CN110407944B

CN110407944B - 隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用

Info

Publication number: CN110407944B
Application number: CN201810405650.2A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 游艳敏; 李艳; 米荣升; 黄燕; 韩先干
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2018-04-29
Filing date: 2018-04-29
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2038-04-29
Also published as: CN110407944A

Abstract

本发明公开了一种隐孢子虫多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1～10所示表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。本发明还公开了隐孢子虫多表位基因片段，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明隐孢子虫多表位基因片段，经原核表达后所得的重组蛋白，或克隆至真核载体所得的真核重组载体，无论是单独免疫，还是添加大蒜素，对小鼠泰泽隐孢子虫感染都有很好的保护作用，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

Description

隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用。

背景技术

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)引起的人兽共患传染病，在健康的人和动物中，常引起自限性腹泻；而在免疫功能缺陷的患者，如艾滋病(AIDS)病人、器官移植病人中，可导致严重疾病，甚至威胁生命。调查显示，隐孢子虫是继轮状病毒后，引起全球五岁以下儿童腹泻第二重要的病原，而全世界10.5％儿童死亡是由腹泻引起的。目前该病尚无特效治疗药物，绝大多数抗生素、抗寄生虫药均无效；亦缺乏获得临床批文的预防疫苗，现有抗原制备的疫苗的免疫保护效果均不够理想。因此，寻找和研制新型的隐孢子虫抗原、研制高效的隐孢子虫病预防疫苗十分迫切。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常使用单一的隐孢子虫抗原基因，构建核酸疫苗或活载体疫苗；或使用其表达的融合蛋白，制备亚单位疫苗。但是，此类疫苗的保护效果均不够令人满意。其原因可能是由于隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，达数千种之多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期。另一方面，使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际上兴起了利用抗原表位预测工具、开展抗原表位预测、构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)的热潮，取得了阶段性成果，尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果。目前国内外尚缺乏隐孢子虫多表位疫苗的研究报道。

发明内容

本发明要解决目前缺少高效的隐孢子虫疫苗的技术问题，提供一种隐孢子虫多表位基因片段cpmcef，利用该基因片段制备的融合蛋白、及构建的真核重组质粒，可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种隐孢子虫多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1～10所示表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

优选的，各表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。在各个表位序列之间加入柔性氨基酸组成的接头序列，能使各个抗原表位在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC(Major Histocompatibility Complex,主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用)分子的结合；同时在各个表位之间用接头序列连接，可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种隐孢子虫多表位基因片段，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述隐孢子虫多表位基因片段包含编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述隐孢子虫多表位基因片段具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述隐孢子虫多表位基因片段的真核重组载体。

优选的，所述真核重组载体还包含细胞因子序列、和/或CpG序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述隐孢子虫多表位融合蛋白、或真核重组载体。

优选的，所述疫苗还包含大蒜素。

在本发明的另一方面，还提供了上述隐孢子虫多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的药物中的应用。

在本发明中，将融合蛋白与弗氏不完全和完全佐剂、Montanide ISA 206等充分混匀制备亚单位疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了上述隐孢子虫多表位基因片段在制备预防或治疗隐孢子虫病的药物中的应用。

在本发明中，将隐孢子虫多表位基因片段克隆到真核载体如pVAX1、pcDNA3.1等，或共同插入细胞因子基因，构建成核酸疫苗。

本发明隐孢子虫多表位基因片段cpmcef，经原核表达后所得的重组蛋白rCpMCEF，或克隆到真核载体中得真核重组载体pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG，无论是单独免疫，还是添加大蒜素，对小鼠泰泽隐孢子虫感染都有很好的保护作用，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例3扩增目的基因片段cpmcef(e)的PCR结果图；

图2是本发明实施例3真核重组表达质粒pMD-cpmcef(e)的BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切鉴定结果图；

图3是本发明实施例3重组表达质粒pVAX-1-cpmcef经BamH Ⅰ和Xb aⅠ双酶切鉴定结果图；

图4是本发明实施例3重组表达质粒pVAX-1-cpmcef的PCR鉴定结果图；

图5是本发明实施例3的CpG片段的PCR扩增结果图；

图6是本发明实施例3的cpmcef基因片段和IFNγ基因片段的PCR扩增结果图；

图7是本发明实施例3的KpnI单酶切真核表达载体pVAX-1的鉴定图；

图8是本发明实施例3的pVAX-cpmcef-CpG转化菌和pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG转化菌的PCR鉴定图；

图9是本发明实施例4的cpmcef基因的PCR扩增图；

图10是本发明实施例4的重组质粒pColdI-cpmcef的PCR扩增图；

图11是本发明实施例4的pColdI-cpmcef诱导株的鉴定图；

图12是本发明实施例4的rCpMCEF表达形式的验证图；

图13是本发明实施例4的rCpMCEF可溶性形式的验证图；

图14是本发明实施例4的rCpMCEF蛋白的Western blot分析图；

图15是本发明实施例5单价疫苗免疫保护试验的血清抗体效价的ELISA检测图；

图16是本发明实施例5单价疫苗免疫保护试验的细胞因子的检测结果图；

图17是本发明实施例5单价疫苗免疫保护试验的定量PCR标准曲线图；

图18是本发明实施例5单价疫苗免疫保护试验的接种后各组小鼠的卵囊排出曲线图；

图19是本发明实施例5多价疫苗免疫保护试验的血清抗体效价的ELISA检测图；

图20是本发明实施例5的小鼠脾淋巴细胞增殖情况图；

图21是本发明实施例5多价疫苗免疫保护试验的细胞因子的检测结果图；

图22是本发明实施例5多价疫苗免疫保护试验的定量PCR标准曲线图；

图23是本发明实施例5多价疫苗免疫保护试验的接种后各组小鼠的卵囊排出曲线图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明应用多个服务器对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析，预测可能存在的T细胞表位。从预测出的抗原表位中，选出10个分值较高的表位基因以任意顺序进行相互串联，形成多表位基因，进行人工合成，各表位之间用柔性氨基酸链接。将该多表位基因克隆到真核表达质粒pVAX1中，同时插入CpG、牛IFN-γ基因，构建多价疫苗。同时，将该基因插入pCold原核表达载体中进行原核表达，制备亚单位疫苗；将该多表位基因克隆到真核表达载体中，构建核酸疫苗。将上述疫苗免疫小鼠，并辅以适当的免疫增强剂，观察对小鼠人工感染的免疫保护效果。结果显示，rCpMCEF蛋白免疫组减卵率高达76.79％和79.94％，rCpMCEF蛋白+Gar组减卵率高达88.52％，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组减卵率高达71.33％，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组减卵率高达88.59％，提示无论是rCpMCEF蛋白单独免疫，或添加大蒜素；pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG单独免疫或添加大蒜素，均对小鼠泰泽隐孢子虫感染有很好的保护作用。

实施例1隐孢子虫抗原T细胞表位预测

通过文献检索，搜集潜在的隐孢子虫候选疫苗抗原，记录其GeneBank登录号，从NCBI中下载相关蛋白序列。

运用离线和在线的表位预测服务器，包括DNAMAN、CTLPred、ProPred1、MAPPP、nHLAPred、BIMAS、LPPEP、SYMHC、NetMHC、MHCPred、Epitopebinding、MMPRED、PREDEP、T-epitope designer、PREDICT、SYFPEITHI、RANKPEP、MHCBench、ProPred、Epipredict、ProPred2、HLADR4Pred、HLADR4Pred、MHC2Pred、MHC-Thread等，对筛选的隐孢子虫抗原进行CTL和Th表位预测，具体方法按照相关软件使用说明进行。对各种软件预测获得的表位分别进行排序和打分，根据多个软件评判结果进行综合分析。

结果：从文献报道中，共选择筛选了26个隐孢子虫疫苗候选抗原，分别是：P23、CP15、CP15/60、GP900、GP15/45/60、TRAP-C1、COWP、COWP2、α-tubulin、β-tubulin、actin、Eif-4、EF-1α、EF-2、HSP70、HSP90、RNApol、Phem2、Cppa-E1、HemA、DHFR-TS、RNR-R1、PD1、Acety-CoA、SCRP、cpa135。对其进行抗原表位预测，共获得361个抗原表位。

实施例2隐孢子虫多表位基因片段cpmcef的设计和合成

在获得的361个表位中，筛选得分相对较高的10个表位(见SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10)串联在一起，表位之间用柔性氨基酸链接，使10个抗原表位在空间上互相独立并各自发挥作用。同时，在其多表位基因序列5’端和3’端分别加上保护性碱基、酶切位点、kozac序列、起始密码子、防错位保护碱基GCT、终止密码子等，形成一条隐孢子虫多表位基因片段，全长442bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，将该基因片段命名为cpmcef。序列由华大基因有限公司合成并连接到pMD-18T载体上，命名为pMD-cpmcef，该pMD-cpmcef重组载体为克隆重组载体。其编码的多肽氨基酸序列见SEQ ID NO.11，命名为CpMCEF。

实施例3隐孢子虫多表位基因片段cpmcef真核表达重组质粒的构建

(1)重组真核表达质粒的构建

按照pVAX-1表达载体多克隆位点上的酶切位点与三联体密码子的要求，重新合成隐孢子虫多表位基因片段cpmcef的上游引物和下游引物。设计的引物如下cpmcef(e)F：CCGGAATTCCCGACCATGGCTATGAAATTGGATGAGGTTGTTG(SEQ ID NO.13)；cpmcef(e)R：CCCTCTAGATTATTCA TCCAAAGCAATATTTCTG(SEQ ID NO.14)。以pMD-cpmcef菌液为模板，进行PCR扩增。经过30个循环的PCR扩增，获得了cpmcef(e)基因，大小与预计相符(见图1)，

图1中，M：100bp DNA分子量标准；1-2：cpmcef(e)PCR扩增产物。用胶回收试剂盒回收目的基因片段cpmcef(e)。采用TA克隆方法将目的基因克隆到pMD-18T载体，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，碱裂解法提取重组质粒DNA，经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的真核重组表达质粒命名为pMD-cpmcef(e)。pMD-cpmcef(e)经BamHⅠ和Xba Ⅰ双酶切，得到两条带，与预计片段大小相同(见图2)。

图2中，1：pMD-cpmcef(e)的BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物；M1：100bp DNA分子量标准；M2：Marker Ⅳ DNA分子量标准。经测序鉴定序列未发生碱基突变。

取pMD-cpmcef(e)质粒和载体pVAX1，分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，用胶回收试剂盒回收载体和目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选(Kan+)阳性菌落。碱裂解法提取质粒，进行酶切及测序鉴定，阳性重组质粒命名为pVAX-1-cpmcef。重组表达质粒pVAX-1-cpmcef经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切鉴定正确，结果如图3所示；重组质粒经PCR扩增(图4)及扩增产物序列分析，显示插入序列未发生突变，插入位点正确。

在图3中，1：pVAX-1-cpmcef的BamH I和Xba I双酶切产物；M：Marker Ⅳ DNA分子量标准。

在图4中，M：DL2000DNA分子质量标准；1：cpmcef片段的扩增产物；2：阴形对照。

(2)含细胞因子和CpG序列的真核重组表达质粒的构建

根据GenBank中登录的牛IFNγ基因序列(登录号NM_174086)，运用Primer 6.0软件设计一对扩增引物IFNγF和IFNγR；根据cpmcef基因序列，设计3条引物cpmcefF、cpmcefR1和cpmcefR2，在上游引物中加入一段Kozak翻译起始序列(GCCACC)；由上海擎熙生物技术有限公司合成的CpG基因，插入pVAX1中，并设计一对引物CpGF和CpGR。在各片段连接处均加上柔性氨基酸(GGGGS等)，并参照pVAX-1载体上的限制性酶切位点Kpn Ⅰ两端的序列。具体序列如表1、2，引物由上海擎熙生物技术有限公司合成。

表1构建pVAX-cpmcef-CpG所需特异性引物

以pVAX-cpmcef质粒DNA为模板，PCR扩增cpmcef片段；以pVAX-CpG质粒DNA为模板，PCR扩增CpG片段；以pMD-18T-IFNγ质粒DNA为模板，PCR扩增获得IFNγ片段。选择Kpn I限制性内切酶将pVAX-1切成线性化载体，用无缝连接试剂盒对酶切后载体和PCR扩增的片段进行连接，体系中线性化载体与各个插入片段的摩尔比为1：2，分别将cpmcef片段、CpG片段与线性化pVAX-1(45ng/μL)连接，将cpmcef片段、IFNγ片段、CpG片段与线性化pVAX-1连接，转化入大肠杆菌。阳性菌经PCR鉴定、序列测定正确后大量繁殖，大量提取质粒，用NanoDrop2000c测定质粒DNA浓度，-80℃保存。

结果：

1)经过30个循环的PCR扩增，成功获得了一个大小为137bp的基因片段(图5，CpG片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)，与预期大小符合。图4中，M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2-6：CpG片段的扩增产物。

2)经过30个循环的PCR扩增，成功获得了一个大小为442bp的cpmcef基因片段以及525bp的IFNγ基因片段(图6，IFNγ片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示)，与预期大小符合。图6中，M：DNA分子质量标准；1-4：cpmcef片段的扩增产物；6-9、12-16：IFNγ片段的扩增产物；5、10：阴形对照。

3)经过限制性内切酶KpnI对真核表达载体pVAX-1作用3h后，成功获得了pVAX-1酶切产物(图7)。图7中，M：DNA分子质量标准；1:KpnI单酶切pVAX-1；2：阴形对照。

4)使用infusion技术将相应片段与载体进行连接，质粒转化至Trans1-T1PhageResistant化学感受态细胞中，挑取单菌落摇菌后对pVAX-cpmcef-CpG转化菌和pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG转化菌进行菌液PCR鉴定，得到与预期条带大小相符的片段(图8)，cpmcef-CpG片段为579bp，cpmcef-IFNγ-CpG片段为1104bp，将测序结果进行分析比对后，相似度100％，无碱基突变。图8中，M：DNA分子质量标准；1:KpnI单酶切pVAX-1；2：pVAX-cpmcef-CpG转化菌PCR鉴定；3：pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG转化菌的PCR鉴定。

实施例4微小隐孢子虫多表位基因片段cpmcef的克隆、表达及纯化

(1)微小隐孢子虫多表位基因片段cpmcef原核表达质粒的构建及鉴定

设计一对上下游引物(表3)，在引物的5’、3’端分别引入限制性内切酶位点及相应的保护性碱基序列。引物由上海擎熙生物技术有限公司合成。以实验室保存的pVAX-cpmcef质粒DNA为模板进行PCR扩增，胶回收cpmcef目的片段，插入pClone007Simple Vector，转化大肠埃希菌，挑取单菌落，PCR和序列测定鉴定正确后，提取鉴定正确的单菌落菌液质粒DNA，使用限制性内切酶BamH I和Hind III切割pClone007-cpmcef质粒及pColdI载体质粒，进行连接，连接产物转化至BL21(DE3)化学感受态细胞中，培养后挑取单菌落摇菌，经PCR和序列测定鉴定正确后，加入终浓度为1mMol/L IPTG于16℃诱导24h，观察表达时相和表达形式。结果，成功地在原核体系中表达了cpmcef基因，重组蛋白大小约为16ku，呈包涵体表达。以感染隐孢子虫的阳性小鼠血清(1:1000稀释)为一抗，以抗His单抗为二抗进行，WesternBlot分析，用Enhanced HRP-DAB Charomogenic Substrate Kit显色。结果显示，出现明显的反应条带，表明重组CpMCEF(recombinant CpMCEF，rCpMCEF)蛋白反应原性良好。

表3PCR扩增所需特异性引物

结果：

1)经过30个循环的PCR扩增，成功获得了一个大小为442bp的基因片段(图9)，与预期大小符合。图9中，M：DNA分子质量标准；1-2：阴性对照；3-4：cpmcef基因的扩增产物。

2)重组质粒pColdI-cpmcef转化菌经PCR扩增，出现一条大小约为442bp的扩增片段(图10)，与预期一致。图10中，M：DNA分子质量标准；1-2：cpmcef基因的扩增产物。

3)pColdI-cpmcef转化菌经终浓度为1mMol/L IPTG于16℃诱导24h后，SDS-PAGE电泳后在16ku处有明显的蛋白条带(图11)。图11中，M：蛋白质分子质量标准；1：未诱导的pColdI-cpmcef菌株蛋白；2-5：IPTG诱导表达24h的pColdI-cpmcef菌株蛋白。

4)将诱导菌液进行超声破碎后，离心收集上清及沉淀，将上清过His柱进行蛋白纯化，使用含有不同梯度咪唑的结合缓冲液，以此从低浓度至高浓度进行洗脱，分别收集流川液、漂洗液和各个浓度的洗脱液，加入蛋白上样缓冲液后，SDS-PAGE鉴定，发现rCpMCEF存在于沉淀中(图12)，说明rCpMCEF是以包涵体形式表达。图12中，M：蛋白质分子质量标准；1：菌液超声裂解后的沉淀；2：流川液；3：漂洗液；4：50mMol/L咪唑洗脱液；5：100mMol/L咪唑洗脱液；6:150mMol/L咪唑洗脱液；7:200mMol/L咪唑洗脱液；8:250mMol/L咪唑洗脱液；9:300mMol/L咪唑洗脱液。

5)用盐酸胍变性剂将包涵体变性后形成可溶性抗原，再使用His柱进行纯化，SDS-PAGE验证结果(图13)。图13中，M：蛋白质分子质量标准；1：2Mol/L盐酸胍洗脱液；2：4Mol/L盐酸胍漂洗液；3：1Mol/L盐酸胍洗脱液。

6)WB验证rCpCTL10蛋白

Western blot分析结果显示，重组rCpMCEF蛋白组出现明显的反应条带，显示重组蛋白的反应原性良好(图14)。图14中，M：蛋白质分子质量标准；1：rCpMCEF蛋白。

实施例5小鼠免疫保护效果试验

试验分2批次完成。

1、单价疫苗的免疫保护效果试验

将192只3周龄雌性ICR小鼠随机分成12组，每组16只，分别为pVAX-CP15/60组、pVAX-P23组、pVAX-CP41组、pVAX-Sushi组、pVAX-CpT全组、pVAX-CpTm组、rCpMCEF蛋白组、真核载体(pVAX-1)对照组、佐剂对照组、TB(真核洗脱液)对照组、只感染不免疫对照组及不感染不免疫对照组。

rCpMCEF蛋白组和佐剂对照组采用皮下多点注射法；其余各组以肌肉注射的方式接种疫苗。每两周免疫一次，共免疫三次。首次免疫时rCpMCEF蛋白组按1:1加入弗氏完全佐剂，充分混匀后进行免疫；二免、三免时则采用弗氏不完全佐剂，添加体积比为1:1。免疫剂量：首次免疫时rCpMCEF蛋白组和佐剂对照组100μg/只，二免三免剂量为50μg蛋白/只；不免疫只感染对照组和不免疫不感染对照组不进行免疫；其余组首次免疫100μL/只，二免三免剂量为50μL/只。首次免疫前及每次免疫后第7d进行眼眶采血，-80℃保存血清，用于检测血清效价及细胞因子的检测。第三次免疫后的第二周每组(不免疫不感染对照组除外)随机抽取10只进行卵囊接种，每只接种5×10⁵个新鲜繁殖或繁殖后于4℃保存不超过2个月的泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)卵囊。剩余的6只用于提取脾脏淋巴细胞。

每次免疫后一周采血并分离血清，用间接ELISA法检测血清抗体效价。

第3次免疫后的第7d，每组在未感染的6只中随机抽取3只小鼠，分别单独分离脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖试验；取淋巴细胞悬液加入FITC anti-mouse CD3、1.25μL PERat Anti-Mouse CD4和1.25μL PE/Cy7Anti-Mouse CD8a，流式细胞仪Cytomics FC 500检测T淋巴细胞亚型。采用BD公司生产的BD^TM Cytometric Bead Array(CBA)EnhancedSensitivity Mouse Flex Set检测各组小鼠血清中的细胞因子含量。接种后每隔2d收一次鼠粪，每次每组收取1g粪便，共收10次，提取粪便DNA，参考Jothikumar等(2008)方法，采用实时荧光定量PCR法对各组粪便中隐孢子虫DNA的含量进行检测。

结果显示，

1)血清抗体ELISA检测

与对照组相比，各实验组小鼠血清中的抗体水平随着免疫次数的增加逐渐增加，显著高于各对照组(图15)，说明pVAX-P23、pVAX-CP15/60、pVAX-CpTm、pVAX-CpT全、pVAX-CP41和pVAX-Sushi在小鼠体内成功表达，表达的蛋白诱导小鼠产生了明显的体液免疫反应，且能被隐孢子虫卵囊可溶性抗原成功检测；rCpMCEF蛋白也诱导小鼠产生了明显的体液免疫反应，且能被隐孢子虫卵囊可溶性抗原成功检测。

2)T淋巴细胞亚型的检测

流式细胞术检测结果显示，在CD4⁺/CD8⁺的比值方面，pVAX1-P23组、pVAX-Sushi组、pVAX-CpTm组和pVAX-CpT全组与pVAX-1组、TB组及空白对照组相比差异显著(P<0.05)，pVAX-CP41组和pVAX-CP15/60组与pVAX-1组、TB组及空白对照组相比差异不显著(P>0.05)；CpMCEF蛋白组与佐剂对照组和空白对照组相比差异显著(P<0.05)(表4)。

表4T淋巴细胞亚型检测结果

注：在同一列中标注相同的字母表示差异不显著(P>0.05)，标注不同的字母代表差异显著(P<0.05)。

3)细胞因子检测

结果显示，各实验组与对照组相比，六种细胞因子的分泌情况存在不同(图16)。IL-4分泌方面，pVAX-CP15/60组、pVAX-CpTm组和pVAX-CpT全组与对照组相比差异显著(P<0.05)，显著高于对照组；IL-5分泌方面，pVAX-Sushi组、pVAX1-P23组、pVAX-CP41组和rCpMCEF蛋白组与对照组相比差异显著(P<0.05)，显著高于对照组，pVAX-CpT全组与对照组相比差异显著(P<0.05)，显著低于对照组；IFN-γ分泌方面，pVAX-Sushi组、pVAX-CP15/60组和pVAX1-P23组与对照组相比差异显著(P<0.05)，显著高于对照组，然而rCpMCEF蛋白组和佐剂对照组与不感染不免疫组相比差异均显著(P<0.05)；TNF分泌方面，核酸疫苗组的pVAX1对照组分泌量显著降低(P<0.05)，与不感染不免疫组相比，pVAX-Sushi组、pVAX1-P23组和pVAX-CP41组分泌量显著增高(P<0.05)，pVAX-CP15/60组显著降低(P<0.05)，rCpMCEF蛋白组与佐剂对照组和不感染不免疫组相比TNF分泌显著增高(P<0.05)；IL-17分泌方面，与对照组相比，pVAX-Sushi组、pVAX-CpT全组、pVAX-CpTm组和rCpMCEF蛋白组显著增高(P<0.05)；IL-12P70分泌方面，pVAX-CP15/60组和pVAX1-P23组与对照组相比显著增高(P<0.05)。

4)粪便卵囊减少率检测

将标准品10倍梯度稀释后，运用qPCR技术使用JVAP18S扩增后，得到以下标准曲线，R²＝0.9997(图17)。

经实时荧光定量PCR检测，不感染不免疫组中未检测出卵囊，其余各组卵囊排出曲线呈相似变化趋势，即均出现两个排卵峰值，其中pVAX-1对照组、TB对照组、只感染不免疫组、pVAX-CP15/60组、pVAX-CpT全组、pVAX-CP41组、rCpMCEF蛋白组均在接种后第12天(Day12post infection,D12PI)出现第一个卵囊排出量峰值，在D21PI又出现第二个峰值(图18)，pVAX-CpTm组在D27PI又出现第三个小峰；而pVAX1-P23免疫组则在D15PI出现第一个峰，但比各对照组要低，在D21PI天出现一个较第一次低很多的峰。

减卵率统计结果显示，rCpMCEF蛋白组减卵率高达76.79％，pVAX-P23组减卵率达69.93％，pVAX-CP15/60组减卵率达51.20％，pVAX-CP41组减卵率达52.03％，显著高于对照组的减卵率。然而，pVAX-Sushi组与pVAX-CpTm组的减卵率略微高于对照组，不及25％；pVAX-CpT全组的减卵率与pVAX-1对照组减卵率无显著差异(表5)。

表5接种后各组小鼠减卵率情况

2、多价疫苗免疫保护试验

为观察添加了CpG、细胞因子的多价核酸疫苗，以及免疫增强剂大蒜素(garlicin,Gar)和黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对疫苗的作用，将288只3周龄雌性ICR小鼠随机分成18组，每组16只，分别为pVAX-P23组、pVAX-P23+Gar组、pVAX-P23+APS组、pVAX-cpmcef组、pVAX-cpmcef-CpG组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+APS组、rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+Gar组、rCpMCEF蛋白+APS组、真核载体(pVAX-1)对照组、佐剂对照组、TB(真核洗脱液)对照组、APS对照组、Gar对照组、只感染不免疫组、不感染不免疫组。

其中pVAX-P23组、pVAX-P23+Gar组、pVAX-P23+APS组、真核载体(pVAX-1)对照组、TB(真核洗脱液)对照组以肌肉注射的方式接种疫苗，每两周免疫一次，共免疫三次，pVAX-P23+Gar组、pVAX-P23+APS组在感染前两天分别开始饲喂大蒜素和黄芪多糖直至实验结束；pVAX-cpmcef组、pVAX-cpmcef-CpG组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+APS组以肌肉注射的方式接种疫苗，每两周免疫一次，共免疫三次，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组和pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+APS组在感染前两天分别开始饲喂大蒜素和黄芪多糖直至实验结束，黄芪多糖溶于水，每只小鼠每天饲喂2mg。

rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+Gar组、rCpMCEF蛋白+APS组和佐剂对照组采用皮下多点注射法，每两周免疫一次，共免疫三次。其中rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+Gar组、rCpMCEF蛋白+APS组首次免疫时rCpMCEF蛋白中需要加入弗氏完全佐剂增加吸收效果，添加体积比为1:1，用乳化器将两者充分混匀后即可进行免疫，二免、三免的时候采用弗氏不完全佐剂，添加体积比为1:1；rCpMCEF蛋白+Gar组和rCpMCEF蛋白+APS组在感染前两天分别开始饲喂大蒜素和黄芪多糖直至实验结束。免疫剂量：首次免疫时rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+Gar组和rCpMCEF蛋白+APS组100μg/只，二免三免剂量为50μg/只；只感染不免疫对照组和不感染不免疫对照组不进行免疫；其余组首次免疫100μL/只，二免三免剂量为50μL/只。首次免疫前及每次免疫后第7天进行眼眶采血，-80℃保存血清，用于检测血清效价及细胞因子的检测。

各试验组第三次免疫后的第二周每组(不免疫不感染对照组除外)随机抽取10只进行卵囊接种，每只接种新鲜制备或于4℃保存不超过2个月的C.tyzzeri 2.65×106个卵囊。剩余的6只用于提取脾脏淋巴细胞。检测内容和方法同单价疫苗试验。

1)血清抗体效价的ELISA检测

经过对免疫前及每次免疫后收集的小鼠血清中所含的抗体水平进行检测，采用ttests法进行各组间的差异显著性分析，经分析发现与对照组相比各实验组小鼠血清中的抗体水平随着免疫次数的增加逐渐增加(图19)，显著高于各对照组(P<0.05)。

2)脾脏淋巴细胞增殖实验

结果显示(图20)，rP23蛋白对小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数明显高于其余三组对照组，其中rP23蛋白组与GST对照组、GSH对照组和空白对照组相比差异显著(P<0.05)。rCpMCEF蛋白对小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数显著高于空白对照组(P<0.05)。图20中，A：rP23；B：rCpMCEF。

3)T淋巴细胞亚型的检测

使用流式细胞术对各组T淋巴细胞亚群进行检测，结果显示，在CD4⁺/CD8⁺的比值方面，不感染不免疫组比值为1.78(表6)，pVAX1-P23组和pVAX-cpmcef组也较低，与不感染不免疫组差异不显著(P>0.05)；其余核酸疫苗组，以及TB对照组、pVAX-1组与对照组相比差异显著(P<0.05)，其中pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组高达5.12，APS对照组与Gar对照组的CD4+/CD8+的比值较高，甚至高于二者的实验组比值。rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+APS组和rCpMCEF蛋白+Gar组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，rCpMCEF蛋白组与佐剂对照组相比差异不显著(P>0.05)。rCpMCEF蛋白+APS组与APS对照组相比差异显著(P<0.05)，比值显著降低。rCpMCEF蛋白+Gar组与Gar对照组相比差异显著(P<0.05)，显著增高(表6)。

表6T淋巴细胞亚型检测结果

4)细胞因子的检测

取3免后(剖杀前)的各组血清，检测各组血清中细胞因子的分泌情况。结果显示，各实验组与对照组相比，六种细胞因子的分泌情况存在不同(图21)。IL-4分泌方面，pVAX-cpmcef组和pVAX-CP23组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。IL-5分泌方面，pVAX-cpmcef-CpG组、Gar对照组和pVAX-1组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著降低，rCpMCEF蛋白+APS组和rCpMCEF蛋白组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。IFN-γ分泌方面，pVAX-1组和TB组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著降低；pVAX-cpmcef-CpG+APS组、rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+APS组和rCpMCEF蛋白+Gar组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。TNF分泌方面，pVAX-cpmcef-CpG组、pVAX-1对照组、TB对照组、Gar对照组和APS对照组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著降低；pVAX-cpmcef-CpG+APS组、pVAX-P23+APS组、pVAX-P23+Gar组、rCpMCEF蛋白组、rCpMCEF蛋白+APS组和rCpMCEF蛋白+Gar组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。IL-17分泌方面，与不感染不免疫组相比，pVAX-1组、Gar对照组、佐剂对照组pVAX-cpmcef-CpG组和pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著降低；pVAX-P23+APS组、pVAX-P23+Gar组、rCpMCEF蛋白组和rCpMCEF蛋白+APS组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。IL-12P70分泌方面，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组、pVAX-cpmcef组、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+APS组、pVAX-P23组、pVAX-P23+Gar组、rCpMCEF蛋白+APS组和rCpMCEF蛋白+Gar组与不感染不免疫组相比差异显著(P<0.05)，显著增高。

5)粪便卵囊减少率检测

同试验一，将标准品10倍梯度稀释后，运用qPCR技术使用JVAP18S扩增后，得到以下标准曲线(图22)，R²＝0.9981。

经实时荧光定量PCR检测，不感染不免疫组中未检测出卵囊，其余各组卵囊排出曲线呈相似变化趋势，即均出现两个排卵峰值，每组峰值出现的日期不同(图23)。

减卵率统计结果(表7)显示，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组减卵率高达88.59％，rCpMCEF蛋白+Gar组减卵率高达88.52％，rCpMCEF蛋白组减卵率高达79.94％，pVAX-P23组减卵率高达74.38％，pVAX-P23+Gar组减卵率高达75.40％，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组减卵率高达71.33％。pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组(减卵率71.33％)与未联合IFNγ的pVAX-cpmcef-CpG组(减卵率37.26％)相比减卵率显著增高(P<0.05)。APS对照组减卵率最低，排卵量高于不感染不免疫组，减卵率只有-41.51％，与APS联合的疫苗的减卵率没有与Gar联合的疫苗减卵率增加的多，甚至pVAX-P23+APS组(减卵率62.30％)、pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+APS组(减卵率25.60％)和cpmcef蛋白+APS组(减卵率23.48％)与未联合APS之前相比显著降低(P<0.05)。pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组(减卵率88.59％)和rCpMCEF蛋白+Gar组(减卵率88.52％)与未联合Gar时相比，显著增高(P<0.05)，Gar对照组的减卵率有60.15％。

表7接种后各组小鼠减卵率情况

上述结果显示，rCpMCEF蛋白免疫组减卵率高达76.79％和79.94％，rCpMCEF蛋白+Gar组减卵率高达88.52％，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG组减卵率高达71.33％，pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG+Gar组减卵率高达88.59％，该结果提示无论是rCpMCEF蛋白单独免疫，还是添加大蒜素；pVAX-cpmcef-IFNγ-CpG单独免疫或添加大蒜素，均对小鼠泰泽隐孢子虫感染有很好的保护作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 1

Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 2

Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 3

Gly Tyr Gln Thr Ser Ala Asp Phe Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 4

Met Tyr Asp Pro Asn Thr Asn Ser Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 5

Val Tyr Ile Pro Tyr Thr Lys Cys Val

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 6

Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Arg Glu Ile

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 7

Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Lys Gln Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 8

Ile Tyr Ile Val Gln Lys Tyr Val Ile

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 9

Val Phe Asp Ser Thr Ser Ile Ser Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）

<400> 10

Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu

1 5

<210> 11

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 11

Met Ala Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile Gly Pro Gly Pro Gly Gly Tyr

20 25 30

Gln Thr Ser Ala Asp Phe Val Gly Gly Gly Gly Ser Met Tyr Asp Pro

35 40 45

Asn Thr Asn Ser Ile Gly Pro Gly Pro Gly Val Tyr Ile Pro Tyr Thr

50 55 60

Lys Cys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Arg Glu

65 70 75 80

Ile Gly Pro Gly Pro Gly Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Lys Gln Leu Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Ile Val Gln Lys Tyr Val Ile Gly Pro Gly

100 105 110

Pro Gly Val Phe Asp Ser Thr Ser Ile Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu

130 135

<210> 12

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 12

ccaatggatc cccgaccatg gctaaacctg ttgctgttcg tacccattta ggaggcggag 60

gttctgccta cactatcgtc tatgcaccta taggaccagg gccgggagga tatcaaactt 120

cagctgattt cgtaggtggt ggcggttcca tgtacgatcc aaacacgaat tctattggac 180

ctggtccagg tgtatacatt ccatacacta aatgtgttgg tggaggaggg tctaaatatt 240

tgtatggtat tagagaaatt ggacccggtc ccggcgatta tatttcaaat gctaaacaat 300

taggcggcgg gggttcaata tatatagttc agaaatatgt aataggaccg ggtccgggcg 360

tatttgatag cacaagtatt tcgcttggtg gggggggctc tgatggaaaa tgcagaaata 420

ttgctttgta aaagcttatt gg 442

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 13

ccggaattcc cgaccatggc tatgaaattg gatgaggttg ttg 43

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 14

ccctctagat tattcatcca aagcaatatt tctg 34

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 15

aaacttaagc ttggtacgcc accatggcta aacctg 36

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 16

ggacccgcct ccacccaaag caatatttct gcattttc 38

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 17

ggtggaggcg ggtccgaat 19

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 18

ctagtggatc cgagctcgtt aaacgt 26

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 19

aaacttaagc ttggtacgcc accatggcta aacctg 36

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 20

agagcctccg cctcccaaag caatatttct gcattttc 38

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 21

ggaggcggag gctctaaata tacaagctat ttcttagc 38

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 22

ggacccgcct ccacccgttg atgctctccg 30

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 23

ggtggaggcg ggtccgaat 19

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 24

ctagtggatc cgagctcgtt aaacgt 26

<210> 25

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 25

ggtggaggcg ggtccgaatt cgaattctct agaggcagtg gagagggcag aggaagtctg 60

ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccatcca tgacgttcct gacgtttaac 120

gagctcggat ccactag 137

<210> 26

<211> 525

<212> DNA

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 26

ggaggcggag gctctaaata tacaagctat ttcttagctt tactgctctg tgggcttttg 60

ggtttttctg gttcttatgg ccagggccaa ttttttagag aaatagaaaa cttaaaggag 120

tattttaatg caagtagccc agatgtagct aagggtgggc ctctcttctc agaaattttg 180

aagaattgga aagatgaaag tgacaaaaaa attattcaga gccaaattgt ctccttctac 240

ttcaaactct ttgaaaacct caaagataac caggtcattc aaaggagcat ggatatcatc 300

aagcaagaca tgtttcagaa gttcttgaat ggcagctctg agaaactgga ggacttcaaa 360

aagctgattc aaattccggt ggatgatctg cagatccagc gcaaagccat aaatgaactc 420

atcaaagtga tgaatgacct gtcaccaaaa tctaacctca gaaagcggaa gagaagtcag 480

aatctctttc gaggccggag agcatcaacg ggcggcgggg gttca 525

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 27

cgcggatccg ctaaacctgt tgctgttcgt accc 34

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 28

cccaagcttt tacaaagcaa tatttctgca ttttccat 38

Claims

1.一种隐孢子虫多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.11所示的氨基酸序列。

2.一种隐孢子虫多表位基因片段，其特征在于，所述基因片段为编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的隐孢子虫多表位基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

4.一种真核重组载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的隐孢子虫多表位基因片段。

5.根据权利要求4所述的真核重组载体，其特征在于，还包含细胞因子序列、和/或CpG序列。

6.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述隐孢子虫多表位融合蛋白、或权利要求4或5所述真核重组载体。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，还包含大蒜素。

8.权利要求1所述的隐孢子虫多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的药物中的应用。

9.权利要求2或3所述的隐孢子虫多表位基因片段在制备预防或治疗隐孢子虫病的药物中的应用。