CN102600479A

CN102600479A - 安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102600479A
Application number: CN2010105939817A
Authority: CN
Inventors: 宫鹏涛; 郑君; 张西臣; 李建华; 张楠; 高江明; 李�赫; 吕强; 张国才; 杨举
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明涉及一种安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗及其制备方法，其特征在于：以真核表达质粒pVAX1为载体，将安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫同源性较高的囊壁蛋白编码基因定向插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了具有交叉保护性的隐孢子虫核酸疫苗。其既可以产生抗安氏隐孢子虫的免疫应答，又可以对微小隐孢子虫具有免疫保护作用，从而可以达到更好的预防动物隐孢子虫病的目的。

Description

安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗及其制备方法，特别是涉及一种对安氏隐孢子虫和微小隐孢子虫具有保护性的核酸疫苗，用于隐孢子虫病的预防和治疗，属于寄生虫疫苗制备技术领域。

背景技术

隐孢子虫是一种单细胞的寄生性原虫，它广泛寄生在脊椎动物胃肠上皮细胞微绒毛的边缘，可引起宿主严重腹泻、脱水和厌食等，从而造成严重的经济损失。由隐孢子虫引起的疾病称隐孢子虫病，此病已经作为一种重要的病原体威胁着人类的生命，尤其是儿童、老年人和免疫缺陷的病人。虽然国内外学者对该病已研究多年，但迄今为止并无有效的预防措施和治疗药物。囊壁的形成是隐孢子虫生活史的必经阶段，通过干扰或者阻碍囊壁的形成过程，从而使虫体缺乏进一步的感染力，而囊壁蛋白将成为阻碍虫体侵染的主要研究靶位。利用囊壁蛋白构建核酸疫苗能够成为控制隐孢子虫病较为合适的途径。目前，国内外确定的能够感染人的隐孢子虫有10种，而对于隐孢子虫的交叉保护性研究还是一个空白。

发明内容

本发明目的在于提供一种安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗及其制备方法，是对安氏隐孢子虫和微小隐孢子虫具有交叉保护性的核酸疫苗，可以有效的防治多种隐孢子虫病，对于隐孢子虫病的防治有明显效果；其适用于工业化生产。

本发明的技术方案是这样实现的：安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗，其特征在于：以真核表达质粒pVAX1为载体，将安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫同源性较高的囊壁蛋白编码基因AB定向插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了具有交叉保护性的隐孢子虫核酸疫苗pVAX1-AB。所述的安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗的制备工艺，包括以下步骤：根据安氏隐孢子虫囊壁蛋白抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，同时使用相同的引物对微小隐孢子虫进行RT-PCR,然后将获得的两个基因分别TA克隆，测序，从而比较其同源性；将所得安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因定向克隆入真核表达载体pVAX1中，构建具有交叉保护性的重组核酸疫苗；提取重组质粒并利用试剂盒纯化后，进行细胞转染；并通过间接免疫荧光及Western blotting 实验进行验证；之后利用安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗进行动物保护性试验。

本发明的积极效果在于：一方面以安氏隐孢子虫囊壁蛋白为抗原，促使机体产生抗安氏隐孢子虫囊壁蛋白的抗体，从而促使机体产生免疫应答，干扰隐孢子虫囊壁的形成和进一步的侵染；另一方面根据安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫同源性较高的囊壁蛋白序列构建核酸疫苗，既可以产生抗安氏隐孢子虫的免疫应答，又可以对微小隐孢子虫具有免疫保护作用，从而可以达到更好的预防动物隐孢子虫病的目的。实验证明，将构建的重组核酸疫苗免疫BALB/c小鼠后，与对照组相比，实验组抗体效价较高，差异显著（P<0.05），细胞免疫水平明显高于对照组（P<0.05）。对微小隐孢子虫的动物保护性试验证明免疫保护率可达48.6%。

附图说明

图1为pVAX1-AB载体构建示意图。

图2安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫囊壁蛋白基因序列比对示意图。

图3为pVAX1-AB基因转染Hela细胞的间接免疫荧光图。

图4为pVAX1-AB转染后Western blotting鉴定图。

图5为交叉保护性核酸疫苗免疫小鼠抗微小隐孢子虫感染的保护作用。

图6为核酸疫苗免疫小鼠抗微小隐孢子虫感染的保护作用。

具体实施方式

实施例1

安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗的制备

本发明以安氏隐孢子虫囊壁蛋白编码基因AB为例，进行重组真核表达载体的构建。首先将目的基因AB与T载体进行连接，用BamHI、Xhol进行双酶切反应，回收片段与经过BamHI和Xhol双酶切反应的真核表达载体pVAX1进行连接，构建pVAX1-AB重组载体。

具体的制备步骤如下：

参照安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因序列开放性阅读框及真核表达载体pVAX1物理图谱设计引物并引入酶切位点。

AB上游引物QF: 5’—CCGGGATCCGCCGCCACCATGTTTACATTTTCAGGGAAGC— 3’；其中5`端含有BamHI位点以及kozak序列；

AB下游引物QR：5’—CGCCTCGAGTTAC CTTGCAGTGTAAAATTTG—3’；5`端含有XhoI位点。

利用上述引物序列对安氏隐孢子虫进行RT-PCR反应（通用参数为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环后于72℃延伸10min），将PCR纯化产物克隆至pMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送生物公司测序鉴定。同时使用相同的引物对微小隐孢子虫进行RT-PCR反应，回收目的片段并克隆至pMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送生物公司测序鉴定。测序后将两组序列进行比对分析（如附图2所示）。然后与用BamHI和XhoI进行双酶切的真核表达载体pVAX1连接，构建重组真核表达质粒pVAX1-AB，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用BamHI和XhoI进行双酶切反应鉴定（如附图1所示）。

实施例2

重组核酸疫苗在真核细胞中表达的验证

提取重组质粒pVAX1-AB,并利用质粒纯化试剂盒进行质粒的纯化，37℃，5% CO₂孵箱培养Hela细胞，使细胞达到50%～80%融合，按Lipofectamine转染试剂盒说明进行转染，转染72小时后更换培养基并用G418进行筛选，同时用未加转染的细胞作对照。当对照细胞大部分死亡时，用含低浓度的G418的培养基维持筛选。1周后有阳性克隆形成，待其逐渐增大后转移扩大培养。分别收集培养上清液、转染细胞和对照细胞。基因转染后进行免疫荧光及Western blotting鉴定（如附图3、4所示）。

实施例3

安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗免疫效果鉴定

将30只4～6周龄，18～22g的雌性清洁级BALB/c小鼠分成3组，每组10只，其中第一组为pVAX1-AB肌注组（佐剂为司苯甘油，100ug/只）,第二组为阴性对照组（肌注100ul/只PBS溶液），第三组为pVAX1肌注组（佐剂为司苯甘油，100ug/只）。各组注射三次，间隔两周。每次免疫前尾静脉采血，分离血清，用微小隐孢子虫卵囊抗原作为包被抗原，通过间接ELISA方法对鼠血清中IgG变化情况进行检测（如附图5所示）。第三次免疫后1周，每组随机各取4只小鼠放血处死，取脾脏，加2mL PBS，在200目筛上研磨，用PBS稀释成细胞悬液（10⁷个/mL）。取100μL细胞悬液，加FITC标记的抗CD4⁺和PE标记的抗CD8⁺ 兔抗鼠单克隆抗体，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入0.5mL荧光保存液，用流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。

体液免疫检测结果证实一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，实验组显示了一定的抗体效价（P<0.05）。细胞免疫水平检测结果表明免疫组CD4⁺ 、CD8⁺变量明显高于阴性对照组，与阴性对照组差异均显著（P<0.05）。

实施例4

重组核酸疫苗对微小隐孢子虫的交叉保护性实验

第三次免疫后两周，每只小鼠接种1×10⁶个微小隐孢子虫卵囊，每天收集各个小鼠的粪便，用饱和硫酸锌浮集法收集卵囊，将沉淀溶于一定量的水中，混匀后，取一滴置于血细胞计数板中，在低倍镜下记数隐孢子虫卵囊总数，直到检测不到卵囊为止。经过统计分析，第11天小鼠卵囊排出量达到高峰，实验组小鼠排出的卵囊数明显减少，与对照组相比差异显著（P<0.05），减虫率可达48.6%（见附图6）。

综合上述实验结果，本发明的安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗pVAX1-AB，能够刺激机体产生免疫应答，对微小隐孢子虫有一定的免疫保护效果，可以用来作为隐孢子虫病的预防和治疗性疫苗。

序列表1：

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）

<400> 1

ccgggatccg ccgccaccat gtttacattt tcagggaagc 40

序列表2：

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）

<400> 1

cgcctcgagt taccttgcag tgtaaaattt g 31

Claims

1. 安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗，其特征在于：以真核表达质粒pVAX1为载体，将安氏隐孢子虫与微小隐孢子虫同源性较高的囊壁蛋白编码基因定向插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了具有交叉保护性的隐孢子虫核酸疫苗。

2.权利要求1所述的安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗，其特征在于所述的制备工艺包括以下步骤：（1）根据安氏隐孢子虫囊壁蛋白抗原基因序列的开放性阅读框设计引物，AB上游引物QF: 5’—CCGGGATCCGCCGCCACCATGTTTACATTTTCAGGGAAGC— 3’；其中5`端含有BamHI位点以及kozak序列；AB下游引物QR：5’—CGCCTCGAGTTAC CTTGCAGTGTAAAATTTG—3’；5`端含有XhoI位点进行PCR，同时使用相同的引物对微小隐孢子虫进行RT-PCR,然后将获得的两个基因分别TA克隆，测序，从而比较其同源性；（2）将所得安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因定向克隆入真核表达载体pVAX1中，构建具有交叉保护性的重组核酸疫苗pVAX1-AB；（3）提取重组质粒并利用试剂盒纯化后，进行细胞转染；并通过间接免疫荧光及Western blotting 实验进行验证；之后利用安氏隐孢子虫交叉保护性核酸疫苗进行动物保护性试验。