KR101570453B1

KR101570453B1 - 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포

Info

Publication number: KR101570453B1
Application number: KR1020140061587A
Authority: KR
Inventors: 이창희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2015-11-20

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포 및 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포는 코돈 최적화된 PEDV 스파이크 1 단백질 항원을 손쉽게 수득할 수 있게 하여, 기존의 발현 시스템보다 발현율 및 획득율이 우수한 특징이 있다. 또한, 상기 재조합 세포주로부터 생산된 재조합 스파이크 1 단백질을 항원으로 이용 시 효과적으로 면역반응을 유도할 수 있어, 이를 돼지 유행성 설사병의 예방, 개선 및 치료를 위한 백신, 의약품 및 사료 등에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포{Recombinant cell expressing recombinant spike 1 protein of porcine epidemic diarrhea virus}

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포 및 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사병(Porcine epidemic diarrhea, PED)은 새끼 돼지에서 심각한 탈수 증상 후에 급성 장염 및 치명적인 물 설사를 유발하여 높은 사망률로 이어지게 하는 심각한 돼지 질병이다(Debouck et al.,(1980), J. Vet. Res, 41, 219-223; Saif et al.,(2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524; Pijpers et al.,(1993), Vet. Rec. 132, 129-131). 상기 돼지 유행성 설사병은 1971년 영국에서 초기에 확인됐지만(Oldham, (1972), Letter to the editor. Pig Farming. Oct. suppl. 72-73), 감염 인자(causative agent)인 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)는 1978년에 확인되었다(Pensaert and Debouck, (1978), Arch. Virol. 58, 243-247). PED는 아시아에서는 1982년에 처음 보고되었고, 아시아 양돈 산업에서 상당한 경제적 손실을 일으키며 돼지의 건강을 위협하고 있다(Chen et al.,(2008), Virus Genes. 36, 355-364; Puranaveja et al.,(2009), Emerg. Infect. Dis. 15, 1112-1115; Li et al., (2012), Emerg. Infect. Dis, 18, 1350-1353; Takahashi et al., (1983), J. Vet. Sci. 45, 829-832). 한국에서는 1992년에 처음 PEDV가 발생하였으나(Kweon et al.,(1993), J. Vet. Rec. 33, 249-254), 종래 연구를 통해 상기 바이러스가 이미 1987년 이전에 존재했다는 것이 보고되었다(Park and Lee, (1997), Korean J. Vet. Res. 37, 809-816). 한국 돼지에서 PED를 제어하기 위해 전국적으로 정기적인 백신 접종을 하고 있음에도, PEDV는 한국 돼지 농장의 생산성에 막대한 피해를 일으키며 지속적으로 발생하고 있다.

PEDV는 니도바이러스 목(order Nidovirales), 코로나바이러스 과(family Coronaviridae)의 알파코로나바이러스(Alphacoronavirus)속에 속하며, 단일가닥이고, 5' 캡 및 3' 폴리아데닐화된 꼬리(polyadenylated tail)를 포함하는 약 28 kb RNA 게놈의 양성-센스 RNA 게놈 바이러스이다(Pensaert and Debouck, (1978), Arch. Virol. 58, 243-247; Saif et al., (2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524). 상기 PEDV 게놈은 5' UTR(untranslated region), 적어도 7개의 ORF(open reading frames)(ORF1a, ORF1b, ORF2 내지 6) 및 3' UTR(Kocherhans et al.,(2001), Virus Genes. 23, 137-144)로 구성된다. ORF1a 및 1b는 게놈의 5'의 3분의 2를 구성하고 비-구조 레플리카아제(replicase) 유전자를 암호화한다. 3' 말단 영역에 존재하는 ORFs는 4개의 주요 구조 단백질, 150-220 kDa의 당화된 스파이크(S) 단백질(glycosylated spike (S) protein), 20-30 kDa의 막(M) 단백질(membrane (M) protein), 7 kDa의 외막(E) 단백질(envelope (E) protein) 및 58 kDa의 뉴클레오캡시드(N) 단백질(nucleocapsid (N) protein)을 암호화한다(Duarte et al.,(1994), Virology. 198, 466-476; Saif, (2012), Wiley-Blackwell, Ames, IA, pp. 501-524).

PEDV의 스파이크 단백질은 추정 신호 펩타이드(putative signal peptide (aa 1-24)), 거대 세포 외 영역, 단일 막관통(transmembrane) 도메인(aa 1,334-1,356) 및 짧은 세포질 꼬리를 포함하는 1,383 내지 1,386 아미노산(amino acids (aa))을 구성하는 타입 I 막 당단백질(glycoprotein)이다. PEDV는 전위 퓨린 절단 부위가 결여되어 스파이크 단백질을 절단하지(uncleaved) 않을지라도, 스파이크 단백질은 다른 코로나바이러스의 스파이크 단백질을 포함하여 상동성을 바탕으로 스파이크 1(aa 1-735) 및 스파이크 2(736-the last aa) 도메인으로 나뉘어 질 수 있다(Duarte and Laude, (1994), J. Gen. Virol. 75, 1195-1200; Lee et al.,(2010), Virus Res. 149, 175-182; Sturman and Holmes, (1984), Adv. Exp. Med. Biol. 173, 25-35). 다른 코로나바이러스의 스파이크 단백질과 마찬가지로, PEDV 스파이크 단백질은 바이러스 침입 역할을 하는 세포 수용체를 포함하는 상호작용 및 자연 숙주에서 중화된 항체를 유도하는 것에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Chang et al.,(2002), Mol. Cells. 14, 295-299). 게다가, 스파이크 1 단백질은 상이한 PEDV 분리주 사이의 유전적 연관성을 측정하기 위해서나, 감별 진단 검사를 개발하기 위한 최적 영역인 것으로 알려져 있다(Lee et al., (2010), Virus Res. 149, 175-182). 따라서, 스파이크 1 도메인의 분자 생물학적 특징을 고려할 때, 상기 스파이크 1 도메인은 PEDV에 대한 효과적인 백신을 개발하기 위한 적절한 표적이 될 수 있다.

본 발명자는 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자를 합성하고, 구조적으로 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 안정적인 돼지-유래 재조합 세포주를 제작하였으며, 상기 재조합 세포주에 의해 생산된 재조합 스파이크 1 단백질이 면역 접종된 토끼 및 돼지 등에서 효과적으로 항체 반응을 유도할 수 있고, PEDV 감염 시, 돼지를 상기 질병으로부터 보호할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 유전자를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 세포주에 의해 생산된, 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 유행성 설사병을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세포주에 의해 생산된, 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 유행성 설사병을 예방하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 돼지 유행성 설사 바이러스 게놈 DNA를 주형으로 목적한 재조합 스파이크 1 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 재조합 스파이크 1 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, PEDV 야외주(field strain)를 이용하여 이의 아미노산 분석을 통해 스파이크 1 유전자 공통 아미노산 서열을 결정하고, 이를 기반으로한 코돈-최적화하여 변경한 뉴클레오티드 서열을 합성하였다(서열번호 1). 상기 합성된 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자는 CD5 신호 서열 및 인간 IgG1의 Fc 도메인을 포함하며, 상기 유전자를 인간 Fc-태그된 융합 단백질인 rS1-Ig을 생산하는 변형된 발현 벡터인 pCDM8-Fc에 클로닝하였다. 최종적으로 상기 재조합 스파이크 1 유전자의 5' 말단에 CD5의 신호서열을 가지고 3' 말단에 인간 Fc 도메인을 가지도록 설계하였다. 이 후, Fc-태그된 PEDV rS1-Ig 절편을 수득하고, SalⅠ 및 XhoⅠ 제한 부위를 이용하여 이를 pFB-Neo 레트로 바이러스 벡터에 삽입하여, PEDV rS1-Ig을 발현하는 재조합 벡터인 pFB-Neo-PEDV-rS1-Ig를 제작하였다. 상기 재조합 레트로 바이러스 벡터를 돼지의 신장 세포 유래의 PK-15 세포주에 형질도입하고, 상기 재조합 레트로 바이러스 벡터가 형질도입된 재조합 세포주를 선발하여 이를 PK-15-PEDV S1-hFc 세포라 명명하였다.

본 발명자는 상기 PK-15-PEDV S1-hFc 세포주를 2014년 4월 22일, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC12580BP를 부여받았다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 재조합 스파이크 1 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결시켜 제조될 수 있다. 여기서, 상기 "발현 벡터"는 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하고 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로서, 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 특정한 숙주 세포에서 외래 유전자의 발현을 효과적으로 유도하는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 입수 가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 pFB-Neo 레트로 바이러스 벡터를 이용하였다. 이러한 발현 벡터의 조절 서열에 본 발명의 재조합 스파이크 1 유전자를 작동가능하게 연결시켜 수득한 DNA 분자를 "재조합 발현 벡터"라고 한다.

상기 세포주는 PK-15-PEDV S1-hFc(수탁번호 KCTC12580BP)인 것이 바람직하다.

본 발명의 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 숙주 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들면 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAEdextran mediated transfection), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection)을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또 다른 최적의 형질전환 방법을 도입할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환된 세포주는 본 발명에 따른 재조합 스파이크 1 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포들은 적합한 배지와 재조합 스파이크 1 단백질의 발현 및/또는 분리를 용이하게 하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해 배양될 수 있다. 배양은 공지 기술을 사용하여 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행한다. 이러한 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 문헌 (예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 공지된 바에 따라 제조할 수도 있다.

상기 재조합 스파이크 1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 재조합 스파이크 1 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 재조합 스파이크 1 단백질의 변이체란 재조합 스파이크 1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 재조합 스파이크 1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명에 있어서, 상기 재조합 스파이크 1 단백질은 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 스파이크 1 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 재조합 스파이크 1 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제로서, 돼지 유행성 설사병의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 능동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 스파이크 1 단백질은 능동 면역을 통하여, 돼지 유행성 설사병을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미한다.

본 발명의 백신 조성물에는 재조합 스파이크 1 단백질 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약학적 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물과 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 스파이크 1 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 스파이크 1 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

상기 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 스파이크 1 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 동물은 바람직하게는 포유류이며, 더욱 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포는 코돈 최적화된 PEDV 스파이크 1 단백질 항원을 손쉽게 수득할 수 있게 하여, 기존의 발현 시스템보다 발현율 및 획득율이 우수한 특징이 있다. 또한, 상기 재조합 세포주로부터 생산된 재조합 스파이크 1 단백질을 항원으로 이용 시 효과적으로 면역반응을 유도할 수 있어, 이를 돼지 유행성 설사병의 예방, 개선 및 치료를 위한 백신, 의약품 및 사료 등에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자를 HEK 293T 세포에 형질 주입하고, 웨스턴 블랏을 통해 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 나타낸 도이다.
도 3은 PK-15-PEDV S1-hFc 세포에서 재조합 스파이크 1 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 PK-15-PEDV S1-hFc 세포에서 발현된 스파이크 1 단백질을 FACS 유세포 분석하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 PK-15-PEDV S1-hFc 세포에서 발현된 스파이크 1 단백질을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 재조합 스파이크 1 단백질을 정제한 결과를 나타낸 도이다(왼쪽은 폰소 S 용액으로 염색한 멤브레인을, 오른쪽은 인간 IgG의 특이항체를 블롯팅한 것을 나타냄).
도 7은 재조합 스파이크 1 단백질에 대한 항체 반응을 나타낸 도이다((A)는 2차 면역 접종하여 수득한 토끼 항체의 반응을 확인한 것임; (B)는 항-인간 IgG 항체; (C)는 PEDV의 스파이크 단백질에 대한 마우스 단클론 항체 특이 반응을 확인한 것임).
도 8은 재조합 스파이크 1 단백질을 면역 접종하여 수득한 토끼 항혈청 및 백신 바이러스 주인 PEDV SM98-1에서 생성된 돼지 고 면역 혈청에 의한 PEDV SM98-1의 중화 반응을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 그룹 1 내지 4에서 분만 6주 전, 3주 전, 분만 전에 수득한 혈청과 백신주인 PEDV SM98-1와의 혈청 중화 반응 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 세포, 바이러스, 항체 및 플라스미드 정보

본 발명에서 사용한 HEK-293T 세포(CRL-1573)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였고, 고포도당(high glucose)(Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (Invitrogen) 및 항생-항진균성 용액(antibiotic-antimycotic solutions)(100; Invitrogen)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다. PK-15 세포는 10% 소태아혈청 및 항생-항진균성 용액을 보충한 RPMI 1640 배지(Invitrogen)에서 배양하였다. 베로(Vero) 세포는 10% 소태아혈청 및 항생-항진균성 용액이 포함된 α-MEM(alpha minimum essential medium) (Invitrogen) 배지에서 배양하였다. 상기 세포들을 가습된 5%, CO₂및 37 ℃가 유지되는 배양기에서 배양하였다. PEDV 백신 주(strain) SM98-1는 농림축산검역본부(Korean Animal and Plant Quarantine Agency)에서 얻었고, 종래에 기술된 방법으로 증식시켰다(Hofmann and Wyler(1998), J. Clin. Microbiol, 26, 2235-2239).

공격(Challenge) PEDV는 야외 바이러스를 포함하는 소장 세포 분쇄액(small intestine homogenate)을 구강 접종한 4일 차 어린 돼지(suckling piglet)의 소장으로부터 분리하였다. 보다 구체적으로, 상기 소장 조직을 모으고, α-MEM을 포함하는 10% 부유물에 넣은 후 MagNa Lyser (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 15초, 7,000 rpm조건으로 3회 반복하여 균일화하였다. 상기 균일화 된 부유물을 4,500g 조건으로 원심분리기(Hanil Centrifuge FLETA5, Incheon, Korea)를 이용하여 분리하였다. 상기 분리된 상층액을 0.22㎛ 공극 사이즈의 syringe filter(Millipore, Billerica, MA)를 통하여 거르고, 분취한 뒤(aliquoted), 조 공격 바이러스(crude challenge virus)로서 사용될 때까지 -80℃ 에서 보관하였다.

겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)-공역된 모든 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. PEDV 스파이크 단백질-특이 모노클로날 항체(monoclonal antibody, MAb)는 경북대학교에서 얻었다. 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)의 스파이크 1 단편을 암호화하는 플라스미드 및 pCDM8-SARSCoV-S1-Ig는 하버드 의학과에서 제공받았다.

실시예 2. 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자 합성 및 클로닝

2-1. 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자 합성 및 클로닝

PEDV 야외주들을 이용한 아미노산 분석을 통해 스파이크 1 유전자 공통 아미노산 서열을 결정하고 이를 돼지 유전자를 기반으로 합성한 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자를 클로닝하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, DNA 조작 및 클로닝은 종래에 알려진 방법(Sambrook and Russell,(2001), Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed)을 따라 수행하였다. E. coli 주(strain) DH5α(RBC Bioscience, Taiwan)는 일반 클로닝의 호스트로서 사용되었다. PEDV 야외주(field strain)인 KNU-0801의 전장 스파이크 1 유전자를 암호화하는 플라스미드인 pCDM8-PEDV-S1-Ig는 종래에 알려진 방법으로 제작하였다(Lee et al.,(2011), J. Microbiol. Biotechnol, 39, 140-145). 스파이크 1 및 이의 변이체(variants)를 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해, PEDV 스파이크 1의 공통 서열은 PEDV 야외 분리주(Lee et al.,(2010), Virus Res, 149, 175-182)의 스파이크 단백질 아미노산 서열의 다중 정렬(multiple alignment)을 기반으로 확인하였고, 종래의 방법(Babcock et al.,(2004), J. Virol, 78, 4552-4560)에 따라 전장, 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 서열을 합성하여 이용하였다. 보다 구체적으로, 원래의 아미노산을 암호화하는 코돈을 다음과 같이 알라닌(GCC), 아르기닌(CGC), 아스파라긴(AAC), 아스팔틱산(GAC), 시스테인(TGC), 글루타믹산(GAG), 글루타민(CAG), 글리신(GGC), 히스티딘(CAC), 이소루신(ATC), 루신(CTG), 리신(AAG), 메티오닌(ATG), 페닐알라닌(TTC), 프롤린(CCC), 세린(TCC), 트레오닌(ACC), 트립토판(TGG), 티로신(TAC), 발린(GTG)으로 바꾸었다. 약 2.2kb의 스파이크 1 유전자(아미노산 서열 25-749)를 인코딩 할 각 아미노산을 코돈-최적화하여 변경한 뉴클레오티드 서열을 합성하였다.

상기 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자는 CD5 신호 서열 및 인간 IgG1의 Fc 도메인(Farzan et al.,(1999), Cell, 96, 667-676)을 포함한다. 상기 유전자를 인간 Fc-태그된 융합 단백질인 rS1-Ig을 생산하는 변형된 발현 벡터인 pCDM8-Fc에 클로닝하였다. 최종적으로 발현되는 재조합 스파이크 1 유전자의 5' 말단에 CD5의 신호서열을 가지고 3' 말단에 인간 Fc 도메인을 가지도록 설계하였다. 이에 해당하는 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

2-2. 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자의 발현 분석

상기 실시예 2-1에서 합성한 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자의 발현율을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, SARS-CoV-rS1(래인 1), 기존 정상 PEDV-S1(래인 2), 상기 실시예 2-1에서 합성한 코돈-최적화-PEDV-rS1(래인 3), C-말단이 절단된 S1 변이체인 PEDV-rS_125-543(래인 4) 및 C-말단이 절단된 S1 변이체인 rS1_25-432(래인 5)의 유전자 발현을 분석하기 위하여, 각 유전자를 HEK-293T 세포주에 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질주입하고 48시간 후 용출 완충액으로부터 단백질을 추출하였다. 그 후, 웨스턴 블랏을 통해 산양 항-인간 IgG-HRP(goat anti-human IgG-HRP) 2차 항체를 이용하여 상기 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 기존 정상 PEDV-S1(래인 2) 단백질은 일시적으로 세포에서 검출할 수 있었지만, 그 발현 정도가 상대적으로 낮고 이후의 단백질 정제 연구에 쓰이기에는 불충분함을 확인하였다. 또한, PEDV-rS_125-543(래인 4) 및 rS1_25-432(래인 5) 단백질은 상기 기존 정상 PEDV-rS1(래인 2)에 비하여 단백질 발현이 강하게 나타남을 확인하였으며, 특히 코돈-최적화-PEDV-rS1 단백질은 코돈 최적화 SARA-CoV rS1(래인 1) 단백질의 발현과 유사하게 높은 수준으로 발현함을 확인하였다.

실시예 3. 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조 및 이를 발현하는 세포주 생산

코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 단백질을 지속적으로 생산할 수 있는 안정적인 세포주를 개발하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2-1에서 합성한 코돈-최적화된 PEDV 스파이크 1 유전자 및 레트로 바이러스 유전자 전달 시스템을 이용하기 위하여, pFB-Neo retrovial vector(Stratagene, La Jolla, CA)에 클로닝을 실시하였다. pCDM8-PEDV opti S1-hFc와 pFB-Neo plasmid를 SalⅠ 및 XhoⅠ으로 절단하고 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 밴드를 확인한 후 gel extraction kit를 이용하여 절편을 분리하였다. SalⅠ및 XhoⅠ으로 잘린 PEDV S1-hFc(약 3.6kb)와 pFB-Neo vector(약 6.3kb)를 라이게이션(ligation)하여 최종적으로 pFB-Neo-PEDV S1-hFc 플라스미드를 제조하였으며, 상기 제작된 플라스미드를 뉴클레오티드 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 상기 pFB-Neo-PEDV S1-hFc 플라스미드를 생산하기 위한 벡터맵을 도 2에 나타내었다.

또한, 고역가의 레트로바이러스를 얻기 위하여 에코트로픽 패키징(ecotropic packaging) 세포주인 HEK-293T 세포주에 상기 플라스미드 pFB-Neo-PEDV S1-Ig, 피막을 형성하는 pVPack-VSV-G(vesicular stomatitis virus G glycoprotein) 및 복제-결함(replication-defective) MMLV(Molony Murine Leukemia virus) gag/pol 유전자를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질주입(transfection)하였다. 상기 과정을 통해 생산된 다클론성 레트로 바이러스(polyclonal retrovirus)를 PK-15 세포주에 접종하고 48시간 이후에 네오마이신(neomycin)(Gibco)을 2000㎍/ml 농도로 첨가하여 선택배양 하였다. 상기 항생제(Neomycin) 처리에 의해 선택된 각각의 세포 클론에서 RT-PCR을 통하여 PED 바이러스 S1 mRNA 발현을 검출하였으며, 결과적으로 재조합 PEDV 스파이크 1 유전자가 성공적으로 세포 내에 삽입되었음을 확인하였다. 이를 PK-15-PEDV S1-hFc 세포라 명명하고, 2014년 4월 22일, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC12580BP를 부여받았다.

실시예 4. PK-15-PEDV S1-hFc 세포의 특성 확인

4-1. 면역 형광 분석(Immunofluorescence assay, IFA)

상기 실시예 3에서 수득한 PK-15-PEDV S1-hFc 세포의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 면역 형광 분석을 수행하였다.

보다 구체적으로, PK-15-PEDV S1-hFc 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에 놓인 현미경 커버 슬립에 배양하였다. 접종 48시간 후, 상기 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10분간 실온에서 고정시키고, 0.2% 트리톤(Triton) X-100를 포함하는 PBS로 10분간 실온에서 세포의 투과화를 증진시킨 뒤(permeabilize), 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 30분간 실온에서 차단하고, 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)(Santa Cruz Biotechnology)을 공역한 산양 항-인간 IgG(goat anti-human IgG) 항체와 함께 배양하였다. 상기 배양된 세포를 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI; Sigma, St. Louis, MO)로 대비 염색하고(counterstaine), fluorescent Leica DM IL LED microscope(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, PK-15-PEDV S1-hFc 세포 내에서 재조합 스파이크 1 단백질이 일정하게 높은 수준으로 발현하며, 항-인간 IgG 항체 특이적으로 세포 염색이 되어 강한 형광을 나타냄을 확인하였다.

4-2. FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석

상기 실시예 3에서 수득한 PK-15-PEDV S1-hFc 세포의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 FACS 유세포 분석기를 이용하여 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 접종 48시간 후 세포를 트립신화(trypsinize)하였고, 5분 동안 250×g(Hanil Centrifuge FLETA 5)로 원심분리하였다. 상기 원심분리된 세포의 펠렛을 차가운 세척 완충액(1% BSA 및 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)이 포함된 PBS)으로 세척하고, 1% 포름알데히드 용액이 포함된 차가운 세척 완충액에 1×10⁶ 개의 세포를 재부유하고, 암 조건, 4℃에서 30분간 세포를 고정시킨 후, 투과화(permeabilization)를 위해 0.2% 트리톤 X-100를 포함하는 PBS에서 37℃로 30분간 배양하였다. 상기 배양한 세포를 원심분리하고 펠렛을 정상 마우스 IgG1 항체(Santa Cruz Biotechnology)가 포함된 완충액에 재부유하고, 4℃로 30분간 배양하였다. 상기 배양된 세포를 세척하고, FITC-공역된 항-인간 혹은 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 암 조건에서 4℃로 30분간 반응시켰다. 상기 과정을 통해 염색된 세포를 세척하고, FACS 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, PK-15-PEDV S1-hFc 세포 대부분은 재조합 스파이크 1 유전자를 발현하고 세포의 동종 집단을 나타내는 특이적인 형광 신호가 일관되게 발현됨을 확인하였다.

4-3. 웨스턴 블랏 분석

상기 실시예 3에서 수득한 PK-15-PEDV S1-hFc 세포의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다.

보다 구체적으로, HEK 293T 세포에 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 이용하여 각 플라스미드를 이입하고, 종래에 기재된(Nam and Lee, (2010), Vet. Microbiol. 144, 41-50) 방법에 따라, 접종 48 시간 후의 세포를 용해 완충액으로 가용화(solubilize)하였다. 세포 용해물은 용해 완충액을 이용하는 시점에 0.1의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)의 비율로 PEDV SM98-1이 감염된 베로 세포를 이용하였다. 상기 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 측정하였다. PK-15-PEDV S1-hFc 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트에 5×10⁵ cells/well로 배양하고, 배양 상층액을 24, 48 및 72시간 간격으로 수득하였다. 용해 가능한 단백질을 프로테아제 억제제와 단백질 A-세파로즈 CL-4B 비드(protein A-Sepharose CL-4B beads)(GE Healthcare)와 함께 4℃에서 16시간동안 면역 침전(immunoprecipitated)하였다. 상기 비드를 5,000×g (Eppendorf centrifuge 5415R, Hamburg, Germany)로 4℃에서 5분간 원심분리하여 모은 후, 0.5 M NaCl이 포함된 PBS로 세 번 세척하였다. 세포 용해물 또는 비드를 4×NuPAGE 샘플 완충액(Invitrogen)에 혼합한 뒤, 70℃에서 10분간 가열하였다. 단백질이 감소되는 조건하에 NuPAGE 4-12% gradient Bis-Tris gel (Invitrogen)로 분리시킨 후, Immunobilon-P (Millipore, Billerica, MA)에 넣어 전기이동(electrotransfer)하였다. 단백질이 옮겨진 막(membrane)을 0.05% Tween-20 (TBST)을 포함하는 TBS(10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl)에 3% powdered skim milk(BD Biosciences, Belford, MA)을 넣어 4℃에서 2시간동안 차단하였다. 그 후, 산양-항 인간 IgG HRP이 공역된 2차 항체; 항-S1 토끼 세럼; 또는 항-PEDV S MAb와 함께 반응시킨 뒤, HRP-라벨된 2차 항체를 상기 반응물이 1:5,000의 비율이 되도록 희석하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응한 단백질을 제조사의 프로토콜에 따라 enhanced chemiluminescence(ECL) 시약(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, PK-15-PEDV S1-hFc 세포에서 약 170-kDa 크기의 재조합 스파이크 1 단백질이 높은 수준으로 점진적으로 분비되는 것을 확인하였다.

실시예 5. 단백질 정제

상기 실시예 3에서 수득한 PK-15-PEDV S1-hFc 세포를 무 혈청 배지(optiPRO SFM; Invitrogen)가 포함된 6-웰 조직 배양 플레이트에 5×10⁵ cells/well의 농도로 배양하였다. 배양 72시간 후, 단백질이 포함된 배양 상층액을 수득하고, 수용성 단백질을 프로테아제 억제제가 있는 단백질 A-세파로즈(A-Sepharose) CL-4B 비드를 이용하여 4℃에서 16시간 동안 면역 침강하였다. 상기 비드를 모으고 세척한 후 샘플을 50 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate)/50 mM 글리신(glycine)(pH 2.0)으로 용해시킨 뒤, 1M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화하였다. 상기 정제된 단백질을 Amicon Ultra centrifugal filters 100K (Millipore)를 이용하여 농축시킨 뒤, BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 농도를 측정하였다. 상기 정제된 단백질을 4 내지 12%의 gradient Bis-Tris gel(Invitrogen)로 분리시킨 후, 니트로셀룰로스 막으로 전기이동(electrotransfer)하였다. 상기 막을 폰소 S(ponceau S) 용액으로 염색하고, 인간 IgG 항체 특이적 반응을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질을 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, PK-15-PEDV S1-hFc 세포에서 약 170 kDa의 크기에 달하는 재조합 스파이크 1 단백질 밴드를 확인하였다. 또한, 6-웰 배양 플레이트의 웰 당 배양된 PK-15-PEDV S1-hFc 세포의 1ml 배양 상층액에서 약 15 내지 20㎍의 재조합 스파이크 1 단백질을 수득할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 토끼 면역 접종

본 발명에 따른 재조합 스파이크 1 단백질 항원에 대한 토끼 항혈청의 재조합 스파이크 1 단백질과의 결합능; 및 재조합 스파이크 1 단백질을 면역 접종하여 수득한 토끼 항혈청에 의한 백신 바이러스 주인 PEDV SM98-1의 중화효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 5에서 정제된 재조합 스파이크 1 단백질 250 ㎍을 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 함께 두 마리의 뉴질랜드 흰 토끼의 피부 내에 면역 접종하였다. 그 후, 상기 실시예 5에서 정제된 재조합 스파이크 1 단백질 250 ㎍을 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)와 함께 2주 간격으로 4회 동안 2차 추가 접종(boosted)하여, 항혈청을 수득하였다. 전-면역 혈청(Pre-immune sera)은 면역 접종하기 전에 수득하였다.

그 후, 재조합 스파이크 1 단백질을 면역 접종하여 수득한 토끼 항혈청과 재조합 스파이크 1 단백질의 항체 반응을 확인하기 위하여, 이의 결합 반응을 관찰하였다. 백신 바이러스 SM98-1를 접종한 베로 세포; 및 정제된 재조합 스파이크 1 단백질의 세포 용해물을 준비하고, 이에 상기 수득한 토끼 항혈청(도 7(A)의 α-rS1 rabbit serum), 인간 IgG1의 Fc 영역을 융합한 단백질을 정확하게 인식하는 항-인간 IgG 항체(도 7(B)의 α-human IgG Ab) 및 마우스 단클론 항체(도 7(C)의 α-PEDV spike Ab)와의 항체 반응을 확인하였다. 보다 구체적으로, 농도별로 4 내지 12% 구배 비스-트리스 겔에서 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 후, 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

또한, 재조합 스파이크 1 단백질을 면역 접종하여 수득한 토끼 항혈청에 의한 백신 바이러스 주인 PEDV SM98-1의 중화를 확인하기 위하여, 상기 면역 접종 전 수득한 혈청; 2차 추가 접종하여 수득한 토끼 항혈청; 및 백신 바이러스 주인 PEDV SM98-1에서 생성된 돼지 고 면역 혈청(hyperimmune serum)을 준비하였다. 트립신을 포함한 베로 세포(원숭이 신장세포)에서 배양한 백신 바이러스 주인 PEDV SM98-1에 대한 중화반응을 수행하고, 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 7(A)에 나타낸 바와 같이, 토끼 항혈청은 정제된 재조합 스파이크 1 단백질(rS1-Ig)과 농도 의존적으로 반응함을 확인하였다. 그러나, PEDV 백신주(SM98-1) 단백질과는 약하게 결합함을 확인하였다.

또한, 도 7(B)에 나타낸 바와 같이, 항-인간 IgG 항체는 정제된 재조합 스파이크 1 단백질(rS1-Ig)과 농도 의존적으로 반응함을 확인하였다. 그러나, PEDV 백신주(SM98-1) 단백질과는 결합하지 않음을 확인하였다.

또한, 도 7(C)에 나타낸 바와 같이, 마우스 단클론 항체는 PEDV 백신주(SM98-1) 단백질과는 강하게 결합함을 확인하였으나, 정제된 재조합 스파이크 1 단백질(rS1-Ig)과는 결합하지 않음을 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 2차 추가 접종하여 최종적으로 수득한 토끼 항혈청은 1:16의 중화 항체 역가를 보이며 PEDV SM98-1 감염된 베로 세포를 충분히 보호함을 확인하였다. 돼지 고 면역 혈청은 1:256이상의 중화 항체 역가가 나타날 때 바이러스 감염 억제 효과가 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 재조합 스파이크 1 단백질은 효과적으로 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 스파이크 1 단백질을 면역 접종한 토끼 항혈청은 야외 분리주의 스파이크 단백질을 나타내는 상동 스파이크 1 단백질을 강하게 인식함을 확인하였다.

실시예 7. 돼지 접종 실험

본 발명의 in vivo 돼지 실험은 동물 보호 및 사용 위원회에서 발표한 지침하에 중앙 백신 연구소에서 수행하였다. 8마리의 임신 돼지(pregnant sow)는 어떠한 발병도 없고, PEDV 백신 접종도 하지 않은 돼지 농장에서 얻었고, 2마리씩 총 4 그룹으로 나누었다. 상기 돼지는 PEDV에 대해 무항체인 것으로 간주하고, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 면역원성(immunogenicity) 실험을 수행하였다. 그룹 1의 돼지는 중앙 백신 연구소에서 구입한 희석한 PEDV 생백신(live vaccine) 및 비활성된 PEDV 백신을 분만 전에 2주 간격으로 근육 내에 접종하였다. 그룹 2의 돼지는 PEDV 생백신 및 400 ㎍의 재조합 스파이크 1 단백질 및 수중 유형 보조제(oil-in-water adjuvant)를 2주 간격으로 근육 내에 접종하였다. 상기 PEDV 생백신 및 비활성된 백신은 중앙 백신 연구소에서 공급받았으며, 이의 메뉴얼에 따랐다. 그룹 3의 돼지에는 오일 보조제를 혼합한 400 ㎍의 재조합 스파이크 1 단백질을, 그룹 4에는 위약(placebo)으로서 세포 배양 배지를 각각 2주 간격으로 3회 근육 내에 접종하였다.

또한, 혈액 샘플 및 초유를 분만 전, 분만 시에 각 3주 간격으로 수집하였다. 8마리의 4 내지 5일생 새끼 돼지를 각 임신 돼지로부터 접종군 및 대조군을 무작위로 선별하였다. 모든 그룹의 새끼 돼지에는 종래의 방법(Kim et al.,(2007), J. Virol. Methods. 146, 172-177)에 따라 real-time RT-PCR에 의해 확인된 10⁵ TCID₅₀/ml 의 PEDV 야외 바이러스를 포함하는 1 ml 소장 세포 분쇄액을 경구 접종하였다. 상기 접종된 새끼 돼지에서 설사 및 사망의 임상적 증상을 매일 관찰하였다. 모든 그룹에서 대변 샘플을 면봉으로 매일 수집하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 TGE/PED Detection Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 접종군 및 대조군의 모든 새끼 돼지는 사후 검사를 위하여 접종 5일후에 안락사시켰다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Group	Prior to farrowing
Group	6 weeks	4 weeks	2 weeks
1	Placebo^a	PEDV live vaccine^b	Inactivated PEDV vaccine^b
2	Placebo	PEDV live vaccine	PEDV S1 immunogen
3	PEDV S1 immunogen^a	PEDV S1 immunogen	PEDV S1 immunogen
4	Placebo	Placebo	Placebo
^a 위약(Placebo)(세포 배양 배지) 및 단백질(PEDV S1)의 면역 접종은 수중 유형 보조제를 포함하여 근육내 주사한 것임. ^b 일반적인 PEDV 생백신 및 비활성화 백신은 제조사의 지시에 따라 근육내 투여함.

Sow group	Piglet no.	Days after oral challenge
Sow group	Piglet no.	0	1	2	3	4	5
1	1	-^a	-	+	+	+	+
1	2	-	-	+++^a	++^a	++	++
2	1	-	-	+	-	-	-
2	2	-	-	+	+	+	+
3	1	-	-	+	+	+	+
3	2	-	-	+	+	-	-
4	1	-	-	Died^b	ND^c	ND	ND
4	2	-	-	+++	+++	+++	+++
^a-, 설사하지 않음; +, 경미한 설사; ++, 적당한 설사; +++, 심각한 설사 ^b RT-PCR 및 부검 진단으로 확인한 PEDV 감염으로 인한 사망. ^c 실험 새끼 돼지의 사망으로 판별하지 않음

표 2에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 한 마리의 새끼 돼지가 사망하고, 다른 새끼 돼지는 접종 후 심각한 물 설사를 함을 확인하였다. 면역 접종된 접종군 중에서는 새끼 돼지가 사망하지는 않았지만, 각 그룹에 따라 접종 후 설사 증상이 나타난 새끼 돼지가 나타남을 확인하였다. 그룹 1의 모든 새끼 돼지는 접종 후 2일 째에 경미하거나 심각한 설사 증세가 나타났으며, 이에 반해, 그룹 2 및 그룹 3에서는 접종 후 1 내지 2일, 또는 실험 기간 동안 경미한 설사 증상이 나타나거나, 설사 증상이 없이 새끼 돼지가 건강한 상태로 있음을 확인하였다.

실시예 8. 혈청 중화(Serum neutralization) 시험

혈청의 PEDV-특이 중화 항체, 상기 실시예 7의 그룹 1 내지 4의 모든 암돼지에서 수득한 초유(colostrum) 샘플 및 백신주인 PEDV SM98-1을 이용하여 96-웰 마이크로 플레이트에서 혈청 중화 시험(serum neutralization (SN) test)을 수행하였다.

보다 구체적으로, 백신주인 PEDV SM98-1를 50 ㎕ 부피의 200 PFU로 만들기 위하여 무혈청 α-MEM으로 희석하였다. 96 웰 플레이트에 상기 희석된 바이러스를 처리하고, 상기 실시예 7의 그룹 1 내지 4에서 수득한 비활성된 혈청을 50 ㎕의 2-폴드 희석액을 포함하게 하여 혼합하고, 37 ℃에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, 100 ㎕의 α-MEM을 포함하는 1×10⁴ 베로(Vero) 세포를 각 웰에 첨가한 뒤, 37℃, 5% 및 CO₂조건하에 3 내지 4일동안 배양하였다. 중화 역가(neutralization titer)는 바이러스-특이적인 모든 복제된 웰에서 세포 변성 효과를 억제하는 최고 혈청 희석액의 역수로서 산출되었다. 크리스탈 바이올렛-포름알데히드 염색제(0.013% 크리스탈 바이올렛, 2.5% 에탄올 및 0.01 M PBS를 포함하는 10% 포름알데히드)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 염색하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 면역 접종하지 않은 돼지(그룹 4)에서는 최소한의 중화 항체 역가를 보였으나, 면역 접종한 돼지(그룹 1 내지 3)에서는 최종 백신 접종한 후에 상당히 증가된 중화 항체 역가가 점차적으로 증가함을 확인하였다. 또한, 그룹 1에서는 분만 시 1:512 이상의 중화 역가를 나타남을 확인하였다. 그러나, 그룹 2 및 그룹 3에서는 상기 그룹 1과 비교하였을 때 1:16 내지 1:32의 낮은 중화 항체 역가가 나타남을 확인하였다. 특히, 각 그룹의 초유 샘플은 혈청 샘플과 유사한 중화 항체 역가가 나타남을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 사료 조성물의 제조

재조합 스파이크 1 단백질 100 mg

비타민 E 0.7 mg

L-카르니틴 0.7 mg

통상의 사료 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 사료를 제조한다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC12580BP

20140422

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Recombinant cell expressing recombinant spike 1 protein of porcine epidemic diarrhea virus <130> KNU1-181 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2988 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized PEDV recombinant spike 1 gene <400> 1 gtcgacacca tgcccatggg gtctctgcaa ccgctggcca ccttgtacct gctggggatg 60 ctggtcgctt ccgtgctagc ctgctccgcc aacaccaact tccgccgctt cttctccaag 120 ttcaacgtgc aggcccccgc cgtggtggtg ctgggcggct acctgcccat cggcgagaac 180 cagggcgtga actccacctg gtactgcgcc ggccgccacc ccaccgcctc cggcgtgcac 240 ggcatcttcc tgtcccacat ccgcggcggc cacggcttcg agatcggcat ctcccaggag 300 cccttcgacc cctccggcta ccagctgtac ctgcacaagg ccaccaacgg caacaccaac 360 gccaccgccc gcctgcgcat ctgccagttc ccctcctcca agaccctggg ccccaccgcc 420 aacgacgacg tgaccaccgg ccgcaactgc ctgttcaaca aggccatccc cgcccacatg 480 tccgagcact ccgtggtggg catcacctgg gacaacgacc gcgtgaccgt gttctccgac 540 aagatctacc acttctactt caagaacgac tggtcccgcg tggccaccaa gtgctacaac 600 tccggcggct gcgccatgca gtacgtgtac gagcccacct actacatgct gaacgtgacc 660 tccgccggcg aggacggcat ctcctaccag ccctgcaccg ccaactgcat cggctacgcc 720 gccaacgtgt tcgccaccga gtcccccggc cacatccccg agggcttctc cttcaacaac 780 tggttcctgc tgtccaacga ctccaccctg ttccacggca aggtggtgtc caaccagccc 840 ctgctggtga actgcctgtg ggccatcccc aagatctacg gcctgggcca cttcttctcc 900 ttcaaccaga ccatcgacgg cgtgtgcaac ggcgccgccg cccagcgcgc ccccgaggcc 960 ctgcgcttca acatcaacga cacctccgtg atcctggccg agggctccat cgtgctgcac 1020 accgccctgg gcaccaacct gtccttcgtg tgctccaact cctccgaccc ccacctggcc 1080 accttcgcca tccccctggg cgccacccag gtgccctact actgcttcct gaaggtggac 1140 acctacaact ccaccgtgta caagttcctg gccgtgctgc cccccaccgt gcgcgagatc 1200 gtgatcacca agtacggcga cgtgtacgtg aacggcttcg gctacctgca cctgggcctg 1260 ctggacgccg tgaccatcaa cttcaccggc cacggcaccg acgacgacgt gtccggcttc 1320 tggaccatcg cctccaccaa cttcgtggac gccctgatcg aggtgcaggg caccgccatc 1380 cagcgcatcc tgtactgcga cgaccccgtg tcccagctga agtgctccca ggtggccttc 1440 gacctggacg acggcttcta ccccatctcc tcccgcaacc tgctgtccca cgagcagccc 1500 atctccttcg tgaccctgcc ctccttcaac gaccactcct tcgtgaacat caccgtgtcc 1560 gcctccttcg gcggccactc cggcgccaac ctgatcgcct ccgacaccac catcaacggc 1620 ttctcctcct tctgcgtgga cacccgccag ttcaccatcc gcctgttcta caacgtgacc 1680 tcctcctacg gctacgtgtc caactcccag gactccaact gccccttcac cctgcagtcc 1740 gtgaacgact acctgtcctt ctccaagttc tgcgtgtcca cctccctgct ggcctccgcc 1800 tgcaccatcg acctgttcgg ctaccccgac ttcggctccg gcgtgaagtt cacctccctg 1860 tacttccagt tcaccaaggg cgagctgatc accggcaccc ccaagcccct ggagggcgtg 1920 accgacgtgt ccttcatgac cctggacgtg tgcaccaagt acaccatcta cggcttcaag 1980 ggcgagggca tcatcaccct gaccaactcc tccttcctgg ccggcgtgta ctacacctcc 2040 gactccggcc agctgctggc cttcaagaac gtgacctccg gcgccgtgta ctccgtgacc 2100 ccctgctcct tctccgagca ggccgcctac gtggacgacg acatcgtggg cgtgatctcc 2160 tccctgtcca actccacctt caacaacacc cgcgagctgc ccggcttctt ctaccactcc 2220 aacgacggct ccaactgcac cgagcccgtg ctggtgggcc tggtgcccag gggctcggat 2280 cccgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 2340 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2400 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2460 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2520 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2580 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2640 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 2700 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 2760 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2820 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2880 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2940 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gactcgag 2988 <210> 2 <211> 990 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant spike 1 protein <400> 2 Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly 1 5 10 15 Met Leu Val Ala Ser Val Leu Ala Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe Arg 20 25 30 Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp 50 55 60 Tyr Cys Ala Gly Arg His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe 65 70 75 80 Leu Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln 85 90 95 Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr 100 105 110 Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asp Asp Val Thr Thr Gly 130 135 140 Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His 145 150 155 160 Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser 165 170 175 Asp Lys Ile Tyr His Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala 180 185 190 Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu 195 200 205 Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile 210 215 220 Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val 225 230 235 240 Phe Ala Thr Glu Ser Pro Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn 245 250 255 Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Phe His Gly Lys Val 260 265 270 Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Trp Ala Ile Pro Lys 275 280 285 Ile Tyr Gly Leu Gly His Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp Gly 290 295 300 Val Cys Asn Gly Ala Ala Ala Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe 305 310 315 320 Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu 325 330 335 His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser 340 345 350 Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val 355 360 365 Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr 370 375 380 Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr 385 390 395 400 Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly 405 410 415 Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp 420 425 430 Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala 435 440 445 Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp 450 455 460 Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp 465 470 475 480 Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln 485 490 495 Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val 500 505 510 Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu 515 520 525 Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp 530 535 540 Thr Arg Gln Phe Thr Ile Arg Leu Phe Tyr Asn Val Thr Ser Ser Tyr 545 550 555 560 Gly Tyr Val Ser Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln 565 570 575 Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser 580 585 590 Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Asp Phe 595 600 605 Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly 610 615 620 Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val 625 630 635 640 Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe 645 650 655 Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly 660 665 670 Val Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val 675 680 685 Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln 690 695 700 Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser 705 710 715 720 Asn Ser Thr Phe Asn Asn Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His 725 730 735 Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Gly Leu Val 740 745 750 Pro Arg Gly Ser Asp Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 755 760 765 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 770 775 780 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 785 790 795 800 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 805 810 815 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 820 825 830 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 835 840 845 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 850 855 860 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 865 870 875 880 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 885 890 895 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 900 905 910 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 915 920 925 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 930 935 940 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 945 950 955 960 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 965 970 975 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 980 985 990

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)의 재조합 스파이크 1(spike 1) 유전자.
제1항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제2항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포주.
제3항에 있어서,
상기 세포주는 수탁번호 KCTC12580BP인 것을 특징으로 하는 PK-15-PEDV S1-hFc 세포주.
제3항 또는 제4항에 따른 세포주에 의해 생산된, 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질.
제5항에 있어서,
상기 재조합 스파이크 1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질.
제5항에 따른 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방용 백신 조성물.
제5항에 따른 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 따른 재조합 스파이크 1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제7항에 따른 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 유행성 설사병을 예방하는 방법.