HRP20000701A2 - Modified plant viruses and methods of use thereof - Google Patents

Description

Područje izuma

Predloženi izum odnosi se na moduliranje naravi i/ili razine imunosne reakcije na molekulu. Posebno, izum se odnosi na izvršenje pojačanja u TH1 imunosnoj reakciji na molekule kao što su antigeni ili imunogeni, ali se ne ograničava samo na njih. Izum se također odnosi na smanjenje TH2 imunosne reakcije na molekulu. Pobliže, izum se odnosi na mijenjanje razine TH1- i TH2-povezanih imunoglobulina, razine proliferacije TH1- i TH2-povezanih citokina i razine proliferacije TH1 i TH2 stanica.

Pozadina izuma

Djelovanje TH1, prije TH2, u podskupini CD4+ T stanica od primarne je važnosti za konstrukciju cjepiva. To je zbog toga što TH1 stanice proizvode IL-2, IFN-γ i TNF-β citokine koji posreduju aktivaciju makrofaga i citotoksične T stanice (e. cytotoxic T cell, CTL), i oni su načelno efektori imuniteta posredovanog stanicom, protiv unutarstaničnih mikroba i usporenog tipa reakcija hiperosjetljivosti (e. delayed type hypersensitivity, DHT). IFN-γ također inducira izotip B stanica/razreda koji prebacuje na načelno efektorski izotip mišjeg IgG. IgG2, i u manjoj mjeri IgG2b, pojačava o antitijelu ovisnu i stanicom posredovanu citotoksičnost (e. antobody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC) i jako veže Clq klasične komplementne staze koja opsonizira stanice ili nakupine antitijela za fagocitozu. Na primjer, kao rezultat te efektorske funkcije u miševima, nađeno je da IgG2 bolje štiti miševe od virusnih infekcija [Ishizaka et al., (1995), J. Infect. Dis. 172:1108], mišjih tumora [Kaminski et al. (1986) J. Immunol. 136;1123] i parazita [Wechsler et al. (1986) J. Immunol. 137:2698], i pojačava bekterijsko čišćenje [Zigterman et al. (1989) Infect. Immunol. 57:2712].

Suprotno tome, TH2 stanice proizvode IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13, koji imaju neželjeno djelovanje u smislu potiskivanja imuniteta posredovanog stanicom [Mossman et al. (1986) J. Immunol. 136:2248]. Nadalje, IL-4 inducira B stanice da proizvode obadva IgG podrazreda koji skromno fiksiraju komplement i ne posreduju ADCC, kao također i IgE, koji veže mast stanice i bazofile.

Prema stanju tehnike, napori su se ulagali za poboljšanje cjepiva usmjeravanjem razvoja TH1 stanica, uz priznavanje da na djelovanje podskupine TH stanica utječe upotrijebljena vrsta životinje [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:2439], identitet antigena, put isporuke antigena [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:809], i režim imunizacije [Brett et al. (1993) Immunology 80:306].

Jedan pristup, prema stanju tehnike, pri stvaranju za antigen specifičnih TH1 reakcija bila je primjena oksidativno/reduktivne konjugacije od ljudskog na antigen [Apostopuolus et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10128-10132] ili konjugacija proteina na bakterjske proteine [Jahn-Schmid et al. (1997) Intl. Immunol. 9:1867]. Međutim, povezivanje na nosače koji se općenito koriste, kao što je KLH i tetanus toksoid, često je neuspješno kod povišenog omjera IgG2a;IgG1.

Druge metode induciranja TH1 reakcije uključuju upotrebu imunomodulatorskih sredstava kao što su vanjska pomoćna sredstva (na primjer: ISCOMS, QS21, Quil A, itd.). Međutim, jedino pomoćno sredstvo, koje je zasad provjereno za upotrebu u ljudima je alaun, a poznato je da on potiče neželjene reakcije tipa TH2, prije nego mnogo poželjniju reakciju tipa TH1. Druga imunomodulatorska sredstva, koja su bila upotrijebljena prema stanju tehnike, uključuju CpG oligodeoksiribonukleotide [Chu et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1623] ili citokine, kao što je interleukin-12 [IL-12, Scott et al. (1997) Seminl. Immunol. 9:285], koji se mogu dodati imunogenskim pripravcima koji dovode do proizvodnje visokih razina IgG2a usmjerenog protiv topivih proteinskih antigena. Međutim, citokini im skraćuju vijek upotrebe, a zbog značajne cijene njihova upotreba za cijepljenje u velikom opsegu neprivlačna je tehnički i komercijalno.

Primijenjen je također i drugačiji pristup upotrebi živih životinjskih virusnih cjepiva za proizvodnju pretežno virus-specifičnog IgG2a u miševima [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:809; Coutelier et al. (1989) J. Exp. Med. 165:64; Nguyen et al. (1994) J. Imiaunol. 152:478; Brubaker et al. (1996) J. Immunol. 157:1598]. Taj pristup ima nekoliko nedostataka. Prvo, cjepiva živih virusa ne rezultiraju dosljedno u TH1 tipu imunosne reakcije, jer neki živi virusi daju prednost proizvodnji drugih imunoglobulinskih izotipova karakterističnih za promijenjene staze T helpera [Coutelier et al. (1987) J. Exp. Med. 165:64; Perez-Filguiera et al. (1995) Vaccine 13:953]. K tome, takova životinjska virusna cjepiva se proizvode iz virusa koji su rasli u sistemima staničnih kultura koje su skupe za konstrukciju i provedbu. Osim toga, životinjski virus upotrijebljen kao vektor, često je virus kojem bi životinja već mogla biti izložena, i životinja bi mogla već proizvoditi antitijela prema tom vektoru. Zbog toga vektor može uništiti imunosni sistem prije nego ugrađeno antigensko mjesto drugog virusa inducira imunosnu reakciju. K tome, pristup s pripravkom životinjskog virusa uključuje genetsko manipuliranje sa živim virusima koji inficiraju životinju, s opasnošću od mutacija koje mogu narasti do novih oblika virusa promijenjene infektivnosti, antigenosti i/ili patogenosti. U stvari, postoji zabrinutost u pogledu sigurnosti pri upotrebi živih životinjskih virusnih cjepiva [World Heath Organization, 1989]. Osim toga, sigurnosna zabrinutost pri upotrebi živih životinjskih virusnih cjepiva nije prevladana upotrebom inaktivnih životinjskih virusa, jer inaktivni životinjski virusi općenito ne daju prednost proizvodnju IgG2. U stvari, misli se da proces infekcije tipiziran sa živim virusima sam po sebi generira IFN-γ koji dovodi do pretežne TH1 reakcije imunoglobulina [Nguyen et al. (1994) J. Inummol. 152:478].

Dok je drugi pristup uključio upotrebu živih bakterijskih vektora i DNA imunizaciju koja daje prednost stvaranju TH1 reakcije na ekspresionirane peptide, taj pristup, međutim, često ovisi i osjetljiv je prema načinu isporuke ili upotrijebljenom pomoćnom sredstvu. Osim toga, sigurnosna zabrinutost pri upotrebi živih bakterijskih cjepiva i DNA cjepiva [World Health Organization, 1989] dalje ograničavaju njihovu kliničku primjenu.

Stoga, dakle/postoji potreba za pripravcima i metodama stvaranja TH1-tipova reakcija. Ponajprije, na stvaranje reakcija tipa TH1 pomoću tih sastava i tom metodom ne djeluje genetička pozadina životinje domaćina, identited antigena, put isporuke antigena i režim imunizacije.

Kratki opis izuma

Predloženi izum daje metode i pripravke koji su učinkoviti u modulaciji naravi i/ili razini imunosne reakcije na molekulu, koja je, na primjer/ ali se ne ograničava samo na, antigen ili imunogen. Posebno, predloženi izum daje raetode i sredstva za pojačavanje TH1 djelovanja u imunosnoj reakciji na molekule kao što su antigeni ili imunogeni, i/ili smanjenje TH2 djelovanja u imunosnoj reakciji na takove molekule. Pobliže, izumom su date metode i sredstva za povećanje TH1 imunosne reakcije koja je usmjerena protiv molekula koje inače općenito stimuliraju TH2 tip reakcije. Izumom su nadalje dati pripravci i metode za smanjenje TH2 imunosne reakcije na molekule. K tome, ovdje su dati pripravci i metode za mijenjanje (to jest povećanje ili smanjenje) razine TH1- i TH2-povezanih imunoglobulina, razine proliferacije TH1- i TH2-povezanih citokina i razine ili proliferacije TH1 i TH2 stanica.

Pobliže, izumom je data metoda za mijenjanje razine TH1-povezanog imunoglobulina u životinji, koja uključuje:

a) osiguvaranje i) biljnog virusa koji sadrži heterologni peptid; i ii) životinju domaćina; b) davanje biljnog virusa životinji domaćinu, čime se dobije liječenu životinju; c) ispitivanje povišene razine TH1-povezanog imunoglobulina u liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, metoda nadalje uključuje d) promatranje porasta razine TH1-povezanog imunoglobulina u liječenoj životinji. Bez namjere za ograničenjem na bilo koji poseban način davanja, u drugoj izvedbi aplikacija je odabrana između intranazalne, oralne, parenteralne, subkutane, intratekalne/ intravenske, intraperitonealne i intramuskularne aplikacije. Također, bez ograničenja izuma na tip izvora pripravaka uključenih u aplikaciju virusa prema izumu, također u drugoj izvedbi davanje nadalje uključuje aplikaciju pripravka odabranog između imunskih pomoćnih dodataka, citokina i farmaceutskih pomoćnih sredstava. U daljnjoj izvedbi, aplikacija ima za posljedicu smanjenje simptoma povezanih s izlaganjem životinje heterolognom peptidu.

Iako nije namjera ograničenje izuma na bilo koji poseban tip životinje domaćina, također, u drugoj izvedbi životinja domaćin je sisavac. Ne namjerava se izum ograničiti na bilo koju posebnu životinju, Međutim, u prednosnoj izvedbi, sisavac je odabran između miša i čovjeka, U izvedbi kojoj se daje veću prednost, životinja domaćin je miš, a TH1-povezani imunoglobulin je odabran između IgG2a i IgG2b. U još povoljnijoj izvedbi, TH1-povezani imunoglobulin je IgG2a. U drugoj prednosnoj izvedbi životinja domaćin je čovjek, a TH1-povezani imunoglobulina je odabran između IgG1 i IgG3.

Bez ograničenja specifičnosti TH1-povezanog imunoglobulina, u alternativnoj izvedbi TH1-povezani imunoglobulin odabran je između imunoglobulina specifičnog za heterologni peptid i imunoglobulina specifičnog za biljni virus. U drugoj alternativnoj izvedbi, biljni virus je RNA virus. U daljnjoj alternativnoj izvedbi, biljni virus je ikozaedarski biljni virus odabran između komo virusa, tombus virusa, sobemo virusa i nepo virusa. U prednosnoj izvedbi biljni virus je komo virus. U još povoljnijoj izvedbi, komo virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (e. cowpea mosaic virus, CPMV).

Budući da izum nije ograničen na neki poseban izvor ili tip heterolognog peptida, u dodatnoj alternativnoj izvedbi heterologni peptid odabran je između β-podjedinice humanog korioničkog gonadotropina, humanog IgE vezanog s membranom, inačice III humanog mutantnog epidermnog receptora faktora rasta, pasjeg parvo virusa, peptidnog hormon, hormona koji oslobađa gonadotropin, alergena, peptida dobivenog iz stanice raka, i peptida dobivenog iz životinjskog patogena.

Nije predviđeno ograničenje izuma što se tiče mjesta na virusu na kojem se ekspresionira heterologni peptid. Također, u drugoj alternativnoj izvedbi, heterologni peptid se ekspresionira na proteinu omotača biljnog virusa. U prednosnoj izvedbi, protein omotača ima strukturu beta-bačve, a heterologni peptid umetnut je u petlju između pojedinačnih lanaca beta lista strukture beta bačve. U još povoljnijoj izvedbi, heterologni peptid je umetnut u βB-βC petlju biljnog virusa. U drugoj prednosnoj izvedbi, heterologni peptid umentut je između alanina 22 i prolina 23 malog proteina omotača (VP-S) virusa mozaične bolesti kravljeg graška. U drugoj izvedbi, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira heterologni peptid umetnuta je u genom biljnog virusa na mjestu na kojem nema izravnih ponavljanja nukleotidne sekvence, koja prekrivaju sekvencu nukleinske kiseline.

Nije predviđeno ograničenje izuma prema tipu heterolognog peptida. Međutim, također u drugoj izvedbi, heterologni peptid je antigen. U prednosnoj izvedbi, heterologni peptid je deriviran iz životinjskog virusa. U još povoljnijoj izvedbi, životinjski virus je odabran između virusa bolesti šape i ustiju, virusa humane imunosne deficijencije, humanog rino virusa, pasjeg parvo virusa. U alternativnoj prednosnoj izvedbi, heterologni virus deriviran je iz pripravka odabranog između životinjskog pategena, hormona i citokina. U izvedbi kojoj se daje veću prednost, životinjski patogen odabran je između virusa, bakterije, protozoa, nematoda, i gljivica. Također u daljnjoj izvedbi, heterologni peptid je imunogenski.

Izum dodatno daje metodu za mijenjanje razine proliferacije TH1 stanica u životinji, koja uključuje: a) osiguravanje: i) biljnog virusa koji sadrži heterologni peptid; i ii) životinju domaćina; b) davanje biljnog virusa životinji domaćinu čime se dobije liječenu životinju; i c) ispitivanje porasta razine proliferacije TH1 stanica u liječenoj životinji u usporedbi s razinom proliferacije TH1 stanica u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, metoda dalje obuhvaća d) promatranje porasta proliferacije razine TH1 stanica u liječenoj životinji u usporedbi prema razini proliferacije TH1 stanica u kontrolnoj životinji. U drugoj izvedbi, aplikacija rezultira smanjenjem simptoma povezanih s izlaganjem životinje domaćina heterolognom peptidu.

Ovdje je također data metoda za mijenjanje razine TH1-povezanog citokina u životinji koja uključuje: a) osiguravanje: i) biljnog virusa koji sadrži heterologni peptid; i ii) životinje domaćina; i b) davanje biljnog virusa životinji domaćinu čime se dobije liječenu životinju; i c) ispitivanje porasta razine citokina proizvedenog pomoću T stanica u liječenoj životinji u usporedbi s razinom citokina proizvedenog pomoću T stanica u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi metoda nadalje uključuje d) promatranje porasta razine citokina proizvedenog pomoću T stanica u liječenoj životinji u usporedbi s razinom citokina proizvedenom pomoću T stanica u kontrolnoj životinji, U drugoj izvedbi, davanje rezultira smanjenjem simptoma povezanih s izlaganjem životinje domaćina heterolognom peptidu. Također, u drugoj izvedbi, citokin je odabran između IL-2, TNF-β i IFN-γ- U prednosnoj izvedbi, citokin je IFN-γ- U daljnjoj izvedbi, razina THA- povezanog citokina u liječenoj životinji je ista kao i razina drugog citokina u životinji domaćinu. U prednosnoj izvedbi, drugi citokin je odabran između IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 i IL-13. U izvedbi kojoj se daje još veću prednost, drugi citokin je IL-4. U dodatnoj izvedbi, razina TH2-povezanog citokina u liječenoj životinji je smanjena u usporedbi s razinom drugog citokina u životinji domaćinu.

Izumom je nadalje data metoda za povećanje razine TH1-tipa imunosne reakcije na odredenu molekulu u životinji, koja metoda uključuje: a) osiguravanje: i) određene molekule; ii) biljnog virusa koji ekspresionira heterologni peptid sposoban za konjugaciju s dotičnom molekulom; i iii) životinju domaćina; b) konjugaciju dotične molekule na heterologni peptid, čime se dobije konjugat; i c) davanje konjugata životinji domaćinu, Čime se dobije životinju liječenu pod takovim uvjetima da je razina TH1-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u liječenoj životinji povećana u usporedbi s razinom TH1-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, metoda nadalje obuhvaća d) ispitivanje porasta razine imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U prednosnoj izvedbi, metoda nadalje uključuje e) promatranje porasta razine imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji.

Kako izum nije ograničen prirodom ili opsegom porasta razine reakcije tipa TH1, u drugoj prednosnoj izvedbi povišena razina imunosne reakcije tipa TH1 odabrana je između (a) porasta razine TH1-povezanog imunoglobulina u liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji, (b) povišene razine proliferacije TH1 stanica u liječenoj životnji u usporedbi s razinom proliferacije TH1 stanica u kontrolnoj životinji, i (c) povišene razine TH1-povezanog citokina u liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog citokina u kontrolnoj životinji. U drugoj izvedbi, TH1-povezani citokin odabran je između IL-2, THF-β i IFN-γ-. U izvedbi kojoj se daje veću prednost, citokin je IFN-γ- Također, u drugoj izvedbi, aplikacija rezultira smanjenjem simptoma povezanih s izlaganjem životinje domaćina dotičnoj molekuli. U alternativnoj izvedbi dotična molekula obuhvaća peptid, polisaharid, nukleinsku kiselinu ili lipid. U prednosnoj izvedbi, dotična molekula derivirana je iz izvora odabranog između životinjskog patogena, alergena i stanice raka.

Nije predviđeno ograničenje izuma prema tipu ili prirodi virusa. Međutim, u drugoj alternativnoj izvedbi, biljni virus je ikozaedarski biljni virus odabran između komo virusa, tombus virusa, sobemo virusa i nepo virusa. U prednosnoj izvedbi, biljni virus je komo virus. U izvedbi kojoj se daje još veću prednost, komo virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV).

Iako nije predviđeno ograničenje mjesta uvođenja heterolognog peptida u virus, u izvedbi kojoj se također daje veću prednost, heterologni peptid je umetnut između alanina 22 i prolina 23 malog proteina omotača (VP-S) virusa mozaične bolesti kravljeg graška. U daljnjoj alternativnoj izvedbi, heterologni virus ekpresioniran je na izloženom dijelu proteina omotača biljnog virusa.

Izum također nije ograničen na narav ili tip heterolognog peptida. Također, u dodatnoj alternativnoj izvedbi, heterologni peptid uključuje jednu ili više amino kiselina s nabojem, odabrane između amino kiselina s negativnim nabojem i amino kiselina s pozitivnim nabojem, pri čemu je negativan naboj na amino kiselini s negativnim nabojem uravnotežen s pozitivnim nabojem na amino kiselini s pozitivnim nabojem. U prednosnoj izvedbi, amino kiseline s negativnim nabojem odabrane su između aspartinske kiseline, glutaminske kiseline i cisteina. U drugoj prednosnoj izvedbi, amino kiseline s pozitivnim nabojem odabrane su između lizina, arginina i hidridina. Također u drugoj prednosnoj izvedbi, heterologni peptid sadrži sekvencu susjednih amino kiselina s nabojem odabranu između prve sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s negativnim nabojem i druge sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojera. U još povoljnijoj izvedbi, sekvenca susjednih amino kiselinama s nabojem pojavljuje se u heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca. U drugoj, još povoljnijoj izvedbi, heterologna sekvenca sadrži prvu i drugu sekvencu. Također, u još povoljnijoj izvedbi, prva sekvenca je susjedna s drugom sekvencom. U posebno povoljnoj izvedbi, susjedne prva i druga sekvenca pojavljuju se u heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca. U daljnjoj prednosnoj izvedbi, heterologni peptid sadrži ne-susjedne amino kiseline s negativnim nabojem i ne-susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem. U još povoljnijoj izvedbi, heterologni peptid sadrži, nadalje, sekvencu susjednih amino kiselina s nabojem, odabranu između prve sekvence koja sadrži amino kiseline s negativnim nabojem, i druge sekvence koja sadrži amino kiseline s pozitivnim nabojem. Također, u još povoljnijoj izvedbi, heterologni peptid sadrži prvu sekvencu. U dodatnoj prednosnoj izvedbi, prva sekvenca susjednih amino kiselina s negativnim nabojem ima opću formulu Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun, koja je ispisana kao SEQ ID NO: 6, gdje n predstavlja cijeli broj od 1 do 40. U posebno povoljnoj izvedbi, prva sekvenca je sekvenca amino kiselina Asp-Glu-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Asp-Glu, navedena kao SEQ ID NO:20.

Bez ograničenja na put ili način davanja, u daljnjoj izvedbi aplikacija je odabrana između intranazalne, oralne ili parenteralne, subkutane, intratekalne, intravenske, intraperitonealne i intramuskularne aplikacije. U dodatnoj izvedbi, aplikacija također uključuje pripravak odabran između imunosnog pomoćnog sredstva, citokina i farmaceutskog pomoćnog sredstva.

Kako tip životinje nije ograničen, izumom se pretpostavlja da je, također u drugoj izvedbi, životinja domaćin sisavac. U prednosnoj izvedbi, sisavac je odabran između miša i čovjeka. U alternativnoj izvedbi, konjugat je iminugenski.

Izumom je također data metoda za smanjenje razine TH2-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu, koja metoda obuhvaća: a) osiguravanje: i) dotične molekule; ii) biljnog virusa; i iii) životinje domaćina; b) konjugaciju dotične molekule s biljnim virusom, čime se dobije konjugat; i c) davanje konjugata životinji domaćinu, čime se dobije liječenu životinju pod takovim uvjetima da je razina imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji smanjena u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, metoda nadalje uključuje d) ispitivanje smanjenja razine imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U prednosnoj izvedbi, metoda nadalje uključuje e) promatranje smanjenja razine imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U drugoj izvedbi, aplikacija ima za posljedicu smanjenje simptoma povezanih s izlaganjem životnje domaćina dotičnoj molekuli. U alternativnoj izvedbi, smanjena razina imunosne reakcije tipa TH2 odabrana je izmedu (a) smanjene razine TH2-povezanog imunoglobulina u liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH2-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji, (b) smanjene razine proliferacije TH2 stanica u liječenoj životinji u usporedbi s razinom proliferacije TH2 stanica u kontrolnoj životinji, i (c) smanjene razine TH2-povezanog citokina u liječenoj životinji u usporedbi s razinm TH2-povezanog citokina u kontrolnoj životinji. U prednosnoj izvedbi, TH2-povezani citokin odabran je između IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 i IL-13. U još povoljnijoj izvedbi, TH2-povezani citokin je IL-4. U drugoj alternativnoj izvedbi, dotična molekula uključuje peptid, polisaharid, nukleinsku kiselinu, ili lipid. U dodatnoj alternativnoj izvedbi, dotična molekula odabrana je između antigena i pomoćnog sredstva. U prednosnoj izvedbi, antigen je peptid. Također, u alternativnoj izvedbi, životinja domaćin je miš, a TH2-povezani imunoglobulin je odabran između IgG1 i IgG3. U dodatnoj izvedbi, životinja domaćin je čovjek, a TH2-povezani imunoglobulin je IgG2.

Izumom je također data metoda za smanjenje razine i opsega imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu, koja metoda uključuje: a) osiguravanje: i) dotične molekule; ii) biljnog virusa; i iii) životinje domaćina koja pokazuje TH2-tip immunosne reakcije na dotičnu molekulu; b) konjugaciju dotične molekule s biljnim virusom, čime se dobije konjugat; i c) davanje konjugata životinji domaćinu, čime se dobije liječenu životinju pod takovim uvjetima da je razina imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji smanjena u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, metoda nadalje uključuje d) ispitivanje smanjenja razine TH2-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH2-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U prednosnoj izvedbi, metoda nadalje uključuju e) promatranje smanjenja razine imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH2 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U drugoj izvedbi, u životinji je dominantna reakcija tipa TH2.

Izumom je također dat postupak za povišenje razine imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u životinji, koji postupak uključuje: a) osiguravanje i) dotične molekule; ii) biljnog virusa koji ekspresionira heterologni peptid koji se može konjugirati na spomenutu molekulu; i iii) životinje domaćina; b) konjugaciju dotične molekule na spomenuti heterologni peptid, čime se dobije konjugat; i c) davanje tog konjugata životinji domaćinu, čime se dobije životinju liječenu pod takovim uvjetima da je razina TH1-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u liječenoj životinji povećana u usporedbi s razinom TH1-tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji; d) prema potrebi, ispitivanje porasta razine imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH1 na dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji; i e) prema potrebi, promatranje porasta razine imunosne reakcije tipa TH1 na spomenutu dotičnu molekulu u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom imunosne reakcije tipa TH1 spomenutu dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji. U jednoj izvedbi, povišena razina TH1-tipa imunosne reakcije odabrana je između (a) povišene razine TH1-povezanog imunoglobulina u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji, (b) povećane razine proliferacije TH1 stanica u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom proliferacije TH1 stanica u kontrolnoj životinji, i (c) povećane razine TH1-povezanog citokina u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog citokina u kontrolnoj životinji. U drugoj izvedbi, TH1-povezani citokin odabran je između IL-2, TNF-β i IFN-γ. Također, u drugoj izvedbi, aplikacija ima za posljedicu smanjenje simptoma povezanih s izlaganjem spomenute životinje domaćina spomenutoj dotičnoj molekuli. U daljnjoj izvedbi, dotična molekula uključuje peptid, polisaharid, nukleinsku kiselinu, ili lipid. U alternativnoj izvedbi, dotična molekula derivirana je iz izvora odabranog između životinjskog pategena, alergena i stanice raka. Također, u drugoj izvedbi, biljni virus je izokaedarski biljni virus odabran između komo virusa, tombus virusa, sobemo virusa i nepo virusa. U alternativnoj izvedbi, biljni virus je komo virus. U još povoljnijoj izvedbi, komo virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV). Također, u drugoj izvedbi, heterologni peptid je ekspresioniran na izloženom dijelu proteina omotača spomenutog biljnog virusa. U alternativnoj izvedbi, heterologni peptid uključuje jednu ili više amino kiselina s nabojem odabranih izmedu amino kiselina s negativnim nabojem i amino kiselina s pozitivnim nabojem, pri čemu je negativan naboj na amino kiselini s negativnim nabojem uravnotežen s pozitivnim nabojem na amino kiselini s pozitivnim nabojem. U drugoj izvedbi, amino kiseline s negativnim nabojem odabrane su izmedu aspartinske kiseline, glutaminske kiseline u cisteina, a spomenute amino kiseline s pozitivnim nabojem odabrane su između lizina, arginina i histidina. U drugoj izvedbi, heterologni peptid sadrži sekvencu sa susjednim amino kiselinama s nabojem odabranu izmedu prve sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s negativnim nabojem i druge sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem. Također, u drugoj izvedbi, sekvenca sa susjednim amino kiselinama nabojem nastaje u heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca. U daljnjoj izvedbi, heterologna sekvenca sadrži spomenute prvu i drugu sekvencu, pri Čemu spomenuta prva sekvenca graniči sa spomenutom drugom sekvencom. Također u daljnjoj izvedbi, susjedne prva i druga sekvenca nastaju u spomenutom heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca. Također, u daljnjoj izvedbi, heterologni peptid sadrži ne-susjedne amino kiseline s negativnim nabojem i ne-susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem, pri čemu spomenuti heterologni peptid, nadalje, sadrži sekvencu susjednih amino kiselina s nabojem odabranih između prve sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s negatinim nabojem i druge sekvence koja sadrži susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem. U drugoj izvedbi, prva sekvenca susjednih amino kiselina s nabojem ima opću formulu Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun koja je ispisana kao SEQ ID NO 6, gdje n predstavlja cijeli broj od 1 do 40, Također u drugoj izvedbi, aplikacija je odabrana između intranazalne, oralne, parenteralne, subkutane, intratekalne, intravenske, intraperitonealne i intramuskularne aplikacije. Također, u drugoj izvedbi, aplikacija nadalje uključuje pripravak odabran između imunosnog pomoćnog sredstva, citokina i farmaceutskog pomoćnog sredstva. U daljnjoj izvedbi, životinja domaćin je sisavac. U drugoj alternativnoj izvedbi, sisavac je odabran između miša i čovjeka. U prednosnoj izvedbi, konjugat je iminugenski.

Izumom je također data metoda za stimulaciju pretežno TH1-tipa za peptid specifične reakcije koja uključuje konjugaciju antigena na biljni virus, i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa. Ponajprije, biljni virus je ikozaedarski biljni virus. Pobliže, biljni virus je komo virus. Također, još povoljnije, biljni virus je biljni virus mozaične bolesti kravljeg graška. U jednoj izvedbi, antigen je strani peptid koji se ekspresionira kao umetnuti peptid kodiran pomoću rekombinantnog gena biljnog ivrusa. Ponajprije, antigen se ekspresionira kao fuzijski polipeptid kodiran s rekombinantnim strukturnim genom proteina omotača. Također u daljnjoj izvedbi, imunogenski kompleks se daje u prisutnosti farmaceutski prihvatljivog pomoćnog sredstva. U daljnjoj izvedbi, način aplikacije imunogenskog kompleksa odabran je između intranazalne inolukacije, parenteralne inokulacije i subkutane inokulacije. Također u drugoj izvedbi, imunogenski kompleks se daje u prisutnosti imunomodulatorskog sredstva. Ponajprije, imunomodulatorsko sredstvo je imunosno pomoćno sredstvo. Pobliže, imunosno pomoćno sredstvo je odabrano iz skupine koja sadrži: toksin kolere (CT) i njegov mutant, toplinski nepostojan enterotoksin (LT) i njegov mutant, Quil A (QS21); RlBl pomoćno sredstvo koje se spominje kao g-inulin, i ISCOM-i. U alternativnoj prednosnoj izvedbi, imunomodulatorsko sredstvo je citokin, ponajprije citokin koji se može izlučiti iz CD4+TH1 limfocita životinje. Pobliže, citokin je odabran iz skupine interleukina 2, interferona γ; tumorskog nekroznog faktora β. U dodatnoj izvedbi, imunogenski kompleks se daje subkutano na jednom mjestu jednostrukom dozom, subkutano na više od jednog mjesta jednostrukom istodobnom dozom, parenteralno na jednom mjestu jednostrukom dozom, parenteralno na više od jednog mjesta jednostrukom istodobnom dozom, subkutano na jednom mjestu u više od jedne doze, parenteralno na jednom rajestu u više od jedne doze, subkutano na više mjesta i/ili parenteralno na više mjesta u više doza.

Izumom je također data himerna virusna čestica koja se može upotrijebiti u bilo kojoj od gore opisanih metoda, i u kojoj na reaktivnom peptidu može biti kemijski konjugirana proteinska ili neproteinska molekula, kodirana unutar strukturnog gena u genomu himernog biljnog virusa. U jednoj izvedbi, kemijski reaktivan peptid umetnut je u protein omotača čestice himernog virusa. U drugoj izvedbi, kemijski reaktivan peptid umetnut je između alanina 22 i prolina 23 malog proteina omotača (VP-S) virusa mozaične bolesti kravljeg graška. Također, u drugoj izvedbi, pozitivni naboji na ostacima reaktivnih amino kiselina (X) uravnoteženi su uključenjeia odgovarajućeg broja aiainokiselinskih ostataka (Y) s negativnim nabojem unutar reaktivnog peptida, koji tako zajedno imaju opću formulu X(n)Y(n) u kojoj n je cijeli broj između 1 i 40. U drugoj izvedbi, umetnuti kemijski reaktivan peptid ima sekvencu amino kiselina opće formule DE(n)GK(n)DE(n) u kojoj n predstavlja cijeli broj između 1 i 40. U prednosnoj izvedbi, umetnuti kemijski reaktivan peptid ima sekvencu amino kiselina DEGKGKGKGKDE. U daljnjoj izvedbi, antigen je ugljikohidratna skupina konjugirana preko kemijske veze na reaktivan peptid ekspresioniran kao umetnutu fuziju unutar strukturnog proteina himernog biljnog virusa.

Izumom je također data metoda premoštivanja TH2 tipa imunosne reakcije, kojoj prednost daju svojstvene imunosne stimulacijske značajke antigena, koja metoda uključuje konjugirajući antigen na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Ovdje je također opisana metoda premoštenja TH2-imunosne reakcije koju potiču svojstvene imunosne stimulacijske značajke peptida koja uključuje ekspresiju peptida kao fuzijskog peptida kodiranog s rekombinantnim genomom biljnog virusa i davanje životiji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Izumom je dodatno data metoda za premoštenje TH2-tipa imunosne reakcije kojoj daje prednost genetička konstitucija životinje prema antigenu, koja uključuje konjugaciju antigena na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Osim toga, izumom je data metoda premoštenja TH2-tipa imunosne reakcije, kojoj daje prednost genetička konstitucija životinje prema peptidu, koja uključuje ekspresiju peptida kao fuzijskog peptida kodiranog s rekombinantnom genomu biljnog virusa i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Izumom je također data metoda premoštenja TH2-tipa imunosne reakcije koju potiču svojstvene imunosne značajke pomoćnog sredstva prisutnog u imunogenskom komplesu koji sadrži antigen, koja uključuje konjugaciju antigena na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Izumom je također data metoda za liječenje infekcijskih bolesti stimulacijom imunosne reakcije koja djeluje u smislu TH1, i koja uključuje konjugaciju antigena povezanog s infektivnim sredstvom na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Također, izumom je data metoda za liječenje životinja koje pate od alergije stimulacijom imunosne reakcije koja djeluje u smislu TH1, i koja uključuje konjugaciju antigena deriviranog od poznatog alergena povezanog s alergijom na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

K tome, izum opisuje metodu liječenja životinje koja pati od raka stimulacijom imunosne reakcije koja djeluje u smislu TH1, koja uključuje konjugaciju antigena povezanog s rakom na biljni virus i davanje životinji dobivenog imunogenskog kompleksa.

Osim toga, ovdje je data metoda za induciranje pomaka u postojećem TH2-tipu imunosne reakcije na antigen prisutan u jednom imunogenskom kompleksu, upotrijebljenom za pobuđivanje imunosne reakcije u životinji, koja obuhvaća inokulaciju životinje s imunogenskim kompleksom koji sadrži antigen konjugiran na biljnu virusnu česticu u drugoj ili slijedećoj dodatnoj dozi.

Definicije

Da bi se olakšalo razumijevanje izuma, dolje su definirani neki pojmovi.

Pojam "antigen" i "antigenski" odnosi se na svaku tvar koju specifično prepoznaje antitijelo ili receptor T stanice. Antigeni sadrže jednu ili više epitopa (koje se također nazivaju i "antigenskim determinantama"). "Epitopa" je struktura na antigenu koja ulazi u interakciju s mjestom vezanja antitijela ili receptora T stanice kao rezultat molekularne komplementarnosti. Epitopa se može natjecati s nedirnutim antigenom iz kojeg je derivirana za vezanje na antitijelo. Općenito, odvojena antitijela i njihovi odgovarajući membranom povezani oblici mogu prepozanti veliko mnoštvo tvari kao antigene, dok receptori T stanica mogu prepoznati samo fragmente proteina koji su kompleksirani s MHC molekulama na površinama stanica. Antigeni koje su prepoznati pomoću receptora imunoglobulina na B stanicama dijele se u tri kategorije: antigeni ovisni o T stanicama, antigeni neovisni o tipu 1 T stanica; i antigeni neovisni o tipu 2 T stanica. Antigen može sadržavati jednu ili više slijedećih molekula: peptid, polisaharid, sekvencu nukleinske kiseline, ili lipid.

Pojmovi "imunogena", "imunogenska" i "imunološki aktivna" odnose se na svaku tvar koja je kadra iducirati specifičnu humoralnu i stanično posredovanu imunosnu reakciju odgovor. Prema definiciji, imunogen mora sadržavati najiaanje jednu epitopu, a općenito sadrži nekoliko epitopa. Imunogeni jesu, ali se ne ograničavaju samo na, primjerice, molekule koje sadrže peptid, polisaharid, sekvencu nukleinske kiseline i/ili lipid. Također su predviđeni i kompleksi peptida s lipidima, polisaharidima ili sa sekvencama nukleinske kiseline, uključiv (bez ograničenja samo na njih) glikopeptide, lipopetide, glikopeptide itd. Ovi kompleksi su posebno korisni imunogeni, gdje manje molekule s nekoliko epitopa ne stimuliraju zadovoljavajuću imunosnu reakciju s njima samima.

Pojam "alergen" odnosi se na antigen ili imunogen koji inducira jednu ili više (alergijskih) reakcija preostjeljivosti, na primjer, ali neograničavajući se samo na, proizvodnju IgE antitijela. Alergeni uključuju, ali nisu ograničeni samo na polene ambrozije, trave, ili drveća, ili onih od gljivica, životinjskih nametnika, kućne prašine ili jela. Pojedinci izloženi alergenu općenito, iako ne i nužno, razvijaju osipe ili pojavu hunjavice ili astme.

Pojam "pomoćno sredstvo", kako se ovdje rabi, odnosi se na svaki spoj koji ubrizgan zajedno s antigenom, pojačava ne-specifičnu imunosnu reakciju na taj antigen.

Pojam "pomoćna tvar" ovdje se odnosi na svaku inertnu tvar (na primjer guma rabika, sirup, lanolin, škrob, itd.) koja oblikuje vehikl za isporuku antigena. Pojam "pomoćne tvari" uključuje tvari koje u prisutnosti dovoljne količine tekućine podaju formulaciji svojstvo ljepljivosti potrebno za pripravljanje pilula ili tableta.

Pojmovi "antitijelo" i "imunoglobulin" koriste se kao sinonim i odnose se na glikoprotein kojeg u tijelu životinje pobuđuje imunogen. Antitijelo pokazuje specifičnost prema imunogenu, ili pobliže, prema jednoj ili više epitopa sadržanih u imunogenu. Urođeno antitijelo sadrži najmanje dva lagana polipeptidna lanca i najmanje dva teška polipeptidna lanca. Antitijela se mogu poliklonirati ili monoklonirati. Pojam "poliklonsko antitijelo" odnosi se na imunoglobulin proizveden u plazma stanicama više od jednog jednostrukog klona; suprotno tome, "monoklonsko antitijelo" odnosi se na imunoglobulin kojeg u plazma stanicama proizvodi jednostruki klon.

Pojam "izotopa" ili "razred", kad se navodi u svezi antitijela, odnosi se na razred antitijela koji je kodiran s određenim tipom gena koji ima konstantno područje teškog lanca. Tako se izotope različitih antitijela razlikuju u sekvenci amino kiseline konstantnog (CH) područja teškog lanca. Poznato je nekoliko izotipova antitijela koji uključuju IgA, IgD, IgG, IgE i IgM. Tako IgG ima γ konstantnu domenu teškog lanca (Cγ); IgM ima μ konstantnu domenu teškog lanca (Cμ); IgA ima α konstantnu domenu teškog lanca (Cα); IgD ima β konstantnu domenu teškog lanca (Cδ); i IgE ima ε konstantnu domenu teškog lanca (Cε). Različiti razredi antitijela pokazuju različite efektorske funkcije i pokazuju različitu lokalizaciju tkiva. Svaki razred antitijela može se ekspresionirati kao membrana (m) ili zaklonjen oblik (s, e. secreted) koji se razlikuju po sekvenci na karboksilnom kraju teškog lanca. Najviše antigena uzrokuje trenutnu ekspresiju IgM u serumu, nakon čega potonji pomoću sekundarnog izotipa prebacuje na reakciju u kojoj su pretežni proizvodi niže od gena teškog lanca, kao što su cγ1 i Cγ2. Izotip antitijela, koje će pretežno stvoriti, općenito ovisi o tipu antigena (na primjer polipeptid, polisaharid, itd.) upotrijebljenog za izazivanje proizvodnje antitijela.

Pojmovi "podtip" ili pod-razred", kad se upotrebljava u svezi s izotipom antitijela, odnose se, kao sinonimi, na antitijela unutar izotipa koji sadrži varijaciju u strukturi teškog lanca. Na primjer, izotip humanog IgG sadrži četiri pod-tipa IgG1, IgG2, ,IgG3 i IgG4, dok mišji IgG izotip sadrži četiri pod-tipa IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3. Ljudski IgA izotip sadrži pod-tipove IgA1 i IgA2. Geni koji kodiraju za konstatan teški lanac ucrtani su u kartu za miša i oni se nalaze na kromozomu 12 u redoslijedu (od 5' kraja) Cμ-Cδ-Cγ3-Cγl-Cγ2b-Cγ2a-Cε-Cα koji odgovara izotipovima IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE i IgA.

Pojam "prebacivanje izotipa" odnosi se na pojavu da se jedan izotip antitijela (na primjer IgM) mijenja u drugi izotip antitijela (na primjer IgG). Slično, pojam "prebacivanje pod-tipa" odnosi se na pojavu da se pod-tip antitijela (na primjer IgG1) mijenja u drugi pod-tip (na primjer, IgG2a) istog pod-tipa antitijela.

Pojam "funkcija efektora", kako se ovdje rabi u svezi s antitijelom, odnosi se na djelovanja u smislu nevezanja antigena, koja su posredovana s molekulama antitijela, i koja se izvršavaju preko konstantnog područja teškog lanca molekule. Efektorske funkcije jesu, na primjer, vezanje receptora na imunosne stanice, komplementna fiksacija itd. Efektorske funkcije olakšavaju odstranjivanje antitijela iz tijela pomoću lize posredovane s komplementom ili fagocitima.

Pojam "specifilno vezanje" ili "naročito vezanje", kad se koristi u svezi interakcije antitijela i antigena znači da interakcija ponajprije pokazuje prednost prema, a još povoljnije da ovisi o prisutnosti određene strukture (to jest, antigenske determinante ili epitope) na antigenu; drugim riječima antitijelo se reorganizira i veže na specifičnu strukturu antigena (uključiv srodne strukture) prije nego na antigen općenito). Na primjer, ako je antitijelo je specifično za epitopu "A", prisutnost antigena koji uključuje epitopu A (ili bez nje, neobilježena A) u reakciji koja sadrži obilježenu "A" i antitijelo će smanjiti količinu obilježenih A povezanih na antitijelo.

Kako se ovdje rabi, "imunogenski-učinkovita količina" odnosi se na onu količinu imunogena potrebnu da izazove proizvodnju antitijela u domaćinu nakon cijepljenja. Povoljno je, iako nije nužno, da je imunološki učinkovita količina "zaštitna" količina. Pojmovi "zaštitna" ili "terapeutska" količina imunogena odnose se na onu količinu imunogena koja umanjuje jedan ili više neželjenih simptoma koji su povezani s izlaganjem životinje domaćina imunogenu. Pojmovi "umanjivati" i "smanjivati" simptome, kako se ovdje rabe u svezi s učinkom pojedinačnog pripravka ili posebne metode, misli se na smanjenje, osujećivanje ili eliminaciju jednog ili više simptoma u usporedbi sa simptomima opaženim u odsutnosti liječenja s određenim pripravkom ili metodom. Kako se ovdje rabi, pojam "smanjivanje" simptoma odnosi se opadanje razina jednog ili više simptoma. Pojam "osujećivanje" simptoma odnosi se na povećanje vremenskog perioda između izlaganja imunogenu i pojave jednog ili više simptoma. Pojam "eliminacija" odnosi se na potpuno "smanjenje" i/ili potpuno osujećenje" jednog ili više simptoma.

Pojam "životinja" odnosi se na bilo koju životinju čija antitijela, ili receptori T stanica su sposobni specifično prepoznati antigen. Alternativno, pojam "životinja" uključuje svaku životinju koja je sposobna inducirati specifičan humaralnu ili stanično posredovanu imunosnu reakciju na imunogen. Prednosne životinje uključuju, ali nisu ograničene na sisavce kao što su glodavci, ljudi, primati, goveda, preživači, lagomorfi, svinje, koze, konji, psi, mačke, ptice itd. Prednosne životinje odabrane su iz reda sisavaca koji se odnosi na rodente, to jest sisavce iz maternice (razred Euthira) koji uključuje porodicu Muridae (na primjer štakore, miševe), ponajprije miševe. Pojam "sekvenca nukleinske kiseline" i "nukleotidna sekvenca", kako se ovdje rabi, odnosi se na oligonukleotid ili polinukleotid, i njegove fragiaente ili dijelove, i na DNA ili RNA genomnog ili sitetičkog porijekla koja može imati jednostruki ili dvostruki lanac, i predstavlja lanac istog smjera ili suprotnog smjera.

Pojmovi "sekvenca amino kiselina", "peptid", "peptidna sekvenca", "polipeptid" i "polipeptidna sekvenca", koji se koriste naizmjence, odnose se na sekvence amino kiselina.

Pojmovi "dotični peptid", "dotična nukleotidna sekvenca" i "dotična molekula" odnose se na peptidnu sekvencu, nukleotidnu sekvencu i molekulu koja se stručnjaku čini poželjnom za manipulaciju iz bilo kojeg razloga. Primjer takove molekule uključuje, ali nije ograničen samo na peptid, glikopeptid, polisaharid, lipopeptid, glikolipid, lipid, steroid, nukleinsku kiselinu itd.

Pojam "deriviran", kad se navodi u svezi peptida deriviranog iz stanice raka, kako se ovdje rabi, odnosi se na peptid koji je dobiven (na primjer izoliran, očišćen itd.) iz stanice raka.

Pojam "biološki aktivan" kad se odnosi na bilo koju molekulu (na primjer polipeptid, nukleotidnu sekvencu,

itd.) odnosi se na molekulu koja ima strukturne, regulacijske i/ili biokemijske funkcije prirodno nastale molekule.

Peptidna sekvenca i nukleotidna sekvenca mogu biti "endogene" ili "heterologne" (to jest "strane"). Pojam "endogena" odnosi se na sekvencu koja je prirodno nađena u stanici ili virusu, u koji je ona uvedena, sve dok ona ne sadrži neku modifikaciju u usporedbi s prirodno nastalom sekvencom. Pojam "heterologna" odnosi se na sekvencu koja nije endogena za statnicu ili virus u koji je uvedena. Na primjer, heterologna DNA uključuje nukleotidnu sekvencu koja je povezana na, ili je obrađena tako da postane povezana na sekvencu nukleinske kiseline na koju inače prirodno nije povezana, ili na koju je povezana na drugačijem mjestu nego prirodno. Heterologna DNA također uključuje nukleotidnu sekvencu koja je prirodno nađena u stanici ili virusu u koji je uvedena i koja sadrži neku modifikaciju u usporedbi s prirodno nastalom sekvencom. Općenito, iako ne i nužno, heterologna DNA kodira heterolognu RNA i heterologne proteine koji se normalno ne proizvode pomoću stanice ili virusa u koji je uvedena. Primjeri heterolognih DNA uključuju reporterske gene, transkripcijske i translacijske regulacijske sekvence, DNA sekevence koje kodiraju proteinske markere koji se mogu birati (na primjer proteine koji donose otpornost lijeka), itd.

Pojam "divlji tip", kad se koristi u svezi peptidne sekvence i nukleotidne sekvence, odnosi se na peptidnu sekvencu, odnosno nukleotidnu sekvencu koja ima značajke te peptidne sekvence i nukleotidne sekvence kad je ona izolirana iz prirodno nastalog izvora. Peptidna sekvenca divljeg tipa i nukleotidna sekvenca divljeg tipa je ona koja je najčešće opažena u populaciji i stoga je arbitrarno označena kao "normalan" oblik ili oblik "divljeg tipa" peptidne sekvence, odnosno nukleotidne sekvence. Suprotno tome, pojam "modificirana" ili "mutantna" odnosi se na peptidnu sekvencu i nukleotidnu sekvencu koja pokazuje modifikacije u sekvenci i/ili u funkcionalnim svojstvima (to jest, promijenjene karakteristike) kad se usporedi s peptidnom sekvencom divljeg tipa, odnosno s nukleotidnom sekvencom divljeg tipa. Treba napomenuti da se mogu izolirati prirodno nastali mutanti; oni se identificiraju temeljem činjenice da oni imaju promijenjene karakteristike kad se usporede s peptidnom sekvencom, odnosno nukleotidnom sekvencom divljeg tipa.

Pojam "izoliran", kad se koristi u odnosu na molekulu (na primjer sekvencu nukleinske kiseline, sekvencu amino kiselina itd.), odnosi se na molekulu koja je identificirana i izdvojena iz najmanje jedne kontaminantne molekule s kojom je povezana.

Kako se ovdje rabi, pojam "očišćena" odnosi se na molekulu (na primjer sekvenca nukleinske kiseline, sekvenca amino kiselina itd.) koja je uklonjena iz svog prirodnog okruženja, izolirana ili odvojena. "Izolirana" molekula je stoga očišćena molekula. "Uglavnom očišćene" molekule su barem 60% bez, ponajprije najmanje 75% bez, a još bolje najmanje 90% bez drugih komponenata s kojima su povezane.

Pojam "patogen" i "životinjski patogen" odnosi se na bilo koji organizam koji uzrokuje bolest životinje. Patogeni uključuju ali nisu ograničeni samo na viruse, bakterije, protozoe, nematode, gljivice itd.

Pojam "stanica raka" odnosi se na stanicu koja je podvrgnuta ranim, međufaznim ili uznapredovalim stupnjevima višefazne neoplastične progresije. Karakteristike ranih, međufaznih i uznapredovalih stupnjeva neoplastične progresije opisane su pomoću mikroskopa. Stanice raka u svakom od ta tri stupnja neoplastične progresije općenito imaju nenormalne kario tipove, uključiv translokacije, inverziju, brisanja, izokromozome, monosomije, i ekstrakromozome. Stanice raka uključuju "hiperplastične stanice", to jest stanice u ranom stupnju malignantne progresije, "displastične stanice", to jest stanice u međufaznim stupnjevima neoplastične progresije i "neoplastične stanice", to jest stanice u uznapredovalim stupnjevima neoplastične progresije.

Pojam "modificirani biljni virus" odnosi se na biljni virus, čiji je bilo koji dio bio modificiran kemijski, biokemijski i/ili postupcima molekularne biologije. "Himerni biljni virus" je biljni virus koji je bio modificiran tehnikom molekularne biologije.

Pojmovi "reakcija tipa TH1" ili "TH1 odgovor", kad se navode u svezi s reakcijom u životinji, odnose na svaku staničnu i/ili humoralnu reakciju koja nastane pomoću TH1 limfocita nakon stimulacije s antigenom, uključiv, ali bez ograničenja samo na, promjene u razini TH1-povezanog imunoglobulina, proliferaciju TH1 stanica i/ili TH1-povezanog citokina. Suprotno tome, "TH2-tip reakcije", "TH2 odgovor", kad se navodi u svezi reakcije u životinji, odnosi se na bilo koju staničnu i/ili humoralnu reakciju koja nastane pomoću TH2 limfocita nakon stimulacije s antigenom, uključiv, ali ne ograničavajući se na promjene u razini TH2-povezanog imunoglobulina, proliferacije TH2 stanica i/ili TH2-povezanog citokina.

Pojmovi "TH1-povezani imunoglobulin" i "imunoglobuilin deriviran iz TH1 stanice" odnosi se na jedan ili više imunoglobulina (na primjer IgG) koje su stvorile TH1 stanice. Suprotno tome, pojmovi "TH2-povezani imunoglobulin" i "imunoglobulin deriviran iz TH2 stanica" odnosi se na jedan ili više imunoglobulina (na primjer, IgG) koje su stvorile TH2 stanice. Pod-tipovi TH-1 povezanih imunoglobulina i TH-2 imunoglobulina su specifični prema vrstama time što se oni mijenjaju od vrste do vrste. NA primjer, dok je kod miševa IgG2 (a posebno IgG2a i IgG2b) načeno TH1-povezani imunoglobulin, u čovjeku su IgG1 i IgG3 TH1-povezani imunoglobulini koji vrše TH1 funkcije. U odnosu prema TH2-povezanim imunoglobulinima, oni uključuju mišji IgG1 i IgG3 i humani IgG2. Metode za utvrđivanje pod-tipova imunoglobulina su u struci poznate i ovdje su također opisane, na primjer, postupak ispitivanja pomoću enzimom vezanog imunosorbenta (e. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), koji koristi jamice za uzorke premazane s komercijalno dostupnim konjugatima alkalne fosfataze (AP)-obilježeni anti IgG (na primjer, alkalna fosfataza (AP)-konjugirani anti-kozji anti mišji IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3 [Southern Biotechnologies Inc. USA]) za detekciju, upotrebom p-nitrofenil fosfata (PNPP, [Sigma]) kao podloge.

Pojam "TH1-povezani citokin" i "citokin deriviran iz TH1 stanice" odnosi se na jedan ili više citokina proizvedenih pomoću TH1 stanica, uključiv, ali ne ograničavajući se na interleukin-2 (IL-2), tumorski nekrozni faktor β (TNF-β) i interferon γ (IFN-γ)- U prednosnoj izvedbi TH1-povezani citokin je IFN-γ. Suprotno tome, pojmovi "TH2-povezani citokin" i "citokin deriviran iz stanice TH2" odnosi se na jedan ili više citokina proizvedeih pomoću TH2 tipa stanica, uključiv, ali ne ograničavajući se na interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 9 (IL-9), interleukin 10 (IL-10) i interleukin 13 (IL-13). U prednosnoj izvedbi TH2-povezani citokin je IL-4.

Opis izuma

Predloženi izum daje metode i pripravke koji su učinkoviti u moduliranju naravi i/ili razine imunosne reakcije na molekulu, koja je, ali nije ograničena samo na, primjerice, antigen ili imunogen. Posebno, izum daje metode i sredstva za poticanje djelovanja TH1 u umunosnom odgovoru na molekule kao što su antigeni ili imunogeni, i/ili smanjenje TH2 djelovanja u imunosnom odgovoru prema takovim molekulama. Pobliže, izum daje metode i sredstva za povećanje TH1 imunosne reakcije koja je usmjerena protiv molekula koji inače općenito stimuliraju TH2-tip reakcije. Izum nadalje daje pripravke i metode za smanjenje TH2 imunosne reakcije na molekule. K tome ovdje su dati pripravci i metode za mijenjanje (to jest povećanje ili smanjenje) razine TH1- i TH2-povezanih imunoglobulina, razine prolifracije TH1- i TH2-povezanih citokina i razine proliferacije TH1 i TH2 stanica.

U prvom aspektu, izum daje modificirane čestice biljnog virusa, koje se mogu predstaviti stanicama molekula imunosnog sistema, koje su učinkovite kao imunogeni ili antigeni za stvaranje antitijela i/ili citokina. Pobliže, molekule predstavljene preko izumom modificiranih čestica biljnog virusa stimuliraju TH1-tip reakcije, pobliže, one stimuliraju pretežno TH1-tip reakcije.

U drugom aspektu, predloženi izum opisuje sredstvo za moduliranje posebne grane staza T hepera za smanjenje ili prevladavanje neželjenog djelovanja prema TH2-tipu reakcije koja je svojstvena određenim molekulama. Pobliže, takova modulacija rezultira u isključivom ili pretežnom TH1-tipu reakcije u sisavcu inokuliranom s molekulom.

U trećem aspketu, izum opisuje metode za moduliranje imunosne reakcije u odsutnosti ekstragenih imunomodulatorskih sredstava (na primjer pomoćnih tvari, citokina, itd.).

U četvrtom aspektu opisane su metode za prevenciju, liječenje ili cijepljenje protiv bolesti (primjerice, ali bez ograničenja na infektivne bolesti, alergije i rak).

Pobliže, izum opisuje upotrebu ne-replicirajućih biljnih virusa kao nosača molekule (na primjer antigena i imunogena).

Ovdje prikazani podaci pokazuju da, iznenađujuće, imunizacija s modificiranim biljnim virusima, kao podlogom za predstavljanje molekule, ima za posljedicu biljne TH1 stanice specifične za virus i specifične za molekulu. Neobično djelovanje prema TH1-tipu imunosnih reakcija ovdje je pokazano na primjeru virusa mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV) prema prisutnim peptidima koji su derivirani iz širokog raspona izvora uključiv bakterije, viruse, imunoglobulin, hormone, protein s površine stanice povezane s rakom. Ovdje je pokazano da djelovanje u siaislu poticanja TH1-tipa imunosne reakcije ne ovisi o izvoru molekule, doziranju molekule, prisutnosti ili odsutnosti pomoćnog sredstva, naravi imunomodulacijskog djelovanja pomoćnog sredstva, ako je ono prisutno, o načinu davanja i o genetičkoj konstituciji (genotipu) imunizirane životinje. Ovaj rezultat iznenađuje, jer je prema stanju tehnike je objavljeno da na aktiviranje podskupina TH stanica djeluje vrsta upotrijebljene životinje, identitet antigena, put isporuke antigena i režim imunizacije. Ovaj rezultat također iznenađuje u pogledu naravi u smislu ne-replikacije biljnih virusa modiciranih prema izumu, a prema stanju tehnike objavljeno je da su za pretežitu TH1 reakciju potrebni živi virusi [Nguyen et al. (1994), gore].

Brojni peptidi su imunogeni kad se ekspresioniraju na CPMV [McLain et al. (1995) AIDS Res Hum Retro 11:327; Dalsgaard et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:248; Brennan et al. (1999) Microbiol. 145:211; Brennan et al. (1999) J. Virol 73:930]. Peptidi derivirani od proteina koji veže fibronektin (FnBP, e. fibronectin-binding protein), nadeni u vanjskoj membrani Staphylococcus aureus i ekspresionirani na površini virusa mozaične bolesti kravljeg graška uzrokuje pretežno za peptid specifičan IgG2a u C57BL/6 miševima [Brennan et al. (1999) Microbiology 145:211], sugerirajući TH1-djelovanje u reakcijama na tu posebnu himernu virusnu česticu (CVP)-ekspresioniranih peptida inokuliranih u jednu vrstu miševa. Međutim, nisu objavljene nikakve stanične (T stanice) reakcije povezane s tom posebnom pojavom.

Posebno, izum opisuje da su, iznenađujuće, peptidi derivirani iz širokog raspona izvora, uključiv bakterije, virus, imunoglobulin, hormon i protein površine stanice povezane s rakom, skloni stvaranju mnogo većih količina za peptid specifičnog IgG2a u usporedbi s količinama za peptid specifičnog IgG1 kad su izloženi, primjerice, na virusu mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV). Taj biljni virus ne replicira humane stanice i stoga se u sistemu sisavca ponaša kao cijeli inaktivan virus. Od ovdje ispitanih raznih CVP-a, 6 je stvaralo pretežno za peptid specifično IgG2a antitijelo ispred IgG2b antitijela, dok se čini da samo CPMV-MAST pod određenim uvjetima daje prednost proizvodnji IgG2b pred proizvodnjom IgG2a. Reakcije za CPMV specifično antitijelo također su pokazale jednaku pretežitost IgG2a ispred IgG1. Na razini stanice, u slezenama CVP imuniziranih miševa proizvedeni su mnogo veći brojevi stanica koje oblikuju mrlju (e. spot forming cells, SFCs) [B stanice] za peptid i za CPMV specifičnog IgG2, u usporedbi sa SFC koje proizvode IgG1.

Premda razumijevanje mehanizma nije potrebno, i bez namjere za ograničenjem izuma na neki poseban mehanizam, čini se da je jaka polarizacija reakcije izotipa na peptid i na virus, ispred reakcije tipa TH1, povezana sa sposobnošću virusa da aktivira za virus specifičnu CD4+ TH1, čime se olakšava skretanje razreda prirodnih B stanica specifičnih za peptid (i virus) na plazma stanice za proizvodnju TH1-povezanog imunoglobulina.

Pretežnost peptid-specifičnog IgG2a ispred IgG1 pokazana je ovdje u 5 različitih prirodnih vrsta miševa koje obuhvaćaju H-2b (C57BL(6), H-2d (BALB/c), H-H-2q (NIH), 2dql (Biozzi AB/H), i H-21s (DBA/1). Čak i u TH2-djelovanju BALB/c i Biozzi AB/H miševa [Natsuume-Sakai et al. (1977) Immunology 32:861; Sant'Anna et al. (1985) Immunogenetics 22:131], IgG2 iznenađujuće prednjači ispred IgG1. Pomoćna sredstva, koja su ovdje ispitana sa CVP, uključuju ona koja daju prednost TH1 reakcijama, kao što je Freundov cjelovit dodatak i ona koji daju prednost TH2 reakcijama [alaun i QS-21: Cooper (1994) "The selective induction of different imiaune responses by vaccine adjuvants. U: Vaccine Design (G.I. Ada., izd.), R.G. Landes Company, str. 125]. Opet su količine IgG2 stvorene upotrebom tog pomoćnog sredstva ili u odsutnosti pomoćnog sredstva bile iznenađujuće mnogo više nego količine IgG1, što jasno potvrđuje da je u stvari nosač biljni virus, a ne pomoćno sredstvo, onaj koji je potaknuo TH1 reakciju. Za razliku od gore opisanog slučaja sa životinjskim virusima, važno je da je pretežitost IgG2a ispred IgG1 opažena bez obzira na vrstu miša ili pomoćnog sredstva upotrijebljenog za imunizaciju.

Izum nadalje opisuje da imunizacija s visokim i s niskim dozama (u rasponu od 2-300 μg) CVP-a dovodi do nastanka reakcije tipa TH1. Tako, doza iznad tri reda veličine magnitude datog antigena, koja ranije pokazala utjecaj na stvaranje mišjih IgG izotipova [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:2439; Hocar et al. (1989), J. Gen. Virol. 70:809], iznenađujuće nije pokazala utjecaj na TH1 djelovanje u izotipovima peptid-specifičnog IgG.

Rezultati dobiveni primjerice s ovdje opisanim ikozaedarskim biljnim virusima bili su iznenađujući, jer, djelomice, druge čestice slične ikozaedarskom. virusu (e. virus-like particles, VPLs) derivirane iz životinjskih virusa, kao što je Norwalk virus [Ball et al. (1998) J. Virol. 72:1345] i rota virus [O'Neal et al. (1997) J. Virol. 71:8707] ne uzrokuju jaku pretežitost IgG2a ispred IgG1, kako je ovdje objavljeno. Svuda je objavljeno da ciljanje posebnog antigena na makrofagima nje dovoljno samo po sebi za stimulaciju polarizirane TH1 reakcije [Sedlik et al. (1997) Intl. Immunol. 9:91], jer je potrebna ko-imunizacija s imuno-modulatoriiaa kao što su IL-12 i poli(1):C.

Pripravci i metode izuma mogu se upotrijebiti za stvaranje antitijela prema molekuli, u induciranju željenog TH1-tipa reakcije i/ili za smanjenje neželjenog TH2-tipa reakcije na molekulu u svrhu, na primjer, detekcije, prevencije i/ili liječenja bolesti. Posebno, modificirani biljni virus prema izumu nalazi posebnu (iako ne i isključivu) primjenu u kliničkim aplikacijama, jer se njegovi imunomodulatorski učinci mogu postići u odsutnosti vanjskih imunomodulatorskih sredstava (kao što su citokini i pomoćna sredstva), čime se izbjegavaju skupi i nepoželjni sporedni učinci, koji su povezani s davanjem tih sredstava. Osim toga, budući da se modificirani biljni virusi prema izumu ne repliciraju u humanim stanicama, oni imaju prednost u odnosu na postojeće nosače cjepiva, jer su s njima izbjegnuti sigurnosni problemi koji su uključeni u postojeće sistemime nosača živih životinjskih virusia/bakterija i DNA.

Izum dalje opisuje pod (A) razvoj TH1/TH2 stanica, (B) TH1-tip i TH2-tip reakcije i patologiju, (C) biljne viruse, (D), određene molekule, (E) ekspresiju polipeptida pomoću biljnih virusa, (F) konjugiranje molekula na biljne viruse, (G) davanje pripravaka životinjama, (H) povišenje reakcije tipa TH1 i (I) smanjenje reakcije tipa TH2.

A. Razvoj TH1/TH2 stanica

Kod miševa, prirodne CD4+ T stanice su klasificirane u dvije skupine, TH1 i TH2, koje su karakterizirane različitim profilima izlučivanja citokina i stoga različitim efektorskim funkcijama [za čitanje pogledaj Mosmann et al. (1986) J. Imunol. 136:2248-2357]. Dok razumijevanje mehanizma nije nužno za provedbu izuma, i bez ograničenja izuma na neki poseban mehanizam, klonovi T stanica, koji pokazuju arhetipska TH1 i TH2 svojstva, mogu biti ekstremi nastavka diferenciranih CD4+ stanica, a profil citokina in vivo, koji je proizveden u "tipičnoj" TH1 ili TH2 reakciji, proizveden je pomoću spektra tipova stanica.

Međutim, zbog pojednostavljenja lakše je navesti dva tipa stanica, ako su one entiteti koji se mogu rastaviti. Tako se pojam "TH1 stanica", kako se ovdje rabi, odnosi na T helper stanicu koja proizvodi jedan ili više TH1-povezanih imunoglobulina (na primjer mišji IgG2a, mišji IgG2b, humani IgG1 i humani IgG3) i/ili jedan ili više TH1- povezanih citokina (na primjer IL-2, TNF-β, i TNF-γ) -Suprotno tome, "TH2 stanica", kako se ovdje rabi, odnosi se na T helper stanicu koja proizvodi jedan ili više TH2- povezanih imunoglobulina (na primjer mišji IgG1, mišji IgG3 i humani IgG2) i/ili jedan ili više TH2-povezanih citokina (na primjer IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, i IL-13).

TH1 i TH2 stanice razvijaju se iz zajedničkog skupa prirodnih CD4+ stanica. Nekoliko faktora može utjecati na deferencijacuju TH stanica u polarizirane TH1 ili TH2 staze. Profil citokina "prirodnog imuniteta" izazvan s različitim sredstvima, narav peptidnog liganda, identitet i količina hormona izlučenih u mikrookruženju, količine antigena i prisutnost T stanica od ko-stimulatorskih receptora i MHC genotip mogu odrediti razvoj podskupova, pri čemu su TH2 stanice mnogo više ovisne o visini razina antigena i prisutnosti ko-stimulatorskih stanica. Na primjer, prema stanju tehnike, u modelima cijepljenja miševa opaženo je da utječe nekoliko faktora koji aktiviraju podskupove TH stanica i stvaraju specifične mišje IgG izotipove. Takovi faktori uključuju genetsku pozadinu upotrijebljene mišje vrste, način isporuke antigena i režim imunizacije (uključiv kvalitetu antigena i vijek trajanja), te narav antigena. Profili TH2-tipa citokina često se pojavljuju kasnije od TH1 reakcija -in vivo.

Vjeruje se da ključni citokin za stvaranje TH1 nastaje aktiviranjem makrofaga i dendritičkih stanica. Vjeruje se da je IL-4 ključni citokin za stvaranje TH2. IL-4 se proizvodi u malim količinama tijekom početne aktivacije T stanice (posebno podskupine CD4 stanica, koje se nazivaju NK1.1 stanice, bile su preložene kao početni izvor proizvodnje IL-4). Vjeruje se da razvoj TH2 odgovora pokreću lokalne koncentracije IL-4, vjerojatno kao rezultat trajne stimulacije T stanice.

Što se tiče funkcije TH1 stanica, te stanice proizvode interleukin 2 (IL-2), interferon-γ (ifn-γ) i tumorski nekrozni faktor-β(TNF-β) koji posreduju makrofag i aktivaciju citotoksične T stanice (e. cytotoxic T cell, CTL) i oni su načelni efektori imuniteta posredovanog stanicom protiv intracelularnih mikroba i DTH (odgođenog tipa reakcije preosjetljivosti, e. delayed type hypersensitivity reaktion) [Mosmann et al. (1986), gore]. CTL reakcije su u sve većoj mjeri prepoznate kao važni terapeutski faktori u liječnju ili odgovoru na tvrde tumore. ifn-γ kojeg proizvode TH1 limfociti, također inducira razred izotipa B stanica koje prebacuju na podrazred IgG2a, koji je načelni efektor izotipa mišjeg IgG. IgG2a (i u manjem opsegu IgG2b) pojačava citotoksičnost ovisnu o antitijelu i posredovanu stanicom (ADCC, e. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; Huesser et al. (1977) J. Exp. Med. 146: 1316) i jako veže Clq klasične komplementne staze koja opsonizira stanice ili grozdove antitijela za fagocitozu [Klaus et al. (1979) Imunology 38:687]. U čovjeku, Igl i Ig2 posreduju te funkcije. Tako, kao rezultat tih efektorskih funkcija, IgG2a bolje štiti miševe od virusnih infekcija, tumora [Kaminski et al. (1986) J. Imunol. 136:1123] i parazita [Wechsler et al. (1986) J. Imunol. 137:2968] i pojačava čišćenje bakterija [Zigtermann et al. (1989) Infect. Imunol. 57:2712].

Suprotno stanicama TH1, TH2 stanice proizvode interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin-10 (IL-10) i interleukin 13 (IL-13), koji guše imunitet posredovan stanicom [Mosmann et al. (1986), gore]. IL-4 pobuđuje B stanice da proizvode IgG1, koji kod miša slabo fiksira komplement i ne posreduje ADCC [Klaus et al. (1979) Imunology 38.687]. On također inducira proizvodnju imunoglobulina E (IgE) koji veže mast stanice i bazofile.

Zbog toga su TH2 stanice uglavnom odgovorne za, o fagocitu neovisnu, obranu domaćina protiv, na primjer, helmintičkih parazite [Sher et al. (1992) Ann Rev Inunubr. 10:385] i u razvoju alergijskih reakcija [Erb et al. (1996) Imunol. Cell Biol. 74:206].

B. TH1-tip i TH2-tip reakcije i patologija

Prema stanju tehnike, opisano je da brojni faktori (na primjer tip antigena, genetička pozadina životinje domaćina, način davanja, izbor pomoćnog sredstva) diktiraju narav i opseg imunosnog odgovora izazvanog izlaganjem molekule imunosnom sistemu životinje. Na primjer, reakcije mišjeg antitijela na topive proteine i na ugljikohidrate su općenito ograničene na IgG1 i IgG2 podrazrede. To sugerira da IgG izotipovi nisu odabrani nasumično. U stvari, živi virusi (uključiv raspon RNA i DNA virusa) ponajprije induciraju proizvodnju specifičnih IgG2a antitijela [Coutelier et al. (1987) J. Exp. Med. 165:64]. Dokazano je da proces infekcije uzrokovan sa živim virusima može biti presudan za proizvodnju IFN-γ koji ponajprije uzrokuje virus-specifične TH1 reakcije i pretežno virus-specifičan IgG2a [Nguyen et al. (1994) J. Imunol. 152:478]. To također može objasniti zašto replicirana (živa) bakterijska i DNA cjepiva stvaraju reakcije koje djeluju u smislu TH1 [Londono et al. (1996) Vaccine 14:545; Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119]. Međutim, poznato je da neki živi virusi, kao što je virus gripe [Balković et al. Antiviral Res. 8:151], virus tipa 1 herpesa simpleksa [HSV-1, e. herpes simplex virus type I; McKendall et al. (1988) J. Gen. Virol 69:847], Theilerov virus mišjeg encefalomijelitisa [Peterson et al. (1992) Imunology 75:652] i virus bolesti stopala i ustiju [Perez-Filguera et al. (1995) Vaccine 13:953] uzrokuje pretežno izotipove različite od IgG2a- Dodatno uz narav antigena, genetička pozadina životinje domaćina, utječe na narav i opseg imunosnog odgovora. Tako u slučaju virusa gripe, BALB/c miševi proizvode pretežno IgG2a/ a C57Bal/6 proizvode pretežno IgG1 [Hocart et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:2439]. Tako je imunosna reakcija protiv tih živih virusa osjetljiva prema genetičkom elementu (imunogenomni faktor).

Narav pomoćnog sredstva također ima ulogu u određivanju naravi imunosnog odgovora. Za virus bolesti stopala i ustiju (FMDV, e. foot-and-mouth disease virus) IgG2 je pretežni izotip koji se proizvodi prema obadva, živom i inaktivnom cjelovitom virusu, osim kad se s inaktivnim virusom kao pomoćno sredstvo upotrebljava voda u ulju. S posljednjom kombinacijom pomoćnog sredstva, rezultat je pretežno IgG2a (Peres-Filgueira et al. (1995) Vaccine 13:953). Stoga, dakle, izbor pomoćnog sredstva može jasno utjecati na vrstu T helper reakcije.

Nadalje, neki inaktivirani virusi mogu izazvati pretežno IgG2a antitijela. Tako općenito, razne studije pokazuju da sposobnost uzrokovanja virus-specifičnog IgG2a ne može biti jednostavno posljedica infekcijskog procesa, već ona također može biti ovisna o naravi samog virusa, H-2 haplo tipu miša, putu imunizacije, te također i o izboru pomoćnog sredstva.

Profili citokina stvorenih pomoću TH1 i TH2 tipa T stanica dovode do različitih fizioloških reakcija prema patogenima koje se žele za smanjenje, ublažavanje ili odstranjivanje patogene tegobe. Međutim oštećenje tkiva također se može pojaviti zbog trajne ili prekomjerne reakcije prema patogenu.

Posebno u slučaju TH1, stvaranje novih i aktiviranje makrofaga može dovesti do neželjene granulomske upale, čiji pre-eminentni primjer je tuberkulozni oblik leproze. Ako je inficirajući mikroorganizam vanstanični organizam, sličan onom koji uzrokuje tuberkulozu, brucelozu, ili organizmi Pneumocystls cannll (protozoa), gljivice kao Candlda alblcans ili Lelshmania major (intracelularni parzit protozoa), TH1 reakcija dovodi do usporednog tipa reakcije preosjetljivosti (DTH. e. delayed-type hypersensitivity) koja rezultira eliminacijom stanica koje sadrže taj mikroorganizam. Oslobađanje IEN-γ u blizini infekcije aktivira makrofage. Lokalizirano oslobađanje lizosomalnih enzima iz makrofaga ubija inficirane stanice i ozdravljuje susjedne stanice rezultirajući u destrukciji napadačkog mikroorganizma. K tome, tu je i oslobađanje proteina nazvanog MIF (e. macrophafe inhibition factor) pomoću TH1 stanice. Taj protein je anti-kemotaktički faktor koji čini imobilnim svaki makrofag u blizini TH1 stanica. Tako makrofagi ostaju na mjestu infekcije. Čini se da je oštećenje pluća zbog tuberkuloze i možda zbog Pneumocystis carinii rezultat nesposobnosti razlikovanja ozljede stanice uzrokovane s aktivnim makrofagima i oslobađanja lizosomalnog enzima u tkivo. TH1-dominantne reakcije mogu također biti uključene u patogenezu organ-specifičnih autoimunosnih poremećaja, akutnog odbacivanja alografta, neobjašnjivog povratnog odbacivanja, kontaktnog dermatitisa i nekih kroničnih upalnih poremećaja nepozante etiologije [zbirno prikazano u Romagnani (1996) Clin. Imunol. Imunopathol. 80:225].

Neprikladne TH2 reakcije također mogu imati nepoželjne posljedice koje uključuju regrutiranje bazofila i eozinofila, što može imati štetne posljedice u razvoju alergija i astme. Reakcija na rani oblik RSM (respiratorni sincitijalni virus) cjepiva (koje sadrži alaun-konjigirano virusno cjepivo) je primjer neodgovarajuće TH2 reakcije koja dovodi do slučajeva eozinofilije i bronhospazme. Slične reakcije mogu dovesti do astmatičnih simptoma. Reakcije tipa TH2 su također odgovorne za Omennov sindrom, smanjenu zaštitu protiv nekih intracelularnih patogena, toleranciju transplantacije, kroničnu GVHD (e. graft versus host disease, bolest domaćina u smislu odbacivanja grafta), površinske poremećaje i neke sistemske autoimunosne bolesti.

Treba napomenuti da mijenjanje sekvence (a time i afiniteta) peptida unutar MHC razreda II može utjecati na narav CD4+ T stanične reakcije [Murray (1998) Imunol. Today 19:157]. Tako se peptidne epitope derivirane od proteina iz infektivnih sredstava mogu modificirati evolucijom tako da uzrokuju preusmjeravanje reakcije domaćina prema patogenu, na primjer između TH1 i TH2 reakcije. Paralelna evolucija domaćina i patogena može imati za posljedicu razvoj T epitopa na patogenu koje se vežu s određenim afinitetima na MHC podskupine. Reakcija domaćina mora biti uravnotežena tako da ispuni zahtjeve detekcije višestrukih patogena i oblika patogena. Zbog toga se može očekivati da u imunogenskim determinantama patogena dolazi do određenog stupnja mijenjanja sekvence. Do neke mjere, to predstavlja jedno sredstvo zbog kojeg se može smatrati, to jest da je imunomodulacija reakcije prema određenom imunogenu mutacija amino kiselina unutar peptida, čime se postiže određen tip imunosne reakcije ispred one koja je izazvana protiv peptida divljeg tipa.

C. Biljni virus

Izumom su date ne-replicirajuće čestice modificiranog biljnog virusa, koje se mogu predstaviti prema stanicama molekula imunosnog sistema i koji su učinkovite kao imunogeni ili antigeni za stvaranje antitijela i/ili citokina, stimulirati TH1 tip reakcije, ponajprije pretežno TH1 tip reakcije, smanjiti neželjeno djelovanje prema postojećem ili očekivanom TH2 tipu reakcije koji je svojstven određenim molekulama.

Izum predviđa upotrebu bilo kojeg virusa u kojem je nukleinska kiselina, koja kodira za kapsidu/skupina odvojena od one koja kodira za druge funkcionalne molekule, i čiji protein omotača ima strukturu (β-bačve. Prednost upotrebe virusa, koji imaju tu strukturu, je to da petlje između pojedinačnih lanaca (β-listova daju uobičajena mjesta za umetanje stranih peptida. Modifikacija jedne ili više petlji je prednosna strategija za ekspresiju stranih peptida u skladu s predloženim izumom. U jednoj izvedbi, izum predviđa upotrebu komo virusa [kao što je virus mozaične bolesti kravljeg graška i virus šarene ljuske graha], nepo virus [kao što je virus prstenaste mrlje krumpira i virus latentne prstenaste mrlje jagoda], tombus virusi [kao što je virus patuljaste nakaznosti rajčice (TBSV, e. tomato bushy stunt virus] i sobemo virusi [kao virus mozaične bolesti južnog graha (SBMV, e. southern bean mosaic virus]. Posebno, tombus virusi i sobeno virusi imaju trodimenzinalnu strukturu sličnu onoj u komo virusu i nepo virusa, ali imaju jednostruki tip β-bačve.

U povoljnijoj izvedbi, virus je komo virus. Prednost komo virusa je to da njegova kapsida sadrži šesnaest kopija svake od 3 različite (β-bačve s kojima se može pojedinačno manipulirati i time on omogućuje ekspresiju 60-180 kopija peptida s jednom virusnom česticom.

Komo virusi su skupina od najmanje 14 biljnih virusa koji pretežno inficiraju mahunarke. Njihovi genomi se sastoje od dvije molekule jednolančane pozitivne RNA različitih duljina, koje su u odvojenim kapsidama u izometrijskim česticama promjera približno 28 nm. Dva tipa nukleoproteinskih čestica završavaju sa središnjom (M) i donjom (B) komponentom, što je posljedica njihovog ponašanja u gradijentu gustoće cezijevog klorida, pri čemu su te RNA unutar čestice poznate kao M i B RNA. Oba tipa čestice imaju identičan proteinski sastav i svaka se sastoji od 60 kopija velikog (VP37) i malog (VP23) proteina omotača. Osim nukleoproteinskih čestica, pripravci komo virusa sadrže promjenljivu količinu praznih (samo protein) kapsida koje su poznate kao vršna (e. top, T) komponenta. U prednosnoj izvedbi, komo virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV, e. cowpea mosaic virus).

U slučaju tipskog člana komo virusa, za virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV, e. cowpea mosaic virus) poznato je da su mu obje, M i B, RNA poliadenilirane i da imaju mali protein (VPg) kovalentno vezan na njihov 5' kraj. Ograničena proučavanja drugih komo virusa ukazuju da su te značajke zajedničke svim RNA članovima skupine. Obje RNA iz CPMV su sekvencionirane i pokazalo se je da se sastoje od 3481 (M) i 5889 (B) nukleotida, ne uključujući poli(A) rep. Obje RNA sadrže jedan, dugačak otvoren okvir čitanja, ekspresija virusnih genskih proizvoda odvija se sintezom i zatim odcjepljenjem predkurzorskih polipeptida. lako su za infekciju cijele biljke potrebne obje RNA, B RNA je sposobna za neovisnu replikaciju u protoplastima, iako se u tom slučaju ne stvaraju virusne čestice. Ova opažanja, povezana s ranijim genetičkim proučavanjima, potvrđuju da su proteini omotača kodirani s M RNA.

3,5 A karta elektronske gustoće za CPMV pokazuje da postoji jasan odnos između CPMV i T-3 biljnih virusa, kao što je tombus virus, posebno virus patuljaste nakaznosti rajčice (TBSV, e. toraato bushy stunt virus) i sobemo virus, posebno virus mozaične bolesti južnog graha (SBMV, e. southern beam mosaic virus). Kapside ovih posljednjih virusa sastavljene su od 180 identičnih proteinskih podjedinica omotača, od kojih svaka sadrži jednu β-bačvastu domenu. One unutar viriona mogu zauzeti tri različita položaja, A, B i C. Pokazano je, da se dva proteina omotača u CPMV sastoje od tri različite β-bačvaste domene, od kojih su dvije derivirane od VP37, a jedna je derivirana od VP23. Tako je, ukupno sa T = 3 virusa, svaka CPMV čestica sastavljena od ukupno do 180 β-bačvastih struktura. Jedna domena iz VP23 zauzima položaj koji je analogan onom iz A-tipa podjedinica u TBSV i SBMV, dok N- i C-terminalne domene u VP37 zauzimaju položaje C i B tipova podjedinica (U.S. patent br. 5,874,087; koji je u cijelosti uvršten kao literaturni izvor).

Analiza difrakcije X zraka na kristalima CPMV i drugim članovima skupine, za virus šarene ljuske graha (BPMV, e. bean pod mottle virus) pokazuje da su 3-D srukture za BPMV i CPMV vrlo slične i općenito su tipične za skupinu komo virusa.

U strukturama CPMC i BPMV, svaka β-bačva sastoji se načelno od 8 lanaca antiparalenog β-lista povezanog s petljama različite duljine. Ravni β-listovi nazvani su B, C, D, E, F, G, H i 1 listovi, a spojne petlje se navode kao petlje βB-βC, βD-βE, βF-βG i βH –βI.

Komo virusi su također strukturno srodni sa životinjskim pikorna virusima. Kapside pikorna virusa sastoje se od 60 kopija, od kojih svaka sadrži tri različita proteina omotača VP1, VP2 i VP3, od kojih svaki ima jednu β-bačvastu domenu. Kao u slučaju komo virusa, ovi proteini omotača se oslobađaju odcjepljenjem predkurzorskog poliproteina, a sintetiziraju se redoslijedom VP2-VP3-VP1. Usporedba trodimenuzinalne strukture za CPMV s onora od pikorna virus je pokazala da su N- i C-terminalne domena u VP37 ekvivalentne onima u VP2 i Vp3 i da su u VP23 ekvivalentne onima u VP1. Ekvivalentnost između strukturnih položaja i rasporeda gena sugerira da VP37 odgovara neodcijepljenom obliku dvaju proteina iz kapside pikorna virusa, Vp2 i VP3.

Jedna od načelnih razlika između komo virusa i pikorna virusa je to, da proteinskim podjedinicama komo virusa nedostaju veliki umeci između lanaca β-bačava koji su pronađeni u pikorna virusima, iako je osnovna arhitektura čestica vrlo slična. Četiri petlje (βB-βC, βD-βE, βF-βG i βH-βI) između β-listova nisu kritične za održavanje strukturnog integriteta virusa, već se u skladu s ovim izumom, upotrebljavaju kao mjesta ekspresije sekvenci stranog peptida, kao što su antigenska mjesta koja su derivirana iz velikog raspona izvora, uključiv bakteriju, virus, imunoglobulin, hormon i površinski protein stanice povezane s rakom.

D. Određena molekula

Prema izumu, modicifirane čestice biljnog virusa mogu predstaviti prema stanicama imunosnog sistema svaku molekulu u svrhu, na primjer, stvaranja antitijela i/ili citokina, povisujući TH1 tip reakcije, i/ili umanjujući TH2 tip reakcije prema molekuli. Antitijela koja su stvorena u reakciji na prema izumu modificirane čestice biljnih virusa mogu se upotrijebiti za izolaciju i čišćenje molekule.

Alternativno, ta antitijela se mogu upotrijebiti za prevenciju, dijagnozu ili za liječenje bolesti koje su povezane s izlaganjem životinje molekuli.

Molekule koje su prikladne za aplikaciju prema ovom izumu uključuju bilo koju molekulu koja je se može predstaviti na izloženom dijelu proteina omotača virusa prema izumu. Primjeri molekula uključuju, ali nisu ograničeni na one koje sadrže peptidnu sekvencu, sekvencu nukleinske kiseline, polisaharid i/ili lipid, kao što je glikopeptid, lipopeptid, glikolipid itd.

Molekule koje se mogu korisno upotrijebiti prema ovom izumu uključuju one koje su očišćene, ali čija je struktura nepoznata, kao i očišćene molekule poznate strukture (na primjer peptide s poznatom sekvencom amino kiselina, sekvence nukleinske kiseline s poznatim sekvencama nukleinske kiseline, polisaharide poznatog sastava i strukture, itd.). U prednosnoj izvedbi, molekule su očišćene i imaju poznatu strukturu.

Tamo gdje je molekula peptid, ona se može predstaviti pomoću prema izumu modificiranih virusa primjenom tehnike molekularne biologije za umetanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid u virusni genom tako da se peptid ekspresionira na izloženom dijelu proteina omotača virusa prema izumu (koji je opisan dolje u nastavku). Alternativno, gdje je molekula, ili gdje molekula sadrži peptidnu sekvencu, sekvencu nukleinske kiseline, polisaharid i/ili lipid, takova molekula se može kemijski konjugirati na reaktivan peptid ekspresioniran pomoću biljnog virusa prema izumu, kako je dolje opisano.

Izum predviđa polipeptidne molekule koje su derivirane od bilo kojeg izvora. Bez namjere za njegovim ograničenjem, izum predviđa polipeptide koji su derivirani od stanica raka i patogenih parazita (na primjer bakterija, virusa, protozoa, nematoda, gljivica itd.) i posebno antigenih i imunogenih peptida deriviranih od tih patogenih parazita. U okviru smisla izuma uključeni su također polipeptidi koji su povezani s razvojem bolesti, polipeptidi koji kodiraju citokine, polipeptidni alergeni, hormoni, enzimi, faktori rasta, anti-idiotipska antitijela, receptori, adhezijske molekule, i dijelovi bilo kojeg prethodnog peptida ili njegovog predkurzora.

Polipeptidi koji su derivirani od stanica raka, koji se smatraju u okviru izuma, jesu, na primjer, ali bez ograničenja samo na njih, antigen povezan s rakom ezofagusa (U.S. patent br. 6,069,233), specifičan mliječni protein (mamaglobin) koji je povezan s rakom dojke (U.S. patent br. 5,922,836), mucinski antigen prostate koji je povezan s adenokarcinomom prostate (U.S. patent br. 5,314,996), antigen specifičan za humanu prostatu (PSA, e. prostate specific antigen) (U.S. patenti br. 6,100,444; 5,902,725), SF-25 antigen adenokarcinoma debelog crijeva (U.S. patent br. 5,212,085), antigeni povezani s urinarnim tumorom (U.S. patent br. 5,993,823), melanogenski antigen (U.S. patent br. 6,087,110), antigen MART-1 melanoma (U.S. patent br. 5,994,523), antigen povezan s humanim tumorom (PRAT) (U.S. patent br. 6,020,478), antigen TRP-2 tumorskog proteina (U.S. patent br. 6,083,703), antigen povezan s humanim tumorom (U.S. patent br. 5,922,566) i antigen specifičan za tumor koji je povezan s virusno induciranim tumorima (U.S. patent br.6,007,806). Svaki od ovih U,S. patenata uvršten je ovdje u cjelosti kao literaturni izvor.

Primjeri polipeptida koji su derivirani od patogenih bakterija uključuju antigene Bordetella pertussis (U.S. patenti br. 4,029,766; 5,897,867; 5,985,655), antigene Mycobacterium tuberculosis (U.S. patent br. 6,110,469), porinski antigeni iz Bacterlotida koji je povezan s ulcerativnim kolitisom i upalnim crijevnim bolestima (U.S. patent br.6,033,864), antigeni Helicobacter pylori (U.S. patent br.6,025,164), antigeni Streptococcus povezani sa zubnim karijesom (U.S. patent br. 6,024,958), antigeni derivirani od Campylobacter jejuni koja je povezana s bolestima s dijarerom (U.S. patent br. 5,874,300), antigen P-glikoproteina stanične površine koji korelira s višestrukom otpornošću vrsta sisavaca prema lijekovima (U.S. patent br. 4,837,306), pilusni antigen prisutan u bakteriji koja stvara adheziju (U.S. patent br.4,795,803) i antigeni Moraxella catarhalis vanjske membranske opne povezan s plućnom bolešću (U.S. patent br.5,993,826). Svaki od ovih U.S. patenata uvršten je ovdje u cijelosti kao literaturni izvor.

Polipeptide koji su derivirani iz patogenih virusa ilustriraju, ali nisu ograničeni samo na njih, polipeptidi izolirani i očišćeni iz virusa kao što je na primjer antigen rota virusa (U.S. patent br. 6,110,724), antigeni virusa humane imunodeficijencije tipa II (HIV-II) i antigeni virusa majmunske imunodeficijencije (SIV) (U.S. patent br. 5,268,265), antigen virusa ne-A, ne-B hepatitisa (U.S. patenti br. 4,702,909; 6,103,485), delta antigen virusa hepatitisa D (U.S. patent br. 4,619,896), antigeni virusa gripe (U.S. patent br. 6,048,537). Također su uključeni virusni polipeptidi čije sekvence nisu poznate, uključiv, ali ne ograničavajući se samo na one koji su derivirani iz pikorna virusa, kao što je virus bolesti stopala i ustoju (FMDV, e. foot-and-mounth disease virus), poliovirus, humani rino virus (HRV), i humani papiloma virus (HPV) (U.S. patent br. 5,874,087), virus hepatitisa C (U.S. patent br. 5,712,087), antigen jezgre hepatitisa B (U.S. patent br. 4,839,277), antigen srodan Epstein Barr virusu (U.S. patent br. 5,679,774), antigen C33 virusa hepatitisa V (U.S. patent br. 5,985,541), antigeni citomegalovirusa (CMV) (U.S. patent br. 6,074,817), antigen virusa tipa 2 humane imunodeficijencije (HIV-2) (U.S. patent br. 6,037,165), antigeni virusa herpesa simpleksa (U.S. patent br. (U.S. patent br. 6,013,433), i HTLV-I i HTLV-II antigeni (U.S. patent br. 5,928,861). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cjelosti kao literaturni izvor.

Polipeptidi u okviru smisla izuma, koji su derivirani iz patogenih protozoa i nematoda uključuju, na primjer, peptidne antigene derivirane iz Plasmonwilum vlvax koji uzrokuje malariju (U.S. patent br. 5,874,527), Leishmania antigena koji su povezani s Leishmanijazom (U.S. patent br. 5,834,592), antigeni nematodnih parasita Dirofilaria immitis (U.S. patent br. 4,839,275), antigeni Anaplasma marginale koji uzrokuju goveđu anaplasmozu (U.S. patent br. 4.956,278). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

Ostali polipeptidi koji su povezani s razvojem bolesti također su uključeni u okvir izuma. Oni uključuju, ali nisu ograničeni samo na, primjerice, predkurzor antigena odbacivanja GAGE tumora, koji je povezan s razvojem raka (U.S. patent br. 6,013,481), antigene ekstrahirane iz epitelnog malpigijana sisavca (na primjer, ezofagus i epiderma) i povezan je s reumatoidnim artritisom (U.S. patent br. 5,888,833), antigeni Rh krvne skupine (U.S. patent br. 5,840,585), antigeni indikativni za prisutnost i progresiju aterosklerotičkih pločica (U.S. patent br. 6,025,477), IgG Fc-vezni proteinski antigen povezan s autoimunosnom bolešću kao što je ulcerativni kolitis, Crohnova bolest, reumatoidni artritis, i sistemski lupus (U.S. patent br. 6,004,760), Sm-D antigen povezan sa sistemskim eritromatoznim lupusom (e. system lupus erythromatosus, SLE) (U.S. patent br. 5,945,105), monocitni antigeni (U.S. patent br. 6,124,436), antigen povezan s autoimunosnom unutarnjom lakom Meniereovom bolešću (U.S. patent br. 5,885,783), mezotelinski antigen povezan s diferencijacijom, koji je uključen u rak mezotelija i jajnika (U.S. patent br. 6,083,502), osteogenski i fibroblastni antigen (OFA), povezan s bolestima koje se odnose na kosti (U.S. patent br. 6,074,833) i antigen povezan s funkciom mast stanica (MAFA, e. mast cell function-associated antigen) koji je povezan s upalnim i alergijskim reakcijama (U.S. patent br. 6,034,227). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

U okvir svrhe izuma također su uključeni polipeptidi koji kodiraju citokine kao što je, primjerice, interleukin-la, interleukin-1β (U.S. patenti br. 5,965,379; 5,955,476; 5,096,906), interleukin-2, interferon-α, interferon-γ i tumorski nekrozni factor (U.S. patent br. 5,965,379), interleukin-6 (U.S. patenti br. 5,965,379; 5,955,476; 5,942,220; 5,460,810), TGF-β super porodica koja uključuje TGF-β porodicu [to jest, koja uljučuje TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, TGFβ4, TGFβ5, i TGFβ1.2], porodica inhibina [to jest, koja uključuje aktivine i inhibine], DPP/VG1 porodica [to jest, koja uključuje morfogenetske proteine koštane moždine (e. bone marrow morphogenetic proteins, BMPs), DPP, i Vg1], i porodica Mullerian inhibicijskih tvari [to jest, uključiv Mullerian inhibicijsku tvar (e. Mullerian inhibiting substance, MIS)] (U.S. patent br. 5,830,671), interleukin-11, faktor inhibicije leukemije, onkostatin M, i cilijarni neurotrofni faktor (U.S. patent br. 5,460,810), i interleukin-12 (U.S. patent br. 5.955,476). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

Izumom su također predviđeni polipeptidni alergeni kao što je, ali ne ograničavaju se samo na, vespid antigen 5 koji se upotrebljava za liječenje pacijenata s vespid venom alergijom (U.S. patent br. 6,106,844), CRX JII Cryptomeria japonica glavni polenski alergeni (U.S. patent br. 6,090,386), polenski alergeni ljuljeva Lol p 1b, 1 i Lot p 1b.2 (U.S. patent br. 5,965,455), alergeni johinog polena, polena obične lijeske i brezinog polena (U.S. patent br. 5,693,495), alergeni grinja kućne prašine Dermatophagoides farinae Derf I i Derf II, i D. pteronssinus Der p 1 i Der p VII alergeni (U.S. patenti br. 5,9958,415; 6,086,897; 6,077,518; 6,077,517), mačji alergen (Fel d I) (U.S. patent br. 5,547,669), žoharski (e. cockroach, CR) alergeni (U.S. patent br. 5,869,288), i kikirikijev alergen (Ara h II (U.S. patent br. 5,973,121). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

U okviru svrhe izuma također su uključeni polipeptidni hormoni koji obuhvaćaju, na primjer, paratiroidni hormon (PTH), paratiroidnom hormonu srodan peptide (PTHrp), i njihove sintetičke analoge (U.S. patenti br. 5,693,616; 6,110,892), prirodno nastali humani hormon rasta i njegove inačice (U.S. patenti br. 5,424,199; 5,962,411), majmunski hormon rasta (U.S. patent br. 5,151,511), hormon koji oslobađa lutemizirajući hormon (e. luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH) i njegove analoge (U.S. patent br. 5,897,863), protein receptora nuklearnog hormona (U,S. patent br. 5,866,686), hormon koji uzrokuje ekdiziju (U.S. patent br. 5,763,400), hormon koji oslobađa gonadotropin (U.S. patent br. 5,688,506), i hormoni koji koncentriraju melanin (MCH) (U.S. patent br. 5,049,655). Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

Molekule nukleinske kiseline u okviru smisla ovog izuma uključuju one koje kodiraju svaku od gore opisanih polipeptidnih molekula.

Molekule koje sadrže polisaharid i koje spadaju u okvir smisla ovog izuma jesu, primjerice, polisaharidni i glikoproteinski antigeni derivirani iz patogenih parazita (posebno od bakterija), kao i glikoproteinski hormoni, kao hormon koji stimulira folikule (e. follicle stimulating hormone, FSH), luteinizirajući hormon (LH), i hormon koji stimulira tiroidu (U.S. patenti br. 6,103,501; 5,856,137; 5,767,067; 5,639,640; 5,444,167; od kojih su svi ovdje uvršteni u cijelosti kao literatura).

Molekule koje sadrže lipid i koje se upotrebljavaju prema ovom izumu obuhvaćaju, bez ograničenja samo na njih, one koje su derivirane iz patogenih parasita (na primjer, lipoproteini, lipopolisaharidi, itd.).

U posebno prednosnoj izvedbi, molekula je peptid. U povoljnijoj izvedbi, peptid je deriviran iz bakterije (na primjer, OM protein F iz Pseudomonas aeruginosa, i protein koji veže fibronektin (e. fibronectin-binding protein, FnBP) iz Staphylococcus aureus, virusa (na primjer, iz pasjeg parvo virusa), imunoglobulin (na primjer, humani mIgE), hormon (na primjer, humani korionički gonadotrofin), i s rakom povezani protein stanične površine (na primjer, receptor epitelnog faktora rasta).

E. Ekspresija polipeptida pomoću biljnih virusa

Biljni virusi ovog izuma mogu se konstruirati u skladu s U.S. patentima br. 5,874,087; 5,958,422 (od kojih je svaki ovdje uvršten u cijelosti kao literatura) za ekspresiju dotičnih peptida koji su derivirani iz bilo kojeg izvora, kako je gore opisano. Na primjer, komo virusi (na primjer CPMV) mogu ekspresionirati eksterno iz jednog virusa od 60 do 180 kopija peptida [1 peptidna kopija na svaku od 60 kopija malog (e. small, S) proteina omotača i 60 kopija velikog (e. large, L) proteina omotača].

Peptidi koji se mogu ugraditi u prema izumu modificirane biljne viruse sadrže prednosno najmanje četiri (4) amino kiseline i oni se podvrgavaju ograničenju u tom pogledu da narav i veličina peptide i mjesto na koje će se on staviti, u ili na virusnoj čestici, ne interferira sa sposobnošću modificiranog virusa za uklapanje kad se uzgaja in vitro ili in vivo. Premda nije namjere ograničiti izum na bilo koji tip izvora peptida, u jednoj izvedbi peptid je onaj čija funkcija zahtjeva posebnu konformaciju za svoje djelovanje. Biološko djelovanje peptide može se održati povezivanjem peptida s većom molekulom (na primjer za poboljšanje njegove postojanosti ili načina predstavljanja u posebnom biološkom sistemu) kako je ranije opisano (U.S. patent br. 5,958,422; koji je ovdje uvršten u cjelosti kao literaturni izvor).

Nukleinska kiselina biljnog virusa modificirana je uvođenjem nukleotidne sekvence, koja kodira dotični peptid kao dodatka (to jest umetanjem u) postojećem virusnom genomu, ili kao supstitucija za dio virusnog genoma. Izbor metode uvođenje određen je uvelike strukturom proteina kapside i lakoćom s kojom se ta dodavanja ili zamjene mogu provesti bez ometanja sposobnosti modificiranog virus da se uklopi u biljke.

U jednoj izvedbi, nukleotidna sekvenca koja kodira za dotični peptid umetnuta je u virusni genom. U prvoj izvedbi, mjesto umetanja ili zamjene s nukleotidnom sekvencom kodira za dotični peptid odabrano je tako da nema izravnih ponavljanja sekvenci koje prekrivaju mjesto. U smislu predloženog izuma, pojam "izravno ponavljanje sekvence", kad se navodi u svezi s konstruktom koji sadrži dotičnu nukleotidnu sekvencu, znači da je identična oligonukleotidna sekvenca prisutna na obje strane dotične nukleotidne sekvence. Konstrukti koji sadrže izravna ponavljanja sekvenci koje prekrivaju dotičnu nukleotidnu sekvencu su nepoželjni, jer su oni genetički nepostojani, što je rezultat rekombinacije između prekrivajućih ponavljanja sekvenci koja dovode do gubitka prekrivene nukleotidne sekvence, i okretanja na sekvencu divljeg tipa.

U alternativnij izvedbi, gdje je strana oligonukleotidna sekvenca uvedena genom biljnog virusa kao supstitucija za dio postojeće sekvence, povoljno je da sekvenca genoma supstituiranog virusa ne kodira aminokiselinsku sekvencu u proteinu omotača virusa koja je važna za replikaciju virusa, kapsidaciju, i/ili širenje u biljci domaćinu. Taj nedostatak se može lako utvrditi i izbjeći primjenom poznatnih metoda iz stanja tehnike u kombinaciji s ovdje opisanim postupcima.

Nukleotidna sekvenca koja kodira dotični peptid može se uvesti u biljni virus identifikacijom onog dijela virusnog genoma koji kodira izloženi dio proteina omotača. Pojam "izloženi dio proteina omotača", kako se ovdje navodi u svezi s virusom, odnosi se na onaj dio virusnog proteina omotača koji je izložen na donjoj površini proteina omotača. Mjesto dijelova proteina omotača, koji su izloženi i koji su stoga moguća optimalna mjesta za uvođenje dotičnog polipeptida, mogu se odmah identificirati ispitivanjem trodimenzionalne strukture biljnog virusa. U daljnjoj izvedbi, aminokiselinska sekvenca izloženih dijelova proteina omotača ispitana je u pogledu amino kiselina koje lome strukturu α-uzvojnice, jer su one moguća optimalna mjesta za umetanje. Primjeri prikladnih amino kiselina jesu prolin i hidroksiprolin, od kojih obadava, kad nastaju u polipeptidnom lancu prekidaju uzvojnicu i stvaraju krutu petlju ili zaokret u strukturi.

Kad se prikladno mjesto u virusnom proteinu omotača, odabere u skladu s gornjim izlaganjem i onim iz U.S. patenata br. 5,958,422 i 5,874,087 (od kojih je svaki uvršten u cijelosti kao literaturni izvor), nukleotidna sekvenca koja kodira dotični peptide može se uvesti u virusni genom na mjestu koje kodira željeno mjesto. Takovo umetanje može se postići umetanjem u ili zamjenom za virusnu sekvencu.

Tamo gdje je umetanje poželjno, to se može postići izborom dvaju različitih mjesta restrikcijskih enzima i odcjepljenjem nukleinske kiseline upotrebom odabranog restrikcijskog enzima. Nukleotidna sekvenca s dvostrukim lance, koja kodira dotični peptid, sintetizira se primjenom u struci poznatih metoda (na primjer, reakcijom polimeraznog lanca, e. polimerase chain reaktion, PCR) tako da oligonukleotidi završavaju s krajevima koji su kompatibilni s odabranim mjestima restrikcijskog enzima, omogućavajući tako umetanje u cijepljenu virusnu nukleinsku kiselinu. Taj postupak ima za posljedicu uvođenje nukleotidne sekvence koja kodira za dotični peptid uz izbjegavanje prisutnosti izravnog ponavljanja sekvenci koje prekrivaju umetak. Prednosno, iako ne i nužno, sintetizirani su oni komplementarni oligonukleotidi u kojima su sekvence koje kodira dotični peptid prekrivene sa sekvencama biljnog virusa, tako da je dotična nukleotidna sekvenca uvedena kao dodatak postojećoj nukleinskoj kiselini.

U prednosnoj izvedbi, biljni virus je CPMV i dotični peptide je umetnut u PB-PC petlju u malom proteinu (VP23) omotača. Ta petlja je jasno izložena na površini virusne čestice i računalno modeliranje je pokazalo da čak i za velike petlje umetnute na tom mjestu nije vjerojatno da bi interferirale s interakcijom između susjednih podskupina odgovornih za strukturu kapside i postojanost. Ta petlja ima jedinstveno mjesto Nhel na položaju 2708 u M RNA-specifičnoj sekvenci, gdje se mogu umetnuti strane sekvence.

Alternativno, tamo gdje je poželjna supstitucija sekvence genoma virusa, virusnu sekvencu koja je odabrana za supstituciju cijepi se upotrebom odgovarajućih restrikcijskih enzima (na primjer, sekvenca između Nhel i AatII mjesta restrikcije u primjerice CPMV) i nukleotidna sekvenca koja kodira dotični peptide substituira se stoga kao što je ranije opisano (U.S. patent br. 5,958,422; koji je ovdje uvršten u cijelosti kao literaturni izvor).

Kad se odredi mjesto i način uvođenja dotičnog peptida u biljni virus, manipulacija s biljnim virusom može se provesti primjenom ranije opisanih metoda (U.S. patenti br. 5,958,422 i 5,874,087; od kojih je svaki ovdje uvršten u cjelosti kao literaturni izvor). Na primjer, tamo gdje je biljni virus RNA virus (na primjer, CPMV), dotični peptid se mora ekspresionirati upotrebom cDNA klona RNA. Konstruirani su klonovi cDNA iz CPMV RNA, M i B, u kojima cDNA klon iz M RNA sadrži umetnutu oligonukleotidnu sekvencu koja kodira heterologni peptid, koji upotrebu virusa mozaične bolesti cvjetače (CaMV) 35S čini promotorskom sekvencom povezanom na 5' krajeve virusne cDNAs, čime se dobiju infektivni transkripti u biljci. Tom tehnikom prevladani su neki problemi koji se susreću pri upotrebi transkripata stvorenih -Ln vltro i može se primijeniti na sve biljne RNA viruse.

Što se posebno tiče manipulacije s genomom od primjerice CPMV, klon pune duljine cDNA iz CPMV M RNA u vektoru transkripcije pPMl je dostupan (pPMM2902), kao cijela duljina cDNA klona iz CPMV B RNA (pBT7-123). Mješavina transkripata iz pPMM2902 i pBT7-123 dovodi do razvoja potpune virusne infekcije kad se elektroporatira u protoplaste kravljeg graška.

Da bi se izbjeglo stvaranje izravnog ponavljanja sekvence koja prekriva umetak, u nukleotidnoj sekvenci područja CPMV genoma koji kodira VP23 može se napraviti drugo mjesto rezanja restrikcijskog enzima. Na primjer, jedna tiha promjena baze (U u C) na položaju 2740 u M RNA stvara jedinstveno mjesto AatII na amino kiselini valinu 27 (položaj 2735 nukleotidne sekvence). To se može postići mutagenezom M13-JR-1, usmjerenom prema mjestu, primjenom metoda opisanih u U.S. patentu br. 5,874,087 (koji je ovdje uvršten u cijelosti kao literaturni izvor). Stvaranje AatII mjesta omogućuje nukleotidna sekvenca koja kodira šest amino kiselina iz prirodne βB-βC petlje u CPMV koju se odstranjuje probavom s Nhel i AatII. Sekvencu se zatim može zamijeniti s bilo kojom sekvencom koja ima Nhel- i AatII-kompatibilne krajeve.

Bez namjere za ograničenjem izuma na neki tip biljnog virusa, na bilo koji način uvođenja dotičnog peptida u virus, i/ili na bilo koje mjesto umetanja u virus, u prednosnoj izvedbi, biljni virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV), a dotični peptid je umetnut između ostataka alanina 22 (Ala22) i prolina 23 (Pro23) u petlji βB-βC malog proteina (VP23) kapside, kako je ranije opisano (U.S. patent br. 5,958,422; koji je uvršten u cijelosti kao literaturni izvor).

F. Konjugiranje molekule na biljne viruse

Biljni virusi prema izumu mogu se modificirati prema bilo kojoj prisutnoj određenoj molekuli prema humoralnim i/ili celularnim komponentama imunosnog sistema kemijskim konjugiranjem dotične molekule na biljni virus kako je dolje opisano.

Pojam "konjugacija", kad se spominje u svezi dotične molekule i virusa, kako se ovdje rabi, znači kovalentno povezivanje dotične molekule na virus, podvrgnut jednostrukom ograničenju tako da narav i veličina dotične molekule i mjesto na kojem je kovalentno povezana na virusnu česticu ne ometaju sposobnost uklapanja modificiranog virusa kad se on uzgaja in vitro ili in vivo.

1. Reaktivan peptid

U jednoj izvedbi, izum predviđa konjugiranje dotičnih molekula na virus na izloženom dijelu virusnog proteina omotača. To se može postići konjugiranjem dotične molekule na divlji tip reaktivnog peptida biljnog virusa, ili alternativno na heterologni reaktivan peptid koji je ekspresioniran na površini virusnog proteina omotača. U prednosnoj izvedbi, dotičnu molekulu konjugira se na heterologni reaktivan peptid koji je ekspresioniran na izloženoj površini biljnog proteina omotača.

Pojam "reaktivan peptid" odnosi se na peptid (bez obzira da li se radi o divljem tipu ili o heterolognom) koji je sposoban za kovalentno vezanje na dotičnu molekulu. Pojam "sposoban za kovalentno vezanje", kad se spominje u svezi interakcije između peptida i dotične molekule, znači da se peptid kovalentno veže na molekulu pod prikladnim uvjetima, kao što je prikladna koncentracija soli, kemijski reagenti, temperatura, pH, itd.

Reaktivni peptidi, kojima se posvećuje zanimanje, kreću se u području veličine od 1 do 100, još bolje od 1 do 50, također još bolje od 1 do 20 amino kiselina. Treba zabilježiti da je potvrđeno da se najmanje 38 aminokiselinskih ostataka može pokazati na površini primjerice CPMVa (U.S. patenti br. 5,958,422 i 5,874,087; od kojih je svaki ovdje u cjelosti uvršten kao literaturni izvor).

Iako nije namjera ograničiti amino kiseline u reaktivnom peptidu na bilo koji poseban tip aminokiselinskih ostataka, u jednoj prednosnoj izvedbi reaktivni peptid sadrži jednu ili više "reaktivnih amino kiselina", to jest amino kiseline koje su sposobne za oblikovanje kovalentne veze s dotičnom molekulom izravno ili posredno, na primjer preko dvofunkcionalne molekule koja je sposobna za kovalentno povezivanje s obje reaktivne amino kiseline i s dotičnom molekulom. U prednosnoj izvedbi, reaktivna amino kiselina je amino kiselina s nabojem. "Amino kiselina s nabojem" je amino kiselina koja sadrži čisti pozitivan naboj ili čisti negativan naboj. "Amino kiseline s pozitivnim nabojem", koje se također navode i kao "bazične amino kiseline", uključuju lizin, arginin, i histidin. "Amino kiseline s negativnim nabojem", koje se također navode i kao "kisele amino kiseline", uključuju aspartinsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, i cistein. Poznavajući osjetljivost biljnih virusa ovog izuma prema prisutnosti destabilizirajućih ostataka s nabojem na površini kapside, povoljno je, iako nije i nužno, da razina naboja na reaktivnom peptidu bude minimalna. To se može postići uključenjem negativno nabijenih i pozitivno nabijenih amino kiselina u reaktivni peptid, tako da je negativan naboj na negativno nabijenim amino kiselinama barem djelomično uravnotežen (to jest neutraliziran) s pozitivnim nabojem na pozitivno nabijenim amino kiselinama, tako da reaktivan peptid ima čisti positivan ili negativan naboj. U još povoljnijoj izvedbi, negativan naboj na negativno nabijenim amino kiselinama je potpuno uravnotežen s pozitivnim nabojem na pozitivno nabijenim amino kiselinama, tako da reaktivan polipeptid ima čisti naboj nula.

Nabijene amino kiseline reaktivnog peptida mogu biti susjedne (to jest, dvije ili više amino kiselina raspoređenih bez interventnih ostataka amino kiselina bez naboja ili analoga amino kiselina bez naboja), ili ne-susjedne (to jest, dvije ili više amino kiselina s nabojem raspoređeno je s najmanje jednim interventnim ostatkom amino kiseline ili analogom amino kiseline bez naboja). Susjedne amino kiseline s nabojem mogu biti sastavljene od jednog [na primjer, Asp-Asp-Asp-Asp (SEQ ID NO:1); Arg-Arg-Arg; Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:2); ili His-His] ili više (na primjer, Asp-Glu; Asp-Arg-Glu-Lys; Cys-His-Lys; Lys-Arg-Arg, ili Lys-Arg-His, ili Lys-His-His) aminokiselinskih ostataka.

Tamo gdje su amino kiseline s nabojem susjedne, one mogu biti raspoređene tako da su amino kiseline s negativnim nabojem raspoređene susjedno jedna do druge, i amino kiseline s pozitivnim nabojem su susjedne jedna do druge. Takove sekvence su, na primjer, bez ograničenja samo na njih, pozititivno nabijene sekvence Lys-Lys-Arg-His~Lys (SEQ ID NO:3) i Arg-Arg-His-Lys (SEQ ID NO:4), i negativno nabijene sekvence Asp-Cys-Glu-Asp (SEQ ID NO:5) i Asp-Asp-Glu-Glu-Glu (SEQ ID NO:6). Alternativno, tamo gdje su nabijene amino kiseline susjedne, one mogu biti raspoređene tako da negativno nabijene amino kiseline nisu susjedne jedna do druge, i/ili da pozitivno nabijene amino kiseline nisu susjedne jedna do druge.

Sekvenca susjednih negativno nabijenih amino kiselina može biti susjedna do sekvence susjednih pozitivno nabijenih amino kiselina, kako je opisano formulom XnYn, gdje X je sekvenca susjednih pozitivno nabijenih amino kiselina, Y je sekvenca negativno nabijenih amino kiselina, a n je cijeli broj od 1 do 50, još bolje od 1 do 25, čak još bolje od 1 do 10 amino kiselina. To su primjerice sekvence Asp-Lys, Glu-Arg, Glu-Cys-Lys-Arg (SEQ ID NO:7), i Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys(SEQ ID NO:8).

Nadalje, sekvenca susjednih nabijenih amino kiselina može nastati u reaktivnom peptidu kao ponavljajuća sekvenca. Pojam "ponavljajuća sekvenca", kad se navodi u svezi s aminokiselinskom sekvencom koja je sadržana u peptidnoj sekvenci, znači da se aminokiselinska sekvenca ponavlja u peptidnoj sekvenci od 1 do 2 puta, još bolje od 1 do 10 puta, i najbolje od 1 do 100 puta. Ponavljanja peptidne sekvence mogu biti ne-susjedna ili susjedna. Pojam "ne-susjedno ponavljanje", kad se navodi u svezi ponavljajuće peptidne sekvence, znači da se najmanje jedna amino kiselina (ili analog amino kiseline) nalazi između ponavljajućih sekvenci. Pojam "susjedno ponavljanje", kad se navodi u svezi ponavljajuće peptidne sekvence, znači da nema interventnih amino kiselina (ili analoga amino kiselina) između ponavljajućih sekvenci.

U jednoj prednosnoj izvedbi, reaktivni peptid sadrži ponavljajuću sekvencu susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem kao i ponavljajuću sekvencu susjednih amino kiselina s negativnim nabojem, gdje je ukupni broj pozitivno nabijenih aminokiselinskih ostataka susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem isti kao i ukupni broj negativno nabijenih aminokiselinskih ostataka u sekvenci susjednih amino kiselina s negativnim nabojem. Također, u još povoljnijoj izvedbi, sekvenca susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem susjedna je sa sekvencom susjednih amino kiselina s negativnim nabojem. To je, na primjer, sekvenca Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Lys (SEQ OD NO:9), Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys-Arg-Glu-Cys-Lys- Arg (SEQ ID NO:10), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO: 11), Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys-Asp-Cys-Glu-His-Arg-Lys (SEQ ID NO:12), Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His-Cys-Asp-Asp-Glu-Cys-Lys-Arg-Arg-Arg-His (SEQ ID NO:13), Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg-Glu-Arg (SEQ OD NO:14), Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His-Asp-His (SEQ ID NO:15).

U alternativnoj prednosnoj izvedbi, predviđeno je da reaktivan peptid sadrži ne-susjedna amino kiseline s negativnim nabojem i ne-susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem. Drugim riječima, nabijene amino kiseline (bez obzira imaju li negativan ili pozitivan naboj) mogu biti raspoređene između amino kiseline (ili analoga amino kiselina) koje su bez naboja (na primjer glicin, alanin, valin, leucin, izileucin, serin, treonin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, prolin, asparagine, i glutamin) ili da imaju drugačiji naboj. U još povoljnijoj izvedbi, reaktivan peptid sadrži, nadalje, sekvencu susjednih nabijenih amino kiselina, pri čemu se sekvenca susjednih nabijenih amino kiselina sastoji od susjednih amino kiselina s negativnim nabojem, ili od susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem. U još povoljnijoj izvedbi, sekvenca je primjerice sekvenca opće formule Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun (SEQ ID NO:16), Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun (SEQ ID NO:17), Lys-Argn-Ser-Gly-Asp-Glu-Asp (SEQ ID NO:18), Lys-Argn-His-Pro-Met-Aspn-Glu (SEQ ID NO:19), gdje n predstavlja cijeli broj od 1 do 40. Također, u još povoljnijoj izvedbi, sekvenca je Asp-Glu-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Asp-Glu (SEQ ID NO:20).

Bilo koji heterologni reaktivan peptid može se općenito ugraditi u biljnu virusnu česticu u skladu s gornjim tehnikama i onima iz U.S. patenata br. 5,958,422 i 5,874,087 (od kojih je svaki ovdje uvršten kao literaturni izvor). Posebno, heterologni reaktivni peptid može se ekspresionirati na izloženom dijelu proteina omotača biljnog virusa. Povoljno je da se reaktivan peptid uraetne u česticu biljnog virusa tako da su reaktivne amino kiseline izložene na proteinu omotača biljnog virusa, još povoljnije da se proteže prema van iz strukture kapside, čime se olakšava pristup pomoću kemijskih liganada i reagenata do reaktivnih amino kiselina reaktivnog peptida. U jednoj izvedbi, reaktivan peptid je umetnut između alanina 22 i prolina 23 malog proteina omotača (VP-S) virusa mozaične bolesti kravljeg graška.

2. Konjugiranje odabrane molekule na reaktivan peptid

Bilo koja odabrana molekula može se konjugirati na reaktivan peptid (bez obzira je li on divljeg tipa ili je homologan) koji je izložen pomoću biljnog virusa prema izumu metodama koje su u struci poznate. Na primjer, metode za konjugiranje polisaharida na peptide jesu primjerice, ali se ne ograničavaju samo na njih, povezivanje preko alfa- ili epsilon-amino skupina na NaJO4-aktivirani oligosaharid [Bocheret al. (1997) J. Imunol. Methods 27:191-202], upotrebom diestera skvarne kiseline (1,2-dietoksiciklobuten-3,4-diona) kao sredstva za povezivanje [Tietze et al. (1991) Bioconjug Chem. 2:148-153], povezivanje preko peptidnog linkera, pri čemu polisaharid ima smanjeni kraj i slobodne karboksilne skupine (U.S. patent br. 5,342,770), povezivanje sa sintetičkim nosačem peptida deriviranim iz humanog toplinski šokiranog proteina hsp65 (U.S. patent br, 5,736,146), i primjenom metoda iz U.S. patenta br. 4,639,512. Ove metode mogu se primijeniti na polisaharidne antigene uključiv, na primjer, Staphylococcus epidermidis površinski antigen (U.S. patent br. 5,961,975). Svaki od ovih U.S patenata ovdje je uvršten u cijelosti kao literaturni izvor.

Opisane su metode za konjugaciju glikoproteina na peptide preko ugljikohidratnih skupina primjenom, na primjer, stvaranja reaktivnih aldehida na ugljikohidratnim skupinama i zatim blagom oksidacijom s natrijevim perjodatom i zatim reakcijom s peroksidaznim hidrazidom [D'Alessandro et aL (1998) Clin. Chim. Acta 22:189-197], upotreba hetero-bifunkcionalnog reagenta za poprečno povezivanje hidrazida 4-94-N-meleimidofenil)maslačne kiseline (MPBH), koji omogućuje povezivanje aldehida deriviranog od ugljikohidrata na slobodne tiole [Chamow et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15916-15922], upotreba organskog reagenta za cijanoliranje 1-cijano-4-dimetilamino piridinijevog tetraflurborata (CDAP) na activne polisaharide prije povezivanja na peptide pod blagim alkalnim uvjetima (pH 7-9) [Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198], karboksilnim aktiviranjem ili hidroksilnim aktiviranjem polisaharida [Devi et aL (1995) Infect. Immun. 63:2906-2911], alkalnom obradom polisaharida prije povezivanja na peptide [Kabir (1987) J. Med, Microbiol. 23:9-18], i metodama iz U.S. patenta br. 4,639,512. Ove metode mogu se primijeniti za, na primjer, konjugaciju glikoproteinskih antigena [primjerice s antigenom virusa humane imunodeficijencije tipa 2 (HIV-2) (U.S. patent br. 6,037,165), i antigenom P-glikoproteina stanične površine (U.S. patent br. 4,837,306)] na biljni virus. Svaki od ovih U.S patenata ovdje je uvršten u cijelosti kao literaturni izvor.

Također, proteinska ili polisaharidna skupina glikoproteina može se upotrijebiti za kovalentno povezivanje glikoproteina s reaktivnim peptidima na virus primjenom postupaka poznatih iz stanja tehnike, koji su bili primijenjeni za konjugiranje glikoproteina na glikoproteine, kao pomoću fotoaktivacije, na derivate azidobenzola jednog od glikoproteina [Rathnam et al. (1980) Biochim. Biophys. Acta 624:436-442].

Ovdje su opisane metode za konjugaciju proteina na proteine (to jest, konjugiranje reaktivnog heterolognog peptida koji sadrži cisteinski ostatak s dotičnim proteinom koji je bio aktiviran s n-maleimidobenzoil-N-hidroksi-sukcinimid esterom (MBS); primjer 11). Također je poznato nekoliko dodatnih metoda, uključiv metodu konjugaciju SL proteina na protein alergena [Jahn-Schmid et al. (1996) Immunotechnology 2:103], povezivanje sa sintetičkim peptidnim nosačem deriviranim iz humanog toplinski šokiranog proteina hsp65 (U.S. patent br. 5,736,146), metode primijenjene za konjugaciju peptida na antitijela (U.S. patenti br. 5,194,254; 4,950,480), metode primijenjene za konjugaciju peptida na inzulinske fragmente (U.S. patent br. 5,442,043), metode iz U.S. patenta br. 4,639,512, i metoda konjugacije cikcličkog dekapeptidnog polimiksinskog B antibiotika na IgG nosač primjenom EDAC-a [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimid]-posredovane tvorbe amida [Drabick et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:583-588]. Svaki od ovih U.S. patenata ovdje je uvršten u cijelosti kao literaturni izvor.

Prema stanju tehnike također su poznati pristupi konjugaciji nukleinskih kiselina na proteine kao što su oni opisani u U.S. patentima br. 5,574,142; 6,117,631; 6,110,687; od kojih je svaki u cijelosti uvršten kao literaturni izvor.

Metode za konjugaciju lipida na peptide bile su opisane u stanju tehnike, i one uključuju, ali nisu ograničene samo na primjenu redukcijskog aminiranja, i povezivanje koje uključuje sekundarni ili tercijarni amin (U.S. patent br. 6,071,532), metode iz U.S. patenta br. 4,639,512, metode koje se koriste za kovatentno povezivanje peptida na jednoslojne liposome [Friede et a. (1994) Vaccine 12:791-797], povezivanje humanog seruma albumina na liposome upotrebom hetero-bifunkcionalnog reagenta N-sukcinimidil-S-acetiltioacetata (SATA) [Kamps et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1278:183-190], povezivanje fragmenata antitijela Fab' na liposome upotrebom fosfo-lipid-poli(etilen glikol)-maleimidnog sidra [Shahinian et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239:157-167], i povezivanje Plasmodiun CTL epitope na palmitinsku kiselinu preko cistein-serinskog djelitelja amino kiselina [Verheul et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:219-226]. Svaki od ovih U.S patenata uvršten je ovdje u cijelosti kao literaturni izvor.

G. Davanje pripravaka životinjama

U jednoj izvedbi, predviđeno je da se modificirani virusi prema izumu upotrijebe za predstavljanje antigenskih molekula kao imunogenske komponente cjepiva.

Prema izumu modificirani biljni virusi osiguravaju posebno zanimljivu sistem predstavljanja epitope u kontekstu konstrukcije cjepiva, jer oni predstavljaju antigensku molekulu na biljnoj čestici tako da ih imunosni sistem lako prepoznaje, na primjer, stavljanjem na izloženi dio proteina omotača virusa. Modificirani virusi prema izumu mogu se dati životinji primaocu bilo kojim željenim putem (na primjer, intranazalno, oralno, parenteralno, subkutano, intravenski, subkutano, intratekalno, intraperitonealno, intramuskularno, itd.).

Premda ovdje prikazani podaci pokazuju da modificirani biljni virusi prema izumu ispoljavaju svoj učinak na stanične i/ili humoralne komponente imunosnog sistema bez obzira na odsutnost ili prisutnost vanjskih imuno-modulacijskih sredstava (na primjer, pomoćnih sredstava, citokina, itd.), izum nije izričito ograničen na primjenu izuma u odsutnosti tih sredstava. Na primjer, budući da je funkcija pomoćnih sredstava da pojačaju prirodu imunosne reakcije kao i posebnu stazu dobivene imunosne reakcije, stručnjak može smatrati uključenje pomoćnih sredstava zajedno s modificiranim virusima prema izumu poželjnim bez obzira na utjecaj koji je to pomoćno sredstvo izazvalo na stazu T helpera.

Iako je izum ilustriran upotrebom, primjerice, pomoćnog sredstva alauna, FCA/FICA, i QS-21, izričito je zamišljeno da izum nije ograničen na ta pomoćna sredstva. Može se, zapravo, uključiti bilo koje zanimljivo pomoćno sredstvo, kao što je, ali bez ograničenja samo na, ono koje sadrži emulzijski sistem i sintetički smolasti materijal koji se može kompleksirati s antigenima, hormonima, lijekovima i serumom (U.S. patent br. 3,919,411), kopolimeri polioksietilen/polioksipropilen blok kopolimera (U.S. patent br. 6,086,899), IH-imidazo[4,5-C-kinolin]-4-amini i njihovi derivati (U.S. patent br. 6,083,505), mutantan Escherichia coli toplinski labilan enterotoksin holotoksin (U,S. patent br. 6,033,673), formil metionil peptid (fMLP) (U.S. patent br. 6,017,537), ADP-ribosilatiran eksotoksin koji je djelomično prikladan za transkutano davanje (U.S. patent br. 5,980,898), interleukin-12 (U,S. patent br. 5,976,539), polidimetil-siloksan i kompleksan emulgator (U.S. patent br. 5,904,925), heiaozoin ili β-hematin (U.S. patent br. 5,849,307), Saccharomyces cervisiae glukan (U.S. patent br. 5,804,199), zinkov hidroksid/kalcijev hidroksid gel, lecitin, i polialfaolefin (U.S. patent br. 5,232,690), polioksietilen sorbitan monoesteri (PS) koji se mogu upotrijebiti za površinsku aplikaciju antigena preko mukoznih membrana (U.S. patent br. 5,942,237), i transdermalni liposomi (U.S. patent br. 5,910,306). Osim toga, u struci su također poznate metode upotrebe kristaličnih površinskih slojeva bakterija (e. surface layers, SL) ) kao pomoćnih sredstava konjugacijom antigena na SL [Jahn-Schmid et al. (1997) International Immunology 9:1867-1874]. Svaki od ovdje navedenih U.S patenata uvršten je u cijelosti kao literaturni izvor.

Nadalje, premda citokini ili pomoćna sredstva nisu potrebni za učinkovitost, modificirani virusi prema izumu mogu se dati zajedno s citokinom ili dotičnim pomoćnim sredstvom. Primjeri citokina uključuju, bez ograničenja samo na njih, interleukin-1α, interleukin-1β, interleukin-2, interleukin-11, interferon-α, interferon-γ, tumorski nekrozni faktor, porodicu TGF-β, porodicu inhibina, porodicu DPP/VG1, Mullerian porodicu inhibitorskih tvari, (e. Mullerian Inhibiting Substance Family), leukemijski inhibitorski faktor, onkostatin M, i cilijarni neurotrofni faktor. Farmaceutska pomoćna sredstva, koja se mogu upotrijebiti u kombinaciji s biljnim virusima modificiranim prema izumu uključuju, na primjer, pomoćno sredstvo na osnovi mikrokristalinične celuloze koje ima poboljšanu stlačivost (U.S. patent br. 6,103,219), galaktomanan hidrokoloid koji je prikladan za povećanje tvrdoće farmaceutskih tableta koje sadrže guar gumu (U.S. patent br. 6,063,402), umreženu amilozu koja se može upotrijebiti kao pomoćno sredstvo za polagano oslobađanje aktivnih spojeva iz tableta ili pilula (U.S. patent br. 5,807,575), enzimski podrezane škrobove koji se mogu stlačiti u tablete (U.S. patent br. 5,468,286), i pomoćna sredstva od lipidnih mjehurića koji se mogu proizvesti u obliku spreja ili kao kapljice koje se mogu dati kroz nosnu sluznicu i pri tome ju ne nadražuju (U.S. patent br. 5,200,393). Svaki od U.S. patenata uvršten je ovdje u cijelosti kao literaturni izvor.

H. Pojačanje THI-tipa reakcije

Modificirani virusi prema izumu mogu se upotrijebiti posebno za povećanje TH1 reakcije na dotičnu molekulu, čineći tako viruse modificirane prema izumu posebno privlačnim nosačima za molekule koja pogađaju, na primjer, infekcijsku bolest, rak, i alergiju.

Pojam "povišenje razine TH1 reakcije" i "povišena razina TH1 reakcije", kad se navodi u svezi s reakcijom životinja na modificirani virus koji sadrži dotičnu molekulu, znači da je razina bilo koje, jedne ili više staničnih i/ili humoralnih reakcija do kojih dolazi preko TH1 limfocita nakon stimulacije s molekulom ili virusom, povećana za bilo koju statistički značajnu količinu u usporedbi s odgovarajućom reakcijom u kontrolnoj životinji. Posebno, povišena razina TH1 reakcije u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu odnosi se na (a) povišenu razinu TH1-povezanog imunoglobulina, (b) povišenu razinu TH1-povezanog citokina, i/ili (c) povišenu razinu proliferaciju TH1 stanica.

Pojam "povišena razina TH1-povezanog imunoglobulina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu odnosi se na porast od najmanje 0.1%, još bolje od 0,1% do 50%, također još bolje od 0,1% do 20%, i najbolje od 0,1% do 10% količine jednog ili više podrazreda TH1-povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG2a, mišji IgG2b, humani IgG1, humani IgG3, itd.), koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus, u usporedbi prema količini ukupnog TH1-povezanog imunoglobulina istog podrazreda. Na primjer, porast od 5% količine za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG2a u usporedbi s količinom ukupnog mišjeg IgG2a u istom mišu smatra se porastom razine TH1 reakcije u mišu. Slično tome, porast od 1% količine za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG2b u usporedbi s količinom ukupnog mišjeg IgG2b u istom mišu smatra se porastom razine TH1 reakcije u mišu (vidi, na primjer, tablicu 4).

Alternativno, pojam "povišena razina TH1-povezanog imunoglobulina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekule odnosi se na porast od ponajprije najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 100.000 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, i najbolje od 2 do 2.000 puta u omjeru količine jednog ili više podrazreda TH1-povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG2a, mišji IgG2b, huraani IgG1, humani IgG3, itd.) koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus, u usporedbi s količinom ukupnog TH1-povezanog imunoglobulina istog podrazreda, s jedne strane, u usporedbi s omjerom jednog ili više podrazreda TH2-povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG1, mišji IgG3, humani IgG2, itd.), koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus (odnosno) u usporedbi s količinom ukupnog TH2-povezanog imunoglobulina istog podrazreda, s druge strane. Na primjer, porast od 1.000 puta u omjeru za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG2a:ukupnom IgG2a, u usporedbi s omjerom za molekulu specifičnog (i/ili za virus-specifičnog) mišjeg IgG1:ukupnom IgG1 u istom mišu smatra se porastom razine TH1 reakcije u mišu. Slično tome, porast od 2.000 puta u omjeru za molekulu specifičnog (i/ili za virus-specifičnog) mišjeg IgG2b:ukupnom IgG2b, u usporedbi s omjerom za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG3;ukupnom IgG3 u istom mišu smatra se porastom razine TH1 reakcije u mišu (vidi na primjer tablicu 4).

Također, u drugoj izvedbi, pojam "povišena razina TH1-povezanog imunoglobulina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekule odnosi se na porast ponajprije od najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, također još bolje ponajprije od 2 do 1000 puta, čak još bolje od 2 do 100 puta, još bolje od 2 do 50 puta geometrijskog prosjeka titra krajnje točke za molekulu specifičnog (i/ili za virus-specifičnog) TH1-povezanog imunoglobulina u usporedbi s geometrijskim prosjekom titra krajnje točke za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) TH1-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji. Pojam "titar krajnje točke" je ono razređenje antitijela koje je specifično za datu molekulu i koje je najviše razređenje antitijela koje proizvodi dokazivu reakciju (na primjer, pomoću ELISA) u kombinaciji s molekulom. Na primjer, porast od 20 puta u geometrijskom prosjeku titra krajnje točke za molekulu specifičnog mišjeg IgG2a u liječenom mišu u usporedbi s geometrijskim prosjekom titra krajnje točke za molekulu specifičnog mišjeg IgG2a u usporedbi s kontrolnim mišem smatra se povišenom razinom TH1-povezanog imunoglobulina (vidi na primjer tablice 2 i 3).

Metode za količinsko utvrđivanje razina imunoglobulina proizvedenog pomoću pojedinačnih B stanica (kao i stanica fuzioniranih s B stanicama, kao što su hibridomi) mogu se lako provesti in vitro upotrebom komercijalno dostupnih reagenata i primjenom raznih testova, uključiv one koji su ovdje opisani, kao ELISA i EUSPOT. Vidi Segwick et al. (1983) J. Immunol. Methods 57:301-309. Vidi također Mazer et al. (1991) J. Allergy Clin. Immunol. 88:235-243.

Također, u drugoj inačici, "povišena razina TH1 reakcije" odnosi se na povišenu razinu TH1-povezanog citokina. Pojam "povišena razina TH1-povezanog citokina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu znači da je količina TH1-povezanog citokina, koja je proizvedena u životinjskim TH1 stanicama, povišena ponajprije za 2 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, također još bolje od 2 do 1.000 puta, i najbolje od 2 do 100 puta u liječenoj životinji u usporedbi s količinom TH1 povezanog citokina koji je proizveden pomoću T stanica u kontrolnoj životinji. Količinu citokina može se utvrditi na primjer pomoću ELISA, kako je ovdje opisano upotrebom komercijalno dostupnih reagenata (na primjer, tablica 6).

U daljnjoj inačici, "povišena razina TH1 reakcije" odnosi se na povišenu razinu proliferacije TH1 stanica. Pojam "povišena razina proliferacije TH1 stanica" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu znači broj proliferiranih TH1 stanica koje je proizvela životinja i koja je povišena ponajprije najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, još bolje od 2 do 1.000 puta i najbolje od 1 do 100 puta, u usporedbi s brojem proliferiranih TH1 stanica koje su proizvedene u kontrolnoj životinji. Broj proliferiranih TH1 stanica može se utvrditi metodama kao što su ovdje opisane, a njihov TH1 tipe se može utvrditi ispitivanjem supernatanata tih stanica u prisutnosti TH1-povezanih citokina (na primjer, tablica 6).

U drugoj izvedbi, predviđeno je da se subjektu daje terapeutsku količinu modificiranih biljnih virusa prema izumu. Ovdje izneseni podaci pokazuju da imunizacija, miša primjerice s himernim virusnim česticama (CVPs) iz CPMV, stvara primarno za CPMV- i za peptid specifična IgG2a i IgG2b antitijela -in sera, kako je utvrđeno pomoću ELISA. Analiza enzimom povezane imuno mrlje (ELISPOT, e. enzyme-linked immunospot) potvrđuje djelovanje u antitijelu reakcije prema TH1 tipu, što pokazuje da CVPs mogu aktivirati u slezeni pretežno za CPMV- i za peptide specifičnu IgG2a-i IgG2b-proizvodnju B stanica. Suprotno tome, u slezeni su utvrđene, ako su uopće utvrđene, samo niske razine B stanica koje proizvode antitijela za CPMV- i za peptid specifičan IgG1 i IgG3 (proizvodi TH2 imunosne staze).

Osim toga, izum opisuje da stanice slezene (T stanice) iz CVP-imuniziranih miševa proizvode CPMV -in vitro proizvodeći visoke razine IFN-γ (TH1-povezani citokin), ali i nedokazive razine IL-4 (TH2-povezani citokin). To sugerira da CVP-i pobuđuju TH1-tip reakcije na virusni nosač, koji sa svoje strane određuje izotip za peptid specifičnu reakciju B stanica. Djelovanje u reakciji prema TH1 tipu nije bilo posljedica naravi antigena, genetičke pozadine inokulirane individue, izbora pomoćnog sredstva, ili doze ili režima doza datog CVP-a.

Dok ovdje izneseni podaci pokazuju da u prednosnoj izvedbi razina TH1-povezanog citokina (na primjer, IFN-γ) poraste u reakciji na liječenje s modificiranim virusima prema izumu bez promjene razine TH2-povezanog citokine (na primjer, IL-4), izričito je predviđeno da izum nije ograničen na povišenje TH1 povezanog citokina u posvemašnjoj odsutnosti TH2 povezanog citokina. Zapravo, u okviru svoje svrhe izum izričito uključuje povišenje TH1-povezanog citokina bez obzira na promjenu (ako je uopće ima) razine TH2 povezanog citokina.

Gornji podaci pokazuju da sposobnost prema izumu modificiranih virusa, koji ne inficiraju ili koji se ne repliciraju u stanicama sisavca, da usmjeravaju imunosnu reakciju na epspresionirane peptide prema TH1 efektorskom tipu bez potrebe za vanjskim imunomodulatorskim sredstvima, kao što su pomoćna sredstva ili citokini, predstavlja prednost biljnih virusa prema izumu kao nosećeg sistema cjepiva.

Na drugi način, ovdje dati modificirani virusi ponašaju se kao inaktivni virusi u kontekstu inokulacije sisavca. Dok su inaktivni virusi predvideni stanjem tehnike tako da pobuđuju TH2 reakciju, ovdje dati inaktivni virusi iznenađujuće pobuđuju TH1 tip reakcije.

I. Smanjenje TH2-tipa reakcije

Modificirani virusi prema izumu mogu se upotrijebiti u aplikacijama gdje je poželjno smanjiti TH2 reakciju na dotičnu molekulu. Na primjer, tamo gdje je poznato da davanje molekule (na primjer, bakterijski antigen) životinji uzrokuje TH2 reakciju (djelomično, pretežno ili isključivo), TH2 reakcija u drugoj životinji se može smanjiti s prisutnošću molekule u drugoj životinji u kontekstu modificiranog biljnog virusa, kako je ovdje opisano.

Pojmovi "djelomična TH1 reakcija" i "djelomična TH2 reakcija" znače da životinja pokazuje (a) TH1- i TH2-povezani imunoglobulin, (b) TH1- i TH2-povezani citokin, i/ili (c) TH1 i TH2 proliferaciju stanica.

"Pretežna TH2 reakcija" je djelomična TH2 reakcija u kojoj je razina bilo kojeg, jednog ili više TH2-povezanog imunoglobulina, TH2-povezanog citokina, i TH2 proliferacije stanica statistički veća od razine TH1 povezanog imunoglobulina, TH1-povezanog citokine, i TH1 proliferacije stanica. Suprotno tome, "pretežno TH1 reakcija" je djelomična TH1 reakcija u kojoj je razina bilo kojeg, jednog ili više TH1 povezanog imunoglobulina, TH1-povezanog citokina, i TH1 proliferacije stanica statistički veća od razine TH2 povezanog imunoglobulian, TH2 povezanog citokina, i TH2 proliferacije stanica.

"Isključivo TH2 reakcija" je pretežita TH2 reakcija gdje životinja pokazuje TH2-povezani imunoglobulin, TH2-povezani citokine, i TH2 proliferaciju stanica u potpunoj odsutnosti TH1-povezanog imunoglobulina, TH1 povezanog citokina, i TH1 proliferacije stanica. Obrnuto, "isključivo TH1 reakcija" je pretežita TH1 reakcija gdje životinja pokazuje TH1-povezani imunoglobulin, TH1-povezani citokine, i TH1 proliferaciju stanica u potpunoj odsutnosti TH2-povezanog imunoglobulina, TH2 povezanog citokina, i TH2 proliferacije stanica.

Osim toga, izumom modificirani virusi mogu se također upotrijebiti, tamo gdje je to poželjno, za smanjenje obima TH2 u životinji. To je posebno korisno u primjeni gdje dodatno cijepljenje slijedi nakon prvog cijepljenja, u kojem se koristi pomoćno sredstvo koje uzrokuje neželjenu, djelomičnu ili isključivu TH2 reakciju. Prema stanju tehnike zna se, da se prethodno postojeću TH2 reakciju ne može prevladati dodatnom aplikacijom pomoćnog sredstva koje bi inače rezultiralo s TH1 reakcijom, kad se daje u primarnom cijepljenju. Specifično, dok upotreba Quil-A kao pomoćnog sredstva ima za posljedicu indukciju TH1 reakcije u mišu, kad je imuniziran s HPV 16 E7 proteinom, ovaj učinak nije viđen ako je ranije postojala TH2 reakcija na E7 (inducirana upotrebom algamulina kao pomoćnog sredstva) [Femando et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:459]. Ovo opažanje pokazuje da tamo gdje je prvo cijepljenje ljudi bilo provedeno s alaunom (koji je jedino pomoćno sredstvo provjereno za ljusku upotrebu i koje inducira TH2 reakcije), dobivena neželjena TH2 reakcija, koja posreduje neželjene alergijske reakcije, može prije toga biti nepovratna. Dok su primarne TH2 stanice, kao i TH1 stanice su postojane i mogu biti neusmjerene prema TH1 fenotipu [Perez et al. (1995) Intl. Immunol. 7:869], pokazano je da u humanim T staničnim linijama i klonovima stvorenim od alergičnih pacijenata, upotreba specifičnih alergena, konjugiranih na bakterijski protein, ima za posljedicu širenje za alergen specifičnih TH1/THO stanica, dok se nekonjugirani alergen širi na TH2 stanicama [Jahn-Schmid et al. (1997) Intl. Immunol. 9:1867]. Tako dakle, imunomodulatorska dominacija CPMV-predstavljanja imunogena (uključivo, ali ne ograničavajući se samo na alergene) može se proširiti na pomicanje dokazane imunosne reakcije od štetne TH2 staze na mnogo povoljniju TH1 stazu. Tako, dominantan imunomodulatorski učinak prema izumu modificiranih biljnih virusa, kad se upotrijebi kao platforma za predstavljanje antigena, nudi sredstvo za prevladavanje proširene TH2 reakcije prema onom antigenu koji je iniciran s prisutnošću dotičnog pomoćnog sredstva.

Pojam "smanjenje razine TH2 reakcije" i smanjena razina TH2 reakcije", kad se navodi u svezi reakcije životinje prema modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu, znači da bilo koja, jedna ili više staničnih i/ili humoralnih reakcija, koja je stvorena s TH2 limfocitima nakon stimulacije s molekulom ili virusom, je reducirana za bilo koju statistički signifikantnu količinu u usporedbi s odgovorajućom reakcijom kontrolne životinje. Posebno, smanjena razina TH2 reakcije u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu odnosi se na (a) reduciranu razinu TH2 povezanog imunoglobulina, (b) reduciranu razinu TH2-povezanog citokina, i/ili (c) reduciranu razinu proliferacije TH2 stanica.

Pojam "reducirana razina TH2-povezanog imunoglobulina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu, koji sadrži dotičnu molekulu, odnosi se na smanjenje ponajprije od 0,1% do 100%, još povoljnije od 0,1% do 80%, također još bolje od 0,1% do 60% količine jednog ili više podrazreda TH2 povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG1, mišji IgG3, humani IgG2, itd.), koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus, u usporedbi s količinom ukupnog TH2-povezanog imunoglobulina istog podrazreda. Na primjer, redukcija od 10% količine za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG1 u usporedbi s količinom ukupnog mišjeg IG1 u istom mišu smatra se reduciranom razinom TH2 reakcije u mišu. Slično, redukcija od 0,1 % količine za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifinog mišjeg IgG3 u usporedbi s količinom ukupnog mišjeg IgG3 u istom mišu, smatra se reduciranom razinom TH2 reakcije u mišu.

Alternativno, pojam "reducirana razina TH2-povezanog imunoglobulina" u životinji koja izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu odnosi se na redukciju ponajprije od najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 100.000 puta, također još povoljnije od 2 do 10.000 puta, i najbolje od 2 do 2.000 puta u omjeru jednog ili više podrazreda TH2-povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG1, mišji IgG3, humani IgG2, itd.), koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus, u usporedbi s količinom ukupnog TH2-povezanog imunoglobulina istog podrazreda, s druge strane, prema omjeru količine jednog ili više podrazreda TH1-povezanog imunoglobulina (na primjer, mišji IgG2a, mišji IgG2b, humani IgG1, humani IgG3, itd.) koji je specifičan za dotičnu molekulu ili za virus (odnosno), u usporedni s ukupnim TH2-povezanim imunoglobulinom istog podrazreda, s druge strane. Na primjer, redukcija za 1.000 puta u omjeru za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG1:ukupnom IG1, u usporedbi s istim omjerom za molekulu specifinog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG2a:ukupnom IgG2a u istom mišu, smatra se reduciranom razinom TH2 reakcije u mišu. Slično tome, redukcija za 2.000 puta u omjeru za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) mišjeg IgG3:ukupnom IgG3, u usporedni s omjerom za molekulu specifičnim (i/ili za virus specifičnim) mišjim IgG2a:ukupnom IgG2a u mišu, smatra se reduciranom razinom TH2 reakcijom u mišu.

U daljnjoj inačici, pojam "reducirana razina TH2-povezanog imunoglobulina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu odnosi se na redukciju ponajprije najmanje od 2 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, čak još povoljnije od 2 do 1.000 puta, i također još bolje od 2 do 100 puta, geometrijskog prosjeka titra krajnje točke za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) TH2-povezanog imunoglobulina u usporedbi s geometrijskim prosjekom titra krajnje točke za molekulu specifičnog (i/ili za virus specifičnog) TH2-povezanog imunoglobulin u kontrolnoj životinji. Na primjer, redukcija za 2 puta geometrijskog prosjeka titra krajnje točke za molekulu specifičnog mišjeg IgG1 u liječenom mišu u usporedbi s geometrijskim prosjekom titra krajnje točke za molekulu specifičnog mišjeg IgG1 u kontrolnom mišu, smatra se reduciranom razinom TH2-povezanog imunoglobulina.

Također, u drugoj inačici, "reducirana razina TH2 reakcije" odnosi se na reduciranu razinu TH2-povezanog citokina. Pojam "reducirana razina TH2-povezanog citokina" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu znači da je količina TH2-povezanog citokina koji je proizveden u životinjskim TH2 stanicama reducirana ponajprije za najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 10.000 puta, također još bolje od 2 do 1.000 puta, i najbolje od 1 do 100 puta u liječenoj životinji u usporedbi s količinom TH2-povezanog citokina koji je proizveden pomoću T stanica u kontrolnoj životinji.

U daljnjoj inačici, "reducirana razina TH2 reakcije" odnosi se na reduciranu proliferaciju razine TH2 stanica. Pojam "reducirana razina proliferacije TH2 stanica" u životinji koja je izložena modificiranom virusu koji sadrži dotičnu molekulu znači da je broj proliferiranih TH2 stanica, koje su proizvedene u životinji, reduciran ponajprije za najmanje 2 puta, još bolje od 2 do 10,000 puta, još bolje od 2 do 1.000 puta, i najbolje od 1 do 100 puta u liječenoj životinji, u usporedbi s brojem proliferiranih T stanica koje su proizvedene u kontrolnoj životinji. Broj proliferiranih T stanica može se utvrditi metodama kao što su ovdje opisane, a njihov TH2 tip može se utvrditi ispitivanjem supernatanata tih stanica u pogledu prisutnosti TH2-povezanih citokina.

Eksperimentalni dio

Slijedeći primjeri služe za ilustraciju nekih prednosnih izvedbi i aspekata predloženog izuma i nisu predviđeni kao ograničenje njegove svrhe.

Ako nije navedeno drugačije, eksperimentalni postupci i materijali u svakom od slijedećih primjera odgovaraju dolje datom općem opisu.

Pokusne životinje

Ženke C57BL/6 (H-2b, BALB/c (H-2d), NIH (H-2q), DBA/1 (H-25) i Biozzi AB/H (H-2dq1) miševa, stare 6-8 tjedana, uzgojene su u Department of Pathology, University of Cambridge, United Kingdom. Svi postupci su provedeni u skladu sa uputama za životinje u medicinskom istraživanju, United Kingdom Home Office guidelines for animals in medical research.

Konstrukcija, propagacija i čišćenje CVPS

Metode primijenjene za ekspresiju stranih peptida na obje podskupine, S i L, CPMV opisane su u Porta et al. (1994) Virology 202:949. Razni specifični CVP-i, upotrijebljeni u ovom istraživanju, opisani su u tablici 1.

Tablica 1: CVP upotrijebljeni za imunizaciju.

[image]

ELISA za određivanje za peptid specifične i ukupne koncentracije izotipa

U nekim slučajevima vrijednosti 00405 navedene u primjerima koji slijede pretvorene su u mikrograme antitijela. Tamo gdje je to učinjeno, primijenjen je slijedeći postupak kao osnova za računanje: jamice su premazane s kozji anti-mišjim IgG (Southern Biotechnologies Inc., USA) ili s peptidom. U svaku jamicu premazanu s kozji anti-mišjim IgG dodani su nizovi razređenja poznate koncentracije IgG2a kapa mAb (Sigma, UK) i razređenja CVP-imuniziranog seruma dodana su u jamice premazane s anti-mišjim IgG ili s peptidom. ELISA je provedena kako je opisano bilo gdje u opisu upotrebom s alkalnom fosfatazom (AP)-obilježenog anti-mišjeg IgG2a konjugata za detekciju. Grafičkim prikazom OD dobivenih iz interakcije kozji anti-mišjeg IgG i monoklonskog IgG2a prema poznatim koncentracijama IgG2a. OD jedinice anti-peptida IgG2a u ispitnom serumu prevedene su u mikrograme za peptid specifičnog IgG2a. OD je očitano u odgovarajućoj točki na IgG2a standardnoj krivulji. Upotrebom iste standardne krivulje, OD jedinice iz seruma inkubiranog u jamicama prevučenim s anti-IgG, mogu se prevesti u mikrograme ukupnog IgG2a prisutnog u uzorku seruma. Postotak za peptid specifičnog IgG2a izračunat je za svaki uzorak seruma, Ista metoda primijenjena je mjerenje ukupnog i za peptid specifičnog IgG1, IgG2b i IgG3.

Statistika

Razlike između skupina ocijenjene su pomoću Studentovog t-testa, pri čemu je P<0,05 smatrano statistički signifikantnim.

Primjer 1

DT- i KLH-konjugirani peptidi ne uzrokuju dominantnu reakciju tipa TH1 seruma antitijela Svako djelovanje u T helper stazi imunosne reakcije, nastale zbog antigena, može se odrediti pomoću svojstvenih imunoloških svojstava promatranog peptida. Za to ispitivanje, C57BL/6 miševi su imunizirani s CTP37 peptidom, deriviranim iz humanog korioničkog gonadotrofina konjugiranog na toksin difterije (DT, e. diphteria toxin; Prof. V. Stevens, Ohio State University), ili s peptidom (peptid 10) deriviranim iz proteina vanjske membrane (e. outer membrane protein, Omp F protein) iz Pseudomonas aeruginosa konjugiranim na KLH (Prof. H.E. Gilleland. Louisiana State University). Obadva konjugata inokulirana su u prisutnosti pomoćnog sredstva QS-21. 2 imunizacije (na dane 0 i 21) ili 3 imunizacije (na dane 0, 14 i 28) date su subkutano. Krv je skupljena krvarenjem iz repa ili slijedećim uzimanjem krvi na dan 42 i serumi su skupljeni i pohranjeni pri -20°C do kasnijeg ELISA ispitivanja. Za detekciju antitijela prema P. aeruglnosa OM protein F i βhCG-CTP37 (peptidi su sintetizirani i očišćeni u tvrtki Genosys Inc. Cambridge, UK), jamice mikrotitarske ploče su premazane s 0,5 μg/jamici dotičnog peptida (vidi tablici 1, gore) tijekom 3 h pri 37°C. Nizovi dvostrukih razređanja seruma inkubirani su na pločicama prevučenim s antigenom 1 h pri 37°C. Vezana antitijela utvrđena su s alkalnom fosfatazom (AP)-konjugiranim kozji anti-mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 (Southern Biotechnologies Inc. USA) upotrebom p-nitrofenil fosfata (PNPP, [Sigma]) kao podloge. Ovi reagenti anti-mišjeg izotipa titrirani su najprije prema standardnim mišjim mijeloma proteinima, koji predstavljaju četiri IgG podrazreda, i razređenje od 1:2000 svakog konjugata dalo je manje od 10% promjene između vezanja mijeloma. To razređenje upotrijebljeno je u svim slijedećim pokusima. Titri završne točke izračuanti su kako je ranije opisano (Brennan et al. (1999) Microbiol. 145:211; Brennan et al. (1999) J. Virol 73:930). Rezultati su prikazani u tablici 2.

Tablica 2. DT- i KHL-konjugirani peptidi ne izazivaju dominantan TH1-tip reakcije serumskog antitijela.

[image]

Imunizacija C57/BL6 miševa uzetih u skupinama po 6 životinja.

*) Serumi su skupljeni na dan 29 i ispitani u pogledu βhCG-CTP37- i OM protein F-specifičnog IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 pomoću ELISA. ;Kako je prikazano u tablici 2, obadva proteina, DT-βhCG~CTP37 i KLH-OM protein F, izazivaju signifikantno više razine za peptid specifičnog IgG1 u usporedbi s IgG2a (P<0,05 i P<0,01 za DT-βhCG-CTP37 i KLH-OM protein), što pokazuje da ovi peptidi na ne-replicirajućem sistemu nosača cjepiva ne stvaraju djelovanje prema TH1 tipu reakcije. ;Primjer 2 ;Ekspresija peptida na CPMV prevladava TH2 djelovanje u imunosnoj reakciji stimuliranoj s peptidima na drugim makromolekularnim sistemima nosača koji dovode do TH1-tipa reakcije ;Suprotno prethodnom primjeru, četiri peptida, uključiv dva (DT-PhCG-CTP37 i KLH-OM protein F) iz primjera 1, ekspresionirani su na CPMV. Četiri skupine od 8 Balb/c miševa imunizirane su subkutano u prisutnosti FIA/FICA u ukupnom volumenu od 100 μl po dozi. Tri imunizacije (na dane 0 i 21 ili na dane 0, 14 i 28) izvršene su injekcijom, 100 ug, 25 μg i daljnjih 25 μg CVP-a. Krv je skupljena ili uzeta iz repa, ili je uzeta na dan 42; serumi su skupljeni i pohranjeni pri -20°C. ;Za detekciju anti-CPMV antitijela, jamice su premazane s 0,1 μg/well CPMV-a, tijekom 3 h pri 37°C. Nizovi razređenja seruma inkubirani su na antigen-matiranim pločama 1 h pri 37°C. Vezana antitijela detektirana su s alkalnom fosfatazom (AP)-konjugiranim kozji-anti-mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3 (Southern-Biotechnologies Inc. USA), s p-nitrofenilfosfatom (PNPP) (Sigma) kao podlogom. Kao i ranije, ovi reagenti za anti-mišje izotope su najprije titrirani prema standardnim mišjim mijeloma proteinima, koji predstavljaju četiri IgG podrazreda. Razređenje od 1:2000 svakog konjugata dalo je manje od 10% promjene između vezanja mijeloma; zbog toga je ovo razređenje uzeto u svim slijedećim pokusima. Titri završnih točaka izračunati su kako je ranije opisano. Za CPMV-specifične titre, rezultati su izraženi kao titar završne točke, izračunat kao inverzija razređenja koje daje prosjek OD405 dobiven s 1:50 razređenjem skupljenog seruma iz neimuniziranih miševa. ;Za titre specifične za peptid, titri završne točke bili su recipročni razređenju koje daje prosjek 00405 viši od OD405 dobiven s 1:50 razređenjem skupljenog seruma iz divljeg tipa CPMV-imuniziranih miševa. Rezultati su prikazani u tablici 3, reci 5 i 7. ;Tablica 3. ;Izotip za peptid specifičnog serumskog IgG uzrokovanog sa CVP koji ekspresionira mnoštvo različitih peptida. ;[image] ;Mišje vrsteb različitih H-2 haplo tipova imunizirane su (5-9/skupini) subkutano ili *intranazalno s brojnim CVP u FCA/RCA, QS-21 ili alaunskim pomoćnim sredstvima, ili bez pomoćnog sredstvad. Serumi su skupljeni na dan 42 (+ dan 83) i ispitani u pogledu mIgE-(AGY2), EGFRvIII-(EGFR1), VP2-(PARVO9), βhCG-CTP37-(HCG1), OM proteina F-(PAE5) i FnBP-(MAST1)-specifičnog IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 pomoću ELISA. Titri su izraženi kao geometrijski prosjek titra završne točke ± SD.

Pojam "završna točka" odnosi se na ono razređenje antitijela koje je specifično za dati antigen i koje je najviše razređenje antitijela koji proizvodi dokazivu reakciju kad se pomiješa s antigenom.

Kako je prikazano u tablici 3, u ovom slučaju epitope su bile prisutne na CPMV, te epitope izazivaju mnogo niže razine IgG1 nego IgG2a, čime je pokazano djelovanje prema TH1 tipu imunosne reakcije. U stvari, suprotno dvjema epitopama (to jest, DT-βhCG-CTP37 i KLH-OM proteina F), koje su bile prisutne bez CPMV (primjer 1), prisustvno iste epitope na CPMV izaziva mnogo višu razinu IgG1 nego IgG2a.

Primjer 3

Prisutnost peptida na CPMV izaziva TH1 tip reakcije u prisutnosti vanjskog imunomodulatorskog sredstva, na primjer, za specifična pomoćna sredstva zna se da potiču TH2-tip imunosne reakcije.

Pomoćna sredstva alaun i QS21 općenito potiču indukciju imunosne reakcije tipa TH2. Da bi se utvrdilo da li se TH2-tip imunosne reakcije potaknute s pomoćnim sredstvom može premostiti sa sistemom predstavljanja prema izumu, tri skupine miševa imuniziarane su subkutano na dane 0 i 21 u svakom slučaju s 5 μ,g CPMV-MAST1 (koji ekspresionira peptid deriviran iz fibronektin-veznog proteina iz Staphylococcus aureus), samim ili s alaunom QS21. Serumi su skupljeni na dan 42 i ispitani u pogledu MAST1 za peptid specifičnog imunoglobulina razreda IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 pomoću ELISA, uglavnom kako je opisano gore u primjerima 1 i 2. Titri pokazuju jako djelovanje prema TH1 reakciji u sve tri skupine miševa, uključiv kontrolnu skupinu u kojoj nije bilo dodano pomoćno sredstvo (tablica 3, gore, reci 8, 9 i 10). Tako je imunomodulatorski učinak pomoćnog sredstva, za koje se zna da potiče TH2 reakcije bio potpuno premošten s prisustvom peptida na himernim CPMV. Također, odsutnost vanjskog pomoćnog sredstva u dijelu ovog ispitivanja služi da se naglasi svojstveno TH1-djelovanje same CPMV podloge (tablica 3, gore, redak 8).

Primjer 4

Peptidi derivirani iz raznih proteina uzrokuju pretežno za peptid specifičan TH1 tip antitijela u serumima kad se ekspresioniraju na CPMV neovisno o genetičkoj pozadini imunizirane individue.

Da bi se potvrdilo univerzalnu upotrebljivost CPMV kao nosača sposobnog za stvaranje TH1 tipa reakcije, i da bi se pokazalo da je imunološki učinak bio neovisan o genetičkoj konstituciji imunizirane individe, miševi različitih MHC razreda 11 haplo tipova inokulirani su sa CVP koji ekspresioniraju peptide derivirane iz brojnih, različitih izvora. CPMV-AGY2 (tablica 3, red 1) ekspresionira peptid iz teškog lanca humanog membranom vezanog imunoglobulina E (IgE); CPMV-EGFR1 (tablica 3, redak 2) ekspresionira peptid deriviran iz proteina, receptora epitelnog faktora rasta, prisutnog na humanim stanicama raka; CPMV-HCG3 (tablica 3, red 6) ekspresionira peptide derivirane iz humanog hormona, korioničkog gonadotrofina (hCGp); CPMV-PARVO9 (tablica 3, reci 3 i 4) ekspresionira peptid iz pasjeg parvo virusa, a CPMV-MAST1 (tablica 3, reci 8-12) i CPMV-PAE5 (tablica 3, red 7) ekspresioniraju peptide derivira iz proteina bakterijske membrane (iz S. aureus i P. aeruginosa). Upotrijebljene su četiri tipične mišje vrste različitih haplo tipova (genotipova); DBA/1 (H-2q); NIH (H-2s); C57BL/6 (H-2b); i Biozzi/ABH (H-2dql). Miševi su imunizirani subkutano s raznim CPV u prisutnosti QS-21 (10 μg/dozi; Aquila Biopharmaceutical Inc, Worcester, MA) u ukupnom volumenu od 100 μl/dozi. Aplicirane su 2 imunizacije na dane 0 i 21, ili 3 imunizacije na dane 0, 14 i 28 (vidi tablicu 3, gore). Krv je skupljena iz repa ili je uzeta na dan 42 kao gore; serumi su skupljeni i pohranjeni pri -20°C. Za detekciju anti-CPMV antitijela jamice su premazane s 0,1 μg/jamici CPMV tijekom 3 h pri 37°C. Nizovi dvostrukih razređenja seruma inkubirani su na pločicama premazanim s antigenom 1 h pri 37°C. Vezana antitijela su detektirana s alkalnom fosfatazom (AP)-konjugiranim kozji anti-mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 (Southern Biotechnologies Inc. USA) s p-nitrofenil fosfatom (PNPP) (Sigma) kao podlogom.

Ti reagenti anti-mišjeg izotipa najprije su titrirani prema standardnim proteinima mišjeg mijeloma koji predstavlja četiri IgG podrazreda. Razređenje od 1:2000 svakog konjugata daje manje od 10% promjene između vezanja mijeloma. To razređenje upotrijebljeno je u svim slijedećim pokusima. Titri završne točke izračunati su kao gore. Za CPMV specifične titre, rezultati su izraženi kao titri završne točke izračunati kao recipročne vrijednosti razređenja koje daje prosjek 00405 viši od 00405 dobivenog s razređenjem 1;50 seruma skupljenog iz neimuniziranih miševa. Za titre specifične za peptid, titri završne točke bili su recipročni razređenju koje daje prosjek OD405 viši od OD405 dobivenog s razređenjem 1:50 seruma skupljenog iz miševa imuniziranih s divljim tipom CPMV.

Pokazalo se je da sva 4 konstrukta uzrokuju visoke razine za peptid specifičnog IgG2a u usporedbi s razina IgG1 ili IgG3 (P<0,01 u svim slučajevima), unatoč prisutnosti poznatog TH2 imunomodulatorskog pomoćnog sredstva (to jest, QS21 ili alauna). Razine za peptid specifičnog IgG1 i IgG3 bile su odgovarajuće mnogo niže u svim skupinama imunizacije (tablica 3, gore). Neki CVP-i također proizvode značajne količine za peptid specifičnog IgG2b. Tamo gdje se to dešava, razine su bile niže od razina IgG2a, s izuzetkom CPMV-MAST1, koji u nekim slučajevima uzrokuje razine IgG2b koje su bile više od razina IgG2a (tablica 3, gore). Tako CVP uzrokuju pretežno za peptid specifičan TH1-tip reakcija za koje se čini da nisu pod utjecajem izvora niti sekvence ekspresioniranog peptida, niti prisutnosti pomoćnog sredstva TH2 imunomodulatorskog potencijala.

Međutim, bitno je da CVP u tim pokusima uzrokuje TH1 tip reakcija u miševima 4 različita H-2 haplo tipa. To pokazuje da učinak nije bio određen ili vođen genom (ili genima) imunosne reakcije. Drugim riječima, genetička sklonost individue nije bila inhibicijski faktor u sposobnosti CPMV-a da izazove TH1 djelovanje u imunosnoj reakciji izazvanoj s pojedinačnim peptidom. Posebno je bilo značajno da je učinak TH1 djelovanja u imunosnoj reakciji bio viđen kod Abiozzi/ABH miševa inokuliranim s CPMV-MAST1. Abiozzi/ABH miševi su genetički predisponirani da potiču reakciju u smislu TH2-djelovanja, čak prije mogućeg djelovanja učinaka vanjskih pomoćnih sredstava ili samih peptida koji su bili uzeti u obzir.

Stoga, dakle, CPMV-povezana TH I reakcija bila je sposobna preskočiti jake svojstvene genetičke faktore za koje se općenito smatra da određuju u značajnom opsegu imunosne reakcije individue. To je dalje naglašeno pomoću analize specifičnosti imunoglobulina iz podtipova staza TH1 i TH2. Manje od 1% proizvedenog IgG1 bilo je specifično za peptid, u usporedbi s 25-100% od ukupnog IgG2a u svim miševima u ispitnoj skupini. Ukratko, upotreba CPMV kao nosača i sistema za predstavljanje peptida može prevladati prepreke na razini genetike individue, čime je dobiveno sredstvo za nepotrebna genomna razmatranja cjepiva u konstrukciji profilaktičkih i terapeutskih sredstava.

Primjer 5

Predstavljanje peptida na česticama CPMV inducira TH1 djelovanje imunosnih reakcija u velikom području režima doziranja.

Iz razmatranja podataka titara za IgG u tablici 3, gore, jasno je da su više razine za peptid specifičnog IgG2a, (indikativne za TH1 tip reakcije) nego za peptid specifičnog IgG1 (indikativne za TH2 tip reakcije) stvorene prema nekoliko različitih antigena bez obzira je li u protokolu imunizacije upotrijebljena visoko ili nisko doziranje (u rasponu od 300 μg CVP pa dolje sve do 2 μg). Tako je daljnja prednost imunomodulatorskih karakteristika CPMV kao sitema nosača bila manja količina materiala potrebnog za pobuđivanje željenog tipa reakcije.

Primjer 6

CVPs uzrokuje TH1 tip reakcije bez obzira je li prisutan parenteralno ili u sluznici, što pokazuje da način aplikacije čestica ne utječe na narav imunosne reakcije koju se stimulira.

NIH miševi su imunizirani intranazalno sa CPMV-PARVO9, CVP-om koji pokazuje peptid deriviran iz VP2 proteina pasjeg parvo virusa. Za ovu inokulaciju, koja je izvršena izravno na površinu sluznice (vidi tablicu 3, red 3), nije upotrijebljeno nikakvo pomoćno sredstvo. Na dane 0 i 14 date su dvije doze, od kojih je svaka sadržavala 100 mg CVP-a. Na dan 42 krv je skupljena uglavnom kako je gore opisano i ispitana u pogledu prisutnosti imunoglobulina specifičnih za PARVO9 peptid (tablica 3; gore, skupina 4). Koncentracija antitijela specifičnog za peptid (VP2) izražena je kao postotak od ukupnog antitijela za svaki od 4 izotipa u pojedinačnom mišu, kako je prikazano u tablici 4. Također, u tablici 4 prikazane su i prosječne postotne vrijednosti za svaki od 4 izotipa.

Tablica 4.

Relativna koncentracija od ukupnih i za peptid specifičnih IgG izotipova in CVP-neimuniziranim miševima.

[image]

Iako su detektirane visoke razine ukupnog IgG1 i IgG3 (koji je bio gotovo isključivo CPMV specifičan), ukupne koncentracije IgG2a i IgG2b također su bile visoke, Osim toga, značajni udjeli bili su specifični za peptid (tablica 4, gore), što ponovno pokazuje djelovanje u smislu reakcija prema TH1 tipu i činjenicu da se takova reakcija može izazvati bez obzira na način davanja antigena prisutnog na CPMV.

Primjer 7

Upotreba himerne virusne čestice koja sadrži imunogenski kompleks za mijenjanje naravi postojeće imunosne reakcije

Postoje situacije u kojima su posebni antigeni prisutni kao cjepiva u prisutnosti pomoćnih sredstava koja uzrokuju pretežno TH2-tip reakcije. U stvari, do danas je provjeren samo alaun kao pomoćno sredstvo koje se smatra sigurnim za humane aplikacije cjepiva, što pokazuje da će mnoga cjepiva, koja će postati dostupna, sadržavati bezuvjetno faktor koji uzrokuje TH2-tip imunosne reakcije sa štetnim sporednim učincima. To potvrđuje potrebu za imunomodulacijom reakcije prema TH1 stazi i udaljavanjem od staze TH2 inducirane u takovim okolnostima. Budući da mnoga cjepiva zahtjevaju višestruke inokulacije da bi postala učinkovita, moguće je usmjeriti ishod promjene TH2 reakcije (koji je povezan s datim peptidom u podskupini cjepiva) da potiče TH1 tip reakcije pojačavanjem početne reakcije s formulacijom koja sadrži peptid koji predstavlja CPMV. Jačina imunomodulatorske dominacije podloge CPMV-a premošćuje snagu TH2 staze pomoćnog sredstva, premda se još uvijek postiže potrebno pojačanje imunosne reakcije prema dotičnom peptidu.

Da bi se to pokazalo, miševi su imunizirani s MAST1 proteinom (tablica 1) u prisutnosti alauna i/ili QS21 pomoćnog sredstva, da se inducira TH2 reakciju, kako je određena s razinama za protein specifičnog IgG. Ispitni miševi su zatim imunizirani s CPMV-MAST1, pri čemu kontrolni miševi nisu primili slijedeću imunizaciju. IgG razine u ispitnim i kontrolnim miševima su određene kako je gore opisano. Povišenje omjera za peptid specifičnog IgG1:IgG2a, IgG3:IgG2a, IgG1:IgG2b, i/ili IgG3/IgG2b u ispitnim životinjama u usporedbi s kontrolnim životinjama pokazuje da himerni virusi prema izumu prevladavaju TH2 reakciju koja je izazvana s pomoćnim sredstvom u primarnoj imunizaciji.

Primjer 8

Upotreba CPMV virusnih čestica, konstruiranih tako da ekspresioniraju i predstavljaju kemijski reaktivne peptide, za konjugaciju imunogenskih proteinskih i ne-proteinskih skupina, posebno ugljikohidratnih skupina.

Deoksiribonukleotidi, koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu formule DEGKGKGKGKDE (SEQ ID NO:29) klonirani su u vektor pCP2 koji odgovara cDNA kopiji RNA2 molekule virusa mozaične bolesti kravljeg graška. Umetanje je izvršeno tako da je reaktivan peptid umetnut u βB-βC petlju VP-S-a (manji od dva proteina omotača CPMV virusa) između alanina 22 i prolina 23, kako je prethodno opisano (U.S. patenti br. 5,958,422 i 5,874,087; od kojih je svaki u cijelosti uvršten kao literaturni izvor). Očišćeni ugljikohidrati su kemijski konjugirani na reaktivne ostatke lizina u peptidu i dobiveni ugljikohidratno konjugirani CVP-i su očišćeni afinitetnom kromatografijom upotrebom, na primjer, za ugljikohidrat specifičnog antitijela ili pomoću DEAE-celulozne kromatografije. Ugljikohidratno konjugirani CVP su inokulirani u miševe prema uglavnom istom režimu imunizacije kako je opisano gore u primjerima 2 i 3. Na dan 42 uzeta je krv iz repa i serumi su ispitani u pogledu IgG podrazreda specifičnog za ugljikohidrat. Pretežnost TH1 reakcije podrazreda IgG čini se dosljednom s dominacijom CPMV-a.

Primjer 9

Pomoću ELISPOT-a utvrđeno je da CVP-i aktiviraju B stanice u slezeni koje proizvode pretežno za CPMV- i za peptid specifičan IgG2a i IgG2b.

Skupljene su stanice slezene iz CPMV-MAST1 (tablica 3, red 10) u QS-21 imuniziranim miševima i crvene krvne stanice su odstranjene hladnom lizom u 0,8% NH4Cl. Stanice su isprane dva puta s RPMI 1640, zbrojene i ponovno suspendirane pri koncentracijama od 5xl06, 5x105, ili 5x104 životno sposobnih stanica/ml. Svaka stanična suspenzija (100 μl/jamici) dodana je u jamice IP ploče s 96 jamica Multiscreen Immobilon (Millipore. Ontario. Canada) koje su prethodno premazane preko noći pri 4°C sa CPMV ili s FnBP peptidom u sterilnom karbonatnom puferu, pH 9,6 i blokirane s RPMI 1640, koji je sadržavao 10% FCS tijekom 1 h pri 37°C. Jamice za negativnu kontrolu premazane su samo s puferom ili s irelevantnim kontrolnim peptidom. Stanice su inkubirane na pločicama 20 h pri 37°C i zatim su isprane tri puta s PBS. Vezana antitijela su detektirana s odgovarajućom alkalnom fosfatazom (AP)-konjugiranim kozji anti-mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b, ili IgG3 (Southern Biotechnologies Inc.). Nakon 2 h pri 37°C, pločice su isprane 4 puta s PBST-om i streptavidin-peroksidaza (100 μl/jamici) dodana je na 30 min pri 37°C. Zatim su isprane s PBST-om, i dodana je podloga Sigma FAST™ DAB (3,3'-diamino-benzidin tetrahidroklorid) (100 μl/jamici) dok se je razvila boja maksimalnog intenziteta. Pločice su oprezno isprane s vodovodnom vodom, i mrlje su izbrojene pomoću disekcijskog mikroskopa (Nikon SMZ-1). Rezultati su izraženi kao prosjek stanica koje tvore mrlju (e. spot-forming cells, SFC) za 106 stanica slezene (SFC/106 stanica slezene) ±SD za oboje, CPMV i peptid, kako je prikazano u tablici 5.

Tablica 5.

CVP-i aktiviraju B stanice u slezeni koje proizvode pretežno za CPMV i za peptid specifičan IgG2a i IgG2a.

[image]

a) C57BL/6 miševi su imunizirani subkutano s CPMV-MAST1 u QS-21 (tablica 3, red 10). Serumi su skupljeni na dan 42 i ispitani u pogledu CPMV- i FnBP-specifičnog IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3 pomoću ELISA. Titri su izraženi kao geometrijski prosjek titra završne točne ±SD.

b) Stanice slezene su skupljene i ispitane pomoću ELISPOT-a u pogledu prisutnosti SPC koje proizvode za CPMV i FnBP specifične IgG1, IgG2b, IgG2b ili IgG3. Rezultati su izraženi kao aritmetička sredina broja SFC/106 stanica slezene ±SD.

ELISPOT analize imunoglobulina uzrokovanih pomoću CPMV-MAST1 u QS21 pokazuju slične visoke brojeve IgG2a i IgG2b stanica koje tvore mrlje u slezenama imuniziranih miševa, suprotno mnogo nižim brojevima IgG1 i IgG3 SFCs (tablica 5). Ovdje su titri bili približno 4 puta viši za CPMV-specifična IgG2a i IgG2b antitijela i SFC u usporedbi sa za peptid (FnBP)-specifičnim antitijelom i SFC u tim miševima (tablica 5). Zanimljivo je, iako su razine za FnBP-specifičan IgG2a i IgG2b u serumima bile vrlo slične, da su mnogo viši brojevi SFC stanica koje proizvode IgG2a nego onih koje proizvode IgG2b detektirani u slezeni pomoću ELISPOT-a (tablica 5), što sugerira da CPMV-MAST1 daju veći broj B stanica koje proizvode FnBP-specifičan IgG2a. Tako, C57BL/6 miševi imunizirani sa CPMV-MAST1 uzrokuju vrlo visoke koncentracije pretežno CPMV-specifičnog IgG2a i IgG2b u serumu, s nižim ali značajnim razinama za CPMV-specifičnih IgG1 i IgG3 (tablica 5).

Primjer 10

CPMV-specifične T stanice u slezeni aktivirane sa CVP proliferaju se za proizvodnju IFN-γ (TH1-povezani citokin), a ne za IL-4 (TH2-povezani citokin).

Slezene iz miševa imuniziranih sa CVP odstranjene su 42 dana nakon prve imunizacije i pripravljene su jednostruke suspenzije stanica. Nakon ispiranja i lize crvenih krvnih stanica s hladnim 0,85%-tnim NH4Cl, skupljeni su splenociti iz 5 miševa i podijeljeni u jamice s okruglim dnom i ploči s 96 jamica (2 x 105/100 μl; Nunclon Delta Surface, Nunc. Denmark) u RPMI 1040 mediju (Gibco, Paisley, UK) koji je sadržavao 1 mM L-glutamina, 10 mM penicilin/streptomicina i 10% fetalnog goveđeg seruma (e. foetal calf serum, FCS). Stanice su uzgajane s 2,5 μg/ml konkanavalina A (ConA, Sigma) ili divljeg tipa CPMV (50 ili 5 μg/ml) 5 dana pri 37°C u 5% CO2. U posljednjih 12 h uzgoja dodano je 0,5 μCi/jamici (metil-3H) timidina (Amersham Life Science). Stanice su skupljene na filtere (Wallac Oy. Turku, Finland) i obrađene su za mjerenje upotrebom scintilacijske tekućine 1450 Microbeta Trilux i luminescentnog brojača (Wallac). Podaci su izraženi kao osni odsječci stimulacije, pri čemu su zbrojevi po minuti u prisutnosti pomoćnog sredstva podijeljeni sa zbrojevima dobivenim u odsutnosti antigena (samo medij). Vrijednost 3 ili veća smatrana je signifikantom. Stanice slezene iz miševa imuniziranih sa CPMV-MAST1 proliferane su vrlo jako in vitro za stimulaciju čak pri niskim koncentracijama (5 |μg/ml) CPMV, što pokazuje jako specifičnu indukciju T stanica posredovanu s nosačem peptida.

Skupljene stanice slezene su zatim uzgajane same ili sa ConA (2,5 μig/ml) ili s divljim tipom CPMV (50 ili 5 μg/ml) na pločicama s 24-jamice (5xl06/jamici u volumenu od 2 ml). Nakon 48 h, 0,5 ml supernatanta skupljeno je u Eppendorfove epruvete i pohranjeno pri -80°C. Supernatanti su ispitani u pogledu prisutnosti obojeg, IFN-γ i IL-4, pomoću ELISA uglavnom kako je gore opisano. Ukratko, ELISA pločice s 96 jamica (Immulon-4) su premazane preko noći s 2 p-g/jamici štakorskog mAb anti-mišjeg IPN-γ ili sa štakorskim mAb anti-mišjim IL-4 (obadva proizvodi tvrtka Pharmingen, San Diego. CA) pri 4°C. Makon blokiranja pločica s PBS-ora, koji je sadržavao 0,05% Tweena i 5% BSA, u svaku jamicu dodani su nizovi razređenja supernatanata kulture mišjih stanica slezene. Kao kontrole dodana su razređenja rekombinantnog mišjeg IFN-γ i IL-4 (Pharmingen), počevši sa 4 ng/ml i 15 ng/ml za IL-4 i IFN-γ. Nakon 1 h pri 37°C, vezani citokin je detektiran upotrebom biotiniliranog štakorskog anti-mišjeg IFN-γ ili anti-IL-4 mAb (oba od tvrtke Pharmingen) tijekom 1 h pri 37 °C. Ti mAb-i prepoznaju epitope na IFN-γ i IL-4 različite od mAb-a upotrijebljenih ranije u postupku za stupanj hvatanja. Streptavidin peroksidaza (Sigma; 2 Pg/ml) dodana je na 30 minuta pri 37 °C i zatim je dodana podloga 0-fenilendiamin (OPD) (1 mg/ml). Nakon 30 minuta pri 37°C, reakcija je zaustavljena dodatkom 50 μl/jamici 2,5 MH2SO4 i apsorbancija je očitana pri 492 nm upotrebom automatiziranog čitača Anthos HT II ELISA pločice. Rezultati su prikazni u tablici 6.

Tablica 6. CPMV stimulira proliferaciju i proizvodnju citokina pomoću stanica slezene fenotipa TH1.

(A)

[image]

(B)

[image]

a,b) C57BL/6 miševi su imunizirani subkutano sa CPMV-MAST1 u QS-21 (tablica 3, red 10). Stanice slezene iz tih miševa (A) i iz neimuniziranih miševa (B) su skupljene i uzgajane 5 dana same, ili s 2,5 μg/inl ConA ili 50 μg/ml CPMV. Proliferacija T stanica izražena je kao srednja CPM±SDa i SIb.

c,d) Supernatanti iz tih kultura su također ispitani u pogledu prisutnosti IFN-γc i IL-4d proteina pomoću ELISA. Rezultati su izraženi kao aritmetička sredina ng/ml±SD. (NT = nije ispitano).

Supernatanti iz te proliferacije stanica su pokazali da sadrže visoke razine IFN-γ i niske ili nedokazive razine IL-4 (tablica 6A). Neimunizirani miševi, prema usporedbi, ne sadrže za CPMV specifično antitijelo ili SFC (nije prikazano) i ne proliferiraju, niti ne proizvode IFN-γ ili IL-4 u reakciji na CPMV stimulaciju (tablice 6B).

Primjer 11

Konjugacija peptida

U ovom primjeru, himerni biljni virus prema izumu konstruiran je tako da ekspresionira reaktivan peptid koji sadrži cisteinski ostatak i koji se može konjugirati s bilo kojim peptidom koji je bio aktiviran upotrebom n-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estera ("MBS" kojeg se može dobiti od tvrtke Pierce).

Deoksiribonukleotidi koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu formule Arg-Glu-Arg-Glu-His-Cys (SEQ ID NO:30) klonirani su u vektor pCP2 koji odgovara kopiji cDNA iz RNA2 molekule virusa mozaične bolesti kravljeg graška. Umetanje je učinjeno tako da je reaktivan peptid umetnut u pb-pc petlju VP-S-a (manjeg od dva peoteina omotača CPMV virusa) između alanina 22 i prolina 23, kako je ranije opisano) (U.S. patenti br. 5,958,422 i 5,874,087; od kojih je svaki u cijelosti uvršten kao literaturni izvor).

Odabrana proteinska molekula koju se želi konjugirati na biljni virus prema izumu aktivirana je upotrebom MBS kako slijedi. Protein se otopi u puferu (na primjer, 0,01 M NaPO4, pH 7,0) do krajnje koncentracije od približno 20 mg/ml. Istovremeno, MBS se otopi u N,N-dimetil formamidu do koncentracije od 5 mg/ml. Otopina MBS-a, 0,51 ml, doda se k 3,25 ml otopine proteina i inkubira se 30 minuta pri sobnoj temperaturi uz miješanje svakih 5 minuta. Dobiveni MBS-aktivirani protein se zatim očisti kromatografijom na Bio-Gel P-10 stupcu (Bio-Rad; volumen podloge40 ml) uravnoteženim s 50 mM NaPO4, pH 7,0 puferom. Skupljene su vršne frakcije (6,0 ml).

Himerni biljni virus koji ekspresionira Arg-Glu-Arg-Glu-His-Cys (20 mg) doda se k otopini MBS-aktiviranog profeeina, miješa se dok se peptid otopi i inkubira se 3 sata pri sobnoj temperaturi. U roku od 20 minuta reakcijka smjesa postane mutna i nastane talog. Nakon 3 sata reakcijsku smjesu se centrifugira 10 min pri 10.000 x g i supernatant se analizira u pogledu sadržaja proteina. Talog konjugata se ispere tri puta s PBS i pohrani pri 4°C. Dobiveni očišćeni s proteinom konjugirani CVP-i se inokuliraju u miševe uglavnom istim režimom imunizacije kako je opisano gore u primjerima 2 i 3. Krvi iz repova uzete su na dan 42 i serumi su ispitani u pogledu podrazreda IgG podrazreda specifičnog za ugljikohidrat. Vidi se da je pretežnost TH1 reakcije IgG podrazreda dosljedna s imunomodulatorskom dominancijom CPMV-a.

Iz gornjeg je jasno da izum osigurava metode i pripravke koji su učinkoviti u moduliranju naravi i/ili razine imunosne reakcije prema svakoj dotičnoj molekuli, ali nije ograničen na antigen ili imunogen. Posebno, ovdje prikazani podaci pokazuju da izum daje metode i sredstva za poticanje TH1 djelovanja u imunosnoj reakciji prema molekulama kao što su antigeni ili imunogeni i/ili redukcija TH2 djelovanja u imunosnoj reakciji prema takovim molekulama. Pobliže, gornji opis pokazuje da izum osigurava metode i sredstva za povećavanje TH1 imunosne reakcije koja je usmjerena protiv molekula koje inače općenito stimuliraju TH2-tip reakcije. Iz gornjega je također jasno da izum nadalje daje pripravke i metode za redukciju TH2 imunosne reakcije prema molekulama. Gornji opis dodatno pokazuje da izum daje pripravke i metode za mijenjanje (to jest smanjenje ili povećanje) razine TH1- i TH2-povezanih imunoglobulina, razine proliferacije TH1- i TH2-povezanih citokina, i razine proliferacije TH1 i TH2 stanica.

Sve publikacije i patenti spomenuti u gornjem opisu uvršteni su ovdje kao literatura. Razne modifikacije i inačice opisanih metoda i sistema izuma biz će očigledne stručnjaku bez udaljavanja od svrhe i smisla izuma. lako je izum opisan pomoću specifične prednosne izvedbe, podrazumijeva se da se on prema zahtjevima ne smije nepotrebno ograničiti na takovu specifičnu izvedbu. U stvari, razne modifikacije opisanih načina provedbe izuma, koje su stručnjaku za ovo i srodna područja očigledne, predviđene su u okviru smisla slijedećih patentnih zahtjeva.

Slijedeći upotrebljivi biljni virusni vektori su pohranjeni u American Tip Culture Collection (ATCC), Rockville, MD., USA, pod uvjetima Budimpeštanskog ugovora (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure i Regulations thereunder): pTB2 (ATCC No. 75280) i pTBU5 (ATCC No. 75281). Pojedinosti konstrukcije za ove plazmide iznesene su u U.S. patentu br. 5,589,367 koji je ovdje uvršten kao literturni izvor.

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

[image]

Claims (23)

1. Postupak za povećanje razine TH1 tipa imunosne reakcije na određenu molekulu u životinji, naznačen time, da uključuje a) osiguranje i) dotične molekule; ii) biljnog virusa koji ekspresionira heterologni peptid sposoban za konjugaciju na spomenutu dotičnu molekulu; i iii) životinje domaćina; b) konjugaciju dotične molekule na spomenuti heterologni peptid čime se dobije konjugat; c) davanje spomenutog konjugata spomenutoj životinji domaćinu, čime se dobije liječenu životinju pod takovim uvjetima, da razina TH1 tipa imunosne reakcije na dotičnu molekulu poraste u usporedbi s razinom TH1 tipa imunosne reakcije na spomenutu dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji; d) prema potrebi, ispitivanje povećanja razine TH1 tipa imunosne reakcije na spomenutu dotičnu molekulu u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1 tipa imunosne reakcije na spomenutu dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji; i e) prema potrebi, promatranje porasta razine TH1 tipa imunosne reakcije na spomenutu dotičnu molekulu u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1 tipa imunosne reakcije na spomenutu dotičnu molekulu u kontrolnoj životinji.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je spomenuta povišena razina TH1 tipa imunosne reakcije odabrana između (a) povišene razine TH1-povezanog imunoglobulina u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog imunoglobulina u kontrolnoj životinji; (b) povišene razine proliferacije TH1 stanica u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom proliferacije TH1 stanica u kontrolnoj životinji; i (c) povišene razine TH1-povezanog citokina u spomenutoj liječenoj životinji u usporedbi s razinom TH1-povezanog citokina u kontrolnoj životinji.

3. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1 i 2, naznačen time, da je spomenuti TH1-povezani citokin odabran između IL-2, TNF-β i IFN-γ.

4. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-3, naznačen time, da spomenuta aplikacija ima za posljedicu smanjenje simptoma povezanih s izlaganjem spomenute životinje domaćina spomenutoj određenoj molekuli.

5. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-4, naznačen time, da je spomenuta određena molekula peptid, polisaharid, nukleinska kiselina ili lipid.

6. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-5, naznačen time, da je spomenuta određena molekula derivirana iz izvora odabranog između životinjskog patogena, alergena i stanice raka.

7. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-6, naznačen time, da je spomenuti biljni virus ikozaedarski biljni virus odabran između komo virusa, tombus virusa, sobemo virusa i nepo virusa.

8. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-7, naznačen time, da spomenuti biljni virus je komo virus.

9. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-8, naznačen time, da spomenuti komo virus je virus mozaične bolesti kravljeg graška (CPMV).

10. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-9, naznačen time, da je spomenuti heterologni peptid ekspresioniran na izloženom dijelu proteina omotača spomenutog biljnog virusa.

11. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-10, naznačen time, da spomenuti heterologni peptid uključuje jednu ili više amino kiselina s nabojem, odabranih između amino kiselina s negativnim nabojem i amino kiselina s pozitivnim nabojem, pri čemu je negativan naboj na spomenutim amino kiselinama s negativnim nabojem uravnotežen s pozitivnim nabojem na spomenutim amino kiselinama s pozitivnim nabojem.

12. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-11, naznačen time, da su spomenute amino kiseline s negativnim nabojem odabrane između aspartinske kiseline, glutaminske kiseline i cisteina, a spomenute amino kiseline s pozitivnim nabojem su odabrane između lizina, arginina i histidina.

13. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-12, naznačen time, da heterologni peptid uključuje sekvencu susjednih amino kiselina s nabojem, odabranih između prve sekvence, koja se sastoji od susjednih amino kiselina s negativnim nabojem i druge sekvence, koja se sastoji od susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem.

14. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-13, naznačen time, da se spomenuta sekvenca susjednih amino kiselina s nabojem pojavljuje u spomenutom heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca.

15. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-14, naznačen time, da spomenuta heterologna sekvenca uključuje spomenute prvu i drugu sekvencu, pri čemu je spomenuta prva sekvenca susjedna do spomenute druge sekvence.

16. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-15, naznačen time, da spomenute susjedne prva i druga sekvenca nastaju u spomenutom heterolognom peptidu kao ponavljajuća sekvenca.

17. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-11, naznačen time, da spomenuti heterologni peptid uključuje ne-susjedne amino kiseline s negativnim nabojem i ne-susjedne amino kiseline s pozitivnim nabojem, i pri čemu spomenuti heterologni peptid, nadalje, uključuje sekvencu susjednih amino kiselina s nabojem, odabranu između prve sekvence koja se sastoji od susjednih amino kiselina s negativnim nabojem i druge sekvence koja se sastoji od susjednih amino kiselina s pozitivnim nabojem.

18. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-17, naznačen time, da spomenuta prva sekvenca susjednih amino kiselina s negativnim nabojem ima opću formulu Asp-Glun-Gly-Lys2n-Asp-Glun navedenu kao SEQ ID No:16, gdje n predstavlja cijeli broj od 1 do 40.

19. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-18, naznačen time, da je aplikacija odabrana između intranazalne, parenteralne, subkutane, intratekalne, intravenske, intraperitonealne i intramuskularne aplikacije.

20. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-19, naznačen time, da spomenuta aplikacija uključuje, nadalje, davanje sastava odabranog između imunosnog pomoćnog sredstva, citokina i farmaceutskog pomoćnog sredstva.

21. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-20, naznačen time, da je spomenuta životinja domaćin sisavac.

22. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-21, naznačen time, da je spomenuti sisavac odabran između miševa i ljudi.

23. Postupak prema bilo kojem zahtjevu 1-22, naznačen time, da je spomenuti konjugat imunogenski.