JP2003514775A - 修飾された植物ウイルス及びその使用方法 - Google Patents

修飾された植物ウイルス及びその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１つの分子に対する免疫応答の性質及び／又はレベルを調節することに関する。特に本発明は、抗原又は免疫原といったような（ただしこれらに制限されるわけではない）分子に対するＴＨ１免疫応答の増大をもたらすことに関する。本発明は同様に、分子に対するＴＨ２免疫応答を低減させることに関する。より特定的に言うと、本発明は、ＴＨ１及びＴＨ２関連免疫グロブリンレベル、ＴＨ１及びＴＨ２関連サイトカインの増殖レベル及びＴＨ１及びＴＨ２細胞の増殖レベルを改変することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、１つの分子に対する免疫応答の性質及び／又はレベルを調節するこ
とに関する。特に本発明は、抗原又は免疫原といったような（ただしこれらに制
限されるわけではない）分子に対するＴＨ１免疫応答の増大をもたらすことに関
する。本発明は同様に、分子に対するＴＨ２免疫応答を低減させることに関する
。より特定的に言うと、本発明は、ＴＨ１及びＴＨ２関連免疫グロブリンレベル
、ＴＨ１及びＴＨ２関連サイトカインの増殖レベル及びＴＨ１及びＴＨ２細胞の
増殖レベルを改変することに関する。
【０００２】 発明の背景 ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＨ２ではなくＴＨ１サブセットのプライミングは、ワクチ
ン設計においてきわめて重要なものである。これは、ＴＨ１細胞が、マクロファ
ージ及び細胞毒性Ｔ細胞活性化（ＣＴＬ）を媒介し、かつ細胞内微生物に対する
細胞媒介免疫性及び遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応の主要なエフェクタであるＩＬ
−２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−βサイトカインを産生するからである。ＩＦＮ−
γは同様に、マウスＩｇＧの主要エフェクタアイソタイプに対するＢ細胞アイソ
タイプクラススイッチングを誘発する。ＩｇＧ２ａそして（それよりはレベルは
低いが）ＩｇＧ２ｂは、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強させ、
食作用のため細胞又は抗体クラスタをオプソニン化する古典的補体活性化経路の
Ｃｌｑに強く結合する。例えば、マウスにおけるこれらのエフェクタ機能の結果
として、ＩｇＧ２ａは、ウイルス感染〔Ishizaka et al.(１９９５)J.Infect. D
is.１７２：１１０８〕、マウス腫瘍〔Kaminski et al.(１９８６)J. Immunol.
１３６：１１２３〕、及び寄生虫〔Wechsler et al.(１９８６)J. Immunol. １
３７：２９６８〕に対しマウスをより良く保護し、かつ細菌浄化を増強する〔Zi
gterman et al.（１９８９）Infect. Immun.５７：２７１２〕ことがわかってき
た。
【０００３】 これとは対照的に、ＴＨ２細胞は、細胞媒介免疫性を抑制するという望ましく
ない効果をもつＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生する〔Mo
ssman et al.（１９８６）J.immunol.１３６：２２４８〕。その上、ＩＬ−４は
、補体の固定度が低くＡＤＣＣを媒介しないＩｇＧサブクラスならびにマスト細
胞及び好塩基球に結合するＩｇＥの両方を産生するべくＢ細胞を誘発する。
【０００４】 先行技術では、ＴＨ細胞サブセットのプライミングが、使用される動物の系統
〔Hocart et al（１９８９）J. Gen. Virol.７０：２４３９〕、抗原の同一性、
抗原送達経路〔Hocart et al.(１９８９)J.Gen Virol ７０：８０９〕及び免疫
化投薬計画〔Brett et al.（１９９３）Immunology ８０：３０６〕の影響を受
けるということを認識した上で、ＴＨ１細胞の発生を方向づけすることによりワ
クチン設計を改善することが試みられてきた。
【０００５】 抗原特異的ＴＨ１応答を生成するための先行技術の１つのアプローチは、抗体
に対するマンナンの酸化／還元接合〔Apostopoulos et al.（１９９５）Proc. N
atl. Acad. Sci.USA ９２：１０１２８−１０１３２〕又は細菌タンパク質に対
するタンパク質の接合〔Jahn-Schmid et al.（１９９７）Intl. Immunol.９：１
８６７〕を使用することによるものであった。しかしながら、ＫＬＨ及び破傷風
トキソイドといったような一般的に使用される担体に対するカップリングでは、
往々にして、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比を増大させることはできない。
【０００６】 ＴＨ１応答を誘発するその他の方法としては、外来性アジュバント（例えばＩ
ＳＣＯＭＳ、ＱＳ２１、Ｑuil Ａ、など）といったような免疫調節作用物質の使
用が含まれる。しかしながら、人間に使用するよう現在承認されている唯一のア
ジュバントはミョウバンであるが、これは、比較的望ましいＴＨ１型の応答より
もむしろ望ましくないＴＨ２型の応答に有利に作用するものとして知られている
。
【０００７】 先行技術によって使用されてきたその他の免疫調節作用物質としては、ＣｐＧ
オリゴデオキシリボヌクレオチド〔Chu et al.（１９９７）J. Exp. Med.１８６
：１６２３〕又は免疫原性組成物に添加されて可溶性タンパク質抗原に対し向け
られた高レベルのＩｇＧ２ａの産生を導くことのできるインターロイキン−１２
といったようなサイトカイン（ＩＬ−１２、Scott et al.（１９９７）Seminl.
Immunol.９：２８５〕が含まれる。しかしながら、サイトカインの短かい半減期
及び多大なコストは、大規模なワクチン接種におけるそれらの利用を技術的にも
商業的にも魅力のないものにしている。
【０００８】 さらにもう１つのアプローチは、マウス体内でウイルス特異的ＩｇＧ２ａを優
位に生成するべく動物ウイルス生ワクチンを使用することであった。〔Hocart e
t al.(１９８９)J.Gen. Virol. ７０：８０９；Coutelier et al.（１９８７）J
. Exp. Med.１６５：６４；Nguyen et al.(１９９４)J. Immunol. １５２：４７
８；Brubaker et al.(１９９６)J. Immunol. １５７：１５９８〕。このアプロ
ーチにはいくつかの欠点がある。まず第１に、一部の生きたウイルスが、交互の
Ｔへルパー経路に特徴的なその他の免疫グロブリンアイソタイプの産生に有利に
作用することから、生ウイルスワクチンは、一貫してＴＨ１型免疫応答が得られ
る結果をもたらさない。〔Coutelier et al.（１９８７）J. Exp. Med.１６５：
６４；Perez-Filgueira et al.（１９９５）Vaccine １３：９５３〕。さらに、
かかる動物ウイルスワクチンは、設計及び運用コストが高い細胞培養システム内
で成長させられるウイルスから生産される。その上、ベクターとして用いられる
動物ウイルスは往々にして、動物がすでに露呈されてしまっている可能性があり
かつベクタに対する抗体をすでに産生しつつあるかもしれないウイルスである。
従ってベクターは、第２のウイルスの取込まれた抗原部位が免疫応答を誘発する
前に免疫系によって破壊される可能性がある。さらに、複合動物ウイルスアプロ
ーチには、突然変異が改変された感染性、抗原性及び／又は病原性をもつ新規な
形のウイルスを発生させ得る危険性のある、生きた動物感染性ウイルスの遺伝子
操作が関与する。実際、動物ウイルス生ワクチンの使用については安全性の問題
が存在する〔世界保健機構、１９８９〕。その上、動物ウイルス生ワクチンの使
用に関する安全性の問題は、不活性動物ウイルスが一般にＩｇＧ２ａ産生に有利
に作用しないことから、不活性動物ウイルスを用いることによって克服されない
。実際、それ自体生きたウイルスによって類型化される感染プロセスがＩＦＮ−
γを生成し、ＴＨ１応答免疫グロブリンの優位性を導くと考えられている〔Nguy
en et al.(１９９４）J. Immunol １５２：４７８〕。
【０００９】 もう１つのアプローチには、発現されたペプチドに対するＴＨ１応答の生成に
有利に作用する生きた細菌ベクター及びＤＮＡ免疫化の使用が関与しているが、
このアプローチは往々にして、使用されるアジュバント又はデリバリー経路のい
ずれかに左右されそれに対し敏感である。その上、生菌ワクチン及びＤＮＡワク
チンの使用に対する安全性の問題〔世界保健機構、１９８９〕がさらにそれらの
臨床的応用を制限している。
【００１０】 かくして、ＴＨ１型応答を生成する組成物及び方法に対するニーズが存在する
。好ましくは、これらの組成物及び方法によるＴＨ１型応答の生成は、宿主動物
の遺伝的背景、抗原の同一性、抗原送達経路及び免疫化投薬計画による影響を受
けない。
【００１１】 発明の要約 本発明は、抗原又は免疫原により（ただしこれらに制限されるわけではない）
例示される１つの分子に対する免疫応答の性質及び／又はレベルを調節する上で
有効である方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、抗原又は免疫原といっ
たような分子に対する免疫応答においてＴＨ１バイアスをもたらし かつ／又は
かかる分子に対する免疫応答においてＴＨ２バイアスを低減させるための方法及
び手段を提供する。より特定的には、本発明は、そうでなければ一般にＴＨ２型
応答を刺激する分子に対して導かれるＴ１免疫応答を増大させるための方法及び
手段を提供する。本発明はさらに、分子に対するＴＨ２免疫応答を低減させるた
めの組成物及び方法を提供する。さらに本書において提供されているのは、ＴＨ
１及びＴＨ２関連免疫グロブリンのレベル、ＴＨ１及びＴＨ２関連サイトカイン
の増殖レベル及びＴＨ１及びＴＨ２細胞の増殖レベルを改変する（すなわち増減
させる）ための組成物及び方法である。
【００１２】 より特定的に言うと、本発明は、動物の体内でＴＨ１関連免疫グロブリンのレ
ベルを改変する方法において、 ａ） ｉ） 異種ペプチドを含有する植物ウイルス及び ｉｉ） 宿主動物を提供する段階；ｂ） 治療動物を生成するべく宿主動物に対
し植物ウイルスを投与する段階、ｃ） 対照動物の体内でＴＨ１関連免疫グロブ
リンレベルとの関係における治療動物内のＴＨ１関連免疫グロブリンレベルの増
大をテストする段階を含んで成る方法を提供する。１実施形態においては、該方
法はさらに、ｄ） 治療動物の体内でのＴＨ１関連免疫グロブリンのレベルの増
大を観察する段階を含んで成る。本発明をいずれかの特定の投与経路に制限する
ことを意図せずに、もう１つの実施形態では、投与は、鼻腔内、経口、中心静脈
内、皮下、髄腔内、末梢静脈内、腹腔内及び筋内投与の中から選択されている。
同様に、本発明をそのウイルスの投与に内含される組成物のタイプ又はその供給
源に制限することなく、さらにもう１つの実施形態においては、投与は、免疫ア
ジュバント、サイトカイン及び薬学賦形剤の中から選択された組成物を投与する
段階をさらに含んで成る。さらにもう１つの実施形態においては、投与の結果、
異種ペプチドに対する宿主動物の露呈に付随する症候が低減される。
【００１３】 本発明を宿主動物のいずれか特定のタイプに制限することが意図されるわけで
はないが、さらにもう１つの実施形態においては、宿主動物は哺乳動物である。
本発明をいずれかの特定の哺乳動物に制限することは意図されていない。しかし
ながら、好ましい実施形態においては、哺乳動物はマウス及びヒトから選択され
る。さらに好ましい実施形態においては、宿主動物はマウスであり、ＴＨ１関連
免疫グロブリンはＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの中から選択される。さらに一層好
ましい実施形態においては、ＴＨ１関連免疫グロブリンがＩｇＧ２ａである。も
う１つの好ましい実施形態においては、宿主動物はヒトであり、ＴＨ１関連免疫
グロブリンはＩｇＧ１及びＩｇＧ３の中から選択される。
【００１４】 ＴＨ１関連免疫グロブリンの特異性を制限することなく、１変形形態において
は、ＴＨ１関連免疫グロブリンは、異種ペプチドに特異的な免疫グロブリン及び
植物ウイルスに特異的な免疫グロブリンの中から選択される。もう１つの変形実
施形態においては、植物ウイルスは、ＲＮＡウイルスである。さらなる変形実施
形態においては、植物ウイルスは、コモウイルス、トンブスウイルス、ソベモウ
イルス及び線虫媒介球状ウイルスの中から選択された正二十面体植物ウイルスで
ある。さらに好ましい実施形態においては、コモウイルスは、カウピーモザイク
ウイルス（ＣＰＭＶ）である。
【００１５】 本発明は、いずれかの特定の供給源又はタイプの異種ペプチドに制限されるわ
けではないが、付加的な変形実施形態においては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
ヒト膜結合性ＩｇＥ、ヒト突然変異体表皮成長因子レセプタ変異体ＩＩＩ、イヌ
パルボウイルス、ペプチドホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アレルゲン
、ガン細胞由来のペプチド、及び動物病原体由来のペプチドの中から選択される
。
【００１６】 本発明は、異種ペプチドが発現されるウイルス上の場所に制限されるよう意図
されているものではない。しかしながら、さらにもう１つの変形実施形態におい
ては、異種ペプチドは、植物ウイルスの外皮タンパク質の露呈された部分におい
て発現される。好ましい実施形態においては、外皮タンパク質は、ベータ−バレ
ル構造をもち、異種ペプチドは、ベータ−バレル構造のベータシートの個々のス
トランド間のループ内に挿入される。より好ましい実施形態においては、異種ペ
プチドは、植物ウイルスのβＢ−ＢＣループ内に挿入される。もう１つの好まし
い実施形態においては、異種ペプチドは、カウピーモザイクウイルスの小型外皮
タンパク質（ＶＰ−Ｓ）のアニリン２２とプロリン２３の間に挿入される。もう
１つの実施形態においては、異種ペプチドをコードする核酸配列が、核酸配列を
フランキングする直接的ヌクレオチド配列反復を含まない部位で植物ウイルスゲ
ノム内に挿入される。
【００１７】 本発明が異種ペプチドのタイプに制限されることは考慮されていない。しかし
ながら、さらにもう１つの実施形態においては、異種ペプチドは抗原性である。
好ましい実施形態においては、異種ペプチドは動物のウイルスに由来する。さら
に好ましい実施形態においては、動物ウイルスは、口蹄疫ウイルス、ヒト免疫不
全症ウイルス、ヒトライノウイルス、イヌパルボウイルスの中から選択される。
代替的な好ましい実施形態においては、異種ペプチドは、動物病原体、ホルモン
及びサイトカインに由来する。より好ましい実施形態においては、動物病原体は
、ウイルス、細菌、原生動物、線虫及び真菌の中から選択される。さらにもう１
つの実施形態においては、異種ペプチドは免疫原生である。本発明はさらに、動
物の体内でのＴＨ１細胞の増殖レベルを改変する方法において、ａ）ｉ）異種ペ
プチドを含む植物ウイルス及び ｉｉ）宿主動物を提供する段階； ｂ）宿主動
物に該植物ウイルスを投与して治療動物を生成する段階；及び ｃ）対照動物か
らのＴＨ１細胞の増殖レベルとの関係における治療動物からのＴＨ１細胞の増殖
レベルの増大についてテストする段階を含んで成る方法を提供する。１つの実施
形態においては、該方法はさらに、対照動物からのＴＨ１細胞の増殖レベルとの
関係における治療動物からのＴＨ１細胞の増殖レベルの増大を観察する段階を含
んで成る。もう１つの実施形態においては、投与の結果、異種ペプチドに対する
宿主動物の露呈に付随する症候が低減される。
【００１８】 同様に本書で提供されているのは、動物の体内でのＴＨ１関連サイトカインの
レベルを改変する方法において、ａ）ｉ）異種ペプチドを含む植物ウイルス及び
ｉｉ）宿主動物を提供する段階； ｂ）宿主動物に該植物ウイルスを投与して
治療動物を生成する段階；及び ｃ）対照動物からのＴ細胞により産生されたサ
イトカインのレベルとの関係における治療動物からのＴ細胞により産生されたサ
イトカインのレベルの増大についてテストする段階を含んで成る方法である。１
つの実施形態においては、該方法はさらに、対照動物からのＴ細胞により産生さ
れたサイトカインのレベルとの関係における治療動物からのＴ細胞により産生さ
れたサイトカインのレベルの増大を観察する段階を含んで成る。もう１つの実施
形態においては、投与の結果、異種ペプチドに対する宿主動物の露呈に付随する
症候が低減される。さらにもう１つの実施形態においては、サイトカインは、Ｉ
Ｌ−２、ＴＮＦ−β及びＩＮＦ−γから選択される。好ましい実施形態において
は、サイトカインはＩＮＦ−γである。さらなる実施形態においては、治療動物
体内のＴＨ−２関連サイトカインのレベルは、宿主動物体内の第２のサイトカイ
ンのレベルと同じである。好ましい実施形態においては、第２のサイトカインは
、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３の中から選択される
。より好ましい実施形態においては、第２のサイトカインはＩＬ−４である。付
加的な実施形態においては、治療動物体内のＴＨ−２関連サイトカインのレベル
は、宿主動物体内の第２のサイトカインのレベルとの関係において低減される。
本発明はさらに、動物体内の問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答のレベルを増
大させる方法において、ａ）ｉ）問題の分子；ｉｉ）問題の分子に対し接合する
能力をもつ異種ペプチドを発現する植物ウイルス；及びｉｉｉ）宿主動物を提供
する段階；ｂ）接合体を生成するべく異種ペプチドに対し問題の分子を接合させ
る段階；及びｃ）治療動物の体内での前記分子に対するＴＨ１型免疫応答レベル
が対照動物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルに比べ増
大することになるような条件下で該治療動物を生成するべく前記宿主動物に対し
前記接合体を投与する段階、を含んで成る方法を提供している。１実施形態にお
いては、該方法は、さらに、ｄ）対照動物の体内での問題の分子に対するＴＨ１
型免疫応答レベルとの関係における治療動物体内の問題の分子に対するＴＨ１型
免疫応答レベルの増大についてテストする段階、を含んで成る。好ましい実施形
態おいては、本発明はさらに、ｅ）対照動物の体内での問題の分子に対するＴＨ
１型免疫応答レベルとの関係における治療動物の体内での問題の分子に対するＴ
Ｈ１型免疫応答レベルの増大を観察する段階、を含んで成る。
【００１９】 増大したＴＨ１型免疫応答レベルの性質又は範囲を制限しないものの、もう１
つの好ましい実施形態おいては、増大したＴＨ１型免疫応答レベルは、（ａ）対
照動物の体内でのＴＨ１関連免疫グロブリンレベルとの関係における治療動物の
体内での増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレベル、（ｂ） 対照動物からのＴ
Ｈ１細胞の増殖レベルとの関係における治療動物からのＴＨ１細胞の増大した増
殖レベル、及び（ｃ） 対照動物の体内でのＴＨ１関連サイトカインレベルとの
関係における治療動物の体内での増大したＴＨ１関連サイトカインレベル、の中
から選択される。もう１つの実施形態おいては、ＴＨ１関連サイトカインは、Ｉ
Ｌ−２、ＴＮＦ−β及びＩＦＮ−γの中から選択される。さらにもう１つの実施
形態おいては、投与は、問題の分子に対する宿主動物の露呈に付随する症候の低
減を結果としてもたらす。１変形実施形態においては、問題の分子はペプチド、
多糖類、核酸又は脂質を含んで成る。好ましい実施形態においては、問題の分子
は、動物病原体、アレルゲン及びガン細胞の中から選択された供給源に由来する
。
【００２０】 本発明をウイルスの該タイプ又は性質に制限することは意図されていない。し
かしながら、もう１つの変形実施形態においては、植物ウイルスは、コモウイル
ス、トンブスウイルス、ソベモウイルス及び線虫媒介球状ウイルスの中から選択
された正二十面体植物ウイルスである。好ましい実施形態においては、植物ウイ
ルスは、コモウイルスである。より好ましい実施形態においては、コモウイルス
は、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）である。
【００２１】 ウイルス内への異種ペプチドの導入場所を制限することは意図されていないが
、異種ペプチドは、カウピーモザイクウイルスの小型外皮タンパク質（ＶＰ−Ｓ
）のアラニン２２とプロリン２３の間に挿入される。さらなる変形実施形態にお
いては、異種ペプチドは、植物ウイルスの外被タンパク質の露呈部分において発
現される。
【００２２】 本発明は、異種ペプチドの該性質又はタイプに制限されない。それでも、付加
的な変形実施形態においては、異種ペプチドは、負に帯電したアミノ酸、正に帯
電したアミノ酸の中から選択された単数又は複数の荷電アミノ酸を含んで成り、
負に帯電したアミノ酸上の負の電荷は、正に帯電したアミノ酸上の正の電荷によ
って平衡化されている。好ましい１実施形態においては、負に帯電したアミノ酸
は、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステインの中から選択されている。も
う１つの好ましい実施形態においては、正に帯電したアミノ酸はリシン、アルギ
ニン及びヒスチジンの中から選択されている。さらに好ましい実施形態において
は、異種ペプチドは、隣接する負に帯電したアミノ酸から成る第１の配列及び隣
接する正に帯電したアミノ酸から成る第２の配列の中から選択された１つの隣接
荷電アミノ酸配列を含んで成る。さらに好ましい実施形態においては、隣接荷電
アミノ酸配列は、反復配列として異種ペプチドの中で発生する。もう１つのさら
に好ましい実施形態においては、異種配列は、第１及び第２の配列を含む。さら
により好ましい実施形態においては、第１の配列は、第２の配列と隣接している
。特に好ましい実施形態においては、隣接する第１及び第２の配列は、反復配列
として異種ペプチド内で発生する。さらに好ましい実施形態においては、異種ペ
プチドは、隣接しない負に帯電したアミノ酸及び隣接しない正に帯電したアミノ
酸を含む。より好ましい実施形態においては、異種ペプチドは、さらに隣接する
負に帯電したアミノ酸から成る第１の配列及び隣接する正に帯電したアミノ酸か
ら成る第２の配列の中から選択された隣接荷電アミノ酸配列を含んで成る。さら
により好ましい実施形態においては、異種ペプチドは第１の配列を含む。さらに
好ましい実施形態においては、隣接する負に帯電したアミノ酸の第１の配列は、
ｎを１〜４０の整数として配列番号１６として列挙されている一般構造式Ａｓｐ
−Ｇｌｕn−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ2n−Ａｓｐ−Ｇｌｕnを有する。特に好ましい実施形
態においては、該第１の配列は、配列番号２０に列挙されているアミノ酸配列式
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕである。
【００２３】 投与の経路又は様式を制限することはしないものの、投与は、鼻腔内、経口、
中心静脈内、皮下、髄腔内、末梢静脈内、腹腔内及び筋内投与の中から選択され
ている。さらなる実施形態においては、投与は、免疫アジュバント、サイトカイ
ン及び薬学賦形剤の中から選択された組成物を投与する段階をさらに含んで成る
。
【００２４】 動物のタイプに制限はないものの、本発明では、さらにもう１つの実施形態に
おいて、宿主動物が哺乳動物であることが考えられている。好ましい実施形態に
おいては、哺乳動物は、マウス及びヒトの中から選択されている。１変形実施形
態においては、接合体は免疫原性である。
【００２５】 本発明により同様に提供されているのは、問題の分子に対するＴＨ−２型免疫
応答のレベルを低減させる方法において、ａ） ｉ）問題の分子；ｉｉ）植物ウ
イルス及び ｉｉｉ）宿主動物を提供する段階； ｂ）接合体を生成するべく植物
ウイルスに対し問題の分子を接合させる段階、及び ｃ）治療動物の体内での分
子に対するＴＨ２型免疫応答レベルが対照動物の体内での問題の分子に対するＴ
Ｈ２型免疫応答レベルに比べ減少することになるような条件下で該治療動物を生
成するべく該宿主動物に対し、該接合体を投与する段階；を含んで成る方法であ
る。１実施形態においては、該方法は、ｄ）対照動物の体内での問題の分子に対
するＴＨ−２型免疫応答レベルとの関係における治療動物体内の問題の分子に対
するＴＨ２型免疫応答レベルの減少についてテストする段階をさらに含んで成る
。好ましい１実施形態においては、該方法はさらに ｅ）対照動物の体内での問
題の分子に対するＴＨ２型免疫応答レベルとの関係における治療動物の体内での
問題の分子に対するＴＨ−２型免疫応答レベルの減少を観察する段階、を含んで
成る。もう１つの実施形態においては、投与は、問題の分子に対する宿主動物の
露呈に付随する症候の低減を結果としてもたらす。１変形実施形態においては、
低減されたＴＨ２型免疫応答レベルは、（ａ）ＣＭの体内でのＴＨ２関連免疫グ
ロブリンレベルとの関係における治療動物の体内での低減されたＴＨ２関連免疫
グロブリンレベル、（ｂ）対照動物からのＴＨ２細胞の増殖レベルとの関係にお
ける治療動物からのＴＨ２細胞の減少した増殖レベル、及び（ｃ）対照動物の体
内でのＴＨ２関連サイトカインレベルとの関係における治療動物の体内での低減
されたＴＨ２関連サイトカインレベル、の中から選択される。好ましい実施形態
においては、ＴＨ２関連サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−９、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３の中から選択される。より好ましい実施形態
においては、ＴＨ２関連サイトカインはＩＬ−４である。もう１つの変形実施形
態においては、問題の分子はペプチド、多糖類、核酸又は脂質を含んで成る。付
加的な一変形実施形態においては、分子は抗原及びアジュバントから選択される
。好ましい一実施形態においては、抗原はペプチドである。さらにもう１つの変
形実施形態においては、宿主動物はマウスであり、ＴＨ２関連免疫グロブリンは
、ＩｇＧｌ及びＩｇＧ３から選択される。付加的な一実施形態においては、宿主
動物はヒトであり、ＴＨ２−関連免疫グロブリンはＩｇＧ２である。
【００２６】 本発明は同様に、問題の分子に対する現存のＴＨ２型免疫応答のレベルを減少
させる方法において、ａ） ｉ）問題の分子；ｉｉ）植物ウイルス及び ｉｉｉ）
問題の分子に対するＴＨ２型免疫応答を示す宿主動物を提供する段階； ｂ）接
合体を生成するべく植物ウイルスに対し問題の分子を接合させる段階、及び ｃ
）治療動物の体内でのＴＨ２型免疫応答レベルが宿主動物の体内でのＴＨ２型免
疫応答レベルに比べ減少することになるような条件下で該治療動物を生成するべ
く該宿主動物に対し、該接合体を投与する段階、を含んで成る方法である。１実
施形態においては、該方法は、ｄ）対照動物の体内での問題の分子に対するＴＨ
２型免疫応答レベルとの関係における治療動物体内の問題の分子に対するＴＨ２
型免疫応答レベルの減少についてテストする段階をさらに含んで成る。好ましい
１実施形態においては、該方法はさらに ｅ）対照動物の体内での問題の分子に
対するＴＨ−２型免疫応答レベルとの関係における治療動物の体内での問題の分
子に対するＴＨ−２型免疫応答レベルの減少を観察する段階を含んで成る。もう
１つの実施形態においては、宿主動物内のＴＨ２型応答は優性である。
【００２７】 本発明は同様に、動物体内の問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答のレベルを
増大させるプロセスにおいて： ａ） ｉ） 前記問題の分子； ｉｉ） 前記問題の分子に対し接合する能力をもつ異種ペプチドを発現する植物
ウイルス；及び ｉｉｉ） 宿主動物； を提供する段階； ｂ） 接合体を生成するべく前記異種ペプチドに対し前記問題の分子を接合さ
せる段階； ｃ） 治療動物の体内での前記分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルが対照動
物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルに比べ増大するこ
とになるような条件下で該治療動物を生成するべく前記宿主動物に対し前記接合
体を投与する段階； ｄ） 対照動物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルと
の関係における前記治療動物体内の前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レ
ベルの増大について任意にテストする段階；及び ｅ） 対照動物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルと
の関係における前記治療動物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応
答レベルの増大を任意に観察する段階、 を含んで成る、プロセスを提供する。１つの実施形態においては、増大したＴＨ
１型免疫応答レベルは、（ａ）ＣＭの体内でのＴＨ１関連免疫グロブリンレベル
との関係における前記治療動物の体内での増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレ
ベル、（ｂ）対照動物からのＴＨ１細胞の増殖レベルとの関係における前記治療
動物からのＴＨ１細胞の増大した増殖レベル、及び（ｃ）対照動物の体内でのＴ
Ｈ１関連サイトカインレベルとの関係における前記治療動物の体内での増大した
ＴＨ１関連サイトカインレベル、の中から選択される。もう１つの実施形態にお
いては、ＴＨ１関連サイトカインがＩＬ−２、ＴＮＦ−β及びＩＦＮ−γの中か
ら選択される。さらにもう１つの実施形態においては、投与は、前記問題の分子
に対する前記宿主動物の露呈に付随する症候の低減を結果としてもたらす。さら
なる１実施形態においては、問題の分子は、ペプチド、多糖類、核酸又は脂質を
含んで成る。１変形実施形態においては、問題の分子は、動物病原体、アレルゲ
ン及びガン細胞の中から選択された供給源に由来する。さらにもう１つの実施形
態においては、植物ウイルスは、コモウイルス、トンブスウイルス、ソベモウイ
ルス及び線虫媒介球状ウイルスの中から選択された正二十面体植物ウイルスであ
る。１変形実施形態においては、植物ウイルスはコモウイルスである。より好ま
しい実施形態においては、コモウイルスは、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭ
Ｖ）である。さらにもう１つの実施形態においては、異種ペプチドは、前記植物
ウイルスの外被タンパク質の露呈部分において発現される。１変形実施形態にお
いては、異種ペプチドは、負に荷電したアミノ酸、正に帯電したアミノ酸の中か
ら選択された単数又は複数の荷電アミノ酸を含んで成り、前記負に帯電したアミ
ノ酸上の負の電荷は、前記正に帯電したアミノ酸上の正の電荷によって平衡化さ
れている。もう１つの実施形態においては、負に帯電したアミノ酸は、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸及びシステインの中から選択され、前記正に帯電したアミ
ノ酸がリシン、アルギニン及びヒスチジンの中から選択されている。もう１つの
実施形態においては、異種ペプチドは、隣接する負に帯電したアミノ酸から成る
第１の配列及び隣接する正に帯電したアミノ酸から成る第２の配列の中から選択
された１つの隣接荷電アミノ酸配列を含んで成る。
【００２８】 さらにもう1つの実施形態においては、隣接荷電アミノ酸配列は、反復配列と
して前記異種ペプチドの中で発生する。さらなる実施形態においては、異種配列
は、前記第１及び第２の配列を含み、前記第１の配列は、前記第２の配列と隣接
している。さらにもう１つの実施形態においては、隣接する第１及び第２の配列
は、反復配列として前記異種ペプチド内で発生する。さらにもう１つの実施形態
においては、異種ペプチドは、隣接しない負に帯電したアミノ酸及び隣接しない
正に帯電したアミノ酸を含み、前記異種ペプチドは、さらに隣接する負に帯電し
たアミノ酸から成る第１の配列及び隣接する正に帯電したアミノ酸から成る第２
の配列の中から選択された隣接荷電アミノ酸配列を含んで成る。もう１つの実施
形態においては、隣接する負に帯電したアミノ酸の第１の配列は、ｎを１〜４０
の整数として配列番号１６として列挙されている一般構造式Ａｓｐ−Ｇｌｕn−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ2n−Ａｓｐ−Ｇｌｕnを有する。さらにもう１つの実施形態にお
いては、投与は、鼻腔内、経口、中心静脈内、皮下、髄腔内、末梢静脈内、腹腔
内及び筋内投与の中から選択されている。さらにもう１つの実施形態においては
、投与は、免疫アジュバント、サイトカイン及び薬学賦形剤の中から選択された
組成物を投与する段階をさらに含んで成る。さらなる１実施形態においては、宿
主動物は、哺乳動物である。もう１つの変形実施形態においては、哺乳動物は、
マウス及びヒトの中から選択されている。１つの好ましい実施形態においては、
接合体は、免疫原性である。
【００２９】 本発明は同様に、植物ウイルスに対し１つの抗原の複合体を含む優位にＴＨ１
型のペプチド特異的免疫応答を刺激し、結果として得られた免疫原性複合体を動
物に投与するための方法をも提供する。好ましくは、植物ウイルスは正二十面体
植物ウイルスである。より好ましくは、植物ウイルスはコモウイルスである。さ
らに一層好ましくは、植物ウイルスはカウピーモザクイクウイルスである。１実
施形態においては、抗原は、植物ウイルスの組換え型構造遺伝子によりコードさ
れた挿入ポリペプチドとして発現される外来性ペプチドである。好ましくは、抗
原は、組換え型外皮タンパク質構造遺伝子によりコードされる融合ポリペプチド
として発現される。さらにもう１つの実施形態においては、免疫原性複合体は、
薬学的に受容可能な賦形剤の存在下で投与される。さらなる実施形態においては
、免疫原性複合体の投与様式は、鼻腔内接種、経口接種、中心静脈内接種及び皮
下接種の中から選択される。さらにもう１つの実施形態においては、免疫原性複
合体は免疫調節作用物質の存在下で投与される。好ましくは、免疫調節作用物質
は免疫アジュバントである。より好ましくは、免疫アジュバントは、コレラ毒素
（ＣＴ）及びその突然変異体、易熱性腸毒素（ＬＴ）及びその突然変異体、Quil
Ａ（ＱＳ２１）；ｇ−イヌリンと呼ばれるＲＩＢＩアジュバント及びＩＳＣＯＭ
を含むグループの中から選択される。好ましい一変形実施形態においては、免疫
調節作用物質はサイトカイン、好ましくは、動物のＣＤ４＋Ｔｈ１リンパ球から
分泌され得るサイトカインである。好ましくは、サイトカインは、インターロイ
キン−２−； インターフェロン−γ；腫瘍壊死因子−βのグループの中から選
択される。付加的な実施形態においては、免疫原性複合体は、単一用量、１部位
で皮下経路によって；単一の同時性用量で複数の部位における皮下経路によって
； 単一用量、１部位で中心静脈内経路によって； 単一の同時性用量で複数の部
位における中心静脈内経路によって； 複数の用量で１部位における皮下経路に
よって； 複数の用量で１部位における中心静脈内経路によって； 複数の用量で
複数の部位における皮下経路によって； 及び／又は、複数の用量で複数の部位
における中心静脈内経路によって、投与される。
【００３０】 本発明によって同様に提供されているのは、上述の方法のいずれかにおいて有
用であり、かつその中で、タンパク様又は非タンパク様の分子を自らに対し化学
的に接合させることのできる反応性ペプチドがキメラ植物ウイルスゲノムの構造
遺伝子内でコードされている、キメラウイルス粒子である。１つの実施形態にお
いては、化学的に反応性をもつペプチドは、キメラウイルス粒子の外皮タンパク
質の中に挿入される。もう１つの実施形態においては、化学反応性ペプチドの挿
入は、カウピーモザイクウイルスの小型外皮タンパク質（ＶＰ−Ｓ）のアラニン
２２とプロリン２３の間で行なわれる。さらにもう１つの実施形態においては、
反応性アミノ酸残基（Ｘ）上の正の電荷は、ｎが１〜４０の間の整数であるもの
として一般構造式Ｘ（ｎ）Ｙ（ｎ）に従った反応性ペプチド内に対応する数の負
に帯電したアミノ酸残基（Ｙ）を包含させることによって平衡化されている。も
う１つの実施形態においては、挿入された化学反応性ペプチドは、ｎが１〜４０
の間の整数であるものとして一般構造式ＤＥ（ｎ）ＧＫ（ｎ）ＤＥ（ｎ）のアミ
ノ酸配列を有する。好ましい実施形態においては、挿入された化学反応性ペプチ
ドはアミノ酸配列ＤＥＧＫＧＫＧＫＧＫＤＥを有する。さらなる実施形態におい
ては、抗原は、キメラ植物ウイルスの構造タンパク質内の挿入された融合として
発現される反応性ペプチドに対し化学結合を介して接合された炭水化物半分であ
る。
【００３１】 本発明は同様に、植物ウイルスに対し抗原を接合させる段階及び動物に対し結
果として得られた免疫原性複合体を投与する段階を含んで成る、抗原の固有の免
疫刺激特性が有利に作用するＴＨ２型免疫反応をバイパスさせる方法をも提供し
ている。
【００３２】 同様に、本書で開示されているのは、植物ウイルスの組換え型ゲノムによって
コードされる融合ポリペプチドとしてペプチドを発現する段階及び動物に対して
結果として得られた免疫原性複合体を投与する段階を含んで成る、ペプチドの固
有の免疫刺激特性が有利に作用するＴＨ２型免疫反応をバイパスさせる方法であ
る。
【００３３】 本発明は付加的に、植物ウイルスに対し抗原を接合させる段階及び結果として
得られた免疫原性複合体を動物に投与する段階を含んで成る、抗原に対する動物
の遺伝的素質が有利に作用するＴＨ２型の免疫反応をバイパスさせる方法をも提
供する。
【００３４】 その上、本発明は、植物ウイルスの組換え型ゲノムによってコードされる融合
ポリペプチドとしてペプチドを発現する段階及び結果として得られた免疫原性複
合体を動物に投与する段階を含んで成る、ペプチドに対する動物の遺伝的素質が
有利に作用するＴＨ２型免疫反応をバイパスさせる方法をも提供している。
【００３５】 同じく本発明により提供されているのは、植物ウイルスに対し抗原を接合させ
る段階及び結果として得られた免疫原性複合体を動物に投与する段階を含んで成
る、抗原を含有する免疫原性複合体内に存在するアジュバントの固有の免疫刺激
特性が有利に作用するＴ２型免疫反応をバイパスさせる方法である。
【００３６】 本発明は付加的に、植物ウイルスに対し感染性作用物質と会合した抗原を接合
させる段階及び結果として得られた免疫原性複合体を動物に投与する段階を含ん
で成る、ＴＨ１バイアスされた免疫応答の刺激による感染症についての動物の治
療方法を提供している。
【００３７】 同様に、本発明は植物ウイルスに対しアレルギーに関連する同起源アレルゲン
に由来する抗原を接合させる段階及び結果として得られた免疫原性複合体を動物
に投与する段階を含んで成る、ＴＨ１バイアスされた免疫応答の刺激によりアレ
ルギーについて動物を治療する方法を提供する。
【００３８】 さらに、本発明は、植物ウイルスに対してガンに関連する抗原を接合させる段
階及び結果として得られた免疫原性複合体を動物に投与する段階を含んで成る、
ＴＨ１バイアスされた免疫応答の刺激によりガンを患う動物を治療する方法を開
示している。
【００３９】 さらに、本書で提供されているのは、動物の体内での免疫応答をプライミング
するのに用いられる１つの免疫原性複合体内に存在する抗原に対する現存のＴＨ
２型免疫応答のシフトを誘発する方法において、２次以降のブースタ投与量内の
植物ウイルス粒子に接合されたその抗原を含有する免疫原性複合体を動物に接種
する段階を含んで成る方法である。
【００４０】 定義 本発明の理解を容易にするため、一定数の用語が以下で定義づけされる。
【００４１】 「抗原」及び「抗原性」という語は、抗体又はＴ細胞レセプタによって特異的
に認識されるあらゆる物質を意味する。抗原は、単数又は複数のエピトープ（「
抗原決定基」とも呼ばれる）を内含する。「エピトープ」というのは、分子相補
性が結果として抗体又はＴ細胞レセプタの結合部位と相互作用する抗原上の１つ
の構造である。エピトープは、それが由来する無傷の抗原と、１つの抗体に対す
る結合のため競合し得る。一般に、分泌された抗体及びその対応する膜結合形態
は、抗原として多様な物質を認識する能力をもち、一方Ｔ細胞レセプタは、細胞
表面上でＭＨＣ分子と複合されるタンパク質のフラグメントのみを認識する能力
をもつ。Ｂ細胞上で免疫グロブリンレセプタによって認識された抗原は、Ｔ細胞
依存性抗原、１型Ｔ細胞独立型抗原及び２型Ｔ細胞独立型抗原という３つのカテ
ゴリに細分される。抗原は、ペプチド、多糖類、核酸配列及び脂質といった分子
のうちの単数又は複数のものを含有することができる。
【００４２】 「免疫原」、「免疫原性」及び「免疫学的に活性な」という語は、特定の体液
性又は細胞媒介型免疫応答を誘発する能力をもつあらゆる物質を意味する。定義
上、免疫原は少なくとも１つのエピトープを含有していなければならず、一般に
、複数のエピトープを含有する。免疫原は、ペプチド、多糖類、核酸配列及び／
又は脂質を含有する分子により例示されるが、これに制限されるわけではない。
（制限的意味なく）グリコペプチド、リポペプチド、糖脂質などを含めた脂質、
多糖類、又は核酸配列とペプチドの複合体も考慮されている。これらの複合体は
、わずかなエピトープを伴うより小さい分子が独自で満足のいく免疫応答を刺激
しない場合に特に有用な免疫原である。
【００４３】 「アレルゲン」という語は、ＩｇＥ抗体の産生を一例とする（ただしこれに限
られるわけではない）単数又は複数の過敏性（アレルギー）反応を誘発する抗原
又は免疫原を意味する。アレルゲンには、ブタクサ、イネ科牧草又は木の花粉、
又は真菌、動物のふけ、ハウスダスト又は食物が含まれるが、これらに制限され
るわけではない。アレルゲンにさらされた個体は、必然的にではないものの一般
的にじんま疹又は、枯草熱又はぜんそくの症状を発生させる。
【００４４】 本書で使用されている「アジュバント」という語は、抗原と共に注射された時
点で非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強させるようなあらゆる化合物の
ことを意味する。
【００４５】 「賦形剤」という語は、抗原の送達のためのビヒクルを形成するあらゆる不活
性物質（例えばアラビアゴム、糖みつ、ラノリン、でんぷんなど）を意味する。
賦形剤という語には、充分な液体の存在下で１つの組成物に対して、丸薬又は錠
剤の調製に必要とされる付着性を付与する物質が含まれる。
【００４６】 「抗体」及び「免疫グロブリン」という語は、免疫原により動物の体内で誘発
される糖タンパク質を意味するのに互換的に用いられる。抗原は、免疫原、又は
より特定的に言うと免疫原の中に含有された単数又は複数のエピトープに対する
特異性を実証する。未変性の抗体は少なくとも２つの軽ポリペプチド鎖と少なく
とも２つの重ポリペプチド鎖を含む。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体であり得る。「ポリクローナル抗体」という語は、血漿細胞の複数の
クローンから産生された免疫グロブリンを意味し、これに対し「モノクローナル
抗体」は、血漿細胞の単一クローンから産生された免疫グロブリンを意味する。
【００４７】 抗体に関して用いられる「アイソタイプ」又は「クラス」という語は、特定の
タイプの重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体ウイルスを意味する。か
くして、異なる抗体アイソタイプは、重鎖定常（ＣＨ）領域のアミノ酸配列が異
なっている。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭを含めた複数の抗体
アイソタイプが知られている。かくしてＩｇＧは、Ｙ重鎖定常ドメイン（Ｃγ）
を有し、ＩｇＭはμ重鎖定常ドメイン（Ｃμ）を有し； ＩｇＡはα重鎖定常ド
メイン（Ｃα）を有し； ＩｇＤはδ重鎖定常ドメイン（Ｃδ）を有し、ＩｇＥ
はε重鎖定常ドメイン（Ｃε）を有する。異なる抗体クラスは、異なるエフェク
タ機能を示し、異なる組織局在化を表わす。各々の抗体クラスは、重鎖のカルボ
キシル末端における配列が異なる膜（ｍ）又は分泌（ｓ）形態として発現され得
る。大部分の抗原は、ＩｇＭの迅速な血清発現とその後に続く、Ｃγ１及びＣγ
２ａといったような下流側重鎖遺伝子の産物が優位である二次アイソタイプスイ
ッチング応答を惹起する。優位な抗体アイソタイプは、抗体の産生を惹起するの
に用いられる抗原タイプ（例えばポリペプチド、多糖類など）によって左右され
る。
【００４８】 抗体アイソタイプに関して用いられる「サブタイプ」及び「サブクラス」とい
う語は、重鎖構造内に変動を含むアイソタイプ内の抗体を互換的に意味する。例
えば、ヒトＩｇＧアイソタイプは、マウスＩｇＧアイソタイプが４つのサブタイ
プＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含有するのに対し、４つのサ
ブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含有する。ヒトＩｇＡア
イソタイプはＩｇＡｌ及びＩｇＡ２サブタイプを含む。定常重鎖についてコード
する遺伝子は、マウス内でマッピングされたものであり、アイソタイプＩｇＭ、
ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＥ及びＩｇＡに対
応する（５′末端からの）Ｃμ−Ｃδ−Ｃγ３−Ｃγ１、Ｃγ２ｂ−サイトカイ
ン２ａ−Ｃε−Ｃαという順序で染色体１２の上に位置設定されている。
【００４９】 「アイソタイプスイッチング」という語は、１つの抗体アイソタイプ（例えば ＩｇＭ）がもう１つの抗体アイソタイプ（例えばＩｇＧ）に変化する現象を意
味する。同様に、「サブタイプスイッチング」という語は、１つの抗体サブタイ
プ（例えばＩｇＧＩ）が同じ抗体アイソタイプのもう１つのサブタイプ（例えば
ＩｇＧ２ａ）に変化する現象を意味する。
【００５０】 抗体に関して本書で使用される「エフェクタ機能」という語は、抗体分子によ
り媒介されかつその分子の定常重鎖領域を通して実施される非抗原結合活性を意
味する。エフェクタ機能は、免疫細胞に対するレセプタ結合、補体固定などによ
って例示される。エフェクタ機能は、補体を媒介とする溶解又は食作用を用いた
体からの抗原の除去を容易にする。
【００５１】 「特異的結合」又は「特異的に結合」するという語は、抗体及び抗原の相互作
用に関して用いられた場合、その相互作用が好ましくは抗原上の特定の構造（す
なわち抗原決定基又はエピトープ）の存在に対する選好性を示し、より好ましく
はこの存在によって左右されることを意味する； 換言すると、抗体は、抗原一
般ではなく特異的抗原構造（関連構造を含む）を認識しており、これに結合して
いる。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識付けされた「
Ａ」及び抗体を含む反応におけるエピトープＡ（又は遊離した標識づけされてい
ないＡ）を含む抗原の存在は、その抗体に結合された標識づけされたＡの量を低
減させることになる。
【００５２】 本書で使用されている「免疫学的に有効な量」という語は、ワクチン接種時点
で宿主内に抗体の産生を誘発するのに必要とされる免疫原の量を意味する。必ず
しも必要ではないものの、免疫学的に有効な量は「保護的」量であることが好ま
しい。免疫原の「保護的」及び「治療的」量という語は、免疫原に対する宿主動
物の露呈に付随する単数又は複数の望ましくない症候を減少させる免疫原の量を
意味する。特定の組成物又は特定の方法の効果に関して本書で使用される症候を
「減少させる」及び「低減させる」という語は、特定の組成物又は方法を用いた
治療を行なわない状態で観察される症候に比較した場合に、単数又は複数の症候
を低減させる、遅延させる又は削除することを意味する。本書で使用されている
ように、症候を「低減させる」という語は、単数又は複数の症候のレベルを低下
させることを意味する。症候を「遅延させる」という語は、免疫原に対する露呈
と単数又は複数の症候が発症するまでの間の時間を延長させることを意味する。
症候を「削除する」という語は、単数又は複数の症候を完全に「低減させる」及
び／又は完全に「遅延させる」ことを意味する。
【００５３】 「動物」という語は、その抗体又はＴ細胞レセプタが１つの抗原を特異的に認
識できるあらゆる動物を意味する。代替的には、「動物」という語は、免疫原に
対し特異的な体液性又は細胞媒介型免疫応答を誘発する能力をもつあらゆる動物
を内含している。好ましい動物としては、げっ歯類、人間、霊長類、ヒツジ科動
物、ウシ亜科動物反すう動物、ウサギ科動物、ブタ科動物、ヤギ科動物、ウマ科
動物、イヌ科動物、ネコ科動物、鳥類などの哺乳動物があるが、これらに限られ
るわけではない。好ましい動物は、ゲッ歯類を意味する「ゲッ歯目（order Rode
ntia） 」すなわち、ネズミ科（例えばラット及びマウス）を含む胎盤を有する
ホ乳動物（真獣亜網）、最も好ましくはマウスの中から選ばれる。本書で使用さ
れている「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」という語は、オリゴヌクレオチ
ド又はポリヌクレオチド及びそのフラグメント又は一部分、及び１本鎖又は２本
鎖であってよく、センス又はアンチセンスストランドを表わしうるゲノム又は合
成由来のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
【００５４】 「アミノ酸配列」、「ペプチド」、「ペプチド配列」、「ポリペプチド」及び
「ポリペプチド配列」という語は、本書中で、アミノ酸配列を意味するものとし
て互換的に使用される。
【００５５】 「問題のペプチド」、「問題のヌクレオチド配列」及び「問題の分子」という
語は、その操作が何らかの理由で当業者により望ましいとみなされうるあらゆる
ペプチド配列、ヌクレオチド配列及び分子をそれぞれ意味している。問題の分子
の例としては、ペプチド、グリコペプチド、多糖類、リポペプチド、糖脂質、脂
質、ステロイド、核酸などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００５６】 本書で使用されている、ガン細胞に由来するペプチドに関する場合、「由来す
る」という語は、ガン細胞から得られた（例えば単離、精製された）ペプチドを
意味するものと意図されている。
【００５７】 任意の分子（例えばポリペプチド、ヌクレオチド配列など）に適用された「生
物学的に活性な」という語は、天然に発生する分子の構造、調節及び／又は生化
学的機能をもつ分子を意味する。
【００５８】 ペプチド配列及びヌクレオチド配列は、「内因性」でも「異種」（すなわち「
外来性」）でもありうる。「内因性」という語は、天然に発生する配列との関係
において何らかの修飾を含まないかぎりにおいて、それが導入される細胞又はウ
イルスの中に天然に発見される配列を意味する。「異種」という語は、それが導
入される細胞又はウイルスに内因性のものでないことを意味する。例えば、異種
ＤＮＡは、天然にはそれが連結されていないか又は天然にはそれが異なる場所で
連結されている核酸配列に連結されているか又は連結状態となるよう操作されて
いるヌクレオチド配列を内含する。異種ＤＮＡは同様に、それが導入される細胞
又はウイルス内に天然に見い出されかつ天然に発生する配列と比べた場合いくつ
かの修飾を含むヌクレオチド配列をも内含している。必然的にではないが、一般
には、異種ＤＮＡは、それが導入される細胞又はウイルスによって通常産生され
ない異種タンパク質及び異種ＲＮＡをコードする。異種ＤＮＡの例としては、リ
ポータ遺伝子、転写及び翻訳調節配列、選択可能なマーカータンパク質（例えば
、薬物耐性を付与するタンパク質）をコードするＤＮＡなどがある。
【００５９】 ペプチド配列及びヌクレオチド配列に関して使用される「野生型」という語は
、天然に発生する供給源から隔離された場合のペプチド配列及びヌクレオチド配
列の特徴をもつペプチド配列及びヌクレオチド配列を意味する。野生型ペプチド
配列及びヌクレオチド配列というのは、１つの個体群の中で最も頻繁に観察され
かくしてそれぞれペプチド配列及びヌクレオチド配列の「通常の」又は「野生型
の」形態と任意に呼称されるものである。これとは対照的に、「修飾された」又
は「突然変異体」という語は、それぞれ野生型ペプチド配列及びヌクレオチド配
列に比較した場合の配列及び／又は機能的特性の修飾（すなわち改変された特徴
）を表わすペプチド配列及びヌクレオチド配列を意味する。天然に発生する突然
変異体を単離することができるということがわかる。すなわち、これらは、野生
型ペプチド配列及びヌクレオチド配列に比較した場合に改変された特徴を有する
という事実によって同定される。
【００６０】 １つの分子（例えば核酸配列、アミノ酸配列など）との関係において使用され
た場合の「単離された」という語は、同定されかつ自らと会合した少なくとも１
つの汚染分子から分離された分子を意味する。
【００６１】 本書で使用される通りの「精製された」という語は、その天然の環境からとり
出され、単離されたか又は分離された分子（例えば核酸配列、アミノ酸配列など
）を意味する。従って、「単離された」分子というのは、精製された分子である
。「実質的に精製された」分子は、それらが会合されているその他の成分から少
なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０
％の割合で免がれている。
【００６２】 「病原体」及び「動物病原体」という語は、動物の体内で病気をひき起こすあ
らゆる生体を意味する。病原体には、ウイルス、細菌、原生動物、線虫、真菌な
どが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００６３】 「ガン細胞」という語は、多段階新生物性進行の早期、中期又は末期にある細
胞を意味する。新生物性進行の早期、中期又は末期の特長は、顕微鏡を用いて記
述されてきた。新生物性進行の３期の各々におけるガン細胞は一般に、転座、逆
位、欠失、同位染色体、一染色体性及び過剰染色体を含む異常核型を有する。ガ
ン細胞には、「増殖性細胞」すなわち悪性進行の早期にある細胞、「形成不全型
細胞」すなわち新生物性進行の中期にある細胞及び「新生物性細胞」すなわち新
生物性進行の末期にある細胞が内含される。
【００６４】 「修飾された植物ウイルス」という語は、化学的、生化学的及び／又は分子生
物学的技術によりその任意の部分が修飾された植物ウイルスを意味する。「キメ
ラ植物ウイルス」というのは、分子生物学技術を用いて修飾された植物ウイルス
である。
【００６５】 動物の体内での応答に関連して用いられる「ＴＨ１型応答」及び「ＴＨ１応答
」という語は、ＴＨ１関連免疫グロブリン、ＴＨ１細胞増殖及び／又はＴＨ１関
連サイトカインのレベルの変化を内含するもののこれに制限されるわけではない
、抗原による刺激の時点でＴＨ１リンパ球によって生成されるあらゆる細胞及び
／又は体液性応答を意味する。これに対し、動物の体内での応答に関して用いら
れる「ＴＨ２型応答」、「ＴＨ２応答」という語は、ＴＨ２関連免疫グロブリン
、ＴＨ２細胞増殖及び／又はＴＨ２関連サイトカインのレベルの変化を含む（た
だしそれに制限されるわけではない）、抗原による刺激の時点でＴＨ２リンパ球
によって生成されるあらゆる細胞及び／又は体液性応答を意味する。
【００６６】 「ＴＨ１関連免疫グロブリン」及び「ＴＨ１細胞由来の免疫グロブリン」とい
う語は、ＴＨ１細胞により生成される単数又は複数の免疫グロブリン（例えばＩ
ｇＧ）を意味する。これに対して、「ＴＨ２関連免疫グロブリン」及び「ＴＨ２
細胞由来免疫グロブリン」という語は、ＴＨ２細胞によって生成される単数又は
複数の免疫グロブリン（例えばＩｇＭ）を意味する。ＴＨ−１関連免疫グロブリ
ン及びＴＨ２関連免疫グロブリンのサブタイプは、種によって変動するという点
で種特異的である。例えば、マウスのＩｇＧ２（及び特にＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ
２ｂ）内には、成分ＴＨ１関連免疫グロブリンが存在するのに対し、ヒトのＩｇ
Ｇ１及びＩｇＧ３内には、ＴＨ１機能を果たすＴＨ１関連免疫グロブリンが存在
する。ＴＨ２関連免疫グロブリンに関しては、これらには、マウスＩｇＧ１及び
ＩｇＧ３及びヒトＩｇＧ２が含まれる。当該技術分野では、免疫グロブリンサブ
タイプの決定方法が知られており、本書でも例えば、基質としてＰ−ニトロフェ
ニルリン酸（ＰＮＰＰ[Sigma]）を用いた検出のために市販のアルカリホスファ
ターゼ（ＡＰ）で標識づけされた抗ＩｇＧ接合体（例えばアルカリホスファター
ゼ（ＡＰ）接合されたヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇ
Ｇ３〔Southern Biotechnologies Inc. USA〕）でサンプルウェルをコーティン
グすることを利用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いて記述
されている。
【００６７】 「ＴＨ１関連サイトカイン」及び「ＴＨ１細胞由来のサイトカイン」という語
は、制限的な意味なくインターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子β（Ｔ
ＮＦ−β）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含め、ＴＨ１型細胞によ
って産生されるサイトカインのうちの単数又は複数のものを意味する。好ましい
実施形態においては、好ましい実施形態は、ＴＨ１関連サイトカインはＩＮＦ−
γである。これに対し、「ＴＨ２関連サイトカイン」及び「ＴＨ２細胞由来のサ
イトカイン」という語は、制限的な意味なく、インターロイキン−４（ＩＬ−４
）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、
インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及
びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含め、ＴＨ２型細胞により産生され
るサイトカインのうちの単数又は複数に関する。好ましい実施形態においては、
ＴＨ２−関連サイトカインはＩＬ−４である。
【００６８】 発明の詳細な説明 本発明は、抗原又は免疫原を一例とする（ただしそれらに制限されるわけでは
ない）１つの分子に対する免疫応答の性質及び／又はレベルを調節する上で有効
である方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、抗原又は免疫原といったよ
うな分子に対する免疫応答においてＴＨ１バイアスを実施しかつ／又は かかる
分子に対する免疫応答においてＴＨ２バイアスを低減させるための方法及び手段
を提供する。より特定的に言うと、本発明は、そうでなければ一般にＴＨ２型応
答を刺激する分子に対して導かれるＴＨ１ 免疫応答を増大させるための方法及
び手段を提供する。本発明は、さらに、分子に対するＴＨ２ 免疫応答を低減さ
せるための組成物及び方法を提供する。さらに本書で提供されているのは、ＴＨ
１及びＴＨ２関連免疫グロブリンのレベル、ＴＨ１及びＴＨ２関連サイトカイン
の増殖レベル及びＴＨ１及びＴＨ２細胞の増殖レベルを改変する（すなわち増減
させる）ための組成物及び方法である。
【００６９】 第１の態様では、本発明は、抗体及び／又はサイトカインの生成のための免疫
原又は抗原のいずれかとして有効である分子を免疫系の細胞に対し提示する能力
をもつ修飾された植物ウイルス粒子を提供する。より特定的には、本発明の修飾
された植物ウイルス粒子を介して提示された分子は、ＴＨ１型応答、より好まし
くは優位なＴＨ１型応答を刺激する。
【００７０】 第２の態様においては、本発明は、或る種の分子において固有であるＴＨ２型
応答に向けての望ましくないバイアスを低減させる又は克服するべくＴヘルパー
経路の特定の分岐を調節するための手段を開示する。より好ましくは、かかる調
節は、結果として排他的に又は優位に、その分子が接種された動物の体内でＴＨ
１型応答をもたらす。
【００７１】 第３の態様においては、本発明は、外来性免疫調節作用物質（例えばアジュバ
ント、サイトカインなど）の無い状態で免疫反応を調節するための方法を開示し
ている。
【００７２】 第４の態様においては、疾病（例えば感染症、アレルギー及びガンなど、ただ
しこれらに制限されるわけではない）を予防、治療するか又はこれに対するワク
チン接種を行なうための方法が記述されている。
【００７３】 より特定的には、本発明は、分子（例えば抗原及び免疫原）の担体としての複
製しない植物ウイルスの使用を開示している。
【００７４】 本書で紹介されているデータは、驚くべきことに、分子提示のためのプラット
フォームとしての修飾された植物ウイルスでの免疫化が、植物ウイルス特異的及
び分子特異的ＴＨ１細胞を結果としてもたらすことを示している。ＴＨ１型免疫
応答に向かっての深いバイアスが、本書において、細菌、ウイルス、免疫グロブ
リン、ホルモン及びガン関連細胞表面タンパク質を含めた広範囲の供給源に由来
するペプチドを提示するため、一例としてのカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭ
Ｖ）を使用して示されている。ＴＨ１型免疫応答に有利なバイアスは、本書で、
分子の供給源、分子の用量、アジュバントの有無、存在する場合にはそのアジュ
バントの免疫調節活性の性質、投与経路及び免疫化された動物の遺伝的素質（遺
伝子型）とは独立したものであることが立証されている。この結果は、ＴＨ細胞
サブセットのプライミングが、使用される動物の系統、抗原の同一性、抗原送達
経路及び免疫化投薬計画の影響を受けるとする先行技術の報告を考えると驚くべ
きことである。この結果は同様に、優位なＴＨ１応答のためには生きたウイルス
が必要とされるという先行技術の報告〔Nauyen et al.(１９９４）前出〕及び本
発明の修飾された植物ウイルスの非複製性を考えても驚くべきことである。
【００７５】 ＣＰＭＶ上で発現された場合、一定数のペプチドが免疫原性である［McLain e
t al.(１９９５)ＡＩＤＳ Res Hum Retro １１：３２７；Dalsgaard et al.（１
９９７）Nat. Biotechnol、１５：２４８；Brennan et al.（１９９９）Microbi
ol、１４５：２１１；Brennan et al.（１９９９）J.Virol ７３：９３０］。ス
タフィロコッカスアウレウスの外膜内に見出され、カウピーモザイクウイルスの
表面上で発現されたフィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎＢＰ）に由来するペ
プチドは、卓越してペプチド特異的なＩｇＧ２ａをＣ５７ＢＬ／６マウスの中で
惹起し［Brennan et al.（１９９９）Microbiology １４５：２１１］、１つの
マウス系統内に接種されたこれらの特定のキメラウイルス粒子（ＣＶＰ）により
発現されたペプチドに対する応答におけるＴＨ１−バイアスを示唆している。し
かしながら、この特定の現象に付随する細胞（Ｔ細胞）応答は全く報告されてい
ない。
【００７６】 特に、本発明は、驚くべきことに細菌、ウイルス、免疫グロブリン、ホルモン
及びガン関連細胞表面タンパク質を含む広範囲の供給源に由来するペプチドが、
一例としてのカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）上で表示された場合のペプ
チド特異的ＩｇＧ１レベルに比べてはるかに高いレベルのペプチド特異的ＩｇＧ
２ａを生成する傾向をもつということを開示している。この植物ウイルスはヒト
細胞内では複製せず、従って、哺乳動物系内で全不活性ウイルスのように挙動す
る。本書でテストされた異なるＣＶＰのうち６つは、ＩｇＧ２ｂ抗体に比べたペ
プチド特異的ＩｇＧ２ａ抗体の優位性を生み出し、一方ＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１の
みが、或る種の条件下でＩｇＧ２ａの産生に比べＩｇＧ２ｂの産生に有利に作用
すると思われた。ＣＰＭＶ特異的応答は同様に、ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａの
同じ優位性を示した。ペプチド及びＣＰＭＶ特異的ＩｇＧ２ａ産生斑形成細胞（
ＳＦＣ）［Ｂ細胞］は共に、ＣＶＰ免疫化されたマウスの脾臓におけるＩｇＧ１
−産生ＳＦＣに比べはるかに多い数で産生された。
【００７７】 メカニズムを理解する必要はなく又いずれかの特定のメカニズムに本発明を制
限する意図もないが、ＴＨ１型応答に有利なペプチド及びウイルスの両方に対す
るアイソタイプ応答の強い分極は、ウイルス特異的ＣＤ４＋ＴＨ１をプライミン
グするウイルスの能力に関係し、かくして、ＴＨ１関連免疫グロブリン産生血漿
細胞へのペプチド（及びウイルス）特異的な未験のＢ細胞のクラススイッチング
を容易にすると思われる。
【００７８】 本書では、ＩｇＧ１に比べたペプチド特異的ＩｇＧ２ａの優位性が、Ｈ−２b
（Ｃ５７ＢＬ／６）、Ｈ−２d（ＢＡＬＢ／ｃ）、Ｈ−Ｈ−２q（ＮＩＨ）、２dq 1 （Biozzi ＡＢ/Ｈ）、及びＨ−２１（ＤＢＡ／１）を包括する５匹の異なるマ
ウス近交系において実証されている。ＴＨ２バイアスされたＢＡＬＢ／ｃ及びBi
ozziＡＢ/Ｈマウスにおいてさえ［Natsuume-Sakai et al.(１９７７)Immunology
３２：８６１；Sant'Anna et al.（１９８５）Immunogenetics２２：１３１］Ｉ
ｇＧ２ａは、ＩｇＧ１より驚くほど優位であった。ＣＶＰで本書中にてテストさ
れたアジュバントには、フロイント完全アジュバントといったようなＴＨ１応答
に有利に作用するもの、及びＴＨ２応答に有利に作用するもの〔ミョウバン及び
ＱＳ−２１；Cooper（１９９４）「ワクチンアジュバントによる異なる免疫応答
の選択的誘発」、Vaccine Design (G.I. Ada.、 ed)、 R.G. Landes Company、
pp １２５中〕が含まれていた。ここでも又、これらのアジュバントを用いて生
成された又はアジュバント無しで生成されたＩｇＧ２ａのレベルは、ＩｇＧ１の
レベルよりも驚くほどはるかに高いものであり、ＴＨ１応答を駆動しているのが
正にアジュバントではなく担体植物ウイルスであることを強調していた。重要な
ことに、上述した動物ウイルスの場合とは異なり、ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ａ
の優位性は、マウス系統又は免疫化に用いられるアジュバントの如何に関わらず
観察された。
【００７９】 本発明はさらに、高い用量及び低い用量（２〜３００μｇの範囲）の両方のＣ
ＶＰの免疫化がＴＨ１型の応答の生成を導いたということを開示している。かく
して、以前にマウスのＩｇＧアイソタイプの生成に影響を及ぼすことが示された
。投与された抗原の３ケタにわたる用量［Hocart et al.(１９８９）J. Gen. Vi
ol、 ７０：２４３９；Hocart et al.、（１９８９）J. Gen. ViroL ７０：８０
９］は驚くべきことに、ペプチド特異的ＩｇＧのアイソタイプにおいてＴＨ１バ
イアスに影響を及ぼさないように思われた。
【００８０】 本書で記述されている一例として正二十面体植物ウイルスで得られた結果は、
一部には、ノーウォークウイルス［Ball et al.(１９９８) J.Virol ７２：１３
４５］及びロタウイルス［O'Neal.et al.(１９９７)J.Virol.７１：８７０７］
が ここで報告されているもののようなＩｇＧ１に対するＩｇＣ２ａの強く優位
性を惹起しないことから、驚くべきものであった。ＩＬ−１２及びポリ（１）：
（ｃ）といったような免疫調節物質での同時免疫化が必要とされることから、マ
クロファージに対する粒状抗原のターゲティングはそれ自体、分極されたＴＨ１
応答［Sedlik et al.(１９９７）Intl. Immunol、９：９１］を刺激するのに充
分ではない。
【００８１】 本発明の組成物及び方法は、例えば疾病を検出し、予防しかつ／又は治療する
目的で１つの分子に対する抗体を生成し、分子に対する望ましいＴＨ１型の応答
を誘発し望ましくないＴＨ２型応答を低減させる上で有用である。特に、本発明
の修飾された植物ウイルスは、その免疫調節効果が（サイトカイン及びアジュバ
ントといったような）外来性免疫調節作用物質の無い状態で達成でき、かくして
これらの作用物質の投与に付随する費用及び不利な副作用が回避されることから
、特に臨床応用分野で使用される（ただし排他的ではない）。その上、本発明の
修飾された植物ウイルスはヒトの細胞において複製されないことから、これらは
、既存の生きた動物ウイルス／細菌及びＤＮＡ担体系に関与する安全性の問題を
回避するため、既存のワクチンに比べ有利である。
【００８２】 本発明はさらに、（Ａ）ＴＨ１／ＴＨ２細胞の発生、（Ｂ）ＴＨ１型及びＴＨ
２型応答と病理学、（Ｃ）植物ウイルス、（Ｄ）問題の分子、（Ｇ）動物に対す
る組成物の投与、（Ｈ）ＴＨ１型応答の増大及び（Ｉ）ＴＨ２型応答の低減、と
いう題の下で記述される。
【００８３】 Ａ．ＴＨ１／ＴＨ２細胞の発生 マウスにおいては、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、示差的なサイトカイン分泌プ
ロフィールひいては全く異なるエフェクタ機能により特徴づけされるＴＨ１及び
ＴＨ２という２つのグループに分類される〔再考のためには Mosmann et al.(１
９８６）J. Immunol. １３６：２２４８−２３５７を参照のこと〕。本発明を実
施するのにメカニズムを理解する必要はなく、又本発明をいずれかの特定のメカ
ニズムに制限するものではないが、原始型ＴＨ１又はＴＨ２特性を示すＴ細胞ク
ローンは、分化されたＣＤ４＋細胞の連続体の極端であり得、「典型的な」ＴＨ
１又はＴＨ２応答で生み出されるin vivoサイトカインプロフィールは、細胞型
スペクトルによって生成される。
【００８４】 しかしながら、単純さを期して、２つの細胞型あたかも分離可能な実体として
言及する方が容易である。かくして、本書で使用されている「ＴＨ１細胞」とい
う語は、単数又は複数のＴＨ１関連免疫グロブリン（例えばマウスＩｇＧ２ａ、
マウスＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ３）及び／又は単数又は複数の
ＴＨ１関連サイトカイン（例えばＩＬ−２、ＴＮＦ−β及びＩＦＮ−γ）を産生
するＴヘルパー細胞を意味する。これに対し、本書で使用されている「ＴＨ２細
胞」は、単数又は複数のＴＨ２関連免疫グロブリン（例えばマウスＩｇＧ１、マ
ウスＩｇＧ３及びヒトＩｇＧ２）及び／又は単数又は複数のＴＨ２関連サイトカ
イン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−
１３）を産生するＴヘルパー細胞を意味する。
【００８５】 ＴＨ１及びＴＨ２細胞は、ナイーブＣＤ４＋細胞の共通プールから発生する。
分極したＴＨ１又はＴＨ２経路へのＴＨ細胞の分化には、複数の因子が影響を及
ぼす可能性がある。異なる作用物質により誘発される「天然免疫」のサイトカイ
ンプロフィール、ペプチドリガンドの性質、微環境分泌されたホルモンの同一性
とレベル抗原のレベル、及びＴ細胞上の同時刺激性シグナリングレセプタ及びＭ
ＨＣ遺伝子型の存在は、サブセットの発生を決定でき、ここでＴＨ細胞は、高い
抗原レベル及び同時刺激分子の存在に、より強く依存している。例えば、先行技
術では、マウスワクチン接種モデルにおいて、どのＴＨ細胞サブセットがプライ
ミングされるかということと特異的マウスＩｇＧアイソタイプの生成にいくつか
の要因が影響を及ぼすということが観察されている。かかる要因としては、使用
されるマウス系統の遺伝的背景、抗原送達経路及び（抗原の数量及び半減期を含
む）免疫化投薬計画そして抗原の性質が含まれる。ＴＨ２型サイトカインプロフ
ィールは往々にして、in vivoでのＴＨ１応答よりも遅く現われる。
【００８６】 ＴＨ１生成のための重要なサイトカインは、活性化されたマクロファージ及び
樹状細胞によって産生されるＩＬ−１２であると考えられている。ＩＬ−４は、
初期Ｔ細胞活性化の間に少量で産生される（ＩＬ−４産生の初期供給源としてＮ
Ｋ１.１細胞と呼ばれるＣＤ４細胞の特定のサブセットが提案されてきた）。Ｔ
Ｈ２応答の発生は、恐らくは持続性Ｔ細胞刺激の結果として、ＩＬ−４の局所的
濃縮の発生により駆動されると考えられている。
【００８７】 ＴＨ１細胞の機能に関しては、これらの細胞は、マクロファージ及び細胞毒性
Ｔ細胞活性化（ＣＴＬ）を媒介し、細胞内微生物に対する細胞媒介免疫性及びＤ
ＴＨ（遅延型過敏反応）の成分エフェクタであるインターロイキン−２（ＩＬ−
２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β
）を産生する［Mosmann et al.（１９８６）前出］。ＣＴＬ反応は、中実腫瘍の
治療における又は中実腫瘍に応えた重要な治療用因子として増々認識されている
。ＴＨ１リンパ球により産生されたＩＦＮ−γは同様に、マウスＩｇＧの主要な
エフェクタアイソタイプであるＩｇＧ2aサブクラスへのＢ細胞アイソタイプクラ
ススイッチングをも誘発する。ＩｇＧ2a（そしてそれより低いレベルでＩｇＧ2b ）は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ：Huesser et al.（１９７７）J.
Exp. Med.１４６：１３１６）を増強させ、食作用のため細胞又は抗体クラスタ
をオプソニン化する古典的補体活性化経路のｃｌｇを強く結合させる［Klaus et
al.（１９７９）Immunology ３８：６８７］。ヒトにおいては、ＩｇＧ１及び
ＩｇＧ３は、これらの機能を媒介する。かくしてこれらのエフェクタ機能の結果
として、ＩｇＧ2aは、ウイルス感染、腫瘍［Kaminski et al.(１９８６）J.Immu
nol.１３６：１１２３］及び寄生虫［Wechsler et al.（１９８６）J.Immunol.
１３７：２９６８］に対してマウスをより良く保護し、細菌の浄化［Zigterman
et al.（１９８９）Infect. Immun.５７：２７１２］を増強させる。
【００８８】 ＴＨ１細胞とは対照的に、ＴＨ２細胞は、細胞媒介免疫を抑制するインターロ
イキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキ
ン−１０（ＩＬ−１０）及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を産生する
［Mosmann et al.（１９８６）、前出］。ＩＬ−４は、マウス内で補体をわずか
しか固定せずＡＤＣＣを媒介しないＩｇＧ１を生成するようＢ細胞を誘発する［
Klaus et al.（１９７９）Immunology３８：６８７］。これは同様に、マスト細
胞及び好塩基球に結合する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生を誘発する。その
結果、ＴＨ２細胞は主として、例えば蠕虫寄生虫に対する食作用独立型宿主防御
［Sher et al.(１９９２）Ann Rev Immunol. １０：３８５］及びアレルギー反
応の発生［Erb et al.（１９９６）Immunol. Cell Biol. ７４：２０６］の原因
となる。
【００８９】 Ｂ．ＴＨ１型及びＴＨ２型応答と病理学 先行技術により、動物の免疫系に対する分子の露呈によって惹起された免疫応
答の性質及び程度を規定するものとして、一定数の要因（例えば抗原型、宿主動
物の遺伝的背景、投与経路、アジュバント選択）が報告されている。例えば、可
溶性タンパク質及び炭水化物に対するマウスの抗体応答は、一般にそれぞれＩｇ
Ｇ1及びＩｇＧ3サブクラスに制限されている。このことは、ＩｇＧアイソタイプ
が無作為に選択されていないということを示唆している。実際、（一定範囲のＲ
ＮＡ及びＤＮＡウイルスを内含する）生きたウイルスは、特異的ＩｇＧ2a抗体の
産生を優先的に誘発する［Coutelier et al.（１９８７）J.Exp.Med.１６５：６
４］。生きたウイルスにより生成される感染プロセスは、ウイルス特異的ＴＨ１
応答を優先的に惹起するＩＦＮ−γの産生及びウイルス特異的ＩｇＧ2aの優位性
にとって非常に重要でありうるということが主張されている［Nguyen et al.（
１９９４）J. Immunol. １５２：４７８］。このことは同様に、複製する（生き
た）細菌及びＤＮＡワクチンが何故ＴＨ１バイアスされた応答を生み出すかをも
説明することができる［Londono et al.(１９９６)Vaccine １４：５４５；Pert
mer et al.（１９９６）J. Virol．７０：６１１９］。しかしながらインフルエ
ンザウイルス［Balkovic et al.(１９８７)Antiviral Res. ８：１５１］、Ｉ型
単純ヘルペスウイルス［ＨＳＶ−１；Mckendall et al.（１９８８）J. Gen Vir
ol ６９：８４７］、サイラーマウス脳脊髄炎ウイルス［Peterson et al.(１９
９２)Immunology７５：６５２］及び口蹄疫ウイルス（Perez-Filgucira et al.
（１９９５）Vaccine １３：９５３）といったような一部の生きたウイルスが、
ＩｇＧ2以外の優位なアイソタイプを惹起することも知られている。抗原の性質
に加えて、宿主動物の遺伝的背景が免疫応答の性質及び程度に影響を及ぼす。か
くして、インフルエンザウイルスの場合、ＢＡＬＢ／ｃマウスが卓越してＩｇＧ 2a を産生し、それでもＣ５７Bal/６は卓越してＩｇＧ1を産生する［Hocart et a
l.(１９８９）J. Gen. Virol. ７０：２４３９］。かくして、これらの生きたウ
イルスに対する免疫反応は、遺伝的要素（免疫ゲノム因子）に対し敏感である。
【００９０】 アジュバントの性質も又、免疫応答の性質を決定する上で１つの役割を果たす
。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）については、不活性ウイルスと共に油中水アジュ
バントが使用された場合を除いて、ＩｇＧ2bが、生きたもの及び不活性なものの
両方の全ウイルスに対し産生された優位なアイソタイプである。前記アジュバン
ト組合せの場合には、ＩｇＧ2aの優位性が結果としてもたらされる（Perez-Filg
ueira et al.（１９９５）Vaccine １３：９５３］、かくして、アジュバントの
選択は、Ｔヘルパ応答の分枝に明らかに影響を及ぼしうる。
【００９１】 その上、一部の不活性化されたウイルスは、卓越してＩｇＧ2a抗体を惹起する
ことができる。従って、全体として、さまざまな研究により、ウイルス特異的Ｉ
ｇＧ2aを惹起する能力が単に感染プロセスに起因せず、ウイルス自体の性質、マ
ウスのＨ−２ハプロタイプ、免疫化経路そしてアジュバントの選択にも左右され
得るということが示されている。
【００９２】 ＴＨ１及びＴＨ２型Ｔ細胞によって生成されたサイトカインプロフィールは、
病原体負担を低減、改善させるか又は除去しようとする病原体に対する示差的生
理学応答を導く。しかしながら、病原体に対する持続的又は過剰な反応に起因し
て、組織の損傷も発生する可能性がある。
【００９３】 特に、ＴＨ１の場合、マクロファージの動員及び活性化は、望ましくない肉芽
腫性炎症を導く可能性があり、その顕著な例が、類結核型のらい病である。感染
性微生物が、結核、ブルセラ病をひき起こす微生物といったような細胞内生体又
は生体ニューモシスティスカリニ (原生動物)、カンジダアルビカン又はリーシ
ュマニアメジャー（細胞内寄生虫−原生動物）である場合、ＴＨ１応答は、これ
らの生体を含有する細胞の削除を結果としてもたらす遅延型過敏症（ＤＴＨ）応
答を導く。感染近くのＩＦＮ−γの放出は、マクロファージを活性化する。マク
ロファージからのリソソーム酵素の局在化された放出は、感染を受けた細胞及び
健康なバイスタンダー細胞を殺し、結果として侵入する微生物の破壊をもたらす
。さらに、ＭＩＦ（マクロファージ阻害因子）と呼ばれるタンパク質のＴＨ１細
胞による放出が存在する。このタンパク質は、ＴＨ１細胞の付近であらゆるマク
ロファージを不動状態にする抗走化性因子である。かくして、マクロファージは
感染部位にとどまる。結核そして恐らくはニューモシスティスカリニが原因で見
られる肺の損傷は、組織内への活性マクロファージ及びリソソーム酵素の放出に
よってひき起こされる無差別細胞損傷の結果である。ＴＨ１が支配する応答は、
同様に、器官特異的自己免疫障害、急性同種異系移植片拒絶、原因不明の再発性
流産、接触皮ふ炎及び病因不明の一部の慢性炎症性障害の病因に関与している可
能性がある［Romagnani(１９９６）Clin、 Immunol. Immunopathol.８０：２２
５により要約されている) 不適切なＴＨ２応答は同様に、アレルギー及びぜんそくの発生において不利な
影響を及ぼし得る好塩基球及び好酸球の動員を含め、望ましくない結果をもたら
す可能性がある。ミョウバン接合型死菌ワクチンを含有するＲＳＭ（呼吸性シン
シチウムウイルス）ワクチンの早期形態に対する応答は、好酸球増多症及び気管
支けいれんの症例を導く不適切なＴＨ２応答の一例である。類似の反応は、ぜん
そく性症候を導くことができる。ＴＨ２型応答は同様に、オーメン症候群、一部
の細胞内病原体に対する保護の低下、移植寛容性、慢性、ＧＶＨＤ（移植片対宿
主病）、アトピー性障害及び一部の全身性自己免疫疾患の原因でもある。
【００９４】 ＭＨＣクラスＩＩ複合体内部のペプチドの配列（ひいては親和力）を改変する
ことでＣＤ４＋Ｔ細胞の応答の性質に影響が及ぼされる可能性があるということ
が指摘されてきた［Murray（１９９８）Immunol Today １９：１５７］。かくし
て、感染性作用物質からのタンパク質に由来するペプチドエピトープは、例えば
ＴＨ１とＴＨ２の応答の間の対病原体宿主応答の再方向づけをひき起こすべく進
化を通して修飾された状態となりうる。宿主と病原体の並行進化は、ＭＨＣサブ
セットに対して特別な親和力で結合する病原体上のＴ−エピトープの発生を結果
としてもたらす可能性がある。宿主応答は、多数の病原体及び病原体形態を検出
する必要条件を満たすように平衡化されなくてはならない。従って、１つの病原
体の免疫性決定因子における或る程度の配列変動が発生すると予想できる。或る
程度、これは、特定の免疫原に対する１つ反応の免疫調節すなわち野生型ペプチ
ドに対してもたらされたものに比べて全く異なるタイプの免疫反応を達成するた
めのペプチド内のアミノ酸の突然変異を考慮し得る１つの手段、を表わしている
。
【００９５】 Ｃ．植物ウイルス． 本発明は、抗体及び／又はサイトカインを生成し、ＴＨ１型応答、好ましくは
優位なＴＨ１型応答を刺激し、或る種の分子内で固有のものである現在の又は予
想上のＴＨ２型応答に向かう望ましくないバイアスを低減させるため、免疫原又
は抗原として有効である分子を免疫系の細胞に提示する能力をもつ複製しない修
飾された植物ウイルス粒子を提供する。
【００９６】 本発明は、カプシドについてコードする核酸が、その他の機能的分子について
コードするものとは別の半分であり、その外皮タンパク質がβ−バレル構造をも
つあらゆるウイルスの使用を考慮している。この構造をもつウイルスを使用する
利点は、βシートの個々のストランド間のループが、外来性ペプチドの挿入のた
めの適切な部位を提供しているという点にある。単数又は複数のループの修飾が
、本発明に従った外来性ペプチドの発現のための好ましい戦略である。１実施形
態においては、本発明は、コモウイルス［例えばカウピーモザイクウイルス及び
インゲン豆果斑紋ウイルス］、線虫媒介球状ウイルス［例えばトマト輸斑イルス
及びイチゴ潜伏性輪斑ウイルス］、トンブスウイルス［例えばトマト低木矮化ウ
イルス（ＴＢＳＶ）］及びソベモウイルス［例えばサザンビーンモザイクウイル
ス（ＳＢＭＶ）］の使用を考慮している。特に、トンブスウイルス及びソベモウ
イルスは、コモウイルス及び線虫媒介球状ウイルスのものと類似の３次元構造を
もつが、単一のタイプのβ−バレルしかもたない。
【００９７】 より好ましい実施形態においては、ウイルスはコモウイルスである。コモウイ
ルスの利点は、そのカプシドが、個々に操作され得る３つの異なるβバレルで各
々構成された６０のコピーを含み、かくして、単一のウイルス粒子による１つの
ペプチドの６０〜１８０のコピーの発現が可能となるという点にある。
【００９８】 コモウイルスは、野菜に優位に感染する少なくとも１４の植物ウイルスから成
るウイルス群である。そのゲノムは、直径約２８ｎｍの等尺性粒子の中に別々に
包膜されているサイズの異なる１本鎖、ポジティブセンスＲＮＡの２つの分子か
ら成る。２つのタイプの核タンパク質は、塩化caesium 密度勾配におけるその挙
動の結果として中間（Ｍ）及び底部（Ｂ）成分と呼ばれ、ここで、粒子内のＲＮ
Ａは、それぞれＭ及びＢ ＲＮＡとして知られている。両タイプの粒子共、大型
（ＶＰ３７）及び小型（ＶＰ２３）の外皮タンパク質各々の６０のコピーから成
る同一のタンパク質組成物を有する。核タンパク質粒子に加えて、コモウイルス
調製物は、上部（Ｔ）成分として知られている可変的量の空の（タンパク質のみ
）カプシドを含有する。好ましい１実施形態においては、コモウイルスは、カウ
ピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）である。
【００９９】 コモウイルスグループの１つの成員例であるカウピーモザイクウイルス（ＣＰ
ＭＶ）の場合、Ｍ及びＢの両方のＲＮＡがポリアデニル化され、その５′末端に
共有結合でリンクされた小型タンパク質（ＶＰｇ）をもつことがわかっている。
その他のコモウイルスに対するより制限された研究は、これらの特長がこのグル
ープの全成員のＲＮＡにより共有されているものであることを示唆している。Ｃ
ＰＭＶからの両方のＲＮＡは共にすでに配列決定されており、ポリ（Ａ）尾部を
除き、３４８１（Ｍ）と５８８９（Ｂ）のヌクレオチドから成ることが示されて
いる。両方のＲＮＡ共、単一の長い読取り枠を含有し、ウイルス遺伝子産物の発
現は、大型前駆体ポリペプチドの合成及びそれに続く分割を通して起こる。全植
物の感染には、両方のＲＮＡが必要とされるが、より大きいＢ ＲＮＡは、原形
質体内での独立した複製の能力をもつ。ただしこの場合、いかなるウイルス粒子
も産生されない。初期遺伝研究と結びつけて、この観察事実は、外皮タンパク質
がＭ ＲＮＡによってコードされることを立証した。
【０１００】 ＣＰＭＶの３.５Ａの電子密度地図は、特にトマト低木矮化ウイルス（ＴＢＳ
Ｖ）といったようなトンブスウイルス及び特にサザンビーンモザイクウイルス（
ＳＢＭＶ）といったようなソベモウイルスなどのＴ−３植物ウイルスとＣＰＭＶ
の間に明白な関係が存在することを示している。これらの前記ウイルスのカプシ
ドは、各々単一のβ−バレルドメインから成る１８０の同一の外皮タンパク質サ
ブユニットで構成されている。これらは、ビリオン内で３つの異なる位置Ａ、Ｂ
及びＣを占有し得る。ＣＰＭＶの２つの外皮タンパク質は、３つの全く異なるβ
−バレルドメインから成ることが示され、そのうち２つのドメインはＶＰ３７そ
して１つはＶＰ２３に由来するものである。かくして、Ｔ−３ウイルスと共通し
て、各々のＣＰＭＶ粒子は、１８０のβ−バレル構造で作り上げられている。Ｖ
Ｐ２３からの単一のドメインは、ＴＢＳＶ及びＳＢＭＶのＡ型サブユニットの位
置と類似の位置を占め、一方、ＶＰ３７のＮ−及びＣ−末端ドメインはそれぞれ
Ｃ及びＢ型のサブユニットの位置を占める（その全体が参考として内含されてい
る米国特許第５、８７４、０８７号）。
【０１０１】 ＣＰＭＶ及び該グループのもう１つの成員であるインゲン豆果斑紋ウイルス（
ＢＰＶＭ）の結晶のＸ線回折分析は、ＢＰＭＶとＣＰＭＶの３次元構造が非常に
類似しており、コモウイルスグループ全般に典型的なものであることを示してい
る。
【０１０２】 ＣＰＭＶ及びＢＰＭＶの構造においては、各々のβバレルは主として、さまざ
まな長さのループにより接続された逆行性βシートの８本のストランドから成る
。平坦なβシートは、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩシートと名付けられ、
接続ループはβＢ−βＣ、βＤ−βＥ、βＦ−βＧ及びβＨ−βＩループと呼ば
れる。
【０１０３】 コモウイルスは同様に、構造的に動物のピコルナウイルスと関係づけされる。
ピコルナウイルスのカプシドは、各々単一のβ−バレルドメインから成る３つの
異なる外皮タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の６０のコピーから成る。コモ
ウイルスの場合と同様、これらの外皮タンパク質は、前駆体ポリタンパク質の分
割によって放出され、ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰＩの順序で合成される。ＣＰＭＶの
３次元構造とピコルナウイルスのものを比較すると、ＶＰ３７のＮ末端及びＣ末
端ドメインがそれぞれＶＰ２及びＶＰ３と等価であり、ＶＰ２３がＶＰ１と等価
であることがわかった。構造的位置と遺伝子順の等価性は、ＶＰ３７が２つのピ
コルナウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２及びＶＰ３の未分割形態に対応するこ
とを示唆している。
【０１０４】 コモウイルスとピコルナウイルスの間の主要な差異の１つは、コモウイルスの
タンパク質サブユニットにはピコルナウイルス内に見い出されるβバレルのスト
ランド間での大きな挿入が欠如しているという点にあるが、粒子の根本的なアー
キテクチャは非常に類似している。βシート間の４つのループ「βＢ−βＣ、β
Ｄ−βＥ、βＦ−βＧ及びβＨ」は、ビリオンの構造的無欠性を維持するために
非常に重要であるが、本発明に従うと、細菌、ウイルス、免疫グロブリン、ホル
モン及びガン関連細胞表面タンパク質を内含する広範囲の供給源に由来する例示
的抗原部位といったような異種ペプチド配列の発現部位として使用される。
【０１０５】 Ｄ．問題の分子 本発明の修飾された植物ウイルス粒子は、例えば抗体及び／又はサイトカイン
を生成する、ＴＨ１型応答を増大する及び／又は分子に対するＴＨ２型応答を低
減させるといった目的であらゆる分子を免疫系の細胞に対し提示する能力をもつ
。本発明の修飾された植物ウイルス粒子に応答して生成される抗体を、分子を隔
離し精製するために使用することができる。代替的には、これらの抗体を、分子
に対する動物の露呈に付随する疾病を予防、診断又は治療するために使用するこ
ともできる。
【０１０６】 当該発明において応用するのに適した分子としては、本発明のウイルスの外皮
タンパク質の露呈部分で提供され得るあらゆる分子が含まれる。分子の例として
は、グリコペプチド、リポペプチド、糖脂質といったように、ペプチド配列、核
酸配列、多糖類及び／又は脂質を含む分子が含まれるが、これらに制限されるわ
けではない。
【０１０７】 本発明において有利に使用できる分子としては、精製されるもののその構造が
未知である分子、ならびに既知の構造をもつ精製された分子（例えば、既知のア
ミノ酸配列を伴うペプチド、既知の核酸配列を伴う核酸配列、既知の組成物及び
構造をもつ多糖類など）が内含される。好ましい実施形態においては、分子は精
製され、既知の構造をもつ。
【０１０８】 分子がペプチドである場合、それは、ペプチドが（以下に詳述する）本発明の
ウイルスの外皮タンパク質の露呈部分において発現されるような形でウイルスゲ
ノム内にそのペプチドをコードする核酸配列を挿入するため分子生物学的技術を
使用して本発明の修飾されたウイルスによって提示され得る。代替的には、分子
がペプチド配列、核酸配列、多糖類及び／又は脂質であるか又はそれを含有する
場合、かかる分子は、以下で記述されるように、本発明の植物ウイルスによって
発現される反応性ペプチドに化学的に接合され得る。
【０１０９】 本発明は、あらゆる供給源に由来するポリペプチド分子を考慮している。本発
明は、その範囲を制限することを意図してはいないものの、ガン細胞及び病原性
寄生虫（例えば細菌、ウイルス、原生動物、線虫、真菌など）に由来するポリペ
プチド、そして特にこれらの病原性寄生虫に由来する抗原性及び免疫性ペプチド
を考慮している。同じく本発明の範囲内に含まれているのは、疾病の発生と関連
するポリペプチド、サイトカインをコードするポリペプチド、ポリペプチドアレ
ルゲン、ホルモン、酵素、成長因子、抗イディオタイプ抗体、レセプタ、付着分
子及び上述のペプチドのいずれかの一部分又はその前駆体の一部分である。
【０１１０】 本発明の範囲内に入るものとして考慮されているガン細胞に由来するポリペプ
チドは、食道ガン関連抗原（米国特許第６，０６９，２３３号）、乳ガンと結び
つけられる哺乳動物特異的タンパク質（マンマグロビン）（米国特許第５，９２
２，８３６号）、前立腺ガンと結びつけられる前立腺ムチン抗原（米国特許第５
，３１４，９９６号）、ヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（米国特許第６，１０
０，４４４；５，９０２，７２５号）、結腸腺ガンのＳＦ−２５抗原（米国特許
第５，２１２，０８５号）、尿腫瘍関連抗原（米国特許第５，９９３，８２８号
）、メラニン形成性抗原（米国特許第６，０８７，１１０号）、ＭＡＲＴ−１黒
色腫抗原（米国特許第５，９９４，５２３号）、ヒト腫瘍関連抗原（ＰＲＡＴ）
（米国特許第６，０２０，４７８号）、ＴＲＰ−２タンパク質腫瘍抗原（米国特
許第６，０８２，７０３号）、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＵＡＮ）（米国特許第５，
９２２，５６６号）及びウイルス誘発型腫瘍と結びつけられる腫瘍特異的Ｔ抗原
（米国特許第６，００７，８０６号）により例示されるが、これらに制限される
わけではない。本書中の米国特許は各々その全体が参考として内含されている。
【０１１１】 病原細菌由来のポリペプチドの例としては、Bordetella Pertussis抗原（米国
特許第４，０２９，７６６；５，８９７，８６７；５，８９５，６５５号）、My
cobacterium tuberculosis抗原（米国特許第６，１１０，４６９号）、潰瘍性大
腸炎及び炎症性腸疾患に結びつけられるBacterioidesからのポリン抗原（米国特
許第６，０３３，８６４号）、Helicobacter pylori抗原（米国特許第６，０２
５，１６４号）、虫歯と結びつけられるStreptococcus抗原（米国特許第６，０
２４，９５８号）、下痢性疾患と結びつけられるCampylbacter jejuni 由来の抗
原（米国特許第５，８７４，３００号）、哺乳動物種の体内での多薬物耐性と相
関されるＰ−糖タンパク質細胞表面抗原（米国特許第４，８３７，３０６号）、
ゆ着性形成細菌内に存在する線毛抗原（米国特許第４，７９５，８０３号）及び
肺疾患と結びつけられるMoraxella catarrhalis 多膜小胞抗原（米国特許第５，
９９３，８２６号）が含まれる。米国特許の各々は、本書中にその全体が内含さ
れている。
【０１１２】 病原性ウイルスに由来するポリペプチドは、ロタウイルス抗原（米国特許第６
，１１０，７２４号）、ヒト免疫不全症ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）抗原及
びサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）抗原（米国特許第５，２６８，２６５号）
、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス抗原（米国特許第４，７０２，９０９号；６，１０３
，４８５号）、Ｄ型肝炎ウイルスのデルタ抗原（米国特許第４，６１９，８９６
号）、インフルエンザウイルス抗原（米国特許第６，０４８，５３７号）を一例
とするようなウイルスから単離され精製されたポリペプチドにより例示されるが
、これらに制限されるわけではない。同様に内含されているのは、口蹄疫ウイル
ス（ＦＭＤＶ）、ポリオウイルス、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）、及びヒト乳
頭腫ウイルス（ＨＰＶ）（米国特許第５，８７４，０８７号）、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）抗原（米国特許第５，７１２，０８７号）、Ｂ型肝炎コア抗原（米
国特許第４，８３９，２７７号）、エプスタインバールウイルス関連抗原（米国
特許第５，６７９，７７４号）。Ｖ型肝炎ウイルスＣ３３抗原（米国特許第５，
９８５，５４１号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原（米国特許第６，０
７４，８１７号）、ヒト免疫不全症ウイルス２型抗原（ＨＩＶ−２）（米国特許
第６，０３７，１６５号）、単純ヘルペスウイルス抗原（米国特許第６，０１３
，４３３号）及びＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩ抗原（米国特許第５，９２８
，８６１号）といったようなピコルナウイルス由来のものを含む（ただしこれら
に制限されるわけではない）、既知の配列をもつウイルスポリペプチドである。
本書に示された米国特許の各々は、その全体が参考として内含されている。
【０１１３】 本発明の範囲内に入る、病原性原生動物及び線虫に由来するポリペプチドとし
て例えば、マラリアをひき起こすPlasmodium vivax由来のペプチド抗原（米国特
許第５，８７４，５２７号）、リーシュマニア症と結びつけられたLeishmania抗
原（米国特許第５，８３４，５９２号）、線虫寄生虫Dirofilaria immitis（米
国特許第４，８３９，２７５号）、ウシアナプラスマ症をひき起こすAnaplasma
marginale の抗原（米国特許第４，９５６，２７８号）が含まれる。本書中の米
国特許の各々は、その全体が参考として内含される。
【０１１４】 疾病の発生と結びつけられるその他のポリペプチドも同様に、本発明の範囲内
に内含される。これらのポリペプチドには、例えばガンの発生と結びつけられる
ＧＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体（米国特許第６，０１３，４８１号）、哺乳動物の
マルピーギー上皮（例えば食道及び表皮）から抽出され慢性関節リウマチに結び
つけられる抗原（米国特許第５，８８８，８３３号）、Ｒｈ血液型抗原（米国特
許第５，８４０，５８５号）、アテローム硬化症プラークの存在及び進行を表わ
す抗原（米国特許第６，０２５，４７７号）、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性
関節リウマチ及び全身性狼瘡といったような自己免疫疾患に結びつけられるＩｇ
ＧＦｃ結合タンパク質抗原（米国特許第６，００４，７６０号）、全身性紅斑性
狼瘡（ＳＬＥ）と結びつけられるＳｍ−Ｄ抗原（米国特許第５，９４５，１０５
号）、単球抗原（米国特許第６，１２４，４３６号）、自己免疫内耳メニエール
病（米国特許第５，８８５，７８３号）、中皮腫及び卵巣ガンに関与するmesoth
elin分化関連抗原（米国特許第６、０８３、５０２号）、骨関連疾患に結びつけ
られる骨原性及び線維芽細胞抗原（ＯＦＡ）（米国特許第６，０７４，８３３号
）及び炎症性及びアレルギー反応に結びつけられたマスト細胞機能関連抗原（Ｍ
ＡＦＡ）（米国特許第６，０３４，２２７号）が含まれるが、これらに制限され
るわけではない。本書中の米国特許の各々は、その全体が参考として内含される
。
【０１１５】 同じく本発明の範囲内に内含されるのは、例えば、インターロイキン−１α、
インターロイキン−１β（米国特許第５，９６５，３７９号；５，９５５，４７
６号；５，０９６，９０６号）、インターロイキン−２、インターフェロン−α
、インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子（米国特許第５，９６５，３７９号）
、インターロイキン−６（米国特許第５，９６６，３７９号；５，９５５，４７
６号；５，９４２，２２０号；５，４６０，８１０号）、ＴＧＰ−β科［すなわ
ちＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ５及びＴＧＦβ１、２を含む
］、インヒビン科［すなわち、アクティビン及びインヒビンを含む］、ＤＰＰ／
ＶＧ１科［すなわち、骨髄形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；ＤＰＰ及びＶｇｌを
含む］、及びミューラー阻害物質科［すなわちミューラー阻害物質（ＭＩＳ）を
含む］を内含するＴＧＦ−β上科（米国特許第５、８３０、６７１号）、インタ
ーロイキン−１１、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ及び繊毛向神経性因子（
米国特許第５，４６０，８１０号）及びインターロイキン−１２（米国特許第５
，９５５，４７６号）といったような、サイトカインをコードするポリペプチド
である。本書中の米国特許の各々は、その全体が参考として内含される。
【０１１６】 本発明は同様に、スズメバチ毒液アレルギーをもつ患者を治療するのに使用さ
れるスズメバチ抗原５（米国特許第６，１０６，８４４、ＣＲＸＩＩＩ Cryptom
eria japonica 主要花粉アレルゲン（米国特許第６，０９０，３８６号）、ホソ
ムギ花粉アレルゲンLolp １ｂ.１及びLol p１ｂ.２（米国特許第５，９６５，４
５５号）、ハンノキ花粉、ハシバミ花粉及びカバノキ花粉（米国特許第５，６９
３，４９５号）、ハウスダストダニDermatophagoides farinae DerfＩ及びDerf
ＩＩアレルゲン及びD.pteronssinus DerpＩ及びDerpＶＩＩアレルゲン（米国特
許第５，９９５８，４１５号；６，０８６，８９７号；６，０７７，５１８号；
６，０７７，５１７号）、ネコアレルゲン（Fed dI）（米国特許第５，５４７，
６６９号）、ゴキブリ（ＣＲ）アレルゲン（米国特許第５，８６９，２８８号）
及び落花生アレルゲン（Ａra hＩＩ）（米国特許第５，９７３，１２１号）とい
ったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ポリペプチドアレルゲン
をも考慮している。本書中の米国特許の各々は、その全体が参考として内含され
ている。
【０１１７】 同様に本発明の範囲内に含まれるのは、例えば、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）
、上皮小体ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨrp）、及びその合成類似体（米国特許
第５，６９３，６１６号；６，１１０，８９２号）、天然に発生するヒト成長ホ
ルモン及びその変異体（米国特許第５，４２４，１９９号；５，９６２，４１１
号）、鳥類成長ホルモン（米国特許第５，１５１，５１１号）、黄体化ホルモン
放出ホルモン（ＬＨＲＨ）及びその類似体（米国特許第５，８９７，８６３号）
、核ホルモンレセプタタンパク質（米国特許第５，８６６，６８６号）、脱皮開
始ホルモン（米国特許第５，７６３，４００号）、ゴナドトロピン放出ホルモン
（米国特許第５，６８８，５０６号）及びメラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）（米
国特許第５，０４９，６５５号）を含むポリペプチドホルモンである。本書中の
米国特許の各々は、その全体が参考として内含されている。
【０１１８】 本発明の範囲内の核酸分子には、上述のポリペプチド分子の各々をコードする
ものが内含される。
【０１１９】 多糖類を含有し、本発明の範囲内に入る分子の例としては、病原性寄生虫（特
に細菌）に由来する多糖類及び糖タンパク質、ならびに卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）及び甲状腺刺激ホルモンといったような糖タンパ
ク質ホルモン（各々その全体が参考として内含されている米国特許第６，１０３
，５０１号；５，８５６，１３７号；５，７６７，０６７号；５，６３９，６４
０号；５，４４４，１６７号）がある。本発明で使用される脂質含有分子には、
病原性寄生虫由来のもの（例えばリポタンパク質、リポ多糖類など）が含まれる
。
【０１２０】 特に好ましい実施形態においては、分子はペプチドである。より好ましい実施
形態においては、ペプチドは、細菌（例えば、Pseudomonas aeruginosaのＯＭタ
ンパク質Ｐ、及びStaphylococcus aureus のフィブロネクチン結合タンパク質（
ＦｎＢＰ））、ウイルス（例えばイヌのパルボウイルス）、免疫グロブリン（例
えばヒトｍＩｇＥ）、ホルモン（例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン）、及びガン
関連細胞表面タンパク質（例えば、上皮成長因子レセプタ）に由来している。
【０１２１】 Ｅ．植物ウイルスによるポリペプチドの発現 本発明の植物ウイルスは、上述のようなあらゆる供給源に由来する問題のペプ
チドを発現するべく、（各々その全体が参考として内含されている）米国特許第
５，８７４，０８７号；５，９５８，４２２号に従って工学処理され得る。例え
ば、一例としてのコモウイルス（例えばＣＤＭＶ）は、１つのペプチドの６０〜
１８０のコピー（小型（Ｓ）外皮タンパク質の６０のコピー及び大型（Ｌ）外皮
タンパク質の６０のコピーの各々の上に１つのペプチドコピー）を単一のウイル
スから外部的に発現する能力をもつ。
【０１２２】 本発明の修飾された植物ウイルス内に取込まれうるペプチドは、好ましくは少
なくとも４つのアミノ酸を含有し、そのペプチドの性質及びサイズそしてそれが
ウイルス粒子内又はその上で置かれている部位が、in vitro又はin vivoで培養
された時点での修飾済みウイルスの集合能力と干渉しないという制限条件のみを
受ける。本発明をいずれかのタイプ又は供給源のペプチドに制限する意図はない
ものの、該ペプチドは、その機能がその活動のために特定の立体配座を必要とす
るようなものである。該ペプチドの生物学的活性は、以前に記述されているよう
に（その全体が参考として内含されている米国特許第５、９５８、４２２号）、
（例えば特定の生物学系内でのその安定性又は提示様式を改善するため）、より
大きな分子をもつペプチドの会合によって維持され得る。
【０１２３】 植物ウイルス核酸は、既存のウイルスゲノムに対する付加（すなわちその中へ
の挿入）としてか又はウイルスゲノムの一部に対する置換のいずれかとして、問
題のペプチドについてコードするヌクレオチド配列を導入することによって修飾
される。導入方法の選択は、大部分が、カプシドタンパク質の構造及び修飾され
たウイルスの植物内での集合能力と干渉することなく付加又は置換を行なうこと
のできる容易さによって決定される。
【０１２４】 １つの実施形態においては、問題のペプチドについてコードするヌクレオチド
配列は、ウイルスゲノム内に挿入される。第１の実施形態においては、問題のペ
プチドについてコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換部位は、その部位と
フランキングする直接的配列反復が存在しないような形で選択される。本発明に
おいては、問題のヌクレオチド配列を含有する構成体に関して使用される「直接
的配列反復」という語は、問題のヌクレオチド配列の両側に同一のオリゴヌクレ
オチド配列が存在することを意味する。問題のヌクレオチド配列をフランキング
する直接的配列反復を含む構成体は、フランキング配列反復の間の組換えの結果
として遺伝的に不安定であり、フランキングされたヌクレオチド配列の喪失及び
野生型配列への逆突然変異を導くことから、望ましくない。
【０１２５】 既存の配列の一部に対する置換として植物ウイルスゲノム内に外来性オリゴヌ
クレオチド配列が導入される１つの変形実施形態においては、置換されたウイル
スゲノム配列が、宿主植物内のウイルス複製、包膜及び／又は伝播にとって重要
であるウイルス外皮タンパク質内のアミノ酸配列をコードしないことが好ましい
。この欠陥は、本書中の教示と組合せて当該技術分野における既知の方法を用い
ることによって容易に決定及び回避され得る。
【０１２６】 問題のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、外皮タンパク質の露呈され
た部分をコードするウイルスゲノムの一部分を同定することによって、植物ウイ
ルス内に導入され得る。ウイルスに関して本書で使用されている「外皮タンパク
質の露呈された部分」という語は、外皮タンパク質の外表面上に配置されたウイ
ルス外皮タンパク質の一部分である。露呈され従って問題のポリペプチドの導入
のための潜在的に最適な部位である外皮タンパク質の一部分の場所は、植物ウイ
ルスの３次元構造の検査によって容易に同定され得る。さらなる実施形態におい
ては、外皮タンパク質の露呈された部分のアミノ酸配列は、潜在的に最適な挿入
部位であるためにαらせん構造を破るアミノ酸について検査される。適切なアミ
ノ酸の例としては、共にポリペプチド鎖の中で発生した時点でつねにらせんを中
断し剛性のこぶを作り出すか又はその構造内で彎曲する、プロリンとヒドロキシ
プロリンがある。
【０１２７】 上述の教示及び（各々その全体が参考として内含されている）米国特許第５，
９５８，４２２号及び５，８７４，０８７号の教示に従ってウイルス外皮タンパ
ク質内の適切な部位がひとたび選択されたならば、問題のペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、望ましい部位をコードする部位でウイルスゲノム内に導入
され得る。かかる導入は、ウイルス配列内への挿入又はそれに対する置換のいず
れかとして達成され得る。
【０１２８】 挿入が望ましい場合、これは２つの異なる制限酵素部位を選択し、選択された
制限酵素を用いて核酸を分割することによって達成できる。オリゴヌクレオチド
が選択された制限酵素部位と相容性のある端部で終結し、かくして分割されたウ
イルス核酸内への挿入を可能にするような形で、当該技術分野において既知の方
法（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）を用いて、問題のペプチドをコード
する２本鎖ヌクレオチド配列が合成される。この手順は、インサートをフランキ
ングする直接的配列反復の存在を回避する一方で、問題のペプチドについてコー
ドするヌクレオチド配列を導入する結果となる。必ずしも必要というわけではな
いが、好ましくは、問題のヌクレオチド配列が既存の核酸に対する付加として導
入されるような形で植物ウイルス配列によって問題のペプチドをコードする配列
がフランキングされているような相補的オリゴヌクレオチドが合成される。
【０１２９】 好ましい実施形態においては、植物ウイルスはＣＰＭＶであり、問題のペプチ
ドは小型外皮タンパク質（ＶＰ２３）内のβＢ−βＣループの中に挿入される。
このループは明らかにウイルス粒子の表面上に露呈され、コンピュータモデリン
グにより、この部位で挿入された大型ループでさえ、カプシド構造及び安全性の
原因となる隣接するサブユニット間の相互作用と干渉する可能性が低いというこ
とが示された。このループは、外来性配列を挿入できるＭＲＮＡ特異的配列の２
７０８の位置に、ユニークなＮｈｅＩ部位を有する。
【０１３０】 代替的には、ウイルスゲノム配列の置換が望ましい場合、置換のために選択さ
れるウイルス配列は、適切な制限酵素を用いて分割され（例えば、一例としての
ＣＰＭＶのＮｈｅＩ及びＡatＩＩ制限部位の間の配列）、以前に記述された通り
問題のペプチドをコードするヌクレオチド配列がそれに置換される（その全体が
参考として内含されている米国特許第５，９５８，４２２号）。
【０１３１】 植物ウイルス内への問題のペプチドの導入部位及びその様式を決定した後、以
前に記述された方法（各々その全体が参考として内含されている米国特許第５，
９５８，４２２号及び５，８７４，０８７号）を用いて、植物ウイルスの操作を
進めることができる。例えば、植物ウイルスがＲＮＡウイルス（例えばＣＰＭＶ
）である場合、ＲＮＡのｃＤＮＡクローンを用いて問題のペプチドを発現させる
ことが必要である。ＭＲＮＡのｃＤＮＡクローンが、植物内で感染性写しを生成
するべくウイルスｃＤＮＡの５′末端にリンクされたカリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータ配列を使用する異種ペプチドをコードする挿
入されたオリゴヌクレオチド配列を含有するような、ＣＰＭＶＲＮＡ Ｍ及びＢ
のｃＤＮＡクローンが構築されてきた。この技術は、in vitroで生成された写し
の使用に付随して遭遇する問題のいくつかを克服し、全ての植物ＲＮＡウイルス
に適用可能である。
【０１３２】 一例としてのＣＰＭＶのゲノム操作に特定的に言及すると、ＣＰＭＶ Ｂ Ｒ
ＮＡの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＢＴ７−１２３）と同様、転写ベクターｐＰＭ
１内のＣＰＭＶ Ｍ ＲＮＡの全長ｃＤＮＡクローンが入手可能である（ｐＰＭ
Ｍ２９０２）。ｐＰＭＭ２９０２及びｐＢＴ７−１２３からの写しの混合物は、
カウピー原形質体内に電気穿孔された時点で、完全ウイルス感染を生じさせる。
【０１３３】 インサートにフランキングする直接的配列反復の生成を回避するため、ＶＰ２
３をコードするＣＰＭＶゲノムの領域のヌクレオチド配列内に、第２の制限酵素
切断部位を作り上げることができる。例えば、Ｍ ＲＮＡの位置２７４０におけ
る単一のサイレント塩基変更（ＵからＣへ）が、アミノ酸バリン２７（ヌクレオ
チド配列の位置２７３５）においてユニークなＡatＩＩ部位を作り上げる。この
ことは、（その全体が参考として内含されている）米国特許第５，８７４，０８
７号内に記述された方法を用いて、Ｍ１３−ＪＲ−１の部位特異的突然変異誘発
によって達成できる。ＡatＩＩ部位の新規作成は、ＣＰＭＶ内の未変性βＢ−β
Ｃループから６つのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、ＮheＩ及びＡat
ＩＩでの消化により除去させることを可能にする。このとき、ＮheＩ及びＡatＩ
Ｉと相容性ある末端をもつあらゆる配列で、この配列を置き換えることが可能で
ある。
【０１３４】 本発明をいずれかの植物ウイルスタイプ、ウイルス内への問題のペプチドのい
ずれかの導入様式及び／又はウイルス内のいずれかの挿入部位に制限しようと意
図するわけではないが、好ましい実施形態においては、植物ウイルスは、カウピ
ーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり、問題のペプチドは、以前に記述された
通り（その全体が参考として内含されている 米国特許第５，９５８，４２２号
）、小型カプシドタンパク質（ＶＰ２３）のβＢ−βＣループ内のアラニン２２
（Ａｌａ22）とプロリン２３（Ｐro23）の間に挿入される。
【０１３５】 Ｆ．植物ウイルスに対する分子の接合 本発明の植物ウイルスは、以下で記述する通り、植物ウイルスに対して問題の
分子を化学的に接合させることにより免疫系の体液性及び／又は細胞成分に対し
任意の問題の分子を提示するべく修飾され得る。
【０１３６】 本書に使用されているように問題の分子及びウイルスに関するものとなってい
る「接合する」という語は、問題の分子の性質及びサイズそしてそれがウイルス
粒子に共有結合によってリンクされる部位が、in vitro又はin vivoで培養され
た時点で集合する修飾済みウイルスの能力と干渉しないという単一の制限条件を
伴って、ウイルスに対して問題の分子を共有結合によってリンクすることを意味
する。
【０１３７】 １．反応性ペプチド １実施形態においては、本発明は、ウイルス外皮タンパク質の露呈された部分
においてウイルスに対し問題の分子を接合させることを考慮している。これは、
植物ウイルスの野生型反応性ペプチド、又代替的にはウイルス外皮タンパク質の
表面上で発現される異種反応性ペプチドに対して問題の分子を接合させることに
よって達成できる。好ましい実施形態においては、問題の分子は、植物外皮タン
パク質の露呈された表面上で発現されている異種反応性ペプチドに接合される。
【０１３８】 「反応性ペプチド」という語は、問題の分子に共有結合する能力をもつ（野生
型か又は異種の）ペプチドを意味する。ペプチドと問題の分子の間の相互作用に
関して使用される「共有結合する能力をもつ」という語は、そのペプチドが、適
切な濃度の塩、化学的試薬、温度、ｐＨなどといった適切な条件の存在下で分子
に共有結合することを意味する。
【０１３９】 反応性の問題のペプチドは１〜１００、より好ましくは１〜５０、さらに一層
好ましくは１〜２０アミノ酸という範囲のサイズをもち得る。特に、少なくとも
３８のアミノ酸残基を、一例としてのＣＰＭＶの表面において表示させることが
できるということが立証されてきた（その全体が参考として内含されている 米
国特許第５，９５８，４２２号及び５，８７４，０８７号）。
【０１４０】 反応性ペプチド内のアミノ酸をいずれかの特定のタイプのアミノ酸残基に制限
することが意図されるわけではなく、１つの好ましい実施形態では、反応性ペプ
チドは、単数又は複数の「反応性アミノ酸」すなわち、例えば反応性アミノ酸及
び問題の分子の両方と共有結合する能力をもつ２官能性分子を介して間接的にか
又は直接的に問題の分子と共有結合リンケージを形成する能力をもつアミノ酸を
含有している。好ましい実施形態においては、反応性アミノ酸は、荷電アミノで
ある。「荷電アミノ酸」というのは、正味の正電荷又は正味の負電荷を含むアミ
ノ酸である。「塩基性アミノ酸」とも呼ばれる「正に帯電したアミノ酸」には、
リシン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。（酸性アミノ酸とも呼ばれる）
「負に帯電したアミノ酸」には、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステイン
が含まれる。カプシド表面における非安定化荷電残基の存在に対して本発明の植
物ウイルスが敏感であることから、必要条件ではないにせよ、反応性ペプチド上
の電荷レベルは最小限におさえられることが好ましい。このことは、反応性ペプ
チド内に負に帯電したアミノ酸と正に帯電したアミノ酸の両方を内含させ、負に
帯電したアミノ酸上の負の電荷が正に帯電したアミノ酸上の正の電荷によって少
なくとも部分的に反対平衡される（すなわち中和される）ようにし、こうして反
応性ペプチドが正味の正又は負の電荷を有するようにすることによって達成でき
る。より好ましい実施形態においては、負に帯電したアミノ酸上の負の電荷は、
正に電荷したアミノ酸上の正の電荷により完全に反対平衡され、かくして反応性
ポリペプチドは、ゼロの正味電荷を有することになる。
【０１４１】 反応性ペプチドの荷電アミノ酸は、隣接型でもよいし（すなわち介入する非荷
電アミノ酸残基又は無電荷アミノ酸類似体が無い状態で配置された２つ以上の荷
電アミノ酸）、又は非隣接型（すなわち少なくとも１つの介入する非荷電アミノ
酸残基又はアミノ酸類似体を伴って配置された２つ以上の荷電アミノ酸）であっ
てもよい。隣接型荷電アミノ酸は１つの〔例えば、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ（配列番号１）；Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ；Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ（配列番号２）；又はＨｉｓ−Ｈｉｓ］又は複数の（例えば、Ａｓｐ
−Ｇｌｕ；Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ；Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ；Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ、又はＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、又はＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
）アミノ酸残基で構成され得る。
【０１４２】 荷電アミノ酸が隣接型である場合、これらは、負に帯電したアミノ酸が互いに
隣接し、正に帯電したアミノ酸が互いに隣接しているような形で配置され得る。
かかる配列の例としては、正に帯電した配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−
Ｌｙｓ（配列番号３）及びＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（配列番号４）、及
び負に帯電した配列Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（配列番号５）及びＡｓｐ
−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（配列番号６）があるが、これらに制限され
るわけではない。代替的には、荷電アミノ酸が隣接型である場合、これらは、負
に帯電したアミノ酸が互いに隣接せず、かつ／又は正に帯電したアミノ酸が互い
に隣接しないような形で配置され得る。
【０１４３】 隣接型の負に帯電したアミノ酸の配列は、Ｘを隣接型の正に帯電したアミノ酸
とし、Ｙを隣接型の負に帯電したアミノ酸の配列であり、ｎが１〜５０の整数、
より好ましくは１〜２５、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸であるものと
してＸｎＹｎという構造式によって記述されるように隣接する正に帯電したアミ
ノ酸配列に隣接してよい。これは、配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ａｒｇ、Ｇｌ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号７）、及びＡｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈ
ｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号８）によって例示される。
【０１４４】 さらに、隣接型の荷電アミノ酸の配列は、反復配列として反応性ペプチド内で
発生し得る。ペプチド配列内に含まれているアミノ酸配列に関連して用いられる
「反復配列」という語は、アミノ酸配列が１〜２回、より好ましくは１〜１０回
そして最も好ましくは１〜１００回、ペプチド配列内で反復されることを意味す
る。ペプチド配列の反復は、非隣接型でも隣接型でもよい。反復ペプチド配列に
関連して用いられる「非隣接型反復」という語は、少なくとも１つのアミノ酸（
又はアミノ酸類似体）が反復配列の間に置かれていることを意味する。反復ペプ
チド配列に関連して用いられる「隣接型反復」という語は、反復配列間には介入
するアミノ酸（又はアミノ酸類似体）が全く存在しないことを意味する。
【０１４５】 １つの好ましい実施形態においては、反応性ペプチドは、隣接型の正に帯電し
たアミノ酸の反復配列ならびに隣接型の負に帯電したアミノ酸の反復配列を含有
し、ここで隣接型の正に帯電したアミノ酸配列内の正に帯電したアミノ酸残基の
合計数は、隣接型の負に帯電したアミノ酸配列内の負に帯電したアミノ酸残基の
合計数と同じである。さらに一層好ましい実施形態においては、隣接型の正に帯
電したアミノ酸配列は、隣接型の負に帯電したアミノ酸配列と隣接している。こ
れは、配列Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号９）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（
配列番号１０）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１１）、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１２）、
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号１３）、Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−
Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号１４）、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１５）に
よって例示される。
【０１４６】 好ましい実施形態においては、反応性ペプチドは、非隣接型の負に帯電したア
ミノ酸及び非隣接型の正に帯電したアミノ酸を含むものとして考慮されている。
換言すると、（負又は正のいずれに帯電しているにせよ）荷電アミノ酸には、非
荷電の（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、プ
ロリン、アスパラギン及びグリタミン）又は異なる電荷をもつアミノ酸（又はア
ミノ酸類似体）が間に配置されていてよい。より好ましい実施形態においては、
反応性ペプチドはさらに、隣接型荷電アミノ酸配列を含み、ここで隣接型荷電ア
ミノ酸配列は、隣接型の負に帯電したアミノ酸又は隣接型の正に帯電したアミノ
酸のいずれかで構成されている。より好ましい実施形態においては、該配列は、
一般構造式、Ａｓｐ−Ｇｌｕn−Ｇｌｙ−Ｌｙｓn−Ａｓｐ−Ｇｌｕn（配列番号
１６）、Ａｓｐ−Ｇｌｕa−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ2n−Ａｓｐ−Ｇｌｕn（配列番号１７
）、Ｌｙｓ−Ａｒｇn−Ｓｃｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（配列番号１
８）、Ｌｙｓ−Ａｒｇn−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｓｐa−Ｇｌｕ（配列番号
１９）の配列により例示され、ここでｎは１〜４０の整数である。さらに一層好
ましい実施形態においては、該配列は、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｓｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｓｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ（配列番号２０
）である。
【０１４７】 上述の教示及び（各々その全体が参考として内含されている）米国特許第５、
９５８、４２２号及び５、８７４、０８７号の教示に従って、あらゆる異種反応
性ペプチドを植物ウイルス粒子へと遺伝子工学処理することができる。特に、植
物ウイルスの外皮タンパク質の露呈された部分において、異種反応性ペプチドを
発現させることができる。反応性アミノ酸が植物ウイルスの外皮タンパク質上で
表示され、より好ましくはカプシド構造から外向きに延び、かくして反応性ペプ
チドの反応性アミノ酸に対する化学的リガンド及び試薬のアクセスを容易にする
ような形で、植物ウイルス粒子内に反応性ペプチドが挿入されることが好ましい
。１つの実施形態においては、反応性ペプチドは、カウピーモザイクウイルスの
小型外皮タンパク質（ＶＰ−Ｓ）のアニリン２２とプロリンの間に挿入される。
【０１４８】 ２．反応性ペプチドに対する問題の分子の接合 当該技術分野において既知の方法を用いて本発明の植物ウイルスにより表示さ
れる反応性ペプチド（野生型か又は異種のいずれであるかには無関係に）に対し
、あらゆる問題の分子を接合させることができる。例えば、ポリペプチドに対す
る多糖類の接合方法としては、ＮａＩＯ4活性化多糖類に対するアルファ−又は
イプシロン−アミノ基のカップリング［Bocher et al.(１９９７)J.Immunol. Me
thods２７：１９１−２０２］、カップリング試薬としてのスクアリン酸ジエス
テル（１，２−ジエトキシシクロブテン−３，４−ジオン）の使用［Tietze et
al.(１９９１） Bioconjug Chem.２：１４８−１５３］、多糖類が還元性末端を
有しカルボキシ基を含まないペプチドリンカーを介してのカップリング（米国特
許第５，３４２，７７０号）、ヒト熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５に由来する
合成ペプチドとのカップリング（米国特許第５，７３６，１４６号）及び米国特
許第４，６３９，５１２号の方法の使用がある。これらの方法は、例えばStaphy
lococcus epidermidis表面抗原を含む多糖類抗原に適用され得る。本書中の米国
特許は、その全体が参考として内含されている。
【０１４９】 糖タンパク質をペプチドに対し糖タンパク質の炭水化物半分を介して接合する
ための方法が、例えば、過ヨウ化ナトリウムとの穏やかな酸化及びその後のペル
オキシダーゼヒドラジドとの反応による炭水化物半分上の反応性アルデヒドの生
成［D'Alessandro et al.(１９９８)Clin. Chim. Acta２２：１８９−１９７］
、遊離チオールに対する炭水化物由来のアルデヒドのカップリングを可能にする
ヘテロ２官能性架橋試薬４−９４−Ｎ−マレイミドフェニル］ブチル酸ヒドラジ
ド（ＭＰＢＨ）の使用［Chamow et al.(１９９２)J.Biol Chem.２６７：１５９
１６−１５９２２］、穏やかなアルカリ性条件（ｐＨ７〜９）下でのペプチドに
対するカップリングに先立ち多糖類を活性化するための有機シアニル化試薬１−
シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）
の使用［Lees et al.(１９９６)Vaccine １４：１９０−１９８］、多糖類のカ
ルボキシル活性化又はヒドロキシル活性化［Devi et al.(１９９５)Infect、 Im
mun.６３；２９０６−２９１１］。ペプチドに対するカップリングに先立つ多糖
類のアルカリ処理［Kabir(１９８７)J. Med. Microbiol.２３：９−１８］及び
米国特許第４，６３９，５１２号の方法、を用いて記述されてきた。これらの方
法は、例えば、［ヒト免疫不全症ウイルス２型（ＨＩＶ−２）抗原（米国特許第
６，０３７，１６５号）及びＰ−糖タンパク質細胞表面抗原（米国特許第４，８
３７，３０６号）によって例示される］糖タンパク質抗原を植物ウイルスに接合
させるために応用することができる。本書中の米国特許の各々は、その全体が参
考として内含されている。
【０１５０】 同様に例えば糖タンパク質のうちの１つのアジドベンゾイル誘導体に対する光
活性化などによってといったように糖タンパク質の接合に対し適用された先行技
術を使用することによって、ウイルス上の反応性ペプチドに対し糖タンパク質を
共有結合でリンクさせるために、糖タンパク質のタンパク質又は多糖類半分のい
ずれでも使用することができる［Rathnam et al.（１９８０）Biochim. Biophys
. Acta ６２４：４３６−４４２］。
【０１５１】 タンパク質に対しタンパク質を接合させるための方法が本書で記述されている
（すなわちｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（
ＭＢＳ）で活性化された問題のタンパク質とシステイン残基を含有する反応性異
種ペプチドを接合させる方法：例１１）。タンパク質アレルゲンに対してＳＬタ
ンパク質を接合する方法［Jahn-Schmid et al.(１９９６）Immunotechnology２
：１０３］。ヒト熱ショックタンパク質 ｈｓｐ６５に由来する合成ペプチド担
体とのカップリング（米国特許第５，７３６，１４６号）、抗体にペプチドを接
合させるのに使用される方法（米国特許第５，１９４，２５４号；４，９５０，
４８０号）、インシュリンフラグメントに対しペプチドを接合させるのに使用さ
れる方法（米国特許第５，４４２，０４３号）、米国特許第４，６３９，５１２
号の方法、及びＥＤＡＣ［１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド］媒介アミド形成を用いてＩｇＧ担体に対し環状デカペプチドポリミ
クシンＢ抗生物質を接合させる方法［Drabick et al.（１９９８）Antimicrob.
Agents Chemother. ４２：５８３−５８８］を含めた、付加的ないくつかの方法
も同様に知られている。本書中の米国特許は、その全体が参考として内含されて
いる。
【０１５２】 各々その全体が参考として内含されている 米国特許第５，５７４，１４２；
６，１１７，６３１；６，１１０，６８７号の中で記述されているもののような
、タンパク質に対し核酸を接合するアプローチも同様に、当該技術分野において
知られている。
【０１５３】 第２又は第３アミンを含有するエーテルリンケージ及び還元性アミノ化の使用
（米国特許第６，０７１，５３２号）、米国特許第４，６３９，５１２号の方法
、単層リポゾームに対しペプチドを共有結合でカップリングするのに使用される
方法［Friede et al.(１９９４）Vaccine １２；７９１−７９７］、ヘテロ−２
官能性試薬Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を用
いてリポゾームに対しヒト血清アルブミンをカップリングする方法［Kamps et a
l.（１９９６）Biochim、 Biophys、Acta １２７８：１８３−１９０］、リン脂
質−ポリ（エチレン グリコール）−マレイミドアンカーを用いた、抗体Ｆab′
フラグメントをリポゾームにカップリングする方法［Shahinian et al.（１９９
５）Biochim Biophys. Acta １２３９：１５７−１６７］、及びシステイン−セ
リンスペーサアミノ酸を介してPlasmodiumＣＴＬエピトープをパルミチン酸にカ
ップリングする方法［Verheul et al.（１９９５）J. Immunol Methods １８２
；２１９−２２６］を含む（ただしこれに制限されるわけではない）、ペプチド
に対し脂質を接合するための方法が、当該技術分野において記述されてきた。本
書中の米国特許は各々、その全体が参考として内含されている。
【０１５４】 Ｇ．動物に対する組成物の投与 １つの実施形態においては、ワクチンの免疫原性成分として、抗原分子の提示
のために本発明の修飾されたウイルスが使用されることが考慮されている。本発
明の修飾された植物ウイルスは、例えばウイルスの外皮タンパク質の露呈部分上
の場所によって免疫系により容易に認識されるような形で植物ウイルス粒子上で
抗原分子を提示することから、ワクチン設計の情況下で特に魅力あるエピトープ
提示系を提供する。本発明の修飾されたウイルスは、望ましいあらゆる経路によ
って（例えば鼻腔内、経口、中心静脈内、皮下、末梢静脈内、皮下、髄腔内、腹
腔内、筋内など）によりレシピエント動物に投与され得る。
【０１５５】 本書で提示されたデータは、本発明の修飾された植物ウイルスが外来性免疫調
節作用物質（例えばアジュバント、サイトカインなど）の有無に関係なく免疫系
の細胞及び／又は体液性成分に対しその効果を及ぼすということを立証している
ものの、本発明は、明示的に、これらの作用物質の不在下での本発明の応用に限
定されていない。例えば、アジュバントは、免疫応答の性質ならびに結果として
得られた免疫反応の特定の経路を増強するために機能することから、当業者は、
該アジュバントが惹起されたＴヘルパー経路に対してもつ影響とは無関係に、本
発明の修飾されたウイルスと合わせたアジュバントの内含を望ましいことである
とみなすかもしれない。
【０１５６】 本発明は、一例としてのアジュバントミョウバン、ＦＣＡ／ＦＩＣＡ及びＱＳ
−２１を用いて例示されたが、本発明がこれらのアジュバントに制限されるもの
ではないことが明示的に考慮されている。むしろ、抗原、ホルモン、薬物及び血
清と複合体を作る能力をもつ合成樹脂材料及びエマルジョン系を含有するもの（
米国特許第３，９１９，４１１号）、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロビレ
ンブロック共重合体の共重合体（米国特許第６，０８６，８９９号）、１Ｈ−イ
ミダゾ（４，５−Ｃ−キノリン）−４−アミン及びその誘導体（米国特許第６，
０８３，５０５号）、突然変異体Escherichia coli易熱性腸毒素ホロトキシン（
米国特許第６，０３３，６７３号）、ホルミルメチオニルペプチド（ｆＭＬＰ）
（米国特許第６，０１７，５３７号）、経皮投与に特に適しているＡＤＰ−リボ
シル化外毒素（米国特許第５，９８０，８９８号）、インターロイキン−１２（
米国特許第５，９７６，５３９号）、ポリジメチルシロキサン及び複合乳化剤（
米国特許第５，９０４，９２５号）、ヘモゾイン又はβ−ヘマチン（米国特許第
５，８４９，３０７号）、Sacharomyces cervisiaeグルカン（米国特許第５，８
０４，１９９号）、水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル、レシチン及びポリアル
ファオレフィン（米国特許第５，２３２，６９０号）、粘膜を介した抗原の局所
的投与に有用なポリオキシエチレンソルビタンモノエステル（ＰＳ）（米国特許
第５，９４２，２３７号）及び経皮リポゾーム（米国特許第５，９１０，３０６
号）といったような（ただしこれらに制限されるわけではない）あらゆる問題の
アジュバントを含み入れることができる。さらに、結晶性細菌表面層（ＳＬ）に
抗原を接合させることによりアジュバントとしてＳＬを用いる方法も同様に、当
該技術分野において知られている［Jahn-Schmid et al.（１９９７）Internatio
nal Immunology９：１８６７−１８７４］。本書中の米国特許の各々は、その全
体が参考として内含されている。
【０１５７】 さらに、効力のために賦形剤又はサイトカインを必要としないものの、本発明
の修飾されたウイルスは、有利な賦形剤又はサイトカインと共に使用して同時投
与することもできる。サイトカインの例としては、制限的な意味はないものの、
インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、イ
ンターロイキン−１１、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、腫瘍壊
死因子、ＴＧＦ−β科、インヒビン科、ＤＰＰ／ＶＧ１科、ミューラー阻害物質
科、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ及び毛様体神経栄養性因子が含まれる。
本発明の修飾された植物ウイルスと組合わせて使用できる薬学賦形剤には、改善
された圧縮性をもつ例示的徴晶質セルロースベースの賦形剤（米国特許第６，１
０３，２１９号）、グアールガムを含有する薬学的錠剤の硬度定格を増大させる
のに適したガラクトマンナン親水コロイド（米国特許第６，０６３，４０２号）
、錠剤又はペレットからの活性化合物の緩放出用賦形剤として有用である架橋ア
ミロース（米国特許第５，８０７，５７５号）、錠剤の形に圧縮可能な酵素より
宿鎖されたでんぷん（米国特許第５，４６８，２８６号）及び鼻腔粘膜への刺激
性のない送達のため噴霧可能な又は滴下可能な形で調製できる脂質小胞賦形剤（
米国特許第５，２００，３９３号）が含まれる。米国特許の各々は、その全体が
参考として内含されている。
【０１５８】 Ｈ．ＴＨ１型応答の増大 本発明の修飾されたウイルスは、問題の分子に対するＴＨ１応答を増大させ、
かくしてこのウイルスを例えば感染症、ガン及びアレルギーをターゲットとする
分子のための特に魅力的な担体にする上で特に有用である。
【０１５９】 問題の分子を含む修飾されたウイルスに対する動物の応答に関連して用いられ
る「ＴＨ１応答のレベルを増大させる」及び「増大したＴＨ１応答レベル」とい
う語は、分子又はウイルスによる刺激時点でＴＨ１リンパ球によって生成される
細胞及び／又は体液性応答のうちの任意の単数又は複数のもののレベルが、対照
動物内での対応する応答に比べて何らかの統計的に有意な量だけ増大させられて
いることを意味している。特に、問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露
呈された動物体内の増大したＴＨ１応答レベルは、（ａ）増大したＴＨ１関連免
疫グロブリンレベル、（ｂ）増大したＴＨ１関連サイトカイン、及び／又は（ｃ
）増大したＴＨ１細胞増殖レベル、を意味する。
【０１６０】 問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露呈された動物の体内の「増大し
たＴＨ１関連免疫グロブリンレベル」という語は、同じサブクラスの合計ＴＨ１
関連免疫グロブリンの量との関係における、問題の分子又はウイルスのいずれか
に特異的なＴＨ１関連免疫グロブリンサブクラス（例えばマウスＩｇＧ２ａ、マ
ウスＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３など）のうちの単数又は複数の数
量の増大、好ましくは少なくとも０.１％、より好ましくは０.１％〜５０％、さ
らに一層好ましくは０.１％〜２０％そして最も好ましくは０.１％〜１０％の増
大を意味する。例えば、同じマウスにおける合計マウスＩｇＧ２ａの量との関係
における分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇＧ２ａの量の５％
の増大が、マウス体内のＴＨ１放出レベルの増大とみなれる。同様にして、同一
マウス内の合計マウスＩｇＧ２ｂの量との関係における分子特異的（及び／又は
ウイルス特異的）マウスＩｇＧ２ｂの量の１％の増大が、マウス体内のＴＨ１応
答レベルの増大とみなされる（例えば表４参照）。
【０１６１】 代替的には、問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露呈された動物にお
ける「増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレベル」という語は、一方では、同じ
サブクラスの合計ＴＨ１関連免疫グロブリンの量に対する問題の分子又はウイル
スのいずれかに特異的である単数又は複数のＴＨ１関連免疫グロブリンサブクラ
ス（例えばマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３
など）の量の比率と、他方では同じサブクラスの合計ＴＨ２関連免疫グロブリン
の量に対する（それぞれ）問題の分子又はウイルスのいずれかについて特異的で
ある単数又は複数のＴＨ２関連免疫グロブリンサブクラス（例えばマウスＩｇＧ
１、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ２など）の量の比率の、好ましくは少なくとも
２倍、より好ましくは２〜１００，０００倍、より好ましくは２〜１０，０００
そして最も好ましくは２〜２，０００倍の増大を意味する。例えば、同じマウス
の体内での分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇＧ１：合計Ｉｇ
Ｇ１の比率との関係における、分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウス
ＩｇＧ２ａ対合計ＩｇＧ２ａの比率の１，０００倍の増大が、そのマウスにおけ
るＴＨ１応答レベルの増大とみなされる。同様にして、同じマウスの体内での分
子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇＧ３：合計ＩｇＧ３の比率と
の関係における、分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇＧ２ｂ対
合計ＩｇＧ２ｂの比率の２，０００倍の増大が、そのマウスにおけるＴＨ１応答
レベルの増大とみなされる（例えば表４参照）。
【０１６２】 さらにもう１つの変形形態においては、問題の分子を含有する修飾されたウイ
ルスに露呈された動物の体内の「増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレベル」と
いう語は、対照動物内の分子特異的（及び／又はウイルス特異的）ＴＨ１関連免
疫グロブリンの幾何平均エンドポイント力価に比べた、分子特異的（及び／又は
ウイルス特異的）ＴＨ１関連免疫グロブリンの幾何平均エンドポイント力価の増
大、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは２〜１０，０００倍、さらに好
ましくは２〜１，０００倍、さらに一層好ましくは２〜１００倍、そして最も好
ましくは２〜５０倍の増大を意味する。「エンドポイント力価」という語は、分
子と組合わされた場合の検出可能な反応（例えばＥＬＩＳＡ）を生成する抗体の
最高希釈でありかつ一定の与えられた分子に特異的な抗体希釈である。例えば、
対照マウス内の分子特異的マウスＩｇＧ２ａの幾何平均エンドポイント力価に比
較した、治療対象マウス体内の分子特異的マウスＩｇＧ２の幾何平均エンドポイ
ント力価の２０倍の増大が、増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレベルとみなさ
れる（例えば表２及び３を参照）。
【０１６３】 個々のＢ細胞（ならびにハイブリドーマといったようなＢ細胞と融合された細
胞）によって産生された免疫グロブリンレベルを定量する方法は、ＥＬＩＳＡ及
びＥＬＩＳＰＯＴといったような本書に記述されているものを含めたさまざまな
テスト及び市販の試薬を用いてin vitroで直ちに達成される。Sebwick et al.（
１９８３）J.Immunol. Methods５７：３０１−３０９を参照のこと。又Mazer et
al.、(１９９１）J.Allergy Clin. Immunol.８８：２３５−２４３．も参照の
こと。
【０１６４】 さらにもう１つの変形形態においては、「増大したＴＨ１応答レベル」は、Ｔ
Ｈ１関連サイトカインレベルの増大を意味する。問題の分子を含有する修飾され
たウイルスに露呈された動物の体内の「ＴＨ１関連サイトカインレベルの増大」
という語は、その動物のＴＨ１細胞により産生されるＴＨ１関連サイトカインの
量が、対照動物のＴ細胞によって産生されるＴＨ１関連サイトカインの量との関
係において治療動物の体内で好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは２〜１
０，０００倍、さらに好ましくは２〜１，０００倍、そして最も好ましくは１〜
１００倍だけ増大させられたことを意味する。サイトカインの数量は、例えば、
市販の試薬を用いて本書に記述されている通りに例えばＥＬＩＳＡなどを用いて
決定できる（例えば表６）。
【０１６５】 さらなる変形形態においては、「増大したＴＨ１応答レベル」は、増大したＴ
Ｈ１細胞増殖レベルを意味する。問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露
呈された動物の体内の「増大したＴＨ１細胞増殖レベル」という語は、その動物
により産生される増殖するＴＨ１細胞の数が、対照動物によって産生される増殖
するＴＨ１細胞の数との関係において、好ましくは少なくとも２倍、より好まし
くは１〜１０，０００倍、さらに好ましくは２〜１，０００倍、そして最も好ま
しくは１〜１００倍だけ増大させられたことを意味する。増殖するＴＨ１細胞の
数は、例えば、本書に記述されているものといったような方法を用いて決定され
得、そのＴＨ１型は、ＴＨ１関連サイトカインの存在についてのこれらの細胞の
上清の検査によって決定され得る（例えば、表６）。
【０１６６】 １つの実施形態においては、本発明の修飾された植物ウイルスが治療的量だけ
患者に投与されることが考慮されている。
【０１６７】 本書に提示されているデータは、ＣＰＭＷの例示的キメラウイルス粒子（ＣＶ
Ｐ）でのマウス免疫化が、ＥＬＩＳＡによって見極められるように、血清中で主
としてＣＰＭＶ−及びペプチド特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体を生成する
ことを実証している。酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析により、Ｔ
Ｈ１型に向かっての抗体応答内のバイアスが確認され、ＣＶＰが、脾臓内で優位
な形でＣＰＭＶ−及びペプチド特異的ＩｇＧ２ａ−及びＩｇＧ２ｂ産生Ｂ細胞を
プライミングしうるということが実証された。これとは対照的に、ＣＰＭＶ−及
びペプチド特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体産生Ｂ細胞（ＴＨ２免疫経路の産物
）は、全くないわけではないものの低レベルでしか検出されなかった。
【０１６８】 さらに、本発明は、ＣＶＰで免疫化されたマウスからの脾細胞（Ｔ細胞）が、
in vitroでＣＰＭＶに対し増殖し、高レベルのＩＦＮ−γ（ＴＨ１関連サイトカ
イン）を産生するものの、ＩＬ−４（ＴＨ２関連サイトカイン）は検出可能なレ
ベルでは産生しなかったということを開示している。このことはすなわち、ＣＶ
Ｐが、それ自体ペプチド特異的Ｂ細胞応答のアイソタイプを支配するウイルス担
体に対するＴＨ１型応答を惹起することを示唆している。ＴＨ１型に向かっての
応答のバイアスは、抗原の性質、接種された個体の遺伝的背景、アジュバントの
選択又は投与されたＣＶＰ用量又は用量投薬計画によって影響されなかった。
【０１６９】 本書で提示されているデータは、好ましい実施形態において、ＴＨ１関連サイ
トカイン（例えばＩＦＮ−γ）のレベルが、ＴＨ２関連サイトカイン（例えばＩ
Ｌ−４）のレベルに変化がない場合において本発明の修飾されたウイルスでの治
療に応答して増大したということを実証しているものの、本発明は検出可能なレ
ベルのＴＨ２関連サイトカインが全く無い場合のＴＨ１関連サイトカインの増大
に制限されるわけではない、ということが明示的に考慮されている。むしろ、本
発明はその範囲内に、明示的に、ＴＨ２関連サイトカインのレベルの変化（もし
あれば）とは無関係のＴＨ１関連サイトカインのレベルの増大を内含している。
【０１７０】 上述のデータは、アジュバント又はサイトカインといったような外来性免疫調
節作用物質の必要なくＴＨ１エフェクタ型に向かって発現されたペプチドに対す
る免疫応答を導くという哺乳動物細胞内で感染又は複製しない本発明の修飾され
たウイルスの能力が、ワクチン担体系としての本発明の植物ウイルスの１つの利
点である、ということを立証している。
【０１７１】 換言すると、本書で提供されている修飾されたウイルスは、哺乳動物への接種
という情況下で不活性ウイルスとして挙動する。不活性ウイルスはＴＨ２応答を
開始させることが先行技術により予測されているものの、本書で提供されている
不活性ウイルスは驚くべきことに、ＴＨ１型の応答を惹起する。
【０１７２】 Ｉ．ＴＨ２型応答の低減 本発明の修飾されたウイルスは、問題の分子に対するＴＨ２応答を低減させる
ことが望ましい利用分野において有用である。例えば、動物に対する分子（例え
ば細菌抗原）の投与がＴＨ２応答（部分的、優位又は排他的のいずれであるかに
かかわらず）を生成することがわかっている場合、もう１つの動物の体内のＴＨ
２応答は、本書に記述されているように、修飾された植物ウイルスの情況下でそ
の他の動物にその分子を提示することによって低減され得る。
【０１７３】 「部分的ＴＨ１応答」及び「部分的ＴＨ２応答」という語は、その動物が、（
ａ）ＴＨ１及びＴＨ２関連免疫グロブリン、（ｂ）ＴＨ１及びＴＨ２関連サイト
カイン及び／又は （ｃ）ＴＨ１及びＴＨ２細胞増殖を示していることを意味す
る。
【０１７４】 「優位なＴＨ２応答」は、ＴＨ２関連免疫グロブリン、ＴＨ２関連サイトカイ
ン及びＴＨ２細胞増殖のうちの任意の単数又は複数のもののレベルがそれぞれＴ
Ｈ１関連免疫グロブリン、ＴＨ１関連サイトカイン及びＴＨ１細胞増殖のレベル
よりも統計的に大きいような、部分的ＴＨ２応答である。これに対し、「優位な
ＴＨ１応答」というのはＴＨ１関連免疫グロブリン、ＴＨ１関連サイトカイン及
びＴＨ１細胞増殖のうちの任意の単数又は複数のもののレベルがそれぞれＴＨ２
関連免疫グロブリン、ＴＨ２関連サイトカイン及びＴＨ２細胞増殖のレベルより
も統計的に大きいような、部分的ＴＨ１応答である。
【０１７５】 「排他的ＴＨ２応答」というのは、ＴＨ１関連免疫グロブリン、ＴＨ１関連サ
イトカイン及びＴＨ１細胞増殖が全く無い状態で動物がＴＨ２関連免疫グロブリ
ン、ＴＨ２関連サイトカイン及びＴＨ２細胞増殖を示す、優位なＴＨ２応答であ
る。換言すると、「排他的ＴＨ１応答」というのは、ＴＨ２関連免疫グロブリン
、ＴＨ２関連サイトカイン、及びＴＨ２細胞増殖が全く無い状態で、動物がＴＨ
１関連免疫グロブリン、ＴＨ１関連サイトカイン及びＴＨ１細胞増殖を示す、優
位なＴＨ１応答である。
【０１７６】 さらに、本発明の修飾されたウイルスは同様に、動物の体内の現存のＴＨ２を
低減させることが望ましい場合にも有用である。これは、望ましくない部分的、
優位な又は排他的ＴＨ２応答を惹起するアジュバントを利用した一次ワクチン接
種の後にブースタワクチン接種が続く応用分野でも特に有用である。先行技術で
は、そうでなければ１次ワクチン接種で投与された時点でＴＨ１応答をもたらす
結果となるアジュバントのブースタ適用によって、予め存在するＴＨ２応答を克
服することはできないと指摘されてきた。特定的に言うと、Quil−Ａをアジュバ
ントとして使用した結果として、ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質で免疫化された時点
でマウス体内でのＴＨ１応答が誘発されるものの、（アジュバントとしてアルガ
ムリンを使用して誘発された）Ｅ７に対する既存のＴＨ２応答があった場合には
この効果はみられなかった［Fernando et al.（１９９８）Scand.J. Immunol.
４７：４５９］。この観察事実は、人間の一次ワクチン接種が（人間に使用する
のに承認されＴＨ２応答を誘発する唯一のアジュバントである）ミョウバンを用
いて行なわれてきた場合、望ましくないアレルギー反応を媒介する結果としての
望ましくないＴＨ２応答はこれまで可逆的であり得ない、ということを示してい
る。プライミングされたＴＨ２細胞はＴＨ１細胞とは異なり安定していてＴＨ１
表現型に向かって導かれ得ないものの［Perez et al.（１９９５）Intl. Immuno
l. ７；８６９］、アレルギー患者から生成されたヒトＴ細胞系統及びクローン
においては、細菌タンパク質に接合された特異的アレルゲンの使用は、未接合の
アレルゲンがＴＨ２細胞を膨張させたのに対し、アレルゲン特異的ＴＨ１／ＴＨ
０細胞の膨張を結果としてもたらすということが示されてきている。［Jahn-Sch
mid et al.（１９９７）Intl. Immunol.９：１８６７］。かくして（アレルゲン
を含むものの、これに制限されるわけではない）免疫原のＣＰＭＶ提示の免疫調
節上の優性を、有害ＴＨ２経路からより恩恵の多いＴＨ１経路へと立証済み免疫
応答をシフトさせる目的で拡大させることができる。かくして、抗原のための提
示プラットフォームとして使用された場合の本発明の修飾された植物ウイルスの
優性の免疫調節効果は、特定のアジュバントの存在によって開始されるその抗原
に対する現存のＴＨ２応答を克服するための１つの手段を提供する。
【０１７７】 問題の分子を含有する修飾されたウイルスに対する動物の応答に関連して使用
される「ＴＨ２応答レベルの低減」及び「低減されたＴＨ２応答レベル」という
語は、分子又はウイルスによる刺激時点でＴＨ２リンパ球により生成される細胞
及び／又は体液性応答のうちの任意の単数又は複数のものが、対照動物における
対応する応答と比べて、いずれかの統計的に有意な量だけ低減されることを意味
する。特に、問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露呈された動物体内の
低減されたＴＨ２応答レベルは、（ａ）低減されたＴＨ２関連免疫グロブリンレ
ベル、（ｂ）低減されたＴＨ２関連サイトカインレベル、及び／又は（ｃ）低減
されたＴＨ２細胞増殖レベル、を意味する。
【０１７８】 問題の分子の分子を含有する修飾されたウイルスに露呈された動物の体内の「
低減されたＴＨ２関連免疫グロブリンレベル」という語は、同じサブクラスの合
計ＴＨ２関連免疫グロブリンの量との関係における、問題の分子又はウイルスの
いずれかに特異的なＴＨ２関連免疫グロブリンサブクラス（例えばマウスＩｇＧ
１、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ２など）のうちの単数又は複数の数量の好まし
くは０.１％〜１００％、より好ましは０.１％〜８０％、さらに一層好ましくは
０.１％〜６０％低減を意味する。例えば、同じマウスにおける合計マウスＩｇ
Ｇ１の量との関係における分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇ
Ｇ１の量の１０％の低減が、そのマウス体内の低減されたＴＨ２応答レベルとみ
なされる。同様にして、同一マウス内の合計マウスＩｇＧ３の量との関係におけ
る分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩｇＧ３の量の０.１％の低
減が、マウス体内の低減されたＴＨ２応答レベルとみなされる。
【０１７９】 代替的には、問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露呈された動物にお
ける「低減されたＴＨ２関連免疫グロブリンレベル」という語は、一方では、同
じサブクラスの合計ＴＨ２関連免疫グロブリンの量に対する問題の分子又はウイ
ルスのいずれかに特異的である単数又は複数のＴＨ２関連免疫グロブリンサブク
ラス（例えばマウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ２など）の量の比率
と、他方では同じサブクラスの合計ＴＨ２関連免疫グロブリンの量に対する（そ
れぞれ）問題の分子又はウイルスのいずれかについて特異的である単数又は複数
のＴＨ１関連免疫グロブリンサブクラス（例えばマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇ
Ｇ２ｂ、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３など）の量の比率の好ましくは少なくとも
１/２、より好ましくは１/２〜１/１００，０００、より好ましくは１/２〜１/
１０，０００、そして最も好ましくは１/２〜１/２，０００の低減を意味する。
例えば、同じマウスの体内での分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウス
ＩｇＧ２ａ対合計ＩｇＧ２ａの比率との関係における、分子特異的（及び／又は
ウイルス特異的）マウスＩｇＧ１対合計ＩｇＧ２ａの比率の１，０００分の１の
低減が、そのマウスにおける低減されたＴＨ２応答レベルとみなされる。同様に
して、同じマウスの体内での分子特異的（及び／又はウイルス特異的）マウスＩ
ｇＧ２ａ対合計ＩｇＧ２ａの比率との関係における、分子特異的（及び／又はウ
イルス特異的）マウスＩｇＧ３対合計ＩｇＧ３の比率の１/２，０００の低減が
、そのマウスにおける低減されたＴＨ２応答レベルとみなされる。
【０１８０】 さらなる変形形態においては、問題の分子を含有する修飾されたウイルスに露
呈された動物の体内の「低減されたＴＨ２関連免疫グロブリンレベル」という語
は、対照動物内の分子特異的（及び／又はウイルス特異的）ＴＨ２関連免疫グロ
ブリンの幾何平均エンドポイント力価に比べた、分子特異的（及び／又はウイル
ス特異的）ＴＨ２関連免疫グロブリンの幾何平均エンドポイント力価の、好まし
くは少なくとも１/２、より好ましくは１/２〜１/１０，０００、さらに好まし
くは１/２〜１/１，０００、さらに一層好ましくは１/２〜１/１００の低減を意
味する。例えば、対照マウス内の分子特異的マウスＩｇＧ１の幾何平均エンドポ
イント力価に比較した、治療対象マウス体内の分子特異的マウスＩｇＧ１の幾何
平均エンドポイント力価の１/２の低減が、低減したＴＨ２関連免疫グロブリン
レベルとみなされる。
【０１８１】 さらにもう１つの変形形態においては、「低減されたＴＨ２応答レベル」は、
ＴＨ２関連サイトカインレベルの低減を意味する。問題の分子を含有する修飾さ
れたウイルスに露呈された動物の体内の「低減されたＴＨ２関連サイトカインレ
ベル」という語は、その動物のＴＨ２細胞により産生されるＴ２関連サイトカイ
ンの量が、対照動物のＴ細胞によって産生されるＴ２関連サイトカインの量との
関係において治療動物の体内で好ましくは少なくとも１/２、より好ましくは１/
２〜１/１０，０００、さらに好ましくは１/２〜１/１，０００、そして最も好
ましくは１〜１/１００に低減させられたことを意味する。
【０１８２】 さらなる変形形態においては、「低減されたＴＨ２応答レベル」は、低減され
たＴＨ２細胞増殖レベルを意味する。問題の分子を含有する修飾されたウイルス
に露呈された動物の体内の「低減されたＴＨ２細胞増殖レベル」という語は、そ
の動物により産生される増殖するＴＨ２細胞の数が、対照動物によって産生され
る増殖するＴ細胞の数との関係において、治療動物の体内で、好ましくは少なく
とも１/２、より好ましくは１/２〜１/１０，０００、さらに好ましくは１/２〜
１/１，０００、そして最も好ましくは１〜１/１００に低減させられたことを意
味する。増殖するＴ細胞の数は、本書に記述されているものといったような方法
を用いて決定され得、そのＴＨ２型は、ＴＨ２関連サイトカインの存在について
のこれらの細胞の上清の検査によって決定され得る。
【０１８３】 実験 以下の例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態及び態様を例示するのに役
立ち、その範囲を制限するものとはみなされない。
【０１８４】 相反する記述のないかぎり、以下の例の各々における実験用手段及び材料は、
以下に列挙する一般的記述に準拠する。
【０１８５】 実験動物 生後６〜８週間の雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b、ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２d）、
ＮＩＨ（Ｈ−２q）、ＤＢＡ／ｌ（Ｈ−２5）及びBiozzi ＡＢ／Ｈ（Ｈ−２dq1）
マウスを、英国ケンブリッジ大学の病理学部において収容された。全ての手順は
、医学的研究中の動物について、英国内務省の指針に従って実施された。
【０１８６】 ＣＶＰＳの構築、繁殖及び精製 ＣＰＭＶのＳ及びＬサブユニットの両方についての外来性ペプチドの発現に使
用される方法は、Porta et al.（１９９４）Uirology ２０２：９４９の中で記
述された通りであった。この調査で使用されたさまざまな特異的ＣＶＰについて
は、表１に記述されている。
【０１８７】
【表１】
【０１８８】 ペプチド特異的及び合計アイソタイプ濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ 一部のケースでは、以下の例で報告するｏＤ405値は、抗体マイクログラム数
に換算された。これが行なわれた場合には、計算の基礎として以下の手順が用い
られた：すなわち、ウェルをヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotechnologies I
nc. ＵＳＡ）又はペプチドのいずれかでコーティングした。既知の濃度のＩｇＧ 24 カッパｍＡｂ（Sigma、 U. K）の階段希釈溶液を、抗マウス−ＩｇＧでコーテ
ィングされたウェルに添加し、ＣＶＰで免疫化された血清の希釈溶液を、抗マウ
スＩｇＧ又はペプチドのいずれかでコーティングしたウェルに添加した。検出の
ためアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識づけされた抗マウスＩｇＧ２ａ接合体
を用いて明細書の他の箇所で報告した通り、ＥＬＩＳＡを実施した。既知の濃度
のＩｇＧ２ａ対してヤギ抗マウスＩｇＧ及びモノクローナルＩｇＧ２の相互作用
から得られるＯＤをプロットすることにより、テスト血清中の抗ペプチドＩｇＧ
２ａＯＤ単位をペプチド特異的ＩｇＧ２のマイクログラム数に換算した。ＩｇＧ
２ａ準曲線上の適切な点において、ＯＤを読取った。同じ標準曲線を使用して、
抗ＩｇＧでコーティングされたウェル内でインキュベートした血清からのＯＤ単
位を血清標本中に存在する合計ＩｇＧ２のマイクログラム数に換算することがで
きる。ペプチド特異的ＩｇＣ２の百分率を、各血清標本について計算した。合計
の及びペプチド特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３を測定するためにも同
じ方法を利用した。
【０１８９】 統計 Ｐ＜０.０５が統計的に有意であるとみなされたスチューデントのｔテストを
用いてグループ間の差異を評価した。
【０１９０】 実施例１ ＤＴ及びＫＬＨ接合ペプチドは、優性ＴＨ１型血清抗体応答を惹起しない 抗原によって生成された免疫応答のＴヘルパー経路内に見られるあらゆるバイ
アスは、関係するペプチドの内因性の免疫学的特性によって支配され得る。これ
をテストするため、ジフテリア毒素（ＤＴ；Prof. V.Stevens、 オハイオ州立大
学）に接合されたヒト絨毛性コナドトロピンに由来するＣＴＰ３７ペプチド又は
、ＫＬＨ（Prof. H.E. Gilleland、 ルイジアナ州立大学）に接合されたPseudom
onas aeruginosaの外膜タンパク質（Omp F protein）に由来するペプチド（pept
ide １０）でＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。両方の接合体を共に、アジュ
バントＱＳ−２１の存在下で接種した。２回の免疫化（０日目と２１日目）又は
３回の免疫化（０、１４及び２８日目）のいずれかを皮下投与した。４２日目に
尾部放血及びそれに続く瀉血により採血し、血清を収集し、その後のＥＬＩＳＡ
決定のために−２０℃で貯蔵した。P.aeruginosa ＯＭタンパク質Ｆ及びＢｈＣ
Ｇ−ＣＴＰ３７に対する抗体の検出のため（ペプチドはGenosys Inc. Cambridge
、 UKによって合成され精製された) 、マイクロタイタープレートウェルを、０.
５μｇ／ウェルのそれぞれのペプチド（上記表１参照）を用いて３７℃で３時間
コーティングした。抗原コーティングされたプレート上で１時間３７℃で一連の
倍加希釈 の血清をインキュベートした。基質としてｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート（ＰＮＰＰ、［Sigma］）を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−
接合ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Southern B
iotechnologies Inc. USA)のいずれかで、結合された抗体を検出した。これらの
抗マウスアイソタイプ試薬はまず最初に、４つのＩｇＧサブクラスを表わす標準
マウス骨髄腫タンパク質に対し滴定された。各接合体の１：２０００の希釈によ
り、骨髄腫結合間の１０％未満の変動が得られる。これは、その後のあらゆる検
定において使用される希釈であった。以前に記述された通りにエンドポイント力
価を計算した（Brennan et al.（１９９９）Microbiol.１４５：２１１；Brenna
n et al(１９９９）J. Virol ７３：９３０）。結果は下表２に示されている。
【０１９１】
【表２】
【０１９２】 表２に示されているように、ＢＴ−βｈＣＧＣＴＰ３７及びＫＬＨ−ＯＭの両
方のタンパク質Ｆが、ＩｇＧ２ａに比べ著しく高いレベルのペプチド特異的Ｉｇ
Ｇ１を惹起し（ＤＴ−βｈＣＧ−ＣＴ３７及びＫＬＨ−ＯＭタンパク質について
それぞれＰ＜０.０５及びＰ＜０.０１）、複合しないワクチン担体系上のこれら
のペプチドの提示がＴＨ１型応答に向けてのバイアスを生成しないことを実証し
ている。
【０１９３】 実施例２ ＣＰＭＶ上のペプチドの発現は、ＴＨ１型応答を導くべくその他の高分子担体
系上でペプチドにより刺激される免疫応答内のＴＨ２バイアスを克服する 前述の例とは対照的に、例１から２つの（ＤＴ−βｈＣＧ−ＣＴＰ３７及びＫ
ＬＭ−ＯＭタンパク質Ｆ）を含む４つのペプチドがＣＰＭＶ上で発現された。一
用量あたり１００μｌの合計体積で、ＦＩＡ／ＦＩＣＡの存在下で皮下で８匹の
Balb／ｃマウスから成る４つグループを免疫化した。それぞれ１００μｇ、２５
μｇさらにもう１度２５μｇのＣＶＰを注射して３回の免疫化（０日目と２１日
目又は０.１４及び２８日目）を実施した。４２日目に尾部放血又は瀉血により
血液を収集した。血清を収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０１９４】 抗−ＣＰＭＶ抗体の検出のため、３７℃で３時間０.１μｇ／ウェルのＣＰＭ
Ｖでコーティングした。一連の血清倍加希釈を、３７℃で１時間抗原交配平板上
でインキュベートした。基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ
、（Sigma）を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−接合ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Southern Biotechnologies Inc
. USA）のいずれかで、結合された抗体を検出した。前述のものと同様、これら
の抗マウスアイソタイプ試薬はまず最初に、４つのＩｇＧサブクラスを表わす標
準マウス骨髄腫タンパク質に対し滴定された。各接合体の１：２０００の希釈に
より、骨髄腫結合間の１０％未満の変動が得られた：従ってこの希釈がその後の
検定において使用された。以前に記述された通りにエンドポイント力価を計算し
た。ＣＰＭＶ特異的力価については、結果は、免疫化されていないマウスからの
プールされた血清の１：５０の希釈で得られたＯＤ４０５よりも高い平均ＯＤ40 5 を提供する希釈の逆数として計算されたエンドポイント力価として表現された
。
【０１９５】 ペプチド特異的力価については、エンドポイント力価は、野生型ＣＰＭＶ免疫
化マウスからのプールされた血清の１：５０の希釈で得られたＯＤ405よりも高
い平均ＯＤ405を提供する希釈の逆数であった。
【０１９６】
【表３】
【０１９７】 「エンドポイント力価」という語は、一定の与えられた抗原について特異的で
ありかつ抗原と組合わされた時点で検出可能な反応を生成する抗体の最高の希釈
であるような抗原希釈である。
【０１９８】 表３によって実証されているように、エピトープがＣＰＭＶ上に提示された場
合、これらのエピトープは、ＩｇＧ２ａよりもはるかに低いレベルのＩｇＧ１を
惹起し、ＴＨ１型免疫応答に向かってのバイアスを立証した。実際、ＣＰＭＶの
提示が無い状態で提示された２つのエピトープ（すなわち、ＤＴ−βｈＣＧ−Ｃ
ＴＰ３７及びＫＬＨ−ＯＭタンパク質Ｆ）とは対照的に（例１）、ＣＰＭＶ上の
これらの同じエピトープの提示は、ＩｇＧ２ａよりもはるかに低いレベルのＩｇ
Ｇ１を惹起した。
【０１９９】 実施例３ ＣＰＭＶ上のペプチドの提示は、例えばＴＨ２型免疫応答に有利に作用するも
のとして知られた特異的アジュバントといった外来性免疫調節作用物質の存在下
でＴＨ１型応答を惹起する アジュバントミョウバン及びＱＳ２１は、一般に、ＴＨ２型免疫応答の誘発に
有利に作用する。アジュバントが有利に作用するＴＨ２型免疫応答が本発明のＣ
ＰＭＶ提示系によってバイパスされ得るか否かを見極めるため、各々の機会で単
独の又はミョウバン又はＱＳ２１を伴う（Staphylococcus aureusのフィブロネ
クチン結合タンパク質に由来するペプチドを発現する）５μｇのＣＰＭＶ−マス
ト１を用いて０日目及び２１日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つのグループを
免疫化した。基本的に上述の例１及び２で記述した通り、４２日目に血清を収集
し、ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３とい
うクラスのＭＡＳＴ１ペプチド特異的免疫グロブリンについて検定した。力価は
、いかなるアジュバントも添加されなかった対照グループを含め（上表３、８、
９、１０段目）３つのグループのマウス全てにおいて、ＴＨ１応答に向かう強い
バイアスを示した。かくして、ＴＨ２応答に有利に作用するものとして知られて
いるアジュバントの免疫調節効果は、キメラＣＰＭＶ上のペプチドの提示によっ
て、完全にバイパスされた。同様に、本調査の一部分における外来性アジュバン
トの不在は、ＣＰＭＶプラットフォーム自体の内因性のＴＨ１−バイアス効果を
強調するのに役立つ（上表３、８段目）。
【０２００】 実施例４ さまざまなタンパク質に由来するペプチドは、免疫化された個体の遺伝的背景
とは無関係にＣＰＭＶ上で発現されたとき、血清中のペプチド特異的ＴＨ１型抗
体を優位に惹起する ＴＨ１型応答を生成する能力をもつ担体としてのＣＰＭＶの普遍的有用性を確
認するためそして免疫学的効果が免疫化された個体の遺伝的素質と無関係であっ
たことを実証するため、異なるＭＨＣクラスＩＩハロタイプのマウスに、一定数
の異なる供給源に由来するペプチドを発現するＣＶＰを接種した。ＣＰＭＶ−Ａ
ＧＹ２（表３、１段目）は、ヒト膜結合免疫グロブリン Ｅ（ＩｇＥ）の重鎖か
らのペプチドを発現する： ＣＰＭＶ−ＥＧＦＲ１（表３、２段目）は、ヒトガ
ン細胞上に存在する表皮成長因子レセプタであるタンパク質に由来するペプチド
を発現する； ＣＰＭＶ−ＨＣＧ３（表３、６段目）は、ヒトホルモン、絨毛性
ゴナドトロピン（ｈＣＧｐ）に由来するペプチドを発現する；ＣＰＭＶ−ＰＡＲ
Ｖ０９（表３、３及び４段目）は、イヌパルボウイルスからのペプチドを発現し
、ＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１（表３、８〜１２段目）及びＣＰＭＶ−ＰＡＥＦ（表３
、７段目）は、（それぞれS. aureus 及び P.aeruginosa の） 細菌膜タンパク
質に由来するペプチドを発現する。
【０２０１】 ＯＢＡ／１（Ｈ−２ｑ）；ＮＩＨ（Ｈ−２ｓ）；Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）
及びBiozzi/ＡＢＨ（Ｈ−２ｄｑ１）といった異なるハプロタイプ（遺伝子型）
を代表する４つのマウス菌株を使用した。１００μｌ／用量という合計体積で、
ＱＳ−２１の存在下で（１０μｇ／用量：Aquila Biopharmaceutical Inc, Worc
ester, ＭＡ）、さまざまなＣＶＰでマウスを皮下免疫化した。０日目及び２１
日目の２回の免疫化か又は、０、１４、及び２８日目の３回の免疫化のいずれか
を投与した（上表３参照）。上述の通り、尾部放血又は瀉血により血液を収集し
、血清を収集し、−２０℃で貯蔵した。抗−ＣＰＭＶ抗体の検出のため、３７℃
で３時間、０.１μｇ／ウェルのＣＰＭＶでウェルをコーティングした。抗原コ
ーティングされた平板上で、一連の倍加希釈の血清を、３７℃で１時間インキュ
ベートした。基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を用いて
、結合した抗体を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）接合ヤギ抗マウスＩｇＧ１
、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ3（Southern Biotechnologies Inc. USA
）で検出した。
【０２０２】 これらの抗マウスアイソタイプ試薬はまず最初に、４つのＩｇＧサブクラスを
表わす標準マウス骨髄種タンパク質対し滴定された各接合体の１：２０００の希
釈により、骨髄腫結合間の１０％未満の変動が得られた。この希釈はその後の全
ての検定で使用された。以前と同様に、エンドポイント力価を計算した。ＣＰＭ
Ｖ特異的力価については、結果は、免疫化されていないマウスからのプールされ
た血清の１：５０の希釈で得られたＯＤ４０５よりも高い平均ＯＤ405を提供す
る希釈の逆数として計算されたエンドポイント力価として表現された。ペプチド
特異的力価については、エンドポイント力価は、野生型ＣＰＭＶ免疫化マウスか
らのプールされた血清の１：５０の希釈で得られたＯＤ405よりも高い平均ＯＤ4 05 を提供する希釈の逆数であった。
【０２０３】 ４つの構成体全てが、既知のＴＨ２免疫調節アジュバント（すなわちＱＳ２１
又はミョウバン）の存在に関わらず、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のレベルとの関係に
おける高いレベルのペプチド特異的ＩｇＧ２ａ惹起することが示された（全ての
ケースでＰ＜０.０１）。それに対応して、ペプチド特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ
３のレベルは、免疫化グループの全ての中で（上表３）はるかに低いものであっ
た。ＣＶＰの一部は同様に、有意な量のペプチド特異的ＩｇＧ２ｂをも産生した
。これが起こった場合、レベルは、ＩｇＧ２ａのレベルよりも高いＩｇＧ２ｂの
レベルを場合により惹起したＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１を除いて、ＩｇＧ２ａのレベ
ルより低いものであった（上表３）。かくして、ＣＶＰは、発現されたペプチド
の存在によっても又、ＴＨ２免疫調節のポテンシャルをもつアジュバントの存在
によっても影響されないと思われるペプチド特異的ＴＨ１型応答を優位に惹起し
た。
【０２０４】 しかしながら決定的なことに、この実験においてＣＶＰは、４つの異なるＨ−
２ハプロタイプのマウスの体内でＴＨ１型応答を惹起した。このことは、効果が
免疫応答遺伝子（Ｉｒ genes）によって決定されたり支配されないことを示して
いた。換言すると、個体の遺伝的素質は、特定のペプチドによって開始される免
疫応答においてＴＨ１バイアスを惹起するＣＰＭＶの能力に関する阻害因子では
なかった。免疫応答におけるＴＨ１バイアスの効果が、ＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１の
接種を受けたAbiozzi／ＡＢＨマウスに見られるということが特に有意義であっ
た。Abiozzi／ＡＢＨマウスは、外来性アジュバント又はペプチド自体の潜在的
バイアス効果が考慮に入れられる前でさえ、ＴＨ２バイアスされた応答に有利に
作用する遺伝的素因をもっている。
【０２０５】 従って、ＣＰＭＶ関連ＴＨ１応答は、個体の免疫反応を大きく支配するものと
一般にみなされている強い内因性の遺伝的因子を圧倒する能力をもっていた。こ
のことはさらに、ＴＨ１及びＴＨ２経路サブタイプからの免疫グロブリンの特異
性の分析によりさらに強調された。テストグループ内の全てのマウスにおける合
計ＩｇＧ２ａの２５〜１００％に比べ、産生されたＩｇＧ１の１％未満しかペプ
チド特異的ではなかった。要約すると、ペプチドのための担体及び提示系として
のＣＰＭＶの使用は、個体の遺伝学のレベルで障壁を克服でき、かくして予防用
及び治療作用物質の設計においてワクチン−ゲノムの問題を軽減するための１つ
の手段を提供する。
【０２０６】 実施例５ ＣＰＭＶ粒子上でのペプチドの提示は、広範な用量投薬計画全体にわたりＴＨ
１バイアスされた免疫応答を誘発する 上述の表３内のＩｇＧ滴定データを考慮すると、免疫化プロトコル内で（３０
０μｇのＣＶＰから２μｇに至る範囲の）高い用量又は低い用量のいずれが利用
されたかに関わらず、（ＴＨ２型応答を表わす）ペプチド特異的ＩｇＧ１よりも
高いレベルの（ＴＨ１型応答を表わす）ペプチド特異的ＩｇＧ２ａが複数の異な
る抗原に対して生成されることが明らかとなった。かくして、担体系としてのＣ
ＰＭＶの免疫調節特性のさらなる利点は、望ましい型の応答を惹起するのに必要
とされる材料が比較的低いということにあった。
【０２０７】 実施例６ ＣＶＰは、中心静脈内に又は粘膜経由でのいずれにより提示されたかに関わら
ずＴＨ１型応答を惹起し、ペプチド投与方法が、刺激された免疫応答の性質に影
響を及ぼさないということを表わしている イヌパルボウイルスのＶＰ２タンパク質に由来するペプチドを表示するＣＶＰ
であるＣＰＭＶ−ＰＡＶ０９で鼻腔内でＮＩＨマウスを免疫化した。粘膜表面上
に直接的なこの接種のためには、いかなるアジュバントも使用されなかった（表
３、３段目参照）。各々１００mgのＣＶＰを含有する２つの用量を、０日目及び
１４日目に投与した。４２日目に、基本的に上述の通りに血液を収集し、ＰＡＲ
Ｖ０９ペプチドに特異的な免疫グロブリンのサブクラスの存在について検定した
（表３：前出、グループ４）。表４内に示されているように個々のマウス内の４
つのアイソタイプの各々について合計抗体の百分率として、ペプチド（ＶＰ２）
−特異的抗体の濃度を表わした。同様に、４つのイソタイプの各々についての平
均百分率値も表４に示されている。
【０２０８】
【表４】
【０２０９】 （ほぼ排他的にＣＰＭＶ特異的であった）高レベルの合計ＩｇＧ１及びＩｇＧ
３が検出されたものの、ＩｇＧ2a及びＩｇＧ20の合計濃度も同じく高いものであ
った。さらに、有意な割合がペプチド特異的であり（上表４）、ここでも又、Ｔ
Ｈ１型に向かっての応答におけるバイアスそしてかかる応答がＣＰＭＶ上で提示
された抗原の投与経路の如何に関わらず惹起され得たという事実を浮き彫りにし
ている。
【０２１０】 実施例７ 現存の免疫応答の性質を改変するためのキメラウイルス粒子含有免疫原性複合
体の使用 ＴＨ２型応答を優位に惹起するアジュバントの存在下で特定の抗原がワクチン
として提示されるような情況が存在する。実際、ヒトワクチンの利用分野のため
に安全とみなされているアジュバントとしてこれまでのところ（優位にＴＨ２型
の免疫応答を惹起する）ミョウバンしか承認されていないという事実は、将来利
用可能となる多くのワクチンが先験的に、不利な副作用をもつＴＨ２型の免疫応
答を惹起する因子を含有することになる、ということを表わしている。このこと
は、かかる情況下で誘発されたＴＨ２経路から離れる方向及びＴＨ１経路に向か
っての応答の免疫調節に対するニーズを強調する。多くのワクチンは有効となる
ために多数回の接種を必要としていることから、ＣＰＭＶ提示ペプチドを含む処
方で初期応答をブーストすることにより、ＴＨ１型応答に有利となるように（サ
ブユニットワクチン内で一定の与えられたペプチドと結びつけられる）ＴＨ２応
答を改変する問題に対処することが可能である。ＣＰＭＶプラットフォームの免
疫調節上の優性の強さは、問題のペプチドの免疫応答の所要ブーストをなおも達
成しながら、アジュバントのＴＨ２経路ポテンシャルをバイパスする。
【０２１１】 これを実証するため、タンパク質特異的ＩｇＧレベルによって決定されるよう
にＴＨ２応答を誘発するため、ミョウバン及び／又はＱＳ２１アジュバントの存
在下でＭＡＳＴ１タンパク質（表１）でマウスを免疫化する。その後、テストマ
ウスをＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１で免疫化し、対照マウスにはその後の免疫化を全く
行なわない。テスト及び対照マウス内のＩｇＧレベルを、上述の通りに決定する
。対照動物との関係におけるテスト動物内のペプチド特異的ＩｇＧ１；ＩｇＧ２
ａ、ＩｇＧ３；ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１；ＩｇＧ２ｂ、及び／又はＩｇＧ３／Ｉｇ
Ｇ２ｂの比率の増大が、本発明のキメラウイルスが一次免疫化でアジュバントに
より誘発されたＴＨ２応答を克服することを実証している。
【０２１２】 実施例８ 免疫原性タンパク質様及び非タンパク質様半分、特に炭水化物半分を接合する
ための化学反応性ペプチドを発現し提示するように工学処理されたＣＰＭＶウイ
ルス粒子の使用 構造式ＤＥＧＫＧＫＧＫＧＫＤＥ（配列番号２９）のアミノ酸配列をコードす
るデオキシリボヌクレオチドを、カウピーモザイクウイルスのＲＮＡ２分子のｃ
ＤＮＡコピーに対応するベクターｐＣＰ２内にクローニングする。挿入は、以前
に記述されたように（各々その全体が参考として内含されている米国特許第５，
９５８，４２２号及び５，８７４，０８７号）アラニン２２とプロリン２３の間
でＶＰ−Ｓ（２つのＣＰＭＶウイルス外皮タンパク質のうちの小さい方）内に反
応性ペプチドが挿入されるような形で行なわれる。精製された炭水化物をペプチ
ド内の反応性リシン残基に化学的に接合させ、結果としての炭水化物接合ＣＶＰ
を、例えば炭水化物特異的抗体又はＤＥＡＥ−セルロースを用いてアフィニティ
クロマトグラフィにより精製する。基本的に上述の例２及び３で記述したものと
同じ免疫化投薬計画に従って、マウスの体内に炭水化物接合ＣＶＰを接種する。
４２日目に尾部放血を行ない、血清を、炭水化物に特異的なＩｇＧサブクラスに
ついて検定する。ＣＰＭＶの免疫調節上の優性と一貫して、ＴＨ１応答ＩｇＧサ
ブクラスの優位性が見られる。
【０２１３】 実施例９ ＣＶＰは、ＥＬＩＳＰＯＴにより決定されるように、脾臓内でＣＰＭＶ−及び
ペプチド特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ産生Ｂ細胞を優位にプライミングする
ＱＳ−２１で免疫化されたマウス内のＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１から脾細胞（表３
、１０段目）をプールして、０.８％のＮＨ4Ｃｌ中の低温溶解により赤血球を除
去した。細胞をＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄し、計数し、１mlあたり５×１０6
、５×１０5、又は５×１０4の生菌数という濃度で、再懸濁させた。各々の細胞
懸濁液（１００μｌ／細胞）を９６ウェルのMultiscreen Immobilon ＩＰ平板（
Millipore, Ontario, Canada）のウェルに付加し、これらのウェルをｐＨ９.６
の無菌炭酸緩衝液中のＣＰＭＶ又はＦｎＢＰペプチドのいずれかで４℃で一晩予
備コーティングさせ３７℃で１時間１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭ１１６４０
で遮断した。
【０２１４】 負の対照ウェルは、緩衝液又は関連性のない対照ペプチドのみでコーティング
させた。細胞を３７℃で２０時間平板上でインキュベートし、次にＰＢＳで三回
洗浄した。結合した抗体を適切なアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−接合ヤギ抗
マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（Southern Biotechno
logies Inc.）で検出した。３７℃で２時間後、平板をＰＢＳＴで４回洗浄し、
３７℃で３０分間ストレプタビジン−ペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）
を添加した。ＰＢＳＴでの洗浄後、最大限の色強度が出るまで、Sigma ＦＡＳＴ TM ＤＡＢ（３、３′−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロリド）基質を添加し
た（１００μｌ／ウェル）。水道水で穏やかに平板を洗浄し、３７℃で３０分間
乾燥させ、解剖顕微鏡（Nikon ＳＭＺ−１）を用いて斑点を計数した。結果は、
表５に示されているように、ＣＰＭＶ及びペプチドの両方について、１０6個の
脾臓細胞あたりの平均班形成細胞（ＳＦＣ）（ＳＦＣ／１０6脾細胞）±ＳＤと
して表わされた。
【０２１５】
【表５】
【０２１６】 ＱＳ２１中のＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１により惹起された免疫グロブリンのＥＬＩ
ＳＰＯＴ分析は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３ＳＦのはるかに低い数とは対照的に、免
疫化されたマウスの脾臓中の同様に高い数のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ斑形成細
胞を示した（表５）。これらのマウス内ではペプチド（ＦｎＢＰ）特異的抗体及
びＳＦＣに比べて約４倍高い力価のＣＰＭＶ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗
体及びＳＦＣが存在していた（表５）。興味深いことに、血清中のＦｎＢＰ特異
的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのレベルは非常に類似していたが、ＥＬＩＳＰＯＴ
（表５）により脾臓内にはＩｇＧ２ｂ産生ＳＦＣに比べてはるかに高い数のＩｇ
Ｇ２ａ産生ＳＦＣが検出され、これはＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１がより多数のＦｎＢ
Ｐ特異的ＩｇＧ２ａ産生Ｂ細胞をプライミングすることを示唆していた。かくし
て、ＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、比較的低い
ものの著しいレベルのＣＰＭＶ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ３で、血清中で非常に
高い濃度の優位にＣＰＭＶ特異的なＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを惹起した（表５
）。
【０２１７】 実施例１０ ＩＬ−４（ＴＨ２関連サイトカイン）ではなくＩＦＮ−γ（ＴＨ１関連サイト
カイン）を産生するべく、ＣＶＰによりプライミングされた脾臓内のＣＰＭＶ特
異的Ｔ細胞が増殖する ＣＶＰで免疫化されたマウスからの脾臓を、１次免疫化から４２日目に除去し
、単一の細胞懸濁液を作製した。氷冷０.８５％ＮＨ4Ｃｌでの赤血球の洗浄及び
溶解の後、５匹のマウスからの脾細胞をプールし、１ｍＭのＬ−グルタミン、１
０ｍＭのペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含有するＲＰＭＩ１０４０培地（Gibco, Paisley, UK）中で丸底９６ウェル平
板（２×１０5／１００μｌ；Nunclon Delta Surfau, Nunc. Denmark） 内に送
り出した。２.５μｇ／mlのコンカナバリンＡ（ConＡ、Sigma）又は野生型ＣＰ
ＭＶ（５０又は５μｇ／ml）で５日間５％のＣＯ2中で３７℃で培養した。培養
の最後の１２時間で、０.５μＣｉ／ウェルの［メチル−３Ｈ］チミジン（Amers
ham Life Science）を添加した。フィルタマット上に細胞を収獲し（Wallac Oy,
Turku、フィンランド）、１４５０Microbeta Trilux液体シンチレーション及び
蛍光カウンタ（Wallac）を用いて標識の取込みを測定した。データは、アジュバ
ントの存在下での一分あたりの計数が抗原の不在下（媒質のみ）で測定された計
数によって除される刺激指数として表わされた。３以上の値が有意であるとみな
された。ＣＰＭＶ−ＭＡＳＴ１で免疫化されたマウスからの脾細胞は、低い濃度
（５μｇ／ml）でさえ刺激に至るまでin vitroで非常に強く増殖し、これはペプ
チド担体により媒介されるきわめて特異的なＴ細胞誘発を表わしていた。
【０２１８】 プールした脾臓細胞をその後、２４ウェルの平板中で単独で、又はＣonＡ（２
.５μｇ／ml）又は野生型ＣＰＭＶ（５０又は５μｇ／ml）で培養した。４８時
間後に、Eppendorf管内に０.５mlの細胞培養上清を収集し、−８０℃で貯蔵した
。基本的に上述のように、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の両方の存
在について上清をテストした。簡単に言うと、４℃で２μｇ／ウェルのラットｍ
Ａｂ抗マウスＩＦＮ−γ又はラットｍＡｂ抗マウスＩＬ−４（共にPharmingen,
San Diego, CA）のいずれかで一晩、９６ウェルのＥＬＩＳＡ平板（Immulon−４
）をコーティングした。０.００５％のTween 及び５％のＢＳＡを含有するＰＢ
Ｓで平板を遮断した後、ウェルに対し、マウス脾細胞培養上清の系列希釈液を添
加した。対照として、それぞれＩＬ−４及びＩＦＮ−γについて４ng／ml及び１
５ng／mlから開始して組換え型マウスＩＦＮ−γ及びＩＬ−４（Pharmingen) の
希釈溶液を添加した。３７℃で１時間放置した後、３７℃で１時間、ビオチニル
化したラット抗マウスＩＦＮ−γ及び抗−ＩＬ−４ｍＡbs（共にPharmingen）を
用いて、結合したサイトカインを検出した。これらのｍＡbsは、該手順の初期に
捕捉段階について使用されたｍＡbsとは異なるＩＦＮ−γ及びＩＬ−４上のエピ
トープを認識する。３７℃で３０分間ストレプタビジンペルオキシダーゼ（Sigm
a；２μｇ／ml）を添加し、それに続いてＯ−フェニレンジアミンＣＯＰＤ基質
（１mg／ml）を添加した。３７℃で３０分後、５０μｌ／ウェルの２.５ＭＨ2Ｓ
Ｏ4を添加することによって反応を停止させ、自動化されたAnthos ＨＴＩＩ Ｅ
ＬＩＳＡ平板読取り装置を用いて４９２ｎｍで吸光度を読取った。結果は表６に
示されている。
【０２１９】
【表６】
【０２２０】 ｃ．ｄ． これらの培養からの上清を同様に、ＩＦＮ−γc及びＩＬ−４aタン
パク質についてＥＬＩＳＡにより検査した。結果は、算術平均ng／ml＋ＳＤとし
て表わされている。（ＮＴ＝テストされず） これらの増殖細胞からの上清は、ＩＦＮ−γ及び低又は未検出レベルのＩＬ−
４を含有することが示された（表６Ａ）。これに比べ、未免疫化マウスは、いか
なるＣＰＭＶ特異的抗体もＳＦＣ（図示せず）も含まず、増殖せず、又、ＣＰＭ
Ｖ刺激に応答してＩＦＮ−γ又はＩＬ−４を産生することもない（表６Ｂ）。
【０２２１】 実施例１１ ペプチドの接合 この例では、サイトカイン残基を含有しかつｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシニミドエステル（Pierceから入手可能な「ＭＢＳ」）を用いて
活性化されたあらゆるペプチドと接合する能力をもつ反応性ペプチドを発現する
べく、本発明に従ったキメラ植物ウイルスを工学処理する。
【０２２２】 構造式Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号３０）で
アミノ酸配列をコードするデオキシリボヌクレオチドを、カウピーモザイクウイ
ルスのＲＮＡ２分子のｃＤＮＡコピーに対応するベクターｐＣＰ２内にクローニ
ングさせる。挿入は、以前に記述されたように（各々その全体が参考として内含
されている米国特許第５、９５８、４２２号及び５、８７４、０８７号）アラニ
ン２２とプロリン２３の間でＶＰ−Ｓ（２つのｃＰＭＶウイルス外皮タンパク質
のうちの小さい方）内に、反応性ペプチドが挿入されるような形で行なわれる。
【０２２３】 本発明の植物ウイルスに接合されることが求められている問題のタンパク質分
子を、以下の要領でＭＢＳを用いて活性化させる。タンパク質を、約２０mg／ml
の最終濃度まで緩衝液（例えば０.０１ＭのＮａＰＯ4、ｐＨ７.０）中で溶解さ
せる。同時に、５mg／mlの濃度まで、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドの中にＭＢ
Ｓを溶解させる。３.２５mlのタンパク質溶液にＭＢＳ溶液０.５１mlを添加し、
５分毎に撹拌しながら３０分間室温でインキュベートする。その後、結果として
得られたＭＢＳで活性化されたタンパク質を、５０ｍＭのＮａＰＯ4、ｐＨ７.０
の緩衝液で平衡化されたＢio−Ｇel Ｐ−１０カラム（Ｂio−Ｒad；４０mlの床
体積）上のクロマトグラフィにより精製する。ピーク画分はプールする（６.０m
l）。
【０２２４】 ＭＢＳ活性化されたタンパク質溶液に対し Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（２０mg）を発現するキメラ植物ウイルスを添加し、ペプチド
が溶解するまで撹拌し、室温で３時間インキュベートする。２０分以内で、反応
混合物は濁った状態となり、沈殿物が形成される。３時間後、反応混合物を１０
分間１０、０００×ｇで遠心分離させ、タンパク質含有率について上清を分析す
る。接合体沈殿物を３回ＰＢＳで洗浄し、４℃で貯蔵する。結果として得られた
精製済みのタンパク質接合したＣＶＰを、以上の例２及び３で記述したものと同
じ免疫投薬計画に従って、マウス体内に接種する。４２日目に尾部放血を行ない
、炭水化物に特異的なＩｇＧサブクラスについて血清を検定する。ＣＰＭＶの免
疫調節上の優性と一貫してＴＨＩ応答ＩｇＧサブクラスの優位性が見られる。
【０２２５】 以上のことから、本発明が、抗原又は免疫原を一例とする（ただしこれらに制
限されるわけではない）あらゆる問題の分子に対する免疫応答の性質及び／又は
レベルを調節する上で有効である方法及び組成物を提供することは明らかである
。特に、本書で提示されたデータは、本発明が、抗原又は免疫原といったような
分子に対する免疫応答においてＴＨ１バイアスをもたらし、かつ／又はかかる分
子に対する免疫応答内のＴＨ２バイアスを低減させるための方法及び手段を提供
することを実証している。より特定的には、以上のことは、本発明が、そうでな
ければ一般にＴＨ２型応答を刺激する分子に対抗して導かれるＴＨ１型免疫応答
を増大するための方法及び手段を提供することを示している。以上のことから同
様に、本発明がさらに、分子に対するＴＨ２免疫応答を低減させるための組成物
及び方法を提供することも明白である。以上のことはさらに、本発明が、ＴＨ１
及びＴＨ２関連免疫グロブリンのレベル、ＴＨ１及びＴＨ２関連サイトカインの
増殖レベル及びＴＨ１及びＴＨ２細胞の増殖レベルを改変する（すなわち増減さ
せる）ための組成物及び方法を提供することを示している。
【０２２６】 以上の明細書で言及した全ての刊行物及び特許は、本書に参考として内含され
ている。本発明の記述された方法及びシステムのさまざまな修正及び変形態様が
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかとなることだ
ろう。本発明について特定の好ましい実施形態と結びつけて記述してきたが、請
求されている通りの本発明がかかる特定的実施形態に不当に制限されるべきでな
いことを理解すべきである。実際、当業者及び関連分野の当業者にとって明白で
ある本発明を実施するための記述された態様のさまざまな修正が、以下のクレー
ム内に入るべく意図されていた。
【０２２７】 以下の有用なウイルスベクターは、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国
際的認知に関するブタペスト条約の条項及びそれに基づく規則の下で、American
Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, Rockville, MD., USA に寄託された状
態にある［ｐＴＢ２（ＡＴＣＣ No. ７５２８０）及びｐＴＢＵ５（ＡＴＣＣ No
.７５２８１）］。これらのプラスミドについての構築の詳細は、本書に参考と
して内含されている米国特許第５，５８９，３６７号の中に記されている。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 9/10 １０１ 19/02 19/02 29/00 29/00 １０１ １０１ 31/04 31/04 31/12 31/12 33/02 33/02 35/00 35/00 37/02 37/02 37/08 37/08 Ｃ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 7/00 ＺＮＡ 14/005 14/005 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA01 CA53 DA01 DB01 MA13 MA17 MA22 MA23 MA52 MA59 MA66 NA14 ZA662 ZA682 ZA892 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB332 ZB352 ZB382 4C085 AA03 BA02 BA04 BA07 BA10 BA14 BA17 BA20 BA51 BA52 BA53 BA54 BA68 BA69 BA78 BA83 BA89 BA92 BB07 BB11 BB17 CC08 DD86 EE03 EE06 FF02 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA09 CA12 CA16 MA13 MA17 MA22 MA23 MA31 MA52 MA59 MA60 MA66 NA14 ZA45 ZA66 ZA68 ZA89 ZA96 ZA97 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB33 ZB35 ZB38 4H045 AA30 BA10 CA01 DA86 EA22

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物体において着目の分子に対するＴＨ１型免疫応答のレベ
    ルを増大させる方法であって： ａ） ｉ） 前記着目の分子； ｉｉ） 前記着目の分子に対し接合する能力をもつ異種ペプチドを発現する植物
    ウイルス；及び ｉｉｉ） 宿主動物； を提供し段階； ｂ） 接合体を生成するべく前記異種ペプチドに対し前記着目の分子を接合さ
    せる段階； ｃ） 治療動物の体内での前記分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルが対照動
    物の体内での前記問題の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルに比べ増大するこ
    とになるような条件下で該治療動物を生成するべく前記宿主動物に対し前記接合
    体を投与し； ｄ） 対照動物の体内での前記着目の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルと
    の関係における前記治療動物体内の前記着目の分子に対するＴＨ１型免疫応答レ
    ベルの増大について任意にテストし；そして ｅ） 対照動物の体内での前記着目の分子に対するＴＨ１型免疫応答レベルと
    の関係における前記治療動物の体内での前記着目の分子に対するＴＨ１型免疫応
    答レベルの増大を任意に観察する、 ステップを含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 前記増大したＴＨ１型免疫応答レベルが、 （ａ） 対照動物の体内でのＴＨ１関連免疫グロブリンレベルとの関係における
    前記治療動物の体内での増大したＴＨ１関連免疫グロブリンレベル、（ｂ） 対
    照動物からのＴＨ１細胞の増殖レベルとの関係における前記治療動物からのＴＨ
    １細胞の増大した増殖レベル、及び（ｃ） 対照動物の体内でのＴＨ１関連サイ
    トカインレベルとの関係における前記治療動物の体内での増大したＴＨ１関連サ
    イトカインレベル、の中から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＴＨ１関連サイトカインがＩＬ−２、ＴＮＦ−β及びＩ
    ＦＮ−γの中から選択される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記投与が、前記問題の分子に対する前記宿主動物の露呈に
    付随する症候の低減を結果としてもたらす、請求項１〜３のいずれか１項に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 前記着目の分子がペプチド、多糖類、核酸又は脂質を含んで
    成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記着目の分子が、動物病原体、アレルゲン及びガン細胞の
    中から選択された供給源に由来するものである、請求項１〜５のいずれか１項に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記植物ウイルスが、コモウイルス、トンブスウイルス、ソ
    ベモウイルス及び線虫媒介球状ウイルスの中から選択された正二十面体植物ウイ
    ルスである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記植物ウイルスがコモウイルスである、請求項１〜７のい
    ずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記コモウイルスがカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）
    である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記異種ペプチドが、前記植物ウイルスの外被タンパク質
    の露呈部分において発現される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記異種ペプチドが、負に帯電したアミノ酸、正に帯電し
    たアミノ酸の中から選択された単数又は複数の荷電アミノ酸を含み、前記負に帯
    電したアミノ酸上の負の電荷は、前記正に帯電したアミノ酸上の正の電荷によっ
    て平衡化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記負に帯電したアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミ
    ン酸及びシステインの中から選択され、前記正に帯電したアミノ酸がリシン、ア
    ルギニン及びヒスチジンの中から選択されている、請求項１〜１１のいずれか１
    項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記異種ペプチドが、隣接する負に帯電したアミノ酸から
    成る第１の配列及び隣接する正に帯電したアミノ酸から成る第２の配列の中から
    選択された１つの隣接荷電アミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記隣接荷電アミノ酸配列が反復配列として前記異種ペプ
    チドの中で発生する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記異種配列が前記第１及び第２の配列を含み、前記第１
    の配列が前記第２の配列と隣接している、請求項１〜１４のいずれか１項に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記隣接する第１及び第２の配列が、反復配列として前記
    異種ペプチド内で発生する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記異種ペプチドが、隣接しない負に帯電したアミノ酸及
    び隣接しない正に帯電したアミノ酸を含み、前記異種ペプチドが、さらに隣接す
    る負に帯電したアミノ酸から成る第１の配列及び隣接する正に帯電したアミノ酸
    から成る第２の配列の中から選択された隣接荷電アミノ酸配列を含む、請求項１
    〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記隣接する負に帯電したアミノ酸の第１の配列が、ｎを
    １〜４０の整数として配列番号１６として列挙されている一般構造式Ａｓｐ−Ｇ
    ｌｕn−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ2n−Ａｓｐ−Ｇｌｕnを有する、請求項１〜１７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記投与が、鼻腔内、経口、中心静脈内、皮下、髄腔内、
    末梢静脈内、腹腔内及び筋内投与の中から選択される、請求項１〜１８のいずれ
    か１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記投与が、免疫アジュバント、サイトカイン及び薬学賦
    形剤の中から選択された組成物を投与する段階をさらに含む、請求項１〜１９の
    いずれか１項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記宿主動物が哺乳動物である、請求項１〜２０のいずれ
    か１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記哺乳動物がマウス及びヒトの中から選択される、請求
    項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記接合体が免疫原性である、請求項１〜２２のいずれか
    １項に記載の方法。
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