互作用には、共有結合相互作用及び非共有結合相互作用が含まれる。非共有結合相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるが、共有結合相互作用は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、炭素－リン結合、チオエーテルなどの炭素－硫黄結合、又はイミド結合などの共有結合に基づく。特定の好ましい実施形態において、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは、少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、さらにより好ましくは、排他的に非ペプチド結合（複数可）を介して連結される。しかしながら、本明細書で使用する用語「連結される」は、少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも１つの第２の付着部位の直接連結だけでなく、代替的に、かつ好ましくは、少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも１つの第２の付着部位の中間体分子（複数可）を介する、かつ本明細書では、典型的には、かつ好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは、１つのヘテロ二官能性クロスリンカーを使用することによる間接的な結合を指す。他の好ましい実施形態において、第１の付着部位及び第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは、少なくとも１つのペプチド結合を介して、さらにより好ましくは、排他的にペプチド結合（複数可）を介して連結される。
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、抗原と第２の付着部位を結合させるか、又は既に第２の付着部位を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるかのいずれかである。好ましくは、本明細書で使用する「リンカー」は、典型的には、かつ好ましくは、しかし、必ずしも必要ではないが、１個のアミノ酸残基として、好ましくは、システイン残基として、既に第２の付着部位を含む。好ましいリンカーは、アミノ酸リンカー、すなわち、少なくとも１個のアミノ酸残基を含有するリンカーである。アミノ酸リンカーという用語は、そのようなリンカーが排他的にアミノ酸残基からなることを意味するものではない。しかしながら、排他的にアミノ酸残基からなるリンカーは、本発明の好ましい実施形態である。該リンカーのアミノ酸残基は、当技術分野で公知の天然アミノ酸又は非天然アミノ酸、全てのＬ又は全てのＤ又はそれらの混合物であるか、好ましくは、それらで構成されている。本発明によるリンカーのさらなる好ましい実施形態は、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む分子であり、したがって、そのような分子も本発明に包含される。抗原とリンカーの結合は、好ましくは、少なくとも１つの共有結合によるもの、より好ましくは、少なくとも１つのペプチド結合によるものである。
ウマ科（equine）哺乳動物：本明細書で使用する「ウマ科（equine）哺乳動物」は、馬、ポニー、ロバ（ａｓｓ）（ロバ（ｄｏｎｋｅｙ））、及びゼブラを含む馬科に含まれる哺乳動物である。好ましくは、本明細書で使用する用語「ウマ科（equine）哺乳動物」は、馬、ポニー、ロバ（ａｓｓ）（ロバ（ｄｏｎｋｅｙ））、及びゼブラを指す。再びより好ましくは、本明細書で使用する用語「ウマ科（equine）哺乳動物」は、馬を指す。
本発明のいくつかの態様が、本明細書に開示され；さらに本明細書でそれぞれ言及される実施形態及び好ましい実施形態は、明示的に言及されなくても、本明細書に開示される本発明の各々及び任意の態様に適用可能である。
発明者らは、驚くべきことに、皮膚炎になった馬の皮膚病変からの皮膚生検において、馬ＩＬ－３１ ｍＲＮＡが、掻痒を伴う皮膚炎を有する部位からの皮膚病変で発現しているのに対し、健全な馬の皮膚試料には全く存在していないことを今回発見した。そのため、強力な自己抗体価を誘導する本発明の組成物は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防及び治療に有効であり、特に、掻痒及び掻痒関連皮膚炎の予防及び治療に有効である。本発明の組成物の有効性は、木、草、花粉、カビ、菌類、塵ダニ、埃、鱗屑、飼料（飼料）ダニ、昆虫又は食品中の成分からのアレルゲンである可能性のあるアレルギー誘発因子とは無関係である。
そのため、複数のアレルゲンによって引き起こされる掻痒又は掻痒関連皮膚炎になった馬に、ＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－３１抗原を含む本発明の組成物をワクチン接種すると、本発明の組成物を用いた治療の前のシーズンに決定された前記スコアと比較して、平均皮膚病変スコアが著しく減少しただけでなく、特に、平均掻痒スコアが非常に強力に減少した。同じ驚くべき結果が、本発明による組み合わせワクチン、すなわち、ＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－３１抗原を含む組成物及びＣＭＶ－ＶＬＰに連結されたｅＩＬ－５抗原を含む組成物を用いて、複数のアレルゲンによって引き起こされる掻痒又は掻痒関連皮膚炎になった馬を治療した場合に見出されている。
そのため、第１の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原を含む組成物であって、前記少なくとも１つの抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物を提供し；ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療の方法における使用のために、好ましくは、有効量の前記組成物が前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒又はアトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒は、アトピー性皮膚炎と関連する掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない。さらに好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
さらなる態様において、本発明は、第１の組成物及び第２の組成物を含む組成物であって、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され；前記第２の組成物は、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結され、必要に応じて、さらにアジュバントを含む、組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、医薬品として使用するための、前記本発明の組成物を提供する。
本発明は、そのため、アレルギー誘発因子とは無関係の全ての掻痒状態又は全てのアレルギー状態に使用するための本発明の組成物を提供する。また、該組成物は、そのため、単独で、又は追加の併用又は組み合わせ治療のいずれかでの本発明による方法に使用される。
好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
別の好ましい実施形態において、前記状態又は障害は、ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療である。
好ましい実施形態において、前記組成物はさらに、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原は、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質であり；（ｃ）及び（ｄ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている。
別の好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６及び配列番号７から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
さらに好ましい実施形態において、本発明による前記少なくとも１つのｅＩＬ－３１抗原に連結された前記コア粒子又は前記第１のコア粒子それぞれは、本発明の組成物中に存在する場合、前記少なくとも１つのｅＩＬ－５抗原に連結された前記第２のコア粒子と同じである。
さらに好ましい実施形態において、本発明による前記少なくとも１つのｅＩＬ－３１抗原に連結された前記コア粒子又は前記第１のコア粒子それぞれは、本発明の組成物中に存在する場合、前記少なくとも１つのｅＩＬ－５抗原に連結された前記第２のコア粒子と異なる。
以下において、前記「コア粒子」の実施形態が定義され、前記「コア粒子」の実施形態と単に呼ばれる場合、それは、前記コア粒子又は前記第１のコア粒子又は前記第２のコア粒子のいずれかを指すべきである。典型的には、かつ好ましくは、それは、前記コア粒子又は前記第１のコア粒子それぞれを指すべきである。
さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは、組換えＶＬＰである。再びさらなる好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、植物ウイルス又はバクテリオファージに由来し、好ましくは、前記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージである。
そのため、さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージに由来する。
さらに好ましいのは、本発明のコア粒子としてのＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰである。さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβ又はＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、さらに好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなる。
さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、（ａ）配列番号２４；（ｂ）配列番号２４と配列番号２５の混合物；又は（ｃ）配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれからなる組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなる。非常にさらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰである。さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなる。再びさらなる好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、配列番号２４を含むか又は好ましくはそれからなる組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなる。
別の好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記組換えコートタンパク質は配列番号２４を含むか又は好ましくはそれからなる。
一実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰではなく、好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰではない。一実施形態において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子ではない。
さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰは、植物ウイルスに由来する。別の好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは組換えＶＬＰであり、好ましくは、前記組換えＶＬＰは、植物ウイルスに由来する。別の好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＶＬＰである。
好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＶＬＰポリペプチドを含むか、本質的にそれからなる、或いはそれからなる改変ＶＬＰであり、前記改変ＶＬＰポリペプチドは、（ａ）ＶＬＰポリペプチド及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなり、前記ＶＬＰポリペプチドは、（ｉ）ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは、植物ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくは、それからなり、変異されるアミノ酸配列は、前記ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記ウイルスのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくは、それからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる。別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。典型的には、かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、最低で１個及び最大で１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個のアミノ酸残基が異なり、好ましくは、これらの違いは、（ｉ）挿入、（ｉｉ）欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸交換、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせから選択される。
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号１５を含むか、若しくは好ましくは、それからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列が、この項の（ｉ）で定義される前記アミノ酸配列である変異アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列が、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、及びより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１５を含むか、好ましくは、それからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号２７を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号２７と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列が、この項の（ｉ）で定義される前記アミノ酸配列である変異アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列が、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、及びより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
さらに好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号２７を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号２７と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号１５を含むか、又は好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、若しくは（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列（（ａ）若しくは（ｂ）で定義される前記アミノ酸配列が配列番号２７を含み；又は（ａ）若しくは（ｂ）で定義される前記アミノ酸配列が、配列番号２７と少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、再びさらに好ましくは、少なくとも９０％、再びより好ましくは、少なくとも９５％、なおさらに好ましくは、少なくとも９８％、なお再びさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む）；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列がこの項の中の（ｉ）で定義される前記アミノ酸配列である変異アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列が、少なくとも９８％、好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１５を含むか、又は好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むか、又は好ましくはそれからなり、この項の中の（ａ）若しくは（ｂ）で定義される前記アミノ酸配列が配列番号２７を含むか；又はこの項の中の（ａ）若しくは（ｂ）で定義される前記アミノ酸配列が、配列番号２７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換される。別の好ましい実施形態において、置換される前記Ｎ末端領域のアミノ酸の数は、前記Ｔヘルパー細胞エピトープが構成されるアミノ酸の数と等しいか、又はそれより少ない。
さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換され、前記置換されるＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記Ｔヘルパー細胞エピトープが構成されるアミノ酸の数と等しいか、又はそれより少ない。典型的には、かつ好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されるＮ末端領域は、５～１５個の連続アミノ酸、好ましくは、９～１４個の連続アミノ酸、より好ましくは、１１～１３個の連続アミノ酸からなる。
さらに非常に好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する。
別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープである。別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、せいぜい２０個のアミノ酸からなる。
非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列である。さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ヒトワクチンに由来する。非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来する。さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくは、それからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくは、それからなる。
非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなるか、又は前記Ｔｈ細胞エピトープは破傷風毒素に由来し、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくは、それからなる。
非常に好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、又は好ましくは、それからなり、前記アミノ酸配列は、配列番号１５若しくは配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、前記アミノ酸配列は配列番号２７を含み、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換され、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、１１～１３個の連続アミノ酸、好ましくは、１１個の連続アミノ酸からなり、さらに、好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する。
別の非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなる。
非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位及び前記第２の付着部位は、少なくとも１つの共有非ペプチド結合を介して連結されている。別の非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位は、アミノ基、好ましくは、リジンのアミノ基を含むか、又は好ましくは、そのアミノ基である。さらに非常に好ましい実施形態において、前記第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくは、システインのスルフヒドリル基を含むか、又は好ましくは、そのスルフヒドリル基である。
非常に好ましい実施形態において、少なくとも１つの第１の付着部位は、アミノ基、好ましくは、リジン残基のアミノ基であり、少なくとも１つの第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくは、システイン残基のスルフヒドリル基又は本発明の少なくとも１つの抗原に化学的に付着されているスルフヒドリル基である。さらに好ましい実施形態において、前記第２の付着部位の１つのみが、前記改変されたウイルス様粒子への前記抗原の結合の単一かつ均一な種類をもたらす少なくとも１つの非ペプチド共有結合を介して前記第１の付着部位と結合し、前記第１の付着部位と結合する前記１つのみの第２の付着部位がスルフヒドリル基であり、前記抗原と前記改変ウイルス様粒子は、規則的で反復性の抗原アレイを形成するために、前記結合を介して相互作用する。
本発明の１つの好ましい実施形態において、該抗原は、典型的には、かつ好ましくは、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用して、化学的架橋により改変ＶＬＰに連結される。好ましい実施形態において、該ヘテロ二官能性クロスリンカーは、好ましい第１の付着部位と、好ましくは、アミノ基と、より好ましくは、改変ＶＬＰのリジン残基（複数可）のアミノ基と反応することができる官能基、及び好ましい第２の付着部位、すなわち、好ましくは、抗原に固有であるか、又は抗原に人工的に付加され、必要に応じて、還元による反応にも利用可能にさせたシステイン（複数可）残基のスルフヒドリル基と反応することができるさらなる官能基、を含有する。いくつかのヘテロ二官能性クロスリンカーは、当技術分野で知られている。これらには、好ましいクロスリンカーＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＫＭＵＳ ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から利用可能で、アミノ基に対して反応性のある１つの官能基及びスルフヒドリル基に対して反応性のある１つの官能基を有する他のクロスリンカーが含まれる。上述のクロスリンカーの全ては、アミノ基との反応の後にアミド結合の形成を、そしてスルフヒドリル基との反応の後にチオエーテル結合の形成をもたらす。本発明の実施に適切なクロスリンカーの別のクラスは、カップリング時の抗原と改変ＶＬＰの間へのジスルフィド結合の導入によって特徴付けられる。このクラスに属する好ましいクロスリンカーには、例えば、ＳＰＤＰ及びスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。
上記の好ましい方法に従ってヘテロ二官能性クロスリンカーを用いることによる改変ＶＬＰへの抗原の連結は、配向様式での改変ＶＬＰへの抗原のカップリングを可能にする。改変ＶＬＰへ抗原を連結する他の方法には、抗原を、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを用いて、改変ＶＬＰに架橋する方法が含まれる。該抗原はまた、最初に、例えば、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランとの反応によってチオール化され得る。次いで、該抗原は、必要であれば、脱保護後に、以下のように改変ＶＬＰへカップリングされ得る。過剰なチオール化試薬の分離後、システイン反応性部分を含み、したがって、例えば、上記のようにチオール化抗原が反応することができるシステイン残基に対して反応性のある少なくとも１つ又はいくつかの官能基を提示するヘテロ二官能性クロスリンカーで事前に活性化した改変ＶＬＰと該抗原を反応させる。必要に応じて、少量の還元剤を反応混合物に含める。さらなる方法において、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ）又は改変ＶＬＰのアミン基又はカルボキシル基に対して反応性のある官能基での他の公知のホモ二官能性クロスリンカーなどのホモ二官能性クロスリンカーを用いて、該抗原を改変ＶＬＰに取り付ける。
本発明の非常に好ましい実施形態において、該抗原は、抗原のＮ末端又はＣ末端のいずれかに付加されたシステイン残基又は抗原内の天然システイン残基を介して改変ウイルス様粒子のリジン残基に連結している。好ましい実施形態において、本発明の組成物はさらにリンカーを含み、前記リンカーが前記第２の付着部位と前記抗原を結合させ、好ましくは、前記リンカーは前記第２の付着部位を含むか、或いはそれからなる。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、本発明による改変ＶＬＰ、好ましくは、組換え改変ＶＬＰであり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子はＶＬＰ、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異されるアミノ酸配列がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくは、それからなり、前記変異アミノ酸配列及び前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、及び再びより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示し、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子はＶＬＰ、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子はＶＬＰ、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記第２のコア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、それからなる。本発明の再び好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９５％及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記第２のコア粒子は、本発明による改変ＶＬＰ、好ましくは、組換え改変ＶＬＰであり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記第２のコア粒子はＶＬＰ、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異されるアミノ酸配列がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である変異アミノ酸配列、を含むか、好ましくは、それからなり、前記変異アミノ酸配列及び前記ＣＭＶのコートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、再びさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記第２のコア粒子はＶＬＰ、好ましくは、組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、前記ＣＭＶの改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９５％、及び好ましくは、少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくは、それからなり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくは、そのタンパク質である。
好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、再発性蕁麻疹、掻痒、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択される。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択される。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、再発性蕁麻疹、掻痒、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択される。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択される。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）及び再発性蕁麻疹から選択される。
好ましい実施形態において、前記掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
好ましい実施形態において、前記掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択される。
さらに好ましい実施形態において、掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択される。
さらに好ましい実施形態において、掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
さらに好ましい実施形態において、掻痒状態は、アトピー性皮膚炎、掻痒、アレルギー性皮膚炎及び再発性蕁麻疹から選択され、前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎、再発性蕁麻疹及び掻痒から選択される。
さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、掻痒である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アレルギー性皮膚炎である。さらに好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、再発性蕁麻疹である。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、強皮症、掻痒、アレルギー性皮膚炎、夏湿疹（ＩＢＨ）、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、再発性蕁麻疹、細胞性肺気腫、炎症性気道疾患、再発性気道閉塞、気道過敏反応、慢性閉塞性肺疾患、及び自己免疫から生じる炎症プロセスから選択され、好ましくは、前記掻痒状態又は前記アレルギー状態は、アトピー性皮膚炎、湿疹、掻痒、アレルギー性皮膚炎、細菌性毛嚢炎、皮膚糸状菌症、及び再発性蕁麻疹から選択される。
再びさらなる好ましい実施形態において、前記組成物の前記投与は、前記投与前の前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状と比較して、前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状を低下させ、好ましくは、前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する前記少なくとも１つのパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレード又は掻痒のレベルであり、さらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、症状病変スコアリング試験によって決定され、前記掻痒のレベルの前記低下は掻痒スコアリング試験によって決定され、さらに好ましくは、前記掻痒のレベルの前記低下は、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬の身体の少なくとも１つの場所の引っ掻きの低下によって決定され、典型的には、かつ好ましくは、前記症状病変スコアリング試験及び前記掻痒スコアリング試験は、実施例７及び実施例８に記載したように行われる。
さらに好ましい実施形態において、前記組成物の前記投与は、前記投与前の前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状と比較して、前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状を低下させ、前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する前記少なくとも１つのパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレード及び掻痒のレベルであり、好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、症状病変スコアリング試験によって決定され、前記掻痒のレベルの前記低下は掻痒スコアリング試験によって決定され、さらに好ましくは、前記掻痒のレベルの前記低下は、前記ウマ科（equine）哺乳動物、好ましくは、前記馬の身体の少なくとも１つの場所の引っ掻きの低下によって決定され、典型的には、かつ好ましくは、前記症状病変スコアリング試験及び前記掻痒スコアリング試験は、実施例７及び実施例８に記載したように行われる。
実施例
本発明で使用される好ましいコア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、特に、組換えＶＬＰである。１つの好ましい態様において、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰは、好ましくは、配列番号２４を含む、好ましくは、それからなる組換えコートタンパク質を含み、好ましくは、それからなる。ＲＮＡバクテリオファージ、特に、ＲＮＡバクテリオファージＱβのそのような好ましいウイルス様粒子はＷＯ ０２／０５６９０５に開示されており、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。特に、ＷＯ ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰ粒子の調製の詳細な説明を含有する。本発明の特定の例については、配列番号２４の組換えコートタンパク質からなるＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰが使用されてきた。別の好ましい実施形態において、該ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＶＬＰ、特に、ＣＭＶの改変ＶＬＰであり、Ｔヘルパー細胞エピトープは、ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換される。非常に好ましい実施形態において、該ＶＬＰは、本明細書に記載され、かつＷＯ ２０１６／０６２７２０に開示されている配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０であるか、又は配列番号２１の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ、好ましくは、配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０である。特に、ＷＯ ２０１６／０６２７２０の実施例１～６は、配列番号２０及び配列番号２１の改変ＣＭＶポリペプチドのＶＬＰ粒子の調製についての詳細な説明を含有する。
本発明で使用される好ましいコア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、特に、組換えＶＬＰである。１つの好ましい態様において、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰは、好ましくは、配列番号２４を含む、好ましくは、それからなる組換えコートタンパク質を含み、好ましくは、それからなる。ＲＮＡバクテリオファージ、特に、ＲＮＡバクテリオファージＱβのそのような好ましいウイルス様粒子はＷＯ ０２／０５６９０５に開示されており、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。特に、ＷＯ ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰ粒子の調製の詳細な説明を含有する。本発明の特定の例については、配列番号２４の組換えコートタンパク質からなるＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰが使用されてきた。別の好ましい実施形態において、該ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＶＬＰ、特に、ＣＭＶの改変ＶＬＰであり、Ｔヘルパー細胞エピトープは、ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換される。非常に好ましい実施形態において、該ＶＬＰは、本明細書に記載され、かつＷＯ ２０１６／０６２７２０に開示されている配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０であるか、又は配列番号２１の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ、好ましくは、配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０である。特に、ＷＯ ２０１６／０６２７２０の実施例１～６は、配列番号２０及び配列番号２１の改変ＣＭＶポリペプチドのＶＬＰ粒子の調製についての詳細な説明を含有する。
実施例１
皮膚炎になった馬の皮膚病変及び健康な皮膚の皮膚パンチ生検の試料採取、ＲＮＡ単離並びにｅＩＬ－３１特異的ＰＣＲ
Ａ．皮膚炎になった馬の皮膚病変及び健康な皮膚の皮膚パンチ生検の試料採取
病変及び健康な皮膚からの２～６ｍｍのパンチ生検を、掻痒状態及びアレルギー性皮膚炎状態になった馬から採取した。
皮膚炎になった馬の皮膚病変及び健康な皮膚の皮膚パンチ生検の試料採取、ＲＮＡ単離並びにｅＩＬ－３１特異的ＰＣＲ
Ａ．皮膚炎になった馬の皮膚病変及び健康な皮膚の皮膚パンチ生検の試料採取
病変及び健康な皮膚からの２～６ｍｍのパンチ生検を、掻痒状態及びアレルギー性皮膚炎状態になった馬から採取した。
Ｂ．皮膚生検のＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ転写
皮膚生検を、４℃でＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ｑｉａｇｅｎ）で保存し、全ＲＮＡを、ＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含めて、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）－マイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転写し、ｅＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｑＰＣＲにより定量化した。
皮膚生検を、４℃でＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ｑｉａｇｅｎ）で保存し、全ＲＮＡを、ＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含めて、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）－マイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転写し、ｅＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｑＰＣＲにより定量化した。
Ｃ．馬ＩＬ－３１＆βアクチンのＰＣＲ及びｑＰＣＲ
ＰＣＲ：ｅＩＬ－３１用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣ－配列番号１１；リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣ－配列番号１２）及びｅβアクチン（フォワードプライマー：ＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧ－配列番号１３；リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴ－配列番号１４）を用いた皮膚生検におけるｅＩＬ－３１ ｅβアクチンの増幅。ＰＣＲを、サイクル３０秒、９８℃、３５×［１０秒 ９８℃、２０秒 ６０℃、３０秒 ７２℃］、２分 ７２℃で、Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行った。
ＰＣＲ：ｅＩＬ－３１用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣ－配列番号１１；リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣ－配列番号１２）及びｅβアクチン（フォワードプライマー：ＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧ－配列番号１３；リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴ－配列番号１４）を用いた皮膚生検におけるｅＩＬ－３１ ｅβアクチンの増幅。ＰＣＲを、サイクル３０秒、９８℃、３５×［１０秒 ９８℃、２０秒 ６０℃、３０秒 ７２℃］、２分 ７２℃で、Ｑ５ホットスタートポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行った。
ｑＰＣＲ：ｅＩＬ－３１用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣ－配列番号１１；リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣ－配列番号１２）及びｅβアクチン（フォワードプライマー：ＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧ－配列番号１３；リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴ－配列番号１４）を用いた皮膚生検におけるｅＩＬ－３１ ｅβアクチンの増幅。ＰＣＲを、ファストスタートユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
馬ＩＬ－３１ ｍＲＮＡは、馬の掻痒を伴うアレルギー性皮膚炎を有する部位からの皮膚病変中で発現する（図１Ａ、列ａ、レーン１＆２）が、健康な馬の皮膚試料には存在しなかった（図１Ａ、列ａ、レーン３＆４）ことが見出された。対照のｍＲＮＡ βアクチンを、全試料中で増幅した（図１Ａ、列ｂ、レーン１～４）。典型的には、（アレルギー性）皮膚炎罹患馬の皮膚病変において、基本的に全ての皮膚層中に高含有率の好酸球が存在する。後者は、好酸球が皮膚病変に関与していないヒト又は犬などの他の家畜哺乳動物における皮膚病変とは対照的である。そのため、馬の掻痒を伴うアレルギー性皮膚炎を有する部位からの皮膚病変中の馬ＩＬ－３１ ｍＲＮＡの顕著な発現は、掻痒を伴うアレルギー性皮膚炎における馬ＩＬ－３１の関与を強く示唆する。
皮膚生検からのハウスキーピング遺伝子βアクチンに関連する馬ＩＬ－３１ ｍＲＮＡの発現は、痒みの皮膚病変から抽出した試料のみが馬ＩＬ－３１ ｍＲＮＡを発現するが、ｅＩＬ－３１は、同一の馬の適合する健康な皮膚試料において検出されず、痒みに苦しんでいない馬の健康な皮膚にも存在しなかったことを示した（図１Ｂ）。
実施例２
アレルギーのある馬から単離したＰＢＭＣによるＴ細胞のインビトロ刺激
Ａ．インビトロ刺激アッセイ
インビトロ刺激アッセイによる健康な馬に対するアレルギー性皮膚炎罹患馬の血液中のＴｈ細胞サブセット中の馬ＩＬ－３１レベルの定量化。ＩＢＨ罹患馬又は健康な馬から血液を採取し、ＰＢＭＣをフィコールにより単離した。
アレルギーのある馬から単離したＰＢＭＣによるＴ細胞のインビトロ刺激
Ａ．インビトロ刺激アッセイ
インビトロ刺激アッセイによる健康な馬に対するアレルギー性皮膚炎罹患馬の血液中のＴｈ細胞サブセット中の馬ＩＬ－３１レベルの定量化。ＩＢＨ罹患馬又は健康な馬から血液を採取し、ＰＢＭＣをフィコールにより単離した。
抗原取り込みを、アレルゲン抽出物及び／又は組換えアレルゲンそれぞれ、並びに陽性対照としてコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）を用いて行った。陰性対照は培地単独であった。ＰＢＭＣを、刺激の存在下で２４時間及び４８時間培養した。
或いは、馬の単球を、モノクローナル抗馬ＣＤ１４抗体（クローン１０５）及び二次ヤギ抗マウスコーティングマイクロビーズを用いて、製造業者による標準的なプロトコルに従って磁気分離（ＭＡＣＳ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）によって単離する。次いで、（Ｍｏｙｏら、２０１３）に記載のように、細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で分離し、組換え馬ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦの存在下でＣＤ１４＋単球を３日間培養することによって、ＭｏＤＣへの分化を誘導する。成熟のために、Ｍｏｙｏら（２０１３）にしたがって、樹状細胞を、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ、ＵＳＡ）、１μｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｘｅｔｅｒ、英国）、２０ｎｇ／ｍｌの馬腫瘍壊死因子α、１０ｎｇ／ｍｌの馬ＩＬ－１β、２０ｎｇ／ｍｌの馬ＩＬ－６及び１００ｎｇ／ｍｌの馬ＩＦＮ－γ（全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）を含む成熟カクテルに一晩暴露する。抗原取り込みを、アレルゲン抽出物及び／又は組換えアレルゲンそれぞれ、及び陽性対照として破傷風トキソイドペプチドを用いて行う。Ｔ細胞を、抗原負荷ＡＰＣと２４時間共培養する。
Ｂ．ＰＢＭＣ細胞のＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ転写
全ＲＮＡを、ＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含めて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ ＸＳキット（Ｍａｃｈｅｒｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてＰＢＭＣ細胞から単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転写し、ｅＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子コピー数をｑＰＣＲにより定量化した。
全ＲＮＡを、ＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含めて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ ＸＳキット（Ｍａｃｈｅｒｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてＰＢＭＣ細胞から単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに転写し、ｅＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子コピー数をｑＰＣＲにより定量化した。
Ｃ．馬ＩＬ－３１ ＲＮＡの定量化
Ｔｈ２細胞によって生成された馬ＩＬ－３１のレベルを、ｑＰＣＲによって細胞抽出物からのｍＲＮＡレベルで定量化した。
Ｔｈ２細胞によって生成された馬ＩＬ－３１のレベルを、ｑＰＣＲによって細胞抽出物からのｍＲＮＡレベルで定量化した。
ｑＰＣＲ：ｅＩＬ－３１用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣ－配列番号１１；リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣ－配列番号１２）及びｅβアクチン（フォワードプライマー：ＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧ－配列番号１３；リバースプライマー：ＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴ－配列番号１４）を用いた皮膚生検におけるｅＩＬ－３１ ｅβアクチンの増幅。ＰＣＲを、ファストスタートユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
ＩＢＨ罹患馬及び健康な非ＩＢＨ馬からのサシバエ属アレルゲン刺激ＰＢＭＣにおける、ハウスキーピング遺伝子ｅβアクチンに対するｅＩＬ－３１ ｍＲＮＡの発現（図１Ｃ）。培地及びアレルゲン刺激は健康な馬においては同等であるが、ＩＬ－３１発現は、アレルゲン刺激時にＩＢＨ罹患馬において培地刺激を上回って増加する。
フローサイトメトリーによるＩＬ－３１の細胞内サイトカイン染色
Ｔｈ２細胞内の細胞内馬ＩＬ－３１レベルを、フローサイトメトリーによってタンパク質レベルで定量化する。
Ｔｈ２細胞内の細胞内馬ＩＬ－３１レベルを、フローサイトメトリーによってタンパク質レベルで定量化する。
実施例３
馬ＩＬ－３１（ｅＩＬ－３１）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌での封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－３１をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を、遺伝子合成により作製した。
馬ＩＬ－３１（ｅＩＬ－３１）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌での封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－３１をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を、遺伝子合成により作製した。
加えて、リンカー（ＧＧＣ）をＣ末端に付加した。このインサートには、５’ＮｄｅＩ及び３’ＸｈｏＩが隣接し、これを、６つのＨｉｓのタグ（精製を容易にするため）及び終止コドンをインフレームで含有するｐＥＴ ４２ｂ（＋）に組込んだ。該構築物をｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－３１（配列番号２２）と命名した。クローニング手順の信頼性を、ＤＮＡ配列決定により確認した。構築物ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－３１（配列番号２２）を大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換した。大腸菌内で発現させた組換えタンパク質を、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号２）と命名した。
ＢＬ２１－ＤＥ３細胞において、クローンｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ３１－Ｃ－ＨｉｓからのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの大規模発現を行った。この目的のために、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓを保有するクローンＢＬ２１－ＤＥ３細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１８０ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養物を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１０ＬのＬＢに接種した。培養物を、０．７のＯＤ６００ｎｍの光学密度まで成長させ、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１．０Ｍストックを１０ｍｌ添加することによって発現を４時間誘導した。組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを不溶性形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に置いた。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの発現を流動的に確認した。培養物を誘導後４時間の時点で採取し、４℃、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ（８００ｒｐｍ）を用いて、再懸濁緩衝液で再懸濁した（４℃で１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）（３ｍｌ／ｇの細胞）。再懸濁細胞をファルコンチューブに収集し、液体窒素中で瞬間凍結し、一晩、－２０℃で保存した。再懸濁細胞を、室温で解凍し、細胞クラッカー又はダウンスホモジナイザー及び超音波処理器によって細胞を開けた（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ａ＝細胞溶解物、５０μｌ）。冷トリトン緩衝液（６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、次いで、６％（ｖ／ｖ）のトリトン－Ｘ－１００を添加する）の０．５容量を添加し、４℃で３０分間攪拌した。その後、溶解物を４８０００×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｂ＝可溶性画分、５０ｍｌ）。封入体を、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて洗浄緩衝液（４℃の１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４８０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心分離した。この洗浄工程を４回繰り返し、トリトン－ｘ １００を除去し、最終的に封入体を－２０℃で保存した。封入体を、室温で解凍し、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘを用いて、可溶化緩衝液（室温の６ＭのＧｄｍＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８）に再懸濁することにより可溶化し（２０ｍｌ／ｇの封入体）、室温で１～２時間攪拌した。可溶化封入体を、平均１０００００×ｇで、１５℃で３０分間、超遠心分離した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｃ＝可溶化したＩＢ ５０μｌ）。
Ｂ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの精製及びリフォールディング
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用いて、そして溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ４．５）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグにより精製した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｄ＝フロースルーＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピークのＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、８ｋＤａのカットオフ膜を用いて、室温で２時間、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析した。
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用いて、そして溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ４．５）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグにより精製した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｄ＝フロースルーＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピークのＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、８ｋＤａのカットオフ膜を用いて、室温で２時間、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析した。
不溶性ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、洗剤で洗浄した封入体から、６Ｍの塩酸グアニジンで抽出した。異なる洗浄工程：細胞溶解物（図２Ａ、レーン１）、可溶性画分（図２Ａ、レーン２）、可溶化封入体（図２Ａ、レーン３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２Ａ）によって分析した。可溶化タンパク質を、金属キレート親和性クロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図２Ａ、レーン４、プールした画分の溶出液）。組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓは、この手順によって高度に濃縮されることが見出された。天然タンパク質を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し（図２Ｂ、レーン１）、主に単量体タンパク質が見出された。変性タンパク質を、下記のリフォールディング手順に供し、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをリフォールディングするために、該タンパク質を、順次以下の緩衝液：緩衝液１（２Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液２（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液３ａ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍのアルギニン、１０％のグリセロール）、緩衝液３ｂ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％のグリセロール）、緩衝液４（ＰＢＳ）により透析した。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａのカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液を用いて、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００スーパーデックス７５プレップグレード（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。溶出画分をプールし、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（ＳＤＳあり、ＤＴＴなし、試料の加熱なし）。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
精製した組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのリフォールディング後の二量体を形成する能力を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（図２Ｂ、レーン２）。約３３ｋＤａの分子量によって判断されるように、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓは、二量体構造で部分的に存在することが実証された。
Ｃ．リフォールディングした組換え馬ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの生物学的活性
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、馬の首に皮下注射した。痒みを、注射部位（首）での５秒以上の痒みと定義した。１時間あたりの引っ掻き／痒みの数を、注射後１時間から開始して、全部で５時間数えた。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの注射後の痒みを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ対照の注射と比較した。対照よりも増加した痒みの数を、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて記録した（図２Ｃ）。
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、馬の首に皮下注射した。痒みを、注射部位（首）での５秒以上の痒みと定義した。１時間あたりの引っ掻き／痒みの数を、注射後１時間から開始して、全部で５時間数えた。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの注射後の痒みを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ対照の注射と比較した。対照よりも増加した痒みの数を、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて記録した（図２Ｃ）。
実施例４
ウマ（equine）インターロイキン５（ｅＩＬ－５）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌における封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－５をコードするＤＮＡ配列（成熟インターロイキン５、エクゥウス・カバッルス（ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９）を、遺伝子合成により作製した。配列番号６。
ウマ（equine）インターロイキン５（ｅＩＬ－５）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌における封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－５をコードするＤＮＡ配列（成熟インターロイキン５、エクゥウス・カバッルス（ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９）を、遺伝子合成により作製した。配列番号６。
加えて、リンカー（ＧＧＣ）をＣ末端に付加した。このインサートには、５’ＮｄｅＩ及び３’ＸｈｏＩが隣接し、これを、６つのＨｉｓのタグ（精製を容易にするため）及び終止コドンをインフレームで含有するｐＥＴ ４２ｂ（＋）に組込んだ。該構築物をｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５（配列番号２３）と命名した。クローニング手順の信頼性を、ＤＮＡ配列決定により確認した。構築物ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５（配列番号２３）を大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換した。大腸菌内で発現させた組換えタンパク質を、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号７）と命名した。同様に、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０を調製し、全ては、システイン残基を含むリンカー及び（配列番号１０を除いて）Ｈｉｓタグを含み、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０は、Ｃ末端にリンカー（ＧＧＣ）及び（配列番号１０を除いて）Ｈｉｓタグを含んでいた。配列番号７、配列番号８及び配列番号９、特に、配列番号７及び配列番号８は、互換的に「ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ」と本明細書で命名する。さらに、それがこの実施例の節及び説明図内でｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓと呼ばれる場合、これらのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ組換えタンパク質のうちの１つを使用し、様々な実施例において、２以上又は全てを繰り返し実験で使用した。非常に好ましく使用されるｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、配列番号７及び配列番号８である。ＢＬ２１－ＤＥ３細胞中のクローンｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ５－Ｃ－ＨｉｓからのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの大規模な発現を行った。この目的のために、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを保有するクローンＢＬ２１－ＤＥ３細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１８０ｍｌのＬＢ中で一晩成長させた。この培養液を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１０ＬのＬＢに接種する。培養物を、０．７のＯＤ６００ｎｍの光学密度まで成長させ、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１．０Ｍストックを１０ｍｌ添加することによって発現を４時間誘導した。組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを不溶性形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に置いた。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの発現を流動的に確認した。培養物を誘導後４時間の時点で採取し、４℃、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ（８００ｒｐｍ）を用いて、再懸濁緩衝液（４℃の１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）で再懸濁した（３ｍｌ／ｇの細胞）。再懸濁細胞をファルコンチューブに収集し、液体窒素中で瞬間凍結し、一晩、－２０℃で保存した。再懸濁細胞を、室温で解凍し、細胞クラッカー又はダウンスホモジナイザー及び超音波処理器によって細胞を開けた（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ａ＝細胞溶解物、５０μｌ）。冷トリトン緩衝液（６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、次いで、６％（ｖ／ｖ）のトリトン－Ｘ－１００を添加する）の０．５容量を添加し、４℃で３０分間攪拌した。その後、溶解物を４８０００×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｂ＝可溶性画分５０ｍｌ）。封入体を、ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて洗浄緩衝液（４℃の１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４８０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心分離した。この洗浄工程を４回繰り返し、トリトン－ｘ １００を除去し、最終的に封入体を－２０℃で保存した。封入体を、室温で解凍し、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘを用いて、可溶化緩衝液（室温で６ＭのＧｄｍＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８）に再懸濁することにより可溶化（２０ｍｌ／ｇの封入体）し、室温で１～２時間攪拌した。可溶化封入体を、平均１０００００×ｇで、１５℃で３０分間、超遠心分離した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｃ＝可溶化したＩＢ ５０μｌ）。
Ｂ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの精製及びリフォールディング
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用いて、そして溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ４．５）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグにより精製した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｄ＝フロースルーＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピークのＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて、室温で２時間、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析した。
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用いて、そして溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ４．５）を用いて、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグにより精製した（ゲル分析のための試料５０μｌ：試料Ｄ＝フロースルーＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピークのＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて、室温で２時間、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対して透析した。
不溶性ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、洗剤で洗浄した封入体から、６Ｍの塩酸グアニジンで抽出した。異なる洗浄工程：細胞溶解物（図３Ａ、レーン１）、可溶性画分（図３Ａ、レーン２）、可溶化封入体（図３Ａ、レーン３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１）によって分析した。可溶化タンパク質を、金属キレート親和性クロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図３Ａ、レーン４、フロースルー、レーン５、プールした画分の溶出液）。組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、この手順によって高度に濃縮されることが見出された。天然タンパク質を、非還元条件下（ＳＤＳあり、ＤＴＴなし、試料の加熱なし）で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図３Ｂ）によって評価し（図３Ｂ、レーン１）、主に単量体タンパク質が見出された。変性タンパク質を、下記のリフォールディング手順に供し、必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをリフォールディングするために、該タンパク質を、順次以下の緩衝液：緩衝液１（２Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液２（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液３（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％のグリセロール）、緩衝液４（ＰＢＳ）により透析した。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａのカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液を用いて、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００スーパーデックス７５プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。溶出画分をプールし、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
生物学的に活性のある天然のＩＬ－５はジスルフィド結合ホモ二量体であるので、精製した組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのリフォールディング後に二量体を形成する能力を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（図３Ｂ、レーン２）。約２８ｋＤａの分子量によって判断されるように、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは天然で二量体であり、天然の三次構造の保存を示すことが実証された。
Ｃ．組換えホモ二量体濃縮ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの構造
α－ヘリックス及びβ－シートを示す遠ＵＶによるＣＤ分光法を、正しい二次構造を確認するために測定した（図３Ｃ）。
α－ヘリックス及びβ－シートを示す遠ＵＶによるＣＤ分光法を、正しい二次構造を確認するために測定した（図３Ｃ）。
質量分析（消化したｅＩＬ－５－Ｃ－ＨｉｓのＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ、その後ＨＰＬＣ）を、タンパク質の二次構造の他に、一次、三次及び四次構造を確認するために行った。典型的には、ＩＬ－５単量体は、２つの単量体の先頭から末端の位置をもたらす２つの分子間ジスルフィド架橋によりホモ二量体として連結されている。
組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓへの市販の抗体結合の能力を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図３Ｄ）。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．５ｍｇ／Ｌの抗Ｈｉｓ抗体５０μｌで一晩コーティングした。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）のＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、３７℃で１時間、スーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、精製組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（１０ｍｇ／Ｌ）を添加し、１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｅＩＬ－５抗体（馬ＩＬ－５親和性精製ポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国、カタログ番号ＡＦ２４７０）を、４μｇ／ｍｌから１／３希釈で滴定し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗ヤギＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて、４５０ｎｍで測定した。
組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの適切なリフォールディングを円二色性（ＣＤ）分光法によって測定し、主に、αヘリックスであるがβシートも存在するということを予想されるとおり見出し得た。（図３Ｃ）。２つの分子間ジスルフィド架橋による２つの単量体の連結を、さらにＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳによって確認した。質量２５０５、２６３３、及び２７６１ｍ／ｚのＭＳＭＳ画分は、典型的なジスルフィドフラグメントパターン３２／２／３２を示す。Ｃｙｓ４４はＣｙｓ８６に分子間連結されるので、２つの単量体は２つのジスルフィド架橋を介して連結される（スペクトルは図示せず）。さらに、リフォールディングした馬ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、ＥＬＩＳＡで市販の抗馬ＩＬ－５抗体によって検出可能であった（図３Ｄ）。
実施例５
ＶＬＰへのｅＩＬ－３１抗原のカップリング、馬の免疫化及び掻痒誘発皮膚炎の馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号２４のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載されるように生成し、７．５倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応のクロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ８．０のＰＢＳ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＱβ単量体の１：１のモル比で誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
ＶＬＰへのｅＩＬ－３１抗原のカップリング、馬の免疫化及び掻痒誘発皮膚炎の馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号２４のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載されるように生成し、７．５倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応のクロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ８．０のＰＢＳ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＱβ単量体の１：１のモル比で誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシー染色（図４Ａ）。Ｑβ、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクマシーブルー（０．０２５％のクマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％のメタノール、１０％の酢酸）で染色し、脱染色剤（４０％のメタノール、１０％の酢酸）で脱染色した。
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット染色（図４Ｂ）。Ｑβ、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした。該膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末で１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末中の１：８００希釈した１０ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ペンタＨｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、マウスモノクローナルＩｇＧ１、カタログ番号３４６６０）とインキュベートした。該膜を、１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０，０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を、ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ１０ｍｌと共に１時間インキュベートした。該膜を、ＰＢＳで１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で発色させ、写真フィルムに感光した。
ウイルス様粒子ＱβへのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの共有結合化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクマシーブルー染色ゲルは、Ｑβに共有結合させた馬ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて予測されるものに相当する分子量を有するバンドの出現を実証した（図４Ａ）。さらに、ウェスタンブロット分析により、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合、これらのバンドの共局在化が示された（図４Ｂ）。
Ｂ．ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応のクロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭのＥＤＴＡ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＶＬＰ単量体の１：１のモル比で誘導体化したＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭのＥＤＴＡに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応のクロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭのＥＤＴＡ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＶＬＰ単量体の１：１のモル比で誘導体化したＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭのＥＤＴＡに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシー染色（図４Ｃ）。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶｔｔ８３０、及びｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクマシーブルー（０．０２５％のクマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％のメタノール、１０％の酢酸）で染色し、脱染色剤（４０％のメタノール、１０％の酢酸）で脱染色した。
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット染色（図４Ｄ）。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶｔｔ８３０、及びｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした。該膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末で１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末中の１：１０００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（モノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体ＨＲＰＯコンジュゲート、Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０）１０ｍｌとインキュベートした。該膜を、１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で発色させ、写真フィルムに感光した。
ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓの共有結合化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクマシーブルー染色ゲルは、ＣＭＶ－ｔｔ８３０に共有結合させた馬ＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓについて予測されるものそれぞれに相当する分子量を有するバンドの出現を実証した（図４Ｃ）。さらに、ウェスタンブロット分析は、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合、これらのバンドの共局在化を示した（図４Ｄ）。
Ｃ．免疫化プロトコル
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を単独でそれぞれ施した馬。馬ＩＬ－３１への自己反応性抗体を作るために、０、２８、及び１０１日目に、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を馬に皮下注射した。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４１日目、及び４１日目以降の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ａ）。
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を単独でそれぞれ施した馬。馬ＩＬ－３１への自己反応性抗体を作るために、０、２８、及び１０１日目に、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を馬に皮下注射した。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４１日目、及び４１日目以降の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ａ）。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ併用治療及びワクチン接種（別々の注射）をそれぞれ施した馬。馬ＩＬ－５及び馬ＩＬ－３１に対する自己反応性抗体を作るために、－６２及び－４０日目に、１，０００μｌのＰＢＳ中ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチン及び０及び１９日目に、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを馬に皮下注射した。免疫前、４２又は９３日目及び１１８日目に馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ｂ）。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの組み合わせ治療及びワクチン接種をそれぞれ施した馬。馬ＩＬ－５及び馬ＩＬ－３１に対する自己反応性抗体を作るために、０、２８、１０５日目に、ｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡの合計２，０００μｌ中それぞれ３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を馬に皮下注射した。免疫前、並びに免疫化プロトコルの少なくとも４２及び８４日目並びに８４日目以降の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ｃ）。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ併用治療及びワクチン接種（別々の注射、同じ日であるが、異なるリンパ節を標的にする）をそれぞれ施した馬。馬ＩＬ－５及び馬ＩＬ－３１に対する自己反応性抗体を作るために、０及び２８日目に、それぞれ１，０００μｌのｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を馬の左身体部位に、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を馬の右身体部位にそれぞれ３００μｇ皮下注射した。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４２日目及び４２日目以降の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ｄ）。
事前にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を施した後に、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種をそれぞれ施した馬。事前にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチン接種した後に馬ＩＬ－３１への自己反応性抗体を作るために、１，０００μｌのｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中３００μｇのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０で０及び２８日目に馬に皮下注射した。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、及び４２日後の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ｅ）。
Ｄ．ＥＬＩＳＡによる血清分析
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を単独でそれぞれ施した馬：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、馬血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を単独でそれぞれ施した馬：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、馬血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０単独でワクチン接種した馬からの４１日目の免疫後の血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬のワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図５Ａ）。応答のピーク時の最大半分力価は、１：１，０００を超えた。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ併用治療及びワクチン接種をそれぞれ施した馬：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）又はｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗原を事前吸収させた馬血清（ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；室温で３０分プレインキュベーション）の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種した馬からの４２、９３又は１１８日目の免疫後の血清をそれぞれ採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬のワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図５Ｂ）。応答のピーク時の最大半分力価は、約１：１，０００であった。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ組み合わせ治療及びワクチン接種をそれぞれ施した馬：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）又はｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗原を事前吸収させた馬血清（ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；室温で３０分プレインキュベーション）の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でワクチン接種した馬からの４２、８４日目の免疫後の血清、並びにその後の血清をそれぞれ採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬のワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図５Ｃ）。抗ＩＬ－５応答及び抗ＩＬ－３１応答の両方のピーク時の最大半分力価は、約１：１，０００であった。
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰ併用治療及びワクチン接種（別々の注射、同じ日であるが、異なるリンパ節を標的にする）をそれぞれ施した馬。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）又はｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗原を事前吸収させた馬血清（ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ ＥＬＩＳＡについては：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ抗原（５μｇ／ｍｌ）で事前吸収；室温で３０分プレインキュベーション）の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でワクチン接種した３頭の馬からの４２日目の免疫後の血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０のワクチンを別々に注射した。別のリンパ節を標的化するために、ワクチンを異なる身体部位に注射した。抗体価を、２回のワクチン接種時に評価し、皮膚炎疾患の症状、掻痒及び血中好酸球増加に対するワクチン接種の効果を記録する。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬（ｎ＝３）のワクチン接種の結果は、自己抗原ｅＩＬ－５及びｅＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図５Ｄ）。抗ｅＩＬ－３１応答の４２日目の平均最大半分力価は約１：１，０００であり、抗ｅＩＬ－５応答の平均最大半分力価は約１：３，０００であった。
事前にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種を施した後に、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＶＬＰの治療及びワクチン接種をそれぞれ施した馬：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）又はｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、馬血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でワクチン接種した２頭の馬からの４２日目の免疫後の血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。これらの馬には、前年に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンをワクチン接種している。抗体価を、２回のワクチン接種時に評価し、皮膚炎疾患の症状、掻痒及び血中好酸球増加に対するワクチン接種の効果を記録する。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬には、同じＶＬＰ骨格を使用して、前年にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンでワクチン接種をしていたが、馬のワクチン接種の結果は、自己抗原ｅＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図５Ｅ）。抗ｅＩＬ－３１応答の４２日目の最大半分力価は１：２，５００を超えていた。
Ｅ．インビボでの有効性：
ケーススタディ１：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ併用ワクチン接種。同時にＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する自己抗体を誘導する能力を評価するために、掻痒性アレルギー性皮膚炎になったアイスランド馬（ＩＤＥＸＸ Ｄｉａｖｅｔ、スイスによって行われたグリーアアレルゲン（Ｇｒｅｅｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ）を用いたアレルギースクリーニングによって、ハンノキ属、ナガバギシギシ、コナヒョウヒダニ、ケナガコナダニ、コナダニ及びサシバエ属についての試験が陽性であった）に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβとｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβの併用ワクチンを接種した。
ケーススタディ１：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ併用ワクチン接種。同時にＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する自己抗体を誘導する能力を評価するために、掻痒性アレルギー性皮膚炎になったアイスランド馬（ＩＤＥＸＸ Ｄｉａｖｅｔ、スイスによって行われたグリーアアレルゲン（Ｇｒｅｅｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ）を用いたアレルギースクリーニングによって、ハンノキ属、ナガバギシギシ、コナヒョウヒダニ、ケナガコナダニ、コナダニ及びサシバエ属についての試験が陽性であった）に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβとｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβの併用ワクチンを接種した。
第１の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ併用ワクチンを使用して皮下に２回ワクチン接種した。１ｍｌの総量のＰＢＳ中３００μｇの各ワクチンを、ワクチン接種日ごとに皮下注射する。馬に、－６２及び－４０日目に１，０００μｌのＰＢＳ中のｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、０及び１９日目に１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを注射した。４２、９３及び１１８日目の血清中の抗体価をＥＬＩＳＡにより分析した。両方のサイトカインに対する抗体価を、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβとｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンでの併用ワクチン接種時に確立した（図５Ｂ、抗ｅＩＬ－５抗体、黒丸、抗ＩＬ－３１抗体、灰色丸）。
ケーススタディ２：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせワクチン接種。抗体価並びに皮膚炎疾患の症状、掻痒及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、掻痒性アレルギー性皮膚炎になったアイスランド馬（ＩＤＥＸＸ Ｄｉａｖｅｔ、スイスによって行われたグリーアアレルゲンを用いたアレルギースクリーニングによってイエカ、サシバエ属、ブユ属の種、サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｃ．）、及びアブ属についての試験が陽性であった）に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０とＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０からなる組み合わせワクチンを接種した。
第１の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせワクチンを使用して、３回皮下にワクチン接種した。総量２ｍｌのｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中３００μｇの各ワクチンを、ワクチン接種日ごとに皮下注射する。馬に、０、２８、及び１０５日目に注射した。血清中のＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ｃ）。ワクチン接種前及び後に、血液中の好酸球数を分析し、皮膚炎の病変及び掻痒を、実施例７及び８に記載の症状スコアリングによってそれぞれスコア化する。血液中の好酸球レベルは、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせワクチンを用いる免疫化の際に減少した（図５Ｆ）。好酸球レベルの減少に伴い、皮膚病変スコアは減少し、病変スコアのコースは、最初の測定と比較して低下した値を示した（図５Ｇ）。病変スコアと同等に、掻痒スコアのコースは第２の免疫後に減少し、長い期間痒みが存在しなかった（図５Ｈ）。治療前のシーズン及び治療中のシーズンからの平均掻痒スコアを比較すると、掻痒はワクチンの存在下で強く減少した（図５Ｉ）。
ケーススタディ３：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０単独を接種した馬。抗体価並びに皮膚炎疾患の症状、掻痒及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、掻痒性アレルギー性皮膚炎になったアイスランド馬（ＩＤＥＸＸ Ｄｉａｖｅｔ、スイスによって行われたグリーアアレルゲンを用いたアレルギースクリーニングによってハンノキ属、ナガバギシギシ、コナヒョウヒダニ、ケナガコナダニ、及びコナダニについての試験が陽性であった）に、ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンのみを接種した。
第１の馬に、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンを使用して、３回皮下に接種した。総量１ｍｌのｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中３００μｇのワクチンを、ワクチン接種日ごとに皮下注射した。馬に、０、２８、及び１０１日目に注射した。血清中のＩＬ－３１に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって分析した（図５Ａ）。ワクチン接種前及び後に、血液中の好酸球数を分析し、皮膚炎の病変及び掻痒を、実施例７及び８に記載の症状スコアリングによってそれぞれスコア化する。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンを用いる治療シーズン中の平均皮膚病変スコアは、前の未治療シーズンと比較して、スコアが低下した（図５Ｊ）。同じ程度に、治療前のシーズン及び治療中のシーズンからの平均掻痒スコアを比較すると、掻痒はワクチンの存在下で強く減少した（図５Ｋ）。
実施例６
ＩＢＨになりやすい馬における異なるＶＬＰへのｅＩＬ－５抗原のカップリング、馬の免疫化及び有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号２４のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰをＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応クロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ８．０のＰＢＳ中等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＱβ単量体の１：２のモル比で誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。必要に応じて、反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
ＩＢＨになりやすい馬における異なるＶＬＰへのｅＩＬ－５抗原のカップリング、馬の免疫化及び有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号２４のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰをＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応クロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｐＨ８．０のＰＢＳ中等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＱβ単量体の１：２のモル比で誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。必要に応じて、反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシー染色（図６Ａ）：Ｑβ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクマシーブルー（０．０２５％のクマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％のメタノール、１０％の酢酸）で染色し、脱染色剤（４０％のメタノール、１０％の酢酸）で脱染色した。
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット染色（図６Ｂ）：Ｑβ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ及びＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした。該膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末で１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末中の１：８００希釈した１０ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（ペンタＨｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、マウスモノクローナルＩｇＧ１、カタログ番号３４６６０）とインキュベートした。該膜を、１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０，０００の希釈で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を、ＰＢＳＴ中１０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと共に１時間インキュベートした。該膜を、ＰＢＳで１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で発色させ、写真フィルムに感光した。
ウイルス様粒子ＱβへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓの共有結合化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクマシーブルー染色ゲルは、Ｑβに共有結合させた馬ＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓについて予測されるものに相当する分子量を有するバンドの出現を実証した（図６Ａ）。さらに、ウェスタンブロット分析は、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合、これらのバンドの共局在化を示した（図６Ｂ）。
Ｂ．ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＷＯ ２０１６／０６２７２０に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応クロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ＰＢＳ又はｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＶＬＰ単量体の１：２のモル比で誘導体化ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。必要に応じて、反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳ又はｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
配列番号２０の改変ＣＭＶポリペプチドを含むＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＷＯ ２０１６／０６２７２０に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応クロスリンカーを、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、精製及びリフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ＰＢＳ又はｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中の等モル過剰量のトリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間還元した。次いで、還元ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質に対するＶＬＰ単量体の１：２のモル比で誘導体化ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、架橋を可能にするために、２２℃で４時間共にインキュベートした。必要に応じて、反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳ又はｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡに対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをサイズ排除クロマトグラフィー又は１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用した接線流濾過のいずれかによって除去した。
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクマシー染色（図６Ｃ）：ＣＭＶｔｔ８３０、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクマシーブルー（０．０２５％のクマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％のメタノール、１０％の酢酸）で染色し、脱染色剤（４０％のメタノール、１０％の酢酸）で脱染色した。
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット染色（図６Ｄ）：ＣＭＶ－ｔｔ８３０、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした。該膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末で１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ粉末中の１：１０００希釈した１０ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（モノクローナル抗Ｈｉｓタグ抗体ＨＲＰＯコンジュゲート、Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０）とインキュベートした。該膜を、１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で発色させ、写真フィルムに感光した。
ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓの共有結合化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクマシーブルー染色ゲルを、ＣＭＶ－ｔｔ８３０に共有結合させた馬ＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓについて予測されるものに相当する分子量を有するバンドの出現を実証した（図６Ｃ）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウェスタンブロット分析は、これらのバンドの共局在化を示した（図６Ｄ）。
Ｃ．免疫化プロトコル
馬、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰ。馬ＩＬ－５への自己反応性抗体を作るために、注射の３０分前に３００μｌのミョウバンと混合した１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、０、２１、及び４２日目に馬に皮下注射した。示すように、追加免疫を１２４日目に施した。或いは、馬に、０、２８、５６、及び８４日目に、アジュバントの非存在下で、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを皮下注射した。２年目の治療の経過観察のために、馬に、アジュバントの非存在下で、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを４週間隔で皮下に２回追加免疫した。免疫化前、及び免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、５６日目及び５６日目以降の様々な追加の時点で、馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
馬、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰ。馬ＩＬ－５への自己反応性抗体を作るために、注射の３０分前に３００μｌのミョウバンと混合した１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、０、２１、及び４２日目に馬に皮下注射した。示すように、追加免疫を１２４日目に施した。或いは、馬に、０、２８、５６、及び８４日目に、アジュバントの非存在下で、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを皮下注射した。２年目の治療の経過観察のために、馬に、アジュバントの非存在下で、１，０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを４週間隔で皮下に２回追加免疫した。免疫化前、及び免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、５６日目及び５６日目以降の様々な追加の時点で、馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
馬、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０。馬ＩＬ－５に対する自己反応性抗体を作るために、馬に、０、２８、５６、８４及び１２６日目に、アジュバントの非存在下で、１，０００μｌのＰＢＳ中４００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを皮下注射した。免疫化前、並びに免疫化プロトコルの少なくとも５６日目及び８４日目のいずれか、並びに８４日目以降の様々な追加の時点で、馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
Ｄ．ＥＬＩＳＡによる血清分析
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、Ｑβ又は精製ＣＭＶｔｔ８３０（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中のスーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、馬血清の３倍希釈液をＰＢＳ中のスーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、Ｑβ又は精製ＣＭＶｔｔ８３０（５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中のスーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、馬血清の３倍希釈液をＰＢＳ中のスーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰをワクチン接種した馬からの免疫後の様々な血清を採取し、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓに対する抗体（図７Ａ）及びＱβ ＶＬＰに対する抗体（図７Ｂ）についてＥＬＩＳＡにより分析した。免疫前血清及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種馬からの免疫化後の様々な血清を、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓに対する抗体（図７Ｃ）及びＣＭＶｔｔ８３０に対する抗体（図７Ｄ）について分析した。対応するナイーブ血清希釈液を差し引いた各希釈液のＯＤ４５０値から計算したデルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値として、馬血清をブロットした。馬のワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－５に対する免疫寛容が克服されたことを示す。応答のピーク時の最大半分力価は、１：１，０００～１：５０，０００の範囲であった。
Ｅ．馬でのインビボ有効性
血液中の好酸球レベルとＩＢＨ疾患症状の相関
１２頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬からのＥＤＴＡ血液を採取し、好酸球レベルを分析した。さらに、疾患症状スコアリングを、シーズン中、すなわち、４月～１０月の間に評価した。血液中の好酸球のレベルは、病変症状スコアリングによる平均疾患症状尺度と相関した。病変症状スコアリングを実施例７に従って行った。実際に、病気の馬の血液中の好酸球数とＩＢＨ病変強度スコアの間に正の相関が見られ（Ｒ２＝０．９２２７、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）（図７Ｅ）、ＩＢＨ罹患馬を免疫化する方法における本発明の組成物及びそれらの使用は、ＩＢＨの治療に有益であることが示された。
血液中の好酸球レベルとＩＢＨ疾患症状の相関
１２頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬からのＥＤＴＡ血液を採取し、好酸球レベルを分析した。さらに、疾患症状スコアリングを、シーズン中、すなわち、４月～１０月の間に評価した。血液中の好酸球のレベルは、病変症状スコアリングによる平均疾患症状尺度と相関した。病変症状スコアリングを実施例７に従って行った。実際に、病気の馬の血液中の好酸球数とＩＢＨ病変強度スコアの間に正の相関が見られ（Ｒ２＝０．９２２７、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）（図７Ｅ）、ＩＢＨ罹患馬を免疫化する方法における本発明の組成物及びそれらの使用は、ＩＢＨの治療に有益であることが示された。
二重盲検プラセボ対照無作為化試験ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ。疾患症状及び血中好酸球増加に対するワクチン接種の効果を評価するために、１０頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を、二重盲検プラセボ対照無作為化試験に登録した。ワクチン接種の前のＩＢＨシーズン（４月～１０月）中に、全ての馬についての隔週症状スコアリングを評価し、血中好酸球増加を、８月の初めに定量化した。その後のＩＢＨシーズンが始まる前に、０、２１及び４２日目に（２月／３月）、６頭のアイスランド馬に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβで免疫し、４頭のアイスランド馬にプラセボを投与した。１ｍｌのＰＢＳ中のワクチンを投与した。全ての注射を、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）と新たに（注入の約３０分前に）予備混合させて投与した。１２４日目に、全ての馬に追加免疫ワクチン接種を行い、抗体価及び好酸球数を、３月から１０月まで毎月測定した。さらに、病変スコアリングを隔週で評価した。また、馬の健康状態だけでなく、馬の寄生状態を３月及び１０月に分析した。
経過観察試験ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ。ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを用いる二重盲検プラセボ対照無作為化試験からの１０頭の馬を、次のシーズン２０１６に経過観察した。事前にワクチン接種した６頭の馬に、４週間隔で２月及び３月に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを２回追加免疫した。事前にプラセボを投与した４頭の馬に、０、２８、５６、及び８４日目に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβの能動免疫を与えた。全ての馬に、経過観察年にアジュバント不含の１ｍｌのＰＢＳでワクチンを投与した。抗体価及び好酸球数を、１月及び３月から１０月まで毎月測定した。さらに、病変スコアリングを隔週から毎月評価した。また、馬の健康状態だけでなく、馬の寄生状態を１月及び１０月に分析した。病変の重症度を４月～１０月まで経過観察した。Ｑβ（図７Ａ）及びｅＩＬ－５（図７Ｂ）に対する抗体価のタイムラインを、シーズン全体にわたって経過観察した。馬に、３週間隔で２月から始める３回の注射によるワクチン接種を、その後、最後の注射後約２ヶ月の時点で追加免疫を行った。しかしながら、最初にかなりの程度で変化した活性のある馬におけるｅＩＬ－５に対する確立された抗体価は、力価の点で追加免疫後の有効性を上回るほどの変動はなかった（図７Ｂ）。
その後の経過観察シーズンについては、試験を非盲検化し、全ての馬にワクチンを投与する半分クロスオーバー試験として続けた。詳細な試験レジメンは以下のとおりである：その後のＩＢＨシーズンが始まる前に、全てのプラセボ馬に、１月から始めて４週間隔で４回免疫し、前シーズンからの全てのワクチン馬に、２月から始めて４週間隔で２回の追加免疫を行った。経過観察の年に、全てのワクチン接種をミョウバンの非存在下で施した。
事前評価年２０１４年、最初の治療年２０１５年（二重盲検プラセボ対照無作為化試験）、及び２年目の治療年２０１６年（経過観察試験）における、４月から９月又は１０月までのプラセボ馬とワクチン接種馬それぞれを比較した病変スコア。ワクチン接種馬の８０％超（Ｖ１：１年目の試験及びＶ２：２年目の試験）は、治療年（複数可）中の病変スコアにおいて５０％及びそれ以上の改善を達成した。ワクチン接種馬（Ｖ１：１年目の試験及びＶ２：１年目及び２年目の試験）のほぼ２０％でさえ、治療年（複数可）中の病変スコアにおいて７５％及びそれ以上の改善を達成した（図７Ｆ）。プラセボグループでは、病変スコアが５０％又は７５％の改善に達成した馬はいなかった（図７Ｆ）。したがって、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンは、病変の重症度、ひいては、治療的に改善される疾患症状に有益な効果を有していた。
二重盲検プラセボ対照無作為化試験ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０。疾患症状及び血中好酸球増加に対するワクチン接種の効果を評価するために、３４頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を、二重盲検プラセボ対照無作為化試験に登録した。ワクチン接種の前のＩＢＨシーズン（２０１５年４月～１０月）中に、全ての馬について、毎月の症状スコアリングを評価し、血中好酸球増加をシーズン中のある時点で定量化した。その後のＩＢＨシーズンが始まる前に、０、２８、５６及び８４日目に（２０１６年１月～４月）、１８頭のアイスランド馬に４００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０で免疫し、１５頭のアイスランド馬にプラセボを投与した。アジュバント不含の１ｍｌのＰＢＳでワクチンを投与した。１２６日目に、全ての馬に、追加免疫ワクチン接種を行い、抗体価、好酸球数及び病変スコアを２０１６年の１月及び３月から１０月まで毎月測定した。
事前評価年２０１５年及び治療年２０１６年における、４月から９月又は１０月までのプラセボ馬とワクチン接種馬を比較した病変スコア。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチン接種馬の臨床スコア（黒実線）を、事前評価シーズン（黒の点線）及び同じシーズン（灰色の実線）からのプラセボ処置馬（灰色の線）と比較すると、強く減少することが見出された（図７Ｇ）。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチン接種馬における治療年と事前評価年の間の病変スコアの低下は、プラセボ処置馬と比較した場合、統計的に有意に大きくなることが見出された。また、ワクチン接種馬の４７％及び１６％が、治療年の間、病変スコアの５０％（及びそれ以上）並びに７５％（及びそれ以上）の改善をそれぞれ達成した（図７Ｈ）。プラセボグループでは、７５％低下に達した馬はおらず、わずか７％が、病変スコアの５０％低下の改善に達した（図７Ｈ）。したがって、ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンは、病変の重症度、ひいては、治療的に改善される疾患症状に有益な効果を有していた。
実施例７
皮膚炎症状病変スコアリング
アレルギー性皮膚炎症状スコアリングについては、病変が生じる場所（尾、たてがみ、腹、脇腹、顔、耳、及び足など）を記録する。各場所は、３つの部分：上、中央、下に分けられる。さらに、病変数に応じて、各場所を、軽度及び重症に分類する。どれくらい多くの部分が影響を受けているのか（上／中／下）及び場所あたりどれくらい多くの病変が見られるのか（軽度／重症）に応じて、１～４点をスコア化することができる（１点＝１つの部分が影響を受けている、病変軽度；４点＝全３つの部分が影響を受けている、病変重症）。
皮膚炎症状病変スコアリング
アレルギー性皮膚炎症状スコアリングについては、病変が生じる場所（尾、たてがみ、腹、脇腹、顔、耳、及び足など）を記録する。各場所は、３つの部分：上、中央、下に分けられる。さらに、病変数に応じて、各場所を、軽度及び重症に分類する。どれくらい多くの部分が影響を受けているのか（上／中／下）及び場所あたりどれくらい多くの病変が見られるのか（軽度／重症）に応じて、１～４点をスコア化することができる（１点＝１つの部分が影響を受けている、病変軽度；４点＝全３つの部分が影響を受けている、病変重症）。
また、これらの場所を、６つのさらなる性質：サイズ（直径）、血液、脱毛、鱗屑、かさぶた、及び苔癬化／腫れについて分類する。全てのこれらの性質についても、１～４点をスコア化することができる。サイズを、＜０．５ｃｍ（１点）、０．５≧ｘ＞１ｃｍ（２点）、１≧ｘ＞２ｃｍ（３点）、及び≧２ｃｍ（４点）に分ける。血液を、無傷の表皮（１点）、軽度（２点）、中程度（３点）、及び重度（４点）に分ける。脱毛を、軽度（１点）、中程度（２点）、重度（３点）、及び無毛（４点）に分ける。鱗屑を、なし（１点）、小さい、少数（２点）、中程度、中型（３点）、及び多い、大きい（４点）に分ける。かさぶたを、なし（１点）、小さい（２点）、半分（３点）、及び全部（４点）に分ける。苔癬化及び／又は腫れを、なし（１点）、軽度（２点）、中程度（３点）、及び重度（４点）に分ける。
さらに、シース又は乳房が膨潤した場合、最小５又は最大２０点：グレード１（５点）、グレード２（１０ポイント）、グレード３（１５点）、及びグレード４（２０点）にスコア化することができる。
最終的に全てのポイントを加算すると、アレルギー性皮膚炎症状スコアになる。
実施例８
掻痒スコアリング
各馬の訪問の期間中の掻痒スコアリング評価。身体の異なる場所での軽度、中程度及び重度の引っ掻きをスコア化する。身体の各部分を別々にスコア化する。さらに、軽度、中程度及び重度に同様に区別される首振りの強さをスコア化する。また、軽度、中程度及び重度に同様に区別される全体的な休みのない行動を判断する。軽度に１点、中程度に２点、及び重度に３点を与える。全てのポイントを加算すると、掻痒スコアが得られる。
掻痒スコアリング
各馬の訪問の期間中の掻痒スコアリング評価。身体の異なる場所での軽度、中程度及び重度の引っ掻きをスコア化する。身体の各部分を別々にスコア化する。さらに、軽度、中程度及び重度に同様に区別される首振りの強さをスコア化する。また、軽度、中程度及び重度に同様に区別される全体的な休みのない行動を判断する。軽度に１点、中程度に２点、及び重度に３点を与える。全てのポイントを加算すると、掻痒スコアが得られる。
実施例９
マウスアレルギー性皮膚炎モデル、マウスのワクチン接種、並びに抗体価の分析、皮膚上へのアレルゲン負荷時の皮膚における局所的なＩＬ－３１ ｍＲＮＡ発現、抗アレルゲンＩｇＥ及びＩｇＧレベル、並びに耳の膨張
Ａ．マウスアレルギー性皮膚炎モデル（改変アトピー性マーチモデル）
マウスを、モデルアレルゲンのオボアルブミン（Ｏｖａ）に対して感作させた。一般的なアレルギー性掻痒現象を強調するサシバエ属アレルゲンと無関係であること、ひいては、ＩＢＨと無関係であることを示すために、Ｏｖａを選択した。マウスがアレルギー性皮膚炎を発症するように、マウスに、最初に、０日目に、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌのミョウバン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１μｇのＯｖａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に１回負荷し、その後、テープを剥がした右耳の皮膚に２ｎｍｏｌ ＭＣ９０３（カルシポトリオール）中２００μｇのＯｖａを経皮（ｅ．ｃ．）経路によって局所的に負荷した。局所的な皮膚感作が、０（＝ワクチン接種プロトコルの２１日目）、２、４、６、８、及び１０日目に起きた。その後、マウスの左耳に、１７、１８、１９、及び２０日目に皮膚を介して２００μｇのＯｖａを負荷した。皮膚炎及び掻痒が発症した後、実施例７及び８に従ってスコア化し、負荷した左耳の耳膨張を、耳の厚さを測定することにより定量化した。また、負荷した耳におけるＩＬ－３１ ｍＲＮＡを２２日目にｑＰＣＲにより定量化した。また、ｏｖａに対するアレルギー状態を、２２日目に、血清中の抗ｏｖａ ＩｇＧ及びＩｇＥ抗体レベルによって定量化した。アレルギー性皮膚炎の実験にマウスの５グループ、ｎ＝６匹のマウスを含めた：グループ１には、ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；グループ２には、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；グループ３には、ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０の組み合わせでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；かつグループ４には、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰでワクチン接種するが、左耳にＰＢＳ対照負荷を与えた。
マウスアレルギー性皮膚炎モデル、マウスのワクチン接種、並びに抗体価の分析、皮膚上へのアレルゲン負荷時の皮膚における局所的なＩＬ－３１ ｍＲＮＡ発現、抗アレルゲンＩｇＥ及びＩｇＧレベル、並びに耳の膨張
Ａ．マウスアレルギー性皮膚炎モデル（改変アトピー性マーチモデル）
マウスを、モデルアレルゲンのオボアルブミン（Ｏｖａ）に対して感作させた。一般的なアレルギー性掻痒現象を強調するサシバエ属アレルゲンと無関係であること、ひいては、ＩＢＨと無関係であることを示すために、Ｏｖａを選択した。マウスがアレルギー性皮膚炎を発症するように、マウスに、最初に、０日目に、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌのミョウバン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１μｇのＯｖａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に１回負荷し、その後、テープを剥がした右耳の皮膚に２ｎｍｏｌ ＭＣ９０３（カルシポトリオール）中２００μｇのＯｖａを経皮（ｅ．ｃ．）経路によって局所的に負荷した。局所的な皮膚感作が、０（＝ワクチン接種プロトコルの２１日目）、２、４、６、８、及び１０日目に起きた。その後、マウスの左耳に、１７、１８、１９、及び２０日目に皮膚を介して２００μｇのＯｖａを負荷した。皮膚炎及び掻痒が発症した後、実施例７及び８に従ってスコア化し、負荷した左耳の耳膨張を、耳の厚さを測定することにより定量化した。また、負荷した耳におけるＩＬ－３１ ｍＲＮＡを２２日目にｑＰＣＲにより定量化した。また、ｏｖａに対するアレルギー状態を、２２日目に、血清中の抗ｏｖａ ＩｇＧ及びＩｇＥ抗体レベルによって定量化した。アレルギー性皮膚炎の実験にマウスの５グループ、ｎ＝６匹のマウスを含めた：グループ１には、ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；グループ２には、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；グループ３には、ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０の組み合わせでワクチン接種し、左耳にｏｖａ負荷を与えた；かつグループ４には、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰでワクチン接種するが、左耳にＰＢＳ対照負荷を与えた。
Ｂ．マウスのワクチン接種
マウスにおけるマウスＩＬ－５及び／又はＩＬ－３１に対する抗体を作るために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、０、１４及び２８日目に、１００μｌのＰＢＳ若しくはｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中２５又は５０μｇのｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰ及びｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０それぞれを皮下又は静脈内に注射した。組成物ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、Ｚｏｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２－３２００に記載されるのと同様の方法で、かつ本明細書に記載のｅＩＬ－５及びｅＩＬ－３１対応物と同様の方法で調製した。ｍＩＬ－３１（配列番号２８）及びｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号２９）それぞれを含む組成物ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を、ｅＩＬ－５及びｅＩＬ－３１対応物について本明細書に記載されるのと同様の方法で調製した。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの４１日目に採血した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
マウスにおけるマウスＩＬ－５及び／又はＩＬ－３１に対する抗体を作るために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、０、１４及び２８日目に、１００μｌのＰＢＳ若しくはｐＨ７．５の２０ｍＭのＮａ２ＰＯ４／２ｍＭ ＥＤＴＡ中２５又は５０μｇのｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰ及びｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０それぞれを皮下又は静脈内に注射した。組成物ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、Ｚｏｕ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（２０１０）３１９２－３２００に記載されるのと同様の方法で、かつ本明細書に記載のｅＩＬ－５及びｅＩＬ－３１対応物と同様の方法で調製した。ｍＩＬ－３１（配列番号２８）及びｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号２９）それぞれを含む組成物ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０を、ｅＩＬ－５及びｅＩＬ－３１対応物について本明細書に記載されるのと同様の方法で調製した。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの４１日目に採血した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
Ｃ．抗体価分析
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ又はｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ又は抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製したｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ又はｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ又は抗馬ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ及び／又はｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でワクチン接種したマウスからの４１日目の血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。マウス血清を、デルタＯＤ５０（ΔＯＤ５０）値としてブロットした。マウスにおけるワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－５及びＩＬ－３１に対する免疫寛容が克服されたことを示す（図８Ａ及び図８Ｂ）。ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβをワクチン接種したマウスは、約１：２０００の抗ＩＬ－５抗体価を確立した（図８Ａ、黒丸）。ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でワクチン接種したマウスは、約１：３００の抗ＩＬ－５抗体価を確立し（図８Ａ、灰色丸）、ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせワクチンを接種したマウスは、約１：１０００の抗ＩＬ－５抗体価を確立し（図８Ｂ、黒丸）、かつ約１：２００の抗ＩＬ－３１抗体価を確立した（図８Ｂ、灰色丸）。応答のピーク時の最大半分力価は約１：１，０００であった。
Ｄ．負荷耳のＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ転写
耳の皮膚生検を、－８０℃で、トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で保存し、全ＲＮＡをＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含むハイピュアＲＮＡ単離キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡに転写し、マウスＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｑＰＣＲにより定量化した。
耳の皮膚生検を、－８０℃で、トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で保存し、全ＲＮＡをＤＮアーゼＩ処理及び不活性化を含むハイピュアＲＮＡ単離キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて単離した。ＲＮＡを、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡに転写し、マウスＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベル及びハウスキーピングβアクチン遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｑＰＣＲにより定量化した。
Ｅ．マウスＩＬ－３１＆βアクチンｑＰＣＲ
ｍＩＬ－３１用の遺伝子特異的ＲＴ２ ｑＰＣＲプライマーアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）及びｍβアクチン用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧ－配列番号３０；リバースプライマー：ＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴ－配列番号３１）を用いる皮膚生検におけるマウスＩＬ－３１（ｍＩＬ－３１）マウスβアクチン（ｍβアクチン）の増幅。ＰＣＲを、ファストスタートユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
ｍＩＬ－３１用の遺伝子特異的ＲＴ２ ｑＰＣＲプライマーアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）及びｍβアクチン用の遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマー：ＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧ－配列番号３０；リバースプライマー：ＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴ－配列番号３１）を用いる皮膚生検におけるマウスＩＬ－３１（ｍＩＬ－３１）マウスβアクチン（ｍβアクチン）の増幅。ＰＣＲを、ファストスタートユニバーサルＳＹＢＲグリーンマスター（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ（グループ１）、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰ（グループ２）、ｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせ（グループ３）のいずれかをワクチン接種したｏｖａアレルギーマウスのｏｖａ負荷耳におけるマウスＩＬ－３１ ｍＲＮＡ発現レベルが示されている。第２のＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種グループ４に、ｏｖａの代わりにＰＢＳ対照で負荷した。ｍＩＬ－３１に対するワクチンを接種したマウスのｏｖａ負荷グループ、ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０のみを用いてワクチン接種したグループ１又はｍＩＬ－５－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせを用いてワクチン接種したグループ３のいずれかは、ｏｖａ負荷耳において低いｍＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベルを示した。ＰＢＳ対照で負荷したＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種グループ４のｍＩＬ－３１ ｍＲＮＡレベルと同等であった。対照的に、グループ２のｏｖａ負荷耳を有するＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種マウスは、ｍＩＬ－３１ ｍＲＮＡ発現の増加を示した。そのため、ｍＩＬ－３１に対するワクチン接種は、ｏｖａアレルゲン負荷時に、皮膚においてｍＩＬ－３１発現を効率的に低下させた（図８Ｃ）。
Ｅ．抗アレルゲン（Ｏｖａ）ＩｇＥ及びＩｇＧレベル
ＩｇＥ：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中の２．５％ミルク粉末でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化Ｏｖａ（希釈１：２５０）と室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。プレートを、再び、ＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
ＩｇＥ：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの抗マウスＩｇＥモノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中の２．５％ミルク粉末でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化Ｏｖａ（希釈１：２５０）と室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。プレートを、再び、ＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
ＩｇＧ：Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌの精製Ｏｖａ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス血清の３倍希釈液をスーパーブロックに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを、再び、ＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの発色液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の約２分後に、１ウェルあたり２５μｌの５％ Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度を、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００又はＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）にて４５０ｎｍで測定した。
免疫前血清及びｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０（グループ１）、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰ（グループ２及び４）、又はｍＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせ（グループ３）でさらにワクチン接種したｏｖａ感作マウスからの２２日目の血清（アレルギー性皮膚炎タイムラインの、実験の終点）を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。グループ１～３にはｏｖａアレルゲンで負荷し、グループ４には負荷耳にＰＢＳで負荷した。抗ｏｖａ ＩｇＧ（図８Ｄ）及び抗ｏｖａ ＩｇＥ（図８Ｅ）抗体価は、異なるグループのマウスのｏｖａアレルゲンに対するアレルゲン感作を示す。マウスの全てのグループは、ｏｖａに対するアレルギー性免疫応答を発症した（図８Ｄ＆８Ｅ）。
Ｆ．耳のｏｖａアレルゲン負荷時の耳の膨張
ｉ．ｐ．注射を用いたｏｖａ感作及びマウスの右耳における皮膚感作の後に、左耳にｏｖａアレルゲン負荷を行った。耳の膨張を、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２日目に、耳の厚さを測定することによって定量化した。１７日目（負荷の初日）と比較した耳の厚さの増加率を示す（図８Ｆ）。ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰに対してワクチンを接種し、ｏｖａ負荷を与えたグループ２は、負荷耳において耳の厚さの連続的な増加を示した（図８Ｆ、三角）。ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０単独（図８Ｆ、黒丸）、及びｍＩＬ－５Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせ（図８Ｆ、四角）をワクチン接種し、ｏｖａ負荷を与えたグループは、耳の厚さの増加から保護され、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種し、ＰＢＳ対照負荷を与えたグループ（点線）と同等の値を示した。そのため、ＩＬ－３１又はＩＬ－５又は両方の組み合わせのいずれかに対するワクチン接種は、皮膚感作及び負荷モデルにおいてモデルアレルゲンのｏｖａを用いた場合、アレルゲン負荷時の耳の膨張からマウスを保護した。
ｉ．ｐ．注射を用いたｏｖａ感作及びマウスの右耳における皮膚感作の後に、左耳にｏｖａアレルゲン負荷を行った。耳の膨張を、１７、１８、１９、２０、２１、及び２２日目に、耳の厚さを測定することによって定量化した。１７日目（負荷の初日）と比較した耳の厚さの増加率を示す（図８Ｆ）。ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰに対してワクチンを接種し、ｏｖａ負荷を与えたグループ２は、負荷耳において耳の厚さの連続的な増加を示した（図８Ｆ、三角）。ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０単独（図８Ｆ、黒丸）、及びｍＩＬ－５Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ＆ｍＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０組み合わせ（図８Ｆ、四角）をワクチン接種し、ｏｖａ負荷を与えたグループは、耳の厚さの増加から保護され、ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種し、ＰＢＳ対照負荷を与えたグループ（点線）と同等の値を示した。そのため、ＩＬ－３１又はＩＬ－５又は両方の組み合わせのいずれかに対するワクチン接種は、皮膚感作及び負荷モデルにおいてモデルアレルゲンのｏｖａを用いた場合、アレルゲン負荷時の耳の膨張からマウスを保護した。
Claims (26)
- （ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子であって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、前記コア粒子；及び
（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原であって、前記少なくとも１つの抗原が、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、前記少なくとも１つの抗原；
を含む組成物であって、
（ａ）及び（ｂ）が、二官能性クロスリンカー及び少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されており；
ウマ科（equine）哺乳動物の掻痒状態若しくはアレルギー状態から選択される状態又は障害の予防又は治療の方法における使用のためのものであり、前記状態又は障害は、アレルギー性皮膚炎と関連する掻痒である、組成物。 - 前記コア粒子が、組換えＶＬＰである、請求項１に記載の使用のための組成物。
- 有効量の前記組成物が、前記ウマ科（equine）哺乳動物に投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記状態又は障害が、ウマ科（equine）哺乳動物の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防又は治療ではない、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ウマ科（equine）哺乳動物は、馬である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、さらに、
（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子であって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、第２のコア粒子；及び
（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原であって、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原が、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、前記少なくとも１つの第２の抗原；
を含み、
（ｃ）及び（ｄ）が、二官能性クロスリンカー及び少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 - 前記第２のコア粒子が、組換えＶＬＰである、請求項８に記載の使用のための組成物。
- 前記ｅＩＬ－５抗原が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項８又は９に記載の使用のための組成物。
- 前記ｅＩＬ－５抗原が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項８又は９に記載の使用のための組成物。
- 前記ＶＬＰが、植物ウイルスに由来するか、又はＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ＶＬＰが、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、且つ前記ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰが、配列番号２４を含む組換えコートタンパク質を含むか、或いはそれからなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ＶＬＰが、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、且つ前記ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰが、配列番号２４からなる組換えコートタンパク質を含むか、或いはそれからなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＶＬＰポリペプチドを含むか或いはそれからなる、改変ＶＬＰであり、前記改変ＶＬＰポリペプチドが、
（ａ）ＶＬＰポリペプチド、及び
（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープ
を含み、
前記ＶＬＰポリペプチドが、
（ｉ）ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列及び前記ウイルスのコートタンパク質が、少なくとも９０％の配列同一性を示す、変異アミノ酸配列、
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 - 前記ＶＬＰが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、或いはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、
（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び
（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープ
を含み、かつ
前記ＣＭＶポリペプチドが、
（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）変異アミノ酸配列であって、前記変異アミノ酸配列及び前記ＣＭＶのコートタンパク質が、少なくとも９０％の配列同一性を示す、変異アミノ酸配列、
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。 - 前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換され、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域が、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する、請求項１６に記載の使用のための組成物。
- 前記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号１５若しくは配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が配列番号２７を含む、請求項１６又は１７に記載の使用のための組成物。
- 前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号１５若しくは配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記アミノ酸配列が配列番号２７を含む、請求項１６又は１７に記載の使用のための組成物。
- 前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列からなる、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物の前記投与が、前記投与前の前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状と比較して、前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する少なくとも１つのパラメータ又は症状を低下させる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記掻痒状態若しくは前記アレルギー状態と関連する前記少なくとも１つのパラメータ又は症状が、皮膚病変のレベル又は重症度グレード又は掻痒のレベルである、請求項２２に記載の使用のための組成物。
- 前記皮膚病変のレベル又は重症度グレードの前記低下が、症状病変スコアリング試験によって決定され、前記掻痒のレベルの前記低下は、掻痒スコアリング試験によって決定される、請求項２３に記載の使用のための組成物。
- 前記掻痒のレベルの前記低下が、前記ウマ科（equine）哺乳動物の身体の少なくとも１つの場所の引っ掻きの低下によって決定される、請求項２４に記載の使用のための組成物。
- 第１の組成物及び第２の組成物を含む組成物であって、
前記第１の組成物が、
（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子であって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、第１のコア粒子；及び
（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原であって、前記少なくとも１つの第１の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、前記少なくとも１つの第１の抗原；
を含み、
（ａ）及び（ｂ）が、二官能性クロスリンカー及び少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されており；
前記第２の組成物が、
（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子であって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、第２のコア粒子；及び
（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原であって、前記少なくとも１つの第２の抗原が、ウマ（equine）インターロイキン５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原が、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、少なくとも１つの第２の抗原；
を含み、
（ｃ）及び（ｄ）が、二官能性クロスリンカー及び少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して連結されている、組成物。
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