TW201927813A

TW201927813A - 用於治療及／或預防異位性皮膚炎之ｉｌ－３１胜肽免疫原及其劑型

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Publication number: TW201927813A
Application number: TW107144910A
Authority: TW
Inventors: 長怡王
Original assignee: 美商聯合生物醫學公司
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-07-16
Also published as: CN111448208A; RU2020122924A; AU2018383708A1; BR112020011308A2; CN111448208B; US20210079054A1; SG11202005526WA; CA3085318A1; JP7250032B2; WO2019118512A3; EP3724218A2; MX2020006105A; JP2021510169A; TWI741241B; WO2019118512A2; KR20210009296A; AU2018383708B2

Abstract

本揭露是關於用於治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)之靶向介白素-31(IL-31)蛋白質部份的個別胜肽免疫原構建。本揭露也關於含有此胜肽免疫原構建的組成物、製備和使用此胜肽免疫原構建的方法，以及利用此胜肽免疫原構建所產生的抗體。

Description

用於治療及/或預防異位性皮膚炎之IL-31胜肽免疫原及其劑型

本揭露是關於靶向介白素-31(IL-31)之胜肽免疫原構建及其劑型，其作為用於治療及/或預防異位性皮膚炎的醫藥組成物。

異位性皮膚炎(AD)被美國獸醫皮膚專科醫師學院專案小組定義為“具特殊臨床表徵的遺傳傾向炎症搔癢過敏性皮膚病”(Olivry 2001)。專案小組還辨識出此疾病在犬類與過敏原特異性IgE有關(Olivry 2001；Marsella & Olivry 2003)。伴隨著繼發性脫毛和紅斑的嚴重搔癢對寵物主人來說是顯著且相關的症狀(美國8,790,651號專利)。

由於準確性差且與流行病學數據不一致，故異位性皮膚炎盛行率為未知，但是據估計佔總犬數的10%(Marsella & Olivry 2003；Scott 2002；Hillier 2001)。全球約有450萬隻狗患有這種慢性且持續終生的疾病。發生率似乎在增加。品種和性別偏好被受到懷疑，但可能會因為地理區域而有很大差異(Hillier 2001；Picco 2008)。

涉及過敏性皮膚炎的潛在因素有很多，且對其了解甚少。食物中的成分(Picco,2008)和環境過敏原(例如跳蚤、塵蟎、豚草、植物萃取物等)可能引發異位性皮膚炎。遺傳因素也扮演重要角色。雖然沒有確定的品種偏好，但某些遺傳模式被認為增加了對異位性皮膚炎的易感性(Sousa & Marsella 2001；Schwartzman 1971)。

介白素-31(IL-31)是於2004年選殖出來的細胞因子。其主要是由活化的第二型T輔助(Th)細胞所產生(Dillon 2004)，但其也在肥大細胞和巨噬細胞中產生。IL-31結合由IL-31受體A(IL-31RA)和抑瘤素M受體(OSMR)所組成的協同受體(Dillon 2004 and Bilsborough 2006)。受體活化透過JAK受體導致STAT磷酸化。在巨噬細胞、角質細胞和在背根神經節中已經顯示了協同受體的表現。最近，已經發現IL-31涉及皮膚炎、搔癢的皮膚損傷、過敏和呼吸道過度敏感。

利用抗CD3和抗CD28抗體刺激T細胞可立即地向上調節IL-31 mRNA的表現(Dillon 2004)。微陣列分析已顯示IL-31引發某些趨化性基因，例如CXCL1、CLL17(胸腺活化調節趨化因子(TARC))、CCL19(巨噬細胞發炎蛋白(MIP)3β)、CCL22(單核細胞衍生的趨化因子(MDC))、CCL23(MIP3)以及CCL4(MIPβ)(Dillon 2004)。

過度表現IL-31的基因轉殖小鼠顯現出皮膚炎症、搔癢症、嚴重的皮膚炎和脫毛(Dillon 2004)。向小鼠皮下注射IL-31引發發炎細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤，並導致表皮增厚和皮膚棘皮症。在NC/Nga小鼠中，其具有由於自然原因導致的異位性皮膚炎(AD)，IL-31在皮膚損傷中過度表現且與搔癢相關(Takaoka 2005；Takaoka 2006)。此外，在鼠類模型中，已經顯示IL-31誘發搔癢症快速發作(Raap 2008)。

進一步的研究指出，IL-31於人類與異位性皮膚炎所引起的皮膚炎症和搔癢有關。在人類AD患者中，在皮膚損傷中的IL-31 mRNA表現顯著高於非損傷皮膚，並且在非損傷皮膚中的IL-31 mRNA表現高於來自健康患者的正常皮膚(Sonkoly 2006)。另一項研究報導在AD患者皮膚中的CD45RO+(記憶)皮膚淋巴細胞抗原(CLA)陽性T細胞表現IL-31 mRNA和蛋白質(Bilsborough 2006)。其也報導在患者皮膚或過敏性接觸性皮膚炎之IL-31 mRNA過度表現與IL-4和IL-13 mRNA表現相關，而非與干擾素(IFN)-γ mRNA表現相關(Neis 2006)。此外，在患有慢性自發性蕁麻疹的人類患者中顯示IL-31血清水平升高，且甚至高於患有AD的患者(Raap 2010)。此外，在人類中觀察到AD嚴重程度與血清IL-31水平的相關性(Rapp 2008)。於異位性個體中，在IgE交聯之後顯示在肥大細胞中IL-31分泌增加，且如同對於金黃色葡萄球菌超抗原的反應。此外，已顯示IL-31在人類結腸肌纖維母細胞刺激幾種促發炎媒介物的產生，包括IL-6、IL-8、CXCL1、CC17和多種金屬蛋白酶(Yagi 2007)。

針對環境過敏原的第I型過敏反應被認為是犬類AD的主要機制，且在AD患犬的皮膚損傷中Th2介導的細胞因子(例如IL-4)的水平增加(Nuttall 2002)。此外，發炎細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞的浸潤是皮膚損傷惡化的重要機制；趨化性基因(例如CCL17/TARC、CCR4和CCL28/黏膜相關上皮趨化因子(MEC))的過度表現有助於AD患犬皮膚損傷的惡化(Maeda 2005；Maeda 2002；and Maeda 2008)。

最近的證據表明，IL-31可能涉及促進過敏性氣喘之過敏性發炎和呼吸道上皮反應特點(Chattopadhyay 2007；and Wai 2007)。

這些觀察結果支持IL-31在搔癢和過敏症狀中扮演重要角色的假設。期望提供可引發針對IL-31之抗體的胜肽免疫原，其有助於治療搔癢症狀及/或過敏症狀，例如犬類、貓類及/或人類的異位性皮膚炎。

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揭露的胜肽免疫原構建含有約25個或更多個胺基酸。此胜肽免疫原構建含有來自犬類IL-31蛋白質(GenBank：BAH97742.1)部分之B細胞抗原決定位。犬類和人類IL-31蛋白質的全長胺基酸序列分別如表1中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。B細胞抗原決定位可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白質的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。揭露的胜肽免疫原構建可刺激針對IL-31具有高特異性之抗體的產生。揭露的胜肽免疫原構建可供患有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)之動物作為免疫治療之使用。

胜肽免疫原構建之B細胞抗原決定位部份具有來自全長犬類IL-31蛋白質(SEQ ID NO：1)或全長人類IL-31蛋白質(SEQ ID NO：2)的胺基酸序列。在一些實施例中，B細胞抗原決定位具有含有如表1所示SEQ ID NOs：1至13及93至98任一之序列。

本揭露的胜肽免疫原構建可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白質的異源性Th抗原決定位胺基酸序列(例如SEQ ID NOs：14至42)。在某些實施例中，異源性Th抗原決定位衍生自自然界的病原菌，例如白喉毒素(SEQ ID NO：18)、惡性瘧原蟲(SEQ ID NO：19)、霍亂毒素(SEQ ID NO：21)。在其他實施例中，異源性Th抗原決定位為以單一序列或組合序列(例如SEQ ID NOs：25、24和26)形式之衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位。

在一些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IL-31的B細胞抗原決定位，其透過任選的異源性間隔子連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。在某些實施例中，胜肽免疫原構建包含具有來自IL-31之胺基酸序列的B細胞抗原決定部位(例如SEQ ID NOs：1至13)，其透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白質的異源性Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：14至42)。在一些實施例中，任選的異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的分子或化學結構。在某些實施例中，間隔子是天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸或其組合。在具體實施例中，胜肽免疫原構建具有如表3所示SEQ ID NOs：43至90及99至105的胺基酸序列。

本揭露也關於包含IL-31胜肽免疫原構建的組成物。在一些實施例中，揭露的組成物包含超過一個的IL-31胜肽免疫原構建。在某些實施例中，組成物包含IL-31胜肽免疫原構建的混合物(例如SEQ ID NOs：43-90的任意組合)，以涵蓋受試者的廣泛遺傳背景。相較於只包含單一胜肽免疫原構建的組成物，包含胜肽免疫原構建混合物的組成物在免疫接種後可導致較高百分比的反應率，以治療搔癢症狀及/或過敏症狀，例如異位性皮膚炎。

本揭露也關於用以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的醫藥組成物。在一些實施例中，醫藥組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含胜肽免疫原複合物的組成物以透過靜電結合所形成。這種穩定化的免疫刺激複合物可進一步增強胜肽免疫原構建的免疫原性。在一些實施例中，醫藥組成物包含佐劑，例如礦物鹽，其包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)、磷酸鋁(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 50V2、ISA 51或ISA 720的油包水乳液。

本揭露也關於針對揭露的IL-31胜肽免疫原構建的抗體。具體而言，當投予受試者時，本揭露的胜肽免疫原構建可刺激高特異性抗體的產生，此抗體可與IL-31胺基酸序列(SEQ ID NOs：1-13)交叉反應。利用胜肽免疫原構建製造的高特異性抗體可與重組含有IL-31的蛋白質交叉反應。揭露的抗體利用高特異性結合至IL-31，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與使用用於胜肽抗原性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。

本揭露也包括利用揭露的胜肽免疫原構建及/或針對胜肽免疫原構建的抗體以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的方法。在一些實施例中，用以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的方法包含將包含揭露的胜肽免疫原構建的組成物投予宿主。在某些實施例中，在此方法中所使用的組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，此胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此穩定化的免疫刺激複合物是利用帶負電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)透過靜電結合所形成，其可與進一步補充的佐劑(任選為礦物鹽或油類以作為佐劑)複合，用以投予患有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的受試者。揭露的方法也包括將胜肽免疫原構建投予具有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)風險或已患病之宿主的給藥方案、劑型和途徑。

第1A圖係具有結構和功能特性強調顯示之犬類IL-31蛋白質(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列。

第1B圖係相對於全長犬類IL-31蛋白質於本揭露中所使用抗原決定部位的序列比對和位置。

第2圖係說明利用配製於佐劑ISA50V2中包含IL-31胜肽免疫原之劑型免疫接種天竺鼠後抗IL-31多株抗體效價的圖形。樣品是在注射後(wpi)第3、6、9、12和15週進行分析。

第3A圖係用於在哺乳類動物細胞(Expi 293F)中表現位於羧基端具有His-tag之犬類IL-31的質體圖譜與來自細胞裂解物和培養基利用抗His-tag抗體探測的西方墨點法結果。第3B圖係在12% Bis Tris SDS PAGE上進行分析之His-tagged IL-31蛋白質表現和純化的庫馬斯藍染色結果。第3C圖係如第3B圖所示之SDS-PAGE膠片之西方墨點法的結果，其利用抗His-tag抗體探測。第3D圖顯示以抗His標誌抗體偵測第3C圖中所示SDS-PAGE膠片的西方墨點結果。

第4A圖係說明利用IL-31抗體之體外IL-31引發的訊息傳遞功能抑制測定的圖式。第4B圖係如第4A圖所示測定步驟的放大圖。

第5A和5B圖係利用由expi293細胞產生之犬類IL-31於犬類DH-82單核細胞中所引發的pSTAT3訊息的圖式。第5A圖顯示以劑量依賴方式利用犬類IL-31引發pSTAT3。第5B圖顯示以時間依賴方式利用犬類IL-31引發pSTAT3。

第6A至6B圖顯示在初始免疫後(wpi)第12(第6A圖)和15週(第6B圖)所示利用衍生自揭露的IL-31胜肽免疫原構建的抗-IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31(1μg/mL)所引發的pSTAT3訊息的抑制。

第7圖係顯示在接種後(wpi)第15週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4751kb(SEQ ID NO：43)和p4752(SEQ ID NO：47)之抗-IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31所引發的pSTAT3訊息的抑制圖式。底部小圖描述對重組犬類IL-31蛋白質(Iμg/mL)所引發pSTAT訊息的抑制(IC₅₀)。

第8圖係說明在利用配製於佐劑ISA50V2中包含IL-31胜肽免疫原(SEQ ID NOs：63、68、71、76、80、84)之劑型免疫接種天竺鼠後抗-IL-31多株抗體效價(Log₁₀)的圖式。在初始免疫後(wpi)第3、6、9、12和15週分析樣品。

第9A至9B圖係顯示在初始免疫後(wpi)第6和12週所示利用衍生自揭露的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：63、68、71、76、80及84)的抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31(1μg/mL)所引發的pSTAT3訊息的磷酸化百分比(第9A圖)和抑制百分比(第9B圖)。

第10A至10B圖係顯示在初始免疫後(wpi)第9和12週所示利用衍生自揭露的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID Nos：63、68、71及64)的抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31(1μg/mL)所引發的pSTAT3訊息的磷酸化百分比(第10A圖)和抑制百分比(第10B圖)。

第11A至11B圖係顯示在初始免疫後(wpi)第6、9和12週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)的抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31(1μg/mL)所引發的pSTAT3訊息的磷酸化百分比(第11A圖)和抑制百分比(第11B圖)。

第12圖係顯示在初始免疫後(wpi)第6、9和12週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)的抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31(1μg/mL)所引發的pSTAT3訊息的百分比抑制圖式。底部小圖描述對重組犬類IL-31蛋白質所引發pSTAT訊息的抑制(IC₅₀)。

第13圖為使用犬類IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：84)的米格魯免疫流程。

第14圖為人類IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：84)(Log₁₀)對米格魯B細胞抗原決定位胜肽(2^nd Ab：山羊抗-狗IgG HRP)的免疫原性的評估。

第15圖為以IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：84)(2^nd Ab：兔抗-狗IgG HRP)初次免疫(DPI)後21和41天，狗血清抗體對rcIL-31的效價(Log₁₀)。

第16圖為以IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：84)(2^nd Ab：蛋白A/G-HRP)初次免疫(DPI)後21和41天，狗血清抗體對rcIL-31的效價(Log₁₀)。

第17A至17B圖顯示使用狗免疫血清之IgG偵測犬DH82單核細胞中犬IL-31誘導之pSTAT信號傳導(代表性樣品1至10)的磷酸化百分比(第17A圖)和抑制百分比(第17B圖)。

第18A至18B圖顯示使用Cytopoint(抗-IL-31mAb)偵測犬DH82單核細胞中犬IL-31誘導之pSTAT信號傳導的磷酸化百分比(第18A圖)和抑制百分比(第18B圖)-IC₅₀：3.21μg/m。

第19A至19C圖為各種IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：83和85)免疫之天竺鼠的免疫和採血方式示意圖，如第19A圖。6和15wpi天竺鼠免疫血清之IgG偵測犬DH82單核細胞中犬IL-31誘導之pSTAT信號傳導的磷酸化百分比(第19B圖)和抑制百分比(第19C圖)。

第20A至20B圖為各種人類IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：87、99、100和101)在天竺鼠中的免疫原性(第20A 圖)以及其LogEC₅₀(第20B圖)。

第21圖顯示天竺鼠免疫血清的IL-31反應性多株抗體對IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：87、99、100及101)的IL-31和IL-31Rα相互作用的抑制作用及各構建的IC₅₀。

第22圖顯示針對IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：87和101)之天竺鼠免疫血清之IL-31反應性多株抗體可抑制IL-31誘導之U87MG細胞的STAT3磷酸化。

第23圖顯示天竺鼠免疫血清中針對IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：87和101)之IL-31反應性多株抗體可抑制IL-31誘導之HaCaT細胞的IL-20表現。

第24A至24B圖顯示代表性人類IL-31胜肽構建(SEQ ID NO：101)在各種多組成製劑中的免疫原性(第24A圖)以及各製劑的LogEC₅₀(第24B圖)。

第25A至25B圖顯示天竺鼠免疫血清IL-31反應性多株抗體對人類IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：101)在各組成中對IL-31和IL-31α反應的抑制(第25A圖)及各組成的IC₅₀(第25B圖)。

第26圖顯示針對IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：101)之天竺鼠免疫血清中IL-31反應性多株抗體在各組成中對HaCaT細胞IL-31誘導之IL-20表現的抑制。

本揭露是關於用於治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)之靶向介白素-31(IL-31) 蛋白質部份的個別胜肽免疫原構建。本揭露也關於含有此胜肽免疫原構建的組成物、製備和使用此胜肽免疫原構建的方法，以及利用此胜肽免疫原構建所產生的抗體。

本揭露的胜肽免疫原構建可含有如表2所示衍生自病原菌蛋白質的異源性Th抗原決定位胺基酸序列(例如SEQ ID NOs：14至42)。在某些實施例中，異源性Th抗原決定位衍生自自然界的病原菌，例如：白喉毒素(SEQ ID NO：18)、惡性瘧原蟲(SEQ ID NO：19)、霍亂毒素(SEQ ID NO：21)。在其他實施例中，異源性Th抗原決定位為以單一序列或組合序列(例如SEQ ID NOs：25、24和26)形式存在之衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位。

在一些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IL-31的B細胞抗原決定位，其透過任選的異源性間隔子連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。在某些實施例中，胜肽免疫原構建包含具有來自IL-31之胺基酸序列的B細胞抗原決定部位(例如SEQ ID NOs：1至13)，其透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白質的異源性Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：14至42)。在一些實施例中，任選的異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的分子或化學結構。在某些實施例中，間隔子是天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸或其組合。在具體實施例中，胜肽免疫原構建具有如表3所示SEQ ID NOs：43至90及95至105的胺基酸序列。

本揭露也關於包含IL-31胜肽免疫原構建的組成物。在一些實施例中，揭露的組成物包含超過一個的IL-31胜肽免疫原構建。在某些實施例中，組成物包含IL-31胜肽免疫原構建的混合物(例如SEQ ID NOs：43-90及95至105的任意組合)，以涵蓋受試者的廣泛遺傳背景。相較於只包含單一胜肽免疫原構建的組成物，包含胜肽免疫原構建混合物的組成物在免疫接種後可導致較高百分比的反應率，以治療搔癢症狀及/或過敏症狀，例如異位性皮膚炎。

本揭露也關於用以治療及/或預防搔癢症狀及/ 或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的醫藥組成物。在一些實施例中，醫藥組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含胜肽免疫原複合物的組成物以透過靜電結合所形成。這種穩定化的免疫刺激複合物可進一步增強胜肽免疫原構建的免疫原性。在一些實施例中，醫藥組成物包含佐劑，例如礦物鹽，其包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)、磷酸鋁(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 50V2、ISA 51或ISA 720的油包水乳液。

本揭露也關於針對揭露的IL-31胜肽免疫原構建的抗體。具體而言，當投予受試者時，本揭露的胜肽免疫原構建可刺激高特異性抗體的產生，此抗體可與IL-31胺基酸序列(SEQ ID NOs：1-13及93至98)交叉反應。利用胜肽免疫原構建製造的高特異性抗體可與重組含有IL-31的蛋白質交叉反應。揭露的抗體利用高特異性結合至IL-31，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與使用用於胜肽抗原性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。

本揭露也包括利用揭露的胜肽免疫原構建及/或針對胜肽免疫原構建的抗體以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的方法。在一些實施例中，用以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的方法包含將包含揭露的胜肽免疫原構建的組成物投予宿主。在某些實施例中，此方法中所使用的組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，此胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此穩定化的免疫刺激複合物是利用帶負電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)透過靜電結合所形成，其可與進一步補充的佐劑(任選為礦物鹽或油類以作為佐劑)複合，用以投予患有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)的受試者。揭露的方法也包括將胜肽免疫原構建投予具有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)風險或已患病之宿主的給藥方案、劑型和途徑。

發明說明使用的章節標題僅用於組織，不應解釋為限制所描述的主題。本發明說明所引用的所有參考文獻或參考文獻的部分可併入本發明說明。

本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。

IL-31胜肽免疫原構建

本揭露提供胜肽免疫原構建，其包含具有來自IL-31之胺基酸序列的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。

本文使用術語“IL-31胜肽免疫原構建”或“胜肽免疫原構建”是指胜肽，其包含(a)具有來自犬類IL-31(SEQ ID NO：1)或人類IL-31(SEQ ID NO：2)之全長序列約15個或更多個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子。

在某些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建可利用此分子式表示：(Th)_m-(A)_n-(IL-31片段)-X

或(IL-31片段)-(A)_n-(Th)_m-X

其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子； (IL-31片段)為具有來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2約15至約75個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH₂；m為1至約4；以及n為0至約10。

於下文描述所揭露IL-31胜肽免疫原構建的各種組分。

a.IL-31片段

揭露的胜肽免疫原構建含有約25個或更多個總胺基酸，具有來自IL-31蛋白質約15個胺基酸。此胜肽免疫原構建含有具有如表1所示SEQ ID NO：1胺基酸序列來自犬類IL-31蛋白質(GenBank：BAH97742.1)的B細胞抗原決定位，或具有如表1所示SEQ ID NO：2胺基酸序列來自人類IL-31蛋白質(GenBank：AAS86448.1)的B細胞抗原決定位。B細胞抗原決定位可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白質的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。揭露的胜肽免疫原構建可刺激針對IL-31具有高特異性之抗體的產生。揭露的胜肽免疫原構建可供患有搔癢症狀及/或過敏症狀(例如異位性皮膚炎)之受試者作為免疫治療之使用。

在一些實施例中，B細胞抗原決定位具有含有如表1所示SEQ ID NOs：1-13及93至98任一之序列。表1所示的IL-31片段為例示性的，且本揭露包括分別為SEQ ID NOs：1和2之全長犬類IL-31蛋白質或人類IL-31蛋白質的任何其他片段。

b.異源性T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)

本揭露提供胜肽免疫原構建，其包含來自IL-31的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。

於IL-31胜肽免疫原構建中的異源性Th抗原決定位可增強IL-31片段的免疫原性，其透過合理設計促進針對優化目標B細胞抗原決定位(即IL-31片段)之特異性高效價抗體的產生。

本文使用術語“異源性”是指衍生自並非IL-31野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位為衍生自非天然存在於IL-31之胺基酸序列的Th抗原決定位(即Th抗原決定位對IL-31而言不是自體衍生的)。因為Th抗原決定位對IL-31而言是異源性的，當異源性Th抗原決定位共價連接至IL-31片段時，IL-31的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸。

本揭露的異源性Th抗原決定位可為不具有天然存在於IL-31之胺基酸序列的任何Th抗原決定位。Th抗原決定位可具有衍生自任何物種(例如人類、豬、牛、狗、大鼠、小鼠、天竺鼠等)的胺基酸序列。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC 結合基序，以允許T輔助細胞的最大活化，從而導致免疫反應的啟動和調節。優選的Th抗原決定位本身為非免疫原性的(即如果有的話，很少利用IL-31胜肽免疫原構建所產生抗體是針對Th抗原決定位)，因此允許針對IL-31片段之目標B細胞抗原決定位的非常集中的免疫反應。

本揭露的Th抗原決定位包括，但不限於，衍生自外來病原菌之胺基酸序列，如表2(SEQ ID NOs：14至42)所例示。此外，Th抗原決定位包括理想化人工Th抗原決定位和組合的理想化人工Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：15和22-28)。異源性Th抗原決定位胜肽以組合序列(例如SEQ ID NOs：23-26)呈現，包含基於特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽骨架內於特定位置處作為代表的胺基酸殘基的混合物。可以利用在合成過程期間在特定位置添加選定受保護之胺基酸的混合物，而非一個特定的胺基酸，於單一過程中合成組合胜肽的集合。此種組合異源性Th抗原決定位胜肽集合可允許對具有不同遺傳背景之動物廣泛的Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽之代表性組合序列包含如表2所示的SEQ ID NOs：23-26。本發明的Th抗原決定位胜肽對來自基因多樣性群體的動物和患者提供廣泛的反應性和免疫原性。

包含Th抗原決定位之IL-31胜肽免疫原構建可於與IL-31片段串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位也可包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激對IL-31片段的免疫反應。

Th抗原決定位胜肽的功能免疫類似物也是有效的，且被包括作為本發明的一部分。功能免疫Th類似物可包含於Th抗原決定位中從1至約5個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，其實質上未改變Th抗原決定位的Th刺激功能。如上文針對IL-31片段所描述的，可以利用天然或非天然胺基酸完成保留性取代、添加和插入。表2辨識了Th抗原決定位胜肽之功能類似物的另一種變異物。具體而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs：15和22是MvF4和MvF5的SEQ ID NOs：25和27的功能類似物，因為利用在氨基端和羧基端將各兩個胺基酸刪除(SEQ ID NOs：15和22)或插入(SEQ ID NOs：25和27)而使其胺基酸骨架有所區別。在類似序列的這兩個系列間的差異並不會影響包含於此些序列中之Th抗原決定位的功能。因此，功能免疫Th類似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NOs：15、22、23、25和27)和衍生自肝炎表面蛋白HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NOs：24、26和28)之Th抗原決定位的多種版本。

在IL-31胜肽免疫原構建中的Th抗原決定位可共價連接於IL-31胜肽的氨基端或羧基端。在一些實施例中，Th抗原決定位是共價連接至IL-31胜肽的氨基端。在其他實施例中，Th抗原決定位是共價連接至IL-31胜肽的羧基端。在某些實施例中，超過一個的Th抗原決定位共價連接至IL-31片段。當超過一個的Th抗原決定位連接至IL-31片段時，每一個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。另外，當超過一個的Th抗原決定位連接至IL-31片段時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接至IL-31片段的氨基端，或連續地連接至IL-31片段的羧基端，或當不同的Th抗原決定位共價連接至IL-31片段的羧基端時，Th抗原決定位可共價連接至IL-31片段的氨基端。Th抗原決定位相對於IL-31片段的排列並無限制。

在一些實施例中，Th抗原決定位直接地共價連接至IL-31片段。在其他實施例中，Th抗原決定位透過於下文進一步詳細描述的異源性間隔子共價連接至IL-31片段。

c.異源性間隔子

揭露的IL-31胜肽免疫原構建任選地包含異源性間隔子，其將來自IL-31的B細胞抗原決定位共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。

如上所述，術語“異源性”是指衍生自並非IL-31野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，當異源性間隔子共價連接至來自IL-31的B細胞抗原決定位時，IL-31的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸，因為間隔子對IL-31序列而言是異源性的。

間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的任何分子或化學結構。依據應用的不同，間隔子的長度或極性可能會有所不同。間隔子連接可透過酰胺或羧基連結，但是其他官能基也是可能的。間隔子可包括化學化合物、天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。

間隔子可為IL-31胜肽免疫原構建提供結構特徵。結構上，間隔子提供Th抗原決定位與IL-31片段的B細胞抗原決定位的物理分離。透過間隔子的物理分離可破壞透過將Th抗原決定位連接至B細胞抗原決定位所產生的任何人工二級結構。另外，透過間隔子之抗原決定位的物理分離可消除Th細胞及/或B細胞反應之間的干擾。此外，可設計間隔子以產生或修飾胜肽免疫原構建的二級結構。例如，可設計間隔子以作為柔性鉸鏈，用以增強Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的分離。柔性鉸鏈間隔子也可允許所呈現之胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效率的交互作用，以增強對Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的免疫反應。編碼柔性鉸鏈之序列的例示見於通常富含脯胺酸的免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：92)提供了一種作為間隔子使用之特別有用的柔性鉸鏈，其中Xaa是任何胺基酸，以天門冬胺酸為優選。

間隔子也可為IL-31胜肽免疫原構建提供功能特徵。例如，可設計間隔子以改變IL-31胜肽免疫原構建的總電荷，其可影響胜肽免疫原構建的溶解度。此外，改變IL-31胜肽免疫原構建的總電荷可影響胜肽免疫原構建與其他化合物和試劑結合的能力。如下文進一步詳細討論的，IL-31胜肽免疫原構建可透過靜電結合與高度帶電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物。IL-31胜肽免疫原構建的總電荷對於形成這些穩定的免疫刺激複合物是重要的。

可作為間隔子的化學化合物包括，但不限於，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(AEEA,mini-PEG1)、12-氨基-4,7,10-三氧雜十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。

天然存在的胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。

非天然存在的胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、氨基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪胺酸、焦麩胺酸等。

IL-31胜肽免疫原構建中的間隔子可共價連接在Th抗原決定位和IL-31胜肽的氨基端或羧基端。在一些實施例中，間隔子共價連接至Th抗原決定位的羧基端和IL-31胜肽的氨基端。在其他實施例中，間隔子共價連接至IL-31胜肽的羧基端和Th抗原決定位的氨基端。在某些實施例中，可使用超過一個的間隔子，例如，當在胜肽免疫原構建中存在超過一個的Th抗原決定位時。當使用超過一個的間隔子時，每個間隔子可以彼此相同或不同。此外，當胜肽免疫原構建中存在超過一個的Th抗原決定位時，可利用間隔子分隔開Th抗原決定位，間隔子可為相同或不同，利用間隔子將Th抗原決定位與B細胞抗原決定位分開。間隔子相對於Th抗原決定位或IL-31片段的排列沒有限制。

在某些實施例中，異源性間隔子是天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。在其他實施例中，間隔子包含超過一個的天然存在或非天然存在的胺基酸。在具體實施例中，間隔子為Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。

d.IL-31胜肽免疫原構建的具體實施例

在某些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建可利用以下分子式表示：(Th)_m-(A)_n-(IL-31片段)-X

或(IL-31片段)-(A)_n-(Th)_m-X

其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位； A為異源性間隔子；(IL-31片段)為具有來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2約15至約75個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH₂；m為1至約4；以及n為0至約10。

在某些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建中的異源性Th抗原決定位具有選自SEQ ID NOs：14-42中任一及其組合的胺基酸序列，如表2所示。在具體實施例中，Th抗原決定位具有選自SEQ ID NOs：22-28中任一的胺基酸序列。在某些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建包含超過一個的Th抗原決定位。

在某些實施例中，任選的異源性間隔子是選自Lys-、Gly、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)任一及其組合。在具體實施例中，異源性間隔子為ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。

在某些實施例中，IL-31片段具有來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2約15至約65個胺基酸殘基。在具體實施例中，如表1所示，IL-31片段具有以SEQ ID NOs：1-13及93至98作為代表的胺基酸序列。

在某些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建具有選自SEQ ID NOs：43-90及99至105任一的胺基酸序列，如表3所示。

e.變異物、同源物和功能類似物

也可使用上述免疫原胜肽的變異物和類似物，其可誘導抗體及/或與抗體交叉反應，而此抗體是針對IL-31蛋白質的優選抗原決定位。類似物(包括等位基因、物種以及誘導變異物)，通常於一個、兩個或幾個位置上有別於天然存在的胜肽，通常是由於保留性取代。類似物通常展現與天然胜肽至少80或90%的序列一致性。一些類似物還包括非天然胺基酸或在一個、兩個或幾個位置上之氨基端或羧基端胺基酸的修飾。

功能類似物的變異物可具有於胺基酸位置的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。

保留性取代是指一個胺基酸殘基被另一個具有相似化學性質的胺基酸殘基所取代。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電的(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；而帶負電的(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。

在一個特定實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少50%的一致性。在另一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少80%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少85%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少90%的一致性。

變異物還包括磷酸化殘基的變化。例如，變異物可包括在被磷酸化之胜肽內的不同殘基。變異物免疫原性IL-31胜肽也可包括偽磷酸化胜肽。偽磷酸化胜肽是藉由用酸性胺基酸殘基(例如麩胺酸和天門冬胺酸)取代IL-31胜肽之一個或多個磷酸化的絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸殘基所產生。

組成物

本揭露還提供包含揭露的IL-31免疫原構建的組成物。

a.胜肽組成物

包含揭露的IL-31胜肽免疫原構建的組成物可為液體或固體形式。液體組成物可包括不改變IL-31胜肽免疫原構建之結構或功能特性的水、緩衝液、溶劑、鹽及/或任何其他可接受的試劑。胜肽組成物可含有一種或多種揭露的IL-31胜肽免疫原構建。

b.醫藥組成物

本揭露還關於包含揭露的IL-31胜肽免疫原構建的醫藥組成物。

醫藥組成物可含有藥學上可接受的遞送系統中的載體及/或其他添加劑。因此，醫藥組成物可含有IL-31胜肽免疫原構建的藥學上有效劑量以及藥學上可接受的載體、佐劑及/或其它賦形劑(例如稀釋劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、助溶劑、緩衝劑等)。

醫藥組成物可含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強針對IL-31胜肽免疫原構建的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。醫藥組成物中使用的佐劑可包括油、油乳液、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、仿病毒顆粒(virosomes)、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施例中，佐劑可選自明礬(磷酸鋁鉀)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、磷酸鈣、弗氏不完全佐劑(IFA)、弗氏完全佐劑、MF59、佐劑65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、Emulsigen®、單磷酸脂質A(MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂質、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂質(脂質A)、γ菊糖、藻類菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)，以及其他佐劑和乳化劑。

在一些實施例中，醫藥組成物含有Montanide^TM ISA 51(由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、Tween® 80(也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以Emulsigen或Emulsigen D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。

醫藥組成物還可包括藥學上可接受的添加劑或賦形劑。例如，醫藥組成物可含有抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、增積劑、載劑、螫合劑、著色劑、稀釋劑、崩散劑、乳化劑、填充劑、膠化劑、pH緩衝劑、防腐劑、助溶劑、穩定劑等。

醫藥組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製醫藥組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。

醫藥組成物可以以液體溶液或懸浮液型式配製成注射劑。含有IL-31胜肽免疫原構建的液體載體也可在注射前製備。醫藥組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製醫藥組成物供靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投予。也可製備適用於其它給藥方式的醫藥組成物，包括口服和鼻內應用。

醫藥組成物也可以適合的劑量單位形式配製。在一些實施例中，醫藥組成物含有每公斤體重約0.5μg至約1mg的IL-31胜肽免疫原構建。醫藥組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，包括投予方式、靶點、患者的生理狀態、患者是人類或動物、投予的其它藥物，以及處理是供預防還是治療。通常，患者是人類，但也可治療包括基因轉殖哺乳類動物的非人類哺乳類動物。當以多劑量遞送時，醫藥組成物可以方便地分成每個劑量單位形式的適當量。投予的劑量取決於治療領域眾所周知的受試者的年齡、體重和一般健康狀況。

在一些實施例中，醫藥組成物含有超過一種的IL-31胜肽免疫原構建。含有超過一種IL-31胜肽免疫原構建之混合物的醫藥組成物允許協同性增強構建的免疫效力。含有超過一種IL-31胜肽免疫原構建的醫藥組成物可在更大的遺傳群體中更為有效，這是由於廣泛的第2類MHC覆蓋，因此提供針對IL-31胜肽免疫原構建之經改善的免疫反應。

在一些實施例中，醫藥組成物含有選自SEQ ID NOs：43-90及99至105的IL-31胜肽免疫原構建(表3)，以及其同源物、類似物及/或組合。在具體實施例中，醫藥組成物含有選自SEQ ID NOs：43-90及99至105(表3)的IL-31胜肽免疫原構建，以及其任意組合。

含有IL-31胜肽免疫原構建的醫藥組成物可用以於投予後在宿主中引發免疫反應並產生抗體。

c.免疫刺激複合物

本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺激複合物的IL-31胜肽免疫原構建的醫藥組成物。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑和胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物呈微粒形式，其可有效地將IL-31胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞以產生免疫反應。免疫刺激複合物可配製成用於腸胃外投予的懸浮液。免疫刺激複合物還可配製成w/o乳液形式，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，用於在腸胃外投予後將IL-31胜肽免疫原有效遞送至宿主免疫系統的細胞。

穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將IL-31胜肽免疫原構建與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可作為免疫原遞送系統併入醫藥組成物中。

在某些實施例中，將IL-31胜肽免疫原構建設計成包含陽離子部份，其於範圍為5.0至8.0的pH下帶有正電荷。IL-31胜肽免疫原構建或構建的混合物的陽離子部份的淨電荷計算是依據，每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及序列中其他胺基酸所帶的電荷為0。將在IL-31胜肽免疫原構建中之陽離子部份的電荷相加，並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。優選地，胜肽免疫原具有範圍大於+2之淨正電荷。在一些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建的陽離子部份為異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列為(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)時，IL-31胜肽免疫原構建的陽離子部份具有+4的電荷。

如本文所述的“陰離子型分子”是指在範圍為5.0至8.0的pH下帶有負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中的每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單鏈DNA分子，CpG基序的重複數在1至10的範圍內。優選地，CpG免疫刺激性單鏈DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，CpG基序的重複數在3至8的範圍內。

更優選地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' X¹CGX² 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X¹是選自由A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)和T(胸腺嘧啶)組成的群組；且X²是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' (X³)₂CG(X⁴)₂ 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X³是選自由A、T或G組成的群組；且X⁴是C或T。

所得到的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常在1-50微米的範圍內，且是許多因素(包括相互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。微粒免疫刺激複合物具有提供佐劑化和體內特異性免疫反應之向上調節的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適用於透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組成物。

抗體

本揭露還提供利用IL-31胜肽免疫原構建所引發的抗體。

本揭露IL-31胜肽免疫原構建包含IL-31片段、異源性Th抗原決定位，以及任選的異源性間隔子，當投予宿主時IL-31胜肽免疫原構建可引發免疫反應和抗體的產生。IL-31胜肽免疫原構建設計可破壞針對自體IL-31的免疫耐受，並引發可辨識構型抗原決定位(而非線性抗原決定位)之位點特異性抗體的產生。

由IL-31胜肽免疫原構建產生的抗體可辨識並結合形式為單體、二聚體、三聚體和寡聚體的IL-31。

利用本發明IL-31胜肽免疫原構建免疫的動物產生的免疫反應證實構建具有產生與IL-31反應之有效的定點抗體(site-directed antibodies)的能力。

方法

本揭露還涉及用以製備和使用IL-31胜肽免疫原構建、組成物和醫藥組成物的方法。

a.IL-31胜肽免疫原構建的製造方法

本揭露的IL-31胜肽免疫原構建可利用普通技術人員所熟知的化學合成方法加以製備(參見例如Fields et al.,Chapter 3 in Synthetic Peptides：A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman & Co.,New York,NY,1992,p.77)。IL-31胜肽免疫原構建可利用自動化美利弗德(Merrifield)固相合成法來合成，利用側鏈受保護之胺基酸，以t-Boc或F-rnoc化學保護α-NH₂，在例如應用生物系統胜肽合成儀430A或431型(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A或431)上進行。包含Th抗原決定位之組合資料庫胜肽的IL-31胜肽免疫原構建的製備可透過提供用於在給定可變位置進行偶聯的替代性胺基酸的混合物而達成。

在欲求之IL-31胜肽免疫原構建組裝完成後，依照標準程序處理樹脂，將胜肽從樹脂上切下，並將胺基酸側鏈上的官能基切除。可利用HPLC純化游離的胜肽，並利用例如胺基酸分析或定序以描述生化特性。胜肽的純化和表徵方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。

可以控制和確定透過此化學過程所產生之胜肽的品質，且結果是IL-31胜肽免疫原構建的再現性、免疫原性和產量可以獲得保證。透過固相胜肽合成之IL-31胜肽免疫原構建的製造的詳細描述顯示於實施例1中。

已經發現允許保留欲求免疫活性之結構變異範圍比起允許保留小分子藥物特定藥物活性或與生物來源藥品共同產生的大分子中存在欲求活性及非欲求毒性的結構變異範圍更具包容性。因此，與欲求胜肽具有相似的色層分析和免疫學特性的胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成過程錯誤而無法避免地作為刪除序列副產物的混合物產生的，其通常如經純化之欲求的胜肽製劑具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以監控製造過程與產品評估過程，確保使用這些胜肽之終產物的再現性與有效性，則經設計的類似物與非預期的類似物的混合物也是有效的。

也可利用包括核酸分子、載體及/或宿主細胞的重組DNA技術來製備IL-31胜肽免疫原構建。因此，編碼IL-31胜肽免疫原構建及其免疫功能類似物的核酸分子也包括在本揭露中作為本發明的一部分。類似地，包含核酸分子的載體(包括表現載體)以及含有載體的宿主細胞也包括在本揭露中作為本發明的一部分。

各種例示性實施例也包括製造IL-31胜肽免疫原構建及其免疫功能類似物的方法。例如，方法可包括在表現胜肽及/或類似物的條件下培養宿主細胞之步驟，宿主細胞包含含有編碼IL-31胜肽免疫原構建及/或其免疫功能類似物之核酸分子的表現載體。較長的合成胜肽免疫原可利用公知的重組DNA技術來合成。這些技術可於具有詳細實驗計畫之眾所周知的標準手冊中加以提供。為了構建編碼本發明胜肽的基因，將胺基酸序列反向轉譯以獲得編碼胺基酸序列的核酸序列，優選地利用對於其中具有待表現基因的生物體來說最適合的密碼子。接下來，通常透過合成編碼胜肽和任何調節因子(如有必要的話)的寡核苷酸以製造合成基因。將合成基因插入適合的選殖載體內並轉染到宿主細胞中。然後在適合所選表現系統和宿主的合適條件下表現胜肽。利用標準方法純化胜肽並描述其特性。

在一些實施例中，IL-31胜肽免疫原構建可以在允許脂化的特定大腸桿菌菌株中表現以製備IL-31脂蛋白，如美國第8,426,163號專利中所述，其透過引用整體併入本文。在某些實施例中，使用的大腸桿菌菌株對由外源蛋白質(特別是膜蛋白)過量表現所引發的毒性作用具有抗性。這種大腸桿菌菌株可以利用美國第6,361,966號專利所描述的方法而被鑑定/產生，其透過引用整體併入本文。能夠產生脂化形式之脂蛋白的大腸桿菌菌株的實例包括，但不限於，C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)和C2014(DE3)(NCIMB 40884)。可以透過常規重組技術在上述的一種大腸桿菌菌株中表現IL-31的脂化形式。簡而言之，可透過例如PCR增幅從其天然來源獲得編碼IL-31的DNA片段，並任選地進行修飾以優化在大腸桿菌中的密碼子使用。然後將DNA片段插入大腸桿菌表現載體中以產生表現質體。優選地，由強啟動子(例如T7、T5、T3或SP6)驅動IL-31脂蛋白的表現，其可例如透過IPTG加以誘導。然後將表現質體引入選擇的大腸桿菌菌株中，並且在對於蛋白質表現合適的條件下培養陽性轉形體。因此可從大腸桿菌細胞中分離出表現的脂蛋白並透過本領域已知的方法(例如利用抗脂蛋白抗體進行免疫墨點法或質譜分析)證實其脂化狀態。

b.免疫刺激複合物的製造方法

各種例示性實施例還包括製造包含IL-31胜肽免疫原構建和CpG寡去氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激複合物的方法。穩定化的免疫刺激複合物(ISC)衍生自IL-31胜肽免疫原構建的陽離子部份和聚陰離子CpG ODN分子。自行組合系統是由電荷的靜電中和所驅動。IL-31胜肽免疫原構建之陽離子部分對陰離子寡聚合物的莫耳電價比例的化學計量決定締合的程度。IL-31胜肽免疫原構建和CpG ODN的非共價靜電結合是完全可再現的過程。此胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物聚集體有助於呈現至免疫系統中“專業的”抗原呈現細胞(APC)，因此可進一步增強複合物的免疫原性。在製造過程中，可輕易地描繪此些複合物的特徵以控制品質。胜肽/CpG ISC在體內具有良好的耐受性。設計這種包含CpG ODN和IL-31片段衍生之胜肽免疫原構建的新穎微粒系統，以利用與CpG ODN使用相關的廣義B細胞促有絲分裂(mitogenicity)，但促進平衡的Th-1/Th-2型反應。

在揭露的醫藥組成物中的CpG ODN在由相反電荷靜電中和所介導的過程中100%結合至免疫原，導致微米大小之微粒的形成。微粒形式允許來自CpG佐劑常規使用之CpG劑量的顯著減少，不利的先天性免疫反應的可能性更低，且促進包括抗原呈現細胞(APC)在內的替代性免疫原處理途徑。因此，此種劑型在概念上是新穎的，且透過替代的機制藉由促進免疫反應的刺激而提供潛在的優點。

c.醫藥組成物的製造方法

各種例示性實施例還包括含有IL-31胜肽免疫原構建的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物是利用油包水乳液和具有礦物鹽的懸浮液的劑型。

為了使醫藥組成物可被廣大群體所使用，且避免IL-31聚集也成為投藥目標的一部分，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在臨床試驗中對於許多劑型而言在人類使用油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是製劑中使用的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽磷酸鋁(ADJUPHOS)經常作為製劑中的佐劑供臨床應用。

其他佐劑和免疫刺激劑包括3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A(MPL)或3-DMP、聚合或單體胺基酸，例如聚麩胺酸或聚離胺酸。此種佐劑可以與或不與其他特定的免疫刺激劑一起使用，免疫刺激劑例如muramyl peptides(例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP) N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(MTP-PE)、N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxy propylamide(DTP-DPP)Theramide^TM)，或其他細菌細胞壁成份。水包油乳液包含MF59(參見Van Nest等人的專利申請案WO 90/14837，其透過引用整體併入本文)，包含5%角鯊烯、0.5% Tween 80，以及0.5% Span 85(任選含有不同量的MTP-PE)，利用微射流機配製成次微米顆粒；SAF，包含10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5% pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩渦震盪以產生大顆粒乳液；以及Ribi^TM佐劑系統(RAS)(Ribi ImmunoChem,Hamilton,Mont.)，其包含2%角鯊烯、0.2% Tween 80，以及一種或多種的細菌細胞壁成份，細菌細胞壁成份選自由monophosphoryllipid A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)以及細胞壁骨架(CWS)組成的群組，優選為MPL+CWS(Detox^TM)。其他佐劑包含弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)，以及細胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)，以及腫瘤壞死因子(TNF))。

佐劑的選擇取決於含有佐劑之免疫原製劑的穩定性、給藥途徑、給藥計畫、佐劑對接種疫苗之物種的效力，且在人類是指已經被相關監管機構批准或可批准用於人類給藥的藥學上可接受的佐劑。例如單獨明礬、MPL或弗氏不完全佐劑(Chang et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 32：173-186(1998)，其透過引用整體併入本文)或適合人類投予之其任選地所有組合。

組成物可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，其被定義為通常用於配製供動物或人類給藥的醫藥組成物的載體。選擇稀釋劑以免影響此結合的生物活性。此種稀釋劑的範例是蒸餾水、生理磷酸緩衝鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和漢克溶液。此外，醫藥組成物或劑型還可包含其他載體、佐劑或無毒的，非治療性的，非免疫原性的穩定劑等。

醫藥組成物還可包括大的緩慢代謝的大分子 (例如蛋白質、多醣類(例如甲殼素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如膠乳功能化瓊脂糖(latex functionalized sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物，以及脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。另外，這些載體可作為免疫刺激劑(即佐劑)。

本發明的醫藥組成物可進一步包含合適的遞送載體。合適的遞送載體包括，但不限於，病毒、細菌、可生物降解的微球體、微粒、奈米粒子、脂質體、膠原蛋白微球和螺旋體(cochleates)。

d.醫藥組成物的使用方法

本揭露也包括使用包含IL-31胜肽免疫原構建之醫藥組成物的方法。

在某些實施例中，包含IL-31胜肽免疫原構建之醫藥組成物可用以治療及/或預防搔癢症狀及/或過敏症狀，例如異位性皮膚炎。

具體實施例

(1)一種以分子式代表之IL-31胜肽免疫原構建： (Th)_m-(A)_n-(IL-31片段)-X

或(IL-31片段)-(A)_n-(Th)_m-X

(2)依據(1)之IL-31胜肽免疫原構建，其中IL-31片段是選自由SEQ ID NOs：1-13及93至98組成的群組。

(3)依據(1)或(2)任一之IL-31胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：14-42組成的群組。

(4)依據(1)之IL-31胜肽免疫原構建，其中胜肽免疫原構建是選自由SEQ ID NOs：43-90及99至105組成的群組。

(5)一種IL-31胜肽免疫原構建包含：包含來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之全長IL-31蛋白質序列約15至約75個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；包含選自由SEQ ID NOs：14-42組成之群組之胺基酸序列的T輔助細胞抗原決定位；以及選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)組成之群組的任選的異源性間隔子，其中B細胞抗原決定位是直接或透過任選的異源性間隔子共價連接至T輔助細胞抗原決定位。

(6)(5)的IL-31胜肽免疫原構建，其中B細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：1-13及93至98組成的群組。

(7)(5)的IL-31胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：14-42組成的群組。

(8)(5)的IL-31胜肽免疫原構建，其中任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。

(9)(5)的IL-31胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端。

(10)(5)的IL-31胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是透過任選的異源性間隔子共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端。

(11)一種包含依據(1)至(4)任一之胜肽免疫原構建的組成物。

(12)一種醫藥組成物包含：a.依據(1)至(4)任一的胜肽免疫原構建；以及b.藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。

(13)(12)的醫藥組成物，其中a.IL-31胜肽免疫原構建是選自由SEQ ID NOs：43至90及99至105組成的群組；以及b.IL-31胜肽免疫原構建與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化免疫刺激複合物。

(14)一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至依據(1)至(10)任一之IL-31胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位。

(15)依據(14)之分離抗體或其抗原決定位結合片段結合至IL-31胜肽免疫原構建。

(16)一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至依據(1)至(10)任一之IL-31胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位。

(17)一種包含依據(14)至(16)任一之分離抗體或其抗原決定位結合片段的組成物。

實施例1. IL-31相關胜肽的合成及其劑型的製備

a.IL-31片段

描述了包含在IL-31胜肽免疫原構建發展計畫中用以合成專門設計的IL-31片段的方法。以小規模量合成的胜肽用於血清學分析、實驗室試驗和田間試驗，其可用於分析醫藥組成物。為了篩選和選擇最佳胜肽構建供有效IL-31胜肽免疫原構建之使用，設計了包含具有長度為約15至約75個胺基酸之序列的大量IL-31相關抗原性胜肽(表1)。

使用來自全長犬類IL-31(SEQ ID NO：1)(第1A圖)和人類IL-31(SEQ ID No：2)蛋白質的胺基酸序列。在表1中鑑定了在各種血清學測定中用於抗原決定位鑑定的IL-31片段(SEQ ID NOs：3-13及93至98)，並且在第1B圖中顯示IL-31片段對全長序列的相對序列比對。將選擇的IL-31片段(SEQ ID NOs：3-13及93至98)透過合成方式連接至精心設計的T輔助細胞(Th)抗原決定位製成IL-31胜肽免疫原構建，此T輔助細胞抗原決定位衍生自病原菌蛋白質，包括被鑑定於表2中的UBITh®1和UBITh®2(分別為SEQ ID NOs：26和25)。T輔助細胞抗原決定位被以單一序列(UBITh®1)或組合資料庫(UBITh®3)形式使用，以增強其各自IL-31胜肽免疫原構建的免疫原性。

在表3中鑑定了具代表性的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：43-90及99至105)。利用鑑定的胜肽編碼於表3中顯示了被合成並評估的IL-31胜肽免疫原構建。

b.典型的胜肽合成

用於供抗IL-31抗體偵測及/或測量之免疫原性研究或相關血清學測試的胜肽通常是在應用生物系統胜肽合成儀430A、431及/或433型上利用F-moc化學小規模合成。每一個胜肽是透過在固相載體上的獨立合成所製備，在三官能基胺基酸的氨基端與側鏈保護基團具有F-moc保護。將完整的胜肽從固相載體上切下，並利用90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)評估合成的胜肽以確定正確的胺基酸組成。也利用反相HPLC(RP-HPLC)評估各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。儘管嚴格控制合成過程(包括逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、取代及提前終止，仍可能產生胜肽類似物。因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物與目標胜肽。儘管包括這些非預期的胜肽類似物，但最後的合成胜肽產物仍可用作免疫應用，包括免疫診斷(作為抗體捕捉抗原)與醫藥組成物(作為胜肽免疫原)。一般來說，只要開發一嚴格的QC程序來監測製造過程及產品品質評估程序，以確保使用這些胜肽之最終產物的再現性與有效性，此胜肽類似物，包括刻意設計或合成程序中產生的副產物混合物，通常可如欲求胜肽的純化產物同樣有效。可利用客製的自動胜肽合成儀UBI2003或類似機型以15mmole至50mmole的規模合成數百至數千克的大量胜肽。對於供臨床試驗之最終醫藥組成物使用的活性成分，可利用預備的RP-HPLC於淺洗脫梯度下純化IL-31胜肽構建，利用MALDI-TOF質譜儀確定胺基酸組成，並以胺基酸分析與RP-HPLC評估純度與一致性。

實施例2. 天竺鼠的IL-31免疫接種

a.動物

使用總共15隻體重為300-350g的天竺鼠評估代表性犬類IL-31肽免疫原構建(SEQ ID NOs：43、47、51、55和59)的免疫原性。如表4所示，將15隻天竺鼠分成5個組別，每個組別3隻動物，並且利用400μg胜肽進行初始免疫，然後在初始免疫後(wpi)第3、6、9和12週進行4次加強免疫。在0、3、6、9、12和15 wpi收集血液樣品以測定抗-IL-31抗體的效價。

b.劑型

用於免疫接種的製劑含有以下物質：

1.400μg的IL-31胜肽免疫原構建

2.胜肽：CpG比例為0.7：1的CpG

3.0.2% TWEEN 80

c.血清抗IL-31抗體的效價測定(利用ELISA)

根據以下方案評估由IL-31胜肽免疫原構建所引發的血清抗IL-31抗體的效價測定：利用配製於pH9.6之50mM 1μg/ml碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中濃度為0.2μg/0,1mL/孔洞的犬類IL-31重組蛋白(rcIL-31)(50ng/孔洞)或IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：3-13及93-98)以100μl體積於37℃下作用1小時以塗覆96孔盤的孔洞。

將rcIL-31塗覆的孔洞與200μl含有1%牛血清白蛋白之PBS於37℃下作用1小時以阻斷非特異性蛋白質的結合，隨後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。將100μl來自經免疫之天竺鼠的連續稀釋血清樣品加至各孔洞中，並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS清洗孔洞5次並乾燥。將配製於含有1% BSA和0.05% Tween 20之PBS中具有最佳稀釋濃度的100μl過氧化物酶標記的山羊抗天竺鼠IgG加至各孔洞中，並在37℃下反應1小時。反應後，利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞六次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm處的吸光值。

為了測定於接受基於IL-31胜肽之疫苗製劑的天竺鼠中的抗體效價，從1：100起進行血清的10倍連續稀釋，供代表性標靶“IL31”B細胞抗原決定位胜肽之起始篩選使用，利用Log₁₀表示效價。為了進一步分析血清與重組犬類IL31的交叉反應，在ELISA上進行從1：100至1：54248800之血清的2倍連續稀釋，並將效價表示為Log EC₅₀。

d.結果

表5顯示來自利用針對標靶IL31 B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：43、47、51、55及59)之各自效價的免疫原性評估結果。

表6和第2圖顯示針對每種IL-31胜肽免疫原構建之對重組犬類IL-31的抗體效價(Log EC₅₀)。

所設計的犬類IL-31胜肽免疫原構建具有高免疫原性，其中SEQ ID NOs：3至7 IL-31區域所覆蓋的AA90-AA144(SEQ ID NO：8)在3wpi一次給藥可引發高效價抗體。所設計的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：43、47、51、55及59)引發的抗體對犬rIL-31具有高交叉反應性。

實施例3. 用於生物分析之犬類IL-31的生產、純化和特性鑑定

a.表現構築

透過利用NCBIs基因組資源(website：ncbi.nlm.nih.gov)鑑定犬類IL-31的序列。利用含有羧基端6-His標籤的全長犬類IL-31基因產生表現構築以用於檢測和純化(第3A圖及第3B圖)。將確認過序列的質體轉染至Expi293細胞中，且將表現的IL-31分泌至培養基中。在轉染72小時後收集培養基，並使用鎳鈷樹脂進行重組蛋白的純化。在含有分泌形式IL-31的培養基與樹脂結合後，利用體積為10倍管柱體積以內的洗滌緩衝液(pH數值為8.0之50mM Tris緩衝液內含500mM氯化鈉和20mM咪唑)洗滌管柱三次。然後利用體積為5倍管柱體積之洗脫緩衝液(pH數值為8.0之50mM Tris緩衝液內含500mM氯化鈉和250mM咪唑)洗脫重組IL-31。透過SDS-PAGE分析洗脫部分，並利用抗His抗體探測西方墨點法結果。

b.結果

在12% Bis Tris SDS PAGE上進行之His標記IL-31蛋白質表現和純化的庫馬斯藍染色(第3C圖)。利用抗His標記抗體探測如第3B圖所示SDS-PAGE膠片之西方墨點法結果(第3D圖)。鑑定並純化培養基中的21.1KD蛋白質，並以此蛋白作為後續分析免疫原性和交叉反應性的參考蛋白質。

實施例4. 在基於細胞之試驗中IL-31介導的PSTAT3訊息傳遞

a.試驗

於第4A-4B圖及第5A-5B圖顯示使用利用IL-31胜肽免疫原構建所引發之IL-31抗體的體外IL-31誘導的訊息傳遞功能抑制測定。

b.IL-31介導的pSTAT3訊息傳遞

將配製於含有15%熱滅活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸鈉、50mg/L健大黴素(gentamicin)和濃度為20ng/mL之犬類干擾素-γ的MEM培養基中的DH-82細胞以每孔洞為1 x 10⁵細胞的細胞密度接種於96孔平底細胞培養盤中，於補充有5%二氧化碳之潮濕空氣中於37℃下培養16小時。在IL-31處理之前進行血清飢餓兩小時以增加IL-31受體表現。在預處理之後，將重組犬類IL-31以不同劑量(0.0001至10ng/mL)反應5分鐘(第5A圖)或1μg/mL反應0、3、5、10及15分鐘(第5B圖)。在接種之後，利用20%終體積之Cell Lysis Mix(5X)裂解細胞，並將其於37℃下以300rpm振盪10分鐘。使用50μl細胞裂解物評估pSTAT3。將50μl過氧化物酶標記的抗pSTAT3(y705)或過氧化物酶標記的抗STAT3抗體加入檢測孔洞並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞五次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm處的吸光值。

c.結果

第5A和5B圖說明利用由expi293細胞產生之犬類IL-31所誘導於犬類DH-82單核細胞中的pSTAT3訊息傳遞圖式。第5A圖顯示以劑量依賴方式利用犬類IL-31誘導pSTAT3，選擇最佳濃度1μg/mL以評估磷酸化。第5B圖顯示以時間依賴方式利用犬類IL-31誘導pSTAT3，以5分鐘作為以下實施例中抑制測定的時間點，來評估抗-IL-31抗體的抑制效力。

實施例5. 在基於細胞之試驗中IL-31介導的PSTAT3訊息傳遞的抑制

a.IL-31介導的pSTAT3訊息傳遞

將配製於含有15%熱滅活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸鈉、50mg/L健大黴素和濃度為20ng/mL之犬類干擾素-γ的MEM培養基中的DH-82細胞以每孔洞為1 x 10⁵細胞的細胞密度接種於96孔平底細胞培養盤中，於補充有5%二氧化碳之潮濕空氣中於37℃下培養16小時。在IL-31處理之前進行血清飢餓兩小時以增加IL-31受體表現。同時，將100μl來自經免疫天竺鼠之利用蛋白質A樹脂純化的連續稀釋血清樣品與濃度為1mg/mL的犬類IL-31充分混合以於37℃下共同培養1小時。在預處理之後，將50μl重組犬類IL-31和純化的血清樣品混合物加入反應5分鐘。在接種之後，利用20%終體積之Cell Lysis Mix(5X)裂解細胞，並將其於37℃下以300rpm振盪10分鐘。使用50μl細胞裂解物評估pSTAT3。將50μl過氧化物酶標記的抗pSTAT3(y705)或過氧化物酶標記的抗STAT3抗體加入檢測孔洞並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞五次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm處的吸光值。

b.結果

第6A-6B圖說明顯示在初始免疫後(wpi)第12(第6A圖)和15週(第6B圖)所示利用衍生自揭露的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：43、47、51、55及59)的抗IL-31 抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31所引發的pSTAT3訊息的抑制圖式。

第7圖說明顯示在接種後(wpi)第15週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4751kb(SEQ ID NO：43)和p4752(SEQ ID NO：47)之抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31所引發的pSTAT3訊息的抑制圖式。第7圖也描述對重組犬類IL-31蛋白質所引發pSTAT訊息的抑制(IC₅₀)。

實施例6.進一步改進犬IL-31肽免疫球蛋白構建於天竺鼠中的免疫原性評估

a.動物

使用總共18隻體重為300-350g的天竺鼠進行免疫。如表7所示，將18隻天竺鼠分成6個組別，每個組別3隻動物，並且利用400μg胜肽(SEQ ID NOs：63、68、71、76、80及84)進行初始免疫，然後在初始免疫後(wpi)第3、6、9和12週進行4次加強免疫。在0、3、6、9、12和15 wpi收集血液樣品以測定抗IL-31抗體的效價。

b.劑型

用於免疫接種的製劑含有以下物質：

1.400μg的IL-31胜肽免疫原構建

2.胜肽：CpG比例為0.7：1的CpG

3.0.2% TWEEN 80

c.血清抗IL-31抗體的效價測定(利用ELISA)

根據以下方案評估由IL-31胜肽免疫原構建所引發的血清抗IL-31抗體的效價測定：利用配製於pH9.6之50mM 1μg/ml碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中犬類IL-31重組蛋白(50ng/well)或代表性IL-31 B抗原決定位胜肽(0.2μg/100μL/well)以100μl體積於37℃下作用1小時以塗覆96孔盤的孔洞。

將rcIL-31或代表性IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：9或12)塗覆的孔洞與200μ1含有1% BSA之PBS於37℃下作用1小時以阻斷非特異性蛋白質的結合，隨後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。將100μl來自經免疫之天竺鼠的連續稀釋血清樣品加至各孔洞中，並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞五次並乾燥。將配製於含有1% BSA和0.05% Tween 20之PBS中具有最佳稀釋濃度的100μl過氧化物酶標記的山羊抗天竺鼠IgG加至各孔洞中，並在37℃下反應1小時。反應後，利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞六次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm處的吸光值。

d.結果

來自免疫原性評估的結果顯示在表8中。

在表9和第8圖中顯示對每種IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID Nos：63、68、71、76、80及84)而言針對重組IL-31的抗體效價(Log EC₅₀)。

這些設計的犬類IL-31胜肽免疫原構建具有高免疫原性，即使在3 wpi一次給藥時也可引發高效價抗體。設計的IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID Nos：63、68、71、76、80及84)引發的抗體對犬類rIL-31具高交叉反應性。

實施例7. 在基於細胞之試驗中天竺鼠血清之抗-IL-31抗體對IL-31介導的PSTAT3訊息傳遞的抑制

a.IL-31介導的pSTAT3訊息傳遞

將配製於含有15%熱滅活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸鈉、50mg/L健大黴素和濃度為20ng/mL之犬類干擾素-γ的MEM培養基中的DH-82細胞以每孔洞為1 x 10⁵細胞的細胞密度接種於96孔平底細胞培養盤中，於補充有5%二氧化碳之潮濕空氣中於37℃下培養16小時。在IL-31處理之前進行血清飢餓兩小時以增加IL-31受體表現。同時，將100μl來自6和12 WPI之經免疫天竺鼠之利用蛋白質A樹脂純化的連續稀釋血清樣品與濃度為1mg/mL的犬類IL-31充分混合以於37℃下共同培養1小時。在預處理之後，將50μl重組犬類IL-31和純化的血清樣品混合物加入反應5分鐘。在接種之後，利用20%終體積之Cell Lysis Mix(5X)裂解細胞，並將其於37℃下以300rpm振盪10分鐘。使用50μl細胞裂解物評估pSTAT3。將50μl過氧化物酶標記的抗pSTAT3(y705)或過氧化物酶標記的抗STAT3抗體加入檢測孔洞並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞5次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm處的吸光值。

b.結果

第9A至9B圖顯示在IL-31肽免疫原構建體(SEQ ID NOs：63、68、71、76、80及84)初次免疫後(wpi)6和12週所獲得天竺鼠免疫血清之抗-IL-31抗體存在下犬DH82單核細胞中犬IL-31誘導的pSTAT3信號傳導的磷酸化百分比(第9A圖)和STAT3磷酸化的抑制(第9B圖)。

第10A至10B圖顯示在IL-31肽免疫原構建體(SEQ ID NOs：63、68、71、76、80及84)初次免疫後(wpi)9和12週所獲得天竺鼠免疫血清之抗-IL-31抗體對犬DH82單核細胞中犬IL-31誘導的pSTAT3信號傳導的磷酸化百分比(第10A圖)和STAT3磷酸化的抑制(第10B圖)。

一般來說，這些設計的IL-31胜肽免疫原構建引發的抗-IL-31反應性抗體顯著地以劑量依賴性方式抑制犬DH82單核細胞中IL-31誘導的pSTAT3信號傳遞。

實施例8. 在基於細胞之試驗中IL-31介導的PSTAT3訊息傳遞的抑制

a.IL-31介導的pSTAT3訊息傳遞

將配製於含有15%熱滅活胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸鈉、50mg/L健大黴素和濃度為20ng/mL之犬類干擾素-γ的MEM培養基中的DH-82細胞以每孔洞為1 x 10⁵細胞的細胞密度接種於96孔平底細胞培養盤中，於補充有5%二氧化碳之潮濕空氣中於37℃下培養16小時。在IL-31處理之前進行血清飢餓兩小時以增加IL-31受體表現。同時，將100μl來自6、9和12 WPI之經免疫天竺鼠之利用蛋白質A樹脂純化的連續稀釋血清樣品與濃度為1mg/mL的犬類IL-31充分混合以於37℃下共同培養1小時。在預處理之後，將50μl重組犬類IL-31和純化的血清樣品混合物加入反應5分鐘。在接種之後，利用20%終體積之Cell Lysis Mix(5X)裂解細胞，並將其於37℃下以300rpm振盪10分鐘。使用50μl細胞裂解物評估pSTAT3。將50μl過氧化物酶標記的抗pSTAT3(y705)或過氧化物酶標記的抗STAT3抗體加入檢測孔洞並在37℃下反應1小時。然後利用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌孔洞五次，並與100μl的TMB受質再反應15分鐘。利用2N H₂SO₄終止反應並測定450nm的吸光值。

b.結果

第11A和11B圖說明顯示在初始免疫後(wpi)第6、9和12週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)的抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31所引發的pSTAT3訊息的磷酸化百分比(第11A圖)和抑制百分比(第11B圖)。

第12圖說明顯示在初始免疫後(wpi)第6、9和12週利用衍生自IL-31胜肽免疫原構建p4854kb(SEQ ID NO：63)和p4859(SEQ ID NO：84)之抗IL-31抗體於犬類DH82單核細胞中犬類IL-31所引發的pSTAT3訊息的抑制百分比圖式。底部小圖描述對重組犬類IL-31蛋白質所引發pSTAT訊息的抑制(IC₅₀)。

一般來說，對於由這些設計的IL-31胜肽免疫原構建引發之抗-IL-31反應性抗體，顯著地以劑量依賴性方式抑制犬DH82單核細胞中IL-31誘導的pSTAT3信號傳導。

實施例9. 在大腸桿菌中生產脂化蛋白質

IL-31胜肽免疫原構建可在允許脂化之特定大腸桿菌菌株中表現以製造脂蛋白，作為治療異位性皮膚炎的免疫原使用。

在美國第8,426,163號專利中描述此過程，其透過引用整體併入本文。

實施例10. 在概念試驗證明中以IL-31肽免疫構建體(SEQ ID NO：84)免疫狗進行功能免疫原性評估

a.動物

使用15隻米格魯進行免疫。將狗分為2組，一組8隻，以油包水乳液製劑進行試驗，另一組為7隻狗，以明礬與皂苷製劑進行試驗。使用100μg含有SEQ ID NO：84 之IL-31胜肽免疫原構建進行初次免疫，在初次免疫(DPI)後21天以相同劑量用相同製劑進行另一次加強免疫。在0、21和41DPI時收集血液樣本，以測量抗-IL-31抗體的效價及評估相應免疫血清中抗體的其他功能特性。免疫方式如第13圖所示。

b.血清抗IL-31抗體針對IL-31B抗原決定位或重組狗IL-31蛋白的ELISA效價

根據下列方式評估由IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：84)引發之血清抗-IL-31抗體的效價：使用100μl犬IL-31重組蛋白(50ng/孔)或IL-31B表位肽(SEQ ID NO：84)將96孔盤孔洞，以0.2μg/0.1mL/孔之50mM碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)在37℃下，以1μg/mL塗佈1小時。將塗佈抗原的孔洞與200μl含1%BSA的PBS於37℃下反應1小時以阻斷非特異性蛋白質結合，然後以含有0.05% TWEEN 20的PBS清洗3次後乾燥。將100μl免疫狗的系列稀釋血清樣本添加至每個孔洞中，並於37℃下反應1小時。然後，使用含有0.05%TWEEN 20的PBS清洗孔洞5次並乾燥。在每個孔洞中加入100μl過氧化物酶標記的兔抗-狗IgG或過氧化物酶標記的重組蛋白A/G(ierce TM)，在含有1%BSA和0.05%TWEEN 20的PBS中製備最佳稀釋度，並於37℃反應1小時。反應後，以含有0.05%TWEEN 20的PBS清洗孔洞6次，並與100μlTMB基質反應15分鐘。以2N H₂SO₄終止反應，偵測450nm的吸光值。為了測定接種IL-31胜肽疫苗製劑之米格魯中的抗體效價，對ELISA進行2倍連續稀釋，從 1：100到1：54,248,800，效價以Log₁₀表示。

c.細胞分析中IL-31介導之pSTAT3信號傳導的抑制

將DH-82細胞以每孔1×10⁵個細胞的密度接種於96孔平底盤中，其中MEM生長培養基含有15%加熱滅活的胎牛血清、2mmol/L GlutaMax、1mmol/L丙酮酸鈉、50μg/L慶大黴素(gentamicin)和20ng/mL犬干擾素-γ，於37℃含5%CO₂的潮濕空氣中，反應16小時。在IL-31處理前，先經血清飢餓2小時以增加IL-31受體表現。在血清飢餓過程中，將100μl經免疫米格魯以蛋白A樹脂純化之系列稀釋血清與1μg/mL的犬IL-31混合均勻，於37℃下共同反應1小時。預處理後，加入50μl重組犬IL-31及純化的血清樣品混合物，反應5分鐘。接種後，用市售試劑套組(InstantOne^TM ELISA試劑盒，Thermo)測定STAT3磷酸化。使用20%最終體積的Cell Lysis Mix(5X)裂解細胞，在37℃下以300rpm震盪10分鐘。將50μl細胞裂解液評估pSTAT3及製備50μl過氧化物酶標記的抗-pSTAT3(y705)或過氧化物酶標記的抗-STAT3抗體加入孔洞中，於37℃反應1小時。接著用含有0.05%TWEEN 20的PBS清洗孔洞5次，並與100μlTMB基質額外反應15分鐘。以2N H₂SO₄終止反應並偵測450nm的吸光度值。

d.結果

針對目標IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：84)不同製劑的免疫原性評估結果如第14圖所示。對於每隻狗，21 DPI和41 DPI重組犬IL-31的抗體效價(Log₁₀ EC₅₀)如第15及16圖所示，其中兔抗-狗IgG HRP(第15圖)或蛋白A/GHRP(第16圖)作為第二追踪劑。

含SEQ ID NO：84代表性之犬IL-31胜肽免疫原構建具有高免疫原性，在21DPI給予一次即可產生針對IL-31B抗原決定位胜肽的高效價抗體(第14圖)，且對犬rIL-31具有高交叉反應性(第15及16圖)。

在配方研究中，很明顯地含皂苷之明礬佐劑比油包水乳劑配方具有更好的免疫增強作用。兩種追踪劑皆顯示出類似的結合特徵和相當的效價。狗免疫原性研究的另一個重要發現是，UBITh®-T輔助胜肽可幫助自身IL-31序列突破/或克服大多數自身蛋白固有的免疫耐受性。

一般來說，在犬DH82單核細胞中IL-31誘導的pSTAT3信號傳遞的顯著抑制以劑量依賴性方式(從500、250、100、75、50、12.5至6.25μg)由設計型IL-31胜肽免疫原構建之明礬/皂苷2種配方所誘導之犬抗IL-31反應性抗體，可對IL-31所誘導之pSTAT3信號傳導磷酸化產生約40-60%的抑制作用，與IL-31單株抗體(cytopoint)相比，乳化製劑具有約35-50%的抑制作用，相當於50-75%的抑制效果。如第18A和18B圖所示，犬類IL-31“Cytopoint”單株抗體在信號傳遞抑制中的IC₅₀=3.21μg/mL。

在天竺鼠免疫原性研究中，2次免疫後來自6wpi免疫血清的抗體在這種pSTAT3信號傳導中具有顯著低的抑制比例，其中15wpi免疫血清的抗體具有更高劑量依賴性的總信號抑制比例(參照第19A至19C圖)。這些數據顯明，免疫超過2次的狗具有更好的信號傳導抑制效果。因此，證明犬IL-31胜肽免疫原構建具有潛力和能力誘導狗體內的有效單株抗體，以減少/阻礙/抑制會引起犬特異性皮膚炎的IL-31刺激作用。

實施例11. 進一步細化人類IL-31胜肽免疫球蛋白構建設計，以評估天竺鼠功能免疫原性

a.以人類IL-31相關胜肽免疫原構建的設計作為犬類IL-31類似物的延伸

IL-31是屬於IL-6細胞因子家族的四螺旋管束細胞因子。IL-31較佳由活化的CD4+TH2細胞和皮膚淋巴細胞相關抗原陽性皮膚CD45RO+(記憶)T細胞產生。IL-4誘導人類TH2細胞中IL-31蛋白的基因表現和釋出，IL-33進一步增強IL-4所誘導的IL-31釋出。

IL-31受體(IL-31R)是由IL-31受體α鏈(IL-31R α)與抑瘤素M受體β(OSMR β)之異二聚體組成。異二聚體IL-31R會在巨噬細胞、樹突細胞、嗜鹼性粒細胞、皮膚神經元和上皮細胞(包括角質形成細胞)中表現。背根神經節中皮膚感覺神經元的細胞體大量表現IL-31R α。最近研究發現，IL-31可能透過IL-31R直接與感覺神經相通，並作為Th2細胞和感覺神經元之間的關鍵神經免疫連接，以產生T細胞介導的炎症性瘙癢。OSMR β不僅是IL-31R的次單位，且還與gp130相互作用形成第II型受體複合物-結合OSM。OSMR β廣泛地在血管系統、心臟、肺、脂肪組織、皮膚、膀胱、乳腺組織、腎上腺及前列腺中表現。

IL-31在IL-31R複合物中主要與IL-31R α結合，而不與OSMR β結合。然而，在交聯時，OSMR β可將IL-31R轉化為高親和力受體並增加IL-31的結合。IL-31與IL-31Rα/OSMRβ受體複合物的相互作可促使Jak/信號傳遞和轉錄活化因子(STAT)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號傳遞及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑的活化。

尚未有IL-31或IL-31/IL-31R α複合物的X光結構數據。然而，由點突變可證明人類IL-31的位置II及IL-31R α與位置III及OSMR β相互作用。特別是，螺旋A中的E22和螺旋C中的E83/H87形成位置II，螺旋DN-端的K111是位置III的重要部分。I-TASSER生成之人類IL-31的Ab initio模型顯示IL-31細胞因子家族的典型四螺旋束折疊，具有上-上下-下結構。IL-31R α相互作用的三個關鍵殘基E22、E83和H87在空間聚集，在預測的位置II呈現。

進一步設計IL-31胜肽免疫原構建的人類IL-31 B細胞抗原決定位以針對IL-31分子上的IL-31Rα結合區域。為了保持E83和H87側鏈構象暴露於溶劑，螺旋C受到相鄰螺旋3種不同方式的控制：(1)螺旋C環-螺旋D(SEQ ID NO：13)、(2)螺旋B-環-螺旋C(SEQ ID NO：95)、及(3)螺旋B-C-D(SEQ ID NO：93)。B細胞抗原決定位有31至64個氨基酸殘基，分別來自於L75-S122、S62-I92或A64-L127。為了使E83和H87的側鏈面向相同方向，p5095kb(SEQ ID NO：101)內的螺旋C抗原決定位受限於因螺旋-螺旋相互作用和人工雙硫鍵的螺旋B。另外，分析具有螺旋C的胜肽結構p5094kb(SEQ ID NO：100)，即B抗原決定位的(SEQ ID NO：94)。

b.IL-31的ELISA抗體特異性分析

重組人類IL-31蛋白(Sino Biological Inx)或人類IL-31B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：13、94、95和93)在塗佈緩衝液(1.5g/L Na₂CO₃、2.9g/L NaHCO₃，pH 9.6)中，以50ng/孔之重組人類IL-31蛋白或200ng/孔人類IL-31B抗原決定位胜肽的濃度固定於微量孔盤上，於4℃反應過夜。以200μL/孔的清洗緩衝液(含有0.05%TWEEN-20的PBS)清洗孔盤3次。使用200μL/孔的分析稀釋劑(0.5%BSA，0.05%TWEEN-20，0.01%ProClin 300在PBS中)於室溫下封阻孔洞1小時。以200μL/孔的清洗緩衝液清洗孔盤3次。添加100μL抗血清(4倍連續稀釋，從1：100到1：4.19×10⁸，共12次稀釋)或稀釋抗體(4倍連續稀釋，從100mg/mL至0.0238ng/mL，總共12次稀釋)至塗佈孔洞中。於室溫下反應1小時。使用200μL/孔的清洗緩衝液清洗孔洞5次。將孔盤與1：10,000稀釋之HRP螯合山羊抗天竺鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反應1小時(100μL/孔)。最後，加入100μL/孔的NeA-Blue TMB基質(Clinical Science Products)，並以100μL/孔的1M H₂SO₄終止反應。利用ELISA偵測儀(Molecule Devices)測量OD₄₅₀的吸光值。使用Prism軟體(GraphPad)進行非線性回歸分析，以樣品稀釋度log值中4個參數曲線的50%的最大吸光值，來確定抗血清特定效價(以log₁₀ Titers或Log₁₀(EC₅₀)表示)。使用Prism軟體的非線性回歸分析，將純化的多株IgG抗體反應性以4個參數曲線之半有效濃度(EC₅₀)表示。

c.IL-31肽免疫原構建及其製劑在動物中所引發之抗體功能特性的評估

進一步分析免疫血清或純化之抗-IL-31多株抗體的能力：(1)阻斷IL-31與其受體IL-31R α之間相互作用的能力，(2)抑制U87MG膠質瘤細胞中IL-31所誘導之STAT3磷酸化，及(3)抑制轉染IL-31R α之HaCaT細胞中的IL-20表現。

1.細胞

在含5%CO₂的37℃恆溫培養箱中，將U87MG細胞株培養於含10%牛血清和1%青黴素/鏈黴素的EMEM中。

在含5%CO₂的37℃恆溫培養箱中，將過量表現IL-31R α的HaCaT轉殖細胞培養於含10%FBS、1%青黴素/鏈黴素、1mM丙酮酸鈉和200μg/mL潮黴素B(Gibco)的DMEM培養基(高葡萄糖，Gibco)。

2.IL-31對IL-31R α鏈的結合

以不同IL-31胜肽免疫原構建免疫之天竺鼠的混合免疫血清中純化出IgG多株抗體，利用ELISA檢測其抑制IL-31與IL-31Rα結合的相對能力。將96孔盤的孔洞分別以50ng抗-His單株抗體(GenScript)在緩衝液(15mM Na₂CO₃，35mM NaHCO₃，pH 9.6)中進行塗佈，在4℃下反應隔夜。在室溫下用200μL/孔的分析稀釋劑(含1%BSA、0.05%TWEEN-20與0.01%ProClin 300的PBS溶液)封阻孔洞 1小時。以200μL/孔的清洗緩衝液(含0.05%TWEEN-20和0.01%ProClin 300的PBS)清洗孔盤3次。將100ng重組之His-標記人類IL-31R α蛋白(R & D system)在室溫下於抗-His表面固定1小時。清洗後，將100μL 10ng/mL的人類IL-31(GenScript)混合物和不同濃度經純化天竺鼠IgG多株抗體在室溫下預反應1小時，接著加至孔洞中。在室溫下反應1小時。以200μL/孔的清洗緩衝液清洗3次。以100μL/孔生物素標記之兔抗-IL-31抗體(0.25μg/mL)(PeproTech Inc.)在室溫下反應1小時，以檢測捕獲的IL-31。接著，使用鏈黴抗生物素蛋白poly-HRP(1：10,000稀釋，Thermo Fisher Scientific)反應1小時(100μL/孔)，以檢測結合之生物素標記的抗體。使用200μL/孔的清洗緩衝液清洗所有孔洞3次。最後，通過100μL/孔的OptEIA TMB底物(BD Biosciences)開發孔，並添加100μL/孔的1M H₂SO₄以終止反應。以VersaMax ELISA微量孔盤偵測儀(Molecular Devices)偵測吸光值，並利用Prism 6軟體藉由符合四參數邏輯曲線的反應曲線來計算(GraphPad軟體)最大半抑制濃度(IC₅₀)。

3.IL-31誘導之STAT3磷酸化分析

為了研究純化之IgG是否能夠抑制U87MG細胞中IL-31誘導的STAT3磷酸化，將細胞接種在12孔盤(2x10⁵/孔)中並在無血清培養基(EMEM中的1%小牛血清)中培養16小時。將細胞在天竺鼠多株抗體存在下，同時與10ng/mL最終濃度之IL-31，總體積為500μL的無血清培養基中於 37℃，5%CO₂下培養30分鐘。以抗-IL-31單株抗體MT313(Mabtech AB)作為對照組。以PathScan p-Stat3 ELISA套組(Cell Signaling)分析磷酸化的STAT3。簡單來說，將細胞懸浮在30μL含1%磷酸酶抑製劑混合物(Sigma-Aldrich)之細胞裂解緩衝液(Cell Signaling)中，以製備細胞裂解物，以12,000xg，在4℃下離心10分鐘除去細胞碎片。

依據說明書，使用10μg澄清的細胞裂解物測量磷酸化STAT3的含量。以VersaMax ELISA微量孔盤(Molecular Devices)測量吸光值。

4.IL-31誘導之IL-20表現

HaCaT是來自於成人皮膚的自發轉化非整倍數永生角質形成細胞株(spontaneously transformed aneuploid immortal keratinocyte cell line)。為了分析IL-31誘導之IL-20表現，製備過度表現人類IL-31R α的穩定HaCaT細胞株。IL-31依賴性的IL-20表現可藉由本發明IL-31胜肽免疫原構建所引發之抗-IL-31抗體進行調控。使用4×10⁵個HaCaT細胞，最終濃度10ng/mL的人類重組IL-31和不同濃度之純化的天竺鼠IgG多株抗體，每孔洞總體積1,000μL培養基，在37℃，5%CO₂下的條件反應1小時後進行分析。以抗-IL-31單株抗體MT313(Mabtech AB)為對照組。依據說明書，以PureLink RNA Mini套組(Thermo Fisher Scientific Inc.)萃取RNA，並利用SuperScript TM III/RNaseOUT Enzyme Mix(Thermo Fisher Scientific Inc.)除去殘留的基因體DNA。以SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix套組(Thermo Fisher Scientific Inc.)將1μg的RNA逆轉錄成cDNA，並使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系統(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行即時定量PCR分析。使用Power SYBRGreen PCR Master Mix套組(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行即時PCR反應。IL-20的QuantiTect引子對(Hs_IL20_1_SG)購自於Qiagen，並合成HPRT的引子對(前置引子：5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’(SEQ ID NO：106)；反置引子：5’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’(SEQ ID NO：107))。所有試驗皆為2重覆。使用比較循環閾值法計算相對量，並以HPRT標準化。將每個抗體處理組之IL-20相對表現量以未處理組的表現量進行標準化。

d.結果

設計、篩選、鑑定、評估功能特性和優化包含代表性人類IL-31胜肽免疫原構建的多組成疫苗製劑。

1.人類IL-31 B細胞抗原決定位胜肽序列的選擇

因為發現螺旋C區域中的兩個關鍵殘基E83和H87與IL-31Rα相互作用，故選擇IL-31螺旋C進行B細胞抗原決定位胜肽的設計。將與UBITh1T輔助胜肽(SEQ ID NO：27)連接之螺旋C胜肽構建與短間隔子ε K連接，並與ISA 51及CpG進行配製，以400μg/1mL初始免疫天竺鼠，並以100μg/0.25mL進行加強(3、6和9 wpi)免疫。為了分析天竺鼠的免疫原性，使用ELISA測定4倍連續稀釋(從1：100至1：4.19×10⁸)的天竺鼠免疫血清。使用重組人類IL-31蛋白塗佈ELISA孔盤，每孔洞50ng。使用A450nm的4個參數非線性回歸分析計算血清效價，其以LogEC₅₀表示。ELISA結果顯示4種胜肽免疫原構建不僅可誘導針對相應IL-31 B抗原決定位胜肽的高免疫原性效價(表10(SEQ ID NO：87)；表11(SEQ ID NO：100和101；及表13第3組(SEQ ID NO：99)，並誘導中至高度針對人類IL-31蛋白的交叉反應(第20A和20B圖)。

2.IL-31胜肽免疫原構建之抗體抑制IL-31和IL-31Rα相互作用之免疫原性的評估

本實施例分析天竺鼠中產生之IL-31胜肽免疫原構建的抗體是否可中和IL-31，進而阻斷IL-31和IL-31Rα之間的相互作用。特別是，以ELISA偵測經4種候選IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：87、99、100和101)免疫之天竺鼠免疫血清所純化的天竺鼠IgG，其中重組人類IL-31Rα蛋白質固定於塗有抗His抗體的固相上。如第21圖所示，從各經IL-31胜肽免疫原構建免疫之天竺鼠血清中所純化的代表性抗體，以劑量依賴性方式(10E-3至10E-2μg/mL)競爭性地抑制IL-31與IL-31Rα的相互作用。

3.抗-IL-31抗體抑制IL-31誘導之STAT3磷酸化的抑制

IL-31信號途徑參與細胞膜上IL-31R α/OSMR複合物的形成，及細胞質下游蛋白STAT3的磷酸化。使用U87MG細胞株評估由IL-31胜肽免疫原構建免疫天竺鼠免疫血清所純化之抗-IL-31抗體，抑制IL-31誘導之STAT3磷酸化的能力。

首先，以IL-31(10ng/mL)和不同濃度的IgG同時處理細胞。將抗-IL-31單株抗體MT313作為陽性對照。如第22圖所示，代表性免疫原(SEQ ID NO：87和101)誘發之抗-IL-31IgG與MT313皆可以劑量依賴性方式降低STAT3的磷酸化。

4.IL-31誘導之IL-20表現的抑制

IL-20與IL-10結構上有關，且皆是角質形成細胞的自分泌因子，可調控所參與的發炎反應。IL-31可在角質形成細胞株HaCaT中誘導IL-20的表現。為了研究IL-31胜肽免疫原構建在天竺鼠中引發之抗-IL-31抗體是否可抑制過度表現IL-31Rα之HaCaT細胞中IL-31依賴性的IL-20表現，所有細胞經10ng/mL的IL-31處理30分鐘，以誘導IL-20基因轉錄。由IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：87和101)誘發之天竺鼠免疫血清的IgG代表性製劑以不同濃度添加到試驗組中，並以MT313作為陽性對照組。以不添加抗體，且在IL-31存在下培養細胞作為陰性對照組。如第23圖所示，在SEQ ID NOs：87和101之代表性胜肽構建所引發的IgG抗體治療組中，發現抗體可濃度依賴性地抑制IL-20的表現。

上述ex-vivo研究證明，由螺旋-螺旋相互作用和導入人工雙硫鍵所構成之螺旋C組成的IL-31胜肽免疫原可證明阻斷IL-31-IL-31Rα相互作用，以及抑制LL-31誘導的信號傳遞鏈。

5.代表性人類IL-31胜肽構建(SEQ ID NO：101)在各多組成製劑中功能免疫原性的評估

使用27隻天竺鼠(300-350g重量)進行免疫。將27隻天竺鼠分成9組，每組3隻，以400μg胜肽進行初始免疫，在初始免疫後3週和6週(wpi)進行2次加強免疫，如表15。在0、3、6、9、12與15wpi收集血液樣本以偵測相對IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：95)之抗-IL-31抗體的效價。如表15所示，包括安慰劑(含PBS)、CPG1、CpG3、ISA51VG、ADJUPHOS、ISA51VG+CpG1、ADJUPHOS+CpG1、ISA5IVG+CPG3和ADJUPHOS+CpG 3等9組。如表15所示(0、3、6、9、12和15wpi)，使用上述IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：95)以ELISA分析血清抗-IL-31抗體效價，效價以Log₁₀表示。第24圖上圖顯示0、3、6和9wpi時的免疫原性數據。每種製劑的詳細平均效價以Log₁₀表示，顯示於第24圖的下圖。

在分析IL-31和IL-31Rα結合的相互作用中，進一步評估9 wpi天竺鼠免疫血清中針對製劑中各種IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：101)的多株抗體，如第25圖所示。計算每種製劑的IC₅₀(μg/mL)，如第25圖所示。同樣地，這些抗體中最有效的抑制物為ISA51/CpG 1或ISA51/CpG，IC₅₀值分別為為0.2036和0.1965μg/mL。

此外，9 wpi天竺鼠免疫血清中針對各種製劑中IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：101)的多株抗體在ex-vivo下，測試抗-IL-31抗體抑制IL-31誘導之IL-20表現能力及IL-31誘導之STAT3磷酸化。

如第25及26圖所示，製劑(第1至9組)中代表性候選肽免疫原構建(SEQ ID NO：101)所誘導之抗體在實驗組中具抗體濃度依賴性的抑制。同樣地，ISA51+CPG1或CpG3中的配方為油包水乳液，具有最高的IL-20表現抑制能力，如第25圖所示(在10μg和100μg/mL時，從1μg/mL降至零為對照組的0.3或0.4倍)，以及類似的STAT3磷酸化(第26圖)。

實施例12. 狗、小鼠和人類不同物種IL-31胜肽免疫原結構交叉反應性的評估

a.抗體專一性的IL-31 ELISA分析

將狗、小鼠和人類IL-31B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：12、93、96、97或98)以200ng/孔的濃度於塗佈緩衝液中(1.5g/L Na₂CO₃，2.9g/L NaHCO₃，pH 9.6)固定在微孔盤上，於4℃下反應隔夜。以200μL/孔的清洗緩衝液(含0.05% TWEEN-20的PBS)清洗孔盤3次。在室溫下以200μL/孔的分析稀釋劑(含0.5%BSA，0.05%TWEEN-20，0.01%ProClin 300的PBS)封阻孔洞1小時。以200μL/孔的清洗緩衝液清洗3次。將100μL抗體稀釋劑中的抗血清(連續10倍稀釋)添加至經塗佈的孔洞中。於室溫下反應1小時。吸出所有孔洞中的液體，並以200μL/孔的清洗緩衝液清洗5次。將孔盤與1：10,000稀釋之HRP綴合山羊抗-天竺鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反應1小時(100μL/孔)。接著，使用200μL/孔的清洗緩衝液清洗所有孔洞5次。最後，添加100μL/孔的NeA-Blue TMB基質(Clinical Science Products)至孔洞中進行反應，並以100μL/孔的IM H₂SO₄終止反應。以ELISA微孔盤偵測儀(Molecule Devices)偵測OD₄₅₀的吸光值。測定抗血清的特異性效價，並以Log₁₀表示。

b.結果

表13和14顯示免疫原性的評估結果。

針對犬類(SEQ ID NOs：83和85)與人類(SEQ ID NO：83和85)相對應胜肽類似物之天竺鼠免疫血清對IL-31 B抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：12和93)具有合理的交叉反應性，如表13所示。然而，針對小鼠IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：104和105)與犬類(102和103)相對應胜肽免疫原構建類似物之天竺鼠免疫血清與對應之IL-31 B抗原決定位胜肽(犬類的SEQ ID NOs：96 vs小鼠的98)之結合具有限的交叉反應。針對犬類IL-31胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：102和103)的天竺鼠免疫血清與對應之小鼠IL-31 B抗原決定位胜肽類似物(SEQ ID NOs：97和98)不具交叉反應，如表14所示。因此，證明可使用犬類模型進行人類應用研究。

實施例13. 具有或不具有佐劑的各種製劑中，重組犬類IL-31蛋白與含UBITH1連接之脂蛋白的天竺鼠免疫原性評估

將重組全長犬類IL-31蛋白(FL-犬IL-31)及含位於IL-31蛋白N-端之UBITh®1序列(促進免疫原性)之重組全長犬類IL-31蛋白(FL-犬IL-31脂蛋白)，以2種不含佐劑組成以及1種ADJUPHOS組成來比較它們的相對免疫原性，以無佐劑2個高劑量和低劑量50μg/0.5mL/劑量/IM、25μg/0.5mL/劑量/IM進行測試，而使用ADJUPHOS作為佐劑之組成僅以高劑量50μg/0.5mL/劑量/IM進行測試，如表12所示。

a.IL-31 ELISA之抗體專一性分析

將重組全長(FL)犬類IL-31蛋白以50ng/孔在塗佈緩衝液(1.5g/L Na₂CO₃、2.9g/L NaHCO₃，pH 9.6)中固定於微量孔盤上，並在4℃下反應隔夜。以200μL/孔的清洗緩衝液(含0.05%TWEEN-20的PBS)清洗孔盤3次。在室溫下用200μL/孔的分析稀釋劑(0.5%BSA、0.05%TWEEN-20、0.01% ProClin 300在PBS中)封阻孔洞1小時。以200μL/孔的清洗緩衝液清洗孔盤3次。將100μL抗體稀釋劑中的抗血清(連續稀釋10倍)添加至經塗佈的孔洞中。在室溫下反應1小時。使用200μL/孔的清洗緩衝液清洗所有孔洞5次。將孔盤與1：10,000稀釋的HRP-綴合山羊抗天竺鼠IgG(H+L)抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反應1小時(100μL/孔)。接著，以200μL/孔的清洗緩衝液清洗所有孔洞5次。最後，以100μL/孔的NeA-Blue TMB基質(Clinical Science Products)進行反應，並加入100μL/孔的1M H₂SO₄終止反應。使用ELISA微孔盤偵測儀(Molecule Devices)測量OD₄₅₀的吸光值。測定抗血清的特異性效價，並以Log₁₀表示。

b.結果

上述2種重組蛋白的免疫原性評估結果如表12所示。

犬類IL-31脂蛋白(第1組至第3組)和一般的犬類IL-31蛋白(第4至6組)均具有免疫原性，在即使沒有佐劑(第1、2、4與5組)時，N-端連接的UBITh®1也可增強這些蛋白質的免疫原性。整體而言，比較相同製劑，IL-31脂蛋白(第1組至第3組)的免疫原性優於一般IL-31非脂蛋白(第4至6組)的免疫原性，這些脂蛋白僅進行一次免疫即具有高免疫原性。一般蛋白質免疫組(第4組至第6組)在進一步加強免疫後，可提升至其相對應的免疫原性，並在2次加強免疫後達到相同的免疫原性，如8 wpi的免疫血清所示。

在第0、3和6週接種疫苗

在第0、3、6、8、10、12和14週收集血清

表14. 犬類和小鼠IL-31胜肽免疫原構建在天竺鼠中的免疫原性及其交叉反應性評估

<110> 聯合生物醫學公司王長怡

<120> 用於治療及/或預防異位性皮膚炎之IL-31胜肽免疫原及其劑型

<130> 2037-TW

<150> US 62/597,130

<151> 2017-12-11

<160> 109

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(159)

<223> 犬類IL-31 1-159(Uniprot C7GOW1-1；GenBank：BAH97742.1)

<400> 1

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(164)

<223> 人類IL-31 1-164(GenBank：AAS86448.1)

<400> 2

<210> 3

<211> 48

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(48)

<223> 犬類IL-31 97-144

<400> 3

<210> 4

<211> 37

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(37)

<223> 犬類IL-31 97-133

<400> 4

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(26)

<223> 犬類IL-31 97-122

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> 犬類IL-31 97-114

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(21)

<223> 犬類IL-31 90-110

<400> 7

<210> 8

<211> 55

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(55)

<223> 犬類IL-31 90-144

<400> 8

<210> 9

<211> 59

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(59)

<223> 犬類IL-31 86-144

<400> 9

<210> 10

<211> 53

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(53)

<223> 犬類IL-31 97-149,C146至S146

<400> 10

<210> 11

<211> 60

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(60)

<223> 犬類IL-31 90-149,C146至S146

<400> 11

<210> 12

<211> 64

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(64)

<223> 犬類IL-31 86-149,C146至S146

<400> 12

<210> 13

<211> 48

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(48)

<223> 人類IL-31 98-145

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 破傷風桿菌1 Th

<400> 14

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> MvF1 Th

<400> 15

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213> 百日咳博德特氏桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(24)

<223> 百日咳博德特氏桿菌Th

<400> 16

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 破傷風桿菌2 Th

<400> 17

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> 白喉桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(23)

<223> 白喉Th

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 惡性瘧原蟲

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(21)

<223> 惡性瘧原蟲Th

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 曼氏血吸蟲

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(17)

<223> 曼氏血吸蟲Th

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> PRT

<213> 霍亂毒素

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(25)

<223> 霍亂毒素Th

<400> 21

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213.> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> MvF 2 Th

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(22)

<223> KKKMvF 3 Th

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (10)..(10)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (11)..(11)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (15)..(15)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (16)..(16)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (19)..(19)

<223> G或T

<400> 23

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 1 Th

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(1)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (2)..(2)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (3)..(3)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (5)..(5)

<223> F或K或R

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (9)..(9)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (10)..(10)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (11)..(11)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (15)..(15)

<223> Q或L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (17)..(17)

<223> L或I或V或F

<220>

<221> SITE

<222> (18)..(18)

<223> D或R

<400> 24

<210> 25

<211> 19

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<400> 25

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 2 Th

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<222> I或F

<220>

<221> SITE

<222> (5)..(5)

<223> I或F

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> T或L

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> I或L

<220>

<221> SITE

<222> (11)..(11)

<223> I或L

<220>

<221> SITE

<222> (14)..(14)

<223> P或I

<220>

<221> SITE

<222> (15)..(15)

<223> Q或T

<220>

<221> SITE

<222> (16)..(16)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (17)..(17)

<223> L或I

<400> 26

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> 麻疹病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th

<400> 27

<210> 28

<211> 18

<212> PRT

<213> B型肝炎病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> HBsAg 3 Th

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 流感病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(11)

<223> 流感基質蛋白1 _1 Th

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(11)

<223> 流感基質蛋白1_1 Th

<400> 29

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> 流感病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> 流感基質蛋白1_2 Th

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 流感病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(9)

<223> 流感非結構蛋白1 Th

<400> 31

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> EBV BHRF1 Th

<400> 32

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> 破傷風桿菌TT1 Th

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(20)

<223> EBV EBNA-1 Th

<400> 34

<210> 35

<211> 21

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(21)

<223> 破傷風桿菌TT2 Th

<400> 35

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(16)

<223> 破傷風桿菌TT3 Th

<400> 36

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> 破傷風桿菌

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(16)

<223> 破傷風桿菌TT4 Th

<400> 37

<210> 38

<211> 18

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(18)

<223> EBV CP Th

<400> 38

<210> 39

<211> 14

<212> PRT

<213> 人類巨細胞病毒(HCMV)

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(14)

<223> HCMV IE1 Th

<400> 39

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(15)

<223> EBV GP340 Th

<400> 40

<210> 41

<211> 13

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(13)

<223> EBV BPLF1 Th

<400> 41

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> 艾伯斯坦-巴爾病毒

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(11)

<223> EBV EBNA-2 Th

<400> 42

<210> 43

<211> 71

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(71)

<223> 犬類IL-31 97-144

<400> 43

<210> 44

<211> 68

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(68)

<223> 犬類IL-31 97-144

<400> 44

<210> 45

<211> 71

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(71)

<223> 犬類IL-31 97-144

<400> 45

<210> 46

<211> 68

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(68)

<223> 犬類IL-31 97-144

<400> 46

<210> 47

<211> 60

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(60)

<223> 犬類IL-31 97-133

<400> 47

<210> 48

<211> 57

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<222> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(57)

<223> 犬類IL-31 97-133

<400> 48

<210> 49

<211> 60

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(60)

<223> 犬類IL-31 97-133

<400> 49

<210> 50

<211> 57

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(57)

<223> 犬類IL-31 97-133

<400> 50

<210> 51

<211> 49

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(49)

<223> 犬類IL-31 97-122

<400> 51

<210> 52

<211> 46

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (21)..(46)

<223> 犬類IL-31 97-122

<400> 52

<210> 53

<211> 49

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(49)

<223> 犬類IL-31 97-122

<400> 53

<210> 54

<211> 46

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K as a spacer

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(46)

<223> 犬類IL-31 97-122

<400> 54

<210> 55

<211> 41

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(41)

<223> 犬類IL-31 97-114

<400> 55

<210> 56

<211> 38

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (21)..(38)

<223> 犬類IL-31 97-114

<400> 56

<210> 57

<211> 41

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK as a spacer

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(41)

<223> 犬類IL-31 97-114

<400> 57

<210> 58

<211> 38

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K as a spacer

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(38)

<223> 犬類IL-31 97-114

<400> 58

<210> 59

<211> 44

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(44)

<223> 犬類IL-31 90-110

<400> 59

<210> 60

<211> 41

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

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<222> (13)..(13)

<223> K或R

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<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

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<212> PRT

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<220>

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<222> (1)..(19)

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<220>

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<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

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<221> 胜肽

<222> (21)..(84)

<223> 犬類IL-31 86-149,C146至S146

<400> 86

<210> 87

<211> 71

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (24)..(71)

<223> 人類IL-31 98-145

<400> 87

<210> 88

<211> 68

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(68)

<223> 人類IL-31 98-145

<400> 88

<210> 89

<211> 71

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (24)..(71)

<223> 人類IL-31 98-145

<400> 89

<210> 90

<211> 68

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITh3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (21)..(68)

<223> 人類IL-31 98-145

<400> 90

<210> 91

<211> 4

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(1)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(4)

<223> epsilon-K-KKK間隔子

<400> 91

<210> 92

<211> 6

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(6)

<223> 柔性鉸鏈間隔子

<400> 92

<210> 93

<211> 64

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(64)

<223> 人類IL-31 87-150,C147至S147

<400> 93

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(9)

<223> 人類IL-31 105-113

<400> 94

<210> 95

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(31)

<223> 人類IL-31 85-115,S85至C85,I115至C115

<400> 95

<210> 96

<211> 31

<212> PRT

<213> 狼

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(31)

<223> 犬類IL-31 84-114,S84至C84,K114至C114

<400> 96

<210> 97

<211> 32

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(32)

<223> 小鼠IL-31 86-117,S86至C86

<400> 97

<210> 98

<211> 30

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(30)

<223> 小鼠IL-31 87-116,V87至C87,S116至C116

<400> 98

<210> 99

<211> 87

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(87)

<223> 人類IL-31 87-150,C147至S147

<400> 99

<210> 100

<211> 32

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(32)

<223> 人類IL-31 105-113

<400> 100

<210> 101

<211> 54

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(54)

<223> 人類IL-31 85-115,S85至C85,I115至C115

<400> 101

<210> 102

<211> 54

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF5 Th(UBITh1)

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(54)

<223> 犬類IL-31 84-114,S84至C84,K114至C114

<400> 102

<210> 103

<211> 54

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(54)

<223> 犬類IL-31 84-114,S84至C84,K114至C114

<400> 103

<210> 104

<211> 55

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(55)

<223> 小鼠IL-31 86-117,S86至C86

<400> 104

<210> 105

<211> 53

<212> PRT

<213> 合成胜肽

<220>

<221> 胜肽

<222> (1)..(19)

<223> MvF 4 Th(UBITH3)

<220>

<221> SITE

<222> (4)..(4)

<223> S或T

<220>

<221> SITE

<222> (7)..(7)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (8)..(8)

<223> G或T

<220>

<221> SITE

<222> (12)..(12)

<223> H或T

<220>

<221> SITE

<222> (13)..(13)

<223> K或R

<220>

<221> SITE

<222> (20)..(20)

<223> epsilon-K

<220>

<221> 胜肽

<222> (20)..(23)

<223> epsilon K-KKK間隔子

<220>

<221> 胜肽

<222> (24)..(53)

<223> 小鼠IL-31 87-116,V87至C87,S116至C116

<400> 105

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT前置子引

<400> 106

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPRT反置子引

<400> 107

<210> 108

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG1寡聚物ODN

<400> 108

<210> 109

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG2寡核酸ODN

<400> 109

Claims

一種以分子式代表之IL-31胜肽免疫原構建：(Th)_m-(A)_n-(IL-31片段)-X或(IL-31片段)-(A)_n-(Th)_m-X其中Th為一異源性T輔助細胞抗原決定位；A為一異源性間隔子；(IL-31片段)為具有來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之約15至約75個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位；X為一胺基酸的一α-COOH或α-CONH₂；m為1至約4；以及n為0至約10。
如申請專利範圍第1項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該IL-31片段係選自由SEQ ID NOs：1-13及93-98組成的群組。
如申請專利範圍第1或2項任一所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：14-42組成的群組。
如申請專利範圍第1項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該胜肽免疫原構建係選自由SEQ ID NOs：43-90及99-105組成的群組。
一種IL-31胜肽免疫原構建包含：包含來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之該全長IL-31蛋白質序列之約15至約75個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位；包含選自由SEQ ID NOs：14-42組成之群組之一胺基酸序列的一T輔助細胞抗原決定位；以及選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)組成之群組的一任選的異源性間隔子，其中該B細胞抗原決定位係直接或透過該任選的異源性間隔子共價連接至該T輔助細胞抗原決定位。
如申請專利範圍第5項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該B細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：1-13及93-98組成的群組。
如申請專利範圍第5項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：14-42組成的群組。
如申請專利範圍第5項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：91)。
如申請專利範圍第5項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係共價連接至該B細胞抗原決定位的該氨基端。
如申請專利範圍第5項所述之IL-31胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係透過該任選的異源性間隔子共價連接至該B細胞抗原決定位的該氨基端。
一種包含如申請專利範圍第1至4項任一所述之一胜肽免疫原構建的組成物。
一種醫藥組成物包含：a.如申請專利範圍第1至4項任一所述之一胜肽免疫原構建；以及b.一藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中a.該IL-31胜肽免疫原構建係選自由SEQ ID NOs：43-90及99-105組成的群組；以及b.該IL-31胜肽免疫原構建與一CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成一穩定化免疫刺激複合物。
一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其特異性地結合至如申請專利範圍第1至10項任一所述之該IL-31胜肽免疫原構建的該B細胞抗原決定位。
如申請專利範圍第14項所述之分離抗體或其抗原決定位結合片段結合至該IL-31胜肽免疫原構建。
一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其特異性地結合至如申請專利範圍第1至10項任一所述之該IL-31胜肽免疫原構建的該B細胞抗原決定位。
一種包含如申請專利範圍第14至16項任一所述之該分離抗體或其抗原決定位結合片段的組成物。