CN110382518B - 用于血清型a型口蹄疫病毒的嵌合疫苗 - Google Patents

用于血清型a型口蹄疫病毒的嵌合疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN110382518B
CN110382518B CN201780081323.XA CN201780081323A CN110382518B CN 110382518 B CN110382518 B CN 110382518B CN 201780081323 A CN201780081323 A CN 201780081323A CN 110382518 B CN110382518 B CN 110382518B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fmdv
seq
chimeric
polypeptide
foot
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780081323.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110382518A (zh
Inventor
阿依达·E·里德
威廉·M·费希尔
德文德拉·K·雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Los Alamos National Security LLC
US Department of Agriculture USDA
Original Assignee
Los Alamos National Security LLC
US Department of Agriculture USDA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Los Alamos National Security LLC, US Department of Agriculture USDA filed Critical Los Alamos National Security LLC
Publication of CN110382518A publication Critical patent/CN110382518A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110382518B publication Critical patent/CN110382518B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/135—Foot- and mouth-disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

描述了合成的口蹄疫病毒(FMDV)嵌合多肽和编码嵌合多肽的核酸分子。所述嵌合多肽比天然存在的FMDV多肽具有更大的T细胞表位覆盖度，并且包括常见的FMDV表位，但排除了罕见的FMDV表位。当作为FMDV基因组的一部分包括时，所述嵌合多肽允许病毒复制并组装至FMDV颗粒中。嵌合多肽和核酸组合物可用于引发免疫应答，其提供针对广泛范围的血清型A型FMDV毒株的保护。

Description

用于血清型A型口蹄疫病毒的嵌合疫苗
交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求享有于2016年10月31日提交的美国临时系列号：62/415,124的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及合成的口蹄疫病毒(FMDV)多肽和核酸及其用于诱导针对血清型A型FMDV的广泛免疫应答的用途。
致谢政府支持
本发明是在合同号为DE-AC0576RLO1830，由美国能源部提供资金的政府支持下进行的。政府对发明享有一定的权利。
发明背景
FMDV在其目前流行的地区引发具有重大经济影响的家畜疾病。此外，如果将FMDV引入无FMDV区域，他可能会造成巨大的经济损失。目前的“杀死，焚烧和掩埋”爆发控制策略因为经济，人道和战略原因而不能令人满意(Breeze，Biosecur Bioterro 2(4)：254-264,2004)。虽然疫苗接种可以是疫情管理的主要部分，但基于灭活病毒的可获得的疫苗在成本、生产安全性、免疫持续时间和保护范围方面都不能令人满意(Rodriguez和Gay,ExpertRev Vaccines 10(3):377-387,2011；Robinson等人,Transbound Emerg Dis 63(Suppl1):30-41,2016)。FMDV在北美、欧盟、澳大利亚和新西兰之外广泛流行。FMDV在环境中是持久的，并且具有高度传染性。FMDV在美国爆发的直接经济影响估计为数百亿至数千亿美元，快速且广泛的疫苗接种可能会使成本降低一半(Schroeder等人,Journal ofAgricultural and Applied Economics 47:47-76,2015)。
FMDV具有七种主要血清型，四种广泛分布(A、O、C和亚洲-1)，并且三种主要在撒哈拉以南非洲(SAT-1、SAT-2和SAT-3)发现。血清型内部多样性很高，并且即使在相同血清型的分离株之间也几乎没有交叉保护。鉴于这种多样性，每次爆发都需要对许多疫苗株之一进行野外匹配。FMDV疫苗的最新发展已经导致许多领域的改进(Robinson等人，TransboundEmerg Dis 63(Suppl 1)：30-41,2016)，但保护范围仍然有限；大多数疫苗只能保护与疫苗株密切相关的爆发，因此防止所有可能的爆发需要过多的大量库存。
因此，仍然需要改善疫苗诱导的对不同FMDV毒株的保护范围。
发明概述
本文公开了FMDV嵌合多肽，其与天然FMDV多肽相比提供了更高水平的T细胞表位覆盖度，具有最小限度的非天然和稀有表位。本文公开的嵌合多肽和核酸组合物可用于引发免疫应答，所述免疫应答提供针对广泛范围的血清型A型FMDV毒株的保护。
本文提供了合成的FMDV多肽，其具有与嵌合多肽VP4.2.1(SEQ ID NO：2)或嵌合多肽VP4.2.2(SEQ ID NO：4)至少98％相同的氨基酸序列。还提供了包含嵌合多肽的重组FMDV。
还提供了编码嵌合VP4.2.1和VP4.2.2多肽的核酸分子和载体。在一些实施方案中，载体包括剩余FMDV蛋白的编码序列，使得在将载体转染到允许的宿主细胞中时，产生传染性FMDV。
本发明还提供了包含一种或两种嵌合FMDV多肽的组合物，或编码一种或两种嵌合FMDV多肽的核酸分子。在一些实例中，组合物包括重组FMDV，其包含嵌合多肽，或两个重组FMDV，各自具有不同的嵌合FMDV多肽。
本文还提供了在受试者中引发针对FMDV的免疫应答的方法，以及通过向受试者施用本文公开的嵌合FMDV多肽、核酸分子、载体、重组FMDV或组合物使受试者对FMDV免疫的方法。
本发明的实施方案的前述及其他目的、特征和优点将根据以下详述变得更显而易见，所述详述参考附图进行。
通过引用的并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个个别出版物、专利或专利申请被具体并个别指出通过引用并入。
附图简述
本专利申请文件含有至少一个彩图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝在受到要求并支付必要的费用后将由专利局提供。
在所附权利要求中特别阐述了本发明的新颖特征。在以下详细描述和附图中提及了本发明的特征和优点：
图1是嵌合免疫原设计方法的示意图。该图显示了该方法的概念性说明，其中选择天然蛋白序列(通过检查)并通过Fischer等人描述的嵌合算法进行处理(Nat Med 13：100-106,2007)以产生合成的高覆盖度序列。
图2A-2C显示了不同疫苗候选物对潜在FMDV衣壳表位的覆盖度。(图2A)与相同大小的天然序列混合物相比，1-、2-和3-嵌合混合物的覆盖度。(图2B)FMDV血清型A型的衣壳蛋白的系统发育分布，如通过天然毒株A24 Cruzeiro(左)所覆盖的，或如通过本文公开的2-序列嵌合混合物(右)所覆盖的。(图2C)隔离年份对病毒变种的覆盖度。嵌合体比天然毒株A24疫苗更好地覆盖了最近的分离株。蓝线表示十年平均值。
图3显示了传染性核酸嵌合构建体的组织培养繁殖和噬斑形态。病毒噬斑(病毒复制中心)被视为平板中未传染细胞的较暗背景上的亮点。
图4显示了A型嵌合FMDV疫苗的衍生。显示了FMDV基因组组织和A型嵌合FMDV突变体的图表。显示了基本的FMDV基因组组织，其描绘了由病毒开放阅读框(ORF)编码的蛋白的位置和在5'和3'非翻译区(UTR)中编码的元件。使用Rieder等人(J Virol.79:12989-12998,2005)描述的FMDV爆发毒株A24Cruzeiro的全长克隆pA24Cru作为骨架，通过DNA合成产生嵌合突变体病毒。
序列
SEQ ID NO：1是嵌合FMDV-VP4.2.1衣壳的核苷酸序列：
GGGGCCGGCCAATCCAGTCCGGCGACCGGCTCGCAGAACCAATCTGGCAACACTGGCAGCATAATTAACAACTACTACATGCAGCAATACCAGAACTCCATGGACACACAGTTGGGAGACAATGCCATCAGTGGAGGCTCCAACGAGGGCTCCACGGACACAACTTCAACACACACAACCAACACTCAAAACAATGACTGGTTCTCGAAGCTCGCCAGTTCAGCTTTTACCGGTCTGTTCGGTGCACTGCTCGCCGACAAGAAGACAGAGGAAACGACACTTCTTGAGGACCGCATCCTCACCACCCGCAACGGGCACACCACCTCGACGACCCAATCGAGTGTGGGTGTCACATACGGGTACTCCACAGGGGAGGACCACGTTTCTGGGCCCAACACATCGGGCCTGGAGACGCGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAAAAGTTCTTGTTTGACTGGACAACGGACAAGCCATTTGGACACCTGGAAAAGCTGGAGCTCCCGACCGACCACAAGGGTGTCTACGGACACTTGGTGGACTCGTTCGCCTATATGAGAAATGGCTGGGATGTTGAGGTGTCCGCTGTTGGCAACCAGTTCAACGGCGGGTGCCTCCTGGTGGCCATGGTACCTGAATGGAAGAAATTTACAACACGGGAGAAATACCAACTCACCCTTTTCCCGCACCAGTTTATTAACCCCAGAACTAACATGACTGCCCACATCGTGGTCCCCTACCTTGGTGTGAACAGGTATGATCAGTACAAGAAGCATAAGCCCTGGACATTGGTTGTCATGGTCGTGTCGCCACTTACGACCACAAGCATTGGTGCGACACAAATCAAGGTCTACGCCAACATAGCTCCGACCTATGTTCACGTGGCCGGTGAACTCCCCTCGAAAGAGGGGATTGTCCCGGTTGCATGTGCGGACGGTTACGGAGGATTGGTGACGACAGACCCGAAGACAGCTGACCCTGTTTATGGCATGGTGTACAACCCGCCTAGGACTAACTTCCCTGGGCGCTTCACCAACCTGTTGGACGTGGCCGAAGCGTGTCCCACTTTCCTCTGCTTTGACAACGGGAAACCGTACGTCGTCACGCGGACGGATGAACAGCGACTTTTGGCCAAGTTTGACCTTTCCCTTGCCGCAAAACATATGTCCAACACATACCTGTCAGGGATTGCTCAGTACTACGCACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCATGTTCACAGGTTCCACTGATTCAAAGGCCCGATACATGGTGGCCTACGTCCCACCTGGGGTGGAGACACCACCGGACACACCTGAAAGGGCTGCCCACTGCATTCACGCTGAATGGGACACTGGACTAAACTCCAAATTCACTTTCTCAATCCCGTACATGTCCGCCGCGGATTACGCGTACACAGCGTCTGACACGGCAGAAACAACCAACGTACAGGGATGGGTCTGCGTCTACCAAATTACACACGGGAAGGCTGAAAATGACACCTTGGTCGTGTCGGCCAGCGCCGGCAAAGACTTTGAGTTGCGCCTCCCGATTGACCCCCGCGCGCAGACCACCGCTACCGGGGAATCAGCAGACCCGGTCACCACCGCCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAAGTCCAGAGACGTCACCACACGGACGTTAGTTTCATCATGGACAGATTTGTGAAGATCGGAACCACTAACCCAACACATGTCATTGACCTCATGCAGACTCACCAACACGGTCTGGTGGGTGCCTTGCTGCGTGCAGCCACGTACTACTTTTCTGACCTGGAAATTGTTGTACGGCACGAAGGCAATCTGACCTGGGTGCCCAACGGCGCCCCTGAAGCAGCCCTGTCCAACACAGGAAACCCCACTGCCTACAACAAGGCACCATTCACGAGACTCGCTCTCCCCTACACTGCGCCGCACCGTGTGCTGGCAACAGTGTACAACGGGACGAACAAGTACTCCGCGGCCAGTGGGCGCACAAGAGGCGACTTGGGGCAACTCGCGGCGCGAATCGCGGCACAGCTTCCTGCTTCATTTAACTTCGGTGCAATCAAGGCCGACGCCATCCACGAACTTCTCGTGCGCATGAAACGGGCCGAGCTCTACTGCCCCAGACCGCTGTTGGCAATAGAGGTGTCTTCGCAAGACAGGTACAAGCAAAAGATCATTGCACCAGCAAAGCAG
SEQ ID NO：2是嵌合FMDV-VP4.2.1衣壳的氨基酸序列：
GAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFTGLFGALLADKKTEETTLLEDRILTTRNGHTTSTTQSSVGVTYGYSTGEDHVSGPNTSGLETRVVQAERFFKKFLFDWTTDKPFGHLEKLELPTDHKGVYGHLVDSFAYMRNGWDVEVSAVGNQFNGGCLLVAMVPEWKKFTTREKYQLTLFPHQFINPRTNMTAHIVVPYLGVNRYDQYKKHKPWTLVVMVVSPLTTTSIGATQIKVYANIAPTYVHVAGELPSKEGIVPVACADGYGGLVTTDPKTADPVYGMVYNPPRTNFPGRFTNLLDVAEACPTFLCFDNGKPYVVTRTDEQRLLAKFDLSLAAKHMSNTYLSGIAQYYAQYSGTINLHFMFTGSTDSKARYMVAYVPPGVETPPDTPERAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYMSAADYAYTASDTAETTNVQGWVCVYQITHGKAENDTLVVSASAGKDFELRLPIDPRAQTTATGESADPVTTAVENYGGETQVQRRHHTDVSFIMDRFVKIGTTNPTHVIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEIVVRHEGNLTWVPNGAPEAALSNTGNPTAYNKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTNKYSAASGRTRGDLGQLAARIAAQLPASFNFGAIKADAIHELLVRMKRAELYCPRPLLAIEVSSQDRYKQKIIAPAKQ
SEQ ID NO：3是嵌合FMDV-VP4.2.2衣壳的核苷酸序列：
GGGGCCGGCCAATCCAGTCCGGCGACCGGCTCGCAGAACCAATCTGGCAACACTGGCAGCATAATTAACAACTACTACATGCAGCAATACCAGAACTCCATGGACACACAGTTGGGAGACAATGCCATCAGTGGAGGCTCCAACGAGGGCTCCACGGACACAACTTCAACACACACAACCAACACTCAAAACAATGACTGGTTCTCGAAGCTCGCCAGTTCAGCTTTTACCGGTCTGTTCGGTGCACTGCTCGCCGACAAGAAGACAGAGGAAATCACACTTCTTGAGGACCGCATCCTCACCACCCGCAACGGGCACACCATCTCGACGACCCAATCGAGTGTGGGTGTCACATACGGGTACTCCACAGAGGAGGACCACGTTGCTGGGCCCAACACATCGGGCCTGGAGACGCGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAAAAGCACTTGTTTGACTGGACAACGGACAAGGCATTTGGACACCTGGAAAAGCTGGAGCTCCCGACCGAACACAAGGGTGTCTACGGACACTTGGTGGACTCGTACGCCTATATGAGAAATGGCTGGGATGTTGAGGTGACCGCTGTTGGCAACCAGTTCAACGGCGGGTGCCTCCTGGTGGCCATGGTACCTGAATGGAAGGAATTTACCCCACGGGAGAAATACCAACTCACCCTTTTCCCGCACCAGTTTATTAGCCCCAGAACTAACATGACTGCCCACATCACGGTCCCCTACCTTGGTGTGAACAGGTATGATCAGTACAAGCAGCATAAGCCCTGGACATTGGTTGTCATGGTCGTGTCGCCACTTACGACCAGCAGCATTGGTGCGTCACAAATCAAGGTCTACGCCAACATAGCTCCGACCCATGTTCACGTGGCCGGTGAACTCCCCTCGAAAGAGGGGATTGTCCCGGTTGCATGTTCGGACGGTTACGGAGGATTGGTGACGACAGACCCGAAGACAGCTGACCCTGCTTATGGCAAGGTGTACAACCCGCCTAGGACTAACTACCCTGGGCGCTTCACCAACCTGTTGGACGTGGCCGAAGCGTGTCCCACTTTCCTCTGCTTTGACGACGGGAAACCGTACGTCGTCACGCGGACGGATGACCAGCGACTTTTGGCCAAGTTTGACGTTTCCCTTGCCGCAAAACATATGTCCAACACATACCTGGCAGGGCTTGCTCAGTACTACACACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCATGTTCACAGGTTCCACTGAGTCAAAGGCCCGATACATGGTGGCCTACATCCCACCTGGGGTGGAGACACCACCGGACACACCTGAAAAGGCTGCCCACTGCATTCACGCTGAATGGGACACTGGACTAAACTCCAAATTCACTTTCTCAATCCCGTACGTATCCGCCGCGGATTACGCGTACACAGCGTCTGACGTGGCAGAAACAACCAACGTACAGGGATGGGTCTGCATCTACCAAATTACACACGGGAAGGCTGAACAAGACACCTTGGTCGTGTCGGTTAGCGCCGGCAAAGACTTTGAGTTGCGCCTCCCGATTGACCCCCGCACGCAGACCACCACTGCCGGGGAATCAGCAGACCCGGTCACCACCACCGTGGAGAACTACGGCGGTGAGACACAAGCCCAGAGACGTCACCACACGGACGTTGGTTTCATCATGGACAGATTTGTGAAGATCGGAAACACGAGCCCAACACATGTCATTGACCTCATGCAGACTCACCAACACGCTCTGGTGGGTGCCTTGCTGCGTGCAGCCACGTACTACTTTTCTGACCTGGAAATTGTTGTACGGCACGACGGCAATCTGACCTGGGTGCCCAACGGCGCCCCTGTAGAAGCTCTGGCGAACACCAGCAACCCCACTGCCTACCACAAGCAACCATTCACGAGACTCGCTCTCCCCTACACTGCGCCGCACCGTGTGCTGGCAACAGTGTACAACGGGACGAGTAAGTACTCCGCGCCTGCTACAAGAAGAGGCGACTTGGGGTCTCTCGCGGCGCGAGTCGCGGCACAGCTTCCTTCTTCATTTAACTTCGGTGCAATCAGGGCCACCACCATCCACGAACTTCTCGTGCGCATGAGACGGGCCGAGCTCTACTGCCCCAGACCGCTGTTGGCAGTAGAGGTGTCTTCGCAAGACAGGCACAAGCAAAAGATCATTGCACCAGCAAGGCAG
SEQ ID NO：4是嵌合FMDV-VP4.2.2衣壳的氨基酸序列：
GAGQSSPATGSQNQSGNTGSIINNYYMQQYQNSMDTQLGDNAISGGSNEGSTDTTSTHTTNTQNNDWFSKLASSAFTGLFGALLADKKTEEITLLEDRILTTRNGHTISTTQSSVGVTYGYSTEEDHVAGPNTSGLETRVVQAERFFKKHLFDWTTDKAFGHLEKLELPTEHKGVYGHLVDSYAYMRNGWDVEVTAVGNQFNGGCLLVAMVPEWKEFTPREKYQLTLFPHQFISPRTNMTAHITVPYLGVNRYDQYKQHKPWTLVVMVVSPLTTSSIGASQIKVYANIAPTHVHVAGELPSKEGIVPVACSDGYGGLVTTDPKTADPAYGKVYNPPRTNYPGRFTNLLDVAEACPTFLCFDDGKPYVVTRTDDQRLLAKFDVSLAAKHMSNTYLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGSTESKARYMVAYIPPGVETPPDTPEKAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYVSAADYAYTASDVAETTNVQGWVCIYQITHGKAEQDTLVVSVSAGKDFELRLPIDPRTQTTTAGESADPVTTTVENYGGETQAQRRHHTDVGFIMDRFVKIGNTSPTHVIDLMQTHQHALVGALLRAATYYFSDLEIVVRHDGNLTWVPNGAPVEALANTSNPTAYHKQPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARVAAQLPSSFNFGAIRATTIHELLVRMRRAELYCPRPLLAVEVSSQDRHKQKIIAPARQ
SEQ ID NO：5是SanDI正向引物的核苷酸序列：
AGCGGAGCATGACGGCCGTGGGACCC
SEQ ID NO：6是VP4反向引物的核苷酸序列：
TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG
SEQ ID NO：7是VP4正向引物的核苷酸序列：
TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG
SEQ ID NO：8是NheI反向引物的核苷酸序列：
TCAACGTCTCCGGCTAGCTTAAGCAGGTCAAAATTC
发明详述
本文显示和描述了本发明的优选实施方案。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。本领域技术人员将想到众多变化、改变和取代，而不背离本发明。本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。旨在下述权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等价物的范围内的方法和结构。
缩写
BEI 二乙烯亚胺
FMDV 口蹄疫病毒
IC 传染性cDNA克隆
ORF 开放阅读框架
PFU 菌斑形成单元
UTR 非翻译区
VP 病毒蛋白
WT 野生型。
术语和方法
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,publishedby Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
为了便于审查本发明的各个实施方案，提供了下列具体术语的解释：
佐剂：非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可包括吸附抗原的矿物质(明矾，氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳液，其中抗原溶液在矿物油(例如，弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包含灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。
施用：通过任何有效途径提供或给予受试者药剂，例如治疗剂(例如重组病毒)。示例性施用途径包括但不限于注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、导管内、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。
抗体：由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。通过特异性抗原(免疫原)在人或其他动物中诱发抗体。抗体的特征在于以一些可证明的方式与抗原特异性反应，抗体和抗原以彼此相互定义。“引发抗体应答”是指抗原或其他分子诱导抗体产生的能力。
简并变体：在本发明的上下文中，“简并变体”是指编码肽的多核苷酸，所述肽包括由于遗传密码而简并的序列。存在20种天然氨基酸，其中大多数通过超过一种密码子指定。因此，包括了编码肽的所有简并核苷酸序列，只要由核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列不变即可。
异源性：异源蛋白或多肽是指衍生自不同来源或物种的蛋白或多肽。
免疫应答：免疫系统细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物如抗原或疫苗的反应。免疫应答可包括涉及宿主防御应答的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本文所用，保护性免疫应答是指保护受试者免于传染的免疫应答(预防传染或预防与传染相关的疾病的发展)。测量免疫应答的方法是本领域熟知的，并且包括例如测量淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。
免疫原：在适当条件下能够刺激免疫应答的化合物、组合物或物质，例如在动物中产生抗体或T细胞应答，包括注射或吸收到动物体内的组合物。
免疫：保护受试者免受传染病，例如通过疫苗接种。
分离的："分离的"生物组分(例如核酸分子、蛋白、病毒或细胞)已经与所述组分在其中天然存在的生物体的细胞活组织中的其他生物组分(例如，其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞)基本上分开或纯化。已经“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸和蛋白。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与所述编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白编码区。
药学上可接受的载体：可用于本发明的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences，EWMartin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适用于一种或多种治疗化合物、分子或药剂(例如本文公开的嵌合多肽或重组病毒)的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质取决于所采用的具体的施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
多肽、肽或蛋白：一种聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”包括指掺入蛋白、多肽或肽中的氨基酸。
在多肽中的保守取代是将蛋白序列中的一个氨基酸残基取代为具有相似生化性能的不同的氨基酸残基。通常，保守取代对所得多肽的活性几乎没有影响。例如，包含一个或多个保守取代(例如不超过1、2、3、4或5个取代)的蛋白或肽保留了野生型蛋白或肽的结构和功能。通过使用例如标准方法如定点诱变或PCR操纵编码多肽的核苷酸序列，可以产生含有一个或多个保守取代的多肽。在一个实例中，可以通过测试抗体交叉反应性或其诱导免疫应答的能力来容易地选择此类变体。保守取代的实例如下所示。
Figure GDA0003836347330000101
保守取代通常保持(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如，如折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)大部分侧链。
通常预期产生蛋白性质的最大变化的取代将是非保守的，例如其中(a)亲水性残基(例如，丝氨酰或苏氨酰)被取代为(或通过)疏水性残基(例如，亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)的变化；(b)半胱氨酸或脯氨酸被取代为(或通过)任何其他残基；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)被取代为(或通过)电负性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)；或(d)具有庞大侧链的残基(例如苯丙氨酸)被取代为(或通过)不具有侧链的残基(例如甘氨酸)的变化。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在其开始发展后改善疾病或病理状况的体征或症状的治疗性干预。“改善”是指疾病体征或症状的数量或严重程度的降低。
纯化：术语“纯化”不需要绝对纯度；相反，他是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的多肽、蛋白、核酸病毒或其他活性化合物是全部或部分地从天然相关蛋白和其他污染物中分离的化合物。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指这样的多肽、蛋白、核酸、病毒或其他活性化合物，其已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离并进行分级以除去最初制剂中的各种组分，如蛋白、细胞碎片和其他组分。
重组：重组核酸分子、蛋白或病毒是具有非天然存在的序列或者具有通过人工组合两个另外分开的序列区段制备的序列。该人工组合可以通过化学合成或通过人工操作分离的核酸分子区段(例如通过基因工程技术)实现。术语“重组”还包括仅通过添加、取代或缺失天然核酸分子、蛋白或病毒的部分而改变的核酸、蛋白和病毒。
序列同一性：两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以用同一性百分比来测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以根据相似性百分比来测量(其考虑了保守氨基酸取代)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高程度的序列同一性/相似性。当直系同源蛋白或cDNA衍生自更密切相关的物种(例如人和小鼠序列)时，与更远距离相关的物种(例如人和秀丽隐杆线虫(C.elegans)序列)相比，该同源性更为显着。
用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson等人,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994.Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990，其提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可从若干来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI)和互联网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一同使用。另外的信息可在NCBI网站上找到。
血清型：一组密切相关的微生物(如病毒)，以抗原特征组进行区分。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物，一种包括人类和非人类哺乳动物的分类。在本文的一些实施方案中，受试者是偶蹄动物，例如但不限于牛、猪、绵羊、山羊、鹿、羚羊、水牛或野牛。
合成：在实验室中通过人工方法产生，例如合成核酸或蛋白可以在实验室中化学合成。
疫苗：一种能够刺激免疫应答的免疫原性材料的制剂，施用以用于预防、改善或治疗疾病，如传染病。免疫原性材料可包括，例如，减毒或灭活的微生物(如减毒病毒)或抗原蛋白、肽或源自传染性微生物的DNA。疫苗可以引发预防性(预防性)和治疗性应答。施用方法根据疫苗而不同，但可以包括接种、摄取、吸入或其他形式的施用。接种可以通过许多途径中的任何途径递送，包括肠胃外，例如静脉内、皮下或肌肉内。疫苗可以与佐剂一起施用以引发免疫应答。
载体：载体是核酸分子，其允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一种或多种选择性标记物基因和其他遗传元件。表达载体是含有必需的调节序列以允许插入的基因的转录和翻译的载体。
除非另有说明，所有在本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的相同含义。单数术语"一种"、"一个"和"所述"包括复数对象，除非上下文清楚地另外指示。“包含A或B”意指包括A或B，或A和B。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值是近似值，并提供用于描述。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但在下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，将以包括术语解释在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅为说明性的，并且不意图为限制性的。
引言
多样性是病毒疫苗开发的主要问题(Gaschen等人，Science 296(5577)：2354-2360,2002)。开发用于免疫原设计的“嵌合”概念以改善对HIV-1疫苗的应答的范围(Fischer等人，Nat Med 13：100-106,2007)。该方法包括产生合成病毒蛋白序列的优化混合物，例如用于共同施用，以便在疫苗中呈现通过群体频率加权的最大数量的潜在表位(图1)。通过该方法设计的HIV-1疫苗在动物研究中显示出相当大的前景(Kong等人，J Virol83(5)：2201-2215,2009；Barouch等人，Nat Med 16(3)：319-323，2010；Santra等人，Virology 428(2)：121-127,2012)，包括对毒性猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)攻击的保护(Barouch等人，Cell 155(3)：531-539,2013)。几项人类I期试验正在进行中，以评估嵌合HIV-1疫苗。嵌合疫苗也显示出对其他病毒的前景，包括丙型肝炎病毒(HCV)(Yusim等人，JGen Virol 91：1194-1206,2010；Yusim等人，Clin Vaccine Immunol 20(2)：302-305,2013)，丝状病毒(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)(Fenimore等人，PLoS ONE 7(10)：e44769,2012)和流感病毒(Kamlangdee等人，JVirol 88(22)：13300)-13309,2014)。通过该方法设计的免疫原针对线性表位覆盖进行了优化，但在许多情况下保留了构象表位。
与天然FMDV多肽和共有FMDV序列相比，本文公开的FMDV嵌合多肽和核酸组合物提供更高水平的T细胞表位覆盖度，同时使非天然和稀有表位的出现最小化。
几个实施方案的概述
本文公开了合成的FMDV嵌合多肽，其具有比天然存在的FMDV多肽更大的T细胞表位覆盖度。合成的FMDV嵌合多肽包含天然病毒变异性并包括常见的FMDV表位，但排除了稀有的FMDV表位。当作为FMDV基因组的一部分包括时，嵌合多肽允许病毒复制和病毒组装成与天然FMDV颗粒高度相似或相同的结构。本文公开的嵌合多肽和核酸组合物可用于引发免疫应答，其提供针对广泛范围的血清型A型FMDV毒株的保护。
本文提供具有与嵌合多肽VP4.2.1(SEQ ID NO：2)或嵌合多肽VP4.2.2(SEQ IDNO：4)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的合成FMDV多肽。在一些实施方案中，合成的FMDV多肽包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在具体实例中，合成FMDV多肽由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成。
本文还提供了包含嵌合多肽的重组FMDV。在一些实施方案中，重组FMDV包括具有与嵌合多肽VP4.2.1(SEQ ID NO：2)或嵌合多肽VP4.2.2(SEQ ID NO：4)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的合成FMDV多肽。在一些实施方案中，重组FMDV包括合成多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的氨基酸序列。在具体实例中，重组FMDV包括由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的合成FMDV多肽。在一些实施方案中，重组FMDV包括来自野生型FMDV毒株的FMDVL、VP4、P2和P3蛋白。在具体的非限制性实例中，野生型FMDV毒株是A24 Cruzeiro。
本文进一步提供了编码嵌合FMDV多肽的核酸分子。在一些实施方案中，核酸编码具有与嵌合多肽VP4.2.1(SEQ ID NO：2)或嵌合多肽VP4.2.2(SEQ ID NO：4)至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的合成FMDV多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的合成FMDV多肽。在具体实例中，核酸分子编码由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的合成FMDV多肽。在一些实施方案中，核酸分子具有与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。在一些实例中，核酸分子具有包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在特定的非限制性实例中，核酸分子具有由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3组成的核苷酸序列。
本发明还提供了包含编码嵌合FMDV多肽的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体还包括FMDV L、VP4、P2和P3蛋白的编码序列，随后将载体转染到允许的宿主细胞中，产生传染性FMDV。在一些实例中，FMDV L、VP4、P2和P3蛋白具有野生型FMDV的氨基酸序列。在具体的非限制性实例中，野生型FMDV是A24 Cruzeiro。
本文还提供了包含至少一种嵌合FMDV多肽，至少一种重组FMDV或至少一种嵌合FMDV多肽编码核酸或至少一种本文公开的载体的组合物。
在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与嵌合多肽VP4.2.1(SEQ ID NO：2)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的嵌合FMDV多肽，其包含SEQ ID NO：2，或由SEQ ID NO组成，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含与嵌合多肽VP4.2.2(SEQID NO：4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的嵌合FMDV多肽，其包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成，和药学上可接受的载体。在一些实例中，所述组合物包含嵌合FMDV多肽，其包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成(或与SEQ ID NO：2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)；嵌合FMDV多肽，其包含SEQ ID NO：4或由SEQID NO：4组成(或与SEQ ID NO：4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)；和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供了包含重组FMDV的组合物，所述重组FMDV包含具有氨基酸序列的嵌合FMDV多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成(或与SEQID NO：2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，提供了包含重组FMDV的组合物，所述重组FMDV包含具有氨基酸序列的嵌合FMDV多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成(或与SEQ ID NO：4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)，和药学上可接受的载体。在一些实例中，所述组合物包含第一重组FMDV和第二重组FMDV，所述第一重组FMDV包含具有SEQ ID NO：2(或与SEQ IDNO：2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的氨基酸序列的合成多肽，所述第二重组FMDV包含具有SEQ ID NO：4(或与SEQ IDNO：4至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的氨基酸序列的合成多肽，和药学上可接受的载体。
本文进一步提供了包含载体的组合物，所述载体包含本文公开的编码嵌合FMDV多肽的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物包含载体，所述载体包含具有SEQ ID NO：1(或与SEQ ID NO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的序列的核酸分子，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含载体，所述载体包含具有SEQ ID NO：3(或与SEQ ID NO：3至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的序列的核酸分子，和药学上可接受的载体。在一些实例中，所述组合物包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含具有SEQ ID NO：1(或与SEQ ID NO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的序列的核酸分子；所述第二载体包含具有SEQID NO：3(或与SEQ ID NO：3至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同)的序列的核酸分子；和药学上可接受的载体。
在本文的一些实施方案中，组合物还包含佐剂。
本文进一步提供了在受试者中引发针对血清型A型FMDV的免疫应答的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用合成的FMDV嵌合多肽、重组FMDV、核酸分子、载体或本文公开的组合物。在一些实例中，受试者是牛。
本文还提供了针对血清型A型FMDV免疫受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用合成的FMDV嵌合多肽、重组FMDV、核酸分子、载体或本文公开的组合物。在施用重组FMDV的一些实例中，在施用之前使重组FMDV失活(例如使用BEI)。
在本文提供的方法的一些实施方案中，受试者是偶蹄动物。在一些实例中，偶足动物是牛、猪、绵羊、山羊、鹿、羚羊、水牛或野牛。
嵌合FMDV疫苗组合物的施用
可以使用任何合适的递送方式将本文所述的FMDV嵌合多肽和多核苷酸组合物施用于受试者。例如，FMDV多核苷酸或多肽可以通过注射、皮下、肌肉内、透皮或经皮胃肠外施用。某些佐剂，例如LTK63、LTR72或PLG制剂，可以鼻内或口服施用。适用于其他施用方式的其他制剂包括栓剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可以由含有0.5％至10％，例如1％-2％的活性成分的混合物形成。其他口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并且含有10％-95％的活性成分，例如25％-70％。
本文公开的FMDV嵌合疫苗通常制备为注射剂，可以是液体溶液或悬浮液。还可以制备适合于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。这些制剂也可以乳化或包封在脂质体中。在一些情况下，疫苗还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖、官能化琼脂糖、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸。例如聚谷氨酸、聚赖氨酸等。
本文公开的FMDV嵌合疫苗可以配制成中性或盐形式的免疫原性化合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，和与无机酸(例如例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸)等形成的那些。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因)等。
疫苗组合物还可以单独或组合地含有液体或赋形剂，例如水、盐水、甘油、右旋糖、乙醇等，以及例如润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂的物质。脂质体也可用作本文公开的组合物的载体。
各种共刺激分子可包含在疫苗制备或递送方案中。这些分子可以改善对淋巴细胞的免疫原呈递，并且包括蛋白例如B7-1或B7-2，和细胞因子例如GM-CSF，IL-2，IL-12。任选地，佐剂也可包含在组合物中。可以使用各种佐剂，包括(1)铝盐(明矾)、如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝；(2)水包油乳液制剂(具有或不具有其他特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰肽或细菌细胞壁组分)；(3)皂苷佐剂，或由其产生的颗粒，例如ISCOM(免疫刺激复合物)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7或IL-12)，干扰素(例如γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或肿瘤坏死因子(TNF)；(6)细菌ADP-核糖基化毒素例如霍乱毒素(CT)百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)的脱毒突变体；(7)其他作为免疫刺激剂的物质，以提高组合物的功效；和(8)具有吸附大分子的微粒。
本文公开的FMDV嵌合疫苗组合物可以以与剂量制剂相容的方式施用，并且其量可以是预防和/或治疗有效的。施用量取决于要治疗的受试者，受试者免疫系统的能力以及所需的保护程度。需要施用的精确量的活性成分可取决于从业者的判断，并且可以对于每个受试者都是特定的。
疫苗制剂可以以单剂量计划或多剂量计划引入。多剂量计划是这样一种计划，其中接种疫苗的主要过程可以是1-10个单独的剂量，然后是在维持和/或加强免疫应答所需的随后时间间隔给予的其他剂量，例如1-4个月的第二剂量，并且如果需要，在几个月后的后续剂量。
施用过程可以包括多核苷酸和多肽，一起或依次(例如，使用多核苷酸组合物引发和用多肽组合物加强)。剂量方案还将至少部分地由个体的需要决定，并且取决于从业者的判断。
可以配制包含编码FMDV嵌合蛋白的可表达多核苷酸的核酸分子和载体，并将其用作DNA疫苗制剂。使用标准基因递送方案，这种FMDV嵌合DNA疫苗可用于活化FMDV特异性T细胞。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见，例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其通过引用整体并入本文)。基因可以直接递送至脊椎动物受试者，或者可选地，先体外后体内地递送至源自受试者的细胞并将细胞再植入受试者中。例如，构建体可以作为质粒DNA或病毒载体DNA递送。
DNA疫苗可以通过许多不同的方法引入，包括使用标准皮下注射针注射在盐水中的DNA。盐水中的注射通常在骨骼肌内肌内或皮内进行，其中DNA被递送至细胞外空间。这可以通过电穿孔，通过使用肌肉毒素如布比卡因暂时损伤肌肉纤维或通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液来辅助。对这种递送方法的免疫应答可受许多因素的影响，包括针型、针调准(needle alignment)、注射速度、注射体积、肌肉类型、以及注射个体的年龄、性别和生理状况。
使用压缩氦作为促进剂，基因枪递送弹道加速已经吸附到金或钨微粒上的质粒DNA(pDNA)进入至靶细胞。替代的递送方法包括裸DNA气溶胶滴注至粘膜表面(例如鼻粘膜和肺粘膜)上，以及向眼部和阴道粘膜局部施用pDNA。粘膜表面递送还通过使用阳离子脂质体-DNA制剂、可生物降解的微球、用于经口施用至肠粘膜的减毒志贺氏菌或李斯特菌载体，以及重组病毒载体如腺病毒载体实现。
递送方法确定了提高有效免疫应答所需的DNA剂量。盐水注射需要不同量的DNA，从10μg-1mg，而基因枪输送需要比肌内注射盐水少100至1000倍的DNA，以引起有效的免疫应答。通常，需要0.2μg至20μg，尽管已经使用了低至16ng的量。盐水注射需要更多的DNA，因为DNA被传递到目标组织(通常是肌肉组织)的细胞外空间，在被细胞摄入之前必须克服例如基底层和大量结缔组织的物理屏障，而基因枪递送将DNA直接轰击到细胞中。
FMDV嵌合核酸疫苗可在递送至细胞之前包装在脂质体中。通常使用脂质体完成脂质包封，所述脂质体能够稳定地结合或捕获并保留核酸。缩合DNA与脂质制剂的比例可以变化，但通常为约1：1(mg DNA：微摩尔脂质)，或更多脂质。
与所公开的FMDV疫苗一起使用的脂质体制剂包括阳离子(带正电)、阴离子(带负电)和中性制剂。
FMDV嵌合核酸疫苗也可以包封、吸附到颗粒载体上或与颗粒载体结合。此类载体将选定分子的多个拷贝呈递给免疫系统并促进分子在局部淋巴结中的捕获和保留。颗粒可被巨噬细胞吞噬，并且可通过细胞因子释放增强抗原呈递。颗粒载体的实例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的微粒，被称为PLG(参见，例如Jeffery等人，Pharm Res 10：362-368,1993)。
评估FMDV嵌合疫苗的功效
特定嵌合蛋白或疫苗组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测定中的任何一种来确定，例如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定，或通过测定致敏受试者中对抗原特异的T淋巴细胞。此类测定是本领域熟知的(Erickson等人，J Immunol 151：4189-4199,1993；Doe等人，Eur J Immunol 24：2369-2376,1994)。因此，免疫应答可以是刺激产生CTL和/或产生或活化辅助T细胞的应答。目标抗原还可以引发抗体介导的免疫应答，其对于诱导保护性免疫是重要的。这些测定详细描述于OIE手册(Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals，2004(第5版))，Office International des Epizooties，Paris(2004)和文献(例如Tekleghiorghis等人，Clin Vaccine Immunol 21(5):674-683,2014)中。因此，免疫应答可包括以下一种或多种作用：通过B细胞产生抗体和/或抑制性T细胞的活化。
可以使用用于估计或实际测量通过本文公开的FMDV嵌合疫苗制剂产生的保护性免疫应答的各种手段，包括但不限于，设计用于确定由特定嵌合蛋白提供的T细胞表位覆盖程度的计算机分析方法或他们的组合，以及在动物例如牛中评估FMDV嵌合疫苗制剂的体内方法。
如本领域所熟知的，FMDV活化的T细胞上的T细胞受体识别的表位可以通过例如51Cr释放测定或通过淋巴细胞增殖测定进行鉴定。在51Cr释放测定中，制备展示目标表位的靶细胞，例如通过将编码表位的多核苷酸克隆到表达载体中并将表达载体转化到靶细胞中。将靶细胞与51Cr一起温育用于标记，然后与受试者衍生的T细胞混合，之后通过将51Cr-结合的蛋白释放到培养基中来测量T细胞的溶细胞活性。
提供了下列实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应当理解为将本发明限制于所述具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：疫苗免疫原的设计和构建
针对不同组的血清型A型FMDV天然序列数据集构建1、2和3序列的嵌合混合物。从国家生物技术信息中心(NCBI)维护的GENBANKTM数据库获取FMDV衣壳序列，通过标准方法将彼此进行比对(Edgar，BMC Bioinformatics 5：113,2004；Katoh等人，，Nucleic Acids Res33(2):511-518,2005；Larsson,Bioinformatics 30(22):3276-3278,2014)并用作嵌合设计网络工具的输入(Thurmond等人，Bioinformatics 24(14)：1639-1640,2008)，其基于Fischer等人(Nat Med 13：100-106,2007)。检查所得氨基酸序列，并检查覆盖范围。通过对FMDV A24 Cruzeiro毒株序列应用碱基变化来衍生编码嵌合核酸的序列，使得由新序列编码的氨基酸与嵌合序列匹配。
覆盖度比较显示1和2序列混合物之间显着增加，2和3序列混合物之间的增加减少。因此，使用2序列混合进行进一步的研究。使用嵌合蛋白在表位覆盖度方面的优点是惊人的。从疫苗学的角度来看，混合物远远优于天然序列或天然序列混合物(图2A)。此外，他们具有广泛的系统发育多样性覆盖度(图2B)，并且具有对最近的FMDV分离株的优异覆盖度(图2C)。如实施例2中所述，商业合成嵌合疫苗的核苷酸序列，并克隆到基于A24 Cruzeiro骨架的cDNA构建体中(图4)。嵌合序列被用于VP2、VP3以及VP1基因，具有从A 24骨架衍生的基因组(5'UTR、前导序列、VP4和非结构蛋白)的其余部分。将这些cDNA构建体在牛组织培养物中传代数次，直至回收传染性病毒(图3)。
实施例2：嵌合病毒的克隆和增殖
使用爆发毒株A24 Cruzeiro(pA24Cru，Rieder等人，J Virol 79(2)：12989-12998,2005)的全长传染性cDNA克隆(IC)作为模板。A24 Cruzeiro的衣壳编码区被相应的嵌合衣壳序列取代。嵌合P1-2A序列由Bio Basic Canada Inc.合成。使用两个连续的PCR反应产生包含来自野生型FMDV A 24Cruzeiro的VP4和2A以及来自嵌合设计的VP2-VP3-VP1的嵌合病毒。在第一次PCR中，使用SanDI正向引物AGCGGAGCATGACGGCCGTGGGACCC(SEQ ID NO：5)和VP4反向引物TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG(SEQ ID NO：6)扩增来自野生型FMDVA24Cruzeiro的5'UTR-VP4片段并且使用VP4正向引物TGTTCGGTGCACTGCTCGCCG(SEQ ID NO：7)和NheI反向引物TCAACGTCTCCGGCTAGCTTAAGCAGGTCAAAATTC(SEQ ID NO：8)产生嵌合2.1和2.2构建体的嵌合VP2-VP3-VP1-2A PCR片段。然后通过末端重叠PCR反应连接这两个片段。使用分别存在于5'UTR和2A编码区中的SanDI和NheI限制性位点，将扩增子凝胶提取并克隆到野生型(WT)传染性cDNA克隆DNA质粒(pA24 WT)中(图4)。通过测序验证嵌合病毒VP4.2.1(SEQ ID NO：1)和VP4.2.2(SEQ ID NO：3)的序列。
通过SwaI酶消化使嵌合病毒cDNA克隆线性化，并按照制造商的说明，通过MEGASCRIPT TM试剂盒(Ambion)产生代表病毒正义基因组的RNA转录物。根据制造商的说明，使用RNEASY TM试剂盒除去RNA转录反应中的污染物将病毒RNA纯化。将大约10μgRNA用于新鲜生长的(对数期)BHK-21细胞的电穿孔。在过夜温育后将样品冷冻，并且使用1/10的接种物继续病毒传代以用于下一次传代。在记录细胞病变效应后，大批量产生每种嵌合病毒，并如前所述进行噬斑测定(Rieder等人，J Virol 67(9)：5139-5145,1993)用于生长表征和这些病毒与野生型FMDV A24 Cruzeiro的比较。简言之，将病毒的连续稀释物吸附在BHK-21细胞单层上，然后加入0.6％的黄蓍胶覆盖层并在37℃下温育48小时。固定平板，用结晶紫(Histochoice中0.3％；Amresco，Solon，Ohio)染色，并计数噬斑。滴度被表示为每毫升噬菌斑形成单位(PFU/ml)并一式两份进行(图3)。
实施例3：病毒中和滴度和r1值
两种嵌合病毒(VP4.2.1和VP4.2.2)通过计算他们被来自接种疫苗或FMDV康复动物的牛血清中和的能力来测试抗原覆盖度。如前所述(Rweyemamu等人，J Hyg(Lond)81(1):107-123,1978)，中和滴度报告为最后血清稀释度的倒数，所述血清稀释度在50％的孔中中和100组织培养传染剂量的同源FMDV(TCID)50。嵌合病毒相对于A24 FMDV野生型亲本病毒的单向抗原关系(r1值)计算为异源和同源血清滴度之间的比率，并如Samuel等人(Vaccine 8(4):390-396,1990)所述进行解释。还使用来自用VP4.2.1和VP4.2.2嵌合疫苗疫苗接种的动物的血清对多种异源A型FMDV进行病毒中和，并计算r1值以推断疫苗与靶病毒之间的抗原关系。
实施例4：抗原产生和疫苗制剂
用A24野生型和嵌合VP4.2.1和VP4.2.1病毒传染BHK-21单层细胞。在观察到完全的细胞病变效应后，通过冻融从细胞中释放病毒。在4℃以8000g在Sorvall离心机TM中进行短暂离心以将细胞碎片的疫苗抗原分离。含有疫苗抗原的上清液用5mM BEI，pH＝8.0±0.2在25℃下灭活24小时。然后将灭活的抗原浓缩并用8％聚乙二醇8000部分纯化。根据制造商的说明书，用Montanide ISA 201VG(Seppic，Paris，France)将疫苗制备为水包油包水(WOW)乳液。简而言之，将油佐剂在30℃下在含水抗原相(50:50)中混合15分钟，并在4℃下储存24小时，然后再进行另一个短暂的混合循环10分钟。通过15％至45％蔗糖密度梯度分级测定140S颗粒(Grubman等人，J.Virol.,(1985)56:120-26)的完整性和实验疫苗中存在的抗原浓度(15μg/剂量的化学灭活抗原)并且记录在259nM的级分吸光度和醋酸铀酰染色的140S制剂的透射电子显微镜(TEM)。
实施例5：动物攻击
在牛中测试FMDV嵌合病毒VP4.2.1和VP4.2.2提供针对野生型病毒攻击的保护的能力。在该研究中，在三个治疗组中使用了21头牛来评估疫苗的效力。该研究包括用于三种不同血清型A型FMDV攻击病毒的每一种的成对安慰剂/疫苗动物：A24 Cruzeiro(1995)、野生型分离株A(Saudi Arabia 95；A/Sau/16/95；GenBank登录号EU553874)和野生型分离株B(Iran-05；A/IRN/1/2005；GenBank登录号EF208769)。给动物施用FMDV嵌合疫苗(衍生自VP4.2.1和VP4.2.2嵌合病毒的BEI灭活蛋白，分别通过肌内途径在右颈和左颈给予10μg/2mL剂量)或安慰剂；21天后，用A24 Cruzeiro攻击一组动物，另外两组动物接受第二次免疫(“加强”)。加强后14天，将剩余的动物用FMDV ASaudi Arabia 95或FMDV A Iran-05攻击。所有攻击都是用1×104牛舌传染剂量50(BTID50)的攻击病毒进行的舌皮内施用。
攻击材料(FMDV血清型A型24Cruzeiro；FMDV A Saudi Arabia 95；FMDV A Iran-05)。将病毒原液在DMEM/1x抗生素中稀释至终浓度为1×104BID50/0.4ml。在免疫接种后14天或加强后，每只动物通过在四个部位(0.4ml总/动物)的每一个中接种0.1ml接受舌皮内(IDL)接种的攻击病毒。疫苗接种、加强和攻击计划如表1所示。
表1设计概述
Figure GDA0003836347330000241
在第0天，收集来自每只动物的基线血清样品。如表1所示，所有牛都接种了他们各自的疫苗。在攻击后3天、7天、10天和14天(dpc)，对所有牛服用镇静剂并检查FMD全面疾病(蹄病变)的临床症状。根据标准临床评分系统进行蹄病变的临床评分(阴性＝未观察到蹄水泡病变；阳性＝观察到一个或多个蹄水泡病变；病变阳性足的数量和是否存在舌病变的也被记录)。FMDV攻击后的发热被定义为攻击后(1-10天攻击后)任何时间的直肠温度≥103.5°F。对于每个治疗组，根据以下公式计算针对发热的保护：(发热阴性的数量)/(受攻击的牛的数量)×100％。
抗体滴度：
通过在第0、7、14、22、29、36、43和50天收集的血清样品上的病毒中和来测定FMDV血清型A型24Cruzeiro，A Saudi Arabia 95和A Iran-05的抗体滴度。通过使用100-150TCID50的FMDV血清型A24 Cruzeiro、A Saudi Arabia 95或A Iran-05在BHK-21细胞培养物中的恒定病毒减少血清中和测定来确定FMDV血清病毒中和(SVN)抗体滴度。通过使用基于细胞病变效应(CPE)的
Figure GDA0003836347330000251
方法计算SVN滴度。测定的检测下限为0.6log10。
对于每个治疗组，对收集的血清每天确定FMDV血清型A24 Cruzeiro、A SaudiArabia 95和A Iran-05的单独的SVN滴度和治疗组平均SVN滴度(几何平均滴度[GMT])±标准偏差(SD)。在疫苗接种之前，所有牛都是FMDV SVN阴性，并且在攻击前所有对照都是FMDVSVN阴性。
FMDV ELISA
根据制造商的说明，使用
Figure GDA0003836347330000252
FMDV NS ELISA(ThermoFisher)检测针对FMDV 3ABC非结构蛋白的抗体。如果抑制百分比≥50％，则认为样品为阳性。
病毒分离
测试了在0-5dpc收集的所有牛的血浆样品。未稀释的样品(20微升)添加到含有LFBKαvβ6细胞单层的24孔板的单孔中。与最常用于FMDV分离的亲本LFBK细胞系相比，该细胞系已显示更适合用于FMDV复制。在3-4天后对孔(阶段1)进行CPE评分。通过从每个阴性孔制备细胞裂解物和随后接种(20微升)到含有新鲜LFBKαvβ6细胞单层的24孔板对无CPE的任何孔进行进一步测试。在3-4天后对孔(阶段2)进行CPE评分，并且如上所述通过接种到新鲜细胞上进一步测试无CPE的任何孔。在3-4天后对孔(阶段3)进行CPE评分。进行了类似的分析以检测在0-5dpc收集的鼻拭子上的活FMDV。[将鼻拭子(涤纶聚酯)放入冷冻运输介质中，混合，除去，并且在-70℃冷冻样本；解冻，离心和澄清样品(Spin-X离心管过滤器)进行测试]。
病毒rRT-PCR检测
通过rRT-PCR分析0-5dpc的所有牛收集的肝素化血液(血浆)样品中是否存在FMDV核酸。使用Applied Biosystems ABI 7500平台进行rRT-PCR的热概况分析：在60℃保持10分钟，运行在95℃下循环变性30秒的45个循环，连接60℃的聚合循环1分钟。对于每个治疗组测定0-5dpc的单个rRT-PCR Ct值。在该测定中，Ct值≤40被评分为阳性(POS)，并且Ct值>40被评为阴性(NEG)。
病毒血症：
对于每个治疗组，FMDV攻击后的病毒血症被定义为阳性或阴性。阳性：在细胞培养物中CPE和/或在任何攻击后收集并测试的样品(1-5天攻击后)中RRT-PCR Ct≤40。阴性：在细胞培养物中没有可检测的CPE并且在收集并测试的全部样品(1-5天攻击后)中rRT-PCRCt>40。对于来自鼻拭子的分离病毒，仅确定培养物中是否存在CPE，并随后如上所列进行分析。对于每个治疗组，根据下式计算针对病毒血症的保护：(病毒阴性牛的数量)/(攻击牛的数量)×100％。
概述
对于每个治疗组，确定针对FMD一般性疾病(蹄水泡病变)的保护。对于每只动物和所述的每种治疗总结了在四个评分时间点的FMD临床疾病评分(蹄水泡病变)。对于每个治疗组，根据下式计算针对全身性FMD(蹄病变)的保护百分比：(蹄病变阴性牛的数量)/(受攻击牛的数量)×100％。如果≥75％的免疫接种的牛未发生一般性疾病，而100％的安慰剂对照在FMDV血清型A型攻击后发生一般性疾病，则认为VP 4.2.1/VP 4.2.2二价疫苗是有效的。所有分析的结果总结在表2中。
表2临床结果概述
Figure GDA0003836347330000261
Figure GDA0003836347330000271
两只安慰剂动物在攻击后5天死亡(推定的心肌炎)。如上文总结的，所有其他安慰剂动物都发展了疾病。然而，在用嵌合疫苗免疫的任何动物中均没有疾病迹象(Fisher'sExact Test for Count Data p-值＝1.323×10-5)。这些结果表明FMDV嵌合疫苗对广泛范围的野生型血清型A型FMDV毒株非常有效。
虽然已经参考所示实施方案的细节描述了本发明，但是这些细节并不旨在限制所附权利要求中限定的本发明的范围。如下定义本发明的实施方案，在其中要求保护专享性质或特权。
Figure IPA0000268193800000011
Figure IPA0000268193800000021
Figure IPA0000268193800000031
Figure IPA0000268193800000041
Figure IPA0000268193800000051
Figure IPA0000268193800000061
Figure IPA0000268193800000071
Figure IPA0000268193800000081
Figure IPA0000268193800000091
Figure IPA0000268193800000101
Figure IPA0000268193800000111
Figure IPA0000268193800000121
Figure IPA0000268193800000131
Figure IPA0000268193800000141
Figure IPA0000268193800000151

Claims (17)

1.一种合成多肽，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
2.一种包含权利要求1所述的合成多肽的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2的组合物，其包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第一合成多肽，含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的第二合成多肽和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求2或3的组合物，其进一步包含佐剂。
5.一种重组口蹄疫病毒，其包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的合成多肽。
6.根据权利要求5的病毒，其包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的合成多肽，及具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的合成多肽。
7.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1的合成多肽。
8.根据权利要求7的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
9.一种载体，其包含权利要求7的分离的核酸分子。
10.根据权利要求9的载体，其进一步包含口蹄疫病毒的L蛋白、VP4蛋白、P2蛋白和P3蛋白的编码序列，随后将载体转染到允许的宿主细胞中，产生传染性口蹄疫病毒。
11.权利要求1所述的合成多肽的应用，用于合成一种药剂，所述药剂在受试者中引发针对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答，其中，向受试者施用所述药剂引发对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答。
12.根据权利要求11的应用，其中所述药剂包含药学上可接受的载体。
13.根据权利要求11的应用，其中所述药剂包含佐剂。
14.根据权利要求11的应用，其中，所述药剂包括第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的合成多肽，所述第二组合物包含具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的第二合成多肽。
15.根据权利要求14的应用，其中所述第一组合物和第二组合物是为在不同的解剖部位单独施用至受试者而制定的。
16.权利要求2所述的组合物的应用，用于合成一种药剂，所述药剂在受试者中引发针对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答，其中，向受试者施用所述药剂引发对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答。
17.权利要求5所述的重组口蹄疫病毒的应用，用于合成一种药剂，所述药剂在受试者中引发针对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答，其中，向受试者施用所述药剂引发对血清型A型口蹄疫病毒的免疫应答。
CN201780081323.XA 2016-10-31 2017-10-25 用于血清型a型口蹄疫病毒的嵌合疫苗 Active CN110382518B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662415124P 2016-10-31 2016-10-31
US62/415,124 2016-10-31
US15/785,875 2017-10-17
US15/785,875 US10172933B2 (en) 2016-10-31 2017-10-17 Mosaic vaccines for serotype a foot-and-mouth disease virus
PCT/US2017/058295 WO2018081274A1 (en) 2016-10-31 2017-10-25 Mosaic vaccines for serotype a foot-and-mouth disease virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110382518A CN110382518A (zh) 2019-10-25
CN110382518B true CN110382518B (zh) 2022-11-29

Family

ID=62020851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780081323.XA Active CN110382518B (zh) 2016-10-31 2017-10-25 用于血清型a型口蹄疫病毒的嵌合疫苗

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10172933B2 (zh)
EP (1) EP3532484A4 (zh)
JP (1) JP7137276B2 (zh)
CN (1) CN110382518B (zh)
AU (1) AU2017350853B2 (zh)
BR (1) BR112019008584A2 (zh)
CA (1) CA3041809A1 (zh)
MX (1) MX2019005045A (zh)
RU (1) RU2019113940A (zh)
WO (1) WO2018081274A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3244920T3 (pl) 2015-01-16 2023-09-25 Zoetis Services Llc Szczepionka przeciw pryszczycy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1408434A (zh) * 2002-09-16 2003-04-09 复旦大学 抗家畜口蹄疫的多肽和dna联合疫苗及其制备方法
CN102406929A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 青岛宝麦德生物医药科技有限公司 一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗
WO2016049209A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Merial Inc. Fmdv recombinant vaccines and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ES2267100T5 (es) 1994-07-15 2011-04-08 The University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunomoduladores.
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
CA2281838A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated cpg dinucleotide in the treatment of lps-associated disorders
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6339068B1 (en) 1997-05-20 2002-01-15 University Of Iowa Research Foundation Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
CA2323929C (en) 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
US20110014232A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 Agricultural Research Council Chimeric foot and mouth disease viruses
CN106987595B (zh) * 2009-11-02 2021-07-06 宾夕法尼亚大学托管会 口蹄疫病毒病毒(fmdv)共有蛋白质、其编码序列及由其制备的疫苗
GB201014965D0 (en) 2010-09-08 2010-10-20 Animal Health Inst Vaccine
US10420832B2 (en) 2012-11-16 2019-09-24 United Biomedical, Inc. Synthetic peptide-based emergency vaccine against foot and mouth disease (FMD)
MX365410B (es) 2013-03-26 2019-05-31 The Pirbright Inst Cápsides estabilizadas del virus de la fiebre aftosa.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1408434A (zh) * 2002-09-16 2003-04-09 复旦大学 抗家畜口蹄疫的多肽和dna联合疫苗及其制备方法
CN102406929A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 青岛宝麦德生物医药科技有限公司 一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗
WO2016049209A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Merial Inc. Fmdv recombinant vaccines and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGO58323.1;Ludi,A.B.等;《GenBank》;20140225;序列部分 *
AHW42489.1;Mohapatra,J.K.等;《GenBank》;20150304;序列部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10172933B2 (en) 2019-01-08
RU2019113940A3 (zh) 2020-12-21
US20180117138A1 (en) 2018-05-03
AU2017350853B2 (en) 2021-11-25
CA3041809A1 (en) 2018-05-03
AU2017350853A1 (en) 2019-05-23
EP3532484A4 (en) 2020-07-01
CN110382518A (zh) 2019-10-25
WO2018081274A1 (en) 2018-05-03
RU2019113940A (ru) 2020-11-09
JP7137276B2 (ja) 2022-09-14
JP2019533465A (ja) 2019-11-21
BR112019008584A2 (pt) 2019-09-17
EP3532484A1 (en) 2019-09-04
MX2019005045A (es) 2019-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210092762A (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성 조성물
EP2961846B1 (en) Crimean-congo haemorrhagic fever virus antigenic composition
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
WO2003089584A2 (en) Use of parapox b2l protein to modify immune responses to administered antigens
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
EP2731961A1 (en) Identification of a west nile virus cd4 t cell epitope and use thereof
KR20160027019A (ko) 뎅기 바이러스 백신에 대한 방법 및 조성물
USRE49514E1 (en) Methods for treating plague
CN110382518B (zh) 用于血清型a型口蹄疫病毒的嵌合疫苗
EP3522919A1 (en) Vaccine
US20230149528A1 (en) Development of mosaic vaccines against foot and mouth disease virus serotype o
EP3894547A1 (en) Recombinant mumps virus vaccine expressing genotype g fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins
KR20200100686A (ko) B형 간염 면역화 레지멘 및 조성물
US20230364220A1 (en) SAR-COV-2 DNA Vaccine and Method of Administering Thereof
US20240092840A1 (en) Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native proteins
EP4277656A1 (en) Replication-competent adenovirus type 4 sars-cov-2 vaccines and their use
JP2024512103A (ja) ワクチンプラットフォームとしての高弱毒化複製可能組換えポックスウイルスおよびその利用方法
KR20240019213A (ko) 코로나바이러스를 위한 바이러스 유사 입자 백신
WO2021222851A1 (en) Combinations of viral proteins, peptide sequences, epitopes, and methods and uses thereof
CN116635521A (zh) 减毒的猪流行性下痢病毒
CN114560916A (zh) SARS-CoV-2编码蛋白来源的T细胞表位多肽KLLEQWNLV及其应用
CN115838763A (zh) CCHFV重组真核表达载体pVAX1-CCHFV-NP、构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant