MXPA02003788A

MXPA02003788A - Virus de planta modificados y metodos para su uso.

Info

Publication number: MXPA02003788A
Application number: MXPA02003788A
Authority: MX
Inventors: Brennan Frank
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2002-09-30
Also published as: DE60033043T2; DE60033043D1; WO2001026682A3; IL149078A0; US20080124358A1; US7666624B2; AU784425B2; AU8022100A; JP2003514775A; CZ20021304A3; EP1223977B1; AR026059A1; CO5270015A1; WO2001026682A2; ZA200202816B; GB9924351D0; EP1223977A2; HRP20000701A2; US7267963B1; CA2387629A1

Abstract

La presente invencion se refiere a modular la naturaleza y/o el nivel de una respuesta inmune a una molecula. En particular, la invencion se refiere a efectuar un aumento en la respuesta inmune TH1 a moleculas tales como, pero sin limitarse a, antigenos o inmunogenos. La invencion tambien se refiere a reducir una respuesta inmune TH2 a las moleculas. Mas particularmente la invencion se refiere a alterar el nivel de inmunoglobulina asociadas con TH1 y TH2, el nivel de proliferacion de citocinas asociadas con TH1 y TH2, y el nivel de proliferacion de celulas TH1 y TH2.

Description

VIRUS DE PLANTA MODIFICADOS Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la modulación de la naturaleza y/o del nivel de una respuesta inmune a una molécula. En particular, la invención se refiere a efectuar un incremento en la respuesta inmune TH1 a moléculas tales como, pero no limitándose a, antígenos o inmunógenos. La invención también se refiere a la reducción de una respuesta inmune TH2 a las moléculas. De una manera más particular, la invención se refiere a la alteración del nivel de inmunoglobulinas asociadas con TH1 y TH2, el nivel de proliferación de citocinas asociadas con TH1 y TH2, y el nivel de proliferación de células TH1 y TH2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La iniciación del subconjunto de células T CD4+, TH1 , en lugar de TH2, es de una importancia primaria en el diseño de una vacuna. Esto se debe a que las células TH1 producen citocinas IL-2, IFN-?, y TNF-ß que median la activación de macrófagos y de células citotóxicas T (CTL), y son los efectores principales de la inmunidad mediada por la célula contra los microbios intracelulares, y de las reacciones de hipersensibilidad de tipo demorado (DTH). IFN-? también induce el cambio de clase de isotipo de células B al isotipo efector principal de IgG de ratón. lgG2a, y hasta un menor grado lgG2b, mejora la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), y fija fuertemente C1q de la ruta de complemento clásica que ozoniza las células o los racimos de anticuerpos para la fagocitosis. Por ejemplo, como un resultado de estas funciones efectoras en el ratón, se ha encontrado que lgG2a protege mejor a los ratones contra las infecciones de virus [Ishizaka y colaboradores (1995) J. Infect. Dis. 172: 1 108], los tumores de murinos [Kaminski y colaboradores (1986) J. Immunol. 136: 1 123], y los parásitos [Wechsler y colaboradores (1986) J. Immunol. 137:2968], y mejora la tolerancia bacteriana [Zigterman y colaboradores (1989) Infect. Immun. 57:2712]. En contraste, las células TH2 producen IL-4, IL-5, IL-10 e IL- 13, que tienen el efecto indeseable de suprimir la inmunidad mediada por células [Mossman y colaboradores (1986) J. Immunol. 136:2248]. Además, IL-4 induce a las células B a producir tanto una subclase de IgG que fija pobremente el complemento y que no media la ADCC, así como IgE que se enlaza con las células mástil y los basófilos. La técnica anterior ha tratado de mejorar el diseño de la vacuna mediante la dirección del desarrollo de células TH1 , mientras que reconoce que la iniciación de subconjuntos de células TH es afectada por la cepa de animal utilizada [Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:2439], la identidad del antígeno, la ruta de suministro del antígeno [Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:809], y el régimen de inmunización [Brett y colaboradores (1993) Immunology 80:306]. Un planteamiento de la técnica anterior para generar respuestas TH1 específicas del antígeno, ha sido a través del uso de la conjugación oxidativa/reductiva de mañano con el antígeno [Apostopoulos y colaboradores (1995) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 92:10128-10132], o la conjugación de proteínas con proteínas bacterianas [Jahn-Schmid y colaboradores (1997) Intl. Immunol. 9: 1867]. Sin embargo, el acoplamiento con los vehículos comúnmente utilizados, tales como KLH y toxoide de tétanos, con frecuencia no tiene éxito para incrementar la proporción de lgG2a:lgG1. Otros métodos para inducir respuestas TH1 incluyen el uso de agentes inmunomoduladores, tales como adyuvantes extraños (por ejemplo: ISCOMS, QS21 , Quil A, ere). Sin embargo, el alum es el único adyuvante que está actualmente aprobado para utilizarse en seres humanos, y se sabe que favorece las respuestas tipo TH2 indeseables, en lugar de la respuesta tipo TH1 más deseable. Otros agentes inmunomoduladores que han sido utilizados por la técnica anterior incluyen oligodesoxirribonucléotidos CpG [Chu y colaboradores (1997) J. Exp. Med. 186: 1623], o citocinas, tales como interleucina-12 [IL-12, Scott y colaboradores (1997) Seminl. Immunol. 9:285], que se pueden agregar a las composiciones inmunogénicas que conduzcan a la producción de altos niveles de lgG2a dirigidos contra los antígenos de proteína soluble. Sin embargo, la corta vida media de las citocinas, y el costo considerable, hacen que su utilización sea técnicamente y comercialmente poco atractiva en la vacunación a gran escala. Todavía otro planteamiento ha sido el uso de vacunas de virus de animales vivos para generar predominantemente lgG2a específica del virus en ratones [Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:809; Coutelier y colaboradores (1987) J. Exp. Med. 165:64; Nguyen y J ... j-.------J-__-_._k_i, _____________ _ __ (1994) J. Immunol. 152:478; Brubaker y colaboradores (1996) J. Immunol. 157: 1598]. Este planteamiento tiene varios inconvenientes. Primero, las vacunas de virus vivos no dan como resultado consistentemente una respuesta inmune tipo TH1 , debido a que algunos virus vivos favorecen la producción de otros isotipos de inmunoglobulina característicos de las rutas de auxiliares T alternativas [Coutelier y colaboradores (1987) J. Exp. Med. 165:64; Pérez-Filgueira y colaboradores (1995) Vaccine 13:953]. En adición, tales vacunas de virus de animales se producen a partir de virus que se cultivan en sistemas de cultivos celulares que son costosos de diseñar y de ejecutar. Más aún, los virus de animales utilizados como el vector, con frecuencia son un virus al que ya puede haberse expuesto el animal, y el animal puede ya estar produciendo anticuerpos para el vector. Por consiguiente, el vector puede ser destruido por el sistema inmune antes de que el sitio antigénico incorporado del segundo virus induzca una respuesta inmune. Adicionalmente, el planteamiento del virus de animal compuesto involucra la manipulación genética de virus vivo que infectan a los animales, con el riesgo de que las mutaciones puedan dar lugar a formas novedosas del virus con una inefectividad alterada, antigenicidad y/o patogenicidad. Realmente, existen preocupaciones de seguridad sobre el uso de vacunas virales de animales vivos [Organización Mundial de la Salud, 1989]. Además, las preocupaciones de seguridad sobre el uso de vacunas virales de animales vivos no se superan utilizando virus de animales inactivos, debido a que los virus de animales inactivos generalmente no favorecen la producción de lgG2a. En realidad, se piensa que el proceso de infección . .... _--J--^._. - .--. f ,.i, AJ-.v^^ _.._.._- „j._ .,_____-_^ll¡fa_M__1M_ . ,_. tipificado por los virus vivos por sí mismo genera IFN-?, conduciendo a una predominancia de inmunoglobulinas de respuesta TH1 [Nguyen y colaboradores (1994) J. Immunol. 1 52:478]. Aunque otro planteamiento ha involucrado la utilización de vectores bacterianos vivos e inmunización de ADN, que favorecen la generación de respuestas TH1 a los péptidos expresados, este planteamiento, sin embargo, con frecuencia depende de, y es sensible a, ya sea la ruta de suministro o el adyuvante utilizado. Más aún, las preocupaciones de seguridad sobre el uso de vacunas bacterianas vivas y vivas de ADN [Organización Mundial de la Salud, 1989] limitan adicionalmente su aplicación clínica. Por lo tanto, existe una necesidad de composiciones y métodos para generar respuestas tipo TH 1 . De preferencia, la generación de respuestas tipo TH1 por estas composiciones y métodos no es afectada por los antecedentes genéticos del animal huésped, la identidad del antígeno, la ruta de suministro del antígeno, y el régimen de inmunización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones que son efectivos para modular la naturaleza y/o el nivel de una respuesta inmune a una molécula ejemplificada por, pero no limitada a, un antígeno o un inmunógeno. En particular, la invención proporciona métodos y medios para efectuar una inclinación TH1 en la respuesta inmune a las moléculas, tales como antígenos o inmunógenos, y/o para reducir una inclinación TH2 en la respuesta inmune a estas moléculas. De una _.--,_* -¿4 -_.*-..-.-- ..11ffi j_ _...__.,^_t_ manera más particular, la invención proporciona métodos y medios para incrementar una respuesta inmune TH1 , que se dirija contra moléculas que de otra manera estimularían en general una respuesta tipo TH2. La invención proporciona además composiciones y métodos para reducir una respuesta inmune TH2 a las moléculas. En la presente se proporcionan adicionalmente composiciones y métodos para alterar (es decir, incrementar o reducir) el nivel de inmunoglobulinas asociadas con TH1 y TH2, el nivel de proliferación de citocinas asociadas con TH1 y TH2, y el nivel de proliferación de células TH1 y TH2. De una manera más particular, la invención proporciona un método para alterar el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en un animal, el cual comprende: a) proporcionar: i) un virus de planta que contenga un péptido heterólogo; y ii) un animal huésped; b) administrar el virus de planta al animal huésped para generar un animal tratado; c) probar un incremento en el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en el animal tratado en relación con el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en un animal de control. En una modalidad, el método comprende además d) observar un incremento en el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en el animal tratado. Sin pretender limitar la invención a cualquier vía de administración particular, en otra modalidad, la administración se selecciona a partir de administración intranasal, oral, parenteral, subcutánea, intratecal, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. También, sin limitación de la invención al tipo o a la fuente de las composiciones incluidas en la administración de los virus de la invención, en todavía otra modalidad, la administración comprende .---_>.--. -..

A *.^ ?j- -- 7 - además administrar una composición seleccionada a partir de adyuvante inmune, citocina y excipiente farmacéutico. En una modalidad adicional, la administración da como resultado la reducción de los síntomas asociados con la exposición del animal huésped al péptido heterólogo. 5 Aunque no se pretende que la invención se limite a cualquier tipo particular de animal huésped, en todavía otra modalidad, el animal huésped es un mamífero. No se pretende que la invención se limite a cualquier mamífero particular. Sin embargo, en una modalidad preferida, el mamífero se selecciona a partir de ratón y ser humano. En una 10 modalidad más preferida, el animal huésped es un ratón, y la inmunoglobulina asociada con TH1 se selecciona a partir de lgG2a e lgG2b. En una modalidad todavía más preferida, la inmunoglobulina asociada con TH1 es lgG2a. En otra modalidad preferida, el animal huésped es un ser humano, y la inmunoglobulina asociada con TH1 se 15 selecciona a partir de lgG1 e lgG3. Sin restringir la especificidad de la inmunoglobulina asociada con TH1 , en una modalidad alternativa, la inmunoglobulina asociada con TH1 se selecciona a partir de la inmunoglobulina específica para el péptido heterólogo, y la inmunoglobulina específica para el virus de 20 planta. En otra modalidad alternativa, el virus de planta es un virus de ARN. En una modalidad alternativa adicional, el virus de planta es un virus de planta icosahédrico seleccionado a partir de Comovirus, Tombusvirus, Sobemovirus y Nepovirus. En una modalidad preferida, el virus de planta es un Comovirus. En una modalidad más preferida, el 25 Comovirus es virus de mosaico de alverjón (CPMV). . -_-__Í Aunque la invención no está limitada a ninguna fuente o tipo particular de péptido heterólogo, en una modalidad alternativa adicional, el péptido heterólogo se selecciona a partir de la subunidad ß de la gonadotropina coriónica humana, IgE enlazada con membrana humana, variante lll del receptor de factor de crecimiento epidérmico mutante humano, parvovirus canino, una hormona de péptido, una hormona de liberación de gonadotropina, un alérgeno, un péptido derivado a partir de una célula de cáncer, y un péptido derivado a partir de un patógeno de animal. La invención no pretende limitarse a la localización sobre el virus en el que se exprese el péptido heterólogo. No obstante, en todavía otra modalidad alternativa, el péptido heterólogo se expresa en una porción expuesta de la proteína de recubrimiento del virus de planta. En una modalidad preferida, la proteína de recubrimiento tiene una estructura de barrera beta, y el péptido heterólogo se inserta en un ciclo entre las cadenas individuales de la hoja beta de la estructura de barrera beta. En una modalidad más preferida, el péptido heterólogo se inserta en el ciclo ßB-ßC del virus de planta. En otra modalidad preferida, el péptido heterólogo se inserta entre la alanina 22 y la prolina 23 de la proteína de recubrimiento pequeña (VP-S) del virus de mosaico de alverjón. En otra modalidad, se inserta una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido heterólogo en el genoma del virus de la planta, en un sitio que está libre de las repeticiones de secuencias de nucleótidos directas que flanquean la secuencia de ácido nucleico. No se contempla que la invención se restrinja al tipo de .-t-s-ü-M-^ _-.-._, --.-- , heterólogo. Sin embargo, en todavía otra modalidad, el péptido heterólogo es antigénico. En una modalidad preferida, el péptido heterólogo se deriva a partir de un virus de animal. En una modalidad más preferida, el virus de animal se selecciona a partir de virus de enfermedad de pie y boca, virus de inmunodeficiencia humana, rinovirus humano, parvovirus canino. En una modalidad preferida alternativa, el péptido heterólogo se deriva a partir de una composición seleccionada a partir de un patógeno de animal, una hormona, y citocina. En una modalidad más preferida, el patógeno de animal se selecciona a partir de un virus, bacteria, protozoario, nemátodo y hongo. En todavía una modalidad adicional, el péptido heterólogo es inmunogénico. La invención proporciona adicionalmente un método para alterar el nivel de proliferación de células TH1 en un animal, el cual comprende: a) proporcionar: 1) un virus de planta que contenga un péptido heterólogo; y ii) un animal huésped; b) administrar el virus de planta al animal huésped para generar un animal tratado; y c) probar un incremento en el nivel de proliferación de células TH1 a partir del animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células TH1 a partir de un animal de control. En una modalidad, el método comprende además d) observar un incremento en el nivel de proliferación de células TH1 a partir del animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células TH1 a partir de un animal de control. En otra modalidad, la administración da como resultado la reducción de los síntomas asociados con la exposición del animal huésped al péptido heterólogo. En la presente también se proporciona un método para alterar el nivel de una citocina asociada con TH1 en un animal, el cual comprende: a) proporcionar: i) un virus de planta que contenga un péptido heterólogo; y ii) un animal huésped; y b) administrar el virus de planta al animal huésped para generar un animal tratado; y c) probar un incremento en el nivel de citocina producida por las células T del animal tratado en relación con el nivel de citocina producida por las células T de un animal de control. En una modalidad, el método comprende además d) observar un incremento en el nivel de la citocina producida por las células T del animal tratado en relación con el nivel de la citocina producida por las células T de un animal de control. En otra modalidad, la administración da como resultado la reducción de los síntomas asociados con la exposición del animal huésped al péptido heterólogo. En todavía otra modalidad, la citocina se selecciona a partir de IL-2, TNF-ß e IFN-?. En una modalidad preferida, la citocina es INF-?. En una modalidad adicional, el nivel de una citocina asociada con TH2 en el animal tratado es igual que el nivel de la segunda citocina en el animal huésped. En una modalidad preferida, la segunda citocina se selecciona a partir de IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13. En una modalidad más preferida, la segunda citocina es IL-4. En una modalidad adicional, se usa el nivel de una citocina asociada con TH2 en el animal tratado en relación con el nivel de la segunda citocina en el animal huésped. La invención proporciona adicionalmente un método para incrementar el nivel de una respuesta inmune tipo TH1 a una molécula de interés en un animal, el cual comprende: a) proporcionar: i) la molécula de interés; ii) un virus de planta que exprese un péptido heterólogo capaz de ____________ ________!_ _A_______ conjugarse con la molécula de interés; y iii) un animal huésped; b) conjugar la molécula de interés con el péptido heterólogo para generar un conjugado; y c) administrar el conjugado al animal huésped para generar un animal tratado bajo condiciones tales que se incremente el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune TH1 a la molécula de interés en un animal de control. En una modalidad, el método comprende además d) probar un incremento en el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a la molécula de interés en un animal de control. En una modalidad preferida, el método comprende además e) observar un incremento en el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a la molécula de interés en un animal de control. Aunque no se limita la naturaleza o el grado del nivel incrementado de respuesta tipo TH1 , en otra modalidad preferida, el nivel incrementado de respuesta inmune tipo TH1 se selecciona a partir de (a) un nivel incrementado de inmunoglobulina asociada con TH1 en el animal tratado en relación con el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en un animal de control, (b) un nivel incrementado de proliferación de células TH1 a partir del animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células TH1 a partir de un animal de control, y (c) un nivel incrementado de citocina asociada con TH1 en el animal tratado en relación con el nivel de citocina asociada con TH1 en un animal de control. En otra modalidad, la citocina asociada con TH1 se selecciona a partir de IL-2, TNF-ß e IFN-?. En una modalidad más preferida, la citocina es INF-?. En todavía otra modalidad, la administración da como resultado la reducción de los síntomas asociados con la exposición del animal huésped a la molécula de interés. En una modalidad alternativa, la molécula de interés comprende un péptido, un polisacárido, un ácido nucleico, o un lípido. En una modalidad preferida, la molécula de interés se deriva a partir de una fuente seleccionada a partir de un patógeno de animal, un alérgeno y una célula de cáncer. No se pretende que la invención se limite al tipo o naturaleza del virus. Sin embargo, en otra modalidad alternativa, el virus de planta es un virus de planta icosahédrico seleccionado a partir de Comovirus, Tombusvirus, Sobemovirus y Nepovirus. En una modalidad preferida, el virus de planta es un Comovirus. En una modalidad más preferida, el Comovirus es virus de mosaico de alverjón (CPMV). Aunque no se pretende limitar la localización de la introducción del péptido heterólogo en el virus, en una modalidad todavía más preferida, el péptido heterólogo se inserta entre la alanina 22 y la prolina 23 de la proteína de recubrimiento pequeña (VP-S) del virus de mosaico de alverjón. En una modalidad alternativa adicional, el péptido heterólogo se expresa en una porción expuesta de la proteína de recubrimiento del virus de planta. La invención no está limitada a la naturaleza o tipo de péptido heterólogo. No obstante, en una modalidad alternativa adicional, el péptido heterólogo comprende uno o más aminoácidos cargados ' .- l 13 - sSliccionados a partir de aminoácidos negativamente cargados y aminoácidos positivamente cargados, en donde la carga negativa sobre los aminoácidos negativamente cargados se equilibra por la carga positiva sobre los aminoácidos positivamente cargados. En una modalidad preferida, los aminoácidos negativamente cargados se seleccionan a partir del ácido aspártico, el ácido glutámico, y cisteína. En otra modalidad preferida, los aminoácidos positivamente cargados se seleccionan a partir de Usina, arginina e histidina. En todavía otra modalidad preferida, el péptido heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos cargados contiguos seleccionados a partir de una primera secuencia que consiste en aminoácidos negativamente cargados contiguos, y una segunda secuencia que consiste en aminoácidos positivamente cargados contiguos. En una modalidad más preferida, la secuencia de aminoácidos cargados contiguos se presenta en el péptido heterólogo como una secuencia de repetición. En otra modalidad más preferida, la secuencia heteróloga comprende las primera y segunda secuencias. En una modalidad todavía más preferida, la primera secuencia es contigua con la segunda secuencia. En una modalidad particularmente preferida, las primera y segunda secuencias contiguas se presentan en el péptido heterólogo como una secuencia de repetición. En una modalidad preferida adicional, el péptido heterólogo comprende aminoácidos negativamente cargados no contiguos, y aminoácidos positivamente cargados no contiguos. En una modalidad más preferida, el péptido heterólogo comprende además una secuencia de aminoácidos cargados contiguos seleccionados a partir de una primera secuencia que consiste en aminoácidos negativamente cargados ¡_g_|¡_ÍÜÜ^^___a *** J¡ -—¿.-A...... contiguos, y una segunda secuencia que consiste en aminoácidos positivamente cargados contiguos. En todavía una modalidad más preferida, el péptido heterólogo comprende la primera secuencia. En una modalidad adicionalmente preferida, la primera secuencia de aminoácidos cargados negativamente contiguos tiene la fórmula general Asp-Glun-Gly- Lys.n-Asp-Glun enlistada como SEQ ID NO: 16, en donde n es un entero de 1 a 40. En una modalidad particularmente preferida, la primera secuencia es la secuencia de aminoácidos Asp-Glu-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Asp-Glu enlistada como SEQ ID NO:20. Sin limitar la ruta o modo de administración, en otra modalidad, la administración se selecciona de intranasal, oral, parenteral, subcutánea, intratecal, intravenosa, intraperitoneal, y administración intramuscular. En una modalidad adicional, la administración además comprende administrar una composición seleccionada de adyuvante inmune, citocinas, y excipiente farmacéutico. Aunque no se limite el tipo de animal, la invención contempla que, todavía en otra modalidad, el animal huésped es un mamífero. En una modalidad preferida, el mamífero se selecciona entre ratón y humano. En una modalidad alternativa, el conjugado es inmunogénico. También se proporciona por la invención un método para reducir el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a una molécula de interés, que comprende: a) proporcionar: i) la molécula de interés; ii) un virus de planta; e iii) un animal huésped; b) conjugar la molécula de interés con el virus de planta para generar un conjugado; y c) administrar el conjugado al animal huésped para generar un animal tratado bajo condiciones tales como el nivel de la respuesta inmune del tipo TH2 a la molécula de interés en el animal tratado se reduce en relación con el nivel de respuesta inmune de tipo TH2 de la molécula de interés en el animal de control. En una modalidad, el método además comprende d) probar una reducción en el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en un animal de control. En una modalidad preferida, el método además comprende e) observar una reducción en el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en un animal de control. En otra modalidad, la administración da como resultado reducir los síntomas asociados con la exposición del animal huésped a la molécula de interés. En una modalidad alternativa, el nivel reducido de respuesta inmune tipo TH2 se selecciona en (a) nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2 en el animal tratado en relación con el nivel de inmunoglobulina asociada con TH2 en un animal de control, (b) nivel reducido de proliferación de células TH2 del animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células TH2 de un animal de control, y (c) nivel reducido de citocina asociada con TH2 en el animal tratado en relación con el nivel de citocina asociada con TH2 en un animal de control. En una modalidad preferida, la citocina asociada con TH2 se selecciona entre IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13. En una modalidad más preferida, la citocina asociada con TH2 es IL-4. En otra modalidad alternativa, la molécula de interés comprende un péptido, polisacárido, ácido nucleico o lípido. En una modalidad alternativa _¿_ y ___| i. -t-ffllMj.f -f adicional, la molécula de interés se selecciona entre un antígeno y un adyuvante. En una modalidad preferida, el antígeno es un péptido. En todavía otra modalidad alternativa, el animal huésped es un ratón, y la inmunoglobulina asociada con TH2 se selecciona entre lgG1 e lgG3. En una modalidad adicional, el animal huésped es humano, y la inmunoglobulina asociada con TH2 es lgG2. La invención también proporciona un método para reducir el nivel de una respuesta inmune tipo TH2 existente a una molécula de interés, que comprende: a) proporcionar: i) la molécula de interés; ii) un virus de planta; e iii) un animal huésped que exhibe una respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés; b) conjugar la molécula de interés con el virus de planta para generar un conjugado; y c) administrar el conjugado al animal huésped para generar un animal tratado bajo condiciones tales, que el nivel de respuesta inmune tipo TH2 en el animal tratado sea reducido en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH2 en el animal huésped. En una modalidad, el método además comprende d) probar una reducción en el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en un animal de control. En una modalidad preferida, el método además comprende e) observar una reducción en el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en el animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH2 a la molécula de interés en un animal de control. En otra modalidad, la respuesta TH2 en el animal huésped es dominante. gfd ^j &¡ fr 17 - La invención proporciona también un proceso para aumentar el nivel de una respuesta inmune tipo TH1 a una molécula de interés en un animal, que comprende: a) proporcionar: i) dicha molécula de interés; ii) un virus de planta que expresa un péptido heterólogo capaz de conjugar a dicha molécula de interés; e iii) un animal huésped; b) conjugar dicha molécula de interés con dicho péptido heterólogo para generar un conjugado; c) administrar dicho conjugado a dicho animal huésped para generar un animal tratado en condiciones de manera que el nivel de la respuesta inmune del tipo TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado se aumente en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en un animal de control; d) opcionalmente probar un incremento en el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune TH1 a dicha molécula de interés en un animal de control; e) opcionalmente observar un aumento en el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado en relación con el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en el animal de control. En una modalidad, el nivel aumentado de respuesta inmune tipo TH1 se selecciona entre (a) nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1 en dicho animal tratado en relación con el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en un animal de control, (b) aumentar el nivel de proliferación de células TH1 de dicho animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células de TH1 de un animal de control, y (c) nivel aumentado de citocina asociada con TH1 en dicho animal tratado en relación con el nivel de citocina asociada con TH1 en un animal de control. En otra modalidad, la citocina asociada con TH1 se selecciona entre IL-2, TNF-ß e IFN-?. En todavía otra modalidad, la administración da como resultado reducir los síntomas asociados con exposición de dicho animal huésped a dicha molécula de interés. En otra modalidad adicional, la molécula de interés comprende un péptido, polisacárido, ácido nucleico, o lípido. En una modalidad alternativa, la molécula de interés se deriva de una fuente seleccionada de un patógeno animal, un alérgeno, y una célula de cáncer. En todavía otra modalidad, el virus de planta es un virus de planta icosahédrico seleccionado de Comovirus, Tombusvirus, Sobernovirus y Nepovirus. En una modalidad alternativa, el virus de planta es un Comovirus. En una modalidad preferida, el Comovirus es un virus de mosaico de alverjón (CPMV). En todavía otra modalidad, el péptido heterólogo se expresa en una porción expuesta de la proteína de recubrimiento del virus de planta. En una modalidad alternativa, el péptido heterólogo comprende uno o más aminoácidos cargados seleccionados de aminoácidos cargados negativamente y aminoácidos cargados positivamente, en donde la carga negativa sobre dicho aminoácido cargado negativamente se equilibra por la carga positiva sobre dichos aminoácidos cargados positivamente. En otra modalidad, los aminoácidos cargados negativamente se seleccionan de ácido aspártico, ácido glutámico, y cisteína, y dichos aminoácidos cargados positivamente se seleccionan de lisina, arginina e histidina. En otra modalidad, el péptido heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos cargados contiguos seleccionados de una primera secuencia que consiste en aminoácidos contiguos cargados negativamente y una *-- • ff?l-i?i_Ítr?l??l?ii c-_r- -fa^->-^-^^- segunda secuencia que consiste en aminoácidos contiguos cargados positivamente. En todavía otra modalidad, la secuencia de aminoácidos contiguos cargados se presenta en dicho péptido heterólogo como una secuencia de repetición. En una modalidad adicional, la secuencia heteróloga comprende la primera y la segunda secuencias, y en donde dicha primera secuencia es contigua con dicha segunda secuencia. En todavía una modalidad adicional, la primera y segunda secuencias contiguas se presentan en dicho péptido heterólogo como una secuencia de repetición. En todavía una modalidad adicional, el péptido heterólogo comprende aminoácidos no contiguos cargados negativamente, y aminoácidos no contiguos cargados positivamente, y en donde el péptido heterólogo además comprende una secuencia de aminoácidos contiguos cargados seleccionados entre una primera secuencia que consiste en aminoácidos contiguos cargados negativamente, y una segunda secuencia que consiste en aminoácidos contiguos cargados positivamente. En otra modalidad, la primera secuencia de aminoácidos contiguos cargados negativamente tiene la fórmula general Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun enlistada como SEQ ID NO: 16, en donde n es un entero del 1 al 40. En todavía otra modalidad, la administración se selecciona de intranasal, oral, parenteral, subcutánea, intratecal, intravenosa, intraperitoneal, e intramuscular. En todavía otra modalidad, la administración además comprende administrar una composición seleccionada de adyuvante inmune, citocina, y excipiente farmacéutico. En una modalidad adicional, el animal huésped es un mamífero. En otra modalidad alternativa, el mamífero se selecciona entre ratón y humano. En una modalidad preferida, el conjugado es inmunogénico. La invención también proporciona un método para estimular una respuesta inmune específica para péptido predominantemente tipo TH1 que comprende la conjugación de un antígeno con un virus de planta, y administrar el complejo inmunogénico resultante a un animal. Preferentemente, el virus de planta es un virus de planta icosahédrico. Más preferentemente, el virus de planta es un Comovirus. Todavía más preferentemente, el virus de planta es un virus de mosaico del alverjón. En una modalidad, el antígeno es un péptido extraño que se expresa como un polipéptido de inserción codificado por un gen estructural recombinante del virus de planta. Preferentemente, el antígeno se expresa como un polipéptido de fusión codificado por un gen estructural de proteína de recubrimiento recombinante. En todavía otra modalidad, el complejo inmunogénico se administra en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, el modo de administración del complejo inmunogénico se selecciona de inoculación intranasal, inoculación oral, inoculación parenteral, e inoculación subcutánea. En todavía otra modalidad, el complejo inmunogénico se administra en presencia de un agente inmunomodulador. Preferentemente, el agente inmunomodulador es un adyuvante inmune. Más preferentemente, el adyuvante inmune se selecciona del grupo que comprende: toxina de cólera (CT) y mutantes de la misma, enterotoxina de corazón lábil (LT) y mutantes de la misma, Quil A (QS21 ); el adyuvante R1 B1 e ISCOMs. En una modalidad preferida alternativa, el agente inmunomodulador es una citocina, preferentemente una citocina que se puede secretar a partir de un linfocito CD4+Th1 de un animal. Más preferentemente, la citocina se selecciona del grupo de interleucina-2; interferón-?; factor de necrosis de tumor-ß. En una modalidad adicional, el complejo inmunogénico se administra mediante ruta subcutánea en un sitio en una sola dosis, mediante una ruta subcutánea en más de un sitio en una sola dosis contemporánea, mediante una ruta parenteral en un sitio en una sola dosis, mediante una ruta parenteral en más de un sitio en una sola dosis contemporánea, mediante una ruta subcutánea en un sitio en más de una dosis, mediante una ruta parenteral en un sitio en más de una dosis, mediante una ruta subcutánea en más de un sitio en más de una dosis, y/o mediante una ruta parenteral en más de un sitio en más de una dosis. También se proporciona por la invención una partícula de virus quimérico, la cual es útil en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, y en la cual un péptido reactivo capaz de tener conjugado químicamente a él una molécula proteinácea o no proteinácea, se codifica dentro de un gen estructural del genoma de virus de planta quimérico. En una modalidad, el péptido químicamente reactivo se inserta en una proteína de recubrimiento de la partícula de virus quimérico. En otra modalidad, la inserción del péptido químicamente reactivo está entre alanina 22 y prolina 23 de la proteína de recubrimiento pequeña (VP-S) del virus de mosaico del alverjón. En todavía otra modalidad, las cargas positivas sobre los residuos de aminoácido reactivos (X) se equilibran mediante la inclusión de un número correspondiente de residuos de aminoácidos cargados negativamente (Y) dentro del péptido reactivo, conformando una fórmula general X(n)Y(n), en donde n es un entero entre 1 y 40. En otra modalidad, el péptido químicamente reactivo insertado tiene una secuencia de aminoácidos de la fórmula general DE(n)GK(n)DE(n), en donde n es un entero de entre 1 y 40. En una modalidad preferida, el péptido químicamente reactivo insertado tiene la secuencia de aminoácidos DEGKGKGKGKDE. En una modalidad adicional, el antígeno es una fracción de carbohidrato conjugada vía un enlace químico con un péptido reactivo expresado como una fusión insertada dentro de una proteína estructural de un virus de planta quimérico. La invención también proporciona un método para desviar la reacción inmune tipo TH2 favorecida por las características estimulantes inmunes inherentes de un antígeno que comprende conjugar el antígeno con un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante a un animal. También se describe en la presente un método para desviar una reacción inmune tipo TH2 favorecida por las características estimulantes inmunes inherentes de un péptido que comprende expresar el péptido como un polipéptido de fusión codificado por el genoma recombinante de un virus de planta, y administrar el complejo inmunogénico resultante a un animal. La invención adicionalmente proporciona un método para desviar una reacción inmune tipo TH2 favorecida por la constitución genética de un animal a un antígeno que comprende conjugar el antígeno a un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante al animal. Más aún, la invención proporciona un método para desviar una reacción inmune tipo TH2 favorecida por la constitución genética de un animal a un péptido que comprende expresar el péptido como un polipéptido de fusión codificado por el genoma recombinante de un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante a un animal. También se proporciona por la invención un método para desviar una reacción inmune tipo TH2 favorecida por las características estimulantes inmunes inherentes de un adyuvante presente en un complejo inmunogénico que contiene un antígeno que comprende conjugar el antígeno con un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante a un animal. La invención adicionalmente proporciona un método para tratar un animal de una enfermedad infecciosa mediante la estimulación de una respuesta inmune desviada TH1 que comprende conjugar un antígeno asociado con el agente infeccioso con un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante al animal. También, la invención proporciona un método para tratar un animal de una alergia mediante la estimulación de una respuesta inmune desviada TH1 que comprende conjugar un antígeno derivado del alérgeno conocido asociado con la alergia con virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante al animal. Además, la invención describe un método para tratar un animal que sufre de cáncer mediante la estimulación de una respuesta inmune desviada TH1 que comprende conjugar un antígeno asociado con ___-t__a_MÉ- ¿i**?mákfem~~ .. **^**^* ^*^ ,f_¿fc..* _. el cáncer con un virus de planta y administrar el complejo inmunogénico resultante al animal. Además, en la presente se proporciona un método para inducir un cambio en la respuesta inmune tipo TH2 existente a un antígeno presente en un complejo inmunogénico usado para iniciar una respuesta inmune en un animal que comprende inocular un animal con un complejo inmunogénico que contiene ese antígeno conjugado con una partícula de virus de planta en una dosis secundaria o de refuerzo posterior.

DEFINICIONES Para facilitar el entendimiento de la invención, varios términos se definen más adelante. Los términos "antígeno" y "antigénico" se refieren a cualquier sustancia que se reconoce específicamente por anticuerpo o un receptor de célula T. Los antígenos contienen uno o más epítopes (también conocidos como "determinantes antigénicos"). Un "epítope" es una estructura o un antígeno que interactúa con un sitio de enlace de un anticuerpo o receptor de célula T como un resultado de complementariedad molecular. Un epítope puede competir con el antígeno intacto, a partir del cual se deriva, para enlazarse con un anticuerpo. En general, los anticuerpos secretados y sus formas de enlace de membrana correspondientes son capaces de reconocer una amplia variedad de sustancias como antígenos, mientras que los receptores de células T son capaces de reconocer solamente fragmentos de proteínas que están en complejo con moléculas MHC sobre las superficies celulares. Los _______^___g_f_^_____j__Í_£_______ ___M___£___£_^___^_|^^A_____________j antígenos reconocidos por los receptores de inmunoglobulina sobre células B se subdividen en tres categorías: antígenos dependientes de células T, antígenos independientes de células T tipo 1 ; y antígenos independientes de células T tipo 2. Un antígeno puede contener una o más de las siguientes moléculas: un péptido, polisacárido, secuencia de ácidos nucleicos, y lípido. Los términos "inmunógeno", "inmunogénico" e "inmunológicamente activo" se refiere a cualquier sustancia que es capaz de inducir una respuesta inmune mediada por célula o humoral específica. Por definición, un inmunógeno debe contener cuando menos un epítope, y generalmente contiene varios epítopes. Los inmunógenos se ejemplifican, pero no se restringen a moléculas que contienen un péptido, polisacárido, secuencia de ácido nucleico, y/o lípido. Los complejos de péptidos con lípidos, polisacáridos, o con secuencias de ácidos nucleicos también se contemplan, incluyendo (sin limitación) glicopéptido, lipopéptido, glicolípido, etc. Estos complejos son inmunógenos particularmente útiles, en donde moléculas más pequeñas con pocos epítopes no estimulan una respuesta inmune satisfactoria por sí misma. El término "alérgeno" se refiere a un antígeno o inmunógeno que induce una o más reacciones de hipersensibilidad (alérgicas), ejemplificadas, pero sin limitarse a la producción de anticuerpos IgE. Los alérgenos incluyen, pero no se restringen a, polen de algas, pastos o árboles, o de hongos, polvos de animales, polvo doméstico o alimentos. Los individuos expuestos a un alérgeno generalmente, aunque no necesariamente, desarrollan urticaria o las manifestaciones de fiebre de heno o asma. El término "adyuvante" como se usa en la presente, se refiere a cualquier compuesto, el cual, cuando se inyecta junto con un antígeno, aumentan no específicamente la respuesta inmune a ese antígeno. El término "excipiente" se refiere en la presente a cualquier sustancia inerte {por ejemplo, goma arábiga, jarabe, lanolina, almidón, etc.) que forma un vehículo para la administración de un antígeno. El término excipiente incluye sustancias, las cuales, en presencia de un líquido suficiente, imparte a la composición la calidad adhesiva necesaria para la preparación de pildoras o tabletas. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan de manera intercambiable para referirse a una glicoproteína evocada en un animal por un ¡nmunógeno. Un anticuerpo demuestra especificidad al inmunógeno, o, más específicamente, a uno o más epítopes contenidos en el inmunógeno. El anticuerpo original comprende cuando menos dos cadenas de polipéptido ligeras, y cuando menos dos cadenas de polipéptido pesadas. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. El término "anticuerpo policlonal" se refiere a inmunoglobulina producida de más de una sola clona de células de plasma; en contraste con "anticuerpo monoclonal" se refiere a inmunoglobulina producida de una sola clona de células de plasma. El término "isotipo" o "clase" cuando se hace en referencia a un anticuerpo se refiere a una clase de anticuerpo que se codifica por un tipo particular de gen de región constante de cadena pesada. De este modo, diferentes isotipos de anticuerpos difieren en la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada (CH). Algunos isotipos de anticuerpos son conocidos, incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. De este modo, IgG posee domino constante de cadena pesada ? (C?); IgM posee dominio constante de cadena pesada µ (Cµ); IgA posee domino constante de cadena pesada a (Ca); IgD posee dominio constante de cadena pesada d (Cd); e IgE posee dominio constante de cadena pesada e (Ce). Diferentes clases de anticuerpos exhiben diferentes funciones efectoras y presentan diferente localización de tejido. Cada clase de anticuerpo se puede expresar como una membrana (m) o una forma secretada (s) que difieren en secuencia en el término carboxilo de la cadena pesada. La mayoría de los antígenos producen la expresión temprana de suero de IgM, seguida después por una respuesta de cambio de isotipo secundaria, en la cual los productos de los genes de cadena pesada corriente abajo, tales como C?1 y C?2a predominan. El isotipo de anticuerpo que predomina generalmente depende del tipo de antígeno (por ejemplo, polipéptido, polisacárido, ere.) usado para provocar la producción del anticuerpo. Los términos "subtipo" y "subclase" cuando se hacen en referencia con un isotipo de anticuerpo, intercambiablemente se refieren a anticuerpos dentro de un isotipo que contienen variación en la estructura de cadena pesada. Por ejemplo, el isotipo IgG humano contiene los cuatro subtipos lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4, mientras que el isotipo IgG de ratón contiene los cuatro subtipos lgG1 , lgG2a, lgG2b, lgG3. El isotipo IgA humano contiene los subtipos lgA1 e lgA2. Los genes que codifican la cadena pesada constante han sido mapeados en el ratón y se localizan en , .»ctccic-l el cromosoma 12 en el orden (a partir del extremo 5') Cµ-Cd-C?3-C?1-C?2b-C?2a-Ce-Ca correspondiente a los isotipos IgM, IgD, lgG3, lgG1 , lgG2b, lgG2a, IgE e IgA. El término "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual un isotipo de anticuerpo {por ejemplo, IgM) cambia a otro isotipo de anticuerpo {por ejemplo, IgG). De manera similar, el término "cambio de subtipo" se refiere al fenómeno mediante el cual un subtipo de anticuerpo {por ejemplo, lgG1) cambia a otro subtipo {por ejemplo, lgG2a) del mismo isotipo de anticuerpo. El término "funciones efectoras" como se usa en la presente en referencia a un anticuerpo se refieren a actividades de enlace con no antígenos que son mediadas por las moléculas de anticuerpos, y las cuales se ejecutan a través de la región de cadena pesada constante de la molécula. Las funciones efectoras se ejemplifican por el enlace receptor sobre las células inmunes, la fijación de complemento, etc. Las funciones efectoras facilitan la remoción de antígeno del cuerpo por medio de lisis o fagocitosis mediada por el complemento. Los términos "enlace específico" o "específicamente enlazado" cuando se usan en referencia a la interacción de un anticuerpo y un antígeno, significa que la interacción preferentemente muestra una preferencia por, y más preferentemente depende de, la presencia de una estructura particular {es decir, el determinante antigénico o epítope) sobre el antígeno; en otras palabras, el anticuerpo s e reconoce y es enlazado a una estructura de antígeno específica (incluyendo estructuras relacionadas) en vez de antígenos en general. Por ejemplo, si un . .. »--t-g.-_-,jfc._». -. ^?ß?nmL?z.y.*j?aii?t. anticuerpo es específico para el epítope "A", la presencia de un antígeno que contenga epítope A (o libre, A sin etiqueta) en una reacción que contiene "A" etiquetado, el anticuerpo reducirá la cantidad de A etiquetado enlazado al anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "cantidad inmunogénicamente efectiva" se refiere a la cantidad de un inmunógeno requerida para invocar la producción de anticuerpos en un huésped después de la vacunación. Se prefiere, aunque no se requiere, que la cantidad inmunológicamente efectiva sea una cantidad "protectora". Los términos cantidad "protectora" y "terapéutica" de un inmunógeno se refieren a que la cantidad del inmunógeno que disminuye uno o más síntomas indeseables que se asocian con la exposición del animal huésped al inmunógeno. Los términos que "disminuye" y "reduce" síntomas como se usa en la presente en referencia al efecto de una composición particular o de un método particular significa que reducen, retrasan o eliminan uno o más síntomas en comparación con los síntomas observados en ausencia del tratamiento con la composición o método particular. Como se usa en la presente, el término "reducción" de síntomas se refiere a disminuir los niveles de uno o más síntomas. El término "retraso" de síntomas se refiere a aumentar el período de tiempo entre la exposición al inmunógeno y el brote de uno o más síntomas. El término "eliminación" de síntomas se refiere a "reducir" completamente y/o "retrasar" completamente uno o más síntomas. El término "animal" se refiere a cualquier animal cuyos anticuerpos, o receptores de células T, son capaces de reconocer * ¿-Lie -í ií-¿"*¡* específicamente un antígeno. Alternativamente, el término "animal" incluye cualquier animal que sea capaz de inducir una respuesta inmune humoral específica o mediada por células a un inmunógeno. Los animales preferidos incluyen, pero no se limitan a mamíferos, tales como roedores, humanos, primates, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc. Los animales preferidos se seleccionan del "orden Rodentia", el cual se refiere a roedores, es decir, mamíferos placentarios (clase Euthria), que incluyen la familia Muridae {por ejemplo, ratas y ratones), más preferentemente ratones. Los términos "secuencia de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" como se usa en la presente se refieren a oligonucleótido o polinucleótido, y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que pude ser de cadena simple o doble, y representan la cadena de sentido o antisentido. Los términos "secuencia de aminoácidos", "péptido" y "secuencia de péptido", "polipéptido" y "secuencia de polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a una secuencia de aminoácidos. Los términos "péptido de interés", "secuencia de nucleótido de interés" y "molécula de interés" se refieren a cualquier secuencia de péptido, secuencia de nucleótido, y molécula, respectivamente, cuya manipulación puede considerar deseable por cualquier razón, por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. Las moléculas ejemplares de interés incluyen, pero no se limitan a, un péptido, glicopéptido, polisacárido, lipopéptido, glicolípido, lípido, esteroide, ácido nucleico, etc. _,__ t.MÉtÍUf¡lmiA?ItlÍt*iÍ»i*y,.. l y . ~ .^¿í l??t+¡ ?tí.*Mua?.lllL*mi.t?~*..

El término "derivado" cuando se hace referencia a un péptido derivado de una célula de cáncer, como se usa en la presente, pretende referirse a un péptido que ha sido obtenido {por ejemplo, aislado, purificado, etc.) de una célula de cáncer. El término "biológicamente activo" cuando se aplica a cualquier molécula {por ejemplo, polipéptido, secuencia de nucleótido, etc.) se refiere a una molécula que tiene funciones estructurales, reguladoras y/o bioquímicas de la molécula que se presenta naturalmente. Una secuencia de péptidos y secuencia de nucleótidos puede ser "endógena" o "heteróloga" (es decir, "extraña"). El término "endógeno" se refiere a una secuencia que se encuentra naturalmente en la célula o virus en el cual se introduce, en tanto no contenga alguna modificación relativa a la secuencia que se presenta naturalmente. El término "heterólogo" se refiere a una secuencia que no es endógena a la célula o virus en la cual se introduce. Por ejemplo, el ADN heterólogo incluye una secuencia de nucleótidos que se liga a, o se manipula para quedar ligado a, una secuencia de ácidos nucleicos a la cual no está ligada por naturaleza, o a la cual se liga en un lugar diferente en la naturaleza. El ADN heterólogo también incluye una secuencia de nucleótidos que se encuentra naturalmente en la célula o virus en la cual se introduce, y la cual contiene alguna modificación en relación con la secuencia que se presenta de manera natural. Generalmente, aunque no necesariamente, el ADN heterólogo codifica ARN heterólogo y proteínas heterólogas que no se producen normalmente por la célula o virus en la cual se introduce. Ejemplos de ADN heterólogo incluye genes reporteros, secuencias reguladoras de transcripción y de traducción, secuencias de ADN que codifican proteínas marcadoras seleccionables {por ejemplo, proteínas que confieren resistencia a los fármacos), ere. El término "tipo natural", cuando se hace en referencia a una secuencia de péptidos y a una secuencia de nucleótidos, respectivamente, que tiene las características de esa secuencia de péptidos y secuencia de nucleótidos cuando se aisla de una fuente que se presenta naturalmente. Una secuencia de péptido del tipo natural y secuencia de nucleótidos es la que se observa más frecuentemente en una población y de este modo se designa arbitrariamente la "normal" o forma "tipo natural" de la secuencia de péptido y la secuencia de nucleótidos, respectivamente. En cambio, el término "modificado" o "mutante" se refiere a una secuencia de péptidos y secuencia de nucleótidos que presenta modificaciones en las propiedades de secuencia y/o funcionales (es decir, características alteradas) en comparación con la secuencia de péptidos y la secuencia de nucleótidos de tipo natural, respectivamente. Se nota que los mutantes que se presentan de manera natural se pueden aislar; éstos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas en comparación con la secuencia de péptidos y la secuencia de nucleótidos de tipo natural. El término "aislado", cuando se usa en relación con una molécula {por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de aminoácidos, etc.) se refiere a una molécula que se identifica y se separa de cuando menos una molécula contaminante con la cual se asocia. Como se usa en la presente, el término "purificado" se refiere a una molécula {por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, __ ¡g_l^?^_. i^jb secuencias de aminoácidos, ere.) que se remueve de su ambiente natural, se aisla, o separa. Una molécula "aislada", por lo tanto, es una molécula purificada. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están cuando menos 60% libres, preferentemente al menos 75% libres, y más preferentemente al menos 90% libres de otros componentes con los cuales se les asocia. Los términos "patógeno" y "patógeno animal" se refiere a cualquier organismo que causa una enfermedad en un animal. Los patógenos incluyen, pero no se limitan a, virus, bacterias, protozoarios, nemátodos, hongos, efe. El término "célula de cáncer" se refiere a una célula que sufre etapas tempranas, intermedias o avanzadas de progresión neoplástica de pasos múltiples. Las características de las etapas tempranas, intermedias y avanzadas de la progresión neoplástica se han descrito usando el microscopio. Las células de cáncer en cada una de las tres etapas de progresión neoplástica generalmente tienen cariotipos anormales, incluyendo translocaciones, inversiones, supresiones, isocromosomas, monosomias, y extracromosomas. Las células de cáncer incluyen "células hiperplásticas", es decir, células en etapas tempranas de progresión maligna, "células displásticas", es decir, células en las etapas intermedias de progresión neoplástica, y "células neoplásticas", es decir, células en las etapas avanzadas de progresión neoplástica. El término "virus de planta modificado" se refiere a un virus de planta, cualquier parte del cual ha sido modificado por técnicas químicas, bioquímicas y/o moleculares biológicas. Un "virus de planta quimérico" es . - .- -i. -ati--. --cj-----. ^g|^^ un virus de planta que ha sido modificado por medio de técnicas biológicas moleculares. Los términos "respuesta tipo TH 1 ", y "respuesta TH1 " cuando se hacen en referencia a una respuesta en un animal se refieren a cualquier respuesta celular y/o humoral que se genera por los linfocitos TH1 después del estímulo por un antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, cambios en el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 , proliferación de células TH1 , y/o citocina asociada con TH1 . En cambio, "respuesta tipo TH2", "respuesta TH2" cuando se hacen en referencia a una respuesta en un animal se refieren a cualquier respuesta celular y/o humoral que se genera por los linfocitos TH2 después del estímulo por un antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, cambios en el nivel de inmunoglobulina asociado con TH2, proliferación de células TH2, y/o citocina asociada con TH2. Los términos "inmunoglobulina asociada con TH1 " e "inmunoglobulina derivada de células TH 1 " se refiere a una o más inmunoglobulinas {por ejemplo, IgG) que son generadas por células TH1 . En cambio, los términos "inmunoglobulina asociada con TH2" e "inmunoglobulina derivada de célula TH2" se refieren a una o más inmunoglobulinas {por ejemplo, IgG) que son generadas por células TH2. Los subtipos de inmunoglobulina asociadas con TH1 y de inmunoglobulina asociadas con TH2 son específicas a la especie porque varían de especie en especie. Por ejemplo, mientras en lgG2 de ratón (y en particular lgG2a e lgG2b) es la inmunoglobulina asociada TH1 de principio, en la lgG1 e lgG3 de hombre son inmunoglobulinas asociadas TH1 las que realizan funciones TH1. Con respecto a las inmunoglobulinas asociadas con TH2, éstas incluyen lgG1 e lgG3 de ratón, e lgG2 de humana. Los métodos para determinar los subtipos de inmunoglobulina se conocen en la técnica y también se describen en la presente usando, por ejemplo, técnicas de prueba inmunosorbente de enzima enlazada (ELISA) que emplean pozos de muestra de recubrimiento con conjugados anti-lgG etiquetados con fosfatasa alcalina comercialmente disponible (AP) {por ejemplo, lgG1 , lgG2a, lgG2b o lgG3 anti-ratón de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (AP) [Southern Biotechnologies Inc. , EUA]) para la detección usando fosfato de p-nitrofenilo (PNPP [Sigma]) como el sustrato. Los términos "citocina asociada TH1 " y "citocina derivada de célula TH1 " se refieren a una o más de las citocinas producidas por células tipo TH1 , que incluyen, sin limitación, interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis de tumor-ß (TNF-ß), e interferón-? (IFN-?). En una modalidad preferida, la citocina asociada con TH1 es IFN-?. En cambio, los términos "citocina asociada con TH2" y "citocina derivada de célula TH2" se refieren a una o más de las citocinas producidas por células tipo TH2, incluyendo, sin limitación, interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), e interleucina-13 (IL-13). En una modalidad preferida, la citocina asociada con TH2 es IL-4.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones que son efectivos para modular la naturaleza y/o el nivel de una respuesta inmune a una molécula ejemplificada por, pero sin limitarse a, un antígeno __hd_-__,__ ."J--^~---*?--^ * • o un inmunógeno. En particular, la invención proporciona métodos y medios para efectuar una desviación TH1 en la respuesta inmune a moléculas tales como antígenos o inmunógenos y/o reducir una desviación TH2 en la respuesta inmune a tales moléculas. Más particularmente, la invención proporciona métodos y medios para aumentar una respuesta inmune TH 1 que se dirige contra las moléculas que de otro modo generalmente estimulan una respuesta tipo TH2. La invención además proporciona composiciones y métodos para reducir una respuesta inmune TH2 a las moléculas. Adicionalmente, se proporcionan en la presente las composiciones y métodos para alterar (es decir, aumentar o disminuir) el nivel de inmunoglobulina asociadas con TH 1 y TH2, el nivel de proliferación de citocinas asociadas con TH 1 y TH2, y el nivel de proliferación de las células TH1 y TH2. En un primer aspecto, la invención proporciona partículas de virus de planta modificados que son capaces de presentar a células del sistema inmunológico moléculas que son efectivas ya sea como inmunógenos o antígenos para la generación de anticuerpos y/o citocinas. Más particularmente, las moléculas presentadas vía las partículas de virus de planta modificados de la invención estimulan una respuesta tipo TH1 , más preferentemente estimulan una respuesta tipo TH1 predominante. En un segundo aspecto, la presente invención describe medios para modular la rama particular de rutas ayudantes T para reducir o superar una desviación indeseable hacia la respuesta tipo TH2, la cual es inherente en ciertas moléculas. Más preferentemente, tal modulación da como resultado una respuesta exclusivamente o predominantemente ñ k?&.á tipo TH1 en un animal inoculado con la molécula. En un tercer aspecto, la invención describe métodos para modular una reacción inmune en ausencia de agentes inmunomoduladores extraños {por ejemplo, adyuvantes, citocinas, etc.). En un cuarto aspecto, se describen métodos para prevenir, tratar o vacunar contra enfermedades (ejemplificados, pero sin limitarse a, enfermedades infecciosas, alergias y cáncer). Más particularmente, la invención describe el uso de virus de plantas no replicantes como portadores de moléculas {por ejemplo, antígenos e inmunógenos). Los datos presentados en la presente muestran que, sorprendentemente, la inmunización con virus de planta modificados como una plataforma para la presentación de moléculas da como resultado células específicas para virus de plantas y células TH1 específicas para moléculas. Una desviación profunda hacia la respuesta inmune tipo TH1 se muestra en la presente usando el virus de mosaico de alverjón ejemplar (CPMV) para presentar péptidos que se derivan de un amplio rango de fuentes incluyendo bacterias, virus, inmunoglobulina, hormona, y proteína superficial de células asociadas con cáncer. La desviación en favor de la respuesta inmune tipo TH1 se demuestra en la presente que es independiente de la fuente de la molécula, la dosis de la molécula, la presencia o ausencia de adyuvante, la naturaleza de la actividad inmunomoduladora del adyuvante si está presente, la ruta de administración, y la constitución genética (genotipo) del animal inmunizado. Este resultado es sorprendente en vista de los reportes de la _______|____i______M_Íi -&-_<«-. -cv_-._.J-i----.. - .ji-_aLC-----t?i-_-_to-. - técnica anterior de que la iniciación de los subconjuntos de células TH es afectada por la cepa del animal usada, la identidad del antígeno, la ruta de administración del antígeno, y el régimen de inmunización. Este resultado también es sorprendente en vista de la naturaleza no replicante de los virus de planta modificados de la invención y los reportes de la técnica anterior de que los virus vivos se requieren para una respuesta TH1 predominante [Nguyen y colaboradores (1994) supra]. Varios péptidos son inmunogénicos cuando se expresan en CPMV [McLain y colaboradores (1995) ADIS Res Hum Retro 11 :327; Daisgaard y colaboradores (1997) Nat. Biotechnol. 15:248; Brennan y colaboradores (1999) Microbiol. 145:21 1 ; Brennan y colaboradores (1999) J. Virol 73:930]. Los péptidos derivados de proteínas de enlace de fibronectina (FnBP) encontrados en la membrana externa de Staphylococcus aureus y expresado sobre la superficie del virus de mosaico de alverjón producen predominantemente lgG2a específico de péptido en ratones C57BL/6 [Brennan y colaboradores (1999) Microbiology 145:21 1 ], sugiriendo una desviación TH1 en las respuestas a estos péptidos expresados por la partícula de virus quimérico particular (CVP) inoculados en una cepa de ratones. Sin embargo, ninguna respuesta celular (células T) asociada con este fenómeno particular se ha reportado. En particular, la invención describe que, sorprendentemente, los péptidos derivados de un amplio rango de fuentes, incluyendo bacterias, virus, inmunoglobulina, hormona y proteína de superficie de célula asociada con cáncer, tienden a genera niveles mucho más altos de lgG2a específicos de péptido relativos con niveles de IgGi específicos de péptidos cuando se exhiben en el virus de mosaico de alverjón ejemplar (CPMV). Este virus de planta no se replica en células humanas y de este modo se comporta como un virus inactivo entero en un sistema de mamífero. En diferentes CVP probados en la presente, 6 generaron una predominancia de anticuerpo lgG2a específico de péptido sobre el anticuerpo lgG2t>, mientras que sólo CPMV-MAST1 favorece la producción de lgG2_ sobre la de lgG2a bajo ciertas condiciones. Las respuestas de anticuerpos específicos de CPMV también mostraron la misma predominancia de lgG2a sobre Igd. A nivel celular, se produjeron cantidades mucho mayores de tanto células que forman manchas (SFCs) [células B] que producen lgG2a específica de péptido como específica de CPMV en comparación con SFCs que producen IgGi en los bazos de ratones inmunizados con CVP. Aunque un entendimiento del mecanismo no se requiere, y sin pretender limitar la invención a ningún mecanismo particular, la polarización fuerte de la respuesta de isotipo tanto del péptido y virus a favor de la respuesta al tipo TH1 parece relacionarse con la capacidad del virus para iniciar CD4+TH1 específico de virus, facilitando mediante esto el cambio de clase de las células B naturales específicas del péptido y específicas (del virus) a células de plasma que producen inmunoglobulina asociada con TH1. La predominancia de lgG2a específico de péptido sobre IgGi se demuestra en la presente en 5 diferentes cepas de ratón endogámico que abarcan las H-2b (C57BL/6), H-2d (BALB/c), H-2q (NIH), 2dql (Biozzi AB/H), y H-2S (DBA/1 ). Aún en los ratones AB/H Biozzi y BALB/c ... ,.._ .-a--.------. s.. --j--?_^ia--..-j^,--M«-.--»,.|[|[| , - -rtmimflHi-ig,- ¡f iíl'i -a-a .ÍMO , I >...!.. . - 40 - desviados a TH2 [Natsuume-Sakai y colaboradores (1977) Immunology 32:861 ; Sant'Anna y colaboradores (1985) Immunogenetics 22: 131], lgG2a sorprendentemente predomina sobre Igd. Los adyuvantes probados en la presente con CVPs incluyeron aquellos que favorecen respuestas TH1 , tales como el Adyuvante Completo de Freund, y aquéllas que favorecen respuestas TH2 [alum y QS-21 : Cooper (1994) "The selective induction of different inmmune responses by vaccine adjuvants. En: Vaccine Design (G.l. Ada., ed), R.G. Landes Company, página 125]. De nuevo, los niveles de lgG2a generados usando estos adyuvantes o en ausencia de adyuvante, fueron niveles sorprendentemente más altos que los niveles de IgGi , resaltando que sin duda el virus de planta portador en vez del adyuvante es el que conduce las respuestas de TH1. De manera importante, a diferencia del caso con virus de animal descritos anteriormente, la predominancia de lgG2a sobre IgG. se observó independientemente de la cepa de ratón o del adyuvante usado para la inmunización. La invención además describe que la inmunización tanto en dosis altas como bajas (variando de 2-300 µg) de CVPs conduce a la generación de respuestas tipo TH1. De este modo, la dosis sobre tres ordenes de magnitud de antígeno administrado, previamente mostró que inflencía la generación de isotipos IgG de ratón [Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:2439; Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:809], sorprendentemente no pareció afectar la desviación TH1 en los isotipos de IgG específico de péptido. Los resultados obtenidos con los virus de planta icosahédricos a»_¡¡___, A ». .--ÉJ--. il iá-Éá. ejemplares descritos en la presente fueron sorprendentes, porque, en parte, otras partículas parecidas a virus icosahédricas (VLPs) derivadas de virus animales, tales como virus de Norwal [Ball y colaboradores (1998) J. Virol 72: 1345] y rotavirus [O'Neal y colaboradores (1997) J. Virol. 71 :8707] no producen tal predominancia fuerte de lgG2a sobre IgGi como se reporta aquí. En cualquier lado se reporta que el objetivo de los antígenos en partículas a los macrófagos no es suficiente en sí mismo para estimular una respuesta TH1 polarizada [Sedlik y colaboradores (1997) Intl. Immunol. 9:91], ya que la co-inmunización con moduladores inmunes, tales como IL-12 y poli(1):(C) se requiere. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para generar anticuerpos a una molécula, al inducir una respuesta tipo TH1 deseable y/o reducir una respuesta tipo TH2 indeseable a una molécula para el propósito de, por ejemplo, detectar, evitar y/o tratar enfermedades. En particular, los virus de planta modificados de la invención encuentran uso particular (aunque no exclusivo) en aplicaciones clínicas, ya que sus efectos inmunomoduladores pueden lograrse en ausencia de agentes inmunomoduladores extraños (tales como citocinas y adyuvantes), mediante lo cual se evita el gasto y los efectos laterales adversos que se asocian con la administración de estos agentes. Más aún, debido a que los virus de planta modificados de la invención no se replican en células humanas, representan una ventaja sobre los portadores de vacunas existentes, ya que evitan preocupaciones de seguridad que están implicadas en los sistemas portadores de ADN y de virus/bacterias de animales vivos existentes.

La invención se describe adicionalmente bajo (A) el Desarrollo de Células TH1/TH2, (B) Respuestas y Patología de Tipo TH1 y Tipo TH2, (C) Virus de Plantas, (D) Moléculas de Interés, (E) Expresión de Polipéptidos Mediante Virus de Plantas, (F) Moléculas de Conjugación para Virus de Plantas, (G) Administración de Composiciones a Animales, (H) Aumento de una Respuesta Tipo TH1 , e (I) Reducción de una Respuesta Tipo TH2. A. Desarrollo de Células TH1/TH2 En ratones, se clasificaron las células CD4+T naturales en dos grupos, TH1 y TH2, que se caracterizaron por perfiles de secreción de citocina diferenciales y, por lo tanto, funciones efectoras distintas [para revisión ver Mosmann y colaboradores (1986) J. Immunol. 136:2248- 2357]. Aunque no es necesario un entendimiento del mecanismo para practicar la invención, y sin limitar la intención a ningún mecanismo particular, clonas de células T que demostraron las propiedades arquetípicas TH1 o TH2 pueden ser extremos de un continuo de células CD4+ diferenciadas y el perfil de citocina in vivo que se produce en una respuesta TH1 o TH2 "típica" se produce mediante un espectro de tipo de células. Sin embargo, por simplicidad, es más fácil referirse a los dos tipos de células como si fueran entidades separables. De este modo, el término "célula TH1 ", como se usa en la presente, se refiere a una célula ayudante T que produce una o más inmunoglobulinas asociadas con TH1 {por ejemplo, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón, lgG1 humana, e lgG3 humana) y/o una o más citocinas asociadas con TH1 {por ejemplo, IL-2, «. 43 - TNF-ß e IFN-?). En cambio, una "célula TH2", como se usa en la presente, se refiere a una célula ayudante T que produce una o más inmunoglobulinas asociadas con TH2 {por ejemplo, IGg1 de ratón, lgG3 de ratón, e lgG2 humana) y/o una o más citocinas asociadas con TH2 {por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13). Las células TH1 y TH2 se desarrollan de un cultivo común de células CD4+ naturales. Varios factores pueden influir en la diferenciación de células TH en la ruta TH1 o TH2 polarizada. El perfil de citocina de "inmunidad natural" evocada por diferentes agentes, la naturaleza del ligando de péptido, la identidad y el nivel de hormonas secretadas microambientalmente, los niveles de antígeno, y la presencia en células T de receptores de señalación co-estimulante y genotipo MHC pueden determinar el desarrollo de los subconjuntos, siendo las células TH2 más dependientes de altos niveles de antígeno y de la presencia de moléculas co-estimulantes. Por ejemplo, la técnica anterior ha observado que, en modelos de vacunación de ratón, influencian varios factores que los subconjuntos de células TH son iniciados, y la generación de isotipos de IgG de ratón específicos. Tales factores incluyen los antecedentes genéticos de la cepa de ratón usada, la ruta de administración de antígeno y el régimen de inmunización (incluyendo la cantidad y vida media del antígeno), y la naturaleza del antígeno. Los perfiles de citocina tipo TH2 frecuentemente aparecen después que las respuestas de TH1 in vivo. La citocina clave para la generación de TH1 se cree que es IL- 2, producida mediante macrófagos activados y células dendríticas. La citocina clave para la generación de TH2 se cree que es IL-4. IL-4 es producida en pequeñas cantidades durante la activación inicial de células T (un subconjunto particular de células CD4 llamada la célula NK1.1 ha sido sugerida como la fuente inicial de la producción de IL-4). El desarrollo de una respuesta TH2 se cree que es conducida por el desarrollo de concentraciones locales de IL-4, posiblemente como un resultado de estimulación de célula T persistente. Con respecto a la función de las células TH1 , estas células producen interleucina 2 (IL-2), interferón-? (IFN-?) y factor de necrosis de tumor ß (TNF-ß), los cuales median la activación de macrófago y célula T citotóxica (CTL), y son los efectores de principio de la inmunidad mediada por células contra microbios intracelulares y de DTH (reacción de hipersensiblidad de tipo retrasado) [Mosmann y colaboradores (1986), supra]. Las reacciones CTL se reconocen cada vez más como factores terapéuticos importantes en el tratamiento de, o respuesta a, tumores sólidos. IFN-?, producidas por linfocitos TH1 , también induce isotipo de célula B que cambia de clase a la subclase lgG2a, el cual es el isotipo efector principal de IgG de ratón. lgG2a (y a menor grado lgG2b) aumenta la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC; Huesser y colaboradores (1977) J. Exp. Med. 146: 1316), y enlaza fuertemente Clq de la ruta de complemento clásica que ozoniza las células o ramilletes de anticuerpos para la fagocitosis [Klaus y colaboradores (1979) Immunology 38:687]. En el hombre, lgG1 e lgG3 median estas funciones. Así como un resultado de estas funciones efectoras, lgG2a protege mejor a los ratones contra las infecciones de virus, tumores [Kaminski y colaboradores (1986) J. Immunol. 136: 1 123] y parásitos [Wechsler y colaboradores (1986) J. Immunol. 137:2968] y aumenta el paso libre bacteriano [Zigterman y colaboradores (1989) Infect. Immun. 57:2712]. En contraste con las células TH1 , las células TH2 producen interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-13 (IL-13), las cuales suprimen la inmunidad mediada por células [Mosmann y colaboradores (1986), supra]. IL-4 induce a las células B a producir IgGi , lo cual en los ratones fija pobremente el complemento y no media ADCC [Klaus y colaboradores (1979) Immunology 38:687]. También induce la producción de inmunoglobulina E (IgE), el cual se une a las células mástil y a los basófiios. En consecuencia, las células TH2 son principalmente responsables de la defensa del huésped independientes de fagocitos contra, por ejemplo, parásitos helmínticos [Sher y colaboradores (1992) Ann Rev Immunol. 10:385] y en el desarrollo de reacciones alérgicas [Erb y colaboradores (1996) Immunol. Cell Biol. 74:206], B. Respuestas y Patología Tipo TH1 y Tipo TH2 La técnica anterior reporta varios factores {por ejemplo, tipo de antígeno, antecedentes genéticos del animal huésped, ruta de administración, elección de adyuvante) para dictar la naturaleza y extensión de la respuesta inmune producida por la exposición de una molécula a un sistema inmune del animal. Por ejemplo, las respuestas del anticuerpo murino a proteínas solubles y a carbohidratos, generalmente se restringen a la subclases IgGi e lgG3, respectivamente. Esto sugiere que los isotipos IgG no se seleccionan aleatoriamente. Sin duda, los virus vivos (incluyendo un rango de virus de ARN y ADN) preferentemente inducen la producción de anticuerpos lgG2a específicos [Coutelier y colaboradores (1987) J. Exp. Med. 165-64]. Se argumenta que el proceso de infección generado por virus vivos puede ser crucial para la producción de IFN-? que preferentemente produce respuestas TH1 específicas de virus y la predominancia de lgG2a específico de virus [Nguyen y colaboradores (1994) J. Immunol. 152:478]. Esto también puede explicar porque las vacunas de ADN y bacterianas (vivas) de replicación generan respuestas desviadas a TH1 [Londono y colaboradores (1996) Vaccine 14:545; Pertmer y colaboradores (1996) J. Virol. 70:61 19]. Sin embargo, se sabe que algunos virus, tales como los virus de influenza [Balkovic y colaboradores (1987) Antiviral Res. 8: 15], virus de herpes simple tipo I [HSV-1 ; McKendall y colaboradores (1988) J. Gen Virol 69:847], virus de encefalomielitis murino de Theiler [Peterson y colaboradores (1992) Immunology 75:652] y el virus de enfermedad de pies y boca [Pérez-Filgueira y colaboradores (1995) Vaccine 13:953] producen isotipos predominantes distintos de lgG2a. Además de la naturaleza del antígeno, los antecedentes genéticos del animal huésped influencia la naturaleza y el grado de una respuesta inmune. De este modo, en el caso del virus de influenza, los ratones BALB/c producen predominantemente lgG2a> aunque C57Bal/6 producen predominantemente IgGi [Hocart y colaboradores (1989) J. Gen. Virol. 70:2439]. De este modo, la reacción inmune contra estos virus vivos es sensible a un elemento genético (factor inmunogenómico). La naturaleza del adyuvante también representa un papel para determinar la naturaleza de la respuesta inmune. Para el virus de enfermedad de pie y boca (FMDV), el lgG2b es el isotipo predominante producido tanto para virus vivo como inactivo entero, excepto cuando se usa adyuvante de agua en aceite con el virus inactivo. Con la última combinación de adyuvante, se tiene como resultado una predominancia de IgG.a (Pérez-Filgueira y colaboradores (1995) Vaccine 13:953). Por lo tanto, la elección de adyuvante claramente puede influenciar la rama de respuesta ayudante T. Además, algunos virus inactivados pueden producir predominantemente anticuerpos lgG2a. De modo que sobre todo, una variedad de estudios muestran que la capacidad para producir lgG2a específico de virus puede no deberse simplemente al proceso de infección, sino puede también depender de la naturaleza del mismo virus, el haplotipo H-2 del ratón, la ruta de inmunización y también de la elección del adyuvante. Los perfiles de citocina generados por la células T tipo TH1 y TH2 conducen a respuestas fisiológicas diferentes a patógenos que buscan reducir, mejorar o remover la carga de patógeno. Sin embargo, el daño al tejido también se puede presentar debido a la sobre-reacción persistente al patógeno. En particular, en el caso de TH1 , el recrudecimiento y la activación de los macrófagos puede conducir a inflamación granulomatosa indeseable, siendo el ejemplo pre-eminente la forma tuberculoide de la lepra. Si el microorganismo infectante es un organismo intracelular como los que causan las tuberculosis, brucelosis, o los organismos c_-_;j---?---c-._- -- c-j.--. -c.*._a?__c__fc_taijrifc»j?t_....--.-_. j». - , -j-jfjf , ||¡__f_ Pneumocystis carinni (protozoarios), un hongo como Candida albicans o Leishmania major (un protozoario de parásito intracelular), la respuesta TH1 conduce a una respuesta de hipersensibilidad tipo retrasada (DTH) que da como resultado la eliminación de las células que contienen estos organismos. La liberación de IFN-? en la vecindad de la infección activa los macrófagos. La liberación localizada de enzimas lisosomales del macrófago mata las células infectadas y las células que están cerca sanas, dando como resultado la destrucción del microorganismo invasor. Además, hay una liberación de la célula TH1 de una proteína llamada MIF (tactor de inhibición de macrófago). Esta proteína es un factor anti- quimiotáctico, el cual vuelve inmóvil cualquier macrófago en la vecindad de la célula TH1. De este modo, los macrófagos siguen en el sitio de la infección. El daño al pulmón visto debido a la tuberculosis y tal vez a Pneumocystis carinii es el resultado de daño celular indiscriminado causado por macrófagos activos y la liberación de enzima lisosomal en el tejido. Las respuestas dominadas por TH1 también pueden mezclarse en la patogénesis de los desórdenes autoinmunes específicos de órganos, el rechazo de aloinjerto agudo, abortos recurrentes sin explicación, dermatitis por contacto, y algunos desórdenes inflamatorios crónicos de etiología desconocida [resumidos por Romagnani (1996) Clin. Immunol. Immunopathol. 80:225]. Las respuestas TH2 inadecuadas también pueden dar como resultado, resultados indeseables que incluyen el recrudecimiento de basófilos y eosinófilos que pueden tener consecuencias adversas en el desarrollo de alergias y asma. La respuesta a una forma temprana de la vacuná RSM (virus sincitial respiratorio) (que contiene vacuna de virus muerto conjugado con alum) es un ejemplo de una respuesta TH2 inadecuada que conduce a casos de eosinofilia y broncoespasmo. Las reacciones similares pueden conducir a síntomas asmáticos. Las respuestas tipo TH2 también pueden ser responsables del síndrome de Omenn, la protección reducida contra algunos patógenos intracelulares, tolerancia al trasplante, GVHD (injerto contra enfermedad del huésped), desórdenes atópicos, y algunas enfermedades autoinmunes sistémicas. Se ha notado que alterando la secuencia (y por lo tanto la afinidad) de péptidos dentro del complejo MHC clase II puede afectar la naturaleza de la respuesta de células CD4+T [Murray (1998) Immunol. Today 19: 157]. De este modo, los epítopes de péptido derivados de proteínas de agentes infecciosos se pueden modificar a través de la evolución para causar la redirección de la respuesta del huésped al patógeno, por ejemplo, entre las respuestas TH1 y TH2. La evolución paralela del huésped y el patógeno puede dar como resultado el desarrollo de epítopes T sobre patógenos que se enlazan con afinidades particulares con subconjuntos MHC. La respuesta del huésped debe balancearse para satisfacer los requisitos de detectar múltiples patógenos y formas de patógenos. Por lo tanto, cierto grado de variación de secuencia en determinantes inmunogénicos de un patógeno se podría esperar que se presentaran. Hasta algún grado, esto representa un medio mediante el cual la inmunomodulación de una reacción a un inmunógeno particular podría contemplarse es decir la mutación de aminoácidos dentro de un péptido para lograr un tipo distinto de reacción inmune sobre la surgida i. - 50 contra el péptido de tipo natural. C. Virus de Planta La invención proporciona partículas de virus de planta modificados no replicantes que son capaces de presentar a las células de las moléculas del sistema inmune que son efectivas, ya sea como inmunógenos o antígenos para generar anticuerpos y/o citocinas, estimular una respuesta tipo TH1 , preferentemente una respuesta tipo TH1 predominante, reducir una desviación indeseable hacia una respuesta TH2 existente, o una inesperada que es inherente en ciertas moléculas. La invención contempla el uso de cualquier virus en el cual el ácido nucleico codifica el cápsido, es una sección separada, a partir de la cual codifica otras moléculas funcionales, y cuyas proteínas de recubrimiento tienen una estructura de barrera ß. Una ventaja del uso de virus que tienen esta estructura es que los ciclos de entre las cepas individuales de hoja ß proporcionan sitios convenientes para la inserción de péptidos extraños. La modificación de uno o más ciclos es una estrategia preferida para la expresión de péptidos extraños de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, la invención contempla el uso de comovirus [tal como el virus de mosaico de alverjón y el virus de vaina de frijol moteada], nepovirus [tales como virus de mancha en anillos de tomate y virus de mancha en anillo latente de fresa], tombusvirus [tal como el virus de mancha del arbusto de tomate (TBSV)], y sobemovirus [tal como el virus de mosaico de frijol del sur (SBMV)]. En particular, los tombusvirus y los sobemovirus tienen estructuras tridimensionales similares a las de los comovirus y nepovirus, pero tienen un solo tipo de barrera ß. -áfe-J-a--, .i. ¿ri-fc-fc-. i En una modalidad más preferida, el virus es un comovirus.

Una ventaja del comovirus es que su cápsido contiene sesenta copias, cada una de 3 diferentes barreras ß que pueden ser manipuladas individualmente, de este modo permitiendo la expresión de 60-180 copias de un péptido mediante una sola partícula de virus. Los comovirus son un grupo de al menos catorce virus de plantas que predominantemente infectan legumbres. Sus genomas consisten en dos moléculas de ARN de cadena simple, de sentido positivo, de diferentes tamaños que se encapsidan separadamente en partículas isométricas de aproximadamente 28 nm de diámetro. Los dos tipos de partículas de nucleoproteína son llamadas componente medio (M) y componente inferior (B) como una consecuencia de su comportamiento en los gradientes de densidad del cloruro de caesio, los ARNs dentro de las partículas son conocidas como ARN M y B, respectivamente. Ambos tipos de partículas tienen una composición de proteína idéntica, que consiste en 60 copias cada una de una proteína de recubrimiento grande (VP37) y una pequeña (VP23). Además de las partículas de nucleoproteína, las preparaciones de comovirus contienen una cantidad variable de cápsidos vacíos (sólo de proteína) que se conocen como componente superior (T). En una modalidad preferida, el comovirus es un virus de mosaico de alverjón (CPMV). En el caso del miembro ejemplar del grupo de comovirus, el virus de mosaico de alverjón (CPMV), se sabe que tanto el ARN M como B son poliadenilados y tienen una pequeña proteína (VPg) covalentemente enlazada a su término 5'. Estudios más limitados sobre otros comovirus .-te-fe i. t sugieren que estas características son compartidas por los ARNs de todos los miembros del grupo. Ambos ARNs del CPMV han sido secuenciados y mostraron consistir en 3481 (M) y 5889 (B) nucleótidos, excluyendo las colas poli(A). Ambos ARNs contienen un cuadro de lectura abierto único, largo, expresión de los productos del gen viral que se presentan a través de la síntesis y de la disociación posterior de polipéptidos precursores grandes. Aunque ambos ARNs se requieren para la infección de las plantas enteras, el ARN B más grande es capaz de la réplica independiente en protoplastos, aunque no se producen partículas de virus en este caso. Esta observación, acoplada con estudios genéticos anteriores, estableció que las proteínas de recubrimiento son codificadas por el ARN M. Un mapa de densidad de electrones de 3.5 A de CPMV muestra que hay una relación clara entre el CPMV y los virus de plantas T-3, tales como los tombusvirus, en particular la mancha del arbusto de tomate (TBSV) y los sobemovirus, en particular el mosaico de frijol del sur (SBMV). Los cápsidos de estos últimos virus están compuestos de 180 subunidades de proteínas de recubrimiento idénticas, consistiendo cada una de un solo dominio de barrera ß. Estos pueden ocupar tres posiciones diferentes, A, B y C, dentro de los viriones. Las dos proteínas de recubrimiento del CPMV mostraron consistir en tres dominios de barrera ß distintas, estando dos derivadas de VP37 y una de VP23. De este modo, en común con los virus T-3, cada partícula CPMV está hecha de 180 estructuras de barril ß. El dominio simple de VP23 ocupa una posición análoga a la de las subunidades tipo A del TBSV y SBMV, mientras que ..---... ^ -»!*** __»__hr^--t-c-»--^^ los dominios terminales N y C del VP37 ocupan las posiciones de las subunidades tipo C y B, respectivamente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,874,087; incorporada en su totalidad para referencia). El análisis de difracción por rayos X de cristales de CPMV y otro miembro del grupo, el virus de vaina de frijol moteada (BPMV) muestra que las estructuras en tercera dimensión de BPMV y CPMV son muy similares y son típicas del grupo de comovirus en general. En las estructuras de CPMV y BPMV, cada barrera ß consiste principalmente en 8 cadenas de hojas ß antiparalelas conectadas por ciclos de longitud variable. Las hojas ß planas se nombran B, C, D, E, F, G, H e I, y los ciclos de conexión se conocen como los ciclos ßB-ßC, ßD-ßE, ßF-ßG y ßH-ßl. Los comovirus también se relacionan estructuralmente con los picornavirus animales. Los cápsidos de los picornavirus consisten en 60 copias de cada una de tres proteínas de recubrimiento diferentes, VP1 , VP2 y VP3, consistiendo cada una de un solo dominio de barrera ß. Como en el caso de los comovirus, estas proteínas de recubrimiento son liberadas por disociación de una poliproteína precursora y se sintetizan en el orden VP2-VP3-VP1. La comparación de la estructura tridimensional de CPMV con la de los picomavirus ha mostrado que los dominios terminales N y C del VP37 son equivalentes a VP2 y VP3, respectivamente, y que VP23 es equivalente a VP1. La equivalencia entre la posición estructural y el orden del gen sugiere que VP37 corresponde a una forma no disociada de las dos proteínas de cápsidos de picornavirus, VP2 y VP3. ____________t________ttfh^ gg^^^^^^y¡ _M_________§j_j_^£ - - 54 - Una de las diferencias principales de entre los comovirus y los picornavirus es que las subunidades de proteína de los comovirus carecen de inserciones grandes entre las cadenas de los barreras ß encontradas en los picornavirus, aunque la arquitectura fundamental de las partículas es muy similar. Los cuatro ciclos (BB-ßC, ßD-ßE, ßF-BG y ßH) entre las hojas ß no son críticas para mantener la integridad estructural de los viriones, sino, de acuerdo con esta invención, se usan como sitios de expresión de las secuencias de péptidos heterólogas, tales como los sitios antigénicos ejemplares que se derivan de un amplio rango de fuentes, incluyendo una bacteria, un virus, una inmunoglobulina, una hormona, y una proteína de superficie de célula asociada con cáncer. D. Moléculas de Interés Las partículas de virus de planta modificados de la invención son capaces de presentar a las células de sistema inmune cualquier molécula para el propósito de, por ejemplo, generar anticuerpos y/o citocinas, aumentar un respuesta tipo TH1 , y/o reducir una respuesta tipo TH2 a la molécula. Los anticuerpos que se generan como respuesta a las partículas de virus de planta modificados de la invención se pueden usar para aislar y purificar la molécula. Alternativamente, estos anticuerpos se pueden usar para evitar, diagnosticar, o tratar enfermedades que están asociados con la exposición de un animal a la molécula. Las moléculas que son convenientes para la aplicación en la presente invención incluyen cualquier molécula que sea capaz de ser presentada como una porción expuesta de la proteína de recubrimiento de los virus de la invención. Las moléculas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquéllas que contienen una secuencia de péptido, secuencia de ácido nucleico, polisacárido, y/o lípido, tal como glicopéptido, lipopéptido, glicolípido, etc. Las moléculas que se pueden usar para ventaja en la presente invención incluyen aquéllas que están purificadas, pero cuya estructura es desconocida, así como moléculas purificadas de estructura conocida {por ejemplo, péptidos con secuencias de aminoácidos conocidas, secuencias de ácidos nucleicos con secuencias de ácidos nucleicos conocidas, polisacáridos de composición y estructura conocidos, etc.). En una modajidad preferida, las moléculas son purificadas y de estructura conocida. Cuando la molécula es un péptido, se puede presentar mediante los virus modificados de la invención usando técnicas biológicas moleculares para insertar una secuencia de ácido nucleico que codifique el péptido en el genoma del virus, de manera que el péptido se expresa como una porción expuesta de la proteína de recubrimiento de los virus de la invención (descritos adicionalmente más adelante). Alternativamente, cuando la molécula es, o contiene, una secuencia de péptido, una secuencia de ácidos nucleicos, un polisacárido, y/o lípido, tal como una molécula puede estar químicamente conjugada a un péptido reactivo expresado por un virus de planta de la invención, como se describe más adelante. La invención contempla moléculas de polipéptidos que se derivan de cualquier fuente. Sin intentar limitar el alcance de la misma, la invención contempla polipéptidos que se derivan de células de cáncer y ? . i?fmlf*tn»<<- »"'*^->> -- .« '__-_a____^„^.^.__^___^._fcM._-<L3 ... -.. -^_t^_^____,-__^.-t a.a .. . ! . parásitos patógenos {por ejemplo, bacterias, virus, protozoarios, nemátodos, hongos, ere.), y en particular péptidos antigénicos e inmunogénicos derivados de esos parásitos patógenos. También se incluyen dentro del alcance de la invención los polipéptidos que se asocian con el desarrollo de enfermedad, polipéptidos que codifican citocinas, alérgenos polipéptidos, hormonas, enzimas, factores de crecimiento, anticuerpos anti-idiotípicos, receptores, moléculas de adhesión, y partes de cualquiera de los péptidos anteriores o los precursores de los mismos. Los polipéptidos que se derivan de células de cáncer que se contemplan que están dentro del alcance de la invención se ejemplifican por, pero no se limitan a, el antígeno asociado con el cáncer del esófago (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,069,233), la proteína específica mamaria (mamaglobina), que se asocia con el cáncer de la mama (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,922,836), el antígeno de mucina de la próstata, que se asocia con los adenocarcinomas de la próstata (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,314,996), antígeno específico de próstata humana (PSA) (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6, 100,444; 5,902,725), el antígeno SF-25 de adenocarcinoma de colon (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,212,085), antígenos asociados con el tumor urinario (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,993,828), antígeno melanogénico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,087, 1 10), el antígeno de melanoma MART-1 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,994,523), antígeno asociado con tumor humano (PRAT) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,020,478), antígeno de tumor de proteína TRP-2 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,083,703), el antígeno asociado con tumor humano (TUAN) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,922,566), y antígeno T específico de tumor, el cual se asocia con tumores inducidos viralmente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,007,806). Cada una de las patentes de los Estados Unidos en la presente se incorpora por entero mediante referencia. Los polipéptidos ejemplares que se derivan de bacterias patógenas incluyen antígenos de Bordetella pertussis (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,029,766; 5,897,867; 5,895,655), antígenos de Mycobacterium tuberculosis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 1 10,469), antígenos porinos a partir de Bacterioides, el cual se asocia con colitis ulcerativa y enfermedad del intestino inflamatorio (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,033,864), antígenos de Helicobacter pylori (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,025, 164), antígenos de Streptococcus asociado con caries dental (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,024,958), antígenos derivados de Campylobacter jejuni, el cual se asocia con enfermedad de diarrea (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,874,300), el antígeno de superficie celular de P-glicoproteína, el cual se correlaciona con resistencia a fármacos múltiples en las especies mamíferos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,837,306), un antígeno pilus presente en bacterias que forman adhesión (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,795,803), y antígenos de vesícula de membrana externa Moraxella catarrhalis asociados con enfermedad pulmonar (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,993,826). Cada una de las patentes de los Estados Unidos en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. Los polipéptidos que se derivan de virus patógenos se ilustran, pero no se limitan a, polipéptidos que han sido aislados y purificados a partir de virus como se ejemplifica el antígeno de rotavirus (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 110,724), Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo II (VIH-II), y los antígenos del Virus de Inmunodeficiencia de simio (SIV) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,268,265), antígeno de virus de hepatitis no A, no B (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,702,909; 6,103,485), antígeno delta de virus de hepatitis D (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,619,896), antígenos de virus de influenza (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,048,537). También se incluyen polipéptidos virales, cuyas secuencias se conocen, incluyendo, pero sin limitarse a, las derivadas de picornavirus, tales como virus de enfermedad de pie y boca (FMDV), poliovirus, rinovirus humano (HRV), y papilomavirus humano (HPV) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,874,087), antígeno de virus de hepatitis C (HCV) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,712,087), antígeno de núcleo de hepatitis B (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,839,277), antígenos relacionados con virus Epstein Barr (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,679,774), antígeno de virus de hepatitis V C33 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,985,541 ), antígenos de citomegalovirus (CMV) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,074,817), antígeno de virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (VIH-2) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,037, 165), antígenos de virus de herpes simple (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,013,433), y antígenos HTLV-I y HTLV-II (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,928,861 ). Cada una de las patentes de los Estados Unidos en la presente se incorporan en su totalidad para referencia. Los polipéptidos dentro del alcance de la invención, que se derivan de los protozoarios y nemátodos patógenos incluyen, por ejemplo, los antígenos de péptido derivados de Plasmodium vivax, que causa malaria (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,874,527), antígenos de Leishmania que se asocian con Leishamniasis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,834,592), los antígenos del parásito nemátodo Dirofilaria immitis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,839,275), y antígenos de Anaplasma margínale, que causa anaplasmosis bovina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,956,278). Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorporan en su totalidad para referencia. Otros polipéptidos que se asocian con el desarrollo de enfermedad también se incluyen dentro del alcance de la invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, el precursor del antígeno de rechazo de tumor GAGE ejemplar, el cual se asocia con el desarrollo del cáncer (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,013,481 ), los antígenos extraídos de epitelios de malfigio de cáncer (por ejemplo, esófago y epidermis), y asociados con artritis reumatoide (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,888,833), los antígenos del grupo de sangre Rh (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,840,585), los antígenos indicadores de la presencia y progresión de la placa aterosclerótica (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,025,477), el antígeno de proteína de enlace Fe IgG asociado con enfermades autoinmunes, tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, y lupus sistémico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,004,760), el antígeno Sm-D asociado con el lupus eritematoso sistémico (SLE) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,945, 105), antígenos de monocito (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 124,436), el antígeno asociado con enfermedad de Meniere autoinume interna (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,885,783), el antígeno asociado con la diferenciación de mesotelina, el cual está implicado en mesoteliomas y cánceres de ovario (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,083,502), el antígeno osteogénico y fibroblástico (OFA) asociado con las enfermedades relacionadas con los huesos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,074,833), y el antígeno asociado con la función de las células mástil (MAFA), el cual se asocia con reacciones inflamatorias y alérgicas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,034,227). Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en ia presente se incorpora en su totalidad para referencia. También incluidos dentro del alcance de la invención están los polipéptidos que codifican citocinas, tales como la interleucina-1 a ejemplar, interleucina-1 ß (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,965,379; 5,955,476; 5,096,906), interleucina-2, interferón-a, interferón-?, y factor de necrosis de tumor (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,965,379), interleucina-6 (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,965,379; 5,955,476; 5,942,220; 5,460,810), la superfamilia TGF-ß que incluye la familia TGF-ß [es decir, incluyendo TGFßl , TGFß2, TGFB3, TGFB4, TGFßd y TGFßl .2], la familia inhibina [es decir, incluyendo activinas e inhibinas], la familia DPP/VG1 [es decir, incluyendo las proteínas morfogenéticas de la médula ósea (BMPs), DPP y Vg1], y la Familia de sustancia Inhibidora Mulleriana [es decir, incluyendo la sustancia inhibidora Mulleriana (MIS) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,830,671), interleucina-1 1 , factor inhibidor de leucemia, oncostatina M, y factor neurotrófico ciliar (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,460,810), e interleucina-12 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,955,476). Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. La invención también contempla alérgenos de polipéptidos tales como, pero sin limitación a, el antígeno véspido 5, el cual se usa para tratar pacientes con alergia al veneno de véspido (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 106,844), las alergias de polen mayores CRX lll Cryptomeria japónica (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,090,386), alergias de polen de heno Lol p Ib.1 y Lol p Ib.2 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,965,455), alérgenos de polen de alifo, polen de avellano y polen de abedul (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,693,495), el moho de polvo doméstico Dermatophagoides farinae Derf I y Derf II, y alérgenos D. pteronssinus Der p I y Der p Vil (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,9958,415; 6,086,897; 6,077,518; 6,077,517), alérgeno de gato (Fel d I) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,547,669), alérgenos de cucaracha (CR) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,869,288), y alérgeno de cacahuate (Ara h II) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,973, 121 ). Cada una de las patentes de los Estados Unidos en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. También incluidas dentro del alcance de la invención están las hormonas de polipéptidos que incluyen, por ejemplo, hormona de paratiroide (PTH), hormona de paratiroide relacionada con péptido (PTHrp), y sus análogos sintéticos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,693,616; 6, 1 10,892), presentados naturalmente en hormona de crecimiento y sus variantes (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,424, 199; 5,962,411 ), hormona de crecimiento de aves (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,151 ,51 1 ), hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) y sus análogos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,897,863), proteína receptora de hormona nuclear (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,866,686), hormona disparadora de ecdisis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,763,400), hormona liberadora de gonadotropina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,688,506), y hormonas concentradoras de melanina (MCH) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,049,655). Cada una de las patentes de los Estados Unidos en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. Moléculas de ácidos nucleicos dentro del alcance de esta invención incluyen aquellas que codifiquen cada una de las moléculas de polipéptido descritas anteriormente. Las moléculas que contienen un polisacárido y las cuales están dentro del alcance de esta invención se ejemplifican mediante antígenos de polisacárido y licoproteína derivados de parásitos patógenos (en particular de bacterias), así como hormonas de glicoproteínas, tales como la hormona estimulante de folículo (FSH), la hormona luteinizante (LH), y la hormona estimulante de tiroides (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6, 103,501 ; 5,856, 137; 5,767,067; 5,639,640; 5,444, 167; cada una incorporada en su totalidad para referencia). Las moléculas que contienen lípidos que encuentran uso en esta invención incluyen, sin limitación, aquéllas que se derivan de -J-- a^? **^^ -***»*-*' **! *-* - > ---*• parásitos patógenos {por ejemplo, lipoproteínas, liposacáridos, etc.). En una modalidad particularmente preferida, la molécula es un péptido. En una modalidad más preferida, el péptido se deriva de una bacteria {por ejemplo, la OM proteína F de Pseudomonas aeruginosa, y la proteína de enlace de fibronectina (FnBP) del Staphylococcus aureus), un virus {por ejemplo, parvovirus canino), una inmunoglobulina {por ejemplo, mlgE humana), una hormona {por ejemplo, gonadotropina coriónica humana), y proteína de superficie celular asociada con cáncer {por ejemplo, receptor de factor de crecimiento epitelial). E. Expresión de Polipéptidos Mediante Virus de Plantas Los virus de plantas de la invención se pueden diseñar técnicamente de acuerdo con las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,874,087; 5,958,422 (cada una incorporada en su totalidad para referencia) para expresar péptidos de interés que se derivan de cualquier fuente como se describe anteriormente. Por ejemplo, los comovirus ejemplares {por ejemplo, CPMV) son capaces de expresar externamente desde un solo virus de 60 a 180 copias de un péptido [1 copia de péptido sobre cada una de las 60 copias de la proteína de recubrimiento pequeña (S) y de las 60 copias de la proteína de recubrimiento grande (L)]. Los péptidos que se pueden incorporar en los virus de planta modificados de la invención preferentemente contienen al menos cuatro (4) aminoácidos, y se someten solamente a la limitación de la naturaleza y el tamaño del péptido y el sitio en el cual se coloca o en la partícula del virus no interfieren con la capacidad del virus modificado para É-i..... ------ -._,_A.-...«>d_<_u_?_aa^Jc^^ -^ | ¡j . »_.t-_<__wt__. j ensamblarse cuando se cultivan in vitro o in vivo. Aunque no se pretende limitar la invención a ningún tipo de fuente de péptido, en una modalidad, el péptido es uno cuya función requiere una conformación particular para su actividad. La actividad biológica del péptido se puede mantener mediante la asociación del péptido con una molécula mayor {por ejemplo, para mejorar su estabilidad o modo de presentación en un sistema biológico particular) como se describió previamente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,958,422; incorpora en su totalidad para referencia). El ácido nucleico viral de planta se modifica introduciendo una secuencia de nucleótidos que codifique el péptido de interés, ya sea como una adición a (es decir, inserción en) el genoma viral existente, o una sustitución para parte del genoma viral. La elección del método para introducción se determina en gran medida por la estructura de la proteína del cápsido y la facilidad con la cual las adiciones o reemplazos se pueden hacer sin interferencia con la capacidad del virus modificado para ensamblar en plantas. En una modalidad, la secuencia de nucleótido que codifica el péptido de interés se inserta en el genoma viral. En una primera modalidad, el sitio de inserción de, o sustitución con, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés se selecciona de manera que están ausentes las repeticiones de secuencias directas que flanquean el sitio. En el contexto de la presente invención, el término "repetición de secuencia directa" cuando se hace en referencia a una construcción que contiene una secuencia de nucleótidos de interés, significa que una l-j-*_-. .-- -.-.c.-A--»-. --«-i^.-^..iJ.-^ secuencia de oligonucleótidos idéntica está presente en ambos lados de la secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones que contienen repeticiones de secuencias directas flanqueando una secuencia de nucleótidos de interés son indeseables, debido a que son genéticamente inestables como un resultado de la recombinación entre las repeticiones de secuencias de flanqueo que conducen a la pérdida de la secuencia de nucleótidos flanqueada, y la reversión a la secuencia del tipo natural. En una modalidad alternativa, en donde la secuencia de oligonucleótido extraña se introduce en el genoma del virus de planta como una sustitución para parte de la secuencia existente, se prefiere que la secuencia del genoma del virus sustituido no codifique una secuencia de aminoácidos en la proteína de recubrimiento viral, lo cual es importante para la réplica del virus, la encapsidación, y/o la propagación en una planta huésped. Este defecto se puede determinar fácilmente y evitarse usando métodos conocidos en la técnica en combinación con las enseñanzas en la presente. La secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés se puede introducir en el virus de planta identificando la parte del genoma del virus que codifica una porción expuesta de una proteína de recubrimiento. El término "porción expuesta de una proteína de recubrimiento" como se usa en la presente en referencia a un virus es esa parte de la proteína del recubrimiento de virus que está dispuesta en la superficie externa de la proteína de recubrimiento. La ubicación de porciones de la proteína de recubrimiento que están expuestas, y las cuales por lo tanto son sitios potencialmente óptimos para la introducción r?-M.it? M?¡m?«^ ???^?^?k -* f ifi ff A f |- | del polipéptido de interés, pueden fácilmente identificarse mediante el examen de la estructura tridimensional del virus de planta. En una modalidad adicional, la secuencia de aminoácidos de las porciones expuestas de una proteína de recubrimiento se examinan para aminoácidos que rompen las estructuras helicoidales a, debido a que son sitios potencialmente óptimos para la inserción. Ejemplos de los aminoácidos adecuados son prolina e hidroxiprolina, ambas de las cuales cuando se presentan en una cadena de polipéptido interrumpen la hélice y crean un doblado rígido o flexión en la estructura. Una vez que se selecciona un sitio adecuado en la proteína de recubrimiento del virus de acuerdo con las enseñanzas anteriores y las de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,958,422 y 5,874,087 (cada una se incorpora en su totalidad para referencia), la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés se puede introducir en el genoma viral en el sitio que codifica el sitio deseado. Tal introducción se puede lograr, ya sea mediante la inserción en, o sustitución por, una secuencia viral. Cuando se desea la inserción, esto se puede lograr seleccionando dos diferentes sitios de enzima de restricción y disociando el ácido nucleico usando las enzimas de restricción seleccionadas. Una secuencia de nucleótidos de cadena doble que codifica el péptido de interés se sintetiza usando métodos conocidos en la técnica {por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa, PCR), de manera que los oligonucleótidos terminan en extremos que son compatibles con los sitios de la enzima de restricción seleccionada, permitiendo de este modo la ____j_fj jíl_________iÍ__ i .-_-fa._. *-.-,,.- inserción en el ácido nucleico del virus disociado. Este procedimiento da como resultado la introducción de una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés, al mismo tiempo que evita la presencia de repeticiones de secuencia directa que flanquean la inserción. Preferentemente, aunque no necesariamente, oligonucleótidos complementarios se sintetizan, en los cuales la secuencia que codifica al péptido de interés está flanqueada por secuencias de virus de plantas, de manera que la secuencia de nucleótidos de interés se introduce como una visión al ácido nucleico existente. En una modalidad preferida, el virus de planta es CPMV, y el péptido de interés se inserta en el ciclo ßB-BC en la proteína de recubrimiento pequeña (VP23). Este ciclo se expone claramente en la superficie de la partícula viral y la modelación por computadora ha mostrado que aún ciclos grandes insertados en este sitio es poco probable que interfieran con la interacción entre subunidades adyacentes responsables de la estructura y estabilidad del cápsido. Este ciclo tiene un sitio Nhel único en la posición 2708 de la secuencia específica de ARN M, en donde se pueden insertar las secuencias extrañas. De manera alternativa, cuando se desea la sustitución de una secuencia de genoma viral, la secuencia viral que se selecciona para la sustitución se disocia usando enzimas de restricción adecuadas {por ejemplo, la secuencia entre los sitios de restricción Nhel y Aatll del CPMV ejemplar), y una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de interés se sustituye por la misma, como se describió previamente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,958,422; incorporada en *?J*i?U**ll¡L~. ^? t?^?..^ su totalidad para referencia). Habiendo determinado el sitio y el modo de introducción del péptido de interés en el virus de planta, la manipulación del virus de la planta puede proseguir usando los métodos previamente descritos (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,958,422 y 5,874,087; cada una se incorpora en su totalidad para referencia). Por ejemplo, cuando el virus de planta es un virus de ARN {por ejemplo, CPMV), es necesario expresar el péptido de interés usando clonas de ADNc del ARN. Las clonas de ADNc de los ARNs M y B del CPMV han sido construidas, en las cuales la clona de ADNc del ARN M contiene una secuencia de oligonucleótidos insertada que codifica un péptido heterólogo, que hace uso del virus de mosaico de coliflor (CaMV), secuencia promotora 35S enlazada a los extremos 5' de los ADNc virales para generar transcripciones infecciosas en la planta. Esta técnica supera algunos de los problemas encontrados con el uso de transcripciones generadas in vitro, y es aplicable a todos los virus de ARN de plantas. Haciendo referencia específicamente a la manipulación del genoma del CPMV ejemplar, una clona de ADNc de longitud completa de ARN M del CPMV en el vector de transcripción pPM1 está disponible (pPMM2902), es una clona de ADNc de longitud completa del ARN B del CPMV (pBT7-123). Una mezcla de las transcripciones de pPMM2902 y pBT7-123 da lugar a una infección de virus completa cuando se incorpora eléctricamente en protoplastos de alverjón. Con el fin de evitar la creación de una secuencia de repetición directa que flanquea la inserción, un segundo sitio de recorte de enzima » -M-fc.. -k- de restricción se puede crear en la secuencia de nucleótidos de la región del genoma del CPMV que codifica VP23. Por ejemplo, un cambio de base silencioso único (U a C) en la posición 2740 del ARN M crea un sitio Aatll en el aminoácido valina 27 (posición 2735 de la secuencia de nucleótido). Esto se puede lograr mediante la mutagénesis dirigida al sitio de M13-JR-1 usando métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,874,087 (incorporada en su totalidad para referencia). La creación del sitio Aatll permite a la secuencia de nucleótidos que codifica los seis aminoácidos del ciclo ßB-ßC natural en el CPMV que se ha removido mediante la digestión con Nhel y Aatll. La secuencia se puede reemplazar entonces mediante cualquier secuencia con extremos compatibles con Nhel y Aatll. Sin pretender limitar la invención a ningún tipo de virus de planta, cualquier modo de introducción del péptido de interés en el virus, y/o cualquier sitio de inserción en el virus, en una modalidad preferida, el virus de planta es el virus de mosaico de alverjón (CPMV), y el péptido de interés se inserta entre la alanina 22 (Ala22) y prolina 23 (Pro23) en el ciclo ßB-ßC de la proteína de cápsido pequeña (VP23) como se describió anteriormente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,958,422; incorporada en su totalidad para referencia). F. Conjugación de Moléculas con Virus de Planta Los virus de plantas de la invención se pueden modificar para presentar cualquier molécula de interés a los componentes humorales y/o celulares del sistema inmune al conjugar químicamente la molécula de interés al virus de planta como se describe más adelante. . __? -j-i-ti-U-. »-_c-J-h_--Í-__-l.-_d-a__._ .

El término "conjugación" que se hace en referencia a una molécula de interés y a un virus como se usa en la presente, significa enlazar covalentemente la molécula de interés con el virus sujeto a la única limitación de que la naturaleza y el tamaño de la molécula de interés y el sitio en ei cual se enlaza covalentemente a la partícula del virus no interfiera con la capacidad del virus modificado de ensamblarse cuando se cultiva in vitro o in vivo. 1. Péptido Reactivo En una modalidad, la invención contempla conjugar moléculas de interés con el virus en una porción expuesta de la proteína de recubrimiento de virus. Eso se puede lograr al conjugar la molécula de interés con un péptido reactivo de tipo natural del virus de planta, o alternativamente con un péptido reactivo heterólogo que se expresa sobre la superficie de la proteína de recubrimiento de virus. En una modalidad preferida, la molécula de interés se conjuga con un péptido reactivo heterólogo que se expresa sobre una superficie expuesta de la proteína de recubrimiento de planta. El término "péptido reactivo" se refiere a un péptido (ya sea del tipo natural o heterólogo) que es capaz de enlazarse covalentemente a la molécula de interés. El término "capaz de enlazarse covalentemente", cuando se hace en referencia a la interacción entre un péptido y una molécula de interés significa que el péptido covalentemente se enlaza a la molécula en presencia de condiciones convenientes, tales como concentración de sales convenientes, reactivos químicos, temperatura, pH, etc. __ü_i_j_6_i?____ ... __... -., ~^_t__h_t_-i_, ^A¡i ,m Los péptidos reactivos de interés pueden variar de tamaño de 1 a 100, más preferentemente de 1 a 50, todavía más preferentemente de 1 a 20 aminoácidos. De manera notable, se ha establecido que al menos 38 residuos de aminoácidos se pueden presentar en la superficie de un CPMV ejemplar (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,958,422 y 5,874,087; cada una se incorpora en su totalidad para referencia). Aunque no se pretende limitar los aminoácidos en el péptido reactivo a ningún tipo particular de residuo de aminoácido, en una modalidad preferida, el péptido reactivo contiene uno o más "aminoácidos reactivos", es decir, aminoácidos que son capaces de formar un enlace covalente con una molécula de interés, ya sea directamente o indirectamente, por ejemplo, vía una molécula bifuncional que sea capaz de enlace covalente, tanto con el aminoácido reactivo como con la molécula de interés. En una modalidad preferida, el aminoácido reactivo es un aminoácido cargado. Un "aminoácido cargado" es un aminoácido que contiene una carga positiva neta, o una carga negativa neta. "Aminoácidos cargados positivamente", que también se conocen como "aminoácidos básicos", incluyen lisina, arginina e histidina. "Aminoácidos cargados negativamente", los cuales se conocen también como "aminoácidos ácidos", incluyen el ácido aspártico, ácido glutámico y cisteína. Dada la sensibilidad de los virus de plantas de la invención a la presencia de residuos cargados desestabilizantes en la superficie del cápsido, se prefiere, aunque no se requiere, que el nivel de carga sobre el péptido M ..------.Jj . .... .. ..... _-c--«. *. ^.» A*[IJ?**?J^,t. ...,.. ?.M?.^ reactívo se minimice. Esto se puede lograr al incluir tanto aminoácidos cargados negativamente como cargados positivamente en el péptido reactivo, de manera que la carga negativa sobre los aminoácidos cargados negativamente sea al menos contrarrestada parcialmente (es decir, neutralizada) mediante la carga positiva sobre los aminoácidos cargados positivamente, de manera que el péptido reactivo tiene una carga positiva neta o negativa. En una modalidad más preferida, la carga negativa sobre los aminoácidos cargados negativamente se contrarrestan completamente mediante la carga positiva sobre los aminoácidos cargados positivamente, de manera que el polipéptido reactivo posee una carga neta de cero. Los aminoácidos cargados del péptido reactivo pueden ser contiguos (es decir, dos o más aminoácidos cargados acomodados en ausencia de residuos de aminoácidos no cargados de intervención o análogos de aminoácidos no cargados), o no contiguos (es decir, dos o más aminoácidos cargados acomodados con al menos un residuo de aminoácido no cargado de intervención o un análogo de aminoácidos). Los aminoácidos cargados contiguos se pueden componer de uno [por ejemplo, Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO: 1 ); Arg-Arg-Arg; Lys-Lys-Lys-Lys- Lys (SEQ ID NO:2); o His-His], o más {por ejemplo, Asp-Glu; Asp-Arg-Glu- Lys; Cys-His-Lys; Lys-Arg-Arg, o Lys-Arg-His, o Lys-His-His) residuos de aminoácidos. Cuando los aminoácidos cargados son contiguos, se pueden acomodar de manera que los aminoácidos cargados negativamente sean contiguos con respecto uno con respecto al otro, y los aminoácidos cargados positivamente sean contiguos uno con respecto al otro. Tal secuencia se ejemplifica por, pero no se limita a, las secuencia cargadas positivamente Lys-Lys-Arg-His-Lys (SEQ ID NO:3) y Arg-Arg-His-Lys (SEQ ID NO:4); y las secuencias cargadas negativamente Asp-Cys-Glu-Asp (SEQ ID NO:5) y Asp-Asp-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO:6). De manera alternativa, cuando los aminoácidos cargados son contiguos, pueden estar acomodados de manera que los aminoácidos cargados negativamente sean no contiguos uno con respecto al otro, y/o los aminoácidos cargados positivamente sean no contiguos uno con respecto al otro. Una secuencia de aminoácidos cargados negativamente contiguos pueden ser contigua a una secuencia o aminoácido cargado positivamente contiguo, como se describe por la fórmula XnYn, en donde X es una secuencia de aminoácidos cargados positivamente contiguos, Y es una secuencia de aminoácidos cargados negativamente contiguos, y n es un entero del 1 al 50, más preferentemente del 1 al 25, todavía más preferentemente del 1 al 10 aminoácidos. Esto se ejemplifica mediante las secuencias Asp-Lys, Glu-Arg, Glu-Cys-Lys-Arg (SED ID NO:7), y Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO:8). Además, las secuencias de aminoácidos cargados contiguos puede presentarse en el péptido reactivo como una secuencia de repetición. El término "secuencia de repetición" cuando se hace en referencia con una secuencia de aminoácidos que se contiene en una secuencia de péptido significa que la secuencia de aminoácidos se reitera de 1 a 2 veces, más preferentemente de 1 a 10 veces, y más preferentemente de 1 a 100 veces, en la secuencia de péptidos. Las repeticiones de la secuencia de péptidos pueden ser no contiguas o f ' - rt - f ?T ----«-ttMiliiiií i ¡- a iniÉü .-M¿^l-Ja--U---t-ri^J---l-MjM^-l, - -c- -»--.- , --».---J » - 75 - contiguas. El término "repetición no contigua" cuando se hace con referencia a la secuencia de péptido de repetición, significa que al menos un aminoácido (o aminoácido análogo) se coloca entre las secuencias de repetición. El término "repetición contigua", cuando se hace en referencia a una secuencia de péptido de repetición signifique que no hay aminoácidos de intervención (o análogos de aminoácidos) entre las secuencias de repetición. En una modalidad preferida, el péptido reactivo contiene una secuencia de repetición de aminoácidos cargados positivamente, así como una secuencia de repetición de aminoácidos cargados negativamente contiguos, en donde el número total de residuos de aminoácidos cargados positivamente en la secuencia de aminoácidos contiguos cargados positivamente es igual al número total de residuos de aminoácidos cargados negativamente en la secuencia de aminoácidos contiguos cargados negativamente. En todavía una aminoácidos más preferida, las secuencias de aminoácidos cargados positivamente contiguos es contigua con las secuencias de aminoácidos cargados negativamente. Esto se ejemplifica mediante las secuencias Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys (SEQ ID NO:9), Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys-Arg (SEQ ID NO: 10), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 1 1 ), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 12), Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 13), Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg (SEQ ID NO. 14), Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His (SEQ _-^_M-^-tt¿-c--- .-A--.---.---. . -.. «_»__, . ._«_,.__. „ ,..¿ i .

ID NO: 15). En una modalidad alternativa preferida, el péptido reactivo se contempla que contenga aminoácidos cargados negativamente no contiguos y aminoácidos cargados positivamente no contiguos. En otras palabras, los aminoácidos cargados (ya sea negativamente o positivamente) se pueden disponer entre los aminoácidos (o análogos de aminoácidos) que ya sea que estén sin cargar {por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, prolina, asparagina y glutamina), o que tengan una carga diferente. En una modalidad más preferida, el péptido reactivo además contiene una secuencia de aminoácidos cargados contiguos, en donde las secuencia de aminoácidos cargados contiguos consiste, ya sea, en aminoácidos cargados negativamente contiguos, o aminoácidos cargados positivamente contiguos. En una modalidad más preferida, la secuencia se ejemplifica mediante una secuencia de fórmula general Asp-GlUn-Gly-LySn-Asp-GlUn (SED ID NO: 16), Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun (SEQ ID NO:17), Lys-Argn-Ser-Gly-Asp-Glu-Asp (SEQ ID NO: 18), Lys-Argn-His-Pro-Met-Aspn-Glu (SEQ ID NO: 19), en donde n es un entero de 1 a 40. En todavía una modalidad más preferida, la secuencia es Asp-Glu-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Asp-Glu (SEQ ID NO:20). Cualquier péptido reactivo heterólogo puede estar genéticamente diseñado técnicamente como una partícula de virus de planta de acuerdo con las enseñanzas anteriores y las de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,958,422 y 5,874, 087 (cada una se incorpora en su totalidad para referencia). En particular, el .-.llttl.-l.fa? ._-__. . _... -..-<cc-^.S.-J-~^-i~| ~..~.^ péptido reactivo heterólogo se puede expresar como una porción expuesta de la proteína de recubrimiento del virus de planta. Se prefiere que el péptido reactivo se inserte en la partícula del virus de planta, de manera que los aminoácidos reactivos se exhiban sobre la proteína de recubrimiento del virus de planta, más preferentemente extendiéndose hacia afuera de la estructura del cápsido, facilitando mediante esto el acceso mediante ligandos químicos y reactivos a los aminoácidos reactivos del péptido reactivo. En una modalidad, el péptido reactivo se inserta entre alanina 22 y prolina 23 de la proteína de recubrimiento pequeña (VP-S) del virus de mosaico de alverjón. 2. Conjugar una Molécula de Interés con un Péptido Reactivo. Cualquier molécula de interés se puede conjugar con un péptido reactivo (ya sea del tipo natural o heterólogo), que se presenta por los virus de planta de la invención usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para conjugar polisacáridos con péptidos se ejemplifican, pero no se limitan a acoplar vía grupos alfa o epsilón-amino con oligosacáridos activado con NalO [Bocher y colaboradores (1997) J. Immunol. Methods 27: 191 -202], usando diéster de ácido escuárico (1 ,2-dietoxiciclobuteno-3,4-diona) como un reactivo de acoplamiento [Tietze y colaboradores (1991 ) Bioconjug Chem. 2: 148-153], acoplando vía un enlazador péptido, en donde el polisacárido tiene una terminal de reducción y no tiene grupos carboxilo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,342,770), acoplando con un portador péptido sintético derivado de la proteína de choque por calor humano hsp65 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número yt?aa í??. ~i.lL^. ^^-J^U?^k^?^ ? ?ya^j ^^t^^Jk^tílM C----Í--J-. 5,736, 146), y usando los métodos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,639,512. Estos métodos se pueden aplicar a antígenos de polisacáridos, incluyendo, por ejemplo, el antígeno de superficie Staphylococcus epidermidis (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,961 ,975). Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. Los métodos para conjugar glicoproteínas con péptidos vía las fracciones de carbohidratos de la glicoproteína han sido descritos usando, por ejemplo, la generación de aldehidos reactivos sobre las fracciones de carbohidratos mediante oxidación leve con periodato de sodio y la reacción posterior con peroxidasa hidrazida [D'Alessandro y colaboradores (1998) Clin. Chim. Acta 22: 189-197], el uso del reactivo de reticulación hetero-bifuncional ácido 4-94-N-melaimidofenil)butírico hidrazida (MPBH), que permite el acoplamiento de aldehidos derivados de carbohidratos con tioles libres [Chamow y colaboradores (1992) J. Biol. Chem. 267: 15916- 15922], el reactivo cianilante orgánico tetrafluoroborato de 1 -ciano-4- dimetilaminopiridio (CDAP) para activar polisacáridos antes de acoplar con péptidos bajo condiciones alcalinas leves (pH 7-9) [Lees y colaboradores (1996) Vaccine 14: 190-198], la activación carboxilo o activación hidroxilo del polisacárido [Devi y colaboradores (1995) Infect. Immun. 63:2906- 291 1 ], el tratamiento alcalino del polisacárido antes de acoplarlo con el péptido [Kabir (1987) J. Med. Microbiol. 23:9-18], y los métodos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,639,512. Estos métodos se pueden aplicar a, por ejemplo, conjugar antígenos de glicoproteína [ejemplificados por el antígeno del virus de inmunodeficiencia humana tipo 2 (HIV-2) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,037, 165), y el antígeno de superficie de células de P-glicoproteína (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,837,306)] con el virus de planta. Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. También, ya sea la proteína o la fracción de polisacárido de una glicoproteína se puede usar para enlazar covalentemente la glicoproteína con péptidos reactivos sobre el virus usando técnicas del arte anterior que han sido aplicados a la conjugación de glicoproteínas con glicoproteínas, tales como mediante la fotoactivación con un derivado de azidobenzoílo de una de las glicoproteínas [Rathnam y colaboradores (1980) Biochim. Biophys. Acta 624:436-442]. Los métodos para conjugar proteínas con proteínas se describen en la presente (es decir, conjugar un péptido heterólogo reactivo que contiene un residuo de cisteína con una proteína de interés que ha sido activada con éster n-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); Ejemplo 1 1 ). Varios métodos adicionales también se conocen, incluyendo el método para conjugar la proteína SL con alérgenos de proteínas [Jahn-Schmid y colaboradores (1996) Immunotechnology 2: 103], acoplando con un portador péptido sintético derivado de la proteína de choque por calor humano hsp 65 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,736, 146), los métodos usados para conjugar péptidos con anticuerpos (Patentes de los Estados Unidos de .t^?A i iáttt^.*.- * **^ *^.. .. .- -_tf.,_ t..j.

Norteamérica Números 5, 194,254; 4,950,480), los métodos usados para conjugar péptidos con fragmentos de insulina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,442,043), los métodos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,639,512, y el método para conjugar el antibiótico de decapéptido cíclico polimixina B con y un portador IgG usando formación amida mediada por [1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida] EDAC [Drabick y colaboradores (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:583-588], Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. Los enfoques para conjugar los ácidos nucleicos con proteínas también se conocen en la técnica, tales como los descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,574, 142; 6, 1 17,631 ; 6,110,687; cada uno de éstos se incorpora en su totalidad para referencia. Los métodos para conjugar lípidos con péptidos se han descrito en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el uso de aminación reductiva y su enlace, el cual contiene una amina secundaria o terciaria (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,071 ,532), los métodos de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,639,512, los métodos usados para acoplar covalentemente péptidos con liposomas unilaminares [Friede y colaboradores (1994) Vaccine 12:791 -797], para acoplar la albúmina de suero humana con liposomas usando el reactivo hetero-bifuncional N- succimidil-S-acetiltioacetato (SATA) [Kamps y colaboradores (1996) Biochim. Biophys. Acta 1278:183-190], para acoplar fragmentos Fab' de anticuerpo con liposomas usando un ancla de fosfolípido-poli(etilenglicol)- maleimida [Shahinian y colaboradores (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239: 157-167], y para acoplar el epítope de Plasmodium CTL con ácido palmítico vía los aminoácidos separadores cisteína-serina [Verheul y colaboradores (1995) J. Immunol. Methods 182:219-226]. Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. G. Administrar Composiciones a los Animales En una modalidad, se contempla que los virus modificados de la invención se usan para la presentación de moléculas antigénicas como el componente inmunogénico de vacunas. Los virus de planta modificados de la invención proporcionan un sistema de presentación de epítopes atractivo especialmente en el contexto del diseño de vacunas, ya que presentan la molécula antigénica sobre la partícula del virus de planta, de manera que es fácilmente reconocida por el sistema inmune, por ejemplo, por la localización de una parte expuesta de la proteína de recubrimiento del virus. Los virus modificados de la invención se pueden administrar a un animal receptor mediante cualquier ruta deseada {por ejemplo, intranasal, oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, subcutánea, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, efe.). Aunque los datos presentados en la presente demuestran que los virus de planta modificados de la invención ejercen su efecto sobre los componentes celular y/o humoral del sistema inmune sin tomar en cuenta la ausencia o presencia de agentes inmunomoduladores extraños {por ejemplo, adyuvantes, citocinas, etc.), la invención no se limita expresamente a la aplicación de la invención en ausencia de estos agentes. Por ejemplo, debido a que los adyuvantes funcionan para mejorar la naturaleza de una respuesta inmune, así como la ruta particular de la reacción inmune resultante, una persona con experiencia en la técnica puede considerar la inclusión de adyuvantes, junto con los virus modificados de la invención como deseable, independientemente de la influencia que el adyuvante ha producido en la ruta del ayudante T. Aunque la invención se ilustró usando los adyuvantes ejemplares alum, FCA/FICA, y QS-21 , se contempla expresamente que la invención no se limitará a estos adyuvantes. En vez de eso, cualquier adyuvante de interés se puede incluir, tal como, pero sin limitarse a, aquellos que contienen un sistema de emulsión y un material de resina sintética que es capaz de complejarse con antígenos, hormonas, fármacos y suero (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 3,919,41 1 ), copolímeros de polioxietileno/copolímeros de bloque de polioxipropileno (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,086,899), 1 H-imidazo[4,5-C-quinolin]-4-amina y sus derivados (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,083,505), holotoxina enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli mutante (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,033,673), péptido de formilmetionilo (fMLP) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,017,537), ADP-exotoxina ribosilante, la cual es particularmente conveniente para la administración transcutánea (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,980,898), interleucina-12 (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,976,539), polidimetilsiloxano y un emulsificante complejo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,904,925), hemozoína o ß-hematina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,849,307), glucano de Saccharomyces cervisiae (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,804, 199), gel de hidróxido de zinc/hidróxido de calcio, lecitina y polialfaolefina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,232,690), monoésteres de polioxietileno sorbitán (PS), que son útiles para la administración tópica de antígenos via las membranas mucosas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,942,237), y liposomas transdérmicos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,910,306). Además, también se conocen en la técnica métodos para usar las capas de superficie bacteriana cristalina (SL) como adyuvantes al conjugar antígenos con la SL [Jahn- Schmid y colaboradores (1997) International Immunology 9: 1867-1874]. Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. Además, aunque no se requieren citocinas o excipientes para eficacia, los virus modificados de la invención se pueden coadministrar usando citocina o excipiente de interés. Citocinas ejemplares incluyen, sin limitación, ¡nterleucina-1 a, interleucina-1 ß, interleucina-2, interleucina-1 1 , interferón-a. interferón-?, factor de necrosis de tumor, la familia de TGF-ß, la familia inhibina, la familia DPP/VG1 , la Familia de Sustancia Inhibidora Mulleriana, el factor inhibitorio de leucemia, oncostatina M, y el factor neutrotrópico ciliar. Los excipientes farmacéuticos que pueden encontrar uso en combinación con los virus de planta modificados de la invención incluyen el excipiente basado en celulosa microcristalina ilustrativo, el cual tiene una comprimibilidad mejorada (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,103,219), hidrocoloide de galactomanán, el cual es conveniente para aumentar el régimen de dureza de la tableta farmacéutica que contiene goma de guar (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,063,402), amilosa reticulada, la cual es útil como un excipiente para la liberación lenta de componentes activos de tabletas o granulos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,807,575), almidones desramificados enzimáticamente, los cuales son comprimibles en una tableta (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,468,286), y excipientes de vesícula de lípido, los cuales se pueden preparar en forma rociables o por gotas para la administración no irritante en la mucosa nasal (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,200,393). Cada una de las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica en la presente se incorpora en su totalidad para referencia. H. Aumentar una Respuesta Tipo TH1 Los virus modificados de la invención encuentran uso particular para aumentar una respuesta TH1 a una molécula de interés, haciendo de este modo los virus modificados de la invención particularmente portadores atractivos para moléculas que se dirigen, por ejemplo, a enfermedad infecciosa, cáncer y alergia. El término "aumentar el nivel de respuesta TH1 " y "aumentar nivel de respuesta TH1 " cuando se hacen referencia a una respuesta del animal a un virus modificado que contiene una molécula de interés, significa que el nivel de cualquiera de una o más de la respuesta celular y/o humoral que se genera por los linfocitos TH1 después de la estimulación mediante la molécula o el virus se aumenta por una cantidad estadísticamente significativa en comparación con la respuesta correspondiente en un animal de control. En particular, un nivel aumentado de respuesta TH1 en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a (a) un nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1 , (b) un nivel aumentado de citocina asociada con TH1 , y/o (c) un nivel de proliferación aumentado de células TH1. El término "nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a un aumento, preferentemente al menos un 0.1%, más preferentemente del 0.1 % a 50%, todavía más preferentemente de 0.1 % a 20%, y más preferentemente de 0.1 % a 10%, de aumento en la cantidad de una o más de las subclases de inmunoglobulina asociadas con TH1 {por ejemplo, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón, lgG1 humana, lgG3 humana, etc.), las cuales son específicas, ya sea para la molécula de interés o para el virus, en relación con la cantidad de la inmunogiobulina asociada con TH1 de la misma subclase. Por ejemplo, un aumento de 5% en la cantidad de lgG2a de ratón específica de molécula (y/o específica de virus), en relación con la cantidad de la lgG2a de ratón total en el mismo ratón se considera un aumento en el nivel de la respuesta de TH1 en el ratón. De manera similar, un aumento del 1 % en la cantidad de lgG2b de ratón específica para molécula (y/o específica para virus) en relación con la cantidad de la lgG2b de ratón total en el mismo ratón se considera un aumento en el nivel de la respuesta TH1 en el ratón (ver, por ejemplo, la Tabla 4). De manera alternativa, el término "nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1 " en un animal que está expuesto a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a un aumento, preferentemente al menos de 2 veces, más preferentemente de 2 a 100,000 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, y todavía más preferentemente de 2 a 2,000 veces, aumento en la proporción de la cantidad de uno o más de las subclases de inmunoglobulina asociada con TH1 {por ejemplo, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón, lgG1 humana, lgG3 humana, etc.), que es específica, ya sea para la molécula de interés o para el virus, en relación con la cantidad de inmunoglobulina asociada con TH1 total de la misma subclase o por un lado, en comparación con la proporción de una o más de las subclases de inmunoglobulinas asociadas con TH2 {por ejemplo, lgG1 de ratón, lgG3 de ratón, lgG2 humana, etc.), la cual es específica, ya sea para la molécula de interés o para el virus (respectivamente), en relación con la cantidad de inmunoglobulina asociada con TH2 total de la misma subclase, por otro lado. Por ejemplo, ?n aumento de 1 ,000 veces en la proporción de lgG2a de ratón:lgG2a total específico para molécula (y/o específico para virus), en relación con la proporción de lgG1 de ratón: lgG1 total específico para molécula (y/o específico para virus) en el mismo ratón se considera un aumento en el nivel de la respuesta de TH1 en el ratón. De manera similar, un aumento de 2,000 veces en la proporción de lgG2b de ratón:lgG2b total específico frfír ff"" "-¡? iJ?Mm jfi_ti_ _^-^ -*^fe-*- .--- -»---* ac. -*—,.«___ .__-..___..__ de molécula (y/o específico de virus), en relación con la proporción de lgG3 de ratón:lgG3 total específico de molécula (y/o específico de virus) en el mismo ratón se considera un aumento en el nivel de respuesta de TH1 en el ratón (ver, por ejemplo, la Tabla 4). En todavía otra alternativa, el término "nivel aumentado de inmunoglobulína asociada con TH1 " en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a un aumento, preferentemente al menos de 2 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, todavía más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, aún más preferentemente de 2 a 100 veces, y mucho más preferentemente de 2 a 50 veces, aumento en la titulación en el punto extremo de la media geométrica de las inmunoglobulina asociadas con TH1 específicas de molécula (y/o específicas de virus) en comparación con la titulación en el punto extremo de la media geométrica de las inmunoglobulinas asociadas con TH1 específicas de molécula (y/o específica de virus) en un animal de control. El término "titulación del punto extremo" es la dilución del anticuerpo que es específica para una molécula dada y la cual es la dilución más alta del anticuerpo que produce una reacción detectabie {por ejemplo, mediante ELISA) cuando se combina con la molécula. Por ejemplo, un aumento de 20 veces en la titulación del punto extremo de la media geométrica de lgG2a de ratón específica para molécula en un ratón tratado en comparación con la titulación del punto extremo de la media geométrica de lgG2a de ratón específico para molécula en un ratón de control se considera un nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1 (ver, por ejemplo, las Tablas 2 y 3).

Los métodos para cuantificar los niveles de inmunoglobulinas producidas por células B individuales (así como células fusionadas con células B, tales como los hibridomas) se logran fácilmente in vitro usando reactivos disponibles comercialmente y una variedad de pruebas, incluyendo las descritas en la presente, tales como ELISA y ELISPOT. Ver Segwick y colaboradores (1983) J. Immunol. Methods 57:301 -309. Ver también Mazer y colaboradores (1991) J. Allergy Clin. Immunol. 88:235- 243. En todavía otra alternativa, un "nivel aumentado de respuesta de TH1 " se refiere a un aumento en el nivel de citocina asociada con TH1.

El término "aumento en el nivel de citocina asociada con TH1 " en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés significa que la cantidad de citocina asociada con TH1 que se produce por las células TH1 del animal se aumenta preferentemente al menos 2 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, todavía más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, y mucho más preferentemente de 1 a 100 veces, en un animal tratado en relación con la cantidad de citocina asociada con TH1 que se produce por las células T de un animal de control. La cantidad de citocina se puede determinar usando, por ejemplo, ELISA, como se describe en la presente usando reactivos disponibles comercialmente {por ejemplo, Tabla 6). En otra alternativa, un "nivel aumentado de respuesta de TH1 " se refiere a un nivel de proliferación aumentado de células TH1. El término "nivel de proliferación aumentado de células TH1 " en un animal que está expuesto a un virus modificado que contiene una molécula de interés significa que el número de células TH1 proliferantes que son producidas por el animal aumenta preferentemente en al menos 2 veces, más preferentemente de 2 a 1 0,000 veces, más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, y mucho más preferentemente de 1 a 1 00 veces, en relación con el número de células TH 1 que son producidas por un animal de control. El número de células TH1 proliferantes se puede determinar usando métodos como los descritos en la presente, y subtipo TH1 se puede determinar mediante el examen de sobrenadantes de estas células para determinar la presencia de citocinas asociadas con TH 1 {por ejemplo, Tabla 6). En una modalidad, se contempla que una cantidad terapéutica de los virus de plantas modificados de la invención se administren a un sujeto. Los datos presentados en la presente demuestran que la inmunización de ratones con las partículas de virus quimérico ejemplares (CVP) de CPMV generan principalmente anticuerpos lgG2a e lgG2_ específicos de CPMV y específicos de péptido en sueros como se determina mediante ELISA. El análisis de mancha inmune enlazada con enzima (ELISPOT) confirmó la desviación en las respuestas del anticuerpo hacia el tipo TH1 , demostrando que las CVPs pueden iniciar predominantemente células B que producen lgG2a e lgG2. específicas de CPMV y específicas de péptido en el bazo. En cambio, sólo niveles bajos de células B que producen anticuerpos Igd e lgG3 específicos de CPMV y específicas de péptido (productos de la ruta inmune TH2) se detectaron, si es que se detectó algo.

Además, la invención describe las células del bazo (células T) de ratones inmunizados con CVP, proliferaron a CPMV in vitro, produciendo altos niveles de IFN-? (una citocina asociada con TH1 ), pero no niveles detectables de IL-4 (una citocina asociada con TH2). Esto sugiere que las CVPs producen una respuesta TH1 al portador viral que, a su vez, controla el isotipo de las respuestas de células B específicas de péptidos. La desviación en la respuesta hacia el tipo TH1 no es afectada por la naturaleza del antígeno, los antecedentes genéticos del individuo inoculado, la elección de adyuvante, o la dosis o el régimen de dosis de CVPs administradas. Aunque los datos presentados en la presente demuestran que, en una modalidad preferida, el nivel de citocina asociada con TH1 {por ejemplo, IFN-?) aumentó en la respuesta al tratamiento con los virus modificados de la invención en ausencia de un cambio en el nivel de citocina asociada con TH2 {por ejemplo, IL-4) se contempla expresamente que la invención no se limita a un aumento en la citocina asociada con TH1 en ausencia total de niveles detectables de citocina asociada con TH2. En vez de eso, la invención incluye expresamente dentro de su alcance un aumento en el nivel de citocina asociada con TH1 , independientemente del cambio (si lo hay) en el nivel de citocina asociada con TH2. Los datos anteriores demuestran la capacidad de los virus modificados de la invención, que no infectan ni se replican en células de mamíferos, para dirigir la respuesta inmune a péptidos expresados hacia el tipo efector TH1 y la necesidad de agentes inmunomoduladores S__j________j ;______y extraños, tales como adyuvantes o citocinas, representan la ventaja de los virus de plantas de la invención como un sistema portador de vacuna. Dicho de otro modo, los virus modificados proporcionados en la presente se comportan como virus inactivos en el contexto de una inoculación a mamífero. Aunque los virus inactivos se predice por la técnica anterior que disparan una respuesta TH2, los virus inactivos proporcionados de la presente sorprendentemente producen una presente tipo TH1. I. Reducir una Respuesta Tipo TH2 Los virus modificados de la invención son útiles en aplicaciones en donde es deseable reducir una respuesta TH2 a una molécula de interés. Por ejemplo, cuando la administración de una molécula {por ejemplo, antígeno bacteriano) a un animal se conoce que genera una respuesta TH2 (ya sea parcial, predominante, o exclusiva), la respuesta TH2 en otro animal se puede reducir presentando la molécula al otro animal en el contexto de un virus de planta modificado, como se describe en la presente. Los términos "respuesta TH1 parcial" y "respuesta TH2 parcial" significan que el animal presenta (a) inmunoglobulina asociada con TH1 y TH2, (b) citocina asociada con TH1 y TH2, y/o (c) proliferación de células TH1 y TH2. Una "respuesta TH2 predominante" es una respuesta TH2 parcial, en la cual el nivel de cualquiera de una o más inmunoglobulinas asociadas con TH2, citocina asociada con TH2, y proliferación de células TH2 es estadísticamente mayor que el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 , citocina asociada con TH1 , y proliferación de células TH1 , respectivamente. En cambio, una "respuesta TH1 predominante" es una respuesta TH1 parcial, en la cual el nivel de una o más de inmunoglobulina asociada con TH1 , citocina asociada con TH1 , y proliferación de células TH1 es estadísticamente mayor que el nivel de inmunoglobulina asociada con TH2, citocina asociada con TH2, y proliferación de células TH2, respectivamente. Una "respuesta TH2 exclusiva" es una respuesta TH2 predominante, en donde el animal presenta inmunoglobulina asociada con TH2, citocina asociada con TH2, y proliferación de células TH2 en ausencia total de inmunoglobulina asociada con TH1 , citocina asociada con TH1 , y proliferación de células TH1 . Inversamente, una "respuesta TH1 exclusiva" es una respuesta TH1 predominante, en donde el animal presenta inmunoglobulina asociada con TH1 , citocina asociada con TH1 , y proliferación de células TH1 en la ausencia total de inmunoglobulina asociada con TH2, citocina asociada con TH2, y proliferación de células TH2. Además, los virus modificados de la invención también son útiles cuando es deseable reducir un TH2 existente en un animal. Es decir de uso particular en aplicaciones en donde las vacunaciones de refuerzo siguen a una vacunación primaria que empleó un adyuvante que produce una respuesta TH2 parcial, predominante o exclusiva indeseable. La técnica anterior ha notado que una respuesta TH2 preexistente no se puede superar por la aplicación de refuerzo de adyuvante, el cual de otro modo daría como resultado una respuesta TH1 cuando se administra en la mi é, ___Éi.?ll liiiiiilÉ-Éilliiii?liil-IÉIi ilf ....«L»/-»^..^^-» ---^^ • . vacunación primaria. Específicamente, cuando se usa Quil-A como adyuvante da como resultado la inducción de respuestas TH1 en ratones cuando se inmunizan con proteína HPV 16 E7, este efecto no se ve cuando fue una respuesta TH2 preexistente a E7 (inducida usando algamulina como adyuvante) [Fernando y colaboradores (1998) Scand. J. Immunol. 47:459]. Esta observación indica que cuando la vacunación primaria de humanos ha sido hecha con alum (el cual es el único adyuvante aprobado para uso humano, y el cual induce respuestas TH2), la respuesta TH2 resultante indeseable, la cual media reacciones alérgicas indeseables puede de aquí en adelante no ser reversible. Aunque iniciadas con células TH2, las células TH1 diferentes, son estables y no se pueden dirigir hacia el genotipo de TH1 [Pérez y colaboradores (1995) Intl. Immunol. 7:869], se ha demostrado que en las líneas celulares T y clonas generadas de pacientes alérgicos, el uso del alérgeno específico conjugado con una proteína bacteriana da como resultado la expansión de las células TH1 /TH0 específicas al alérgeno, mientras que el alérgeno no conjugado extendió las células TH2 [Jahn-Schmidt y colaboradores (1997) Int. Immunol. 9: 1867]. De este modo, la dominancia inmunomoduladora de la presentación de CPMV de inmunógenos (incluyendo, pero sin limitarse a, alérgenos) se puede extender para cambiar una respuesta inmune establecida de una ruta TH2 perjudicial a una ruta TH1 más benéfica. De este modo, el efecto inmunomodulador dominante de los virus de planta modificados de la invención cuando se usa como la plataforma de presentación para un antígeno ofrece un medio para superar la respuesta TH2 existente para ese antígeno que se inicia mediante la * - 94 - presencia de un adyuvante particular. El término "reducir el nivel de respuesta TH2" y "nivel reducido de respuesta TH2" cuando se hace en referencia a la respuesta del animal a un virus modificado que contiene una molécula de interés, significa que uno o más de la respuesta celular y/o humoral que se genera por linfocitos TH2 después del estímulo mediante la molécula o el virus es reducida por cualquier cantidad estadísticamente significativa en comparación con la respuesta correspondiente en un animal de control. En particular, un nivel reducido de una respuesta TH2 en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés, se refiere a (a) un nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2, (b) un nivel reducido de citocina asociada con TH2, y/o (c) un nivel de proliferación reducido de células TH2. El término "nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés, se refiere a una reducción de, preferentemente del 0.1 % al 100%, más preferentemente del 0.1 % al 80%, todavía más preferentemente del 0.1 % al 60%, en la cantidad de una o más subclases de inmunoglobulina asociada con TH2 {por ejemplo, lgG1 de ratón, lgG3 de ratón, lgG2 humana, efe.), la cual es específica para ya sea la molécula de interés o el virus, en relación con la cantidad de la inmunoglobulina asociada con el TH2 total de la misma subclase. Por ejemplo, una reducción del 10% en la cantidad de lgG1 de ratón específica para molécula (y/o específica para virus), en relación con la cantidad de la lgG1 de ratón total en el mismo ratón se considera un nivel reducido de ^.^^.^ ^^.?.*?Jes?i??*taaii ¿??..1-JbiÍ?j*? respuesta de TH1 en el ratón. De manera similar, una reducción de 0.1 % en la cantidad de lgG3 de ratón específica para molécula (y/o específica para virus), en relación con la cantidad de lgG3 de ratón total en el mismo ratón se considera un nivel reducido de respuesta TH2 en el ratón. De manera alternativa, el término "nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a una reducción en, preferentemente al menos 2 veces, más preferentemente desde 2 a 100,000 veces, todavía más preferentemente de 2 a 10,000 veces, y mucho más preferentemente de 2 a 2,000 veces, en la proporción de una o más de las subclases de inmunoglobulina asociadas con TH2 {por ejemplo, lgG1 de ratón, lgG3 de ratón, lgG2 humana, efe.), la cual es específica, ya sea para la molécula de interés o para el virus, en relación con la cantidad de inmunoglobulina asociada con TH2 total de la misma subclase, por un lado, en relación con la proporción de la cantidad de una o más subclases de inmunoglobulinas asociadas con TH1 {por ejemplo, lgG2a de ratón, lgG2b de ratón, lgG1 humana, lgG3 humana, etc.), la cual es específica, ya sea para la molécula de interés o para el virus (respectivamente), en relación con la cantidad de la inmunoglobulina asociada con TH2 total de la misma subclase, por otro lado. Por ejemplo, una reducción de 1 ,000 veces en la proporción de lgG1 de ratón:lgG1 total específica de molécula (y/o específica de virus), en relación con la proporción de lgG2a de ratón: lgG2a total específica para molécula (y/o específica para virus) en el mismo ratón se considera un nivel reducido de respuesta TH2 en el ratón. De manera similar, una reducción de 2,000 veces en la proporción de la lgG3 de ratón:lgG3 total específica de molécula (y/o específica de virus), en relación con la proporción de lgG2a de ratón:lgG2a total específica de molécula (y/o específica de virus) en un ratón se considera un nivel reducido de respuesta TH2 en el ratón. En otra alternativa, el término "nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés se refiere a una reducción en, preferentemente al menos 2 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, todavía más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, y todavía más preferentemente de 2 a 100 veces, en la titulación del punto extremo de la media geométrica de inmunoglobulinas asociadas con TH2 específica de molécula (y/o específicas de virus) en comparación con ia titulación del punto extremo de la media geométrica de las inmunoglobulinas asociadas con TH2 específicas de molécula (y/o específicas de virus) en un animal de control. Por ejemplo, una reducción en 2 veces de la titulación del punto extremo de la media geométrica de la lgG1 de ratón específica de molécula en un ratón tratado en comparación con la titulación del punto extremo de la media geométrica de la lgG1 de ratón específica de molécula en un ratón de control se considera un nivel reducido de inmunoglobulina asociada con TH2. En todavía otra alternativa, un "nivel reducido de respuesta TH2" se refiere a un nivel reducido de citocina asociada con TH2. El término "nivel reducido de citocina asociada con TH2" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés, significa que la cantidad de citocina asociada con TH2 que se produce por ,-.,_-.-,- ?^^?J.^??íu^.r..JM??^ ^.t£a^s?.^^y*^^». «- -- -fe»*..- . las células TH2 del animal se reduce preferentemente al menos por 2 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, todavía más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, y mucho más preferentemente de 1 a 100 veces, en un animal tratado en relación con la cantidad de citocina asociada con TH2 que se produce por las células T de un animal de control. En una alternativa adicional, un "nivel reducido de respuesta TH2" se refiere a un nivel de proliferación de células TH2. El término "nivel de proliferación reducida de células TH2" en un animal que se expone a un virus modificado que contiene una molécula de interés significa que el número de células TH2 proliferantes que se producen mediante el animal se reduce preferentemente por al menos 2 veces, más preferentemente de 2 a 10,000 veces, más preferentemente de 2 a 1 ,000 veces, y mucho más preferentemente de 1 a 100 veces, en el animal tratado en relación con el número de células T proliferantes que se produjeron por un animal de control. El número de células T proliferantes se puede determinar usando métodos tales como los descritos en la presente, y su tipo TH2 se puede determinar mediante el examen de los sobrenadantes de estas células para determinar la presencia de citocinas asociadas con TH2. EXPERIMENTAL Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención, y no se considera limitante del alcance de la misma. A menos que se diga otra cosa, los procedimientos y _j-J^M_-_."t- ->""- *>^^>^??lti?Mt ??rl^»M?^.^y?J^í^^ _tti-_i..f jj materiales experimentales en cada uno de los siguientes ejemplos se conforman con las descripciones generales enlistadas más adelante. Animales Experimentales Ratones hembras C57BL/6 (H-2b, BALB/c H-2d), NIH (H-2q), DBA/1 (H-25) y Biozzi AB/H (H-2dql, de 6 a 8 semanas de edad, se alojaron en el Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Reino Unido. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los lineamientos para animales en investigación médica de United Kingdom Home Office. Construcción, Propagación y Purificación de CVPS Los métodos usados para la expresión de péptidos extraños, tanto en subunidades S y L de CPMV fueron como se describe en Porta y colaboradores (1994) Virology 202:949. Las distintas CPVs usadas en esta investigación se describen en la Tabla 1.

Tabla 1 : CPVs usadas para la inmunización CVP Secuencia Extraña CPMV-PAE5 Los aminoácidos 282-295 (NEYGVEGGRVNAVG; SEQ ID NO:21 ) de la membrana externa de la proteína F (OM de proteína F) de Pseudomonas aeruginosa enlazada por residuos S y G a los residuos 305-318 (NATAEGRAINRRVE; SEQ ID NO.22) de la proteína F sobre la subunidad L de CPMV.

CPMV-MAST1 Los aminoácidos 1 -30 del enlace de fibronectina (FnBP) de Staphylococcus aureus; GQNNGNQSFEEDTEKDKPKYEQGGNIIDID (SEQ ID NO:23) sobre la subunidad S del CPMV.

CPMV-HCG1 Los 37 aminoácidos terminales C de la subunidad ß de la gonadotropina coriónica (ßhCG-CTP37); TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO:24) sobre la subunidad S del CPMV.

CPMV-HCG3 Los aminoácidos 1 09-1 1 8 y 132-145 del término C de ßhCG (truncado del péptido CTP37): TCDDPRFQDSSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO:25) sobre la subunidad S del CPMV.

CPMV-AGY2 Un péptido de 14 aminoácidos (ELDVCVEEAEGEAP; SEQ ID NO:26) del segmento extracelular Ce4 de la mlgE humana de la subunidad S del CPMV.

CPMV-EGFR1 Los primeros 13 aminoácidos (LEEKKGNYVVTDH; SEQ ID NO:27) del término N del receptor variante lll del factor de crecimiento epidérmico mutante humano (EGFRvIM) sobre la subunidad S del CPMV.

CPMV-PARVO9 Los aminoácidos 3-19 (DGAVQPDGGQPAVRNER; SEQ ID NO:28) del péptido 3L17 derivado de la proteína VP2 del parvovirus canino sobre tanto la subunidad S como la subunidad L del CPMV. ^¿^^^^?^w^^ ^^^^ ^^ _ tt ELISA para determinar las concentraciones de isotipo específicas de péptido y totales. En algunos casos, los valores OD os reportados en los ejemplos que siguen se convirtieron en microgramos de anticuerpo. Cuando se hizo esto, el siguiente procedimiento se usó como base para el cálculo: los pozos se recubrieron, ya sea con IgG anti-ratón de cabra (Southern Biotechnologies Inc. EUA), o con péptido. Diluciones en serie de una concentración conocida de anticuerpo monoclonal kappa de lgG2a (Sigma, RU) se añadieron a los pozos recubiertos con IgG anti-ratón y diluciones de sueros inmunizados con CVP se añadieron a los pozos recubiertos, ya sea con IgG anti-ratón o con péptido. La ELISA se llevó a cabo como se reporta en cualquier lado en la especificación usando el conjugado lgG2a anti-ratón etiquetado con (AP) fosfatasa alcalina para su detección. Graficando el OD obtenido de la interacción de la IgG anti- ratón de cabra y la lgG2a monoclonal contra las concentraciones conocidas de IgG.a, las unidades de OD de lgG2a antipéptido en el suero de prueba se convirtieron en microgramos de lgG2a específicos de péptido. Se leyó una OD en un punto conveniente de la curva estándar de lgG2a. Usando la misma curva estándar, unidades de OD de sueros incubados en pozos recubiertos anti-lgG, se pueden convertir en microgramos de lgG2a total presente en la muestra de suero. El porcentaje de lgG2a específico de péptido se calculó para cada muestra de suero. El mismo método se utilizó para medir el IgGi, lgG2 e lgG3 específico para péptido y total. Estadísticas Las diferencias entre los grupos se evaluaron usando la prueba t de Students, en donde P<0.05 se consideró estadísticamente significativo. F.IFMPI n 1 Péptidos conjugados DT y KLH no producen respuestas de anticuerpos de suero tipo TH1 dominantes Cualquier desviación vista en la ruta ayudante T de una respuesta inmune generada por un antígeno se puede controlar mediante las propiedades inmunológicas intrínsecas del péptido de interés. Para probar esto, ratones C57BL/6 fueron inmunizados con péptido CTP37, derivados de la gonadotropina coriónica humana, conjugada con toxina difteria (DT; Prof. V. Stevens, Ohio State University), o con un péptido (péptido 10) derivado de la proteína de la membrana externa (Omp F protein) de Pseudomonas aeruginosa conjugada con KLH (Prof. H.E. Gilleland, Louisiana State University). Ambos conjugados se inocularon en presencia de el adyuvante QS-21 . Cualquiera de las 2 inmunizaciones (en los días 0 y 21 ) o 3 inmunizaciones (en los días 0, 14 y 28) se administraron subcutáneamente. Se recolectó sangre mediante sangrado de la cola o siguiendo la exsanguinación en el día 42 y se recolectó suero y se almacenó para determinaciones de la ELISA posterior a -20°C. Para la detección de anticuerpos para la proteína de membrana externa F de P. aeruginosa y ßhCG-CTP37 (los péptidos se sintetizaron y purificaron por Genosys Inc. Cambridge, RU), pozos de placas de microtitulación se recubrieron con 0.5 µg/pozo de los péptidos respectivos (ver Tabla 1 , anterior) durante 3 horas a 37°C. Una serie de diluciones dobles de suero fueron incubadas en las placas recubiertas con antígeno durante 1 hora a , -__k...i 37°C. Se detectó anticuerpo unido, ya sea como IgGi, lgG2a, lgG2_ o lgG3 anti-ratón de cabra conjugada con (AP) fosfatasa alcalina (Southern Biotechnologies Inc. , EUA) usando fosfato p-nitrofenilo (PNPP [Sigma]) como el sustrato. Estos reactivos de ¡sotipo anti-ratón se titularon primero contra las proteínas de mieloma de ratón estándares que representan la cuatro subclases IgG y una dilución de 1 :2000 de cada conjugado da menos de 10% de variación entre el enlace de mieloma. Esta fue la dilución usada en todos los ensayos posteriores. Las titulaciones del punto extremo se calcularon como se describió previamente (Brennan y colaboradores (1999) Microbiol. 145:21 1 ; Brennan y colaboradores (1999) J. Virol 73:930). Los resultados se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Péptidos conjugados DT y KLH no producen respuestas de anticuerpos de sueros tipo TH1 dominantes a Inmunización de ratones C57/BI6 usaron 6 animales/grupo * Los sueros se recolectaron en el día 29 y se examinaron para determinar Igd, lgG2a, lgG2_ o lgG3 específicos de ßhCG-CTP37 OM de proteína F mediante ELISA. Como se muestra en la Tabla 2, tanto DT-ßhCG-CTP37 como KLH-OM de proteína F produjeron niveles significativamente más altos de IgGi específica para péptido, comparada con lgG2a (P<0.05 y P<0.01 para DT-ßhCG-CTP37 y KLH-OM de proteína, respectivamente), demostrando que la presentación de estos péptidos sobre sistemas portadores de vacunas no replicantes no genera una desviación hacia una respuesta tipo TH1. F.I F MPI n 7 La expresión de péptidos sobre CPMV supera una desviación TH2 en la respuesta inmune estimulada por los péptidos en otros sistemas portadores macromoleculares que conducen a una respuesta tipo TH1 En comparación con el ejemplo anterior, cuatro péptidos, incluyendo dos (DT-ßhCG-CTP37 y KLH-OM de proteína F) del Ejemplo 1 se expresaron sobre CPMV. Cuatro grupos de ocho ratones Balb/c se inmunizaron subcutáneamente en la presencia de FIA/FICA en un volumen total de 100 µg por dosis. Tres inmunizaciones (en los días 0 y 21 o en los días 0, 14 y 28) se llevaron a cabo inyectando respectivamente, 100 µg, 25 µg y otros 25 µg de CVPs. La sangre se recolectó sangrando la cola o por exsanguinación el día 42; los sueros se recolectaron y se almacenaron a -20°C. Para la detección de anticuerpo anti-CP V, se recubrieron los pozos con 0.1 µg/pozo de CPMV durante 3 horas a 37°C. Una serie de diluciones dobles de suero se incubaron en las placas acopladas con antígeno durante una hora a 37°C. El anticuerpo de enlace se detectó ya sea con IgGi, lgG2a, lgG2b, o lgG3 anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Sothern-Biotechnologies Inc. EUA) con p- nitrofenilfosfato (PNPP) (Sigma) como el sustrato. Como antes, estos reactivos isótopos anti-ratón primero se titularon contra proteínas de mieloma de ratón estándar representando las cuatro subclases de IgG. Una dilución de 1 :2000 de cada conjugado dio menos de 10% de variación entre el enlace de mieloma; por lo tanto esta dilución se usó en todos los ensayos posteriores. Las titulaciones del punto extremo se calcularon como se describió anteriormente. Para titulaciones específicas para el CPMV, los resultados se expresaron como titulación del punto extremo, calculadas como la inversa de la dilución que da una OD4_5 media mayor que la OD .5 obtenida con una dilución de 1 :50 de suero recolectado de ratones no inmunizados. Para titulaciones específicas de péptido, las titulaciones de punto extremo fueron la inversa de la dilución que da una OD .5 media mayor que la OD40s obtenida con una dilución 1 :50 de suero combinado de ratones inmunizados con CPMV del tipo natural. Los resultados se demuestran en la Tabla 3, filas 5 y 7.

Tabla 3. Isotipo de suero de IgG específico de péptido producido mediante partículas de virus quimérico que expresan una variedad de diferentes péptidos Las cepas de ratón de diferentes haplotipos H-2 fueron inmunizados3 (5-9/grupo) subcutáneamente o *¡ntranasalmente con varias CVPsa en cualquiera de FCA/FICA, QS-21 o adyuvante de alum o sin adyuvante0. Los sueros se recolectaron en el día 42 (+ día 83) y se examinaron para determinar Igd , lgG2A, IgG.b, o lgG3 específico para mfgE-(AGY2), EGFRvlll-(EGFRI ), VP2-(PARVO9), ßhCG-CTP37-(HACG1 ), OM de proteína F-(PAE5) y FnBP-(MAST1 )-mediante ELISA. Las titulaciones se expresan como titulaciones de punto extremo de media geométrica±SD. El término "titulación de punto extremo" es la dilución de anticuerpo que es específica para un antígeno dado y la cual es la dilución más alta del anticuerpo que produce una reacción detectable cuando se combina con el antígeno. Como se demuestra por la Tabla 3, en este caso en donde los epítopes se presentaron en CPMV, estos epítopes provocaron niveles mucho más bajos de Igd que lgG2a, demostrando una desviación hacia la respuesta inmune tipo TH 1 . Sin duda, comparando con los dos epítopes (es decir, DT-ßhCG-CTP37 y KLH-OM de proteína F) en donde se presentaron en ausencia de la presentación de CPMV (Ejemplo 1 ), la presentación de los mismos epítopes en CPMV provocaron niveles mucho menores de Igd que de lgG2a. F.I F P I n a La presentación de péptidos sobre el CPMV produce una respuesta tipo TH1 en presencia de agentes inmunomoduladores extraños, por ejemplo, adyuvantes específicos conocidos que ofrecen respuestas inmunes tipo TH2 Los adyuvantes alum y QS21 generalmente favorecen la inducción de una respuesta inmune tipo TH2. Con el fin de determinar si la respuesta inmune tipo TH2 que es favorecida por los adyuvantes podría ser desviada por el sistema de presentación de CPMV de la invención, tres grupos de ratones C57BL/6 se inmunizaron subcutáneamente y los días 0 y 21 en cada ocasión con 5 µg de CPMV-MAST1 (que expresa un péptido derivado de la proteína de enlace de fibronectina de Staphylococcus aureus) ya sea solo o con alum de QS21. Los sueros se recolectaron en el día 42 y se probaron para determinar las inmunoglobulinas específicas de péptido MAST1 de las clases: Igd, lgG2a, lgG2 , o lgG3 mediante ELISA, esencialmente como se describe en los ejemplos 1 y 2, anteriores. Las titulaciones indicaron una desviación fuerte hacia una respuesta TH1 en los tres grupos de ratones incluyendo el grupo de control en el cual no se añadió adyuvante (Tabla 3, anterior, filas 8, 9 y 10). De este modo, un efecto inmunomodulador de los adyuvantes que se sabe que favorecen respuestas TH2 fue completamente sobrepasado por la presentación de péptidos sobre los CPMVs quiméricos. También, la ausencia de un adyuvante extraño en parte de esta investigación sirve para dar énfasis al efecto de desviación TH1 intrínseco de la misma plataforma del CPMV (Tabla 3, anterior, fila 8). F.I F MPI n __ Péptidos derivados de una variedad de proteínas producen anticuerpos tipo TH1 específicos para péptidos predominantemente en sueros cuando se expresan sobre el CPMV independientemente de los antecedentes genéticos del individuo inmunizado Para verificar la utilidad universal del CPMV como un portador capaz de producir respuesta tipo TH1 , y con el fin de demostrar que el efecto inmunológico fue independiente de la constitución genética de un individuo inmunizado, ratones de diferentes haplotipos MHC clase 1 1 fueron inoculados con CVPs que expresan péptidos derivadas de varias . j-j_-t-* __«d___J__fc__ i^títitliíi^iH.S^?,^?¡íjS?^??.^uátít ? ^?i?^*?t -J - --1 J . fuentes diferentes. CPVM-AGY2 (Tabla 3, fila 1 ) expresa un péptido a partir de la cadena pesada de la inmunoglobulina E (IgE) enlazada a la membrana humana; CPMV-EGFR1 (Tabla 3, fila 2) expresa un péptido derivado a partir del receptor de crecimiento epitelial, de proteína, presente en las células de cáncer humanas; CPMV-HCG3 (Tabla 3, fila 6) expresan péptidos derivados de la hormona humana, gonadotropina coriónica (hCGß); CPMV-PARVO9 (Tabla 3, filas 3 y 4) expresa un péptido de parvovirus canino, y CPMV-MAST1 (Tabla 3, filas 8-12) y CPMV-PAE5 (Tabla 3, fila 7) expresan péptidos derivado de proteína de membrana bacteriana (de S. aureus y P. aeruginosa, respectivamente). Cuatro cepas de ratón representativas de diferentes haplotipos (genotipos) se usaron: DBA/1 ; NIH; C57BL/6; y Biozzi/ABH (H-2dq 1 ). Los ratones fueron inmunizados subcutáneamente con las distintas CVPs en la presencia de QS-21 (10 µg/dosis; Aquila Biopharmaceutical Inc, Worcester, MA) en un volumen total de 100 µl/dosis. Cualquiera de las 2 inmunizaciones en los días 0 y 21 , o 3 inmunizaciones; en los días 0, 14 y 28 se administraron (ver Tabla 3, anterior). Se recolectó la sangre mediante sangrado de la cola o exsanguinación en el día 42 como anteriormente; los sueros se recolectaron y se almacenaron a -20°C. Para la detección de anticuerpo anti-CPMV, los pozos se recubrieron con 0 1 µg/pozo de CPMV durante 3 horas a 37°C. Una serie de diluciones dobladas de suero se incubaron sobre las placas recubiertas de antígeno durante una hora a 37°C. El anticuerpo en ligado se detectó ya sea con fosfatasa alcalina IgGi , lgG2a, lgG2b, o lgG3 anti-ratón de cabra conjugada con (AP) fosfatasa alcalina (Southern Biotechnologies Inc, EUA) con p- .-.._.. .re,, . vttfi _. A-fe Ui nitrofenil fosfato (PNPP) (Sigma) como el sustrato. Estos reactivos de isotipo anti-ratón primero se titularon contra proteínas de mieloma de ratón estándar que representan las cuatro subclases de IgG. Una dilución de 1 :2000 de cada conjugado da menos de 10% de variación entre el enlace de mieloma. Esta dilución se usó en todos los ensayos posteriores. Las titulaciones del punto extremo se calcularon como anteriormente. Para titulaciones específicas para CPMV, los resultados se expresaron como titulación del punto extremo, calculadas como la inversa de la dilución que da una OD4os media mayor que la OD os obtenida con una dilución 1 :50 de suero recolectado de ratones no inmunizados. Para las titulaciones específicas de péptidos, las titulaciones de punto extremo fueron la inversa de la dilución que da una OD .5 media mayor que la OD405 obtenida con una dilución 1 :50 de suero recolectado de ratones inmunizados con CPMV tipo natural. Las 4 construcciones mostraron producir altos niveles de lgG2a específicos para péptido en relación con los niveles de IgGi o lgG3 (P<0.01 en todos los casos), a pesar de la presencia de un adyuvante inmunomodulador de TH2 conocido (es decir, QS21 o alum). Los niveles de Igd y de lgG3 específicos para péptidos fueron correspondientemente mucho más bajos dentro de todos los grupos de inmunización (Tabla 3, anterior). Algunas de las . CVPs también produjeron cantidades significativas de lgG2b específica para péptido. Cuando esto se presentó, los niveles fueron menores que los niveles de lgG2a con excepción del CPMV-MAST1 , el cual en algunos casos provocó niveles de lgG2b que fueron mayores que los niveles de lgG2a (Tabla 3, anterior). De este ._&._- <->J-,-__.-_ti .&.«_- .*- -?-_.a-_-_,- ~-_-JL. -.-,-_._,_-.-__-t ,____ _ modo, las CVPs produjeron predominantemente respuestas tipo TH1 específicas para péptido que no parecen estar influenciadas por la fuente ni por la secuencia del péptido expresado ni por la presencia del coadyuvante con potencial inmunomodulador de TH2. Sin embargo, crucialmente, las CVPs de este experimento produjeron respuestas tipo TH1 en los ratones de cuatro diferentes haplotipos TH2. Esto indicó que el efecto no fue determinado ni controlado por los genes de respuestas inmunes (Ir genes). En otras palabras, la disposición genética de un individuo no fue un factor de inhibición en la capacidad del CPMV para producir una desviación a TH1 en la respuesta inmune disparada por un péptido particular. Fue especialmente significativo que el efecto de la desviación a TH1 en una respuesta inmune fue vista en ratones Biozzi/ABH inoculados con CPMV-MAST1. Los ratones Biozzi/ABH están genéticamente predispuestos para favorecer una respuesta desviada a TH2, aún cuando los efectos de desviación potenciales de los adyuvantes extraños o de los péptidos mismos se tomaron en cuenta. Por lo tanto, la respuesta TH1 asociada con CPMV fue capaz de sobrepasar los factores genéticos intrínsecos fuertes generalmente considerados que gobiernan hasta un grado significativo la reacción inmune de un individuo. Esto fue enfatizado además por el análisis de la especificidad de las inmunoglobulinas a partir de los subtipos de rutas TH1 y TH2. Menos del 1 % de lgG1 producida fue específico de péptido, comparada con 25-100% de la lgG2a total en todos los ratones en el grupo de prueba. En resumen el uso de CPMV como portador y el sistema de t-a-v_---_> -¡-J-.T _.,* _--.,_,_-^»-c*.»-.--> -.t_>___»A__^^_j|^[r¡(--i-----. .--•-.. i t * 111 presentación para péptidos puede superar barreras al nivel de la genética de un individuo proporcionando mediante esto un elemento para superar consideraciones genómicas de vacunas en el diseño de agentes profilácticos y terapéuticos. F.IFMPLQ 5 Presentación de péptidos sobre partículas de CPMV induce respuestas inmunes desviadas TH1 sobre un amplio rango de regímenes de dosis Es aparente de una consideración de los datos de titulación de IgG en la Tabla 3, anterior, que niveles más altos de lgG2a específicos de péptido (indicadores de una respuesta tipo TH1 ) que de IgGi específico de péptido (indicadores de una respuesta tipo TH2) fueron generadas para diferentes antígenos independientemente de si la dosis fue alta o baja (variando desde 300 µg de CVPs hasta 2 µg) fueron utilizadas en el protocolo de inmunización. De este modo, una ventaja adicional de las características inmunomoduladoras del CPMV como un sistema portador fue la cantidad más baja de material que se requirió para producir un tipo deseado de respuesta. F.I F MP I f> fi CPVs producen una respuesta tipo TH1 ya sea presentada parenteralmente o mucosalmente que indica que el método para la administración de partículas no afecta la naturaleza de la respuesta inmune que fue estimulada Ratones NIH fueron inmunizados intranasalmente con CPMV- PARVO9, una CVP que presenta un péptido derivado de la proteína VPS def parvovirus canino. No se usó adyuvante para esta inoculación -_._. ___— m-j-t-, ^a-ite----J-a>->aB aÉ*--*-1"---t- -^^^iri-l »"? f i- --»-» -*-.-•_ i. I i-W-JÉ-JJ-MÉt directamente sobre la superficie de la mucosa (ver Tabla 3, fila 3). Dos dosis conteniendo cada una 100 µg de CVP se administraron los días 0 y el día 14. En el día 42 se recolectó sangre esencialmente como se describe anteriormente y se probó para determinar la presencia de subclases de inmunoglobulinas específicas para péptidos de PARVO9 (Tabla 3; anterior, grupo 4). La concentración de anticuerpo específico para péptido (VP2) se expresó como un porcentaje del anticuerpo total de cada uno de los cuatro isotipos dentro de los ratones individuales como se muestra en la Tabla 4. También, los valores del porcentaje medio para cada uno de los cuatro isotipos se muestra en la Tabla 4. Tabla 4. Concentración relativa de los isotipos IgG específicos para péptido y totales en ratones inmunizados con CVP Concentración Concentración % de isotipo media de isotipo media de isotipo específico para total (µg /ml) específico de péptido de la péptido (µg /ml) concentración de isotipo total IgGi 94.5+40.7 <0.004 |i.a <0.004 % loG 22- 1 35.0+9.7 8.9+3.9 µa 6.6 % laG 2__ 96.5+17.9 4.7)ia3.1 + 4.9 % IgG. 44.0+14.3 <0 004 µ? <0.004 % Aunque se detectaron altos niveles de Igd e lgG3 totales (los cuales fueron casi exclusivamente específicos para CPMV) las concentraciones totales de lgG2a e lgG2b fueron también altas. Además, proporciones significativas fueron específicas de péptido (Tabla 4, anterior), destacando de nuevo la desviación en la respuesta hacia el tipo «_tefcA-.-^-_^-t~------^^ TH1 y el hecho de que esta respuesta puede ser producida independientemente de la ruta de administración del antígeno presentado en los CPMV. F.IFMPI O 7 Uso de complejo inmunogénico que contiene partículas de virus quimérico para alterar la naturaleza de una respuesta inmune existente Hay situaciones en las cuales se presentan antígenos particulares como vacunas en presencia de adyuvantes que producen una respuesta tipo TH2 predominantemente. Sin duda, la aprobación hasta la fecha de solamente alum (el cual produce una respuesta inmune tipo TH2 predominantemente) como un adyuvante que se considera seguro para aplicaciones de vacunas humanas indica que muchas vacunas estarán disponibles que contendrán a priori un factor que produce una respuesta inmune tipo TH2 con efectos colaterales adversos. Esto da énfasis a la necesidad de la ¡nmunomodulación de una respuesta hacia la ruta TH1 y alejarse de la ruta TH2 inducida en esta circunstancia. Ya que muchas vacunas requieren inoculaciones múltiples para ser efectivas, es posible dirigir el problema de alterar una respuesta TH2 (es decir asociada con un péptido dado en una vacuna de subunidad) a favor de la respuesta tipo TH1 mediante reforzar la respuesta inicial con una formulación que contiene péptido presentado con CPMV. La fuerza de la dominación inmunomoduladora de la plataforma CPMV desvía el potencial de la ruta TH2 del adyuvante, al mismo tiempo que todavía logra el refuerzo requerido de la respuesta inmune al péptido en cuestión. Para demostrar esto, los ratones se inmunizaron con proteína MAST1 (Tabla 1 ) en presencia de alum y/o adyuvante QS21 para inducir una respuesta TH2 como se determina por los niveles de IgG específicos de proteína. Los ratones de prueba se inmunizaron posteriormente con CPMV-MAST1 , con ratones de control que no recibieron inmunización posterior. Los niveles de IgG en los ratones de prueba y de control se determinaron como se describió anteriormente. Un aumento en la proporción de lgG 1 : lgG2a, lgG3: lgG2a, lgG 1 : lgG2b, y/o lgG3/lgG2b específicos de péptido en los animales de prueba en relación con los animales de control demuestra que los virus quiméricos de la invención supera a la respuesta TH2 la cual se induce por el adyuvante en la inmunización primaria. EJEMPLO 8 El uso de partículas de virus CPMV diseñadas técnicamente para expresar y presentar químicamente péptidos reactivos para conjugar fracciones proteináceas inmunogénicas conjugadas y no proteináceas, especialmente fracciones de carbohidratos Los desoxirribonucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos con la fórmula DEGKGKGKGKDE (SEQ ID NO:29) se clonan en el vector pCP2 correspondiente a una copia de ADNc de la molécula de ARN2 del virus de mosaico de alverjón. La inserción se hace de manera que el péptido reactivo se inserta en el ciclo ßB-ßC de VP-2 (la más pequeña de las dos proteínas de recubrimiento del virus CPMV) entre la alanina 22 y prolina 23 como se describió anteriormente (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,958,422 y 5,874,087; cada uno se incorpora en su totalidad para referencia). Los carbohidratos ?--t-fe-----j-_-aÍ ._--.--«-__ jfcjfej t, - I m ¬ purificados se conjugan químicamente con residuos de lisina reactivos en el péptido y las CVP conjugadas por carbohidratos resultantes se purifican mediante cromatografía por afinidad usando por ejemplo, un anticuerpo específico para carbohidrato, o mediante cromatografía por celulosa DEAE. Las CVP conjugadas con carbohidratos se inoculan en los ratones siguiendo esencialmente el mismo régimen de inmunización como se describe en los ejemplos 2 y 3 anteriores. Los sangrados de cola se tomaron en el día 42 y los sueros se probaron para determinar subclases de IgG específicas para el carbohidrato. Se dio un predominio de subclases de IgG compuesta a TH1 consistentes con el dominio inmunomodulador del CPMV. EJEMPLO 9 CVPs iniciaron predominantemente células B que producen IgG?a e lgG2b específicas para CPMV y péptido en el bazo como se determinó mediante ELISPOT Las células del bazo de CPMV-MAST1 (Tabla 3, fila 10) en ratones inmunizados con QS-21 se combinaron y los glóbulos rojos se removieron mediante lisis en frío en 0.8% de NH4CI. Las células se lavaron dos veces con RPMI 1640, se contaron y se volvieron a suspender en concentraciones ya sea de 5 x 106, 5 x 10s, o 5 x 104 células viables/mililitro. Cada suspensión celular (100 µl/pozo) se añadió a los pozos de placas de 96 pozos Multiscreen Immobilon IP (Millipore, Ontario, Canadá) los cuales fueron pre-recubiertos durante la noche a 4°C ya sea con péptido CPMV o FnBP en regulador de carbonato estéril, pH 9.6 y se bloquearon con RPM1 1640 que contenía 10% de FCS durante una hora a _É-»---_-l- 37°C. Los pozos con control negativo se recubrieron solamente con regulador o con un péptido de control irrelevante. Las células se incubaron sobre las placas durante 20 horas a 37°C y luego se lavaron tres veces con PBS. El anticuerpo de enlace se detectó con la Igd , lgG2a, lgG2b, o igG3 anti-ratón de cabra conjugado con (AP) fosfatasa alcalina, (Southern Biotechnologies Inc). Después de dos horas a 37°C, las placas se lavaron cuatro veces con PBST y se añadió estreptavidina- peroxidasa (10 µl /pozo) durante 30 minutos a 37°C. Después de lavarlo con PBST se añadió sustrato de FAST™ DAB (tetraclorhidrato de 3,3'- diaminobenzidina) (100 µl /pozo) hasta que se desarrolló la intensidad de color máximo. Las placas se lavaron generosamente con agua de ia llave, se secaron durante 30 minutos a 37°C, y se contaron las manchas usando un microscopio de disección (Nikon SMZ-1 ). Los resultados fueron expresados como células que formaron manchas medias (SFC) por 106 células del bazo (SFC/1 06 células del bazo). SD± tanto para CPMV como el péptido, como se muestra en la Tabla 5. Tabla 5. CVPs iniciaron predominantemente células B que producen lgG2a e lgG2b específicas para CPMV y específicas para péptido en el bazo Ratones C57BL/6 fueron inmunizados subcutáneamente con CPMV- MAST1 en QS-21 (Tabla 3, fila 10). El suero se recolectó el día 42 y se examinó para determinar IgGi , lgG2a, lgG2b o lgG3 específico para CPMV- y FnBP mediante ELISA. Los títulos se expresaron como la titulación de punto extremo de la media geométrica+SD. Las células del bazo se combinaron y se examinaron para determinar la presencia de SFC que produce IgGi , lgG2a, IgG.b o lgG3 específico para CPMV y FnBP mediante ELISPOT. Los resultados se expresaron como el número de mediar hermética de SFC/106 células de bazo±SD.

El análisis ELISPOT de inmunoglobulinas producido por CPMV-MAST1 en QS21 mostró similarmente altos números de lgG2a e IgG.b células que forman manchas en los bazos de ratones inmunizados en contraste con los números mucho menores de SFC Igd , lgG3 (Tabla 5). Estos fueron aproximadamente titulaciones cuatro veces más altas de anticuerpo lgG2a e lgG2b específico para CPMV y SFC comparadas con anticuerpos y SFC específicos para péptido (FnBP) en estos ratones (Tabla 5). De manera interesante, aunque los niveles de lgG2a e IgG.b específicos para SFC en sueros fueron muy similares, números mucho más altos de SFC que producen lgG2a que SFC que producen IgG.b se detectaron en el bazo mediante ELISPOT (Tabla 5), lo que sugiere que CPMV-MAST1 inició un número mayor de células B que producen lgG2a específicos de FnBP. De este modo, ratones C57BL/6 inmunizados con CPM-MAST1 produjeron concentraciones muy altas de lgG2a e IgG.b especifico para CPMV predominantemente en suero, con niveles menores pero significativos de Igd e lgG3 específicos para CPMV (Tabla 5). -í ?y?Ki g?U l-<_M-<MI «-M--c -----?_<--- F.I F MPI n i n Células T específicas para CPMV en el bazo iniciadas por CVPs se proliferan para producir IFN-? (una citocina asociada con TH1 ), no IL-4 (una citocina asociada con TH2) Los bazos de ratones inmunizados con CVPs se removieron 42 días después de la inmunización primaria y se hicieron suspensiones de una sola célula. Después del lavado y lisis de glóbulos rojos con NH4CI al 0.85% enfriado con hielo, los esplenocitos de 5 ratones se cultivaron y se dosificaron en placas de 96 pozos con fondo redondo (2 x 105/100 µl; Nunclon Delta Surface, Nunc, Dinamarca) en medio RPMI 1040 (Gibco, Paisley, RU) que contenía 1 mM L-glutamina, 10 mM de penicilina/estreptomicina y 10% de suero de becerro fetal (FCS). Las células se cultivaron con 2.5 µg/ml de concanavalma A (ConA, Sigma) o CPMV tipo natural (50 o 5 µg/ml) durante 5 días a 37°C en 5% de CO2. Las últimas 12 horas de cultivo 0.5 µCi/pozo de (metil-3H) timidina (Amersham Life Science) se añadieron. Las células se cosecharon sobre esteras de filtro (Wallac Oy, Turku, Finlandia) y la incorporación de etiqueta medida usando un contador de cintilación y luminiscencia líquida Microbeta Trilux 1450 (Wallac). Los datos se expresaron como índices de estimulación, en donde las cuentas por minuto en presencia de adyuvante se dividieron entre las cuentas medidas en ausencia de antígeno (solamente medio). Un valor de 3 o mayor se consideró significativo. Las células de bazos de ratón inmunizado con CPMV-MAST1 proliferaron muy fuertemente in vitro con estimulación con todavía concentraciones más bajas (5 µg/ml) de CPMV, indicando una inducción de células T muy t<t?fc_tr rt--t - T ftrirr - — - ...-_»-_-. ---..- .. ^¡¡J[|ri_.4dt-.-a..-...zS.c.-..r<.a <kt??, „_,.__ „ — ,_l.?m,,_li.,l.-- _. „_-_,._.,j,i * % - 119 específicas mediadas por el portador péptido. Las células de bazo combinadas se cultivaron subsecuentemente solas o ya sea ConA (2.5 µg/ml) o CPMV del tipo natural (50 o 5 µg/ml) en placas de 24 pozos (5 x 106/pozo en volumen de 5 2 ml). Después de 48 horas, 0.5 ml de sobrenadante de cultivo celular se recolectó en tubos de Eppendorf y se almacenó a -80°C. Los sobrenadantes se probaron para determinar la presencia tanto de IFN-? e IL-4 mediante ELISA esencialmente como se describió anteriormente. Brevemente, placas de ELISA de 96 pozos (lmmulon-4) se recubrieron 10 durante la noche con 2 µg/pozo ya sea de IFN-? anti-ratón de anticuerpo mAb de rata o IL-4-antiratón mAb de rata (ambos Pharmingen, San Diego, CA) a 4°C. Después de bloquear las placas con PBS que contenía 0.05% de Tween y 5% de BSA, diluciones en serie de sobrenadante de cultivo de célula de bazo de ratón se añadieron a los pozos. Como controles, 15 diluciones de IFN-? de ratón recombinante e IL-4 (Pharmingen), iniciando en 4 ng/ml y 15 ng/ml para IL-4 e IFN-?, respectivamente, se añadieron. Después de una hora a 37°C, la citocina enlazada se detectó usando IFN-? anti-ratón de rata biotinilada o mAbs de anti-IL-4 (ambos Pharmingen) durante una hora a 37°C. Estos mAbs reconocieron diferentes epítopes 20 sobre IFN-? e IL-4 que mAbs usados para el paso de captura anterior en el procedimiento. Se añadió peroxidasa de estreptavidina (Sigma; 2 µg/ml) durante 30 minutos a 37°C seguido por sustrato de 0-fenilenodiamina (OPD) (1 mg/ml). Después de 30 minutos a 37°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl/pozo 2.5 MH2SO4 y la absorbancia se leyó a 5 492 nm usando un lector de placa Anthos HT II ELISA automatizado. Los Jaa-jt-,1 * 120 - resultados se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. CPMV estimula la proliferación y la producción de citocina mediante las células de bazo del fenotipo TH1 (A) (B) a Ratones C57BL/6 se inmunizaron subcutáneamente con CPMV-MAST1 en QS-21 (Tabla 3, fila 10). Las células del bazo de estos ratones (A) y de ratones no inmunizados (B) se mezclaron y cultivaron durante 5 días ya sea solas o con 2.5 microgramos/mililitro o 50 microgramos/mililitro de CPMV. La proliferación de células T se expresa tanto como la media de CPM±SD3 y Slb. d Los sobrenadantes de estos cultivos también se examinaron para determinar la presencia de proteína IFN-?° e IL-4d mediante ELISA. Los resultados se expresaron como la media aritmética ng/ml±SD (NT = no probados). Los sobrenadantes de estas células proliferantes se mostró que contenían altos niveles de IFN-? y niveles bajos o no detectables de IL-4 (Tabla 6A). Los ratones no inmunizados en comparación no contenía anticuerpo específico para CPMV o SFC (no mostrado) y no proliferaron, ni produjeron IFN-? o IL-4 como respuesta al estímulo por CPMV (Tabla 6B). FJFMPLO 11 Conjugación de péptidos En este ejemplo, un virus de planta quimérica de acuerdo con la invención se diseñó técnicamente para expresar un péptido reactivo que contiene un residuo de cisteína y el cual es capaz de conjugarse con cualquier péptido que ha sido activado usando éster n-maleimidobenzoil- N-hidroxisuccinimida ("MBS" disponible de Pierce). Los desoxirribonucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos con la fórmula Arg-Glu-Arg-Glu-His-Cys (SEQ ID NO:30) se clonaron en el vector pCP2 correspondiente a una copia de ADNc de la molécula de ARN2 del virus de mosaico de alverjón. La inserción se hace de manera que el péptido reactivo se inserta en el ciclo ßB-ßC de VP-S (la más pequeña de las dos proteínas recubiertas con el virus de CPMV) entre alanina 22 y prolina 23 como se describió previamente (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica números 5,958,422 y 5,874,087; cada una se incorpora en su totalidad para referencia). La molécula de proteína de interés que se busca que se conjugue con el virus de planta de la invención se activa usando MBS como sigue. La proteína se disuelve en regulador (por ejemplo, 0.01 M NaPO , pH 7.0) a una concentración final de aproximadamente 20 mg/mililitro. Al mismo tiempo, MBS se disuelve en N, N-dimetil formamida a una concentración de 5 mg/ml. La solución de MBS, 0.51 ml, se añade ¡?ét?tíuá^?^»-u^,'--?¡^tiJ^..jt^^ií áug ü-ií?,i^^ m . * 122 - a 3.25 ml de la solución de proteínas y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación cada 5 minutos. La proteína activada con MBS resultante se purifica mediante cromatografía sobre una columna Bio-Gel P-10 (Bio-Rad; volumen del lecho de 40 ml) equilibrado con regulador 50 mM NaPO , pH 7.0. Las fracciones pico se depositaron (6.0 ml). Los virus de plantas quiméricas que expresan Arg-Glu-Arg- Glu-His-Cys (20 mg) se añadieron a la solución de proteína activada MBS, se agitaron hasta que el péptido se disolvió y se incubaron 3 horas a temperatura ambiente. Dentro de 20 minutos, la mezcla de la reacción se volvió turbia y se formaron precipitados. Después de 3 horas, la mezcla de la reacción se centrifugó a 10,000 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se analizó para determinar el contenido de proteínas. El precipitado conjugado se lavó tres veces con PBS y se almacenó a 4°C. Las CVPs conjugadas de proteína purificada resultante se inoculó en los ratones siguiendo esencialmente el mismo régimen de inmunización que se describió en los ejemplos 2 y 3 anteriores. Se tomaron sangrados de la cola en el día 42 y se probaron los sueros para subclases de IgG específicas para el carbohidrato. Se dio un predominio de subclases de IgG con respecto a TH 1 consistente con la dominación inmunomoduladora de CPMV. A partir de lo anterior, es claro que la invención proporciona métodos y composiciones que son efectivas para modular la naturaleza y/o el nivel de una respuesta inmune a cualquier molécula de interés ejemplificado por, pero sin limitarse a, un antígeno o inmunógeno. En ^? ?ili s?iÉiÉ MÉll¿á^ íiá^tí^ * * * 123 particular, los datos presentados en la presente demuestran que la invención proporciona métodos y medios para efectuar una desviación TH1 en la respuesta inmune a las moléculas tales como antígenos o inmunógenos, y/o reducir la desviación TH2 en la respuesta inmune a 5 estas moléculas. Más particularmente, lo anterior muestra que la invención proporciona métodos y medios para aumentar una respuesta inmune TH1 la cual se dirige contra moléculas que de otro modo generalmente simulan una respuesta tipo TH2. De lo anterior, también es evidente que la invención además proporciona composiciones y métodos 0 para reducir la respuesta inmune TH2 de las moléculas. Lo anterior adicionalmente muestra que la invención proporciona composiciones y métodos para alterar (es decir, aumentar o disminuir) el nivel de inmunoglobulinas asociadas con TH1 y TH2, el nivel de proliferación de citocinas asociadas con TH1 y TH2, y el nivel de proliferación de células 5 TH1 y TH2. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporaron en la presente mediante referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistemas de la invención serán aparentes para los expertos en la técnica 0 sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con una modalidad preferida específica, deberá entenderse que la invención como se reclama no deberá indudablemente limitarse a esta modalidad específica. Sin duda, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención los cuales fueron 5 obvios para los expertos en la técnica y en los campos relacionados aJ _-._- ...*r_«-JÍ-Í-tJ_-_-_, -__sl_-_A,_-.< mismo pretendieron estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Los siguientes vectores virales de plantas útiles están en depósito en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD., EUA, bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósitos de Micro-organismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes y Regulaciones bajo el mismo: pTB2 (ATCC número 75280) y pTBU5 (ATCC número 75281 ). Los detalles de construcción para estos plásmidos se presentan en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,589,367 incorporada en la presente mediante referencia.

I?^-t---i _-.-.._-.-.....-- f.^_>i3_._-«__ É______^iU_______________L______b LISTADO DE SECUENCIAS <110> Br«-riñan, Fr-_alc <120> VIRUS DE PLANTA MODIFICADOS Y MÉTODOS PARA SU USO <130> DOW-04660 <1S0S- GB9924351.1 <151 1999-10-14 <160 30 <170> patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT «2i3> Artificial/Desconocido <220 <22i misc_caracterísitica <222- {) .. () 223 Sintético <400> 1 Asp Asp Asp ?sp 1 <2"!0> 2 <211> 5 <212> PRT <2i3> Artificial/Desconocido <22D> <22i> misc_caracterísitica <222> () .. () '"3> Sintético <400> 2 Lys Lys r_ys Lys Lys 1 s <210> 3 <211> 5 <212> PRT <2i3> Artificial/Desconocido <220 <221> lsc_caracteristica <222> () .. () <223> Sintética <400> 3 <210> 4 0 <211> 4 <212> PRT <2i3> Artificial/Desconocido <220> < 22 X > mlsc_caracteristlca <222> <) ..() 5 <223> Sintético <400> 4 Arg Arg His Lys 1 <210> 5 <2Xl- 4 <212> PRT 0 <2i3> Artificial/Desconocido <220> <221> mlsc_característica <222> () .. 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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un proceso para aumentar el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a una molécula de interés en un animal, que comprende: a) proporcionar: i) dicha molécula de interés; ii) un virus de planta que expresa un péptido heterólogo capaz de conjugarse con dicha molécula de interés; y iii) un animal huésped; b) conjugar dicha molécula de interés con dicho péptido heterólogo para generar un conjugado; c) administrar dicho conjugado con dicho animal huésped para generar un animal tratado bajo condiciones de manera que el nivel de respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado aumente en relación con el nivel de la respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en un animal de control; d) opcionalmente probar un incremento en el nivel de la respuesta inmune TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado en relación con el nivel de la respuesta inmune tipo TH1 con dicha molécula de interés en un animal de control; y e) opcionalmente observar un aumento en el nivel de la respuesta inmune tipo TH1 a dicha molécula de interés en dicho animal tratado en relación con el nivel de la respuesta inmune tipo TH1 con dicha molécula de interés en un animal de control. 2. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho nivel aumentado de la respuesta inmune tipo TH1 se selecciona entre (a) nivel aumentado de inmunoglobulina asociada con TH1 en dicho animal tratado en relación con el nivel de inmunoglobulina asociada con TH1 en un animal de control, (b) nivel aumentado de proliferación de las células TH1 de dicho animal tratado en relación con el nivel de proliferación de células TH1 de un animal de control, y (c) nivel aumentado de citocina asociada con TH1 en dicho animal tratado en relación con el nivel de citocina asociada con TH1 en un animal de control. 3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dicha citocina asociada con TH1 se selecciona de IL-2, TNF-ß e IFN-?. 4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque dicha administración da como resultado la reducción de los síntomas asociados con exposición de dicho animal huésped a dicha molécula de interés. 5. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque dicha molécula de interés comprende un péptido, polisacárido, ácido nucleico, o lípido. 6. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, caracterizado porque dicha molécula de interés se deriva de una fuente seleccionada de un patógeno animal, un alérgeno, y una célula de cáncer. 7. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, caracterizado porque dicho virus de planta es un virus de planta icosahédrico seleccionado de Comovirus, Tombusvirus, Sobemovirus, y Nepovirus. 8. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, caracterizado porque dicho virus de planta es un Comovirus. 9. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, caracterizado porque dicho Comovirus es virus de mosaico de alverjón (CPMV). 10. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, caracterizado porque dicho péptido heterólogo se expresa como una porción expuesta de la proteína de recubrimiento de dicho virus de planta. 1 1. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, caracterizado porque dicho péptido heterólogo comprende uno o más aminoácidos cargados seleccionados de aminoácidos cargados negativamente, aminoácidos cargados positivamente, caracterizado porque la carga negativa en dichos aminoácidos cargados negativamente se equilibra por la carga positiva en dichos aminoácidos cargados positivamente. 12. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11 , caracterizado porque dichos aminoácidos cargados negativamente se seleccionan de ácido aspártico, ácido glutámico, y cisteína, y dichos aminoácidos cargados positivamente se seleccionan de lisina, arginina, e histidina. 13. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 12, caracterizado porque dicho péptido heterólogo comprende una secuencia de aminoácidos contiguos cargados seleccionados de una primera secuencia que consiste en aminoácidos cargados negativamente contiguos y una segunda secuencia que consiste en aminoácidos cargados positivamente contiguos. 14. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, caracterizado porque dicha secuencia de aminoácidos cargados contiguos se presenta en dicho péptido heterólogo como una secuencia de repetición. 15. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, caracterizado porque dicha secuencia heteróloga comprende dicha primera y segunda secuencias, y caracterizado porque dicha primera secuencia es contigua con dicha segunda secuencia. 16. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15, caracterizado porque dicha primera y segunda secuencias contiguas se presentan en dicho péptido heterólogo como una secuencia de repetición. 17. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 , caracterizado porque dicho péptido heterólogo comprende aminoácidos cargados negativamente no contiguos y aminoácidos cargados positivamente no contiguos, y caracterizado porque dicho péptido heterólogo comprende además una secuencia de aminoácidos cargados contiguos seleccionada de una primera secuencia que consiste en aminoácidos cargados negativamente contiguos, y una segunda secuencia que consiste en aminoácidos cargados positivamente contiguos. 18. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, caracterizado porque dicha primera secuencia de aminoácidos __fc__»|t_a¡_^__-,.to,.__I,gt||m cargados negativamente contiguos tiene la fórmula general Asp-Glun-Gly- Lys2a-Asp-Glun enlistada como SEQ ID NO: 16, en donde n es un entero de 1 a 40. 19. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 18, caracterizado porque dicha administración se selecciona de intranasal, oral, parenteral, subcutánea, intratecal, intravenosa, intraperitoneal, y administración intramuscular. 20. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 19, caracterizado porque dicha administración comprende además administrar una composición seleccionada del adyuvante inmune, citocina, y excipiente farmacéutico. 21. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 20, caracterizado porque dicho animal huésped es un mamífero. 22. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 , caracterizado porque dicho mamífero se selecciona de ratón y humano. 23. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 22, caracterizado porque dicho conjugado es inmunogénico.