JP2023540778A - Ａｃｅ２結合力が減少したコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン変異体及びこれを含むワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＡＣＥ２結合力が減少した新規の受容体結合ドメイン変異体、これを含む融合タンパク質及びその用途に関するものであって、既存のコロナウイルスのスパイクタンパク質又はその受容体結合ドメインを使用したワクチンが有するＡＣＥ２との結合によるＡＣＥ２の発現減少によって肺又は心臓の副作用をもたらすおそれがあり、特に、肺又は心臓の基礎疾患を病んでいる患者に致命的であり得るという短所を克服することができる。特に、本発明の受容体結合ドメイン及びＦｃを結合した融合タンパク質は、生体内の半減期が非常に向上し、追加的なモディフィケーションを通じてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質、Ｍタンパク質、ＯＲＦタンパク質などを結合し、より優れた効能を有する多価免疫原性組成物への活用可能性が高い。よって、本発明の受容体結合ドメイン変異体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を始めとしたコロナウイルス感染症の予防及び治療に有用である。
【選択図】 図２

Description

本発明は、ＡＣＥ２結合力が減少した新規のコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン変異体、これを含む融合タンパク質及びその用途に関する。

コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）は、ＲＮＡウイルスの一種類として、遺伝情報がリボ核酸（ＲＮＡ）からなるウイルスであって、人と動物の呼吸器と消化器系の感染を誘発する。主に、コロナウイルスは、粘膜伝染、飛沫伝播などで容易に感染し、人は、一般に軽微な呼吸器感染を起こすが、致命的な感染を起こすことも稀にある。

重症急性呼吸器症侯群－コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、中国の武漢で出現して以来、全世界に迅速に拡散されており、ＷＨＯは、該当のウイルスに感染した疾患をＣＯＶＩＤ－１９と命名した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染が拡散されながら、ＷＨＯは、１月３０日に「国際的公衆保健非常事態」（ＰＨＥＩＣ）を宣布し、コロナ１９確診者が全世界で続出することから、ＷＨＯは、３月１１日に、ホンコン風邪（１９６８）及び豚インフルエンザ（２００９）に続いて、史上３番目にコロナ１９に対してペンデミック（世界的大流行）を宣布した。

全世界的に約１億人の患者が発生し、約２００万人が死亡しており、毎日数万人から数十万人の確診患者が追加され、持続的に感染患者が増加する趨勢にある（２０２１年１月１８日基準、ＣＯＶＩＤ－１９ Ｄａｓｈｂｏａｒｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＣＳＳＥ） ａｔ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＪＨＵ））。韓国でも、約７万人の確診患者が発生しながら地域社会を通じた感染で拡散され、毎日数百人の確診患者が追加されており、合計１２６４人の死亡者が報告された（２０２１年１月１８日基準、大韓民国の中央災難安全対策本部）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染すると、発熱（８３％～９９％）、咳（５９％～８２％）、食慾不振（４０％～８４％）、疲労（４４％～７０％）、呼吸困難（３１％～４０％）、痰及び咳（２８％～３３％）、筋肉痛及びその他の痛症（１１％～３５％）などの症状が表れると知られており（Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）．６ Ａｐｒｉｌ ２０２０．）、２日～１４日以内の潜伏期を経た後、上記の各症状が発現されると報告された。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、伝染力が非常に高く、一般に、直接／間接的な接触、感染者から排出されたエアロゾル形態の飛沫などを介して伝播されるものとして知られており、一部の場合では、無症状者からの伝染も可能なものとして報告される（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ３０ Ａｐｒｉｌ ２０２０．）。また、完治した後にも、後遺症に苦しんだり再感染する事例が続々と報告されている。よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染予防が特に強調されており、このために、個人的／社会的次元で、マスク着用、手洗い、社会的距離置きなどを積極的に行っているが、教会を始めとした多様な地域で感染する事例が発生しており、その経路が不明確であるので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの開発が至急な状況である。現在、多様な機関でワクチン候補物質を開発及び研究中にあり、組換えワクチン、非活性ウイルスワクチン、ｍＲＮＡワクチンなどの多様な形態のワクチンが臨床試験中にあり、最近、ファイザー、モデルナ、アストロゼネカなどの製薬社で開発した少数のワクチンが緊急に承認されて接種されているが、需要に比べて生産及び供給が極めて不足している状況であり、多くの変種コロナウイルスが続々と登場し、新しいワクチン開発が持続的に要求されている。

一方、ＡＣＥ２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２）は、前炎症性物質であるアンジオテンシンＩＩを分解し、炎症から腎臓、肺、心臓を保護するものとして知られている。前記ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス系列の細胞進入過程で、ウイルスの受容体として重要な役割をするものとして知られている。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＡＣＥ２とスパイクタンパク質（Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）との結合を中心に、細胞内作用及びＴＭＰＲＳＳ２との共同作用による直接融合の二つのメカニズムを通じて作用するものとして報告された（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２０，２１，５２２４；１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０２．０５２など）。よって、現在研究される多くの治療剤及びワクチンの開発戦略は、スパイクタンパク質を標的としており、特に、ほとんどのワクチンの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対する中和抗体の形成を目的とする。

病原体の遺伝子情報を用いて病原体の抗原決定部位のみを別途に生産し、これを注入する組換えワクチンの場合、ほとんどのスパイクタンパク質又はその断片、特にＡＣＥ２に結合する受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）を抗原として注入し、スパイクタンパク質又はＲＢＤに対する中和抗体の形成を通じた抗体媒介ウイルス中和効果を薬理メカニズムとする。

特に、前記受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）は、スパイクタンパク質に含まれたＡＣＥ２と結合する特定配列のアミノ酸であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型受容体結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）が報告されており、その結合構造に対する研究結果が持続的に報告されている（Ｎａｔｕｒｅ．３０ Ｍａｒｃｈ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．３ Ａｐｒｉｌ；Ｃｅｌｌ．９ Ａｐｒｉｌ）。

しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のように、ＡＣＥ２結合を通じた細胞進入メカニズムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する従来の研究において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイクタンパク質がＡＣＥ２に結合する場合、陰性フィードバック（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ）を通じて急性肺不全で保護的な役割をするＡＣＥ２の発現を減少させ、これを通じて肺での病状を悪化させると報告されたことがある（Ｋｅｉｊｉ ｅｔ ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，２００５）。これに加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による死亡は、主に心不全及び急性腎臓損傷によるものと報告されており、最近、ＡＣＥ２遮断剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶによる急性肺損傷を予防する効果を示すことを確認し、現在、ＣＯＶＩＤ－１９の治療剤として臨床試験が進行中にある。よって、スパイクタンパク質とＡＣＥ２との相互作用は、コロナウイルスの細胞進入（感染）以外にも、ＡＣＥ２発現減少による肺又は心臓での病状発現及び悪化に影響を及ぼすものと理解される（Ｇｒｉｆｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０２０）。

このような各報告に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又は受容体結合ドメインを免疫原として使用するワクチンを人体に投与する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の形成を誘導するのとは別個に、スパイクタンパク質又は受容体結合ドメインがＡＣＥ２と結合することができ、前記報告のように、ＡＣＥ２の発現減少などの病理メカニズムを通じて肺と心臓で急性損傷及び不全などの副作用を示すおそれがある。このような副作用は、特に、肺又は心臓に基礎疾患のある患者にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又は受容体結合ドメインを免疫原として使用するワクチンを投与する場合、ＡＣＥ２の発現減少及びこれによる致命的な副作用を誘発し得るという短所がある。

このような背景技術下で、本発明者等は、コロナウイルス由来のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインとＡＣＥ２との結合による肺又は心臓での副作用を克服したコロナウイルスの予防又は治療用ワクチンを開発するために鋭意努力した結果、受容体結合ドメインの一部のアミノ酸配列が置換された変異体が野生型受容体結合ドメインより低い親和力を示し、ＡＣＥ２の発現減少を示さないことを確認し、前記変異体とＦｃタンパク質及び／又は他のコロナウイルス由来のドメインの融合タンパク質をマウス及びサル動物モデルで免疫原として使用する場合、野生型受容体結合ドメインを含む融合タンパク質と比較して著しく高い受容体結合特異的中和抗体形成力価を示し、高いコロナウイルス中和能力を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。

本背景技術部分に記載の前記情報は、本発明の背景に対する理解を向上させるためのものに過ぎないので、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている先行技術を形成する情報を含まない場合がある。

本発明の目的は、ＡＣＥ２との結合力が減少したコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン変異体及びその用途を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質及びその用途を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質を有効成分として含有する単価又は多価の免疫原性組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、コロナウイルスの予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、コロナウイルス感染症の予防のためのワクチン接種方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、コロナウイルス感染症の予防又は治療方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質をコーディングする核酸を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記核酸を含む組換えベクターを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記核酸又は組換えベクターが導入された宿主細胞を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質の製造方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、ＡＣＥ２受容体に対する結合力が減少したコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）変異体を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質を含むワクチン組成物を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質のワクチン組成物の製造のための用途を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体、融合タンパク質及び／又はワクチン組成物を対象に投与する段階を含むコロナウイルス感染症に対するワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）方法を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質を有効成分として含むコロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質のコロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物の製造のための用途を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体、融合タンパク質及び／又は薬学組成物を対象に投与する段階を含むコロナウイルス感染症の予防又は治療方法を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質のコロナウイルス感染症の予防又は治療用途を提供する。

また、本発明は、前記受容体結合ドメイン変異体又は融合タンパク質をコーディングする核酸を提供する。

また、本発明は、前記核酸を含有する組換えベクターを提供する。

また、本発明は、前記核酸又は組換えベクターが導入された宿主細胞を提供する。

また、本発明は、前記宿主細胞を培養する段階を含む受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質の製造方法を提供する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とＡＣＥ２との結合構造を示した図である（Ｎａｔｕｒｅ．３０ Ｍａｒｃｈ）

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の野生型ＲＢＤのアミノ酸配列を示した図であって、陰影は、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を示し、青色のボックスは、ＭＨＣ Ｉ及びＩＩに対するエピトープを示し、赤色のアミノ酸は、本発明の実施例でスクリーニングされた変異部位を示す。

実施例で製造した野生型ＲＢＤ又はＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質を模式的に示した図である。

ＩｇＧ１－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＲＢＤｗｔ－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

Ｆｃ－ＲＢＤｗｔの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

Ｎ－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＲＢＤｍ（Ｑ１７５Ａ、Ｎ１８３Ａ）－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＲＢＤｍ（Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ）－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

Ｆｃ－ＲＢＤｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＲＢＤｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＲＢＤｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ）－Ｆｃの模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｇ１８４Ｄ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

Ｆｃ－ＲＢＤｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ）の模式図である。

ＧＩＣ－１１１４Ｎの模式図である。

ＧＩＣ－１１１４Ｎｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図である。

ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ）の模式図である。

ＧＩＣ－１１５１の模式図である。

ＧＩＣ－１１５１ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１３２ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

ＧＩＣ－１１３３ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の模式図（左側）及び製造産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果（右側）を示す図である。

多様な濃度の指示された融合タンパク質のＡＣＥ２受容体に対する時間による結合親和度を示したグラフ（各項目の上端）及び結合親和度を定量した値を示す図である。

単一濃度の指示された融合タンパク質のＡＣＥ２受容体に対する時間による結合親和度を示したグラフである。

指示された融合タンパク質のｈＡＣＥ２受容体に対する結合効率を示した図である。

指示された融合タンパク質の処理時、ＨＥＫ２９３細胞でｈＡＣＥ２発現減少（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を確認したことを示す図である。

マウス動物モデルを対象にした本発明の融合タンパク質を使用したワクチン接種を概略的に示した図である。

野生型ＲＢＤ、Ｆｃドメイン及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質を含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４）又はＲＢＤ変異体（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）、Ｆｃドメイン及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質）（ＧＩＣ－１１１４ｍ）を単独で又はアジュバントと共にマウス動物モデルにワクチン接種した場合、ＲＢＤ特異的中和抗体形成力価を確認したことを示す図である。

ａｄｄａｖａｘをアジュバントとして用いてＧＩＣ－１１５１ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）をマウスに接種してから４週後に得た血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ特異的中和抗体形成力価を示した図である。

サル動物モデルを対象にした本発明の融合タンパク質を使用したワクチン接種を概略的に示した図である。

ＧＩＣ－１１１４又はＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）をアジュバント（ａｄｄａｖａｘ）と共にサル動物モデルにワクチン接種した場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的中和抗体形成力価を確認したことを示す図である。点線は、ＵＳＦＤＡが告示したワクチンとして有意味なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質標的抗体の力価数値（２８８０ ｔｉｔｅｒ）を示す（ＵＳＦＤＡ、Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ）。

ＧＩＣ－１１１４又はＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）をアジュバント（ａｄｄａｖａｘ）と共にワクチン接種してから４週目に採取したサルの血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能力をｓＶＮＴを通じて確認した結果を示す図である。

ＧＩＣ－１１１４又はＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）をアジュバント（ａｄｄａｖａｘ）と共にワクチン接種してから８週目に採取したサルの血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能力をｓＶＮＴを通じて確認した結果を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。但し、下記の詳細な説明は、本発明に対する例示として提示されるものであって、これによって本発明が制限されることはなく、本発明は、後述する特許請求の範囲の記載及びそれから解釈される均等範疇内で多様な変形及び応用が可能である。

他の方式で指示されない限り、核酸及びアミノ酸は、左側から右側にそれぞれ５’から３'及びＮ－末端からＣ－末端配向に記録される。明細書内で列挙した数値範囲は、範囲を定義する数字を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数又は任意の非整数分画を含む。

他の方式で定義されない限り、本願で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者が通常的に理解するのと同一の意味を有する。本願に記述されたものと類似又は等価の任意の方法及び材料が本発明をテストするための実行で使用され得るが、好ましい材料及び方法が本願で記述される。

２０１９年１２月に中国で最初に発見された新しいコロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、現在、全世界的に１億人の確診患者と数十万人の死亡者を発生させながら大流行している。このような状況の中でも、未だに効能が完璧に立証された治療剤及びワクチンが非常に不足し、多くの研究者及び企業が治療剤とワクチンの開発に多くの努力を傾けている。

現在開発されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、ほとんどがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染（細胞進入）及び症状発現メカニズムに最も大きな役割を占めるものと報告されるスパイクタンパク質又はその断片を免疫原とし、中和抗体を生成することを目的とする。
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と非常に類似するメカニズムを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対する報告、及び最近のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＡＣＥ２の役割に対する多くの研究でスパイクタンパク質がＡＣＥ２に結合する場合、ＡＣＥ２の発現を減少させることができ、肺又は心臓でのＡＣＥ２の発現減少は、病状の悪化を誘発し得ると報告されている（Ｋｅｉｊｉ ｅｔ ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，２００５；Ｇｒｉｆｏｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０２０）。よって、スパイクタンパク質又はその断片を免疫原とするワクチン組成物は、肺又は心臓などで副作用を示す可能性が高く、特に、基礎疾患を有する患者に投与される場合に致命的であり得るという短所を有する。

本発明の一実施例では、このようなスパイクタンパク質又はその断片を免疫原とするワクチンの短所を克服するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインとＡＣＥ２との結合構造の分析に基づいて受容体結合ドメインの受容体結合モチーフアミノ酸に変異を誘導し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン変異体を製造し、前記受容体結合ドメイン変異体は、野生型に比べてＡＣＥ２に対する結合力が低く、陰性フィードバックによるＡＣＥ２発現が減少することを確認した。

本発明の更に他の実施例において、本発明の受容体結合ドメイン変異体を含む多様なＦｃ融合タンパク質を製造し、これを使用して哺乳類動物モデル（マウス、サル）を対象にしてワクチン療法（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）を行った結果、非常に高いレベルの中和抗体形成及びＴ細胞免疫反応誘導が可能であり、コロナウイルス感染に対する優れた予防及び治療効果を示すことができることを確認した。

したがって、本発明は、一観点において、ＡＣＥ２受容体に対する結合能力が減少したコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）変異体に関する。

前記「受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）」は、コロナウイルスのスパイクタンパク質において受容体であるＡＣＥ２と結合する特定のアミノ酸配列を意味し、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含む。前記受容体結合ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質のドメインであることが好ましく、一例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の受容体結合ドメインの野生型アミノ酸配列（配列番号１）が報告されたことがある（Ｎａｔｕｒｅ．３０ Ｍａｒｃｈ）。

本発明の用語である「受容体結合モチーフ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ、ＲＢＭ）」は、受容体結合ドメイン（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ、ＲＢＤ）に含まれたアミノ酸配列であって、受容体であるＡＣＥ２と接触する部位を含み、一例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の受容体結合モチーフの野生型アミノ酸配列（配列番号１の１２０～１８８アミノ酸）が報告されたことがある（Ｎａｔｕｒｅ．３０ Ｍａｒｃｈ）。

コロナウイルスのスパイクタンパク質は、コロナウイルスの細胞感染に最も重要な役割をするだけでなく、ウイルスの組換え及びリリースにも非常に重要な役割をするものとして知られている。特に、受容体結合ドメインは、スパイクタンパク質の受容体であるＡＣＥ２との結合及び相互作用に直接関与するドメインであって、コロナウイルスの種間に高度にその配列が保存されていることを特徴とする。

本発明において、受容体結合ドメイン又は受容体結合モチーフは、現在報告されたコロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン又はモチーフのみならず、遺伝子に変異を含む変種コロナウイルスのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン又はモチーフ配列であり得る。

本発明において、前記受容体結合ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来であることが好ましいが、これに制限されない。

本発明において、受容体結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列で表示されるものであり得るが、これに制限されるものではなく、これと高い相同性を示す配列、例えば、配列番号１と８０％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列であり得る。

本発明に係る受容体結合ドメインは、特定のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が保存的に置換された変異体又はその切片も含む意味で解釈される。

本明細書において、「保存的置換」とは、１個以上のアミノ酸を該当の受容体結合ドメイン変異体の生物学的又は生化学的機能の損失をもたらさない類似する生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含む受容体結合ドメインの変形を意味する。

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを意味する。例えば、類似する側鎖を有するアミノ酸残基部類は、該当の技術分野によく知られている。これらの部類は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

本発明において、前記受容体結合ドメインは、受容体結合モチーフを中心にＡＣＥ２と結合される。よって、本発明において、受容体結合ドメインモチーフ以外のアミノ酸配列に保存的置換が発生することが好ましいが、これに制限されない。

本発明において、「受容体結合ドメイン変異体」は、野生型受容体結合ドメイン配列において一部のアミノ酸残基の変異、好ましくは、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入などを含むだけでなく、Ｎ－末端又はＣ－末端での一部のアミノ酸残基の切断などを全て含む概念で使用され、よって、本発明において、受容体結合ドメイン変異体は、「受容体結合ドメイン変異体の切片」を含む広義の概念で使用される。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、受容体結合モチーフのアミノ酸配列に変異を含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のＬ１３７、Ｇ１６４、Ｖ１６５、Ｆ１６８、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｎ１８３及びＧ１８４で構成された群からいずれか一つ以上のアミノ酸での変異を含むことを特徴とすることができ、好ましくは、Ｌ１３７、Ｆ１６８、及びＧ１８４で構成された群からいずれか一つ以上、さらに好ましくは、Ｌ１３７及びＦ１６８のアミノ酸での変異；及びＧ１８４のアミノ酸での変異；で構成された群から選ばれるいずれか一つ以上の変異を含むことができ、最も好ましくは、Ｌ１３７及びＦ１６８のアミノ酸での変異を含むことを特徴とすることができるが、これに制限されない。

本発明において、前記変異は、置換、欠失、挿入などのアミノ酸突然変異、アミノ酸の糖鎖化、側鎖の置換などを全て含む最広義の概念である。

本発明において、前記変異は、アミノ酸の置換であることを特徴とすることができる。

本発明において、前記変異は、ＡＣＥ２受容体に対する結合力を減少させるものであれば、アラニン以外にも、アルラニンと類似する側鎖を有するアミノ酸残基又は他のアミノ酸残基への置換が可能であって、例えば、リシン、チロシン、スレオニン、アスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなどに置換されるものであり得るが、これに制限されない。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｌ１３７Ａ、Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ及びＧ１８４Ｄから選ばれる一つ以上のアミノ酸残基の置換を含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａのアミノ酸置換；及びＧ１８４Ｄのアミノ酸置換；で構成された群から選ばれるいずれか一つ以上の置換を含むことがさらに好ましく、最も好ましくは、Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａのアミノ酸置換を含むことを特徴とすることができるが、これに制限されない。

本発明において、前記受容体結合ドメインが配列番号１と異なるアミノ酸配列を有する場合（例えば、スパイクタンパク質に変異を有する変種コロナウイルスの受容体結合ドメイン）、又はその切片である場合、通常の技術者は、配列の整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及び分析などを通じて上記のアミノ酸に相応するアミノ酸を容易に導出することができる。この場合、本発明の受容体結合ドメイン変異体は、前記記載のアミノ酸に相応するアミノ酸のうちいずれか一つ以上で変異を含むことを特徴とすることができることは自明である。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、生物学的特性又は物理／化学的特性の変形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）のために、他のポリペプチド、タンパク質又は糖、ＰＥＧなどの構造体と融合されて使用されることを特徴とすることができる。

本発明において、「Ｌ１３７」のように１文字（ｏｎｅ ｌｅｔｔｅｒ）のアミノ酸残基名と数字（ｎ）が共に記載された表現は、各アミノ酸配列での該当のｎ番目の位置でのアミノ酸残基及び種類を意味する。

例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、「Ｌ１３７」は、配列番号１の１３７番目の位置でのアミノ酸残基がアスパラギンであることを意味する。「Ｌ１３７Ａ」のように、数字の後のアミノ酸残基名はアミノ酸の置換を意味し、前記「Ｌ１３７Ａ」は、配列番号１の１３７番目の位置でのロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）がアラニン（Ａｌａ、Ａ）に置換されたことを意味する。

本発明の一実施例において、前記受容体結合ドメイン変異体を免疫グロブリンのＦｃドメインと連結し、融合タンパク質を製造した。前記融合タンパク質は、生物学的活性損失が最小化されながらも、半減期の増加、発現レベルの増加などの生物学的特性の向上を示すことができる。

したがって、本発明は、他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質に関する。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体以外に、他の物質を追加的な構成で含むことができる。例えば、Ｆｃドメイン、コロナウイルス由来の物質（好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の物質）、リンカー、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）、抗原、抗体などを含み得るが、これに制限されない。

本発明において、前記コロナウイルス由来の物質は、コロナウイルス由来のタンパク質、核酸（好ましくは、ＲＮＡ）、多糖体などのコロナウイルスから由来する全ての物質を意味する。

本発明において、コロナウイルス由来の物質は、コロナウイルス由来のタンパク質又はその切片であり得る。また、コロナウイルス由来の物質は、より好ましくは、コロナウイルス由来のＮタンパク質又はＭタンパク質、さらに好ましくは、コロナウイルス由来のＮタンパク質又はそのＲＮＡ結合ドメインであることを特徴とすることができる、

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体以外に、二つ以上の物質を含むことを特徴とすることができ、同一の受容体結合ドメイン変異体を二つ以上含んだり、他の物質を二つ以上含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記コロナウイルスは、コロナウイルス亜科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）属に属するＲＮＡウイルスを意味する（Ｎｉｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ．８０６－８２８頁）。前記コロナウイルス亜科は、アルファ／ベータ／ガンマ／デルタコロナウイルスの４個の属に区分され得る。例えば、人間に感染が可能なヒトコロナウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３などがあるが、これに制限されない。

本発明の一実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン及びヌクレオカプシドタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを融合したタンパク質を製造したが、コロナウイルスは、スパイクタンパク質とその受容体であるＡＣＥ２との結合で宿主の細胞内に進入及び感染させ、特に、各種間のＳ１サブユニットに含まれた受容体結合ドメインは高度に保存されているので、本発明の融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の受容体結合ドメイン及びＲＮＡ結合ドメインにのみ限定されないことは自明である。

本発明において、前記コロナウイルス由来の物質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から由来したことを特徴とすることができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質、Ｍタンパク質又はＯＲＦタンパク質などがあり得る。また、本発明の融合タンパク質には、Ｍタンパク質が含まれることが好ましいが、これに制限されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体とコロナウイルス由来の物質とが連結されたことを特徴とすることができる。

本発明において、さらに好ましくは、前記融合タンパク質は、前記受容体結合ドメイン変異体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質とが連結されたことを特徴とすることができ、最も好ましくは、Ｎタンパク質のＲＮＡ結合ドメインが連結されたことを特徴とすることができる。

本発明の一実施例では、２個の受容体結合ドメイン変異体及び２個のＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインがリンカーで連結された融合タンパク質（図２２及び図２３を参照）を製造し、その免疫原性を試験したが、これに制限されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、ＲＮＡ受容体結合ドメイン変異体－Ｎタンパク質（又はそのＲＮＡ結合ドメイン）－Ｎタンパク質（又はそのＲＮＡ結合ドメイン）－ＲＮＡ受容体結合ドメイン変異体の順に連結されたことを特徴とすることができる。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体と、Ｎタンパク質及びＭタンパク質のうちいずれか一つ以上とが共有結合を通じて直接連結されてもよく、リンカー、タンパク質、多糖体などの連結器を介して間接的に連結されてもよい。

本発明の用語である「リンカー」は、受容体結合ドメイン変異体、Ｆｃドメイン、コロナウイルス由来の物質（例、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質など）のような融合タンパク質の各ドメインを連結する分子を意味する。

本発明において、前記リンカーは、好ましくは、グリシン－セリンリンカー（Ｇｌｙｃｉｎｅ－Ｓｅｒｉｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ、ＧＳリンカー）であり得る。前記グリシン－セリンリンカーとしては、例えば、Ｇ２Ｓ、Ｇ３Ｓ、Ｇ４Ｓリンカーなどがあるが、これに制限されない。

本発明において、前記リンカーは、さらに好ましくは、配列番号６乃至配列番号１１で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体（ＲＢＤ）－ＧＳリンカー－Ｎ又はＭタンパク質、ＲＢＤ－ＧＳリンカー－Ｎタンパク質－ＧＳリンカー－Ｍタンパク質、又はＲＢＤ－ＧＳリンカー－Ｍタンパク質－ＧＳリンカー－Ｎタンパク質の順に連結されたことを特徴とすることができるが、これに制限されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号６０で表示される配列を含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体及びＦｃドメインを含むことを特徴とすることができる。

本発明の用語である「Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）において細胞表面の受容体及び補体システムのタンパク質などと相互作用する抗体のテール領域であって、重鎖定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含み、重鎖定常ドメインのヒンジ領域をさらに含むことができる。本発明において、前記Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＦｃドメイン、その断片及びその変異体を全て含む概念で使用される。

本発明の一実施例では、受容体結合ドメイン変異体及び／又はコロナウイルス由来の物質が連結された２個の同一のＦｃドメインが二硫化結合を通じて結合された同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）形態の融合タンパク質を製造した。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体及びＦｃドメインを二つ以上含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体及びＦｃドメインを含むタンパク質の二量体（ｄｉｍｅｒ）であることを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体、Ｆｃドメイン及び一つ以上のコロナウイルス由来の物質を含むタンパク質の二量体であることを特徴とすることができる。

例えば、本発明において、前記二量体は、各Ｆｃドメインの一つ以上のシステイン残基の二硫化結合を通じて形成され得るが、これに制限されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体及びＦｃドメインを含むタンパク質の異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）又は同種二量体であり得る。本発明の一実施例では、前記融合タンパク質を同種二量体の形態で製造したが、これに制限されない。

本発明において、前記Ｆｃドメインは、哺乳動物の免疫グロブリンのＦｃドメインであり得る。好ましくは、前記Ｆｃドメインは、マウス、ウサギ又はヒトの免疫グロブリンのＦｃドメイン、さらに好ましくは、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインであり得るが、これに制限されない。

本発明において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＧのＦｃドメイン、その断片或いはこれらの変形であり得る。好ましくは、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃドメイン）であり得るが、これに制限されない。

本発明において、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり得る。より具体的には、 前記Ｆｃドメインは、各生物体由来のＩｇＧアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などから由来したＦｃドメインであり得る。

本発明において、前記Ｆｃドメインは、最も好ましくは、配列番号２で表示されたり、これを含むことを特徴とすることができるが、これに制限されない。

本発明において、前記Ｆｃドメインは、糖鎖を含むことができ、野生型に比べて増加又は減少した糖鎖を含んだり、糖鎖が除去された形態であり得る。化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用した遺伝工学的エンジニアリング方法などの当業界に知られている通常的な方法で免疫グロブリンＦｃドメインの糖鎖の増加、減少又は除去が行われ得る。Ｆｃドメインからの糖鎖の除去は、１次補体構成要素Ｃ１のＣ１ｑへの結合親和力を急激に減少させ、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）又はＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の減少又は消失をもたらし、それによって、生体内の不必要な免疫反応を誘導しない特徴を示すことができる。

本発明において、前記受容体結合ドメイン変異体は、ＦｃドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端に連結されたことを特徴とすることができ、好ましくは、Ｃ－末端に連結されたことを特徴とすることができる。

本発明において、前記受容体結合ドメインがＦｃドメインのＮ－末端及びＣ－末端のうちいずれか一つの末端に連結された場合、Ｆｃドメインの他の末端にコロナウイルス由来の物質がさらに連結されたことを特徴とすることができる。

本発明において、前記Ｆｃドメインの他の末端にコロナウイルスのＯＲＦタンパク質、Ｎタンパク質及び／又はＭタンパク質、好ましくはＮタンパク質、さらに好ましくはＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインが連結されたことを特徴とすることができる。

本発明において、融合タンパク質に含まれる受容体結合ドメイン変異体、Ｆｃドメイン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の物質（好ましくは、Ｎタンパク質及び／又はＭタンパク質）のようなそれぞれの構成は、共有結合などを通じて直接連結されてもよく、リンカーを介して間接的に連結されてもよい。本発明の一実施例では、配列番号６乃至配列番号１１で表示されるリンカーを使用してＦｃドメインのＣ－末端及び／又はＮ－末端に、受容体結合ドメイン（又はその変異体）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質を連結することによって融合タンパク質を製造したが、これに制限されない。

本発明において、前記融合タンパク質は、好ましくは、受容体結合ドメイン変異体－Ｆｃドメイン－ヌクレオカプシドタンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質－Ｆｃドメイン－受容体結合ドメイン変異体の順に連結されたこと、又はその二量体の形態であることを特徴とすることができ、Ｍタンパク質がヌクレオカプシドタンパク質にさらに連結され得るが、これに制限されない。

本発明において、他の末端にＮタンパク質が結合する場合、抗原として作用して細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）の発現向上を誘導し、ウイルスを死滅させることができる。

本発明の用語であるヌクレオカプシドタンパク質は、ウイルスの遺伝物質、コロナウイルスの場合、ＲＮＡを取り囲むカプシドタンパク質を意味する。ヌクレオカプシドタンパク質は、コロナウイルスに感染した細胞において非常に高いレベルに発現が向上することが報告されており、特に、ヌクレオカプシドタンパク質のＲＮＡ結合ドメインは高度に保存される配列である。本発明において、ヌクレオカプシドタンパク質は、「Ｎタンパク質」と同一の意味で相互互換的に使用される。

本発明の用語であるＭタンパク質は、細胞膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。

本発明において、Ｎタンパク質及びＭタンパク質などのコロナウイルス由来の物質は、タンパク質全体のみならず、タンパク質の切片を含む意味で使用される。例えば、前記Ｎタンパク質は、Ｎタンパク質全体のみならず、Ｎタンパク質の特定のドメイン又は切片を含む意味で使用され、好ましくは、Ｎタンパク質のＲＮＡ結合ドメイン、又はこれを含む切片がこれに含まれる。前記Ｎタンパク質及びＭタンパク質は、強い免疫原性を有することを特徴とし、細胞毒性リンパ球の分化を促進することを特徴とすることができる。

本発明において、前記Ｎタンパク質は、配列番号３の配列で表示されたり、配列番号３で表示される配列を含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、Ｎタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記ＲＮＡ結合ドメインは、配列番号４で表示されることを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号４３乃至４８で構成された群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列で表示されたり、これを含むことを特徴とすることができる。

本発明において、前記融合タンパク質は、配列番号５０乃至５４、及び配列番号５６乃至配列番号５８で構成された群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列で表示されたり、これを含むことを特徴とすることができる。

本発明の一実施例において、Ｆｃドメインの一末端（Ｎ－末端又はＣ－末端）に受容体結合ドメイン変異体、他の末端にＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを連結して製造した融合タンパク質が、高いコロナウイルスのＲＢＤ特異的中和抗体形成力価及びＴ細胞免疫反応誘導能を示すことを確認した。

本発明の受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質は、免疫原性を示し、よって、中和抗体の形成誘導、細胞毒性Ｔリンパ球の分化刺激、Ｔｈ細胞の分化刺激などの体内での多様な免疫反応を誘導することができる。本発明の一実施例では、本発明の受容体結合ドメイン変異体及びこれを含む融合タンパク質が、野生型受容体結合ドメイン及びこれを含む融合タンパク質と同一のレベルの又は著しく高い免疫反応を誘導することを確認した。

したがって、本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質を含有するワクチン組成物に関する。

本発明の用語である「ワクチン組成物」は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原又は免疫原として作用し、免疫反応を導出できる物質を含む組成物を意味し、本発明において、「ワクチン」又は「免疫原性組成物」と同一の意味で相互互換的に使用され得る。

本発明の用語である「免疫反応」は、先天免疫反応及び適応免疫反応、例えば、補体媒介免疫反応、細胞媒介（Ｔ細胞）免疫反応及び／又は抗体（Ｂ細胞）反応を全て含む最広義の概念である。

本発明のワクチン組成物は、投与対象でコロナウイルスに対する免疫反応を誘導又は増加させることができ、より具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和抗体の形成、細胞毒性リンパ球の分化などを誘導及び／又は増加させることができ、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者である場合、ウイルスの再活性化可能性を予防、緩和、除去又は減少；及び／又は前記ウイルスの再活性化と関連した他の疾患又は合併症を発生する可能性を予防又は減少させることができる。

本発明において、前記ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含むことを特徴とすることができる。

本発明の用語である「アジュバント」は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｇｌｅｎｎｙによってアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓａｌｔ）が免疫反応を増加させることが発見されながら生じた概念であって、免疫原性組成物又はワクチンを投与する対象でさらに強力な免疫反応を誘導するために入れる補助成分を意味する。例えば、前記アジュバントとしては、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ＭＦ５９又はその類似体（ＭＦ５９ ｌｉｋｅ）、ＡＳ０３又はその類似体（ＡＳ０３ ｌｉｋｅ）、ＡＦ０３又はその類似体（ＡＦ０３ ｌｉｋｅ）、ＳＥ又はその類似体（ＳＥ ｌｉｋｅ）などのスクアレン含有エマルジョン、カルシウム塩、ｄｓＲＮＡ類似体、脂肪多糖質（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、リピド（Ｌｉｐｉｄ）Ａ類似体（ＭＰＬ－Ａ、ＧＬＡなど）、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、イミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ）、ＣｐＧ ＯＤＮ、ミネラルオイル、トル様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）の拮抗剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、Ｃ－型レクチンリガンド、ＣＤ１ｄリガンド（α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅなど）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、ＱＳ２１などのサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ペプチドなどがあるが、これに制限されない。

本発明の一実施例において、アジュバントとして、ＡｄｄａＶａｘ（ＭＦ５９ ｌｉｋｅ）、ＭＰＬＡ、及びＡｌｕｍなどを単独で又は組み合わせて使用しており、いずれにおいても免疫反応がブースティングされることを確認した。

したがって、本発明において、前記アジュバントは、好ましくは、ＭＦ５９、Ａｌｕｍ、ＭＰＬＡ、及びその組み合わせで構成された群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。

本発明のワクチン組成物の最適な投与量は、被検体で適した免疫反応の観察を含む標準研究によって確認され得る。初期のワクチン化後、被検体に対しては、適当な間隔を置いて１回又は数回ブースター免疫化処理が行われ得る。

本発明のワクチン組成物は、薬剤学的に有効な量で投与され得る。本発明の用語である「薬剤学的に有効な量」は、免疫反応を誘導又は増加できる程度に十分でありながらも副作用や深刻又は過度な免疫反応を起こさない程度の量を意味し、適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様に決定され得る。「薬剤学的に有効な量」を決定するときに考慮される多様な一般的な事項は、当業者に公知となっており、例えば、文献［Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０］及び［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０］に記載されている。

本発明のワクチン組成物は、コロナウイルス治療剤又は対症治療剤などと同時に投与されてもよく、他のワクチン、ウイルス治療剤、免疫補助剤、症状緩和剤などと共に投与されてもよい。

本発明のワクチン組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて剤形化することによって単位用量の形態で製造されたり、又は多用量容器内に入れて製造され得る。このときの剤形は、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用され得る。当該技術分野に知られている適切な製剤としては、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されているものを使用することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの各潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあるが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。

本発明のワクチン組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明に係る組成物の投与経路としては、これらに限定されないが、例えば、呼吸器内、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、腹腔内、腸管、舌下、口腔又は局所投与が可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率又は疾病の重症度などによってその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために、公知の技術を用いて本発明の組成物を適切な剤形に製剤化することができる。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質のワクチン組成物の製造のための用途に関する。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体、融合タンパク質及び／又はワクチン組成物を対象に投与する段階を含むコロナウイルス感染症に対するワクチン接種方法に関する。

本発明の実施例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の受容体結合ドメインを使用したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１などのウイルスも、保存された配列（ＲＢＭ）を有するスパイクタンパク質とＡＣＥ２との結合を通じて類似するメカニズムで細胞に進入し、病症を示すので、コロナウイルス感染症全体の予防又は治療に使用され得る。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体及び／又は融合タンパク質を有効成分として含むコロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物に関する。

本発明において、前記薬学組成物は、ワクチン療法のための治療用ワクチン組成物であることを特徴とすることができる。

本発明で使用される用語である「予防」は、本発明に係る薬学組成物の投与によって目的とする疾患を抑制したり、発病を遅延させる全ての行為を意味する。

本発明で使用される用語である「治療」は、本発明に係る薬学組成物の投与によって目的とする疾患に対する症状が好転したり、有利に変更される全ての行為を意味する。

前記薬学組成物は、通常的に薬学組成物に使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。

前記薬学組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合は、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調剤される。

本発明に係る薬学組成物は、通常の方法によって多様な形態で剤形化して使用され得る。適切な剤形としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質又は軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤又は乳化液剤、注射剤、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液などがあるが、これに限定されない。

本発明に係る薬学組成物は、薬学的に不活性である有機又は無機担体を用いて適切な剤形に製造することができる。すなわち、剤形が錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠及び硬質カプセル剤である場合、ラクトース、スクロース、澱粉又はその誘導体、タルク、炭酸カルシウム、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩を含むことができる。また、剤形が軟質カプセル剤である場合は、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体及び液体のポリオールを含むことができる。また、剤形が溶液又はシロップ形態である場合は、水、ポリオール、グリセロール、及び植物性オイルなどを含むことができる。

本発明に係る薬学組成物は、前記担体以外にも、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、甘味剤、着色剤、浸透圧調節剤、酸化防止剤などをさらに含むことができる。

本発明に係る薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なリスク・ベネフィット比で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野によく知られている要素によって決定され得る。本発明に係る薬学組成物は、個別治療剤として投与されてもよく、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的に又は同時に投与されてもよく、単一又は多重投与されてもよい。上記の各要素を全て考慮して、副作用がなく、且つ最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。

本発明の薬学組成物は、個体に多様な経路で投与され得る。前記薬学組成物は、経口又は非経口で投与され得る。非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などがあり得る。経口投与時、タンパク質又はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤でコーティングされたり、上記の分解から保護されるように剤形化され得る。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。

本発明に係る薬学組成物の投与方法は、剤形によって容易に選択可能であり、経口又は非経口投与であり得る。投与量は、患者の年齢、性別、体重、病症の程度、投与経路によって変わり得る。

本発明において、前記コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）であることが最も好ましい。

本発明において、前記薬学組成物は、他のコロナウイルス感染症の治療用組成物又は治療療法と併用して使用され得る。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体、融合タンパク質のコロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物の製造のための用途に関する。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体、融合タンパク質、及び／又は薬学組成物を対象に投与する段階を含むコロナウイルス感染症の予防又は治療方法に関する。

本発明は、更に他の観点において、本発明のドメイン変異体及び／又は融合タンパク質のコロナウイルス感染症の予防又は治療用途に関する。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体又は融合タンパク質をコーディングする核酸に関する。

本明細書で使用される核酸は、細胞及び細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在したり、又は部分的に精製された形態又は実質的に純粋な形態で存在することもできる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び該当の技術分野によく知られているその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分又はその他の汚染物質、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質から精製されて出る場合、「単離」されたり、「実質的に純粋になった」ものである。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

本発明は、更に他の観点において、本発明の核酸を含有する組換えベクターに関する。

本発明において、前記組換えベクターは、受容体結合ドメイン変異体又は前記融合タンパク質をコーディングする核酸のタンパク質発現を誘導できるベクターであれば、当業者が当業界に公知となったベクターを適宜選択して制限なく使用することができる。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、Ｔ７系列（Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３など）、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、温度依存型（λｐｈｏＡ）、ｐｈｏＢ、ｒｍＢ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ又は１ＰＬプロモーターを含むベクターを使用することができ、酵母を宿主として使用する場合、ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＧＫ又はＴＤＨ３プロモーターを含むベクターを使用することができ、バシラスの場合、Ｐ２プロモーターを含むベクターを使用できるが、これは、一部の実施様態を羅列したものであって、前記プロモーターを含むベクター以外にも、本発明に係る融合タンパク質の発現を誘導するためのプロモーターを含むベクターとして宿主に適切なものであれば制限がなく、当業界に公知となった多様なベクターを当業者が適宜選択して使用することができる。

本発明の用語である「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現できる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能できたり、又は、一部の場合にゲノム自体に統合され得る。プラスミドが現在のベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター」は、時々相互交換的に使用される。しかし、本発明は、当業界に知られたり、又は知られるようになるのと同等な機能を有するベクターの他の形態を含む。大腸菌で使用されるタンパク質発現ベクターとしては、Ｎｏｖａｇｅｎ（米国）社のｐＥＴ系列；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）のｐＢＡＤ系列；Ｔａｋａｒａ（日本）のｐＨＣＥやｐＣＯＬＤ；ＧｅｎｏＦｏｃｕｓ（大韓民国）のｐＡＣＥ系列；などを使用することができる。枯草菌では、ゲノムの特定の部分に目的遺伝子を挿入してタンパク質発現を具現したり、ＭｏＢｉＴｅｃｈ（ドイツ）のｐＨＴ系列のベクターなどを使用することができる。カビや酵母でも、ゲノム挿入や自己複製ベクターを用いてタンパク質発現が可能である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）などのＴ－ＤＮＡシステムを用いて植物用タンパク質発現ベクターを使用することができる。哺乳動物細胞培養物の発現のための典型的な発現ベクターは、例えば、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（ＷＯ９１／０８２９１号）及びｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）などをベースとする。

「発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須的なＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、及び転写及び解読の終決を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーが含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も大きな影響を及ぼす因子は、プロモーターである。高発現用のプロモーターとして、ＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来のプロモーターなどが好ましく使用される。

本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうちいずれもベクターに使用され得る。有用な発現調節配列の例には、前記記述したプロモーター以外にも、例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼの各プロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ－交配システムのプロモーター、原核細胞又は真核細胞、又はこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものとして知られた構成と誘導のその他の配列、及びこれらの多くの組み合わせが含まれる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターΦは、Ｅ．ｃｏｌｉでタンパク質を発現させるのに有用に使用され得る。

核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、プレ配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（接合）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。

本明細書に使用された用語である「発現ベクター」は、通常の異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｒｒｉｅｒ）であって、一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異型ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内にあると、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。

当業界に周知されたように、宿主細胞において形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、該当の遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び該当の遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含むことができる。

本発明は、更に他の観点において、本発明の受容体結合ドメイン変異体又は融合タンパク質をコーディングする核酸；及び／又は前記組換えベクターが導入された宿主細胞に関する。

本発明において、前記宿主細胞は、タンパク質などを生産するために、遺伝子又は組換えベクターなどが導入された発現用細胞を意味する。前記宿主細胞は、本発明の受容体結合ドメイン変異体又は融合タンパク質を発現できる細胞であれば制限なく使用可能であり、好ましくは真核細胞、さらに好ましくは、酵母、昆虫細胞、動物細胞、最も好ましくは動物細胞であり得る。例えば、融合タンパク質の発現に主に使用されるＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株などが使用され得るが、これに制限されない。

本発明の前記受容体結合ドメイン変異体又は前記融合タンパク質を発現させるために、非常に多様な発現宿主／ベクター組み合わせが利用可能である。真核宿主に適した発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、牛乳頭種ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節配列を含む。細菌宿主に使用できる発現ベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように、Ｅ．ｃｏｌｉから得るものを例示できる細菌性プラスミド、ＲＰ４のように、より広い宿主範囲を有するプラスミド、λとλＮＭ９８９などの非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示され得るファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性単一鎖のＤＮＡファージなどのその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターはｐＶＬ ９４１である。

前記組換えベクターは、形質転換又は形質感染などの方法で宿主細胞に導入され得る。本明細書に使用された用語である「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本明細書に使用された用語である「形質感染」は、任意のコーディング配列が実際に発現されるかどうかとは関係なく、発現ベクターが宿主細胞によって収容されることを意味する。

もちろん、全てのベクターと発現調節配列が、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに全て同等に機能を発揮しないことを理解しなければならない。同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮することはない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なく、本発明の範囲を逸脱しない状態で様々なベクター、発現調節配列及び宿主から適宜選択することができる。例えば、ベクターを選択するにおいては、宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその内部で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮されなければならない。発現調節配列を選定するにおいても、様々な因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との親和性など、特に可能性のある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定されたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングできる能力、培養及び発酵要件、本発明のＤＮＡ配列によってコーディングされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定されなければならない。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模動物培養で発現できる各種のベクター／発現調節配列／宿主の組み合わせを選定することができる。発現クローニングによってｃＤＮＡをクローニングしようとするときのスクリーニング法として、バインディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）法、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）法、フィルムエマルジョン（ｆｉｌｍ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）法などが適用され得る。

前記遺伝子及び組換えベクターは、従来に公知となった多様な方法を通じて宿主細胞に導入され得る。本発明の受容体結合ドメイン変異体又は融合タンパク質をコーディングする核酸をコーディングする遺伝子が宿主細胞のゲノムに直接導入され、染色体上の因子として存在し得る。本発明の属する技術分野の当業者にとって、前記遺伝子を宿主細胞のゲノム染色体に挿入したときにも、組換えベクターを宿主細胞に導入した場合と同一の効果を有することは自明であると言えるだろう。

本発明は、更に他の観点において、前記宿主細胞を培養する段階を含む受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質の製造方法に関する。

前記受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質を発現できる組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞内に導入される場合、受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質が、宿主細胞で発現されるのに十分な期間の間、又は宿主細胞が培養される培養培地内に受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質が分泌されるのに十分な期間の間、宿主細胞を培養することによって製造され得る。

場合によって、発現された受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質は、宿主細胞から分離した後、均一になるように精製することができる。前記受容体結合ドメイン変異体又はこれを含む融合タンパク質の分離又は精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法、例えば、クロマトグラフィーによって行われ得る。前記クロマトグラフィーは、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーから選ばれた一つ以上の組み合わせであり得るが、これに限定されない。前記クロマトグラフィー以外に、ろ過、超ろ過、塩析、透析などをさらに組み合わせて使用することができる。

本発明では、特定のアミノ酸配列及び塩基配列を記載したが、本発明で実施しようとする酵素と実質的に同一のアミノ酸配列及びこれをコーディングする塩基配列が本発明の権利範囲に属することは当業者にとって自明であろう。実質的に同一であることは、アミノ酸又は塩基配列の相同性が非常に高い場合を含み、その他にも、配列の相同性とは関係なく、構造的特徴を共有したり、本発明で使用されたのと同一の機能を有するタンパク質を意味する。本発明の核心を構成する配列を除いた他の配列が一部欠失したタンパク質又はこれをコーディングする塩基配列の断片も、本発明に含まれ得る。したがって、本発明は、断片の長さとは関係なく、本発明で使用されたのと同一の機能を有するアミノ酸又は塩基配列を全て含む。

実施例

下記の実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものに過ぎなく、これによって本発明が限定されることはない。

実施例１：野生型受容体結合ドメイン又は変異体を含む融合タンパク質の製造

前記受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）変異体のＡＣＥ２結合能力及び免疫原性を評価するために、図３に示すように、対照群及び実験群を設定し、融合タンパク質を製作した（図４乃至図２５）。前記融合タンパク質を生産するために、下記の表１の野生型ＲＢＤ、ＲＢＤ変異体、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）のＲＮＡ結合ドメインを連結して制作し、前記融合タンパク質をコーディングする塩基配列を含むポリヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のｇＢｌｏｃｋ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓサービスを通じて合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターに積載した。

前記製作したベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入し、それぞれの融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２５％の濃度である環境で７日間培養した後、培養液を収去し、融合タンパク質を精製した。

Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いてそれぞれのタンパク質を精製した。Ｔｈｅｒｍｏ社のタンパク質Ａ結合バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて平衡を行った。その後、０．２２μｍフィルターでろ過した上澄み液をカラムにローディングし、レジンボリュームの１０倍に該当するタンパク質Ａ結合バッファーを用いてカラムを洗浄した。その後、Ｔｈｅｒｍｏ社のＩｇＧ溶出バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を入れて溶出した。ｐＨ９の１Ｍトリス－ＨＣｌが２０％になるように収去用チューブに入れた後、融合タンパク質を収去した。収去された融合タンパク質は、透析を通じてＰＢＳバッファーに変えた。

その後、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを行い、２１４ｎｍの波長で吸光度を測定し、高濃度の融合タンパク質を確保した。このとき、分離・精製された融合タンパク質は、Ｒ（ｒｅｄｕｃｅｄ）又はＮＲ（ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｅｄ）の条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行し、クマシーブルーで染色することによって生成を確認した。

ＧＩＣ－１１５１、ＧＩＣ－１１５１ｍの場合、陽イオン交換樹脂（Ｃａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ｒｅｓｉｎ；Ｃａｐｔｏ Ｓ、ＧＥ）を用いてクロマトグラフィー精製した。５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーを用いて平衡を行った。その後、０．２２μｍのフィルターでろ過した上澄み液をカラムにローディングし、レジンボリュームの１０倍に該当する５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーを用いてカラムを洗浄した。その後、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ（ｇｒａｄｉｅｎｔ）バッファーを入れ、５ｍＬずつ区間を分けて溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色して確認し、予想されるサイズとして確認される区間の融合タンパク質を集め、サイズ排除レジン（Ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｒｅｓｉｎ）（ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ １６／６００、ＧＥ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを行い、２１４ｎｍの波長で吸光度を測定し、高濃度の融合タンパク質を確保した。このとき、分離・精製された融合タンパク質は、 Ｒ（ｒｅｄｕｃｅｄ）又はＮＲ（ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｅｄ）の条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行し、クマシーブルーで染色して確認した。

製造された融合タンパク質のアミノ酸配列及びこれをコーディングする核酸配列は、次の表３及び表４に示す通りである。

実施例２：融合タンパク質及びＡＣＥ２の結合親和度の確認

ＡＨＣバイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）（Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－５０６０）は、マイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）９６ウェル（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－ｏｎｅ、Ｃａｔ：６５５２０９）に１Ｘキネティックバッファー（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）（１０Ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－１０４２）を２００μｌずつ入れて予め水和させた。バイオセンサーに付けるリガンド（融合タンパク質）を１Ｘ Ｎｉ－ＮＴＡキネティックバッファーに１０μｇ／ｍｌの濃度で希釈した。リガンドに付けるｈＡＣＥ２（Ｈｉｓ－Ｔａｇ、Ａｃｒｏ、ＡＣ２－Ｈ５２Ｈ８）を５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２ｎＭ、１５．６ｎＭ、７．８ｎＭ又は６０ｎＭ（単一濃度での結合確認）になるように１Ｘキネティックバッファーに希釈した。マイクロプレート９６ウェル（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－ｏｎｅ、Ｃａｔ：６５５２０９）に各試薬を２００μｌずつ入れ、プログラムをセッティングした。

実施例１で製造した融合タンパク質のうちＦｃドメインのＣ－末端に野生型ＲＢＤ（ＲＢＤｗｔ）又はＲＢＤ変異体（ＲＢＤｍ）が連結された融合タンパク質のＡＣＥ２に対する結合親和度を確認した（受容体の濃度別確認）。その結果、図２６に示したように、野生型ＲＢＤを含む融合タンパク質は、ＡＣＥ２受容体に対する高い結合親和度（低いＫＤ値）を示す一方で、ＲＢＤ変異体（ＲＢＤｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ））を含む融合タンパク質は、低い結合親和度（高いＫＤ値）を示した。一方、単独でＬ１３７Ａ又はＦ１６８Ａ変異を有するＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質の場合は、結合後に解離程度が低く表れたが、Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａ変異を全て有するＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質の場合は、結合後に高い解離率を示した（図２６）。Ｇ１８４Ｄの単独変異を有するＲＢＤ変異体（ＲＢＤｍ（Ｇ１８４Ｄ））の場合は、ＡＣＥ２に全く結合しないことが確認された。各融合タンパク質の結合親和度は、次の表５に示す通りである。

また、実施例１で製造した融合タンパク質のうちＦｃドメインのＮ－末端に野生型ＲＢＤ（ＲＢＤｗｔ）又はＲＢＤ変異体（ＲＢＤｍ）が連結された融合タンパク質のＡＣＥ２に対する結合親和度を確認した（単独濃度）。図２７に示したように、野生型ＲＢＤ又はＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質は、ＦｃドメインのＮ－末端又はＣ－末端の結合位置とは関係なく同一の結果を示した。このような結果は、Ｆｃドメイン又はＲＢＤの結合位置とは関係なく、特定のアミノ酸が変異されたＲＢＤ変異体自体がＡＣＥ２との結合親和度に影響を示すことを意味する。また、Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａ以外に、追加的なアミノ酸置換（Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ、Ｎ１８３Ａ）を含む場合にも結合親和度が減少したが、Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａを含まない場合（Ｇ１６４Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｆ１６８Ａ、Ｑ１７５Ａ、Ｓ１７６Ａ及びＮ１８３Ａ変異体）には結合親和度が維持された。

総合的に、野生型ＲＢＤを含む融合タンパク質に比べて、本発明のＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質の結合力が１０倍～１００倍以上減少したことを確認し、前記結果は、ｉ）Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａ変異、又はｉｉ）Ｇ１８４Ｄ変異を含む場合、ＲＢＤのＡＣＥ２受容体に対する結合親和度が著しく減少することを示す。

実施例３：融合タンパク質のｈＡＣＥ２結合効率及びｈＡＣＥ２減少（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）確認

ｈＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈＡＣＥ２、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、Ｃａｔ Ｎｏ：＃ＳＬ２２１）を十分に成長させた後、ＦＡＣＳチューブ当たり３ｘ１０^５細胞数（ｃｅｌｌｓ）／１００μｌのＦＡＣＳバッファー（５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ ｉｎ ＰＢＳ）の濃度で分配した。各チューブに下記の表６に記載のタンパク質をそれぞれ処理して混合した後、４℃で１時間にわたって反応させた。

その後、各サンプルを４℃で３００ｘｇの条件で５分間遠心分離することによって上澄み液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを添加し、ペレットを懸濁した。遠心分離及び懸濁過程をさらに２回繰り返した後、ＦＡＣＳバッファーを用いて抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＦＩＴＣ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ Ｎｏ：＃３１２５９）を１：５００で希釈した後、前記サンプルに１００μｌ処理し、４℃で３０分間反応させた。その後、各サンプルを４℃で３００ｘｇの条件で５分間遠心分離することによって上澄み液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを添加し、ペレットを懸濁した。遠心分離及び懸濁過程をさらに２回繰り返し、結合していない抗体を除去した後、各サンプルにＦＡＣＳバッファー５００μｌを添加して懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ^ＴＭ、ＢＤ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたＦＩＴＣ強度測定を通じて各融合タンパク質のｈＡＣＥ２に対する結合効率を確認した。

その結果、図２８に示したように、ＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）及びＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｇ１８４Ｄ））が、野生型ＲＢＤを含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４）より著しく低いｈＡＣＥ２結合効率を示すことを確認した。

確認した各受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質の結合効率の減少が、ｈＡＣＥ２発現減少の抑制につながるかどうかを確認した。具体的には、ｈＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈＡＣＥ２、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ、Ｃａｔ Ｎｏ：＃ＳＬ２２１）を十分に成長させた後、ＦＡＣＳチューブ当たり３ｘ１０^５細胞数（ｃｅｌｌｓ）／１００μｌのＦＡＣＳバッファー（５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ ｉｎ ＰＢＳ）の濃度で分配した。各チューブに前記表６に記載のタンパク質をそれぞれ処理して混合した後、３７℃で１時間にわたって反応させた。その後、各サンプルを４℃で３００ｘｇの条件で５分間遠心分離することによって上澄み液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを添加し、ペレットを懸濁した。遠心分離及び懸濁過程をさらに２回繰り返した後、ＦＡＣＳバッファーを用いてヤギ抗－ヒトＡＣＥ－２細胞外ドメイン抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＡＣＥ－２ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＦ９３３）を最終濃度２μｇ／ｍｌで希釈し、各サンプルを１００μｌで処理した。４℃で１時間にわたって反応させた後、各サンプルを４℃で３００ｘｇの条件で５分間遠心分離することによって上澄み液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを添加し、ペレットを懸濁した。遠心分離及び懸濁過程をさらに２回繰り返した後、ＦＡＣＳバッファーを用いてウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）交差－吸着２次抗体（Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） ｃｒｏｓｓ－ａｄｓｏｒｂｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＡ５－１００８１）を１：１０００の比率で希釈した後、前記サンプルを１００μｌで処理し、４℃で３０分間反応させた。各サンプルを４℃で３００ｘｇの条件で５分間遠心分離することによって上澄み液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを添加し、ペレットを懸濁した。遠心分離及び懸濁過程をさらに２回繰り返した後、各サンプルにＦＡＣＳバッファー５００μｌを添加して懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ^ＴＭ、ＢＤ、ＣＡ、ＵＳＡ）を通じて各融合タンパク質のｈＡＣＥ２の発現減少を確認した。

図２９に示したように、野生型ＲＢＤを含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４）を処理した場合は、ｈＡＣＥ２の発現減少が確認されたが、ＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）及びＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｇ１８４Ｄ））を処理する場合は、ＨＥＫ２９３のｈＡＣＥ２発現に対する影響性が著しく減少することを確認した。

したがって、本発明のＲＢＤ変異体は、野生型ＲＢＤとは異なり、ｈＡＣＥ２に対する低い結合親和度、結合効率を示し、ｈＡＣＥ２の発現減少を誘発しないので、ワクチンのための免疫原（抗原）として使用される場合にも、野生型ＲＢＤによるｈＡＣＥ２の発現減少による既存のワクチンの副作用危険が非常に低いと予想され、コロナウイルスのワクチンとして有用に使用することができる。

実施例４：マウスにおいて、ＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質を用いたワクチン接種時の免疫反応確認

実施例４－１：マウスの準備及びワクチン接種

実施例１で製造した融合タンパク質の免疫原性を評価するための動物実験に使用されたマウス及び使用された融合タンパク質は、下記の表７に示す通りである。

各融合タンパク質の分子量を考慮して、同一のモル数を有するように投与量を考慮した（ＧＩＣ－１１１４（Ｎ－Ｆｃ－ＲＢＤｗｔ）：１４０ｋＤａ、ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｎ－Ｆｃ－ＲＢＤｍｔ＿Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）：１４０ｋＤａ、ＧＩＣ－１１５１ｍ（ＲＢＤｍｔ＿Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ－Ｎ－Ｎ－ＲＢＤｍ＿Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）：８５ｋＤａ）。

大腿筋を介した筋肉内投与（Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路で投与し、１次接種してから２週後、再び融合タンパク質を投与した。投与してから４週次に、各個体の腹帯静脈を介して採血し、血清を分離した後、超低温冷凍庫に保管した。また、４週次に、各個体の脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ｍｅｄｉｕｍ）＋１０％ＦＢＳで混合し、１５ｍＬのコニカル（ｃｏｎｉｃａｌ）チューブに入れた後、氷のように冷たい（ｉｃｅ ｃｏｌｄ）状態で準備した（図３０）。

実施例４－２：中和抗体形成の確認

実施例４－１で採取した血清のマウス中和抗体形成力価を確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。具体的には、１Ｘ ＰＢＳ（１０Ｘ ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、ＭＬ ００８－０２）１：１０希釈）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｓタンパク質ＲＢＤ（ＡＣＲＯ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＳＰＤ－Ｃ５３Ｈ３）又はヒト組換えＩｇＧ１タンパク質（Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＩｇＧ１ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、１０７０２－ＨＮＡＨ）を希釈し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３５０１）に１００μｌ（５００ｎｇ／ｗｅｌｌ）ずつ入れた後、接着フィルム（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｐｌａｓｔｉｃ）で覆い、４℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養した。

１Ｘ ＥＬＩＳＡアッセイ希釈液（５Ｘ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１２０３）、１Ｘ ＰＢＳ希釈）を各プレートのウェルに１００μＬずつ添加し、１００ｒｐｍの速度で振りながら常温で２時間にわたって定置した。各プレートの上澄み液を除去し、洗浄バッファー（０．０５％ ｏｆ Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９４９） ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ）を２００μＬずつ添加し、各ウェルを２回洗浄した。各マウスから採取した血清２μＬに１Ｘ ＥＬＩＳＡアッセイ希釈液２５４μｌを入れて１次希釈した後（１：１２８）、これを１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８の比率でさらに連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、各ウェル当たり１００μｌの希釈された血清を添加した後、１００ｒｐｍの速度で振りながら常温で２時間にわたって定置した。希釈した検体を除去し、２００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄した。ヤギ抗マウス（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１４３０）希釈液（１Ｘ ＥＬＩＳＡ Ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ、１：１００００）を各ウェルに１００μＬ添加し、遮光された状態で１００ｒｐｍの速度で振りながら常温で１時間３０分間培養した。上澄み液を除去した後、２００μＬの洗浄バッファーで５回洗浄した。ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１１０１）を各ウェル当たり１００μＬずつ入れた後、常温で１分間反応させ、停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、７７３１６）を各ウェル当たり１００μＬずつ入れた後、反応を停止させた。各試料に対して、ＥＬＩＳＡリーダー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３）を使用して４５０ｎｍでＯＤ値を測定し、中和抗体形成力価を確認した。

図３１に示したように、アジュバントが添加されていない融合タンパク質でワクチン接種を実施した場合、野生型ＲＢＤを含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４）を投与する場合に比べて、ＲＢＤ特異体を含む融合タンパク質（ＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ））を投与する場合に著しく高いＲＢＤ特異的中和抗体力価（ｔｉｔｅｒ）を示すことを確認した。また、アジュバントを併用投与し、免疫反応をブースティングする場合に各抗体形成力価が向上し、ＧＩＣ－１１１４又はＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）を使用した場合、いずれにおいても類似するレベルの中和抗体形成力価を示すことを確認した。

Ｆｃドメインが含まれていない融合タンパク質であるＧＩＣ－１１５１ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）の場合、Ａｄｄａｖａｘをアジュバントとして用いてマウスに接種し、４週後に得た血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ特異的中和抗体形成力価を確認した。図３２に示したように、ＧＩＣ－１１５１ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）は、ＧＩＣ－１１１４及びＧＩＣ－１１１４ｍ（L１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）と類似するレベルのＲＢＤ特異的中和抗体形成力価を示した。

前記結果は、ＲＢＤ変異体及びこれを含む融合タンパク質が、遺伝子変異及びＡＣＥ２結合親和度の減少にもかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ特異的抗体の力価に影響を及ぼさないので、副作用が減少しながらも野生型ＲＢＤを含むワクチン組成物と同一又は向上したレベルの免疫原性を示すことができることを意味する。

実施例５：サルモデルにおけるＲＢＤ変異体を含む融合タンパク質を用いたワクチン接種時の免疫反応確認

実施例５－１：マウスの準備及びワクチン接種

実施例１で製造した融合タンパク質の免疫原性を評価するための動物実験に使用されたサルモデル及び使用された融合タンパク質とアジュバントは、下記の表８に示す通りである。

同一の量の融合タンパク質（２５μｇ）を１回大腿筋を介した筋肉内投与経路でサルモデルに接種し、接種後に７日間隔で５６日まで（８週間、合計８回）大腿部静脈から採血することによって抗体の力価を測定し、接種してから２８日及び５６日にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２代理ウイルス中和試験（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ｓＶＮＴ）を行った。

採血した血液は、ＳＳＴチューブに移し、室温で３０分間定置した後、４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって血清を収得し、１．７ｍＬの微小遠心管（Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅ）（Ａｘｙｇｅｎ、ＵＳＡ）に保管した（図３３）。

実施例５－２：中和抗体形成力価の確認

実施例４－２に示したのと同一の方法を使用し、サルモデルから採取した血清に含まれた中和抗体形成力価を確認した。図３４に示したように、接種してから１週次には、ＧＩＣ－１１１４が高いＲＢＤ特異的中和抗体形成力価を示したが、ＵＳＦＤＡの告示による有意味なワクチン能力を立証する基準力価数値（２８８０）には到逹しておらず、２週後には基準力価数値を上回り、ＲＢＤ変異体を含むＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）を投与したサルの血液で野生型ＲＢＤを含むＧＩＣ－１１１４を投与したサルより高い中和抗体形成力価を示すことを確認した。抗体の力価は、約３週と４週との間に最高値を示しており、８週までも大きな減少なしで高い抗体形成力価が維持され、本発明のＲＢＤ変異体及び融合タンパク質が１回投与されただけでも、追加的な免疫ブースティングなしで長期免疫原性を示すことができることを確認した。

実施例５－２：融合タンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２代理ウイルス中和試験（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ｓＶＮＴ）

本発明の融合タンパク質を接種したサルモデルから採取した血液の抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を効果的に中和できるかどうかを確認するために、代理ウイルス中和試験（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ；ｓＶＮＴ）を行った。

具体的には、ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク阻害剤スクリーニング分析キット（ＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｋｉｔ、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃７９９３６）を使用してＥＬＩＳＡを行った。分析キット内のＡＣＥ２－Ｈｉｓ（Ｃａｔ＃１１００３）を、最終濃度が１μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに希釈し、５０μｌの希釈液をウェルプレートに分注して１時間にわたって付着させた。付着後、上澄み液を除去し、各プレートを１００μｌの１Ｘ免疫バッファー（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｕｆｆｅｒ）１で３回洗浄した後、１００μｌのブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）２で１０分間ブロッキングした後、上澄み液を除去する。

準備されたプレートに、サルモデルから採取した血清試料希釈液（最終的に１：６４まで希釈）１０μｌ及び１Ｘ免疫バッファー１ ２０μｌを各ウェルに分注し、陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）とブランク（Ｂｌａｎｋ）のために阻害剤バッファー（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ）を１０μｌ／ｗｅｌｌで分注した。陽性対照群、試験阻害剤（Ｔｅｓｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として表示されたウェルには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（最終濃度１ｎｇ／μｌで希釈）を２０μｌ分注し、ブランクとして表示されたウェルには、阻害剤バッファー（ＰＢＳ）を２０μｌ分注した後、１時間にわたって常温で反応させた。各プレートを１００μｌの１Ｘ免疫バッファー１で３回洗浄した後、１００μｌのブロッキングバッファー２で１０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファー２を用いて二次ＨＲＰ－標識抗体（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＨＲＰ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）１（Ｃａｔ＃５２１３０Ｈ）を１０００Ｘに希釈した後、１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、１時間にわたって常温で反応させた。各プレートを１００μｌの１Ｘ免疫バッファー１で３回洗浄した後、１００μｌのブロッキングバッファー２で１０分間ブロッキングした。ＥＬＩＳＡ ＥＣＬ基板ＡとＥＬＩＳＡ ＥＣＬ基板Ｂを１：１の比率で混ぜながら１００μｌ／ｗｅｌｌで分注した後、ＧｌｏＭａｘ^{（登録商標）} Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて試料のルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）値を測定した。

図３５及び図３６に示したように、サルモデルから採取された血清のｓＶＮＴ実験の結果、本発明の融合タンパク質のうちＲＢＤ変異体を含むＧＩＣ－１１１４ｍ（Ｌ１３７Ａ、Ｆ１６８Ａ）を投与したサルの血清に含まれたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、野生型ＲＢＤを含むＧＩＣ－１１１４を投与したサルの場合より著しく高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能力を示すことが確認された。

前記各結果をまとめると、本発明のＲＢＤ変異体及びこれを含む融合タンパク質を接種するときに、高い力価と中和能力を有する抗体を形成できることを意味する。

以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の各請求項とそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。

本発明のコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン変異体は、ＡＣＥ２に対する結合力が特異的に減少したことを特徴とするので、既存のコロナウイルスのスパイクタンパク質又はその受容体結合ドメインを使用したワクチンが有するＡＣＥ２との結合及び陰性フィードバックによるＡＣＥ２の発現減少によって肺又は心臓の副作用をもたらすおそれがあり、特に、肺又は心臓の基礎疾患を病んでいる患者に致命的であり得るという短所を克服することができる。特に、本発明のコロナウイルス受容体結合ドメイン及びＦｃを結合した融合タンパク質は、生体内の半減期が非常に向上し、追加的なモディフィケーションを通じてコロナウイルス由来のドメイン、例えば、Ｎタンパク質、Ｍタンパク質、ＯＲＦタンパク質などを結合し、より優れた効能を有する多価免疫原性組成物への活用可能性が高い。よって、本発明のコロナウイルス受容体結合ドメイン変異体は、ＣＯＶＩＤ－１９を始めとしたコロナウイルス感染症の予防及び治療に有用である。

電子ファイルを添付した。

Claims (26)

1. ＡＣＥ２受容体に対する結合力が減少したコロナウイルス由来の受容体結合ドメイン変異体。
2. 配列番号１のアミノ酸配列のＬ１３７、Ｇ１６４、Ｖ１６５、Ｆ１６８、Ｑ１７５、Ｓ１７６、Ｎ１８３及びＧ１８４からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の位置での変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載の受容体結合ドメイン変異体。
3. Ｌ１３７及びＦ１６８アミノ酸の変異；及び
   Ｇ１８４アミノ酸の変異；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の変異を含むことを特徴とする、請求項２に記載の受容体結合ドメイン変異体。
4. 前記変異は置換であることを特徴とする、請求項２に記載の受容体結合ドメイン変異体。
5. Ｌ１３７Ａ及びＦ１６８Ａのアミノ酸置換；及び
   Ｇ１８４Ｄのアミノ酸置換；からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の置換を含むことを特徴とする、請求項４に記載の受容体結合ドメイン変異体。
6. 前記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることを特徴とする、請求項１に記載の受容体結合ドメイン変異体。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質。
8. コロナウイルス由来の物質をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. 前記コロナウイルス由来の物質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＮタンパク質及びＭタンパク質からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. 前記受容体結合ドメイン変異体及びコロナウイルス由来の物質は、グリシン－セリンリンカーで連結されたことを特徴とする、請求項８に記載の融合タンパク質。
11. Ｆｃドメインをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の融合タンパク質。
12. 前記受容体結合ドメイン変異体は、ＦｃドメインのＮ末端及びＣ末端のうちいずれか一つ以上に連結されたことを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
13. 前記受容体結合ドメイン変異体がＦｃドメインのＮ末端及びＣ末端のうちいずれか一つの末端に連結され、他の一つの末端に一つ以上のコロナウイルス由来の物質が連結されたことを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質。
14. 前記Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインであることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
15. 前記融合タンパク質は、受容体結合ドメイン変異体及びＦｃドメインを含むタンパク質の二量体であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
16. 前記融合タンパク質は、コロナウイルス由来の物質を一つ以上さらに含むタンパク質の二量体であることを特徴とする、請求項１５に記載の融合タンパク質。
17. 請求項１～６のいずれか１項に記載の受容体結合ドメイン変異体；又は
    前記受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質；を含むワクチン組成物。
18. アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載のワクチン組成物。
19. 前記アジュバントは、アルミニウム塩、スクアレン、スクアレン含有エマルジョン、カルシウム塩、ｄｓＲＮＡ類似体、脂肪多糖質、リピドＡ類似体、フラジェリン、イミダゾキノリン、ＣｐＧ ＯＤＮ、ミネラルオイル、トル様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）の拮抗剤、Ｃ－型レクチンリガンド、ＣＤ１ｄリガンド、界面活性剤、リポソーム、サポニン、サイトカイン、及びペプチドからなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載のワクチン組成物。
20. 請求項１７～１９のいずれか１項に記載のワクチン組成物を患者に投与する段階を含むコロナウイルス感染症に対するワクチン接種方法。
21. 請求項１～６のいずれか１項に記載の受容体結合ドメイン変異体又は前記受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質を有効成分として含むコロナウイルス感染症の予防又は治療用薬学組成物。
22. 前記コロナウイルス感染症はＣＯＶＩＤ－１９であることを特徴とする、請求項２１に記載の薬学組成物。
23. 請求項２１に記載の薬学組成物を対象に投与する段階を含むコロナウイルス感染症の予防又は治療方法。
24. 請求項１～６のいずれか１項に記載の受容体結合ドメイン変異体；又は
    前記受容体結合ドメイン変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸。
25. 請求項２４に記載の核酸を含む組換えベクター。
26. 請求項２４に記載の核酸；又は
    請求項２５に記載の組換えベクターが導入された宿主細胞。