CN111448208B - 用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的il-31肽免疫原及其剂型 - Google Patents

用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的il-31肽免疫原及其剂型 Download PDF

Info

Publication number
CN111448208B
CN111448208B CN201880079547.1A CN201880079547A CN111448208B CN 111448208 B CN111448208 B CN 111448208B CN 201880079547 A CN201880079547 A CN 201880079547A CN 111448208 B CN111448208 B CN 111448208B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide immunogen
peptide
seq
canine
epitope
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880079547.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111448208A (zh
Inventor
王长怡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ubi Ip Holding Co
Original Assignee
Ubi Ip Holding Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ubi Ip Holding Co filed Critical Ubi Ip Holding Co
Publication of CN111448208A publication Critical patent/CN111448208A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111448208B publication Critical patent/CN111448208B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

本公开是关于用于治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的靶向白介素‑31(IL‑31)蛋白质部份的个别肽免疫原构建体。本公开也关于含有此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法，以及利用此肽免疫原构建体所产生的抗体。

Description

用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的IL-31肽免疫原及其剂型
本申请是要求了2017年12月11日提交的美国临时申请系列号62/597,130的权益的PCT国际申请，其通过引用以其整体并入本文。
【技术领域】
本公开是关于靶向白介素-31(IL-31)的肽免疫原构建体及其剂型，其作为用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的医药组合物。
【发明背景】
异位性皮肤炎(AD)被美国兽医皮肤专科医师学院项目小组定义为“具特殊临床表征的遗传倾向炎症搔痒过敏性皮肤病”(Olivry 2001)。项目小组还辨识出此疾病在犬类中与过敏原特异性IgE有关(Olivry 2001；Marsella&Olivry 2003)。伴随着继发性脱毛和红斑的严重搔痒对宠物主人来说是显著且相关的症状(美国8,790,651号专利)。
由于准确性差且与流行病学数据不一致，故异位性皮肤炎盛行率为未知，但是据估计占总犬数的10％(Marsella&Olivry 2003；Scott 2002；Hillier 2001)。全球约有450万只狗患有这种慢性且持续终生的疾病。发生率似乎在增加。品种和性别偏好被受到怀疑，但可能会因为地理区域而有很大差异(Hillier 2001；Picco 2008)。
涉及过敏性皮肤炎的潜在因素有很多，且对其了解甚少。食物中的成分(Picco，2008)和环境过敏原(例如跳蚤、尘螨、豚草、植物萃取物等)可能引发异位性皮肤炎。遗传因素也扮演重要角色。虽然没有确定的品种偏好，但某些遗传模式被认为增加了对异位性皮肤炎的易感性(Sousa&Marsella 2001；Schwartzman 1971)。
白介素-31(IL-31)是于2004年克隆出来的细胞因子。其主要是由活化的第二型T辅助(Th)细胞所产生(Dillon2004)，但其也在肥大细胞和巨噬细胞中产生。IL-31结合由IL-31受体A(IL-31RA)和抑瘤素M受体(OSMR)所组成的共受体(Dillon 2004 andBilsborough 2006)。受体活化通过JAK受体导致STAT磷酸化。在巨噬细胞、角质细胞和在背根神经节中已经显示了共受体的表达。最近，已经发现IL-31涉及皮肤炎、搔痒的皮肤损伤、过敏和呼吸道过度敏感。
利用抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞可立即地向上调节IL-31mRNA的表达(Dillon2004)。微阵列分析已显示IL-31引发某些趋化性基因，例如CXCL1、CLL17(胸腺和活化调节趋化因子(TARC))、CCL19(巨噬细胞炎症蛋白(MIP)3β)、CCL22(单核细胞衍生的趋化因子(MDC))、CCL23(MIP3)以及CCL4(MIPβ)(Dillon 2004)。
过度表达IL-31的转基因小鼠显现出皮肤炎症、搔痒症、严重的皮肤炎和脱毛(Dillon 2004)。向小鼠皮下注射IL-31引发炎症细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，并导致表皮增厚和皮肤棘皮症。在NC/Nga小鼠中，其具有由于自然原因导致的异位性皮肤炎(AD)，IL-31在皮肤损伤中过度表达且与搔痒相关(Takaoka2005；Takaoka2006)。此外，在鼠类模型中，已经显示IL-31诱发搔痒症快速发作(Raap2008)。
进一步的研究指出，IL-31于人类与异位性皮肤炎所引起的皮肤炎症和搔痒有关。在人类AD患者中，在皮肤损伤中的IL-31mRNA表达显著高于非损伤皮肤，并且在非损伤皮肤中的IL-31mRNA表达高于来自健康患者的正常皮肤(Sonkoly 2006)。另一项研究报导在AD患者皮肤中的CD45RO+(记忆)皮肤淋巴细胞抗原(CLA)阳性T细胞表达IL-31mRNA和蛋白质(Bilsborough 2006)。其也报导在患者皮肤或过敏性接触性皮肤炎的IL-31mRNA过度表达与IL-4和IL-13mRNA表现相关，而非与干扰素(IFN)-γmRNA表达相关(Neis 2006)。此外，在患有慢性自发性荨麻疹的人类患者中显示IL-31血消水平升高，且甚至高于患有AD的患者(Raap 2010)。此外，在人类中观察到AD严重程度与血清IL-31水平的相关性(Rapp 2008)。于异位性个体中，在IgE交联之后显示在肥大细胞中IL-31分泌增加，且如同对于金黄色葡萄球菌超抗原的反应。此外，已显示IL-31在人类结肠肌纤维母细胞刺激几种促发炎媒介物的产生，包括IL-6、IL-8、CXCL1、CC17和多种金属蛋白酶(Yagi 2007)。
针对环境过敏原的第I型过敏反应被认为是犬类AD的主要机制，且在AD患犬的皮肤损伤中Th2介导的细胞因子(例如IL-4)的水平增加(Nuttall 2002)。此外，炎症细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的浸润是皮肤损伤恶化的重要机制；趋化性基因(例如CCL17/TARC、CCR4和CCL28/黏膜相关上皮趋化因子(MEC))的过度表达有助于AD患犬皮肤损伤的恶化(Maeda 2005；Maeda 2002；and Maeda 2008)。
最近的证据表明，IL-31可能涉及促进过敏性哮喘的过敏性发炎和呼吸道上皮反应特点(Chattopadhyay 2007；and Wai 2007)。
这些观察结果支持IL-31在搔痒和过敏症状中扮演重要角色的假设。期望提供可引发针对IL-31的抗体的肽免疫原，其有助于治疗搔痒症状和/或过敏症状，例如犬类、猫类和/或人类的异位性皮肤炎。
参考文献：
1.BAMMERT，et al.，US Patent No.8.790.651(issued July 29，2014)
2.BILSBOROUGH，et al.，J Allergy Clin Immunol.，117(2)：418-25(2006)
3.CHATTOPADHYAY，et al.，JBiol Chem，282：3014-26(2007)
4.LENG，et al.，US Patent No.8,426,163(issued April 23，2013)
5.DILLON，et al.，Nat Immunol，5：752-60(2004)
6.HILLIER，Veterinary Immnunology and Immunopathology，81：147-151(2001)
7.MAEDA，et al.，Vet.Immunol.Immunopathol.，90，145-154；(2002)
8.MAEDA，et al.，Vet.Immunol.Immunopathol.，103，83-92；(2003)
9.MAEDA，etal.，J.Vet.Med.Sci.，70，51-55(2008)
10.MARSELLA&OLIVRY，Clinicsin Dermatology，21：122-133(2003)
11.NEIS，etal.，J.Allergy Clin.Immunol.，118，930-937(2006)
12.NUTTALL，et al.，Vet.Immunol.Immunopathol.，87，379-384(2002)
13.OLIVRY，et al.，Veterinary Immunology and Immunopathology，81：143-146(2001)
14.PICCO，et al.，VetDermatol.，19：150-155(2008)
15.RAAP，et al.，J A llergy Clin Immunol.，122(2)：421-3(2008)
16.RAAP，et al.，Exp Dermatol.，19(5)：464-6(2010)
17.SCHWARTZMAN，et al.，Clin.Exp.Immunol.，9：549-569(2971)
18.SCOTT，et al.，Canadian Veterinary Journal，43：601-603(2002)
19.SONKOLY，et al.，JAllergy Clin Immunol.，117：411-7(2006)
20.SOUSA，et al.，Veterinary Immunology and Immunopathology，81：153-157(2001)
21.TAKAOKA，et al.，Eur J.Pharmacol.，516，180-181(2005)
22.TAKAOKA，et al.，Exp.Dermatol.，15，161-167(2006)
23.WAI，et al.，Immunology，122，532-541(2007)
24.WALKER，et al.，US Patent No.6，361，966(issued March 26，2002)
25.YAGI，et al.，International Journal of Molecular Medicine，19(6)：941-946(2007)
26.“Atopic Dermatitis”，Wikipedia，The Free Encyclopedia，websiteaddress：en.wikipedia.org/wiki/Atopic_dermatitis(accessed December 8，2017).
27.“Interleukin 31”，Wikipedia，The Free Encyclopedia，website address：en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_31(accessed December8，2017).
【发明概述】
本公开是关于用于治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的靶向白介素-31(IL-31)蛋白质部份的个别肽免疫原构建体。本公开也关于含有此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法，以及利用此肽免疫原构建体所产生的抗体。
公开的肽免疫原构建体含有约25个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体含有来自犬类IL-31蛋白质(GenBank：BAH97742.1)部分的B细胞表位。犬类和人类IL-31蛋白质的全长氨基酸序列分别如表1中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。B细胞表位可通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对IL-31具有高特异性的抗体的产中生。公开的肽免疫原构建体可供患有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的动物作为免疫治疗使用。
肽免疫原构建体B细胞表位部份具有来自全长犬类IL-31蛋白质(SEQ ID NO：1)或全长人类IL-31蛋白质(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。在一些实施例中，B细胞表位具有含有如表1所示SEQ ID NO：1至13及93至98中任一项的序列。
本公开的肽免疫原构建体可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NO：14至42)。在某些实施方案中，异源性Th表位衍生自自然界的病原菌，例如白喉毒素(SEQ ID NO：18)、恶性疟原虫(SEQ ID NO：19)、霍乱毒素(SEQ IDNO：21)。在其他实施方案中，异源性Th表位为以单一序列或组合序列(例如SEQ ID NO：25、24和26)形式的衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位。
在一些实施方案中，肽免疫原构建体包含来自IL-31的B细胞表位，其通过任选的异源性间隔子连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施方案中，肽免疫原构建体包含具有来自IL-31的氨基酸序列的B细胞抗原位点(例如SEQ ID NO：1至13和93至98)，其通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位(例如SEQ ID NO：14至42)。在一些实施方案中，任选的异源性间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中，间隔子是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施方案中，肽免疫原构建体具有如表3所示SEQ ID NO：43至90及99至105的氨基酸序列。
本公开也关于包含IL-31肽免疫原构建的组合物。在“些实施方案中，公开的组合物包含超过一个的IL-31肽免疫原构建体。在某些实施方案中，组合物包含IL-31肽免疫原构建体的混合物(例如SEQ ID NO：43-90和99至105的任意组合)，以涵盖受试者的广泛遗传背景。相较于只包含单一肽免疫原构建体的组合物，包含肽免疫原构建体混合物的组合物在免疫接种后可导致较高百分比的反应率，以治疗搔痒症状和/或过敏症状，例如异位性皮肤炎。
本公开也关于用以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的医药组合物。在一些实施方案中，医药组合物包含公开的肽免疫原构建体，肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定化的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中，医药组合物包含佐剂，例如矿物盐，其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDEISA50V2、ISA51或ISA720的油包水乳液。
本公开也关于针对公开的IL-31肽免疫原构建的抗体。具体而言，当施用于受试者时，本公开的肽免疫原构建体可刺激高特异性抗体的产生，此抗体可与IL-31氨基酸序列(SEQ ID NO：1-13)交叉反应。利用肽免疫原构建体制造的高特异性抗体可与重组含有IL-31的蛋白质交叉反应。公开的抗体利用高特异性结合至IL-31，而没有多少(如果有的话)针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与使用用于肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。
本公开也包括利用公开的肽免疫原构建体和/或针对肽免疫原构建体的抗体以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的方法。在一些实施方案中，用以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物施用于宿主。在某些实施方案中，在此方法中所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在，此稳定化的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)通过静电结合所形成，其可与进一步补充的佐剂(任选为矿物盐或油类以作为佐剂)复合，用以施用于患有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的受试者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体施用于具有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)风险或已患病的宿主的给药方案、剂型和途径。
【附图说明】
图1A至图1B-具有结构和功能特性强调显示的犬类IL-31蛋白质(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列(图1A)和相对于全长犬类IL-31蛋白质于本公开中所使用抗原位点的序列比对和位置(图1B)。
图2-说明利用配制于佐剂ISA50V2中包含IL-31肽免疫原的剂型免疫接种豚鼠后抗IL-31多克隆抗体效价的图形。样品是在注射后(wpi)第3、6、9、12和15周进行分析。
图3A至图3D-用于在哺乳类动物细胞(Expi 293F)中表达位于羧基端具有His-tag的犬类IL-31的质粒图谱(图3A)与来自细胞裂解物和培养基利用抗His标签抗体探测的蛋白印记结果(图3B)。在12％Bis Tris SDS PAGE上进行分析的His标记的IL-31蛋白质表达和纯化的考马斯蓝染色结果(图3C)。以抗His标签抗体探测图3C中所示SDS-PAGE胶片的蛋白印记结果(图3D)。
图4A至图4B-说明利用IL-31抗体的体外IL-31引发的信号传导功能抑制测定的图式(图4A)。图4B中显示了该测定步骤的放大图。
图5A和5B-显示了建立体外功能分析的图，该体外功能分析测量利用由expi293细胞产生的犬类IL-31于犬类DH-82单核细胞中所引发的STAT3的磷酸化水平。图5A显示以剂量依赖方式利用犬类IL-31引发pSTAT3。图5B显示以时间依赖方式利用犬类IL-31引发pSTAT3。
图6A至6B-显示在初始免疫后(wpi)第12(图6A)和15周(图6B)所示利用衍生自公开的IL-31肽免疫原构建体的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31(1μg/mL)所引发的pSTAT3信号传导的抑制。
图7-显示在接种后(wpi)第15周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4751kb(SEQID NO：43)和p4752(SEQ ID NO：47)的抗-IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31所引发的pSTAT3信号传导的抑制图式。底部小图描述对重组犬类IL-31蛋白质(1μg/mL)所引发pSTAT信号传导的抑制(IC50)。
图8-说明在利用配制于佐剂ISA50V2中的包含IL-31肽免疫原(SEQ ID NO：63、68、71、76、80、84)的剂型免疫接种豚鼠后抗-IL-31多克隆抗体效价(Log10)的图式。在初始免疫后(wpi)第3、6、9、12和15周分析样品。
图9A至9B-显示在初始免疫后(wpi)第6和12周所示利用衍生自公开的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：63、68、71、76、80及84)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31(1μg/mL)所引发的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图9A)和抑制百分比(图9B)。
图10A至10B-显示在初始免疫后(wpi)第9和12周所示利用衍生自公开的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID No：63、68、71及64)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31(1μg/mL)所引发的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图10A)和抑制百分比(图10B)。
图11A至11B-显示在初始免疫后(wpi)第6、9和12周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31(1μg/mL)所引发的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图11A)和抑制百分比(图11B)。
图12-显示在初始免疫后(wpi)第6、9和12周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31(1μg/mL)所引发的pSTAT3信号传导的百分比磷酸化。底部小图描述对重组犬类IL-31蛋白质所引发pSTAT信号传导的抑制(IC50)。
图13-使用犬类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：84)的比格犬免疫流程。
图14-人类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：84)(Log10)对比格犬B细胞表位肽(2nd Ab：山羊抗-狗IgG HRP)的免疫原性的评估。
图15-以IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：84)(2nd Ab：兔抗-狗IgG HRP)初次免疫(DPI)后21和41天，狗血清抗体对rcIL-31的效价(Log10)。
图16-以IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：84)(2nd Ab：蛋白A/G-HRP)初次免疫(DPI)后21和41天，狗血清抗体对rcIL-31的效价(Log10)。
图17A至17B-显示使用狗免疫血清的纯化IgG于犬DH82单核细胞中犬IL-31诱导的pSTAT信号传导(代表性样品1至10)的磷酸化百分比(图17A)和抑制百分比(图17B)。
图18A至18B-显示使用Cytopoint(抗-IL-31mAb)于犬DH82单核细胞中犬IL-31诱导的pSTAT信号传导的磷酸化百分比(图18A)和抑制百分比(图18B)-IC50：3.21μg/m。
图19A至19C-图19A中提供了利用各种IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：83和85)免疫的豚鼠的免疫和采血方式示意图。6和15wpi豚鼠免疫血清的纯化IgG于犬DH82单核细胞中犬IL-31诱导的pSTAT信号传导的磷酸化百分比(图19B)和抑制百分比(图19C)。
图20A至20B-示各种人类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87、99、100和101)在豚鼠中的免疫原性(图20A)以及其LogEC50(图20B)。
图21-显示豚鼠针对IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87、99、100及101)的豚鼠免疫血清的IL-31反应性多克隆抗体对IL-31和IL-31Rα相互作用的抑制作用及各构建的IC50。
图22-显示针对IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87和101)的豚鼠免疫血清的IL-31反应性多克隆抗体可抑制IL-31诱导的U87MG细胞的STAT3磷酸化。
图23-显示豚鼠针对IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87和101)的豚鼠免疫血清的IL-31反应性多克隆抗体可抑制IL-31诱导的HaCaT细胞的IL-20表达。
图24A至24B-显示代表性人类IL-31肽构建体(SEQ ID NO：101)在各种多组分制剂中的免疫原性(图24A)以及各制剂的LogEC50(图24B)。
图25A至25B-显示豚鼠针对人类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)的豚鼠免疫血清的IL-31的反应性多克隆抗体在各制剂中对IL-31和IL-31α相互作用的抑制(图25A)及各制剂的IC50(图25B)。
图26-针对IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)的豚鼠免疫血清的IL-31反应性多克隆株抗体在各制剂中对HaCaT细胞IL-31诱导的IL-20表达的抑制。
【发明详述】
本公开是关于用于治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的靶向白介素-31(IL-31)蛋白质部份的个别肽免疫原构建体。本公开也关于含有此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法，以及利用此肽免疫原构建体所产生的抗体。
公开的肽免疫原构建体含有约25个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体含有来自犬类IL-31蛋白质(GenBank：BAH97742.1)部分的B细胞表位。犬类和人类IL-31蛋白质的全长氨基酸序列分别如表1中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。B细胞表位可通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对IL-31具有高特异性的抗体的产生。公开的肽免疫原构建体可供患有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的动物作为免疫治疗使用。
肽免疫原构建体的B细胞表位部份具有来自全长犬类IL-31蛋白质(SEQ ID NO：1)或全长人类IL-31蛋白质(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。在一些实施方案中，B细胞表位具有含有如表1所示SEQ ID NO：1至13及93至98中任一项的序列。
本公开的肽免疫原构建体可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NO：14至42)。在某些实施方案中，异源性Th表位衍生自自然界的病原菌，例如：白喉毒素(SEQ ID NO：18)、恶性疟原虫(SEQ ID NO：19)、霍乱毒素(SEQ IDNO：21)。在其他实施方案中，异源性Th表位为以单一序列或组合序列(例如SEQ ID NO：25、24和26)形式存在的衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位。
在一些实施方案中，肽免疫原构建体包含来自IL-31的B细胞表位，其通过任选的异源性间隔子连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施方案中，肽免疫原构建体包含具有来自IL-31的氨基酸序列的B细胞抗原位点位(例如SEQ ID NO：1至13和93至98)，其通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性Th表位(例如SEQ ID NO：14至42)。在一些实施方案中，任选的异源性间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中，间隔子是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施方案中，肽免疫原构建体具有如表3所示SEQ ID NO：43至90及95至105的氨基酸序列。
本公开也关于包含IL-31肽免疫原构建体的组合物。在一些实施方案中，公开的组合物包含超过一个的IL-31肽免疫原构建体。在某些实施方案中，组合物包含IL-31肽免疫原构建体的混合物体(例如SEQ ID NO：43-90及95至105的任意组合)，以涵盖受试者的广泛遗传背景。相较于只包含单一肽免疫原构建体的组合物，包含肽免疫原构建体混合物的组合物在免疫接种后可导致较高百分比的反应率，以治疗搔痒症状和/或过敏症状，例如异位性皮肤炎。
本公开也关于用以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的医药组合物。在一些实施方案中，医药组合物包含公开的肽免疫原构建体，肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定化的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中，医药组合物包含佐剂，例如矿物盐，其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 50V2、ISA 51或ISA720的油包水乳液。
本公开也关于针对公开的IL-31肽免疫原构建体的抗体。具体而言，当施用于受试者时，本公开的肽免疫原构建体可刺激高特异性抗体的产生，此抗体可与IL-31氨基酸序列(SEQ ID NO：1-13及93至98)交叉反应。利用肽免疫原构建体制造的高特异性抗体可与重组含有IL-31的蛋白质交叉反应。公开的抗体利用高特异性结合至IL-31，而没有多少(如果有的话)针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与使用用于肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。
本公开也包括利用公开的肽免疫原构建体和/或针对肽免疫原构建体的抗体以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的方法。在一些实施方案中，用以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物施用于宿主。在某些实施方案中，此方法中所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在，此稳定化的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)通过静电结合所形成，其可与进一步补充的佐剂(任选为矿物盐或油类以作为佐剂)复合，用以施用于患有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的受试者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体施用于具有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)风险或已患病之宿主的给药方案、剂型和途径。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的通过引用明确地将整体并入本文。
除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一个”、“一种”和“该”包含复数形式。类似地，单词“或”是意指包括“和”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更应被理解的是，用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述之公开的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非意指加以限制。
IL-31肽免疫原构建体
本公开提供肽免疫原构建体，其包含具有来自IL-31的氨基酸序列的B细胞表位，B细胞表位直接或是通过任选的异源性间隔子共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
本文使用术语“IL-31肽免疫原构建体”或“肽免疫原构建体”是指肽，其包含(a)具有来自犬类IL-31(SEQ ID NO：1)或人类IL-31(SEQ ID NO：2)的全长序列约15个或更多个氨基酸残基的B细胞表位；(b)异源性Th表位；以及(c)任选的异源性间隔子。
在某些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体可利用此式表示：
(Th)m-(A)n-(IL-31片段)-X
或
(IL-31片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-31片段)为具有来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2约15至约75个氨基酸残基的B细胞表位；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
于下文描述所公开IL-31肽免疫原构建体的各种组分。
a-IL-31片段
公开的肽免疫原构建体含有约25个或更多个总氨基酸，具有来自IL-31蛋白质约15个氨基酸。此肽免疫原构建体含有具有如表1所示SEQ ID NO：1氨基酸序列来自犬类IL-31蛋白质(GenBank：BAH97742.1)的B细胞表位，或具有如表1所示SEQ ID NO：2氨基酸序列来自人类IL-31蛋白质(GenBank：AAS86448.1)的B细胞表位。B细胞表位可通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原菌蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对IL-31具有高特异性的抗体的产生。公开的肽免疫原构建体可供患有搔痒症状和/或过敏症状(例如异位性皮肤炎)的受试者作为免疫治疗使用。
在一些实施方案中，B细胞表位具有含有如表1所示SEQ ID NO：1-13及93至98中任一项的序列。表1所示的IL-31片段为例示性的，且本公开包括分别为SEQ ID NO：1和2的全长犬类IL-31蛋白质或人类IL-31蛋白质的任何其他片段。
b.异源性T辅助细胞表位(Th表位)
本公开提供肽免疫原构建体，其包含来自IL-31的B细胞表位，B细胞表位直接或是通过任选的异源性间隔子共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
于IL-31肽免疫原构建体中的异源性Th表位可增强IL-31片段的免疫原性，其通过合理设计促进针对优化目标B细胞表位(即IL-31片段)的特异性高效价抗体的产生。
本文使用术语“异源性”是指衍生自并非IL-31野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，异源性Th表位为衍生自非天然存在于IL-31之氨基酸序列的Th表位(即Th表位对IL-31而言不是自体衍生的)。因为Th表位对IL-31而言是异源性的，当异源性Th表位共价连接至IL-31片段时，IL-31的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
本公开的异源性Th表位可为不具有天然存在于IL-31之氨基酸序列的任何Th表位。Th表位可具有衍生自任何物种(例如人类、猪、牛、狗、大鼠、小鼠、豚鼠等)的氨基酸序列。Th表位还可具有针对多种物种第2类MHC分子的混杂结合基序。在某些实施方案中，Th表位包含多个混杂的第2类MHC结合基序，以允许T辅助细胞的最大活化，从而导致免疫反应的启动和调节。优选的Th表位本身为非免疫原性的(即如果有的话，利用IL-31肽免疫原构建体所产生抗体很少是针对Th表位)，因此允许针对IL-31片段的目标B细胞表位的非常集中的免疫反应。
本公开的Th表位包括，但不限于，衍生自外来病原菌的氨基酸序列，如表2(SEQ IDNO：14至42)所例示。此外，Th表位包括理想化人工Th表位和组合的理想化人Th表位(例如SEQ ID NO：15和22-28)。异源性Th表位肽以组合序列(例如SEQ ID NO：23-26)呈现，包含基于特定肽的同源物的可变残基在肽骨架内于特定位置处作为代表的氨基酸残基的混合物。可以利用在合成过程期间在特定位置添加选定受保护的氨基酸的混合物，而非一个特定的氨基酸，于单一过程中合成组合肽的集合。此种组合异源性Th表位肽集合可允许对具有不同遗传背景之动物广泛的Th表位覆盖。异源性Th表位肽的代表性组合序列包含如表2所示的SEQ ID NO：23-26。本发明的Th表位肽对来自基因多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。
包含Th表位的IL-31肽免疫原构建体可于与IL-31片段串联的单一固相肽合成中同时产生。Th表位也可包括Th表位的免疫类似物。免疫Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物和任何这些Th表位的片段，其足以增强或刺激对IL-31片段的免疫反应。
Th表位肽的功能免疫类似物也是有效的，且被包括作为本发明的一部分。功能免疫Th类似物可包含于Th表位中从1至约5个氨基酸残基的保守取代、添加、删除和插入，其实质上未改变Th表位的Th刺激功能。如上文针对IL-31片段所描述的，可以利用天然或非天然氨基酸完成保守取代、添加和插入。表2辨识了Th表位肽的功能类似物的另一种变异物。具体而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NO：15和22是MvF4和MvF5的SEQ ID NO：25和27的功能类似物，因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(SEQ ID NO：15和22)或插入(SEQID NO：25和27)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列间的差异并不会影响包含于此些序列中之Th表位的功能。因此，功能免疫Th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NO：15、22、23、25和27)和衍生自肝炎表面蛋白HBsAg 1-3Ths(SEQID NO：24、26和28)的Th表位的多种版本。
在IL-31肽免疫原构建体中的Th表位可共价连接于IL-31肽的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，Th表位是共价连接至IL-31肽的氨基端。在其他实施方案中，Th表位是共价连接至IL-31肽的羧基端。在某些实施方案中，超过一个的Th表位共价连接至IL-31片段。当超过一个的Th表位连接至IL-31片段时，每一个Th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外，当超过一个的Th表位连接至IL-31片段时，Th表位可以任何顺序排列。例如，Th表位可连续地连接至IL-31片段的氨基端，或连续地连接至IL-31片段的羧基端，或当不同的Th表位共价连接至IL-31片段的羧基端时，Th表位可共价连接至IL-31片段的氨基端。Th表位相对于IL-31片段的排列并无限制。
在一些实施方案中，Th表位直接地共价连接至IL-31片段。在其他实施方案中，Th表位通过于下文进一步详细描述的异源性间隔子共价连接至IL-31片段。
c.异源性间隔子
公开的IL-31肽免疫原构建体任选地包含异源性间隔子，其将来自IL-31的B细胞表位共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
如上所述，术语“异源性”是指衍生自并非IL-31野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，当异源性间隔子共价连接至来自IL-31的B细胞表位时，IL-31的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸，因为间隔子对IL-31序列而言是异源性的。
间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的任何分子或化学结构。依据应用的不同，间隔子的长度或极性可能会有所不同。间隔子连接可通过酰胺或羧基连结，但是其他官能基也是可能的。间隔子可包括化学化合物、天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。
间隔子可为IL-31肽免疫原构建体提供结构特征。结构上，间隔子提供Th表位与IL-31片段的B细胞表位的物理分离。通过间隔子的物理分离可破坏通过将Th表位连接至B细胞表位所产生的任何人工二级结构。另外，通过间隔子的表位的物理分离可消除Th细胞和/或B细胞反应之间的干扰。此外，可设计间隔子以产生或修饰肽免疫原构建体的二级结构。例如，可设计间隔子以作为柔性铰链，用以增强Th表位和B细胞表位的分离。柔性铰链间隔子也可允许所呈现的肽免疫原与适当的T h细胞和B细胞之间更有效率的相互作用，以增强对Th表位和B细胞表位的免疫反应。编码柔性铰链的序列的例示见于通常富含脯胺酸的免疫球蛋白重链铰链区。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：92)提供了一种作为间隔子使用的特别有用的柔性铰链，其中Xaa是任何氨基酸，以天门冬胺酸为优选。
间隔子也可为IL-31肽免疫原构建体提供功能特征。例如，可设计间隔子以改变IL-31肽免疫原构建体的总电荷，其可影响肽免疫原构建体的溶解度。此外，改变IL-31肽免疫原构建体的总电荷可影响肽免疫原构建体与其他化合物和试剂结合的能力。如下文进一步详细讨论的，IL-31肽免疫原构建体可通过静电结合与高度带电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物。IL-31肽免疫原构建体的总电荷对于形成这些稳定的免疫刺激复合物是重要的。
可作为间隔子的化学化合物包括，但不限于，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(AEEA，mini-PEGI)、12-氨基-4，7，10-三氧杂十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-N赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-氨基己酸(Aca；6-氨基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。
IL-31肽免疫原构建体中的间隔子可共价连接在Th表位和IL-31肽的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，间隔子共价连接至Th表位的羧基端和IL-31肽的氨基端。在其他实施方案中，间隔子共价连接至IL-31肽的羧基端和Th表位的氨基端。在某些实施方案中，可使用超过一个的间隔子，例如，当在肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时。当使用超过一个的间隔子时，每个间隔子可以彼此相同或不同。此外，当肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时，可利用间隔子分隔开Th表位，间隔子可为相同或不同，利用间隔子将Th表位与B细胞表位分开。间隔子相对于Th表位或IL-31片段的排列没有限制。
在某些实施方案中，异源性间隔子是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在其他实施方案中，间隔子包含超过一个的天然存在或非天然存在的氨基酸。在具体实施方案中，间隔子为Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ IDNO：91)。
d.IL-31肽免疫原构建体的具体实施方案
在某些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体可利用以下式表示：
(Th)m-(A)n-(IL-31片段)-X
或
(IL-31片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-31片段)为具有来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2约15至约75个氨基酸残基的B细胞表位；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
在某些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体中的异源性Th表位具有选自SEQ IDNO：14-42中任一及其组合的氨基酸序列，如表2所示。在具体实施方案中，Th表位具有选自SEQ ID NO：22-28中任一项的氨基酸序列。在某些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体包含超过一个的Th表位。
在某些实施方案中，任选的异源性间隔子是选自Lys-、Gly、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)任一项及其组合。在具体实施方案中，异源性间隔子为ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。
在某些实施方案中，IL-31片段具有来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2约15至约65个氨基酸残基。在具体实施方案中，如表1所示，IL-31片段具有以SEQ ID NO：1-13及93至98作为代表的氨基酸序列。
在某些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体具有选自SEQ ID NO：43-90及99至105任一的氨基酸序列，如表3所示。
e.变异物、同源物和功能类似物
也可使用上述免疫原肽的变异物和类似物，其可诱导抗体和/或与抗体交叉反应，而此抗体是针对IL-31蛋白质的优选表位。类似物(包括等位基因、物种以及诱导变异物)，通常于一个、两个或几个位置上有别于天然存在的肽，通常是由于保守取代。类似物通常展现与天然肽至少80或90％的序列一致性。一些类似物还包括非天然氨基酸或在一个、两个或几个位置上的氨基端或羧基端氨基酸的修饰。
功能类似物的变异物可具有于氨基酸位置的保守取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除和/或其任意组合。
保守取代是指一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基所取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在一个特定实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少50％的一致性。在另一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少80％的一致性。在又一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少85％的一致性。在又一实施方案中，功能类似物与原始氨基酸序列具有至少90％的一致性。
变异物还包括磷酸化残基的变化。例如，变异物可包括在被磷酸化的肽内的不同残基。变异物免疫原性IL-31肽也可包括伪磷酸化肽。伪磷酸化肽是藉由用酸性氨基酸残基(例如谷氨酸和天冬氨酸)取代IL-31肽的一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基所产生。
组合物
本公开还提供包含公开的IL-31免疫原构建体的组合物。
a.肽组合物
包含公开的IL-31肽免疫原构建体的组合物可为液体或固体形式。液体组合物可包括不改变IL-31肽免疫原构建体的结构或功能特性的水、缓冲液、溶剂、盐和/或任何其他可接受的试剂。肽组合物可含有一种或多种公开的IL-31肽免疫原构建体。
b.医药组合物
本公开还关于包含公开的IL-31肽免疫原构建体的医药组合物。
医药组合物可含有药学上可接受的递送系统中的载体和/或其他添加剂。因此，医药组合物可含有IL-31肽免疫原构建体的药学上有效剂量以及药学.上可接受的载体、佐剂和/或其它赋形剂(例如稀释剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂等)。
医药组合物可含有一种或多种佐剂，其作用是加速、延长或增强针对IL-31肽免疫原构建体的免疫反应，而本身不具有任何特异性抗原作用。医药组合物中使用的佐剂可包括油、油乳液、铝盐、钙盐、免疫刺激复合物、细菌和病毒衍生物、仿病毒颗粒(virosomes)、碳水化合物、细胞因子、聚合物微粒。在某些实施方案中，佐剂可选自明矾(磷酸铝钾)、磷酸铝(例如)、氢氧化铝(例如)、磷酸钙、弗氏不完全佐剂(IFA)、弗氏完全佐剂、MF59、佐剂65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、单磷酸脂质A(MPL)、QuilA、QS21、ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂质体、磷脂质、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、亲脂性磷脂质(脂质A)、γ菊糖、藻类菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)，以及其他佐剂和乳化剂。
在一些实施方案中，医药组合物含有MontanideTM ISA 51(由植物油和二缩甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物，用以制造油包水乳液)、80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或其任意组合。在其他实施方案中，医药组合物是以Emulsigen或Emulsigen D作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳液。
医药组合物还可包括药学上可接受的添加剂或赋形剂。例如，医药组合物可含有抗氧化剂、黏结剂、缓冲剂、增积剂、载剂、螫合剂、着色剂、稀释剂、崩散剂、乳化剂、填充剂、胶化剂、pH缓冲剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂等。
医药组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外，可配制医药组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同施用以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有通常知识者很容易判定此种递送系统。
医药组合物可以以液体溶液或悬浮液型式配制成注射剂。含有IL-31肽免疫原构建体的液体载体也可在注射前制备。医药组合物可利用任何适合的用法施用，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等，并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施方案中，可配制医药组合物供静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。也可制备适用于其它给药方式的医药组合物，包括口服和鼻内应用。
医药组合物也可以适合的剂量单位形式配制。在一些实施方案中，医药组合物含有每公斤体重约0.5μg至约1mg的IL-31肽免疫原构建体。医药组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，包括施用方式、靶点、患者的生理状态、患者是人类或动物、施用的其它药物，以及处理是供预防还是治疗。通常，患者是人类，但也可治疗包括转基因哺乳类动物的非人类哺乳类动物。当以多剂量递送时，医药组合物可以方便地分成每个剂量单位形式的适当量。施用的剂量取决于治疗领域众所周知的受试者的年龄、体重和一般健康状况。
在一些实施方案中，医药组合物含有超过一种的IL-31肽免疫原构建体。含有超过一种IL-31肽免疫原构建体的混合物的医药组合物允许协同性增强构建体的免疫效力。含有超过一种IL-31肽免疫原构建体的医药组合物可在更大的遗传群体中更为有效，这是由于广泛的第2类MHC覆盖，因此提供针对IL-31肽免疫原构建体的经改善的免疫反应。
在一些实施方案中，医药组合物含有选白SEQ ID NO：43-90及99至105的IL-31肽免疫原构建体(表3)，以及其同源物、类似物和/或组合。在具体实施方案中，医药组合物含有选自SEQ ID NO：43-90及99至105(表3)的IL-31肽免疫原构建体，以及其任意组合。
含有IL-31肽免疫原构建体的医药组合物可用以于施用后在宿主中引发免疫反应并产生抗体。
c.免疫刺激复合物
本公开也关于含有与CpG寡核苷酸形成免疫刺激复合物的IL-31肽免疫原构建体的医药组合物。此种免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物呈微粒形式，其可有效地将IL-31肽免疫原呈现给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外施用的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成w/o乳液形式，作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液，用于在肠胃外施用后将IL-31肽免疫原有效递送至宿主免疫系统的细胞。
稳定化的免疫刺激复合物可藉由通过静电结合将IL-31肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定化的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入医药组合物中。
在某些实施方案中，将IL-31肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份，其于范围为5.0至8.0的pH下带有正电荷。IL-31肽免疫原构建体或构建体的混合物的阳离子部份的净电荷计算是依据，每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)带有+1电荷，每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)带有-1电荷，以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在IL-31肽免疫原构建体中的阳离子部份的电荷相加，并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。优选地，肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔子。在某些实施方案中，当间隔子序列为(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)时，IL-31肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。
如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的pH下带有负电荷的任何分子。在某些实施方案中，阴离子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的净负电荷计算是依据，在寡聚合物中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子，CpG基序的重复数在1至10的范围内。优选地，CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基，CpG基序的重复数在3至8的范围内。
更优选地，阴离子型寡核苷酸可以式5′X1CGX2 3′表示，其中C和G是未甲基化的；且X1是选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)组成的组；且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子型寡核苷酸可以式5′(X3)2CG(X4)23′表示，其中C和G是未甲基化的；且X3是选自由A、T或G组成的组；且X4是C或T。
所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式，其大小通常在1-50微米的范围内，且是许多因素(包括相互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和体内特异性免疫反应的向上调节的优点。此外，稳定化的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备医药组合物。
抗体
本公开还提供利用IL-31肽免疫原构建体所引发的抗体。
本公开IL-31肽免疫原构建体包含IL-31片段、异源性Th表位，以及任选的异源性间隔子，当施用于宿主时IL-31肽免疫原构建体可引发免疫反应和抗体的产生。IL-31肽免疫原构建体设计可破坏针对自体IL-31的免疫耐受，并引发可识别构型表位(而非线性表位)的位点特异性抗体的产生。
由IL-31肽免疫原构建体产生的抗体可识别并结合形式为单体、二聚体、三聚体和寡聚体的IL-31。
利用本发明IL-31肽免疫原构建体免疫的动物产生的免疫反应证实构建体具有产生与IL-31反应的有效的定点抗体(site-directed antibodies)的能力。
方法
本公开还涉及用以制备和使用IL-31肽免疫原构建体、组合物和医药组合物的方法。
a.IL-31肽免疫原构建体的制造方法
本公开的IL-31肽免疫原构建体可利用普通技术人员所熟知的化学合成方法加以制备(参见例如Fields et al.，Chapter 3 in Synthetic Peptides：A User’s Guide，ed.Grant，W.H.Freeman&Co.，New York，NY，1992，p.77)。IL-31肽免疫原构建体可利用自动化美利弗德(Merrifield)固相合成法来合成，利用侧链受保护的氨基酸，以t-Boc或F-moc化学保护α-NH2，在例如应用生物系统肽合成仪430A或431型(Applied BiosystemsPeptide Synthesizer Model 430A或431)上进行。包含Th表位的组合文库肽的IL-31肽免疫原构建体的制备可通过提供用于在给定可变位置进行偶联的替代性氨基酸的混合物而达成。
在期望的IL-31肽免疫原构建体组装完成后，依照标准程序处理树脂，将肽从树脂上切下，并将氨基酸侧链上的官能基切除。可利用HPLC纯化游离的肽，并利用例如氨基酸分析或测序以描述生化特性。肽的纯化和表征方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的。
可以控制和确定通过此化学过程所产生的肽的质量，且结果是IL-31肽免疫原构建体的再现性、免疫原性和产量可以获得保证。通过固相肽合成的IL-31肽免疫原构建体的制造的详细描述显示于实施例1中。
已经发现允许保留期望免疫活性的结构变异范围比起允许保留小分子药物特定药物活性或与生物来源药品共同产生的大分子中存在期望活性和不期望毒性的结构变异范围更具包容性。因此，与期望肽具有相似的色谱分析和免疫学特性的肽类似物，不论是刻意设计或因合成过程错误而无法避免地作为删除序列副产物的混合物产生的，其通常如经纯化的期望的肽制剂具有相同的效果。只要建立严格的QC程序，以监控制造过程与产品评估过程，确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性，则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、载体和/或宿主细胞的重组DNA技术来制备IL-31肽免疫原构建体。因此，编码IL-31肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的核酸分子也包括在本公开中作为本发明的一部分。类似地，包含核酸分子的载体(包括表达载体)以及含有载体的宿主细胞也包括在本公开中作为本发明的一部分。
各种例示性实施方案也包括制造IL-31肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的方法。例如，方法可包括在表达肽和/或类似物的条件下培养宿主细胞的步骤，宿主细胞包含含有编码IL-31肽免疫原构建体和/或其免疫功能类似物的核酸分子的表达载体。较长的合成肽免疫原可利用公知的重组DNA技术来合成。这些技术可于具有详细实验计划的众所周知的标准手册中加以提供。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列反向翻译以获得编码氨基酸序列的核酸序列，优选地利用对于其中具有待表达基因的生物体来说最适合的密码子。接下来，通常通过合成编码肽和任何调节因子(如有必要的话)的寡核苷酸以制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体内并转染到宿主细胞中。然后在适合所选表达系统和宿主的合适条件下表达肽。利用标准方法纯化肽并描述其特性。
在一些实施方案中，IL-31肽免疫原构建体可以在允许脂化的特定大肠杆菌菌株中表达以制备IL-31脂蛋白，如美国第8,426,163号专利中所述，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，使用的大肠杆菌菌株对由外源蛋白质(特别是膜蛋白)过量表达所引发的毒性作用具有抗性。这种大肠杆菌菌株可以利用美国第6,361,966号专利所描述的方法而被鉴定/产生，其通过引用整体并入本文。能够产生脂化形式的脂蛋白的大肠杆菌菌株的实例包括，但不限于，C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)和C2014(DE3)(NCIMB 40884)。可以通过常规重组技术在上述的一种大肠杆菌菌株中表达IL-31的脂化形式。简而言之，可通过例如PCR扩增从其天然来源获得编码IL-31的DNA片段，并任选地进行修饰以优化在大肠杆菌中的密码子使用。然后将DNA片段插入大肠杆菌表达载体中以产生表达质粒。优选地，由强启动子(例如T7、T5、T3或SP6)驱动IL-31脂蛋白的表达，其可例如通过IPTG加以诱导。然后将表达质粒引入选择的大肠杆菌菌株中，并且在对于蛋白质表达合适的条件下培养阳性转化体。因此可从大肠杆菌细胞中分离出表达的脂蛋白并通过本领域已知的方法(例如利用抗脂蛋白抗体进行免疫印记法或质谱分析)证实其脂化状态。
b.免疫刺激复合物的制造方法
各种例示性实施方案还包括制造包含IL-31肽免疫原构建体和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激复合物的方法。稳定化的免疫刺激复合物(ISC)衍生自IL-31肽免疫原构建体的阳离子部份和聚阴离子CpG ODN分子。自行组装系统是由电荷的静电中和所驱动。IL-31肽免疫原构建体的阳离子部分对阴离子寡聚合物的摩尔电荷比例的化学计量决定缔合的程度。IL-31肽免疫原构建体和CpG ODN的非共价静电结合是完全可再现的过程。此肽/CpG ODN免疫刺激复合物聚集体有助于呈现至免疫系统中“专业的”抗原呈现细胞(APC)，因此可进一步增强复合物的免疫原性。在制造过程中，可轻易地表征此些复合物的特征以控制质量。肽/CpG ISC在体内具有良好的耐受性。设计这种包含CpG ODN和IL-31片段衍生的肽免疫原构建体的新颖微粒系统，以利用与CpG ODN使用相关的广义B细胞促有丝分裂(mitogenicity)，但促进平衡的Th-1/Th-2型反应。
在公开的医药组合物中的CpG ODN在由相反电荷静电中和所介导的过程中100％结合至免疫原，导致微米大小的微粒的形成。微粒形式允许来自CpG佐剂常规使用的CpG剂量的显著减少，不利的先天性免疫反应的可能性更低，且促进包括抗原呈现细胞(APC)在内的替代性免疫原处理途径。因此，此种剂型在概念上是新颖的，且通过替代的机制藉由促进免疫反应的刺激而提供潜在的优点。
c.医药组合物的制造方法
各种例示性实施方案还包括含有IL-31肽免疫原构建体的医药组合物。在某些实施方案中，医药组合物是利用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。
为了使医药组合物可被广大群体所使用，且避免IL-31聚集也成为施用目标的一部分，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在临床试验中对于许多剂型而言在人类使用油包水乳液，但基于其安全性，明矾仍然是制剂中使用的主要佐剂。因此，明矾或其矿物盐磷酸铝(ADJUPHOS)经常作为制剂中的佐剂供临床应用。
其他佐剂和免疫刺激剂包括3De-O-酰化单磷酰脂A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。此种佐剂可以与或不与其他特定的免疫刺激剂一起使用，免疫刺激剂例如胞壁酰肽(例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1′-2′二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-isoglu-L-A1a-二棕榈酰丙氨酰(DTP-DPP)TheramideTM)，或其他细菌细胞壁成份。水包油乳液包含MF59(参见Van Nest等人的专利中请案WO 90/14837，其通过引用整体并入本文)，包含5％角鲨烯、0.5％Tween 80，以及0.5％Span 85(任选含有不同量的MTP-PE)，利用微射流机配制成次微米颗粒；SAF，包含10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩涡震荡以产生大颗粒乳液；以及RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem，Hamilton，Mont.)，其包含2％角鲨烯、0.2％Tween 80，以及一种或多种的细菌细胞壁成份，细菌细胞壁成份选自由单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)组成的群，优选为MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐剂包含弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)，以及细胞因子(例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)，以及肿瘤坏死因子(TNF))。
佐剂的选择取决于含有佐剂的免疫原制剂的稳定性、给药途径、给药计划、佐剂对接种疫一苗的物种的效力，且在人类是指已经被相关监管机构批准或可批准用于人类给药的药学上可接受的佐剂。例如单独明矾、MPL或弗氏不完全佐剂(Chang et al.，AdvancedDrug Delivery Reviews 32：173-186(1998)，其通过引用整体并入本文)或适合人类施用的其任选地所有组合。
组合物可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制供动物或人类给药的医药组合物的载体。选择稀释剂以免影响此结合的生物活性。此种稀释剂的范例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和汉克溶液。此外，医药组合物或剂型还可包含其他载体、佐剂或无毒的，非治疗性的，非免疫原性的稳定剂等。
医药组合物还可包括大的缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多醣类(例如甲壳素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如胶乳功能化琼脂糖(latex functionalizedsepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物，以及脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可作为免疫刺激剂(即佐剂)。
本发明的医药组合物可进一步包含合适的递送载体。合适的递送载体包括，但不限于，病毒、细菌、可生物降解的微球体、微粒、纳米粒子、脂质体、胶原蛋白微球和螺旋体(cochleates)。
d.医药组合物的使用方法
本公开也包括使用包含IL-31肽免疫原构建体的医药组合物的方法。
在某些实施方案中，包含IL-31肽免疫原构建体的医药组合物可用以治疗和/或预防搔痒症状和/或过敏症状，例如异位性皮肤炎。
具体实施例
(1)一种IL-31肽免疫原构建体，其可以由以下式表示：
(Th)m-(A)n-(IL-31片段)-X
或
(IL-31片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔子；
(IL-31片段)为具有来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2约15至约75个氨基酸残基的B细胞表位；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
m为1至约4；以及
n为0至约10。
(2)依据(1)的IL-31肽免疫原构建体，其中IL-31片段选自由SEQ ID NO：I-13及93至98组成的组。
(3)依据(1)或(2)任一项的IL-31肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位选自由SEQID NO：14-42组成的组。
(4)依据(1)的IL-31肽免疫原构建体，其中肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO：43-90及99至105组成的组。
(5)一种IL-31肽免疫原构建体，其包含：
包含来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的全长IL-31蛋白质序列约15至约75个氨基酸残基的B细胞表位；
包含选自由SEQ ID NO：14-42组成的组的氨基酸序列的T辅助细胞表位；以及
选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)组成的组的任选的异源性间隔子，
其中B细胞表位是直接或通过任选的异源性间隔子共价连接至T辅助细胞表位。
(6)(5)的IL-31肽免疫原构建体，其中B细胞表位选自由SEQ ID NO：1-13及93至98组成的组。
(7)(5)的IL-31肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位选自由SEQ ID NO：14-42组成的组。
(8)(5)的IL-31肽免疫原构建体，其中任选的异源性间隔子为(α，ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。
(9)(5)的IL-31肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是共价连接至B细胞表位的氨基端。
(10)(5)的IL-31肽免疫原构建体，其中T辅助细胞表位是通过任选的异源性间隔子共价连接至B细胞表位的氨基端。
(11)一种包含依据(1)至(4)任一项的肽免疫原构建体的组合物。
(12)一种医药组合物，其包含：
a.依据(1)至(4)任一项的肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
(13)(12)的医药组合物，其中
a.IL-31肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO：43至90及99至105组成的组；以及
b.IL-31肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
(14)一种分离的抗体或其表位结合片段，其特异性地结合至依据(1)至(10)中任一项的IL-31肽免疫原构建体的B细胞表位。
(15)依据(14)的分离抗体或其表位结合片段结合至IL-31肽免疫原构建体。
(16)一种分离的抗体或其表位结合片段，其特异性地结合至依据(1)至(10)任一项的IL-31肽免疫原构建体的B细胞表位。
(17)一种包含依据(14)至(16)任一项的分离的抗体或其表位结合片段的组合物。
实施例1.IL-31相关肽的合成及其剂型的制备
a.IL-31片段
描述了包含在IL-31肽免疫原构建体开发计划中用以合成专门设计的IL-31片段的方法。以小规模量合成的肽用于血清学分析、实验室试验和田间试验，其可用于分析医药组合物。为了筛选和选择最佳肽构建体供有效IL-31肽免疫原构建体的使用，设计了包含具有长度为约15至约75个氨基酸的序列的大量IL-31相关抗原性肽(表1)。
使用来自全长犬类IL-31(SEQ ID NO：1)(图1A)和人类IL-31(SEQ ID No：2)蛋白质的氨基酸序列。在表1中鉴定了在各种血清学测定中用于表位鉴定的IL-31片段(SEQ IDNO：3-13及93至98)，并且在图1B中显示IL-31片段对全长序列的相对序列比对。将选择的IL-31片段(SEQ ID NO：3-13及93至98)通过合成方式连接至精心设计的T辅助细胞(Th)表位制成IL-31肽免疫原构建体，此T辅助细胞表位衍生自病原菌蛋白质，包括被鉴定于表2中的和(分别为SEQ ID NO：26和25)。T辅助细胞表位被以单一序列或组合文库形式使用，以增强其各自IL-31肽免疫原构建体的免疫原性。
在表3中鉴定了具代表性的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：43-90及99至105)。利用鉴定的肽编码于表3中显示了被合成并评估的IL-31肽免疫原构建体。
b.典型的肽合成
用于供抗IL-31抗体检测和/或测量之的免疫原性研究或相关血清学测试的肽通常是在应用生物系统肽合成仪430A、431和/或433型上利用F-moc化学小规模合成。每一个肽是通过在固相载体上的独立合成所制备，在三官能基氨基酸的氨基端与侧链保护基团具有F-moc保护。将完整的肽从固相载体上切下，并利用90％三氟乙酸(TFA)移除侧链保护基团。利用基质辅助雷射脱附游离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)评估合成的肽以确定正确的氨基酸组成。也利用反相HPLC(RP-HPLC)评估各个合成肽以确认产物的合成样态与浓度。尽管严格控制合成过程(包括逐步地监测偶合效率)，由于在延长循环中某些意外事件，包括氨基酸的插入、删除、取代及提前终止，仍可能产生肽类似物。因此，合成产物一般包括多种肽类似物与目标肽。尽管包括这些非预期的肽类似物，但最后的合成肽产物仍可用作免疫应用，包括免疫诊断(作为抗体捕捉抗原)与医药组合物(作为肽免疫原)。一般来说，只要开发严格的QC程序来监测制造过程及产品质量评估程序，以确保使用这些肽之的最终产物的再现性与有效性，此肽类似物，包括刻意设计或合成程序中产生的副产物混合物，通常可如欲求期望肽的纯化产物同样有效。可利用客制的自动肽合成仪UBI2003或类似机型以15mmole至150mmole的规模合成数百至数千克的大量肽。对于供临床试验的之最终医药组合物使用的活性成分，可利用预备的RP-HPLC于浅洗脱梯度下纯化IL-31肽构建体，利用MALDI-TOF质谱仪确定氨基酸组成，并以氨基酸分析与RP-HPLC评估纯度与一致性。
实施例2.豚鼠的IL-31肽免疫原构建体免疫接种以进行免疫原性评估
a.动物
使用体重为300-350g的豚鼠进行免疫以评估代表性犬类IL-31肽免疫原构建体(SEQ I D NO：43、47、51、55和59)的免疫原性。如表4所示，将15只豚鼠进行分组，每个组别3只动物，并且利用400μg肽进行初始免疫，然后在初始免疫后(wpi)第3、6、9和12周进行4次100μg的加强免疫。在0、3、6、9、12和15wpi收集血液样品以测定抗-IL-31抗体的效价和相应免疫血清中存在的抗体的其它功能特性。
b.剂型
用于免疫接种的制剂含有以下物质：
1.400μg的IL-31肽免疫原构建体
2.肽∶CpG比例为0.7∶1的CpG
3.0.2％TWEEN80
c.血清抗IL-31抗体的效价测定(利用ELISA)
根据以下方案评估由IL-31肽免疫原构建体所引发的血清抗IL-31抗体的效价测定：
利用配制于pH9.6的50mM 1μg/ml碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中浓度为0.2μg/0，1mL/孔洞的犬类IL-31重组蛋白(rcIL-31)(50ng/孔洞)或IL-31B表位肽(SEQ ID NO：3-13及93-98)以100μl体积于37℃下作用1小时以涂覆96孔盘的孔洞。
将rcIL-31涂覆的孔洞与200μl含有1％BSA的PBS于37℃下作用1小时以阻断非特异性蛋白质的结合，随后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞三次并干燥。将100μl来自经免疫的豚鼠的连续稀释血清样品加至各孔洞中，并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS清洗孔洞5次并干燥。将配制于含有1％BSA和0.05％Tween 20的PBS中具有最佳稀释浓度的100μl过氧化物酶标记的山羊抗豚鼠IgG加至各孔洞中，并在37℃下反应1小时。反应后，利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞六次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm处的吸光值。
为了测定接受基于IL-31肽的疫苗制剂的豚鼠中的抗体效价，从1∶100起进行血清的10倍连续稀释，供代表性标靶“IL31”B细胞表位肽的起始筛选使用，利用Log10表示效价。为了进一步分析血清与重组犬类IL31的交叉反应，在ELISA上进行从1∶100至1∶54248800的血清的2倍连续稀释，并将效价表示为Log EC50。
d.结果
表5显示来自利用针对标靶IL31 B细胞表位肽(SEQ ID NO：43、47、51、55及59)的各自效价的免疫原性评估结果。
表6和图2显示针对每种IL-31肽免疫原构建体的对重组犬类IL-31的抗体效价(Log EC50)。
所设计的犬类IL-31肽免疫原构建体具有高免疫原性，其中SEQ ID NO：3至7所覆盖的IL-31区域AA90-AA144(SEQ ID NO：8)在3wpi一次给药可引发高效价抗体。所设计的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：43、47、51、55及59)引发的抗体对犬rIL-31具有高交叉反应性。
实施例3.用于生物分析的犬类IL-31的生产、纯化和特性鉴定
a.表达构建体
通过利用NCBIs基因组资源(website：ncbi.nlm通过利用NCBIs基因组资源(website：ncbi.n1m.nih.gov)鉴定犬类IL-31的序列。利用含有羧基端6-His标签的全长犬类IL-31基因产生表达构建体以用于检测和纯化(图3A和图3B)。将确认过序列的质粒转染至Expi293细胞中，且将表达的IL-31分泌至培养基中。在转染72小时后收集培养基，并使用镍钴树脂进行重组蛋白的纯化。在含有分泌形式IL-31的培养基与树脂结合后，利用体积为10倍管柱体积以内的洗涤缓冲液(pH数值为8.0的50mM Tris缓冲液内含500mM氯化钠和20mM咪唑)洗涤管柱三次。然后利用体积为5倍管柱体积的洗脱缓冲液(pH数值为8.0的50mMTris缓冲液内含500mM氯化钠和250mM咪唑)洗脱重组IL-31。通过SDS-PAGE分析洗脱部分，并利用抗His抗体探测蛋白印记结果。
b.结果
在12％Bis Tris SDS PAGE上进行His标记IL-31蛋白质表达和纯化的考马斯蓝染色(图3C)。利用抗His标记抗体探测如图3C所示SDS-PAGE凝胶的蛋白印记结果(图3D)。鉴定并纯化培养基中的21.1KD蛋白质，并以此蛋白作为后续分析免疫原性和交叉反应性的参考蛋白质。
实施例4.在基于细胞的试验中IL-31介导的PSTAT3信号传导
a.试验
图4A和4B以及图5A和5B显示使用利用IL-31肽免疫原构建体所引发的IL-31抗体的体外IL-31诱导的信号传导功能抑制测定。
b.IL-31介导的pSTAT3信号传导
将配制于含有15％热灭活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸钠、50mg/L庆大霉素(gentamicin)和浓度为20ng/mL的犬类干扰素-γ的MEM培养基中的DH-82细胞以每孔洞为1x 105细胞的细胞密度接种于96孔平底细胞培养盘中，于补充有5％二氧化碳的潮湿空气中于37℃下培养16小时。在IL-31处理之前进行血清饥饿两小时以增加IL-31受体表达。在预处理之后，将重组犬类IL-31以不同剂量(0.0001至10ng/mL)反应5分钟(图5A)或1μg/mL反应0、3、5、10及15分钟(图5B)。在接种之后，利用20％终体积的Cell Lysis Mix(5X)裂解细胞，并将其于37℃下以300rpm振荡10分钟。使用50μl细胞裂解物评估pSTAT3。将50μl过氧化物酶标记的抗pSTAT3(y705)或过氯化物酶标记的抗STAT3抗体加入检测孔洞并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞五次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm处的吸光值。
c.结果
图5A和5B说明利用由expi293细胞产生的犬类IL-31于犬类DH-82单核细胞中所诱导的pSTAT3信号传导图式。图5A显示以剂量依赖方式利用犬类IL-31诱导pSTAT3，选择最佳浓度1μg/mL以评估磷酸化。图5B显示以时间依赖方式利用犬类IL-31诱导pSTAT3，以5分钟作为以下实施例中抑制测定的时间点，来评估抗-IL-31抗体的抑制效力。
实施例5.在基于细胞的试验中IL-31介导的PSTAT3信号传导的抑制
a.IL-31介导的pSTAT3信号传导
将配制于含有15％热灭活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸钠、50mg/L庆大霉素和浓度为20ng/mL的犬类干扰素-γ的MEM培养基中的DH-82细胞以每孔洞为1x105细胞的细胞密度接种于96孔平底细胞培养盘中，于补充有5％二氧化碳之潮湿空气中于37℃下培养16小时。在IL-31处理之前进行血清饥饿两小时以增加IL-31受体表达。同时，将100μl来自经免疫豚鼠的利用蛋白质A树脂纯化的连续稀释血清样品与浓度为1mg/mL的犬类IL-31充分混合以于37℃下共同培养1小时。在预处理之后，将50μl重组犬类IL-31和纯化的血清样品混合物加入反应5分钟。在接种之后，利用20％终体积的Cell Lysis Mix(5X)裂解细胞，并将其于37℃下以300rpm振荡10分钟。使用50μl细胞裂解物评估pSTAT3。将50μl过氧化物酶标记的抗pSTAT3(y705)或过氧化物酶标记的抗STAT3抗体加入检测孔洞并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞五次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm处的吸光值。
b.结果
图6A和6B说明显示在初始免疫后(wpi)第12(图6A)和15周(图6B)所示利用衍生自公开的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：43、47、51、55及59)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31所引发的pSTAT3信号传导的抑制图式。
图7说明显示在接种后(wpi)第15周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4751kb(SEQ ID NO：43)和p4752(SEQ ID NO：47)的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31所引发的pSTAT3信号传导的抑制图式。图7也描述对重组犬类IL-31蛋白质所引发pSTAT信号传导的抑制(IC50)。
实施例6.进一步改进犬IL-31肽免疫球蛋白构建体于豚鼠中的免疫原性评估
a.动物
使用总共18只体重为300-350g的豚鼠进行免疫。如表7所示，将18只豚鼠分成6个组别，每个组别3只动物，并且利用400μg肽(SEQ ID NO：63、68、71、76、80及84)进行初始免疫，然后在初始免疫后(wpi)第3、6、9和12周进行4次加强免疫。在0、3、6、9、12和15wpi收集血液样品以测定抗IL-31抗体的效价。
b.剂型
用于免疫接种的制剂含有以下物质：
1. 400μg的IL-31肽免疫原构建体
2.肽∶CpG比例为0.7∶1的CpG
3. 0.2％TWEEN 80
c.血清抗IL-31抗体的效价测定(利用ELISA)
根据以下方案评估由IL-31肽免疫原构建体所引发的血清抗IL-31抗体的效价测定：
利用配制于pH9.6的50mM 1μg/ml碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中犬类IL-31重组蛋白(50ng/well)或代表性IL-31 B表位肽(0.2μg/100μL/well)以100μl体积于37℃下作用1小时以涂覆96孔盘的孔洞。
将rcIL-31或代表性IL-31 B表位肽(SEQ ID NO：9或12)涂覆的孔洞与200μl含有1％BSA的PBS于37℃下作用1小时以阻断非特异性蛋白质的结合，随后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞三次并干燥。将100μl来自经免疫的豚鼠的连续稀释血清样品加至各孔洞中，并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞五次并干燥。将配制于含有1％BSA和0.05％Tween 20的PBS中具有最佳稀释浓度的100μl过氧化物酶标记的山羊抗豚鼠IgG加至各孔洞中，并在37℃下反应1小时。反应后，利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞六次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm处的吸光值。
为了测定于接受基于IL-31肽的疫苗制剂的豚鼠中的抗体效价，从1∶100起进行血清的10倍连续稀释，供代表性标靶“IL31”B细胞表位肽的起始筛选使用，利用Log10表示效价。为了进一步分析血清与重组犬类IL31的交叉反应，在ELISA上进行从1∶100至1∶54248800之血清的2倍连续稀释，并将效价表示为Log EC50。
d.结果
来自免疫原性评估的结果显示在表8中。
在表9和图8中显示对每种IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID No：63、68、71、76、80及84)而言针对重组IL-31的抗体效价(Log EC50)。
这些设计的犬类IL-31肽免疫原构建体具有高免疫原性，即使在3wpi一次给药时也可引发高效价抗体。设计的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID No：63、68、71、76、80及84)引发的抗体对犬类rIL-31具高交叉反应性。
实施例7.在基于细胞的试验中豚鼠血清的抗-IL-31抗体对IL-31介导的PSTAT3信号传导的抑制
a.IL-31介导的pSTAT3信号传导
将配制于含有15％热灭活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸钠、50mg/L健大霉素和浓度为20ng/mL的犬类干扰素-γ的MEM培养基中的DH-82细胞以每孔洞为1x105细胞的细胞密度接种于96孔平底细胞培养盘中，于补充有5％二氧化碳的潮湿空气中于37℃下培养16小时。在IL-31处理之前进行血清饥饿两小时以增加IL-31受体表达。同时，将100μl来自6和12WPI的经免疫豚鼠的利用蛋白质A树脂纯化的连续稀释血消样品与浓度为1mg/mL的犬类IL-31充分混合以于37℃下共同培养1小时。在预处理之后，将50μl重组犬类IL-31和纯化的血清样品混合物加入反应5分钟。在接种之后，利用20％终体积的CellLysis Mix(5X)裂解细胞，并将其于37℃下以300rpm振荡10分钟。使用50μl细胞裂解物评估pSTAT3。将50μl过氧化物酶标记的抗pSTAT3(y705)或过氧化物酶标记的抗STAT3抗体加入检测孔洞并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞5次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm处的吸光值。
b.结果
图9A和9B显示在公开的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：63、68、71、76、80及84)初次免疫后(wpi)6和12周所获得豚鼠免疫血清的抗-IL-31抗体存在下犬DH82单核细胞中犬IL-31诱导的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图9A)和STAT3磷酸化的抑制(图9B)。
图10A和10B显示在公开的IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：63、68、71及84)初次免疫后(wpi)9和12周所获得豚鼠免疫血清的抗-IL-31抗体对犬DH82单核细胞中犬IL-31诱导的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图10A)和STAT3磷酸化的抑制(图10B)。
一般来说，这些设计的IL-31肽免疫原构建体引发的抗-IL-31反应性抗体显著地以剂量依赖性方式抑制犬DH82单核细胞中IL-31诱导的pSTAT3信号传导。
实施例8.在基于细胞的试验中IL-31介导的PSTAT3信号传导的抑制
a.IL-31介导的pSTAT3信号传导
将配制于含有15％热灭活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸钠、50mg/L庆大霉素和浓度为20ng/mL的犬类干扰素-γ的MEM培养基中的DH-82细胞以每孔洞为1x105细胞的细胞密度接种于96孔平底细胞培养盘中，于补充有5％二氧化碳的潮湿空气中于37℃下培养16小时。在IL-31处理之前进行血清饥饿两小时以增加IL-31受体表达。同时，将100μl来自6、9和12WPI的经免疫豚鼠之利用蛋白质A树脂纯化的连续稀释血清样品与浓度为1mg/mL的犬类IL-31充分混合以于37℃下共同培养1小时。在预处理之后，将50μl重组犬类IL-31和纯化的血清样品混合物加入反应5分钟。在接种之后，利用20％终体积的CellLysis Mix(5X)裂解细胞，并将其于37℃下以300rpm振荡10分钟。使用50μl细胞裂解物评估pSTAT3。将50μl过氧化物酶标记的抗pSTAT3(y705)或过氧化物酶标记的抗STAT3抗体加入检测孔洞并在37℃下反应1小时。然后利用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤孔洞五次，并与100μl的TMB底物再反应15分钟。利用2N H2SO4终止反应并测定450nm的吸光值。
b.结果
图11A和11Bh显示在初始免疫后(wpi)第6、9和12周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)所获得的豚鼠免疫血清的抗IL-31抗体存在下犬类DH82单核细胞中犬类IL-31所引发的pSTAT3信号传导的磷酸化百分比(图11A)和抑制百分比(图11B)。
图12说明显示在初始免疫后(wpi)第6、9和12周利用衍生自IL-31肽免疫原构建体p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)获得的豚鼠免疫血清的抗IL-31抗体于犬类DH82单核细胞中犬类IL-31所引发的pSTAT3信号传导的抑制百分比图式。底部小图描述对重组犬类IL-31蛋白质所引发pSTAT信号传导的抑制(IC50)。
一般来说，对于由这些设计的IL-31肽免疫原构建体引发的抗-IL-31反应性抗体，显著地以剂量依赖性方式抑制犬DH82单核细胞中IL-31诱导的pSTAT3信号传导。
实施例9.在大肠杆菌中生产脂化蛋白质
IL-31肽免疫原构建体可在允许脂化的特定大肠杆菌菌株中表达以制造脂蛋白，作为治疗异位性皮肤炎的免疫原使用。
在美国第8,426,163号专利中描述此过程，其通过引用整体并入本文。
实施例10.在概念试验证明中以IL-31肽免疫构建体(SEQ ID NO：84)免疫狗进行功能免疫原性评估
a.动物
使用15只比格犬进行免疫。将狗分为2组，可组8只，以油包水乳液制剂进行试验，另一组为7只狗，以明矾与皂苷制剂进行试验。使用100μg含有SEQ ID NO：84的IL-31肽免疫原构建体进行初次免疫，在初次免疫(DPI)后21天以相同剂量用相同制剂进行另一次加强免疫。在0、21和41DPI时收集血液样本，以测量抗IL-31抗体的效价及评估相应免疫血清中抗体的其他功能特性。免疫方式如图13所示。
b.血清抗IL-31抗体针对IL-31 B表位或重组狗IL-31蛋白的ELISA效价
根据下列方式评估由IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：84)引发的血清抗-IL-31抗体的效价：
使用100μl犬IL-31重组蛋白(50ng/孔)或IL-31B表位肽(SEQ ID NO：84)将96孔盘的孔洞，以0.2μg/0.1mL/孔的50mM碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)在37℃下，以1μg/mL涂覆1小时。将涂覆抗原的孔与200μl含1％BSA的PBS于37℃下反应1小时以阻断非特异性蛋白质结合，然后以含有0.05％TWEEN 20的PBS清洗3次后干燥。将100μl免疫狗的系列稀释血清样本添加至每个孔洞中，并于37℃下反应1小时。然后，使用含有0.05％TWEEN 20的PBS清洗孔洞5次并干燥。在每个孔洞中加入100μl过氧化物酶标记的兔抗-狗IgG或过氧化物酶标记的重组蛋白A/G(ierce TM)，在含有1％BSA和0.05％TWEEN 20的PBS中制备最佳稀释度，并于37℃反应1小时。反应后，以含有0.05％TWEEN 20的PBS清洗孔洞6次，并与100μl TMB底物反应15分钟。以2N H2SO4终止反应，测定450nm的吸光值。为了测定接种IL-31肽疫苗制剂的比格犬中的抗体效价，对ELISA进行2倍连续稀释，从1∶100到1∶54,248,800，效价以Log10表示。
c.细胞分析中IL-31介导的pSTAT3信号传导的抑制
将DH-82细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于96孔平底盘中，其中MEM生长培养基含有15％加热灭活的胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸钠、50μg/L庆大霉素(gentamicin)和20ng/mL犬干扰素-γ，于37℃含5％CO2的潮湿空气中，反应16小时。在IL-31处理前，先经血清饥饿2小时以增加IL-31受体表达。在血清饥饿过程中，将100μl经免疫比格犬以蛋白A树脂纯化的系列稀释血清与1μg/mL的犬IL-31混合均匀，于37℃下共同反应1小时。预处理后，加入50μl重组犬IL-31及纯化的血清样品混合物，反应5分钟。接种后，用市售试剂盒(InstantOneTMELISA试剂盒，Thermo)测定STAT3磷酸化。使用20％最终体积的Cell Lysis Mix(5X)裂解细胞，在37℃下以300rpm震荡10分钟。使用50μl细胞裂解液评估pSTAT3及制备50μl过氧化物酶标记的抗pSTAT3(y705)或过氧化物酶标记的抗STAT3抗体加入孔洞中，于37℃反应1小时。接着用含有0.05％TWEEN 20的PBS清洗孔洞5次，并与100μlTMB底物再反应15分钟。以2N H2SO4终止反应并测定450nm的吸光值。
d.结果
针对目标IL-31 B表位肽(SEQ ID NO：84)不同制剂的免疫原性评估结果如图14所示。对于每只狗，21 DPI和41 DPI重组犬IL-31的抗体效价(Log10 EC50)如图15和16所示，其中兔抗-狗IgG HRP(图15)或蛋白A/G HRP(图16)作为第二追踪剂。
具有SEQ ID NO：84的代表性犬IL-31肽免疫原构建体具有高免疫原性，在21DPI施用一次即可产生针对IL-31B表位肽的高效价抗体(图14)，且对犬rIL-31具有高交叉反应性(图15和16)。
在配方研究中，很明显地含皂苷的明矾佐剂比油包水乳剂配方具有更好的免疫增强作用。两种追踪剂皆显示出类似的结合特征和相当的效价。狗免疫原性研究的另一个重要发现是，-T辅助肽可帮助自身IL-31序列突破/或克服大多数自身蛋白固有的免疫耐受性。
一般来说，在犬DH82单核细胞中IL-31诱导的pSTAT3信号传递的显著抑制以剂量依赖性方式(从500、250、100、75、50、12.5至6.25μg)由设计型IL-31肽免疫原构建体的明矾/皂苷2种配方所诱导的犬抗IL-31反应性抗体，可对IL-31所诱导的pSTAT3信号传导磷酸化产生约40-60％的抑制作用，与IL-31单株抗体(cytopoint)相比，乳化制剂具有约35-50％的抑制作用，相当于50-75％的抑制效果。如图18A和18B所示，犬类IL-31“Cytopoint”单克隆抗体在信号传递抑制中的IC50＝3.21μg/mL。
在豚鼠免疫原性研究中，2次免疫后来自6wpi免疫血清的抗体在这种pSTAT3信号传导中具有显著低的抑制比例，其中15wpi免疫血清的抗体具有更高剂量依赖性的总信号抑制比例(参照图19A至19C)。这些数据表明，免疫超过2次的狗具有更好的信号传导抑制效果。因此，证明犬IL-31肽免疫原构建体具有潜力和能力诱导狗体内的有效多克隆抗体，以减少/阻碍/抑制会引起犬特异性皮肤炎的IL-31刺激作用。
实施例11.进一步细化人类IL-31肽免疫球蛋白构建体设计以评估豚鼠功能免疫原性
a.以人类IL-31相关肽免疫原构建体的设计作为犬类IL-31类似物的延伸
IL-31是属于IL-6细胞因子家族的四螺旋管束细胞因子。IL-31优先由活化的CD4+TH2细胞和皮肤淋巴细胞相关抗原阳性皮肤CD45RO+(记忆)T细胞产生。IL-4诱导人类TH2细胞中IL-31蛋白的基因表达和释放，IL-33进一步增强IL-4所诱导的IL-31释放。
IL-31受体(IL-31R)是由IL-31受体α链(IL-31Rα)与抑瘤素M受体β(OSMRβ)的异二聚体组成。异二聚体IL-31R在巨噬细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、皮肤神经元和上皮细胞(包括角质形成细胞)中表达。背根神经节中皮肤感觉神经元的细胞体大量表达IL-31Rα。最近研究发现，IL-31可能通过IL-31R直接与感觉神经相通，并作为Th2细胞和感觉神经元之间的关键神经免疫连接，以产生T细胞介导的炎症性瘙痒。OSMRβ不仅是IL-31R的亚单位，且还与gp130相互作用形成第II型受体复合物-结合OSM。OSMRβ广泛地在血管系统、心脏、肺、脂肪组织、皮肤、膀胱、乳腺组织、肾上腺及前列腺中表达。
IL-31在IL-31R复合物中主要与IL-31Rα结合，而不与OSMRβ结合。然而，在交联时，OSMRβ可将IL-31R转化为高亲和力受体并增加IL-31的结合。IL-31与IL-31Rα/OSMRβ受体复合物的相互作可促使Jak/信号传递和转录活化因子(STAT)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号传递及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的活化。
尚未有IL-31或IL-31/IL-31Rα复合物的X光结构数据。然而，由点突变可证明人类IL-31的位置II与IL-31Rα且位置III及OSMRβ相互作用。特别是，螺旋A中的E22和螺旋C中的E83/H87形成位置II，螺旋DN-端的K111是位置III的重要部分。I-TASSER生成之人类IL-31的Ab initio模型显示IL-31细胞因子家族的典型四螺旋束折迭，具有上-上下-下结构。IL-31Rα相互作用的三个关键残基E22、E83和H87在空间聚集，在预测的位置II.呈现。
进一步设计IL-3l肽免疫原构建体的人类IL-31B细胞表位以针对IL-31分子上的IL-31Rα结合区域。为了保持E83和H87侧链构象暴露于溶剂，螺旋C受到相邻螺旋3种不同方式的限制：(1)螺旋C环-螺旋D(SEQ ID NO：13)、(2)螺旋B-环-螺旋C(SEQ ID NO：95)、及(3)螺旋B-C-D(SEQ ID NO：93)。B细胞表位肽有31至64个氨基酸残基，来自于L75-S122、S62-I92或A64-L127。为了使E83和H87的侧链面向相同方向，p5095kb(SEQ ID NO：101)内的螺旋C表位因螺旋-螺旋相互作用和人工二硫键的引入受限于螺旋B。另外，测试了仅具有螺旋C作为B表位的(SEQ ID NO：94)的肽构建体p5094kb(SEQ ID NO：100)。
b.IL-31的ELISA抗体特异性分析
重组人类IL-31蛋白(Sino BiologicalInx)或人类IL-31B表位肽(SEQ ID NO：13、94、95和93)在涂布缓冲液(1.5g/L Na2CO3、2.9g/L NaHCO3，pH 9.6)中，以50ng/孔的重组人类IL-31蛋白或200ng/孔人类IL-31B表位肽的浓度固定于微量孔盘上，于4℃反应过夜。以200μL/孔的清洗缓冲液(含有0.05％TWEEN-20的PBS)清洗孔盘3次。使用200μL/孔的分析稀释剂(0.5％BSA，0.05％TWEEN-20，0.01％ProClin 300在PBS中)于室温下封闭孔1小时。以200μL/孔的清洗缓冲液清洗孔盘3次。添加100μL抗血清(4倍连续稀释，从1∶100到1∶4.19×108，共12次稀释)或稀释抗体(4倍连续稀释，从100mg/mL至0.0238ng/mL，总共12次稀释)至涂布孔洞中。于室温下反应1小时。使用200μL/孔的清洗缓冲液清洗孔洞5次。将孔盘与1∶10，000稀释的HRP缀合山羊抗豚鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories)反应1小时(100μL/孔)。最后，加入100μL/孔的NeA-Blue TMB底物(ClinicalScience Products)，并以100μL/孔的1M H2SO4终止反应。利用ELISA侦测仪(MoleculeDevices)测量OD450的吸光值。使用Prism软件(GraphPad)进行非线性回归分析，以样品稀释度log值中4个参数曲线的50％的最大吸光值，来确定抗血清特定效价(以log10 Titers或Log10(EC50)表示)。使用Prism软件的非线性回归分析，将纯化的多克隆IgG抗体反应性以4个参数曲线的半有效浓度(EC50)表示。
c.IL-31肽免疫原构建体及其制剂在动物中所引发的抗体功能特性的评估
进一步分析免疫血清或纯化的抗IL-31多克隆抗体的能力：(1)阻断IL-31与其受体IL-31Rα之间相互作用，(2)抑制U87MG胶质瘤细胞中IL-31所诱导的STAT3磷酸化，及(3)抑制转染IL-31Rα的HaCaT细胞中的IL-20表达。
1.细胞
在含5％CO2的37℃恒温培养箱中，将U87MG细胞株培养于含10％牛血清和1％青霉素/链霉素的EMEM中。
在含5％CO2的37℃恒温培养箱中，将过量表达IL-31Rα的HaCaT转殖细胞培养于含10％FBS、1％青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和200μg/mL潮霉素B(Gibco)的DMEM培养基(高葡萄糖，Gibco)。
2.IL-31对IL-31Rα链的结合
以不同IL-31肽免疫原构建体免疫的豚鼠的混合免疫血清中纯化出IgG多克隆抗体，利用ELISA检测其抑制IL-31与IL-31Rα结合的相对能力。将96孔盘的孔洞分别以50ng抗-His单克隆抗体(GenScript)在缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)中进行涂布，在4℃下反应隔夜。在室温下用200μL/孔的分析稀释剂(含1％BSA、0.05％TWEEN-20与0.01％ProClin 300的PBS溶液)封闭孔洞1小时。以200μL/孔的清洗缓冲液(含0.05％TWEEN-20和0.01％ProClin 300的PBS)清洗孔盘3次。将100ng重组的His-标记人类IL-31Rα蛋白(R&Dsystem)在室温下于抗-His表面固定1小时。清洗后，将100μL 10ng/mL的人类IL-31(GenScript)混合物和不同浓度经纯化豚鼠IgG多克隆抗体在室温下预反应1小时，接着加至孔洞中。在室温下反应1小时。以200μL/孔的清洗缓冲液清洗3次。以100μL/孔生物素标记的兔抗IL-31抗体(0.25μg/mL)(Pepro Tech Inc.)在室温下反应1小时，以检测捕获的IL-31。接着，使用链霉抗生物素蛋白poly-HRP(1∶10,000稀释，Thermo FisherScientific)反应1小时(100μL/孔)，以检测结合的生物素标记的抗体。使用200μL/孔的清洗缓冲液清洗所有孔洞3次。最后，通过100μL/孔的OptEIA TMB底物(BD Biosciences)对孔显色，并添加100μL/孔的1MH2SO4以终止反应。以VersaMax ELISA微量孔盘侦测仪(Molecular Devices)测定吸光值，并利用Prism 6软件藉由符合四参数逻辑曲线的反应曲线来计算(GraphPad软件)最大半抑制浓度(IC50)。
3.IL-31诱导的STAT3磷酸化分析
为了研究纯化的IgG是否能够抑制U87MG细胞中IL-31诱导的STAT3磷酸化，将细胞接种在12孔盘(2x105/孔)中并在无血清培养基(EMEM中的1％小牛血清)中培养16小时。将细胞在豚鼠多克隆抗体存在下，同时与10ng/mL最终浓度的IL-31，总体积为500μL的无血清培养基中于37℃，5％CO2下培养30分钟。以抗IL-31单克隆抗体MT313(Mabtech AB)作为对照组。以PathScan p-Stat3 ELISA试剂盒(Cell Signaling)分析磷酸化的STAT3。简单来说，将细胞悬浮在30μL含1％磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)中，以制备细胞裂解物，以12,000xg，在4℃下离心10分钟除去细胞碎片。依据说明书，使用10μg澄清的细胞裂解物测量磷酸化STAT3的含量。以VersaMax ELISA微量孔盘侦测仪(Molecular Devices)测量吸光值。
4.IL-31诱导的IL-20表达
HaCaT是来自于成人皮肤的自发转化非整倍数永生角质形成细胞株(spontaneously transformed aneuploid immortal keratinocyte cellline)。为了分析IL-31诱导的IL-20表达，制备过度表达人类IL-31Rα的稳定HaCaT细胞株。IL-31依赖性的IL-20表达可藉由本发明IL-31肽免疫原构建体所引发的抗IL-31抗体进行调控。使用4×105个HaCaT细胞，最终浓度10ng/mL的人类重组IL-31和不同浓度的纯化的豚鼠IgG多克隆抗体，每孔洞总体积1,000μL培养基，在37℃，5％CO2下的条件反应1小时后进行分析。以抗-IL-31单克隆抗体MT313(Mabtech AB)为对照组。依据说明书，以PureLink RNA Mini试剂盒(Thermo Fisher ScientificInc.)提取RNA，并利用SuperScript TM III/RNaseOUTEnzyme Mix(Thermo Fisher Scientific Inc.)除去残留的基因组DNA。以SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)将1μg的RNA逆转录成cDNA，并使用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR系统(ThermoFisher Scientific Inc.)进行实时定量PCR分析。使用Power SYBRGreen PCR Master Mix试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行实时PCR反应。IL-20的QuantiTect引物对(Hs_IL20_1_SG)购自于Qiagen，并合成HPRT的引物对(正向引物：5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’(SEQ ID NO：106)；反向引物：5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’(SEQ ID NO：107))。所有试验皆为2重复。使用比较循环阈值法计算相对量，并以HPRT标准化。将每个抗体处理组的IL-20相对表达量以未处理组的表达量进行标准化。
d.结果
设计、筛选、鉴定、评估功能特性和优化包含代表性人类IL-31肽免疫原构建体的多组分疫苗制剂。
1.人类IL-31 B细胞表位肽序列的选择
因为发现螺旋C区域中的两个关键残基E83和H87与IL-31Rα相互作用，故选择IL-31螺旋C进行B细胞表位肽的设计。将与UBITh1 T辅助肽(SEQ ID NO：27)连接的螺旋C肽构建与短间隔子εK连接，并与ISA 51及CpG进行配制，以400μg/1mL初始免疫豚鼠，并以100μg/0.25mL进行加强(3、6和9wpi)免疫。为了分析豚鼠中的免疫原性，使用ELISA测定4倍连续稀释(从1∶100至1∶4.19×108)的豚鼠免疫血清。使用重组人类IL-31蛋白涂布ELISA孔盘，每孔洞50ng。使用A450nm的4个参数非线性回归分析计算血清效价，其以LogEC50表示。ELISA结果显示4种肽免疫原构建体不仅可诱导针对相应IL-31 B表位肽的高免疫原性效价(表10(SEQ ID NO：87)；表11(SEQ ID NO：100和101；及表13第3组(SEQ ID NO：99)，并诱导中至高度针对人类IL-31蛋白的交叉反应(图20A和20B)。
2.IL-31肽免疫原构建的抗体抑制IL-31和IL-31Rα相互作用的免疫原性的评估
本实施例分析豚鼠中产生的IL-31肽免疫原构建体的抗体是否可中和IL-31，进而阻断IL-31和IL-31Rα之间的相互作用。特别是，以ELISA测定经4种候选IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87、99、100和101)免疫的豚鼠免疫血清所纯化的豚鼠IgG，其中重组人类IL-31Rα蛋白质固定于涂有抗His抗体的固相上。如图21所示，从各经IL-31肽免疫原构建体免疫的豚鼠血清中所纯化的代表性抗体，以剂量依赖性方式(10E-3至10E-2μg/mL)竞争性地抑制IL-31与IL-31Rα的相互作用。
3.抗IL-31抗体抑制IL-31诱导的STAT3磷酸化
IL-31信号途径参与细胞膜上IL-31Rα/OSMR复合物的形成，及细胞质下游蛋白STAT3的磷酸化。使用U87MG细胞株评估由IL-31肽免疫原构建体免疫的豚鼠免疫血清所纯化的抗-IL-31抗体，抑制IL-31诱导的STAT3磷酸化的能力。
首先，以IL-31(10ng/mL)和不同浓度的IgG同时处理细胞。将抗IL-31单克隆抗体MT313作为阳性对照。如图22所示，代表性免疫原(SEQ ID NO：87和101)诱发的抗IL-31IgG与MT313皆可以剂量依赖性方式降低STAT3的磷酸化。
4.IL-31诱导的IL-20表达的抑制
IL-20与IL-10结构上有关，且皆是角质形成细胞的自分泌因子，可调控所参与的炎症反应。IL-31可在角质形成细胞株HaCaT中诱导IL-20的表达。为了研究IL-31肽免疫原构建体在豚鼠中引发的抗IL-31抗体是否可抑制过度表达IL-31Rα的HaCaT细胞中IL-31依赖性的IL-20表达，所有细胞经10ng/mL的IL-31处理30分钟，以诱导IL-20基因转录。由IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：87和101)诱发的豚鼠免疫血清的IgG代表性制剂以不同浓度添加到试验组中，并以MT313作为阳性对照组。以不添加抗体，且在IL-31存在下培养细胞作为阴性对照组。如图23所示，在SEQ ID NO：87和101的代表性肽构建体所引发的IgG抗体治疗组中，发现抗体可浓度依赖性地抑制IL-20的表达。
上述离体功能研究证明，由螺旋-螺旋相互作用和导入人工二硫键所构成的螺旋C组成的IL-31肽免疫原可证明阻断IL-31-IL-31Rα相互作用，以及抑制IL-31诱导的信号传递链。
5.代表性人类IL-31肽构建体(SEQ ID NO：101)在各多组分制剂中功能免疫原性的评估
使用27只豚鼠(300-350g重量)进行免疫。将27只豚鼠分成9组，每组3只，以400μg肽进行初始免疫，在初始免疫后3周和6周(wpi)进行2次加强免疫，如表15所示。在0、3、6、9、12与15wpi收集血液样本以检测相对IL-31B表位肽(SEQ ID NO：95)的抗IL-31抗体的效价。如表15所示，包括安慰剂(含PBS)、CPG1、CpG3、ISA51VG、ADJUPHOS、ISA51VG+CpG1、ADJUPHOS+CpG1、ISA51VG+CPG3和ADJUPHOS+CpG 3等9组。如表15所示(0、3、6、9、12和15wpi)，使用上述IL-31 B表位肽(SEQ ID NO：95)以ELISA分析血清抗IL-31抗体效价，效价以Log10表示。图24上图显示0、3、6和9wpi时的免疫原性数据。每种制剂的详细平均效价以Log10表示，显示于图24的下图。
在分析IL-31和IL-31Rα结合的相互作用中，进一步评估9wpi豚鼠免疫血清中针对制剂中各种IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)的多克隆抗体，如图25所示。计算每种制剂的IC50(μg/mL)，如图25所示。同样地，这些抗体中最有效的抑制物为ISA51/CpG1或ISA51/CpG，IC50值分别为为0.2036和0.1965μg/mL。
此外，9wpi豚鼠免疫血清中针对各种制剂中IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)的多克隆抗体在离体模型中，测试抗IL-31抗体抑制IL-31诱导的IL-20表达能力及IL-31诱导的STAT3磷酸化。
如图25和26所示，制剂(第1至9组)中代表性候选肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)所诱导的抗体在实验组中具抗体浓度依赖性的抑制。同样地，ISA51+CPG1或CpG3中的配方为油包水乳液，具有最高的IL-20表达抑制能力，如图25所示(在10μg和100μg/mL时，从1μg/mL降至零为对照组的0.3或0.4倍)，以及类似的STAT3磷酸化(图26)。
实施例12.狗、小鼠和人类不同物种IL-31肽免疫原性交叉反应性的评估
a.抗体特异性的IL-31ELISA分析
将狗、小鼠和人类IL-31B表位肽(SEQ ID NO：12、93、96、97或98)以200ng/孔的浓度于涂布缓冲液中(1.5g/LNa2CO3，2.9g/L NaHCO3，pH9.6)固定在微孔盘上，于4℃下反应过夜。以200μL/孔的清洗缓冲液(含0.05％TWEEN-20的PBS)清洗孔盘3次。在室温下以200μL/孔的分析稀释剂(含0.5％BSA，0.05％TWEEN-20，0.01％ProClin 300的PBS)封闭孔1小时。以200μL/孔的消洗缓冲液清洗3次。将100μL抗体稀释剂中的抗血消(连续10倍稀释)添加至经涂布的孔洞中。于室温下反应1小时。吸出所有孔洞中的液体，并以200μL/孔的清洗缓冲液清洗5次。将孔盘与1∶10,000稀释HRP缀合山羊抗-豚鼠IgG(H+L)抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)反应1小时(100μL/孔)。接着，使用200μL/孔的清洗缓冲液清洗所有孔洞5次。最后，添加100μL/孔的Ne A-Blue TMB底物(Clinical ScienceProducts)至孔洞中进行反应，并以100μL/孔的1M H2SO4终止反应。以ELISA微孔盘侦测仪(Molecule Devices)测量OD450的吸光值。测定抗血清的特异性效价，并以Log10表示。
b.结果
表13和14显示免疫原性研究的评估结果。
针对犬类(SEQ ID NO：83和85)与人类(SEQ ID NO：99)相对应肽类似物的豚鼠免疫血清对IL-31 B表位肽(SEQ ID NO：12和93)具有合理的交叉反应性，如表13所示。然而，针对小鼠IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：104和105)与犬类(102和103)相对应肽免疫原构建体类似物的豚鼠免疫血清与对应的IL-31 B表位肽(犬类的SEQ ID NO：96相对于小鼠的97和98)的结合具有限的交叉反应。针对犬类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：102和103)的豚鼠免疫血清与对应的小鼠IL-31 B表位肽类似物(SEQ ID NO：97和98)不具交叉反应，如表14所示。因此，证明可使用犬类模型进行人类应用研究。
实施例13.具有或不具有佐剂的各种制剂中，重组犬类IL-31蛋白与含UBITH1连接的脂蛋白的豚鼠免疫原性评估
将重组全长犬类IL-31蛋白(FL-犬IL-31)及含位于IL-31蛋白N-端的序列(促进免疫原性)的重组全长犬类IL-31蛋白(FL-犬IL-31脂蛋白)，以2种不含佐剂组成以及1种ADJUPHOS组成来比较它们的相对免疫原性，以无佐剂2个高剂量和低剂量50μg/0.5mL/剂量/IM、25μg/0.5mL/剂量/IM进行测试，而使用ADJUPHOS作为佐剂的组成仅以高剂量50μg/0.5mL/剂量/IM进行测试，如表12所示。
a.IL-31ELISA的抗体特异性分析
将重组全长(FL)犬类IL-31蛋白以50ng/孔在涂布缓冲液(1.5g/L Na2CO3、2.9g/LNaHCO3，pH 9.6)中固定于微量孔盘上，并在4℃下反应过夜。以200L/孔的清洗缓冲液(含0.05％TWEEN-20的PBS)消洗孔盘3次。在室温下用200μL/孔的分析稀释剂(0.5％BSA、0.05％TWEEN-20、0.01％ProClin 300在PBS中)封闭孔洞1小时。以200L/孔的消洗缓冲液清洗孔盘3次。将100L抗体稀释剂中的抗血清(连续稀释10倍)添加至经涂布的孔洞中。在室温下反应1小时。使用200μ L/孔的清洗缓冲液清洗所有孔洞5次。将孔盘与1∶10,000稀释的HRP-缀合山羊抗豚鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories)反应1小时(100μL/孔)。接着，以200μL/孔的清洗缓冲液清洗所有孔洞5次。最后，以100μL/孔的NeA-Blue TMB底物(ClinicalScience Products)进行反应，并加入100μL/孔的1M H2SO4终止反应。使用ELISA微孔盘侦测仪(Molecule Devices)测量OD450的吸光值。测定抗血清的特异性效价，并以Log10表示。
b.结果
上述2种重组蛋白的免疫原性评估结果如表12所示。
犬类IL-31脂蛋白(第1组至第3组)和一般的犬类IL-31蛋白(第4至6组)均具有免疫原性，在即使没有佐剂(第1、2、4与5组)时，N-端连接的也可增强这些蛋白质的免疫原性。整体而言，比较相同制剂，IL-31脂蛋白(第1组至第3组)的免疫原性优于一般IL-31非脂蛋白(第4至6组)的免疫原性，这些脂蛋白仅进行一次免疫即具有高免疫原性。一般蛋白质免疫组(第4组至第6组)在进一步加强免疫后，可提升至其相对应的免疫原性，并在2次加强免疫后达到相同的免疫原性，如8wpi的免疫血清所示。
表1
于血清学分析使用的IL-31及其片段的氨基酸序列
*利用丝氨酸或半胱氨酸取代的氨基酸下方划有底线
表2
在IL-31衍生的肽免疫原构建体设计中所使用经选择的混杂T辅助细胞表位
表15
多组分制剂中代表性人类IL-31肽免疫原构建体(SEQ ID NO：101)在豚鼠中的免疫原性评估

Claims (4)

1.一种IL-31肽免疫原构建体，其中该IL-31肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO:43-90及99-105组成的组。
2.一种包含如权利要求1所述的肽免疫原构建体的组合物。
3.一种医药组合物，其包含：
a.如权利要求1所述的肽免疫原构建体；以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其中
该IL-31肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
CN201880079547.1A 2017-12-11 2018-12-11 用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的il-31肽免疫原及其剂型 Active CN111448208B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762597130P 2017-12-11 2017-12-11
US62/597,130 2017-12-11
PCT/US2018/065025 WO2019118512A2 (en) 2017-12-11 2018-12-11 Peptide immunogens of il-31 and formulations thereof for the treatment and/or prevention of atopic dermatitis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111448208A CN111448208A (zh) 2020-07-24
CN111448208B true CN111448208B (zh) 2024-02-27

Family

ID=66820956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880079547.1A Active CN111448208B (zh) 2017-12-11 2018-12-11 用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的il-31肽免疫原及其剂型

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210079054A1 (zh)
EP (1) EP3724218A2 (zh)
JP (1) JP7250032B2 (zh)
KR (1) KR20210009296A (zh)
CN (1) CN111448208B (zh)
AU (1) AU2018383708B2 (zh)
BR (1) BR112020011308A2 (zh)
CA (1) CA3085318A1 (zh)
MX (1) MX2020006105A (zh)
SG (1) SG11202005526WA (zh)
TW (1) TWI741241B (zh)
WO (1) WO2019118512A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
EP3765069A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Zoetis Services LLC Peptide vaccines against interleukin-31
US20220324960A1 (en) * 2019-08-29 2022-10-13 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 Antibodies for Veterinary Use
TW202142551A (zh) * 2020-01-28 2021-11-16 美商聯合生物醫學公司 針對pcsk9胜肽免疫原及其預防和治療pcsk9介導疾病的製劑
CN116981691A (zh) * 2020-11-23 2023-10-31 斯克奥特比奥股份有限公司 抗原结合分子及其用途
AU2023223603A1 (en) 2022-02-28 2024-08-22 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg A CONJUGATE CONSISTING OF OR COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN OR A MANNAN.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6713301B1 (en) * 1998-06-20 2004-03-30 United Biomedical, Inc. Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US9102752B2 (en) * 2013-03-15 2015-08-11 United Biomedical, Inc. Peptide vaccine for prevention and immunotherapy of dementia of the Alzheimer's type
MA40824A (fr) * 2014-10-22 2017-08-29 Saiba Gmbh Particules de cmv de type virus modifié
EP3302457A2 (en) 2015-06-08 2018-04-11 Lophius Biosciences GmbH Composition for determination of cell-mediated immune responsiveness
NZ740595A (en) * 2015-09-08 2022-02-25 Univ Zuerich Treatment of insect bite hypersensitivity
CN116688110A (zh) * 2016-04-27 2023-09-05 礼蓝美国公司 犬特应性皮炎的治疗

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6713301B1 (en) * 1998-06-20 2004-03-30 United Biomedical, Inc. Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210009296A (ko) 2021-01-26
SG11202005526WA (en) 2020-07-29
TWI741241B (zh) 2021-10-01
AU2018383708A1 (en) 2020-07-16
EP3724218A2 (en) 2020-10-21
WO2019118512A2 (en) 2019-06-20
JP7250032B2 (ja) 2023-03-31
US20210079054A1 (en) 2021-03-18
RU2020122924A (ru) 2022-01-14
WO2019118512A3 (en) 2020-04-09
CA3085318A1 (en) 2019-06-20
JP2021510169A (ja) 2021-04-15
MX2020006105A (es) 2020-11-09
TW201927813A (zh) 2019-07-16
AU2018383708B2 (en) 2023-10-26
BR112020011308A2 (pt) 2020-11-17
CN111448208A (zh) 2020-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111448208B (zh) 用于治疗和/或预防异位性皮肤炎的il-31肽免疫原及其剂型
US20230218748A1 (en) Artificial promiscuous t helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens
CN113574073A (zh) 针对降钙素基因相关肽(cgrp)的肽免疫原及其用于预防和治疗偏头痛的制剂
JP7569091B2 (ja) インターロイキン６（ｉｌ－６）調節異常による影響を受ける疾患の免疫療法のための、ｉｌ－６を標的とするペプチド免疫原及びその製剤
CN111565801B (zh) 用于IgE介导过敏性疾病治疗的靶向膜结合型IgE的肽免疫原及其剂型
RU2799440C2 (ru) Пептидные иммуногены il-31 и их составы для лечения и/или профилактики атопического дерматита
TW202142551A (zh) 針對pcsk9胜肽免疫原及其預防和治療pcsk9介導疾病的製劑
TWI853872B (zh) 免疫治療il-6失調疾病的il-6的胜肽免疫原及其製劑
TWI823051B (zh) 針對垂體腺苷酸環化酶激活胜肽的胜肽免疫原及其預防和治療偏頭痛的製劑
TWI781347B (zh) 針對源自c9orf72二肽重複蛋白的胜肽免疫原結構
CN111405908A (zh) Tau肽免疫原构建体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40025696

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant