KR20210136471A - 구제역 바이러스 억제 활성을 갖는 신규한 돼지 인터페론-알파 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 억제 활성을 갖는 신규한 돼지 인터페론-알파 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 돼지 항체의 Fc 영역이 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분의 N 말단에 결합된 돼지 인터페론-알파 융합 단백질은 안정성이 개선되어 생체 내에서 오랫동안 유지되고, 구제역 오일 백신과 함께 혼합접종 시 구제역 바이러스를 빠르게 억제함과 동시에 중화항체의 생성을 단시간 내에 유도하여, 그에 따라 구제역을 초기에 방어할 수 있음을 확인하였다.

Description

구제역 바이러스 억제 활성을 갖는 신규한 돼지 인터페론-알파 융합 단백질 및 이의 용도 {New porcine IFN-α fusion protein inhibiting foot-and-mouth disease and uses thereof}

본 발명은 구제역 바이러스 억제 활성을 갖는 신규한 돼지 인터페론-알파 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 돼지 항체의 Fc 영역이 링커를 통해 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분의 N 말단에 결합된 돼지 인터페론-알파 융합 단백질은 안정성이 개선되어 생체 내에서 오랫동안 유지되고, 종래의 구제역 오일 백신과 혼합접종 시 구제역 바이러스를 빠르게 억제함과 동시에 중화항체의 생성을 단시간 내에 유도하여, 구제역을 초기에 방어할 수 있음을 확인하였다.

구제역(foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로, 빠른 복제와 급속하게 전파되는 것이 특징이다. 구제역 바이러스는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae) 과(family), 아프소바이러스(Apthovirus) 속(sp.)에 속하며, 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3)으로 분류된다.

구제역에 대한 방어 대책으로 사용되고 있는 긴급 백신(emergency vaccine)을 돼지에 접종하였을 경우, 최소 7일 이후 구제역 바이러스 감염에 대한 방어능이 형성된다(Salt JS et al., 1998, Vaccine, 16:746-754). 돼지의 경우, 배출하는 바이러스 양이 소보다 월등히 많고, 감염 후 24시간 이내에 바이러스를 호흡기를 통해 배출하므로 백신 접종 후 방어능이 형성되기 전까지 바이러스 전파의 위험성은 매우 크다. 따라서 이에 대한 대비책으로 구제역 백신과 항바이러스제의 병용 연구가 활발히 수행되어 왔다.

특히, 인터페론-알파는 바이러스 억제 효과 뿐만 아니라, 면역 유도를 위한 아쥬반트(adjuvant)로서의 효과도 보고되어, 효과적인 백신 병용제로서 제시된 바 있다(Su C et al., 2013, PLos One, 8:e66134). 그러나, 인터페론은 생체 내 지속시간이 짧다는 점에서 제약이 있기 때문에, 해당 기술분야에서 인터페론의 생체 내 지속시간 개선에 대한 필요성은 여전히 존재한다.

이러한 배경하에, 본 발명의 발명자들은 구제역 백신과 병용하였을 때, 항체 유도에 의한 방어가 가능한 시기까지 효과가 지속되는 인터페론-알파 단백질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 공통 서열(consensus sequence)을 포함하는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 구제역 바이러스 억제 효과를 장시간 동안 지속적으로 유지할 수 있고, 종래의 구제역 오일 백신과 사용 전에 간편하게 혼합하여 투여할 수 있어 사용 편이성이 높고, 단 시간 내에 유의한 방어 효과를 유도할 수 있고, 적어도 접종 4일 후부터 중화항체가가 상당히 증가되어 구제역 바이러스에 대한 초기 방어에 매우 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분과 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역의 융합단백질(이하, '돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질'이라 약칭함; 영문 표기시'poINF-α-Fc protein'으로 기재함)을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는, 돼지 인터페론-알파 부분 및 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역을 포함하는 융합단백질일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는, 본 발명에 따른 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명에 따른 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분 및 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역을 포함하는 융합단백질로서, 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명에 따른 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분 및 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역을 포함하는 융합단백질로서, 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명에 따른 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분 및 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역을 포함하는 융합단백질로서, 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방용 및/또는 구제역 바이러스 감염증 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 사료 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 선택적으로 오일 아쥬번트와 함께, 유효량의 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법을 제공하는 것이다.

이하의 본 명세서에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 일 실시형태에서, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분 및 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역을 포함하는 재조합 융합단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질은 돼지 유래 IgG 항체의 신호서열, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분, 소정 길이의 펩타이드 링커, 및 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역이 순서대로 작동가능하게 연결된 재조합 융합단백질일 수 있다.

더 구체적으로, 본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 돼지 유래 IgG 항체의 중쇄 신호서열, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분, 글리신(G)-시스테인(S)을 포함하는 반복단위로 구성된 GS 링커, 및 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역이 순서대로 작동가능하게 연결되어 있고, 제거가능한 히스티딘(His) 태그를 포함하는 시스테인 프로테아제(cysteine protease) 계열 인식 부위를 추가로 포함하는 재조합 융합단백질일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "인터페론-알파"는 척추동물의 면역세포에서 만들어지는 자연 단백질인 인터페론 중 1형 인터페론이 결합하는 수용 복합체로서, 바이러스, 박테리아, 기생충, 종양 등 외부 감염원 내지 침입체에 대응하여 면역반응을 향상시킨다. 본 명세서에 사용된 용어 "돼지 인터페론-알파 부분"은 돼지에서 발현되는 1형 인터페론이 결합하는 수용 복합체 및/또는 완전한 또는 전장 돼지 인터페론-알파 단백질로부터 유래한 기능적으로 정상인 그의 일부를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "돼지 유래 항체 IgG 클래스"는 돼지로부터 유래된 면역글로블린 G로 일컬어지는 항체 개별형 중 하나이다. 동일한 중쇄 및 경쇄가 각각 2개로 구성된 단량체이며, 항원결합자리가 2개 존재한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "Fc 영역"은 일반적으로 항체의 불변영역을 지칭하며, 본 발명에서 Fc 영역은 IgG의 모든 서브클래스에서 유래될 수 있다. 상기 항체는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질"은 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 단백질 또는 그의 일부와 Fc 부분이 링커로 연결된 재조합 융합단백질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "돼지 유래 IgG 항체의 신호서열"은 본 발명에 따른 재조합 융합단백질의 안정적인 발현 및 분비를 유도하기 위해 융합단백질의 상류에 도입된 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 본 발명에 따른 일 실시형태에서, 상기 신호서열은 IgG 항체의 중쇄에서 유래된 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 상기 신호 서열은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열 중의 위치 1부터 위치 57까지의 염기서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 염기서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 상기 신호 서열은 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 돼지 인터페론-알파의 "공통 서열(consensus sequence)"은 17개 아형(subtype) 돼지 IFN-α에서 가장 빈번하게 나타나는 염기서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드로서, 기능적으로 더 우수한 항바이러스 효과와 면역유도효과를 나타내는 특징을 보유하는 한(문헌 [Ozes ON et al., A comparison of interferon-Con1 with natural recombinant interferons-alpha: antiviral, antiproliferative, and natural killer-inducing activities. J Interferon Res. 1992 Feb;12 (1):55-9. 참고], 소정의 상동성을 갖는 염기서열에 의해 암호화될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 염기서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 상기 공통 서열은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열 내 위치 58부터 위치 555까지의 염기서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 염기서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 공통 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 내 위치 20부터 위치 185까지의 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 공통 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 '링커'는 융합 단백질의 구조형성에 유리하도록 유연성(flexibility)을 부여할 수 있는 소정 아미노산 길이의 링커를 지칭한다. 일예로, 글리신 및 시스테인을 포함하는 반복단위로 구성된 GS 링커일 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서 GS 링커를 사용하는 경우, GS 링커는 [GSGS], [GGGS], [GGGGS], [GGSGG], [GGGSS], [GGGS GGGGS GGGS] 등의 반복단위가 적어도 2회 이상, 바람직하게는 3회 이상 연속적으로 반복될 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, GS 링커로서 [GGGS]₃를 도입하는 것이 본 발명의 재조합 융합 단백질의 발현 효율, 정상 기능을 갖는 단백질 생산 측면에서 유리할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 융합단백질에서 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역은 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열 내 위치 592부터 1212까지의 염기서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 염기서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 따른 일 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드 서열 내 위치 198부터 404까지의 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.

본 명세서서 사용된, 용어 '시스테인 프로테아제(cysteine protease) 계열 인식 부위'는 본 발명에 따른 재조합 융합단백질을 발현시킬 수 있는 적합한 발현 시스템에서 시스테인 프로테아제 계열의 프로테아제가 인식하여 분해할 수 있는 부위를 지칭한다. 본 발명에 따른 시스테인 프로테아제(cysteine protease) 계열 인식 부위는 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질의 안정적인 발현 및 기능적으로 완전한 단백질의 생산을 보조하고, 히스티딘 태그를 이용한 단백질 정제 후 이 태그의 간편한 제거를 가능케 한다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 시스테인 프로테아제 계열의 프로테아제 인식 부위는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 인식 부위일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, TEV 프로테아제 인식 부위는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열 내 위치 1213부터 1238까지의 염기서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 염기서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 일 실시형태에서, TEV 프로테아제 인식 부위는 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드 서열 내 위치 405부터 413까지의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, TEV 프로테아제 인식 부위는 서열번호 6의 폴리펩타이드 서열 또는 이와 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 재조합 융합단백질의 분리 및 정제를 위해 히스티딘 태그(Tag)가 말단에 단독으로 또는 시스테인 프로테아제 계열의 프로테아제 인식 부위와 함께 부가될 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 히스티딘 태그는 TEV 프로테아제 인식 부위 다음에 부가될 수 있다. 히스티딘 태그의 길이는 단백질 정제 효율을 고려하여 적절히 조정될 수 있으나, 적어도 4개 이상, 바람직하게는, 적어도 6개 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역 다음에, 제거가능한 형태의 히스티딘 태그를 포함하는 시스테인 프로테아제 계열 프로테아제 인식 부위가 도입된 상태로 발현되고, 태그 제거 및 단백질 정제를 거쳐 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 히스티딘 태그 제거 후 수득한 본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 면역원성 및/또는 중화항체 유도와 직접적 관련성이 없을 뿐 아니라, 존재시 오히려 면역원성, 중화항체 유도 활성, 제형화 등에 불리하게 작용할 것으로 추정되는 TEV 프로테아제 인식 부위를 지님에도 불구하고, 실제 목적 동물인 돼지에 투여시, 4일 이내의 짧은 기간 내에 우수한 중화항체역가를 나타내었고, 또 종래 오일 형태의 구제역 백신(에멀젼 형태)과 혼용시에도 관찰가능한 부작용 없이 유의한 구제역 바이러스 억제 효능을 나타내었다.

본 발명에 따른 재조합 융합단백질이 돼지 유래 IgG 항체의 중쇄 신호서열, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파, 글리신(G)-시스테인(S)을 포함하는 반복단위로 구성된 GS 링커, 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역, TEV 프로테아제 인식 부위 및 히스티딘 태그로 이루어지는 경우, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화되는 재조합 융합단백질 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드 서열을 갖는 재조합 융합단백질일 수 있다.

본 발명의 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질은 통상의 단백질 분리방법을 이용하여 분리할 수 있다. 구체적으로, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이온교환 크로마토그래피, 친화성, 소수성 또는 크기별 배제 크로마토그래피, 전기영동, 암모늄 설페이트 침전과 같은 분별용해도, SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 방법을 통해 정제될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 분리 및 정제된 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 및 상기 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 일부 아미노산이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질"이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 융합단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 본 명세서서 내에서 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, 참고문헌(Pearson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444)에 기재된 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453)을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 예를 들어, GCG 프로그램 패키지(Devereux J. et al., 1984, Nucleic Acids Research, 12:387), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul S.F. et al., 1990, J MOLEC BIOL, 215:403 및 Carillo et al., 1998, SIAM J Applied Math, 48:1073) 등을 이용할 수 있다. 또한 무료로 접근하여 이용할 수 있는 BLAST 또는 ClustalW를 통해 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, 참고문헌(Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math, 2:482 및 Needleman et al., 1970, J Mol Biol. 48:443)에 개시된 것과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 참고문헌(Schwartz and Dayhoff, 1979, National Biomedical Research Foundation, 353-358 및 Gribskov et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14:6745)에 기술된 것과 같은 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 용어, "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)을 나타낸다.

본 발명의 다른 양상의 일 실시형태에서, 본 발명은 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기서 사용된, 용어 “인터페론-알파-Fc 융합단백질"은 상기 기재된 바와 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "벡터(vector)"는 유전자 또는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 해당 기술분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 염기서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 한 양상의 일 실시형태에서, 본 발명은 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파와 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역의 융합단백질인 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스에 대한 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기서 사용된, 용어 “인터페론-알파-Fc 융합단백질"은 상기 기재된 바와 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “구제역 바이러스"는 항원 변이성이 가장 높은 바이러스 중 하나이며, 복제 과정에서 3D 폴리머라제가 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문에 다양한 혈청형이 존재한다. 상기 구제역 바이러스에는 7개의 혈청형이 존재하고, 혈청형이 동일하다 하더라도 바이러스 종(strain)별로 방어효과가 상이하다. 상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 구제역 바이러스의 혈청형으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈청형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “구제역"은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 국제수역사무국(OIE)에 의하여 리스트(List) 질병으로 분류되어 있으며, 축산물의 국가간 교역에 있어 매우 중요한 요소로 작용하고 있다. 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데과(Piconaviridae) 과, 아프소바이러스(Apthovirus) 속에 속한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적 제제로서, 구제역 또는 구제역 바이러스의 예방을 위해 생물체에 주입 또는 주사하여 생체 내 면역이 생기도록 하는 면역원을 의미한다.

본 발명의 백신 조성물은 융합단백질 외에 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아쥬반트는 보조제로서, ISA 201 (Seppic, France) 또는 ISA 206 (Seppic, France)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 아쥬반트를 더 포함하여 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상의 일 실시형태에서, 본 발명은 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파와 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역의 융합단백질인 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기서 사용된, 용어 “인터페론-알파-Fc 융합단백질" 및 "구제역"은 상기 기재된 바와 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “구제역 바이러스 감염 예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여로 구제역 바이러스의 감염을 억제 또는 지연시키고, 결과적으로 구제역 바이러스 감염증의 발현을 사전에 차단하는 모든 병리학적 및/또는 약제학적, 및/또는 수의학적 효능 및 효과를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “구제역 바이러스 감염증"은 구제역을 일으키는 바이러스가 감염되어 병리학적 증상이 나타나는 질환을 의미한다. 상기 구제역 바이러스는 소, 돼지, 양 등의 발굽이 2개로 갈라진 우제류만을 감염시키는 바이러스로, 수포를 유발하여 구제역 바이러스로 명명하였다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “치료"는 치료하고자 하는 대상체(세포 포함)의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 상기 약학적 조성물의 투여로 구제역의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료용 약학적 조성물"은 대상체, 구체적으로는 돼지를 포함하는 구제역 바이러스 감염 위험이 있는 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 해당 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제형은 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 생착(engraftment)을 촉진하는 화합물(예를 들어 항-T세포 수용체 항체, 면역 억제제 등), 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 하이드록시에틸 전분 등의 안정제를 하나 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 형태는 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

부형제는 투여를 위해 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 액상 또는 에어로솔 투여 형태의 사용에 적합한 부형제는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향료 성분, 보존제, 및 착색 성분을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 경구 투여 형태(예를 들어, 파우더, 정제, 캅셀제 및 캐플릿)에서 사용하기에 알맞은 부형제의 예는 전분, 설탕, 미결정 셀룰로오스, 부형제, 과립화제, 활택제, 결합제 및 붕해제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여의 편리함 때문에, 정제 및 캅셀제는 가장 유용한 경구 투여 유닛 형태이고, 이 경우 고형 부형제가 적용된다. 바람직하게는 정제는 표준 수상 또는 비수상(nonaqueous) 기술을 이용하여 코팅될 수 있다. 본 발명의 경구 투여 형태에서 사용될 수 있는 부형제의 예는 결합제, 충진제, 붕해제, 및 활택제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 약학적 조성물 및 투여 형태에서의 사용에 적당한 결합제는 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 다른 전분, 젤라틴, 아카시아와 같은 천연 및 합성 검류, 소디움 알지네이트, 알지닉 산, 다른 알지네이트, 분말 트라가칸트(powdered tragacanth), 구아검(guar gum), 셀룰로오스 및 그의 유도체(예를 들어, 에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 카복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 소디움 카복시메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 파이로리돈, 메틸셀룰로오스, 프리-젤라틴화 전분, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로로스, 미결정 셀룰로오스, 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 붕해제는 정제가 수성 환경에 노출되었을 때 붕해되도록 하기 위하여 사용된다. 너무 많은 붕해제를 포함한 정제는 보관 중에 붕해될 수 있는 반면, 너무 적게 포함한 정제는 바람직한 조건 하에서 바람직한 속도로 붕해되지 않는다. 따라서 활성 성분의 방출을 조절하는데 나쁘지 않도록 너무 많지도 너무 적지도 않은 충분한 붕해제의 양이 본 발명의 고형 경구 투여 형태를 형성하기 위해 사용되어야 한다. 사용된 붕해제의 양은 제제의 타입에 따라 다양하고, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 쉽게 판단할 수 있다. 통상 약 0.5 내지 약 15 중량 퍼센트의 붕해제, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 중량 퍼센트의 붕해제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 활택제는 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 미네랄 오일, 경질(light) 미네랄 오일, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 글리콜, 스테아릭 산, 소디움 라우릴 설페이트, 탈크, 수소화 식물유(예를 들어, 땅콩 유, 면실 유, 해바라기 유, 참깨 유, 올리브 유, 옥수수 유, 및 콩 유), 건크 스테아레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 라우레에이트, 아가, 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분이 분해하는 속도를 줄일 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 상기 화합물은 안정화제, 아스코르빅 산과 같은 항산화제, pH 완충제, 또는 염 완충제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리 콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 구제역 바이러스 감염 예방용 및/또는 구제역 바이러스 감염증 치료용 조성물의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 해당 기술분야의 통상의 기술자 또는 수의학 분야의 숙련가에 의하여 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 유효량은 바람직한 효과를 주기 위해 요구되는 화합물의 양이다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 투여의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 유효량은 구제역 바이러스의 감염 및/또는 구제역 바이러스 감염으로 인해 발병되는 이상, 증상, 및 질병을 완화(alleviate), 향상(improve), 경감(mitigate), 개선(ameliorate), 안정화, 질병의 확산 억제, 질병의 진행을 늦추거나 지연, 질병을 치유하기 위해 충분한 시간 동안 요구되는 용량이다.

상기 유효량은 약학적 조성물의 약동학적 특성, 투여 방법, 연령, 개체의 건강상태 및 체중, 질병 상태의 특성 및 범위, 치료 횟수 및 최근의 치료 형태와 같은 수많은 인자에 의해 달라질 수 있다. 당업자라면 상기 인자에 기초하여 적정량을 조절할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식, 예를 들어 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학적 조성물은 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 융합단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ml 당 1 내지 1000 μg의 단백질, 바람직하게는 10 내지 500 μg, 더 바람직하게는 100 내지 250 μg 을 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양상의 일 실시형태에서, 본 발명은 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파와 돼지 유래 항체 IgG 클래스의 Fc 영역의 융합단백질인 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방용 및/또는 구제역 바이러스 감염증 개선용 사료 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 사료 조성물은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기에서 사용된, 용어 “인터페론-알파-Fc 융합단백질", "구제역", "구제역 바이러스 감염증" 및 "예방"은 상기 기재된 바와 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “개선"은 본 발명의 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 포함하는 사료 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “사료"는 동물의 생명을 유지하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 상기 사료는 가축 등의 동물이 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 포함하며, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질 등의 동물성 사료가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 사료는 분말 사료, 고형 사료, 모이스트 펠릿 사료, 드라이 펠릿 사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 사료 조성물은 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있을 수 있으며, 상기 사료 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있을 수 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양상의 일 실시형태에서, 선택적으로 오일 아쥬번트와 함께, 유효량의 본 발명에 따른 돼지 인터페론-알파-Fc 재조합 융합단백질, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법을 제공한다.

여기서 사용된, 용어 “인터페론-알파-Fc 융합단백질", "구제역", "구제역 바이러스 감염증", "예방" 및 "치료"는 상기 기재된 바와 같다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “대상체"는 구제역 바이러스가 감염되어, 실질적으로 유해한 영향을 받을 수 있는 모든 동물, 구체적으로 숙주 동물을 의미한다. 동물은 구제역 바이러스가 감염되어 유해한 감염증이 발병될 위험이 있는 숙주 동물, 구체적으로 소, 말, 양, 돼지, 염소 등의 우제류 동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된, 용어 “투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 융합단백질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 상기 융합단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 조성물이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시형태에서, 상기 융합단백질은 오일 아쥬반트(adjuvant)와 함께 투여될 수 있으며, 상기 오일 아쥬반트는 ISA 201 (Seppic, France) 또는 ISA 206 (Seppic, France)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 안정성이 개선되어 생체 내에서 오랫동안 유지되며, 종래의 구제역 오일 백신과 함께 혼합접종 시 구제역 바이러스에 대한 직접적인 방어효과와 중화항체 형성을 촉진하는 효과를 동시에 가짐으로써, 구제역을 초기에 효과적으로 방어할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 플라스미드(plasmid)를 디자인한 모식도를 나타낸 도이다 (pPH: polyhedron promoter, ss: porcine IFN-α IgG heavy chain의 signal sequence, linker: GS linker, His: His tag).
도 2a는 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 단백질 확인을 나타낸 도이고, 도 2b는 ELISA를 이용하여 배양 상층액 내 단백질을 정량한 것을 나타낸 도이다.
도 3은 세포 내 polFN-α-Fc 융합단백질의 구제역 바이러스 억제 효과를 나타낸 도이다 (^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ns: not significant).
도 4는 polFN-α-Fc 융합단백질과 polFN-α 단백질의 돼지 혈액 내 구제역 바이러스의 억제 효과를 나타내는 지속시간을 비교한 도이다 (^* P < 0.05).
도 5는 polFN-α-Fc 융합단백질과 오일 아쥬번트의 혼합 시 마우스에서 구제역 바이러스의 억제효과를 나타낸 도이다.
도 6은 polFN-α-Fc 융합단백질과 오일 아쥬번트의 혼합 시 마우스에서의 구제역 바이러스 억제효과 지속시간을 나타낸 도이다.
도 7은 구제역 O형 시험백신과 polFN-α-Fc 융합단백질의 혼합 접종으로 접종 2일 후(3마리 중 3마리)(도 7c) 또는 4일 후(3마리 중 1마리)(도 7e)에 돼지에서의 구제역이 신속하게 방어 되거나 바이러스 배출량이 10² 카피(copy) 이하로 감소되는 것을 확인한 도이다.
도 8은 구제역 O형 시험백신과 polFN-α-Fc 융합단백질을 혼합 접종한 돼지에서 접종 4일후, 접종 7일 후의 중화항체가를 비교한 결과를 나타낸 도이다 (^* P < 0.05).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 세포 준비 및 바이러스 접종

재조합 배큘로 바이러스(recombinant baculovirus)를 증식시키기 위해 Sf-9 세포를 사용하였고, 단백질을 생산하기 위해 Hi-five 세포를 사용하였다. Sf-9 세포와 Hi-five 세포는 Sf-900 II 무혈청 배지(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여, 27 ℃, 120 rpm 환경의 교반 인큐베이터(Shaking incubator)에서 부유 배양하였다.

구제역 바이러스에 대한 세포에서의 억제 효과를 실험하기 위해 Plum Island Animal Disease Center, ARS (미국 뉴욕)로부터 제공된 LFBK (porcine kidney) 세포를 사용하였다. LFBK 세포는 FBS (fetal bovine serum) 10% 를 첨가한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) 배지를 사용하여, 5% CO₂, 37 ℃의 인큐베이터에서 배양하였다.

세포에서의 억제효과를 시험하기 위해 FMDV O/SKR/2002 (Genbank accession no. AH012984.2)를 사용하였고, 마우스에서의 억제효과를 시험하기 위해 베트남에서 시료를 도입하여 바이러스를 분리한 후 마우스에 적응시킨 FMDV O/VIT/2013을 사용하였다. 돼지의 공격접종에는 돼지에서 2번 계대한 FMDV O/SKR/Boeun/2017 수포액을 사용하였고, 바이러스 중화시험에는 구제역 O/SKR/Boeun/2017 바이러스를 LFBK 세포에서 6회 계대한 바이러스를 사용하였다.

구제역 바이러스의 역가는 Spearman-karber 방법을 이용하여 TCID₅₀으로 측정하였다 (Ramakrishnan MA, 2016, World J Virol, 5:85-86). 모든 구제역 바이러스 접종시험은 대한민국 농림축산검역본부의 생물안전 3등급(bio-safety level 3) 시설에서 수행되었다.

참고예 2. 통계학적 분석

T-test와 로그(log) 순위 시험(log-rank test, 마우스 생존률 통계처리시 사용)은 GraphPad Prism (Ver 5.0; GraphPad Software, La Jolla, Ca, USA)과 GraphPad Instat (Ver 3.05; GraphPad Software, La Jolla, Ca, USA)를 사용하여 실시하였다.

실시예 1. 구제역 O 형 시험백신 및 재조합 배큘로 바이러스 제작

1-1. 구제역 O 형 시험백신의 제조

구제역 O 형 시험백신은 농림축산검역본부 구제역백신연구센터에서 생산된 O/SKR/2017/Boeun 의 항원 15μg, ISA 206 (Seppic, France)과 전체 부피의 10% 로 Al(OH)₃ 겔을 사용하여 W/O/W 오일 백신으로 제형화(formulation) 하였다. 제형화 방법은 ISA 206 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행되었다. 제조된 시험백신은 24시간 이상, 4℃ 에 보관하여 유화가 안정한지 확인한 후 사용하였다.

1-2. 클로닝(cloning) 및 재조합 배큘로 바이러스 제작

발현 유전자를 돼지 IgG 항체의 신호 서열(Genbank accession no. NP998993; 서열번호 3), 돼지 IFN-α 공통 서열(서열번호 4), 플렉서블 (GGGS)₃ 링커, 돼지 IgG 항체의 Fc 부분(서열번호 5), 및 His tag를 갖는 TEV 인식 부위(His tag의 제거가 가능하도록 삽입함)(서열번호 6)의 순서로 융합단백질 구조를 설계하였다. 융합단백질이 분비형(secretion form)으로 발현되어 배양 상층액에서 회수될 수 있도록 돼지 IgG 항체의 신호 서열을 삽입하였고, 단백질의 구조형성 및 기능적으로 완전한 단백질 발현에 유리하도록 Gly-Ser 링커, 보다 구체적으로(GGGS)₃ 링커를 사용하였다. 설계한 융합단백질을 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에 의뢰하여 합성하였다(도 1).

돼지 IFN-α 공통 서열 유전자는 17개 아형(subtype)의 돼지 인터페론에서 가장 빈번하게 나타나는 염기서열을 이용하였다(Huang L et al., 2012, Cytokine, 57:37-45). 클로닝을 위한 벡터는 pFastbac I (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하였으며, BamHI 과 EcoRI 제한효소 부위를 이용하여 클로닝 하였다.

재조합 배큘로 바이러스는 Bac-to Bac 배큘로바이러스 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 Sf-9 세포에서 생산하였다. 음성 대조군 바이러스로서 삽입부(insert)가 결여되어 있는 pFastbac I 벡터를 사용하여 재조합 배큘로 바이러스를 제작하였다. 생산된 배큘로 바이러스의 역가는 BacPAK^TM qPCR 적정 키트(Takara Bio USA Inc, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 제품 매뉴얼에 따라 측정하였다.

실시예 2. 단백질의 정제 및 확인

단백질을 생산하기 위해 Hi-five 세포에 배큘로 바이러스를 3 MOI (multiplicity of infection of 0.5) 로 접종한 후, 30 시간 후 상층액을 수거하였다. 수거된 상층액을 Capturem^TM His-tagged Purification Maxiprep kit (Takara Bio USA Inc, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 정제하였다.

정제된 단백질은 Pierce^TM BCA Protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 정량하였다. 단백질 확인을 위해, Hi-five 세포에 배큘로 바이러스를 3 MOI로 접종하고, 30시간 후 수거된 Bac-poIFN-α-Fc 감염 세포 유제액, 감염 세포 상층액, 감염 세포 상층액에서 정제된 단백질, Bac-음성 대조군의 상층액을 웨스턴 블롯(western blotting)을 하였다.

1차 항체로 Swine IFN-α1 폴리클로날 항체 (Kingfisherbiotech, MN, USA)를 사용하였고, 2차 항체로 래빗 항-염소 IgG H&L (HRP) (Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였다.

단백질 생산량의 변화를 확인하기 위해, Hi-five 세포에 Bac-poIFN-α-Fc 바이러스를 1 MOI 또는 3 MOI 로 접종한 후, 24시간, 48시간, 72시간에 상층액을 수거하고, 돼지 IFN-α 용 ELISA 키트 (Cloud Clone Corp., Wuhan, Hubei, China)를 이용하여 인터페론 알파를 정량하였다. 인터페론 알파 단백질의 농도는 키트 내 대조군의 표준 곡선에 적용하여 계산하였다.

poIFN-α-Fc 융합단백질을 확인하기 위해 실시한 웨스턴 블롯 (Western blot) 결과, 세포 상층액 (supernatant)에서 정제한 경우와 정제하지 않은 경우 모두 His tag를 포함하여 약 46kDa의 단백질 밴드(band)가 확인되었다(도 2a). 한편, 세포 용해물과 배큘로바이러스 부재 대조군(baculovirus null control)을 감염시킨 세포의 상층액에서는 특이 밴드가 관찰되지 않았다.

돼지 IFN-α ELISA를 통하여 단백질의 양을 확인하였을 때, 3 MOI와 1 MOI 접종 시, 동일하게 접종 24시간 후에 상층액 내 인터페론 단백질 수준이 가장 높았다(도 2b). 접종 후 48시간 후부터 단백질 양의 감소가 관찰되었으나, 1 MOI 접종시에 비해 3 MOI 접종시에 단백질 수준이 오래 유지되었다.

실시예 3. 구제역 바이러스에 대한 증식억제 효과(unit) 측정

96-웰 플레이트의 미리 구분해 둔 웰에 LFBK 세포에서 생산된 poIFN-α-Fc 융합단백질 또는 효모 발현 재조합 돼지 인터페론 알파 1 단백질 (Abcam, Cambridge, UK)을 처리하고, 24시간 후 상층액을 제거하였다.

250 TCID₅₀의 FMDV O/SKR/2002 를 감염시키고, 48시간 후 CPE 를 확인하였다. 인터페론 단백질의 항바이러스 효과는 CPE 가 50% 억제된 가장 높은 희석배수의 역수로 단위(unit)를 계산하였다. 종래의 방법을 일부 수정하여 수행하였다 (Moraes MP, 2007, J Virol, 81:7124-7135).

3-1. 세포에서의 구제역 바이러스에 대한 억제효과 확인

96-웰 플레이트에 LFBK 세포를 넣어 밤새 배양한 후, 다음날 웰 당 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 단위(unit)의 poIFN-α-Fc 융합단백질을 처리하였다. 24시간 후, 250 TCID₅₀의 FMDV O/SKR/2002 를 1시간 동안 감염시키고, 배지를 교체하였다.

24시간 후, 상층액을 수거하여 바이러스 RNA는 MagNA Pure 96 Automation System (Roche, Basel, Switzerland)와 MagNA Pure 96 DNA & Viral NA Small Volume Kit (Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 추출하였고, 종래의 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다 (Kim SM et al., 2010, Antiviral Res, 87:307-317).

poIFN-α-Fc 융합단백질을 0.25 단위(unit)를 사용했을 때부터 구제역 바이러스 억제 효과가 나타났고 (P < 0.01), poIFN-α-Fc 융합단백질의 양이 증가함에 따라 구제역 바이러스의 억제효과가 상승하는 패턴이 관찰되었다 (P < 0.05) (도 3).

3-2. 돼지 혈청에서의 안정성 검사

동일한 유닛(unit)의 본 발명의 poIFN-α-Fc 융합단백질 또는 효모에서 발현한 재조합 돼지 인터페론-알파 1 단백질(Abcam, Cambridge, UK)을 야외 돼지 혈청과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하여 37℃ 에서 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 동안 정치시킨 후, -20℃ 에 냉동하였다. 냉동한 시료를 동시에 해동한 후, 상기 실시예 3에 기재된 구제역 바이러스에 대한 증식억제 효과(unit) 측정방법(IFN biological assay)으로 유닛을 측정하였다.

돼지 혈청에서 단백질의 효과지속시간을 비교하기 위한 실험에서, 대조군 재조합 돼지 IFN-α 단백질은 돼지 혈액과 혼합하여 정치한 후 6시간째부터 유닛이 하락하기 시작한 반면에, 본 발명에 따른 poIFN-α-Fc 융합단백질은 12시간 동안 바이러스 억제 효과 (unit/ml)가 동일하게 유지되었고, 24시간 후부터 바이러스 억제효과가 감소하기 시작하였다(도 4).

또한, 돼지 혈액과 혼합하여 정치한 후 24시간, 48시간에도 본 발명의 poIFN-α-Fc 융합단백질의 바이러스 억제효과가 대조군 재조합 돼지 IFN-α 보다 우수함을 확인하였다 (P < 0.05).

이를 통해, poIFN-α-Fc 융합단백질의 구제역 바이러스 억제의 지속시간이 길게 유지되고, 바이러스 억제에 효과적임을 시사한다.

실시예 4. 마우스에서의 방어효과 지속시간 시험

구제역 상용 백신에 사용하는 오일 아쥬반트 2가지, ISA 201 (Seppic, France)과 ISA 206 (Seppic, France)을 본 발명의 poIFN-α-Fc 융합단백질에 섞어 접종하였을 때 구제역 바이러스의 억제효과를 알아보기 위해 마우스 실험을 수행하였다(도 5).

7주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 그룹당 10 마리씩, 마리당 6μg의 poIFN-α-Fc 융합단백질 또는 PBS를 ISA 206 (Seppic, France) 또는 ISA 201 (Seppic, France)와 1:1 (v/v)로 볼텍싱(vortexing)하여 섞은 후, 근육접종(Intramuscular injection, IM) 하였다.

접종 2일 후, 마우스에 적응시킨 구제역 100 LD₅₀의 O/VIT/2013 바이러스를 복강접종(intraperitoneal injection) 하였다. 구제역 바이러스 공격접종 후 7일간 마우스의 생존율을 관찰하였다.

C57BL/6 마우스 공격접종 시 항원을 포함한 아쥬반트를 사용할 경우, 너무 이른 시기(백신 접종 후 약 3일 후)부터 방어가 되므로, 마우스 실험은 항원을 넣지 않고 진행하였다 (You SH et al., Antiviral Res, 143:195-204). 마우스 공격접종 실험은 농림축산검역본부 실험동물윤리위원회의 허가를 받아 진행하였으며, 농림축산검역본부 구제역백센연구센터의 생물안전 3등급 (bio-safety level 3; BL-3) 시설에서 실시하였다.

구제역 백신의 대표적인 오일 아쥬반트인 ISA 201 또는 ISA 206 에 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합접종한 결과, ISA 201 + poIFN-α-Fc 의 생존율 (7일 기준 60%)은 PBS 대조군(7일 기준 0%)이나 ISA 201 만을 접종하였을 때(7일 기준 20%)보다 통계학적으로 높았다(P < 0.05, log rank test) (도 5a). 또한, ISA 206 + poIFN-α-Fc 의 생존율(7일 기준 80%) 역시 PBS 대조군 (7일 기준 0%)이나 ISA 206 만을 접종하였을 때 (7일 기준 40% 생존률)보다 통계학적으로 높게 나타났다(P < 0.05, log rank test) (도 5b).

이를 통해, poIFN-α-Fc 융합단백질을 구제역 백신에 사용하는 대표적인 오일 아쥬반트와 혼합하여 접종하는 경우, poIFN-α-Fc 융합단백질에 의해 구제역 바이러스 억제율이 증가함을 확인하였으므로 통상의 구제역 오일 백신과 혼합하여 접종할 수 있으며, 또한 poIFN-α-Fc 융합단백질에 의한 구제역 바이러스 감염 억제효과의 유의한 상승을 기대할 수 있음을 시사한다.

또한, ISA 201 만을 포함한 마우스 그룹의 생존율은 PBS 그룹과 통계적으로 유의한 차이가 없었던 반면(P > 0.05, log rank test), ISA 206 만을 포함한 마우스 그룹의 생존율은 PBS 그룹보다 높아 ISA 206을 포함한 실험군이 접종 초기의 구제역 바이러스 억제효과가 높게 나타남을 확인하였다(P < 0.05, log rank test). 그에 따라, 이후 실험에서는 ISA 206을 오일 아쥬반트로 사용하였다.

poIFN-α-Fc 융합단백질과 오일 아쥬반트 ISA 206을 혼합 시, 지속시간을 확인하기 위해 마우스에서 백신 접종 후 1일과 3일에 공격접종하는 실험을 수행하였다(도 6).

백신접종 1일 후 공격접종한 마우스에서는 ISA 206 + poIFN-α-Fc 그룹의 생존율이 ISA 206 그룹의 생존율보다 높게 나타났다(P < 0.05, log rank test) (도 6a). 백신 접종 3일 후 공격접종한 마우스의 경우, ISA 206 + poIFN-α-Fc 접종 그룹에서 80%의 생존율을 보였으나, ISA 206만을 접종한 그룹의 생존율도 높아 두 그룹 간의 통계학적 유의차는 나타나지 않았다(P > 0.05, log rank test)(도 6b).

실시예 5. 돼지에서의 공격접종 시험

구제역 중화항체가 4배 이하의 9주령 돼지 (마리 당 20 내지 25kg)를 15마리 준비하였다. 구제역 공격접종 4일 전, 구제역 O 형 시험백신과 poIFN-α-Fc 단백질 혼합, 구제역 O 형 시험백신을 각각 3마리씩 근육접종(IM) 하였다.

또한, 구제역 공격접종 2일 전에 구제역 O 형 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질(마리 당 200μg) 혼합, 구제역 O 형 시험백신, PBS 를 각각 3마리씩 근육접종하였다. 구제역 O/SKR/Boeun/2017 바이러스를 돼지에서 2회 계대하여 수득한 수포액을 돼지 1마리 당 10⁵ TCID₅₀ 의 역가로 왼쪽 뒷다리 제구부(heel bulb)에 50μl씩 2곳에 피하접종(Intradermal injection)으로, 공격접종을 수행하였다. 돼지 공격접종 실험은 농림축산검역본부의 실험동물윤리위원회의 허가를 받아 진행하였으며, 농림축산검역본부 구제역백신연구센터의 생물안전 3등급 (bio-safety level 3; BL-3) 시설에서 실시하였다.

5-1. 임상증상 관찰 및 돼지혈청, 타액에서 구제역 바이러스 RNA의 측정

공격접종일부터 8일간 매일 1회 임상증상을 관찰하고, 구강(oral) swab을 실시하였으며, 2일에 1회 돼지의 혈액을 채취하였다. 파행 및 코, 입, 혀, 발의 수포 여부를 관찰하고, 임상증상 점수 (lesion score)를 결정하였으며, 최고점을 12로 하였다 (Kim SM et al., J Virol, 89:8267-8279).

구강 스왑(swab)은 Universal Viral Transport Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 채취하였고, 볼텍싱한 후, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 혈액은 원심분리하여 혈청(serum)으로 준비하였다.

준비된 구강 스왑 액과 혈청 시료를 이용하여 상기 실시예 3-1에서 기재된 바와 동일하게 바이러스 RNA를 추출하여 정량 실시간 PCR을 수행하였다.

공격접종 2일(도 7b) 전에 시험백신을 접종한 그룹에서는 PBS 접종 그룹(도 7a) 과 함께 공격접종 3일 또는 4일 후부터 임상증상이 나타나기 시작하여, 최고점의 임상증상 지수(12점)를 나타내었다. 혈청 내 구제역 바이러스 RNA 수준에 있어서도, PBS 접종군은 최대 약 log 6 카피(copies)/ml 수준을 나타내었고, 공격접종 2일전 시험백신 접종군 역시 최대 log 5 카피(copies)/ml을 나타내었다. 타액 내 FMDV RNA 수준은 PBS 또는 시험백신 접종 군에서 접종 약 2일 후부터 5~6일까지 약 log 3 카피(copies)/ml로 지속되었다.

반면에, 공격접종 2일 전에 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합하여 접종한 그룹(도 7c)에서는 3마리중 2마리는 임상증상이 나타나지 않았고, 1마리에서는 미약한 임상증상(임상증상 지수 2점)을 나타내었다. 혈액 내 구제역 바이러스 RNA 수준에 있어서도 2마리는 FMDV RNA가 전혀 검출되지 않았고, 1마리에서 최대 log 1 카피(copies)/ml의 미약한 수준으로 1회 검출되었다가 소멸되는 것을 관찰하였다. 타액내 FMDV RNA는 불규칙적으로 관찰되었고, log 1-3 copies/ml의 FMDV RNA 수준이 1~2일 정도 관찰되거나, 관찰되지 않았다. 타액내 RNA 의 경우 같은 실험 공간내 구제역 바이러스 존재에 의해 비감염 동물에서도 불규칙하게 관찰된다. 따라서 3마리 모두에서 poIFN-α-Fc 융합단백질에 의한 구제역 바이러스에 대한 방어 효과가 관찰되었다.

공격접종 4일 전에 시험 백신(도 7d) 또는 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질(도 7e)을 혼합하여 접종한 경우, 시험백신 접종 군은 PBS 접종군에 비해 임상증상과 혈액 및 타액 내 바이러스 배출량이 다소 감소하는 경향을 나타냈으나, 중등도의 임상증상(임상증상지수 5-7)과 log 3-4 카피(copies)/ml의 혈액내 구제역 바이러스 RNA 수준이 관찰되었다. 반면에, 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합하여 접종한 그룹(도 7e) 에서는 3마리중 1마리에서 임상지수 1의 미약한 증상과 log 1 카피(copies)/ml의 혈액내 구제역 바이러스 RNA 수준을 보여, 공격접종 4일 전 백신 그룹의 경우 3마리중 1마리에서 poIFN-α-Fc 융합단백질에 의한 구제역 바이러스에 대한 방어 효과를 나타내었다.

이를 통해, 시험백신에 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합하여 접종하는 경우, 구제역 임상증상과 생체내 FMDV RNA 배출 수준이 대조군 대비 현저히 감소한 것을 확인하였고, 이는 poIFN-α-Fc 융합단백질의 구제역바이러스 억제효과가 뛰어남을 시사한다.

실시예 6. 돼지에서의 중화항체가 측정

구제역 중화항체가 4배 이하의 9주령 돼지 (마리 당 20 내지 25kg)를 준비하고, 7마리의 돼지에 구제역 O형 시험백신을 접종하였고, 8마리의 돼지에는 구제역 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질(마리당 120 μg)을 혼합하여 접종하였다.

접종 4일, 7일 후 각각 채혈하여 혈청을 분리하고, 바이러스 중화시험 (virus neutralizing test)을 OIE 육지동물 진단 및 백신 매뉴얼 (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals from the World Animal Health Organization)에 따라 실시하였다.

바이러스는 LFBK 세포에서 5회 계대하여 적응시킨 O/SKR/2017/Boeun 바이러스를 사용하였고, 돼지에서 채취한 혈청은 56℃에서 30분 동안 비동화(heat-inactivation)하여 준비하였다. 비동화한 혈청을 2배 단계 희석하여 100 TCID₅₀의 구제역 바이러스와 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, LFBK 세포를 혈청 플레이트에 추가하여 37℃에 정치하였다. 48 내지 72시간 후 CPE를 확인하였고, Spearman-karber 방법을 이용하여 중화항체가를 계산하였다 (Ramakrishnan MA, 2016, World J Virol, 5:85-86).

그 결과, 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합하여 접종한 그룹의 경우, 접종 7일만에 평균 약 300:1 (log 2.5)의 높은 중화항체가가 획득되었으며, 시험백신만 접종한 그룹(평균 약 88:1의 중화항체가, log 1.94)에 비해 높은 중화항체가가 획득됨을 확인하였다(P < 0.05) (도 8). 뿐만 아니라, 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합하여 접종한 그룹은 접종 4일만에도 평균 약 86:1(log 1.93)의 중화항체가가 획득되어 시험백신 접종 그룹 (평균 약 17:1의 중화항체가, log 1.23) 보다 높은 중화항체가를 나타내었다 (P < 0.01).

이를 통해, 시험백신과 poIFN-α-Fc 융합단백질을 혼합 접종하는 경우, 접종 4일 후부터 중화항체가를 현저히 증가시킴으로써, 초기 구제역 방어에 매우 효과적임을 시사한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> New porcine IFN-alpha fusion protein inhibiting foot-and-mouth disease <130> KPA200062-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of porcine IFN-alpha-Fc fusion protein <400> 1 atggaatttc gtctgaactg ggtcgtgctg ttcgctctgc tgcaaggtgt ccaaggttgc 60 gacctgcctc agactcactc tctggctcac actcgtgctc tgcgtctgct ggctcagatg 120 cgtcgtatct ctcctttctc ctgcctggac caccgtcgtg acttcggttt tcctcaagag 180 gctctcggtg gcaaccaggt gcaaaaggct caagctatgg ctctggtgca cgagatgctc 240 cagcagacct tccagctgtt ctccaccgaa ggttctgctg ctgcttggga cgagtccctg 300 ttgcaccaat tctgcactgg actggaccag cagctgcgtg atctggaagc ttgcgtgatg 360 caagaggctg gcttggaggg tactcctctg ctggaagagg actctatcct ggctgtgcgc 420 aagtacttcc accgtctgac cctgtacctg caagagaagt cctactctcc ctgcgcttgg 480 gagatcgtgc gtgctgaagt gatgcgcgct ttctccagct ctcgtaacct gcaggaccgt 540 ctgcgtcgta aagaaggtgg cggttctggc ggtggatcag 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5 10 15 Val Gln Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg 20 25 30 Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys 35 40 45 Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly 50 55 60 Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu 65 70 75 80 Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp 85 90 95 Asp Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu 100 105 110 Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr 115 120 125 Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His 130 135 140 Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp 145 150 155 160 Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn 165 170 175 Leu Gln Asp Arg Leu Arg Arg Lys Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 180 185 190 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 195 200 205 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 210 215 220 Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val 225 230 235 240 Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln 245 250 255 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln 260 265 270 Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp 275 280 285 Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser 290 295 300 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser 305 310 315 320 Arg Ser Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro 325 330 335 Asp Ile His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly 340 345 350 Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe 355 360 365 Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu 370 375 380 Thr Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 385 390 395 400 Gln Lys Ser Ile Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His 405 410 415 His His His <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of porcine heavy chain IgG <400> 3 Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Gln Gly <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus porcine IFNalpha without signal sequence <400> 4 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His 20 25 30 Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu 100 105 110 Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> porcine IgG Fc domain <400> 5 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His 20 25 30 Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val 35 40 45 Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr 50 55 60 Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu 100 105 110 Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV recognition site with 6x His Tag <400> 6 Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His 1 5 10 15

Claims (20)

1. 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역이 링커를 통해 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분의 N-말단에 융합된 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 돼지 유래 IgG 항체의 신호서열, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파 부분, 펩타이드 링커, 및 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역의 순서로 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역 다음에, 제거가능한 형태의 히스티딘 태그를 포함하는 시스테인 프로테아제 계열 프로테아제 인식 부위가 도입된 상태로 발현되고, 상기 태그 제거 및 단백질 정제 과정을 거쳐 수득된 것인, 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질에서, 돼지 유래 IgG 항체의 신호서열은 서열번호 3의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파는 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 펩타이드 링커는 글리신(G) 및 시스테인(S)을 포함하는 반복단위로 구성된 GS 링커이며, 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역은 서열번호 5의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 시스테인 프로테아제 계열 프로테아제 인식 부위는 서열번호 6의 폴리펩타이드 서열을 갖는 히스티딘 태그를 포함하는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 인식 부위인 것인, 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질 발현 및 생산용 재조합 벡터.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시되는 것인, 재조합 벡터.
   
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스에 대한 백신 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드 서열을 갖는 것인, 백신 조성물.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 구제역 바이러스는 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1의 구제역 바이러스 혈청형으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈청형인 것인, 백신 조성물.
   
10. 제7항에 있어서, 상기 구제역 바이러스에 대한 백신 조성물은 아쥬번트를 더 포함하는 것인, 백신 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 아쥬번트는 ISA 201 또는 ISA 206인 것인, 백신 조성물.
    
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료용 약학적 조성물.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드 서열을 갖는 것인, 약학적 조성물.
    
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 개선용 사료 조성물.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드 서열을 갖는 것인, 사료 조성물.
    
16. 돼지 유래 IgG 항체의 신호서열, 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파, 펩타이드 링커 및 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역의 순서로 작동가능하게 연결된 유효량의 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질; 또는 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 약학적 조성물 및 사료 조성물 중에서 선택되는 하나 이상의 조성물을 인간을 제외한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 돼지 인터페론-알파-Fc 융합단백질은 상기 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역 다음에, 제거가능한 형태의 히스티딘 태그 또는 히스티딘 태그를 포함하는 시스테인 프로테아제 계열 프로테아제 인식 부위가 도입된 상태로 발현되고, 상기 태그 제거 및 단백질 정제 과정을 거쳐 수득된 것으로서, 상기 돼지 유래 IgG 항체의 신호서열은 서열번호 3의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 상기 공통 서열을 포함하는 돼지 인터페론-알파는 서열번호 4의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 상기 펩타이드 링커는 글리신(G) 및 시스테인(S)을 포함하는 반복단위로 구성된 GS 링커이며, 상기 돼지 유래 IgG 항체의 Fc 영역은 서열번호 5의 폴리펩타이드 서열을 갖는 것이고, 상기 시스테인 프로테아제 계열 프로테아제 인식 부위는 서열번호 6의 폴리펩타이드 서열을 갖는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 인식 부위인 것인, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법.
    
18. 제16항에 있어서, 상기 융합단백질 또는 상기 조성물은 오일 아쥬반트 또는 구제역 오일 백신과 함께 투여되는 것인, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 오일 아쥬반트는 ISA 201 또는 ISA 206인 것인, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법.
    
20. 제18항에 있어서, 상기 융합단백질 또는 상기 조성물은, 구제역 오일 백신과 함께 투여시, 상기 오일 백신 단독 투여에 비해 구제역 바이러스 감염율을 감소시키고, 중화항체를 신속하게 유도하는 것인, 구제역 바이러스 감염 예방 또는 구제역 바이러스 감염증 치료 방법.
    

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