CN102219858A

CN102219858A - 微小隐孢子虫ctl多表位基因和融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN102219858A
Application number: CN2010102005092A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 李艳; 米荣升; 黄燕; 周鹏
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明公开了一种微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白，其包含：SEQ ID NO.1～10所示CTL表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。本发明还公开了微小隐孢子虫CTL多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白，能制成亚单位疫苗和核酸疫苗，对小鼠隐孢子虫感染具有很好的免疫保护效果，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

Description

微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白及其应用。

背景技术

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是一种主要由微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)引起的人兽共患传染病，在免疫功能正常的机体中，可引起自限性腹泻，在免疫功能缺陷患者如艾滋病(AIDS)病人中，可导致严重甚至威胁生命的疾病。隐孢子虫病已被列为世界最常见6种腹泻病之一，并被WHO和美国疾病预防控制中心列入新发传染病。目前对该病尚无特效药物，绝大多数抗生素、抗寄生虫药均无效，因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就愈发显得重要。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类疫苗并未获得满意的免疫保护效果。其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来国际上兴起了利用抗原表位预测工具，开展抗原表位预测，构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)的热潮，而且也取得了阶段性成果，尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果。目前国内外尚没有隐孢子虫多表位疫苗的研究报道。

CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)在抗细胞内病原的保护性反应中发挥重要作用。微小隐孢子虫的免疫机制目前尚不清楚，普遍认为与机体细胞免疫功能状态有关，有学者认为CD8⁺T细胞可能在牛抗微小隐孢子虫感染中起重要作用。因此对隐孢子虫CTL表位进行研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决缺少隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白，该CTL多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

此外，还需要提供一种微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白，其包含：SEQ IDNO.1～10所示CTL表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

优选的，所述CTL表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。在各个CTL表位序列之间加入柔性氨基酸组成的接头序列，能使各个CTL抗原表位在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC(Major Histocompatibility Complex，主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用)分子的结合；同时在各个CTL表位之间用接头序列连接，可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种微小隐孢子虫CTL多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述微小隐孢子虫CTL多表位基因具有编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述微小隐孢子虫CTL多表位基因具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述微小隐孢子虫CTL多表位基因的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述微小隐孢子虫CTL多表位基因和表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述重组载体，或已用上述微小隐孢子虫CTL多表位基因序列转化或转染。

在本发明的另一方面，还提供了一种微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将融合蛋白与弗氏不完全和完全佐剂、Montanide ISA 206等充分混匀制备亚单位疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种微小隐孢子虫CTL多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将微小隐孢子虫CTL多表位基因克隆到真核载体如pVAX1、pcDNA3.1等，或共同插入细胞因子基因，构建成核酸疫苗。

本发明微小隐孢子虫CTL多表位基因，经原核表达后所得的重组蛋白，通过Western blot和免疫小鼠血清抗体ELISA检测结果显示，该重组蛋白具有较好的免疫原性和反应原性；同时动物保护性实验显示，该重组蛋白制成的亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫感染有极好的免疫保护效果。此外，本发明构建的含微小隐孢子虫CTL多表位基因的重组真核表达质粒，作为核酸疫苗进行动物保护性实验，结果表明该重组真核表达质粒具有很好的免疫保护效果。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例3重组表达质粒pET-CpCTL10的双酶切鉴定图；

图2是本发明实施例3重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳图；

图3是本发明实施例3纯化的表达产物SDS-PAGE电泳结果图；

图4是本发明实施例4重组表达产物的Western blot图；

图5是本发明实施例5微小隐孢子虫多表位基因CpCTL10(e)的PCR扩增产物电泳鉴定图；

图6是本发明实施例5重组克隆载体pMD-CpCTL10(e)双酶切鉴定图；

图7是本发明实施例5真核重组表达质粒pVAX-1-CpCTL10的双酶切鉴定图；

图8是本发明实施例6重组表达蛋白rCpCTL10免疫后小鼠隐孢子虫鼠基因型卵囊排出曲线图；

图9是本发明实施例6核酸疫苗免疫后小鼠隐孢子虫鼠基因型卵囊排出曲线图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明应用多个服务器对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析，预测可能存在的CD8⁺细胞毒性T细胞(CD8⁺cytotoxic T lymphocyte，CD8⁺CTL)表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因CP15、gp15/45/60、GP900、cpa135、TRAP-C1、CP15/60中选出10个分值较高的表位基因以任意顺序进行相互串联，形成多表位基因，进行人工合成，各表位之间用柔性氨基酸链接。将该多表位基因克隆到原核表达载体中进行原核表达，并对表达的融合蛋白的免疫原性和反应原性进行验证；将该多表位基因克隆到真核表达载体中，构建核酸疫苗；将原核重组表达蛋白和真核重组表达质粒分别免疫小鼠，观察亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫保护效果。结果显示，重组表达蛋白制成的亚单位疫苗免疫组始终未检测到卵囊排出，而PBS空白对照组和佐剂对照组均有较多的卵囊排出，提示该重组亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有极好的免疫保护效果。由真核重组表达质粒制成的核酸疫苗，免疫小鼠的攻击感染试验结果表明，与空载体对照组与生理盐水空白对照组相比，核酸疫苗免疫组的排出卵囊数量显著减少，开始排出卵囊时间明显延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该真核重组表达质粒具有很好的免疫保护效果。

实施例1微小隐孢子虫CTL疫苗候选抗原表位预测

从文献中查找目前报道的潜在的微小隐孢子虫候选疫苗抗原，记录其GeneBank登录号，从NCBI中下载相关蛋白序列。运用表位预测服务器SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)、ProPred-I(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)和NetMHC 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)，分别对微小隐孢子虫各个抗原的可能产生9个氨基酸残基的H2-d(包括H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd)限制性CTL表位进行预测。本发明预测9个氨基酸残基的CTL表位，主要是由于大部分能与MHC-I类分子结合的多肽都有严格的长度，一股为8-10个氨基酸残基组成，其中9肽最为常见。具体方法为：预测H2-Kd，H2-Ld限制性表位时，将抗原氨基酸序列分别输入服务器，保存SYFPEITHI预测分值大于20的9肽；同时保存ProPred-I返回结果的前15位；寻找二者的重复序列。按照文献[PanagiotopoulosC，Qin H，Tan R，et al.Identification of a β-cell-specific HLA class I restrictedepitope in type 1 diabetes[J].Diabetes，2003，52(11)：2647-2651]报道的方法，计算两者所含MHC I类分子结合9肽的得分并排序，选取得分明显大于其他肽段的序列。同时结合NetMHC 3.0预测结果，进行综合分析。预测H2-Dd限制性表位时，保存ProPred-I返回结果的前15位，结合NetMHC 3.0预测结果，进行综合分析。

结果：从文献报道中收集到31个隐孢子虫疫苗候选抗原，对其进行抗原表位预测，共获得H2-d型CTL表位226个。其中H2-Kd型CTL表位136个、H2-Ld型CTL表位69个、H2-Dd型CTL表位21个。

实施例2微小隐孢子虫CTL多表位基因的设计和合成

从目前研究较多的微小隐孢子虫候选疫苗抗原CP15、gp15/45/60、GP900、cpa135、TRAP-C1、CP15/60中选取10段预测分值较高的CTL表位(见下表1)串联在一起，表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接，使10个CTL抗原表位在空间上互相独立并各自发挥作用。最终设计合成了一条编码137个氨基酸(SEQ ID NO.11)的多表位基因。为便于重组载体的构建，在CTL多表位基因5’端依次加上保护性碱基CCAAT、酶切位点BamH I、kozac序列、起始密码子(ATG)、防错位保护碱基GCT；3’端加上保护性碱基CCAAT，酶切位点Hind III、终止密码子TTA，全长442bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，将该基因命名为CpCTL10。序列由上海英潍捷基生物技术有限公司合成并连接到pMD-18T载体上，命名为pMD-CpCTL10，该pMD-CpCTL10重组载体为克隆重组载体。

表16个疫苗候选抗原中用于多表位基因CpCTL10合成的CTL表位预测结果

CTL多表位氨基酸序列如下：

MAKPVAVRTHLGGGGSAYTIVYAPIGPGPGGYQTSADFVGGGGSMYDPNTNSIGPGPGVYIPYTKCVGGGGSKYLYGIRE

IGPGPGDYISNAKQLGGGGSIYIVQKYVIGPGPGVFDSTSISLGGGGSDGKCRNIAL(SEQ ID NO.11)。

实施例3微小隐孢子虫CTL多表位基因的克隆、表达及纯化

(1)微小隐孢子虫多表位基因原核表达质粒的构建及鉴定

取pET28a(+)质粒和pMD-CpCTL10质粒，分别用BamH I和Hind III双酶切，回收载体和目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。碱裂解法提取质粒DNA，经BamH I和Hind III双酶切鉴定，将鉴定正确的重组原核表达质粒命名为pET-CpCTL10。pET-CpCTL10双酶切鉴定结果如图1所示，在图1中，“1”代表重组表达质粒pET-CpCTL10的Hind III和BamH I双酶切产物，“M”指DNA分子量标准Marker Ⅳ。选2个以上鉴定为阳性的重组表达质粒送上海英潍捷基生物技术有限公司重复测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

(2)重组质粒的诱导表达

将鉴定正确的BL21(DE3)转化菌培养至D_600nm达0.5左右时，以终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导7h，期间每隔1h取样，将表达产物进行15％SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达。经IPTG诱导7h后表达量达到最高(见图2)，SDS-PAGE分析表达蛋白的分子质量与预计的18ku相近。在图2中，1：重组质粒转化菌未诱导产物；2-9：不同株IPTG诱导7h表达产物；M：蛋白质标准分子量。取IPTG诱导7h的表达菌，液氮冻融3次并进行超声波裂解，收集上清液，沉淀加8mol/L尿素溶解，离心后分别收集尿素上清和沉淀，分析重组蛋白的存在形式。BandScan软件分析显示，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55.3％，主要为包涵体表达。

(3)重组蛋白的纯化与复性

诱导表达的菌体用1×结合缓冲液(0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L咪唑，pH7.9)充分悬浮，冻融超声裂解后离心收集包涵体，用含尿素的结合缓冲液重悬，离心后取上清。经Ni-NTA His Bind Resin层析柱进行分步洗脱并收集含目的蛋白的洗脱液，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE鉴定(见图3)，结果表明，表达产物经His亲和层析树脂纯化，获得了较纯的目的蛋白，BandScan软件分析显示，融合蛋白约占纯化后总蛋白的75.1％。在图3中，1：纯化后的融合蛋白；M：蛋白质标准分子量。将纯化的蛋白转移至透析袋中，依次经过含6mol/L、4mol/L、2mol/L尿素的透析液中各透析6h，最后放入无尿素的透析液中透析6h。

实施例4重组蛋白的免疫原性检测

1.重组蛋白的Western blot分析

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素(NC)膜上进行免疫印迹检测。将NC膜浸在含50g/L脱脂奶粉的磷酸缓冲液PBST中，室温封闭2h，用PBST洗涤后，将NC膜与1∶200稀释的鼠抗微小隐孢子虫血清温育1h，洗涤后再用稀释度为1∶1000的HRP标记的羊抗鼠IgG温育1h，用二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。

Western blot结果显示，pET-28a(+)-CpCTL10表达的重组蛋白(recombinant CpCTL10，rCpCTL10)与鼠抗微小隐孢子虫血清出现特异性反应(见图4)。

2.重组蛋白免疫血清的制备

以透析的重组蛋白为抗原免疫2只4周龄清洁级BALB/c小鼠，通过背部皮下多点注射的方法免疫3次。每次免疫的间隔时间为2周，免疫剂量为0.05mg/只。初次免疫时加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，第2次和第3次免疫时加入等体积的弗氏不完全佐剂乳化。第3次免疫2周后眼眶采血，分离血清并保存。

3.间接ELISA法检测重组蛋白免疫血清的抗体效价

将透析后的重组蛋白以8μg/mL于4℃包被酶标板过夜，用含5％脱脂奶粉的PBST于37℃封闭2h，与不同稀释度的重组蛋白免疫小鼠阳性血清于37℃温育1h，再与1∶1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG于37℃反应1h，加四甲基联苯胺底物缓冲液(TMB-H₂O₂)于37℃反应10min，用2mol/L H₂SO₄终止反应，测定吸光度(OD_450nm)，检测重组蛋白免疫血清中特异抗体水平，初步评估免疫血清的抗体效价。

以免疫血清的OD450nm≥阴性对照OD450nm值2.1倍以上判定为阳性，剔除明显异常的数值，结果显示，经3次免疫后产生了较高的血清抗体效价，血清经1∶1600稀释后，抗体效价仍远高于对照组(见表2)。

表2rCpCTL10免疫小鼠血清抗体效价ELISA检测结果(OD_450nm)

在表2中，+：重组蛋白免疫BALB/c小鼠阳性血清；1-2：1号和2号小鼠；-：未免疫BALB/c小鼠血清；*：为明显异常的数值，计算时予以剔除。

实施例5微小隐孢子虫CTL多表位基因真核表达重组质粒的构建

(1)重组真核表达质粒的构建

按照pVAX-1表达载体多克隆位点上的酶切位点与三联体密码子的要求，重新合成微小隐孢子虫多表位基因CpCTL10的上游引物和下游引物。设计的引物如下CpCTL10(e)F：CCGGAATTCCCGACCATGGCTATGAAATTGGATGAGGTTGTTG(SEQ ID NO.13)；CpCTL10(e)R：CCCTCTAGATTATTCA TCCAAAGCAATATTTCTG(SEQ ID NO.14)。以pMD-CpCTL10菌液为模板，进行PCR扩增。经过30个循环的PCR扩增，获得了CpCTL10(e)基因，大小与预计相符(见图5)，图5中，M：100bp DNA分子量标准；1-2：CpCTL10(e)PCR扩增产物。用胶回收试剂盒回收目的基因片段CpCTL10(e)。采用TA克隆方法将目的基因克隆到pMD-18T载体，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，碱裂解法提取重组质粒DNA，经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的真核重组表达质粒命名为pMD-CpCTL10(e)。pMD-CpCTL10(e)经BamH I和Xba I双酶切，得到两条带，与预计片段大小相同(见图6)。图6中，1：pMD-CpCTL10(e)的BamH I和Xba I双酶切产物；M1：100bp DNA分子量标准；M2：MarkerⅣ DNA分子量标准。经测序鉴定序列未发生碱基突变。

取pMD-CpCTL10(e)质粒和载体pVAX1，分别用限制性内切酶BamH I和Xba I进行双酶切，用胶回收试剂盒回收载体和目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选(Kan+)阳性菌落。碱裂解法提取质粒，进行酶切及测序鉴定，阳性重组质粒命名为pVAX-1-CpCTL10。重组表达质粒pVAX-1-CpCTL10经BamH I和Xba I双酶切鉴定正确，结果如图7所示。在图7中，1：pVAX-1-CpCTL10的BamH I和Xba I双酶切产物；M：Marker Ⅳ DNA分子量标准。

(2)重组质粒的大量提取和纯化

将鉴定正确的重组质粒pVAX-1-CpCTL10转化菌以0.1％浓度重新接种500mL培养基，碱裂解法大量提取质粒DNA，用聚乙二醇(PEG8000)沉淀法纯化质粒DNA，用GE Healthcare NanoVue紫外可见光分光光度计测定质粒pVAX-1-CpCTL10的浓度。

质粒经大量抽提并纯化后，用紫外可见光分光光度计测定质粒pVAX-1-CpCTL10的浓度为1.463mg/mL。

实施例6动物保护性实验

(1)动物分组与免疫

将60只4周龄BALB/c小鼠分成6组，每组10只。亚单位疫苗组用纯化的重组表达CpCTL10(recombinant CpCTL10，rCpCTL10)抗原经PBS稀释后与弗氏佐剂结合进行免疫，抗原免疫剂量及方式同实施例4；核酸疫苗组将重组质粒pVAX-1-CpCTL10用生理盐水稀释后以0.05mg/只的剂量进行免疫。另设4个对照组分别为pVAX-1质粒对照组、佐剂对照组、PBS对照组和生理盐水对照组，pVAX-1免疫剂量亦为0.05mg/只小鼠，佐剂对照组免疫剂量为PBS 0.05mL/只加等体积佐剂，生理盐水、PBS对照组免疫剂量为0.05mL/只小鼠。每2周免疫1次，共免疫3次。3免后1周从试验组中任意选取两只小鼠眼眶采血测定血清效价。

(2)保护性实验

第3次免疫2周后各组小鼠每只经口接种1×10⁶个隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)卵囊。从接种后第1d起每隔2d采粪便10g，加40mL水溶解，铜纱网过滤，滤液3000r/min离心10min，收集沉淀。加10mL饱和蔗糖溶液混匀，1500r/min离心10min。用铁丝圈蘸取液面表层至载玻片上，盖上盖玻片，用10×40倍显微镜镜检，对50个视野内的隐孢子虫卵囊进行计数。同时称取每组小鼠的体重、排粪便重量，持续记录1个月，根据结果综合评价制备的多表位抗原对小鼠的免疫保护效果。

(3)重组表达蛋白rCpCTL0亚单位疫苗的动物免疫保护效果

各组小鼠粪便中隐孢子虫鼠基因型卵囊排出情况如图8所示。

结果显示，感染后第10d，PBS空白对照组检测到隐孢子虫鼠基因型卵囊排出，至感染后第34d仍有卵囊排出，共检测到的相对卵囊数为15个；

佐剂对照组在感染后第4d开始检测到隐孢子虫鼠基因型卵囊排出，至感染后第34d停止排出卵囊，共检测到的相对卵囊数为14个；

rCpCTL10免疫组则始终未检测到卵囊排出，提示该重组蛋白rCpCTL0亚单位疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染具有极好的免疫保护效果。

(4)核酸疫苗的免疫保护效果

各组小鼠粪便中隐孢子虫鼠基因型卵囊排出情况如图9所示。

结果显示，与对照组相比，pVAX-1-CpCTL10免疫组所排出的卵囊数量明显减少，34d总共检测到的相对卵囊数为2个；而pVAX-1空载体对照组为17个，生理盐水空白对照为20个，差异非常明显。

与对照组相比，pVAX-1-CpCTL10免疫组开始排出卵囊时间明显延后。攻虫后第7d，生理盐水对照组小鼠检测到有隐孢子虫卵囊排出；感染后第10d，在pVAX-1空载体免疫对照组检测到卵囊排出；攻虫后第13d，pVAX-1-CpCTL10试验组小鼠检测到卵囊排出。

与对照组相比，pVAX-1-CpCTL10免疫组卵囊排出持续时间减少，仅在感染后第13d检测到卵囊；而空载体pVAX-1对照组排出卵囊持续时间在24d以上，至试验结束时即感染后第34d仍有卵囊排出；生理盐水空白对照组卵囊排出时间持续24d。

图9结果表明重组真核表达质粒pVAX-1-CpCTL10制成的核酸疫苗具有很好的免疫保护效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>微小隐孢子虫CTL多表位基因和融合蛋白及其应用

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>1

Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>2

Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>3

Gly Tyr Gln Thr Ser Ala Asp Phe Val

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>4

Met Tyr Asp Pro Asn Thr Asn Ser Ile

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

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<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>5

Val Tyr Ile Pro Tyr Thr Lys Cys Val

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

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Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Arg Glu Ile

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>7

Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Lys Gln Leu

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

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<223>CTL表位

<400>8

Ile Tyr Ile Val Gln Lys Tyr Val Ile

1 5

<210>9

<211>9

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<213>Cryptosporidium parvum

<220>

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<223>CTL表位

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1 5

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<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(9)

<223>CTL表位

<400>10

Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu

1 5

<210>11

<211>137

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

Met Ala Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile Gly Pro Gly Pro Gly Gly Tyr

20 25 30

Gln Thr Ser Ala Asp Phe Val Gly Gly Gly Gly Ser Met Tyr Asp Pro

35 40 45

Asn Thr Asn Ser Ile Gly Pro Gly Pro Gly Val Tyr Ile Pro Tyr Thr

50 55 60

Lys Cys Val Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Leu Tyr Gly Ile Arg Glu

65 70 75 80

Ile Gly Pro Gly Pro Gly Asp Tyr Ile Ser Asn Ala Lys Gln Leu Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Ile Val Gln Lys Tyr Val Ile Gly Pro Gly

100 105 110

Pro Gly Val Phe Asp Ser Thr Ser Ile Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu

130 135

<210>12

<211>442

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccaatggatc cccgaccatg gctaaacctg ttgctgttcg tacccattta ggaggcggag 60

gttctgccta cactatcgtc tatgcaccta taggaccagg gccgggagga tatcaaactt 120

cagctgattt cgtaggtggt ggcggttcca tgtacgatcc aaacacgaat tctattggac 180

ctggtccagg tgtatacatt ccatacacta aatgtgttgg tggaggaggg tctaaatatt 240

tgtatggtat tagagaaatt ggacccggtc ccggcgatta tatttcaaat gctaaacaat 300

taggcggcgg gggttcaata tatatagttc agaaatatgt aataggaccg ggtccgggcg 360

tatttgatag cacaagtatt tcgcttggtg gggggggctc tgatggaaaa tgcagaaata 420

ttgctttgta aaagcttatt gg 442

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(43)

<223>引物

<400>13

ccggaattcc cgaccatggc tatgaaattg gatgaggttg ttg 43

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<400>14

ccctctagat tattcatcca aagcaatatt tctg 34

Claims

1.一种微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白，其特征在于，包含：SEQ ID NO.1～10所示CTL表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白，其特征在于，所述CTL表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。

3.根据权利要求1或2所述的微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

4.一种微小隐孢子虫CTL多表位基因，其特征在于，包含编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的微小隐孢子虫CTL多表位基因，其特征在于，具有编码SEQ IDNO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的微小隐孢子虫CTL多表位基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

7.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4所述的微小隐孢子虫CTL多表位基因。

8.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求4所述的微小隐孢子虫CTL多表位基因和表达载体。

9.权利要求1所述的微小隐孢子虫CTL多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

10.权利要求4所述的微小隐孢子虫CTL多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。