CN101880328B

CN101880328B - 微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN101880328B
Application number: CN2010101902052A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 李艳; 米荣升; 黄燕; 周鹏
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2010-06-02
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: CN101880328A

Abstract

本发明公开了一种微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白，其包含：SEQIDNO.1～10所示Th表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。本发明还公开了微小隐孢子虫Th多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白，能制成核酸疫苗和亚单位疫苗，对小鼠隐孢子虫感染具有很好的免疫保护效果，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

Description

微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用。

背景技术

隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是一种世界性分布的人兽共患寄生虫病，该病在免疫功能正常的机体中，可引起自限性腹泻；在免疫功能缺陷患者如艾滋病（AIDS）病人中，可导致严重甚至威胁生命的疾病。该病已被列为世界最常见的6种腹泻病之一，并被世界卫生组织和美国疾病控制与预防中心列入新发传染病。目前对该病尚无特效药物，绝大多数抗生素、抗寄生虫药物均无效，因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就显得愈发重要。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类单一的疫苗候选分子的免疫保护效果并不理想，其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期，导致单一抗原、单一表位的免疫保护效果不够理想。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际寄生虫学界开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原表位预测，构建多表位疫苗（multi-epitope vaccine），来预防和控制寄生虫病，并取得了阶段性成果，尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果，其中不少已进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。在隐孢子虫领域目前尚无这方面的报道。

多数研究结果显示，CD4⁺辅助性T细胞（helper T cell, Th）在抗隐孢子虫感染中发挥着极其重要的作用。Aguirre观察到主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）类分子缺失导致缺乏CD4⁺ T细胞的小鼠很难控制微小隐孢子虫（Cryptos- poridium parvum）感染；陈淑兰等检测隐孢子虫病患者外周血中CD4⁺ T细胞及CD4/CD8细胞比值，发现CD4⁺ T细胞极显著低于正常对照组，而CD8⁺ T细胞反而升高，致使CD4/CD8比值显著降低；Ungar曾报道选择性地耗竭辅助性T细胞（CD4⁺ T细胞）会延长小鼠隐孢子虫感染，证明CD4⁺ T细胞对于机体清除隐孢子虫感染至关重要。在对人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）阳性病人的研究中也进一步证实了抗隐孢子虫感染中CD4⁺ T细胞的必要性。Flanigan认为艾滋病增加了患者对微小隐孢子虫的易感性，最严重的情况通常见于CD4⁺ T细胞数量最少的个体；Riggs也证实在艾滋病患者或别的细胞免疫缺陷患者，控制微小隐孢子虫感染的能力和CD4⁺T细胞数量直接相关；Schmidt等用高效抗逆转录病毒疗法治疗伴有微小隐孢子虫感染的HIV阳性病人时，发现血循环和粘膜中CD4⁺T细胞增加，粘膜中CD4⁺T细胞增加的更多并达到更高水平。

鉴于CD4⁺T细胞在隐孢子虫感染中的重要作用，对隐孢子虫Th表位进行研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决缺少隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白，该Th多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

此外，还需要提供一种微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白，其包含：SEQ ID NO.1～10所示Th表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

优选的，所述Th表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。在各个Th表位序列之间加入柔性氨基酸组成的接头序列，能使各个Th抗原表位在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC （主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用）分子的结合；同时在各个Th表位之间用接头序列连接，可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种微小隐孢子虫Th多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述微小隐孢子虫Th多表位基因具有编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述微小隐孢子虫Th多表位基因具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述微小隐孢子虫Th多表位基因的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述重组载体，或已用上述微小隐孢子虫Th多表位基因序列转化或转染。

在本发明的另一方面，还提供了一种微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将融合蛋白与弗氏不完全和完全佐剂、Montanide ISA 206等充分混匀制备亚单位疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种微小隐孢子虫Th多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将微小隐孢子虫Th多表位基因克隆到真核表达载体如pVAX1、pcDNA3.1等，或共同插入细胞因子基因，构建成核酸疫苗。

本发明微小隐孢子虫Th多表位基因，经原核表达后所得的重组蛋白，通过Western blot和免疫小鼠血清抗体ELISA检测结果显示，该重组蛋白具有较好的免疫原性和反应原性，同时动物保护性实验显示，该重组蛋白制成的亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫感染有较好的免疫保护效果。此外，本发明构建的含微小隐孢子虫Th多表位基因的重组真核表达质粒，作为核酸疫苗进行动物保护性实验，结果表明该重组真核表达质粒具有很好的免疫保护效果。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例3重组原核表达质粒pET-28a（+）-CpTh10的双酶切鉴定图；

图2是本发明实施例3重组蛋白表达产物的SDS-PAGE 电泳图；

图3是本发明实施例4重组表达产物的Western blot分析图；

图4是本发明实施例5重组真核表达质粒pVAX-1-CpTh10的双酶切鉴定图；

图5是本发明实施例6重组蛋白rCpTh10免疫后小鼠隐孢子虫卵囊排出曲线图；

图6是本发明实施例6核酸疫苗免疫后小鼠隐孢子虫卵囊排出曲线图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第3版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。

本发明利用生物信息学软件和多个表位预测服务器，对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum，C. parvum）候选疫苗抗原与宿主MHCⅡ类分子H2-Ad和H2-Ed结合的表位分别进行预测，筛选出10个得分较高的Th表位序列以任意顺序进行相互串联，形成多表位基因，各表位之间用柔性氨基酸链接。将该多表位基因克隆到原核表达载体中进行原核表达，并对表达的融合蛋白的免疫原性和反应原性进行验证；将该多表位基因克隆到真核表达载体中，构建核酸疫苗；将原核重组表达蛋白和真核重组表达质粒分别免疫小鼠，观察亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫保护效果。结果显示，重组表达蛋白制成的亚单位疫苗，与PBS空白对照组和佐剂对照组相比，免疫组的排出卵囊数量减少，开始排出卵囊时间明显延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该重组亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有较好的免疫保护效果。由真核重组表达质粒制成的核酸疫苗，免疫小鼠的攻击感染试验结果表明，核酸疫苗免疫组始终未检测到卵囊排出，而空载体对照组与生理盐水空白对照组均有较多的卵囊排出，提示该真核重组表达质粒具有很好的免疫保护效果。

实施例1 微小隐孢子虫疫苗候选抗原Th表位预测

从文献中查找目前报道的潜在的微小隐孢子虫疫苗候选抗原，记录其GeneBank登录号，从NCBI中下载相关蛋白序列。运用表位预测服务器RANKPEP（http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/）、MHCPred（http://www. darrenflower.info/mhcpred/）、MHC2Pred（http://www. imtech.res.in/ raghava/mhc2pred/）和MHC Binding Predictionhttp:// epitope.liai.org: 8080/tools/matrix/iedb_input? Matrix Class =I,II），分别预测同鼠源H2-d（包括H2-Ad和H2-Ed）型MHCⅡ类分子结合的9个氨基酸长度的Th表位。考虑到Th细胞表位槽两端呈开放状态，进入槽内的抗原肽长度变化较大，在预测的9肽结构基础上做了一定的加长。具体过程为，首先将微小隐孢子虫抗原的氨基酸序列分别以FASTA格式输入以上服务器，返回的表位数据存至word文档。若氨基酸序列长度大于1000个氨基酸残基时，保存得分高的前20个表位，否则取前15个表位。RANKPEP服务器保存显示为红色的返回结果。找出前2个（预测H2-Ed）或4个（预测H2-Ad）服务器预测结果重复率大于60%的片段（即有5个以上重复氨基酸残基）取其并集，将序列向两端各延长1-6个序列作为鼠源H2-d型分子结合的候选表位。

结果：对文献报道的31个隐孢子虫疫苗候选抗原进行抗原表位预测，共获得H2-d型Th表位135个。

实施例2 微小隐孢子虫Th多表位基因的设计和合成

从5个研究较多的微小隐孢子虫疫苗候选抗原P23、CP15、gp15/45/60、GP900、CP15/60中选取10段预测分值较高的Th表位（见下表1）以任意顺序串联在一起，表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接，使10个Th抗原表位在空间上互相独立并各自发挥作用。以SEQ ID NO.11为例，该设计合成的Th多表位氨基酸序列包含232个氨基酸（见SEQ ID NO.11），编码该SEQ ID NO.11氨基酸序列的基因序列为Th多表位基因。为便于重组载体的构建，在Th多表位基因5’端依次加上保护性碱基CCAAT、酶切位点BamHⅠ、kozac序列、起始密码子（ATG）、防错位保护碱基GCT；3’端加上保护性碱基CCAAT，酶切位点Hind Ⅲ、终止密码子TTA，全长727 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，将该基因命名为CpTh10。序列由上海英潍捷基生物技术有限公司合成并连接到pMD-18T载体上，命名为pMD-CpTh10，该pMD-CpTh10重组载体为克隆重组载体。

表1 用于多表位基因CpTh10合成的微小隐孢子虫疫苗候选抗原Th表位预测结果

Th多表位基因编码的氨基酸序列长度为232 AA，等电点9.231。

具体序列如下：

MAAPAEPAPQDKPADAPAAEAGGGGSLLTMKLDEVVELLPARKRRGPGPGGCLNRRTAAFIAKLRKSKGGGGSPVRHGKPGVGSTSSSRFIPLKGPGPGSQPTTPAQSEGATTETIGGGGSLLKDAGSSAFGLRYIVPSVGPGPGPIPGSQAGQIADTSNLFPVQGGGGSDSSFAGAYKYAVSNGIKGPGPGGECEAKGATYVGVIGKDGGGGGSISLSGDGKCRNIALDEI（SEQ ID NO.11）。

该SEQ ID NO.11氨基酸序列中，第一个氨基酸M是由起始密码子编码的氨基酸，第二个氨基酸A是由保护碱基编码的氨基酸。

全长727 bp的CpTh10的核苷酸序列为：

CCAATGGATCCCCGACCATGGCTGCCCCTGCTGAACCTGCTCCACAGGATAAGCCAGCTGATGCCCCAGCTGCTGAAGCTGGAGGCGGAGGCTCTCTCCTTACCATGAAATTGGATGAGGTTGTTGAGCTTTTACCAGCACGTAAAAGACGTGGACCAGGGCCGGGAGGTTGTCTTAACAGAAGAACTGCAGCTTTTATCGCAAAGCTCCGCAAATCTAAGGGTGGTGGCGGTTCCCCAGTACGTCATGGTAAGCCAGGCGTTGGTTCAACCAGTTCTTCCAGATTCATTCCTCTAAAGGGACCTGGTCCAGGCTCCCAACCCACTACTCCAGCTCAAAGTGAAGGCGCAACTACCGAAACCATAGGTGGAGGAGGGTCTCTTTTGAAGGATGCTGGTTCCTCTGCTTTTGGACTCAGATACATCGTTCCTTCCGTTGGACCCGGTCCCGGCCCAATTCCAGGTTCTCAAGCAGGACAAATAGCTGATACAAGCAATTTATTCCCAGTTCAAGGCGGCGGGGGTTCAGATTCTTCATTTGCTGGTGCATACAAATATGCAGTTTCAAATGGTATTAAGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGAATGTGAGGCAAAAGGAGCAACTTATGTTGGTGTTATCGGAAAAGATGGAGGTGGGGGGGGCTCTATTTCGCTTTCTGGAGATGGAAAATGCAGAAATATTGCTTTGGATGAAATCTAAAAGCTTATTGG（SEQ ID NO.12）。

实施例3 微小隐孢子虫Th多表位基因的克隆、表达及纯化

（1）微小隐孢子虫多表位基因原核表达质粒的构建及鉴定

取pET28a（+）质粒和pMD-CpTh10 质粒，分别用BamH I和Hind Ⅲ双酶切，回收载体和目的基因片段，用T₄ DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。碱裂解法提取质粒，经BamH I和Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果如图1所示，双酶切鉴定结果正确，表明pET28a（+）-CpTh10为Th多表位融合蛋白的重组表达载体。在图1中，“1”代表重组表达质粒pET28a（+）-CpTh10的Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切产物，“M”指100 bp DNA分子量标准（100 bp DNA ladder marker）。

（2）重组质粒的诱导表达

将鉴定正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。挑选阳性BL21（DE3）转化菌培养至D_600nm达0.5左右时，以终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导8 h，期间每隔1 h取样，将表达产物进行15% SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达。结果经IPTG 诱导5 h后表达量达到最高（见图2），SDS-PAGE分析表达蛋白的分子质量与预计的约30 ku相近。在图2中，1：重组质粒转化菌未诱导产物；2：重组质粒转化菌IPTG 诱导5 h表达产物；3：纯化后的融合蛋白；M：蛋白质标准分子量。

取IPTG诱导5 h 的表达菌，液氮冻融3次并进行超声波裂解，收集上清液，沉淀加8 mol/L尿素溶解，离心后分别收集尿素上清和沉淀，分析重组蛋白的存在形式。BandScan软件分析显示，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的17.6%，主要为可溶性表达。

（3）重组蛋白的纯化

诱导表达的菌体用1×结合缓冲液（0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L咪唑,pH7.9）充分悬浮，冻融超声裂解后离心收集上清。经Ni-NTA His Bind Resin 层析柱进行分步洗脱并收集含目的蛋白的洗脱液，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE鉴定（见图2），结果表明，表达产物经His亲和层析树脂纯化，获得了较纯的目的蛋白，BandScan 软件分析显示，融合蛋白约占纯化后总蛋白的90.0%。

实施例4 重组蛋白的免疫原性检测

1.重组蛋白的Western blot分析

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素（NC）膜上进行免疫印迹检测。将NC膜浸在含50 g/L脱脂奶粉的磷酸缓冲液PBST中，室温封闭2 h，用PBST洗涤后，将NC膜与1∶200稀释的鼠抗隐孢子虫鼠基因型血清温育1 h，洗涤后再用稀释度为1∶1000 的HRP标记的羊抗鼠IgG温育1 h，用二氨基联苯胺（DAB）溶液显色。

Western blot分析结果显示，重组CpTh10（recombinant CpTh10，rCpTh10）蛋白与鼠抗隐孢子虫鼠基因型血清出现特异性反应（见图3）。在图3中，1：重组质粒表达菌全菌诱导产物；2：纯化后的融合蛋白；M：蛋白质标准分子量。

2. 重组蛋白免疫血清的制备

以纯化的重组蛋白rCpTh10为抗原免疫2只4周龄清洁级BALB/c小鼠，通过背部皮下多点注射的方法免疫3次。每次免疫的间隔时间为2周，免疫剂量为0.08 mg/只。初次免疫时加入等体积的弗氏完全佐剂进行充分乳化，第2次和第3次免疫时加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化。第3次免疫2周后眼眶采血，分离血清-70 ℃保存。

3. 免疫血清效价的ELISA检测

以8 μg/mL重组蛋白4℃包被过夜，并用含5%脱脂奶粉的PBST 37℃封闭2 h，与不同稀释度的重组蛋白免疫小鼠阳性血清37℃温育1 h，再与1：1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG于37 ℃反应1 h，加四甲基联苯胺底物缓冲液（TMB-H₂O₂）37℃反应10 min，用2 mol/L H₂SO₄终止反应，测定吸光度（OD_450nm），检测重组蛋白免疫血清中特异抗体水平，评估免疫血清的抗体效价。

间接ELISA法测定重组蛋白rCpTh10免疫的BALB/c小鼠血清抗体效价，以免疫血清的OD_450nm≥阴性对照OD_450nm值2.1倍以上判定为阳性，结果显示，经3次免疫后，BALB/c小鼠产生了较高的血清抗体效价，血清经1：1600稀释后，抗体效价仍远高于对照组（见表2）。

表2 rCpTh10免疫小鼠血清抗体效价ELISA检测结果（OD_450nm）

在表2中，+：重组蛋白免疫BALB/c小鼠血清；1-2：1和2号免疫小鼠；-：未免疫BALB/c小鼠血清。

实施例5 微小隐孢子虫Th多表位基因重组真核表达质粒的构建

（1）重组真核表达质粒的构建

取pMD-CpTh10重组质粒和pVAX1真核表达载体DNA，分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，用胶回收试剂盒回收载体和目的基因片段，用 T₄ DNA 连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。碱裂解法提取质粒，进行酶切及测序鉴定，阳性重组质粒命名为pVAX1-CpTh10。

重组质粒pVAX-1-CpTh10经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，得到了与预计大小相符的片段（见图4）。在图4中，1：pVAX-1-CpTh10的EcoR I和XhoⅠ酶切鉴定；M1：DNA分子量标准Ⅳ；M2：100 bp DNA分子量标准。重组质粒经测序鉴定未发生碱基突变，开放阅读框编码顺序正确。

（2）重组质粒的大量提取和纯化

将鉴定正确的重组质粒pVAX1-CpTh10转化菌以0.1%浓度重新接种500 mL培养基，碱裂解法大量提取质粒，用聚乙二醇（PEG8000）沉淀法纯化质粒DNA，用GE Healthcare NanoVue紫外可见光分光光度计测定质粒pVAX1-CpTh10的浓度。

实施例6 动物保护性实验

（1）动物分组与免疫

将60只4周龄BALB/c小鼠分成6组，每组10只。rCpTh10亚单位疫苗组用纯化的重组表达蛋白rCpTh10经PBS稀释后与弗氏佐剂充分乳化进行免疫，抗原免疫剂量0.05 mg/只小鼠，免疫方式同实施例4的2（重组蛋白免疫血清的制备）；核酸疫苗组将重组质粒pVAX1- CpTh10 用生理盐水稀释后以0.05 mg/只小鼠的剂量进行免疫。另设4个对照组分别为PBS对照组、生理盐水对照组、佐剂对照组和pVAX-1空质粒对照组。每2周免疫1次，共免疫3次。3免后1周从试验组中任意选取2只小鼠眼眶采血测定血清效价。

（2）保护性实验

第3次免疫2周后各组小鼠每只经口接种l×l0⁶个隐孢子虫鼠基因型卵囊。从接种后第1 d起每隔2 d采粪便10 g，蔗糖漂浮检查隐孢子虫卵囊排出情况。同时称取每组小鼠的排粪便重量，持续记录1个月，根据结果综合评价制备的多表位抗原对小鼠的免疫保护效果。

（3）重组蛋白rCpTh10的免疫保护效果

与PBS空白对照组和佐剂对照组相比，rCpTh10免疫组的排出卵囊数量减少。各组小鼠粪便中隐孢子虫卵囊排出情况如图5所示，至感染后第27天，rCpTh10免疫组检测到的相对卵囊数为11个，PBS空白对照组为15个，佐剂对照组14个。

与对照组相比，rCpTh10免疫组开始排出卵囊时间明显延后。其中佐剂对照组于感染后第4 d检测到卵囊；PBS对照组于感染后第10 d检测到卵囊；rCpTh10免疫组则于感染后第16 d检测到卵囊（见图5）。

与对照组相比，rCpTh10免疫组卵囊排出时间明显缩短，为16 d，而PBS空白对照组为19 d，佐剂对照组为25 d（见图5）。

图5结果表明该重组亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有较好的免疫保护效果。

（4）核酸疫苗的免疫保护效果

至感染后33天，核酸疫苗pVAX-CpTh10免疫组始终未检测到卵囊排出；而生理盐水对照组于感染后第7 d开始检测到卵囊，13-19 d达到高峰，至感染后第28 d排卵囊结束； pVAX-1空载体组于感染后第10 d检测到卵囊，第16 d达到高峰，至试验结束即接种后第33 d，仍有卵囊排出（见图6）。

图6结果表明该重组真核表达质粒具有很好的免疫保护效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（19）

<223> Th表位

<400> 1

Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala

1 5 10 15

Ala Glu Ala

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（19）

<223> Th表位

<400> 2

Leu Leu Thr Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg

1 5 10 15

Lys Arg Arg

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（18）

<223> Th表位

<400> 3

Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe Ile Ala Lys Leu Arg Lys

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（21）

<223> Th表位

<400> 4

Pro Val Arg His Gly Lys Pro Gly Val Gly Ser Thr Ser Ser Ser Arg

1 5 10 15

Phe Ile Pro Leu Lys

20

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（17）

<223> Th表位

<400> 5

Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln Ser Glu Gly Ala Thr Thr Glu Thr

1 5 10 15

Ile

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（19）

<223> Th表位

<400> 6

Leu Leu Lys Asp Ala Gly Ser Ser Ala Phe Gly Leu Arg Tyr Ile Val

1 5 10 15

Pro Ser Val

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（20）

<223> Th表位

<400> 7

Pro Ile Pro Gly Ser Gln Ala Gly Gln Ile Ala Asp Thr Ser Asn Leu

1 5 10 15

Phe Pro Val Gln

20

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（17）

<223> Th表位

<400> 8

Asp Ser Ser Phe Ala Gly Ala Tyr Lys Tyr Ala Val Ser Asn Gly Ile

1 5 10 15

Lys

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（18）

<223> Th表位

<400> 9

Gly Glu Cys Glu Ala Lys Gly Ala Thr Tyr Val Gly Val Ile Gly Lys

1 5 10 15

Asp Gly

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> Cryptosporidium parvum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> （1）..（17）

<223> Th表位

<400> 10

Ile Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu Asp Glu

1 5 10 15

Ile

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Ala Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala

1 5 10 15

Pro Ala Ala Glu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Thr Met Lys Leu

20 25 30

Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg Lys Arg Arg Gly Pro Gly

35 40 45

Pro Gly Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe Ile Ala Lys Leu

50 55 60

Arg Lys Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Val Arg His Gly Lys Pro

65 70 75 80

Gly Val Gly Ser Thr Ser Ser Ser Arg Phe Ile Pro Leu Lys Gly Pro

85 90 95

Gly Pro Gly Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln Ser Glu Gly Ala Thr

100 105 110

Thr Glu Thr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Lys Asp Ala Gly Ser

115 120 125

Ser Ala Phe Gly Leu Arg Tyr Ile Val Pro Ser Val Gly Pro Gly Pro

130 135 140

Gly Pro Ile Pro Gly Ser Gln Ala Gly Gln Ile Ala Asp Thr Ser Asn

145 150 155 160

Leu Phe Pro Val Gln Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Ser Phe Ala Gly

165 170 175

Ala Tyr Lys Tyr Ala Val Ser Asn Gly Ile Lys Gly Pro Gly Pro Gly

180 185 190

Gly Glu Cys Glu Ala Lys Gly Ala Thr Tyr Val Gly Val Ile Gly Lys

195 200 205

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys

210 215 220

Arg Asn Ile Ala Leu Asp Glu Ile

225 230

<210> 12

<211> 727

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccaatggatc cccgaccatg gctgcccctg ctgaacctgc tccacaggat aagccagctg 60

atgccccagc tgctgaagct ggaggcggag gctctctcct taccatgaaa ttggatgagg 120

ttgttgagct tttaccagca cgtaaaagac gtggaccagg gccgggaggt tgtcttaaca 180

gaagaactgc agcttttatc gcaaagctcc gcaaatctaa gggtggtggc ggttccccag 240

tacgtcatgg taagccaggc gttggttcaa ccagttcttc cagattcatt cctctaaagg 300

gacctggtcc aggctcccaa cccactactc cagctcaaag tgaaggcgca actaccgaaa 360

ccataggtgg aggagggtct cttttgaagg atgctggttc ctctgctttt ggactcagat 420

acatcgttcc ttccgttgga cccggtcccg gcccaattcc aggttctcaa gcaggacaaa 480

tagctgatac aagcaattta ttcccagttc aaggcggcgg gggttcagat tcttcatttg 540

ctggtgcata caaatatgca gtttcaaatg gtattaaggg cccgggtccg ggcggcgaat 600

gtgaggcaaa aggagcaact tatgttggtg ttatcggaaa agatggaggt ggggggggct 660

ctatttcgct ttctggagat ggaaaatgca gaaatattgc tttggatgaa atctaaaagc 720

ttattgg 727

Claims

1.一种微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白，其特征在于，包含：SEQ ID NO.1～10所示Th表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列，所述Th表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。

2.根据权利要求1所述的微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

3.一种微小隐孢子虫Th多表位基因，其特征在于，包含编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的微小隐孢子虫Th多表位基因，其特征在于，所述Th多表位基因为编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的微小隐孢子虫Th多表位基因，其特征在于，所述Th多表位基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的微小隐孢子虫Th多表位基因。

7.权利要求1所述的微小隐孢子虫Th多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

8.权利要求3所述的微小隐孢子虫Th多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗为包含真核表达载体和权利要求3所述微小隐孢子虫Th多表位基因序列的核酸疫苗。