CN102973951A - 一种锦鲤疱疹病毒orf25核酸疫苗 - Google Patents

一种锦鲤疱疹病毒orf25核酸疫苗 Download PDF

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张东鸣
王好
李新伟
张伟
祖岫杰
杨春桥
郭海勇
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Abstract

本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，该疫苗具有较好的免疫原性。本发明所提供的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，是将ORF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到的重组质粒。本发明所提供的锦鲤疱疹病毒核酸疫苗对于鲤鱼疱疹具有有效的预防作用。

Description

一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗
技术领域
本发明涉及一种锦鲤疱疹病毒核酸疫苗，属生物技术领域。 
背景技术
锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种如框镜鲤等发病的一种具有高度传染性和致死性的疾病。 
该病于1998年首次在以色列的Magan Michael地区和美国爆发，2000年该病传至英国、德国和比利时；2002年4月，印尼发生本病，同时中国广东省锦鲤疑似发生本病；同年12月我国台湾省证实锦鲤感染本病；2003年10月日本证实该病已在本国存在。目前，该病在我国的鲤鱼养殖中发病较多，造成鲤鱼的大量死亡，给鲤鱼养殖业带来了几乎毁灭般的打击。尽管有多种传统疫苗可用于疾病的免疫预防，但在生产实践中以及我们的试验研究结果均表明，利用灭活苗来免疫预防锦鲤疱疹病毒病不能起到完全免疫保护作用，同时在我国尚未见有分离出或研究出KHV弱毒株病毒的报道，因此亟待有该病毒的新型疫苗问世。 
核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)又称基因疫苗、DNA疫苗，它是利用DNA重组技术将保护性抗原蛋白基因克隆到真核表达载体，并将其直接导入体内，使抗原蛋白内源性表达递呈给免疫系统，诱发机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。ORF25基因表达糖基化蛋白，基因大小849bp，编码282个氨基酸，具有信号肽切割位点，表达蛋白主要存在于细胞质，是KHV主要的结构蛋白基因，诱导产生中和抗体作用，具有良好免疫原性。本发明以ORF25基因为目的基因，pIRES-neo为真核表达载体，构建了pIRES-ORF25真核表达重组质粒，并研究其免疫效力，研制出高效、新型KHV核酸疫苗。 
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好免疫原性的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗。 
本发明所提供的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，是将ORF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到pIRES-ORF25重组质粒。 
其中，所述ORF25基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；其对应的氨基 酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。 
本发明利用将编码锦鲤疱疹病毒的ORF25基因定向克隆到真核表达载体pIRES-neo中，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒DNA经限制性核酸内切酶鉴定证实含有正确的ORF25基因。用SDS碱裂解法大量提取质粒，通过罗氏FuGENE HD转染试剂将重组质粒导入框镜鲤尾鳍细胞(MFC)内，收集转染48小时后的MFC细胞，用Western-blot方法检验目的基因的蛋白表达情况，证明所构建的真核重组表达质粒成功在MFC细胞中得到了表达。重组表达质粒进行肌肉注射健康鲤鱼，每14天免疫一次，共免疫3次，每周心脏采血，利用ELISA方法检测鲤鱼血清中的KHV特异性抗体。用ORF25重组质粒免疫的鲤鱼血液中可检测到KHV的特异性抗体，加强免疫后抗体水平随免疫次数的增加而增高。采用固定病毒稀释血清方法，测定ORF25重组质粒免疫后各试验组鲤鱼血清中抗KHV中和效价，ORF25重组质粒免疫组鲤鱼血清均产生了明显的中和抗体。第三次免疫后两周用100TCID50的KHV对各组鲤鱼胸腔攻毒，免疫后的鲤鱼保护率显著提高。对每组鲤鱼进行病理切片，显示免疫鲤鱼大大提高了感染后腮、肾、脾、肝的病理状况。 
其中，本发明所用锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)和框镜鲤尾鳍原代细胞(MFC)均由吉林农业大学动物科技学院实验室保存提供。 
本发明的有益效果：本发明的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗容易生产，在大肠杆菌中可高效克隆；稳定性强，可在大肠杆菌中长期严格复制克隆；在鱼体内使用安全，由于是真核载体表达保护性抗原所以不会造成病毒扩散；免疫剂量小，所发明的核酸疫苗对鲤鱼进行免疫后，载体高效表达，确保了抗原高效持续表达并分泌到胞外，所以免疫剂量极小。 
本发明的核酸疫苗目前已在鲤鱼上进行试验，取得了非常明显保护效率。如果用该疫苗免疫鱼，必将大大减少鱼患锦鲤疱疹的患病机率，保证鱼的产量和质量。本发明能使鱼建立针对锦鲤疱疹病毒病有效的抗病机制，使养殖户减少经济损失。同时减少药物使用量，从而保证水产品的质量，维护生态稳定性。使用本发明具有重要的经济效益、社会效益和生态效益。 
附图说明
图1：锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)的ORF25基因PCR扩增电泳图，其中M为DNA分子质量标准，1为ORF25基因PCR产物； 
图2：重组质粒pIRES-ORF25的PCR鉴定结果，其中M为DNA分子质量标准，1 为重组质粒pIRES-ORF25的PCR结果，2为阳性对照，3为阴性对照； 
图3：重组质粒pIRES-ORF25的双酶切分析电泳图，其中M为DNA分子标准质量，1为pIRES-ORF25的酶切结果； 
图4：含pIRES-ORF25表达载体的MFC细胞表达蛋白的Western-blot分析结果，其中M为蛋白Marker，1为pIRES-ORF25转染组，2为阴性对照； 
图5：用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼腮组织的显微切片(×100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES-ORF25的免疫组； 
图6：用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼肾脏组织的显微切片(×100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES-ORF25的免疫组； 
图7：用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼脾脏组织的显微切片(×100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES-ORF25的免疫组； 
图8：用疱疹病毒KHV静脉胸腔攻毒后每组鲤鱼肝脏组织的显微切片(×100)，其中A为注射PBS组，B为注射pIRES组，C为空白组，D为注射pIRES-ORF25的免疫组。 
图9：真核表达载体pIRES-neo的物理图谱 
具体实施方式
实施例1：ORF25基因的克隆与鉴定 
1.设计ORF25基因扩增引物 
根据GenBank上已登录的KHV-I株ORF25基因序列，利用软件Primer Premiers 5.0设计引物，上游引物为：F1 5′-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3′，下游引物为：F2 5′-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3′，分别引入EcoR V和EcoR I两个限制性酶切位点(划线部位)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 
2.ORF25基因的PCR扩增与鉴定 
以KHV核酸DNA为模板，对ORF25基因进行PCR扩增。反应体系为：F1，F2(20pmol/μL)0.5μL、10×ExBuffer 2.5μL、dNTP 2μL、DNA 1μL、ExTaq酶0.25μL、加灭菌水补足至25μL。PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性94℃，40s；退火59.3℃，30s；延伸72℃，1min。扩增循环数均为35次；最后，反应体系于72℃总延伸 10min，反应结束后4℃保存。 
取5μL PCR产物，在1×TAE缓冲液中以DL 2000 Marker作分子量对照，1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增片段的大小，记录凝胶成像结果。如图1所示，经PCR扩增出预期的DNA片段，为849bp，说明成功扩增出ORF25基因。所述ORF25基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。 
实施例2：pIRES-ORF25重组真核表达质粒的构建与鉴定 
1.pIRES-neo质粒的制备 
取5μl含pIRES-neo质粒(购自金维克(中国)生物技术中心)DH5α菌液，加入到5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜。按照分子克隆操作指南(第三版)SDS碱裂解法小量制备质粒。 
2.pIRES-neo质粒的酶切 
对pIRES-neo质粒进行EcoR V和EcoR I双酶切，1.0％琼脂糖电泳，参照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收酶切大片。 
3.ORF25基因在pIRES-neo质粒中的克隆 
利用天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将ORF25的PCR产物进行回收纯化，取纯化后的基因片段5μl，pIRES-neo质粒双酶切回收的大片段1μl，10倍T4 buffer1μl，T4DNA连接酶1μl，ddH2O2μl，混均置16℃过夜。将连接产物转至DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆菌落，随机挑取部分阳性菌落，接种在LB液体培基中培养过夜，按照分子克隆操作指南(第三版)SDS碱裂解法小量制备质粒。 
5.重组质粒pIRES-ORF25的PCR和酶切鉴定 
参照上述ORF25的PCR条件，取适量小量制备的重组质粒pIRES-ORF25为模板进行PCR扩增。结果如图2所示，获得了长为849bp的片段，与目的基因大小一致。 
对pIRES-ORF25质粒进行EcoR V和EcoR I双酶切，酶切体系如下：EcoR V和EcoR I各0.5μl，10倍H buffer1μl，质粒2μl，ddH2O 6μl,总体积为10μl，37℃水浴1h。1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统采集酶切结果。结果如图3所示，pIRES-ORF25应用EcoR V、EcoR I双酶切后出现两条带，一条约5237bp，与pIRES经EcoR V、EcoR I双酶切后的大片段大小一致，另一条约849bp，与ORF25大小一致，表明ORF25已经成功插入到pIRES-neo载体中。 
实施例3：重组质粒pIRES-ORF25在MFC细胞中的表达 
1.重组质粒的大量提取及纯化 
将鉴定为阳性的pIRES-ORF25质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落；接种于5mL含Amp+的LB液体培养液，37℃震荡培养至对数生长期(OD600≈0.6)；取1mL接种于500mL含Amp的LB液体培养液扩大培养。将上述培养物5000r/min离心10min，弃上清，低温冰柜放置数小时后，用200ml冰预冷的STE(0.1mol/LNaCl，10m mol/L Tris-HCl pH8.0，1m mol/L EDTA)将细菌沉淀重悬，按上述方法离心收集细菌。 
参照分子克隆操作指南(第三版)SDS碱裂解法大量制备质粒方法提取质粒，大提与纯化方法如下： 
(1)用18ml碱裂解液I，重悬细菌沉淀(置于漩涡振荡器上振荡)； 
(2)加入新配置的2ml溶菌酶(10mg/ml)； 
(3)加入40ml新配置的碱裂解液Ⅱ，盖上离心管盖后轻轻颠倒数次，以彻底混匀，室温下放置5-10min； 
(4)加入20ml预冷的溶液Ⅲ，盖上离心管轻轻混匀后，冰浴10min； 
(5)在4℃条件下11000r/min离心30min，将上清液移至量筒中，弃去离心管中的沉淀； 
(6)量取上清液的体积，加入0.6倍体积的异丙醇后转移至新的离心管中，充分混匀后，室温作用10min； 
(7)室温下8000r/min离心15min回收核酸沉淀； 
(8)小心弃上清，将离心管敞开盖，倒置于洁净滤纸上除去残余的上清，室温条件下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇后将离心管倒置洁净滤纸上使剩余的乙醇挥发掉； 
(9)用3ml TE溶解湿润的核酸沉淀，然后转移到15ml离心管中，冰浴冷却至0℃； 
(10)加入3ml预冰冷的5mol/L LiCL，混匀后4℃10000r/min离心10min； 
(11)将上清转移至30ml离心管中，加入等量体积异丙醇，混匀后室温10000r/min离心10min； 
(12)小心倒掉上清，倒置使液体流干，70%乙醇洗涤沉淀和管壁，小心倒掉乙醇后在洁净滤纸上倒置数分钟使没有乙醇残留，但应使沉淀保持湿润； 
(13)用500μl含RNase A的TE溶解沉淀，转移至微量离心管，室温放置30min； 
(14)将质粒-RNase混合物用酚：氯仿抽提一次后，再用氯仿抽提一次，然后用标准的乙醇沉淀法回收核酸； 
(15)加入1ml灭菌水将质粒溶解，再加入0.5ml PEG-MgCl2溶液，室温放置超过10min后，室温条件下12000r/min离心20min，回收沉淀； 
(16)用70%乙醇重悬沉淀以除去微量的PEG，12000r/min离心5min，回收沉淀； 
(17)吸去乙醇，重复上一步操作，然后将离心管置于管架上放置20min，使乙醇完全挥发； 
(18)用500μlTE溶解沉淀质粒，以1:100用TE稀释后测OD260并计算质粒的浓度。按1 OD260=50μg质粒/ml计算。 
(19)分装后-20℃保存。 
2.重组质粒的转染 
将实验室保存的框镜鲤尾鳍细胞(MFC)复苏后培养至对数生长期后接种于6孔板，置于27°C 5%CO2细胞培养箱中进行培养，待细胞覆盖率达80%左右时进行转染。 
使用罗氏FuGENE HD转染试剂进行转染，按试剂盒的使用说明进行，具体步骤如下： 
先将转染试剂、质粒和优化培养基温浴至15-25℃；将质粒用不含血清M199培养液稀释至2μg/100μL；然后向混合液中加入转染试剂5μL，将转染试剂直接加入到稀释后的质粒中，操作时应避免和EP管壁接触；将转染体系置于室温作用20min；将细胞培养板用无血清的M199培养液洗涤两次，加入1.9mL无血清的培养液；将100μL转染液滴入细胞中，轻摇细胞板混匀，置于27℃5%CO2细胞培养箱培养5h后倒掉培养液，六孔细胞培养板中每孔加入2mL含10%胎牛血清的M199培养液，27℃5%CO2细胞培养箱培养。收集孵育48h后的细胞备用，同时设PIRES-neo空质粒对照和正常细胞对照。 
3.Western-blot鉴定蛋白的表达 
收集转染48小时后的MFC细胞，用Western-blot方法检验目的基因的蛋白表达情况。结果如图4所示，可观察到约32KD的蛋白条带，与预期获得的目的蛋白大小一致；阴性对照均没有蛋白条带出现。表明所构建的真核表达重组质粒pIRES-ORF25成功在MFC细胞中得到了表达。 
实验例4：重组质粒pIRES-ORF25诱导免疫鲤鱼及效果检测 
实验前10天，在248尾同一批次健康鲤鱼(体长20-30cm，体重200-300g)中随机选取8尾应用PCR方法检测没有感染KHV后，剩余480尾平均分成6组，每组40尾，在实验室水族箱中正常条件下喂养。 
实验时用丁香油将鲤鱼麻醉，待鱼停止游动后迅速对肌肉部位进行核酸疫苗接种， 并马上放回清水中。实验共分为6个处理组：1.未注射组；2.注射生理盐水(高压灭菌)；3.注射pIRES-neo空载体组(剂量为10μg)；4.注射重组质粒pIRES-ORF25(剂量为1μg)；5.注射重组质粒pIRES-ORF25(剂量为10μg)；6.注射重组质粒pIRES-ORF25(剂量为50μg)。 
以上6组鲤鱼肌肉注射剂量均为200μL，每14天免疫一次，共免疫3次。免疫前采血，第一次免疫至三次免疫后两周，每周心脏采血。血液于37℃放置1h，4℃放置2h后4500r/min离心15min，收集上层血清。采用盐析法粗提，重组蛋白A(HiTrap rProteinA Sepharose)亲和层析法精提鲤鱼血清中的IgM，将纯化的蛋白免疫实验兔后制得高效价的兔抗鱼IgM血清。 
1.ELISA检测鲤鱼血清中抗体水平 
包被：用包被液将纯化的ORF25蛋白按照600ng/mL稀释，ELISA板每孔包被100μL，37℃温箱中作用1h，4℃过夜； 
洗涤：每孔加300μL PBST洗涤ELISA板，共洗涤3次，每次5min，滤纸上拍打后晾干； 
封闭：每孔加100μL 5%脱脂牛奶，37℃温箱中作用1.5h； 
洗涤：同上； 
加入待测血清：每孔加入10μL待测血清，37°C温箱作用1.5～2h； 
洗涤：同上； 
加入酶标二抗：将酶标二抗按工作浓度稀释后，每孔加入100μL，37℃温育1.5～2h； 
洗涤：同上； 
显色：每孔加入底物显色液100μL，室温条件下避光显色15min，观察显色反应； 
终止：每孔加终止液50μL，立即用酶标仪测定OD450nm吸光光度值。 
结果判定：当待测血清OD450nm值/阴性对照OD450nm值≥2.0时，判定为阳性。 
各实验组免疫后，每周心脏采血，利用ELISA方法检测鲤鱼血清中的KHV特异性抗体。结果由表1所示，对鲤鱼进行免疫后，注射重组质粒的鲤鱼血液中均可检测到KHV的特异性抗体，加强免疫后抗体水平随免疫次数的增加而增高；对照组没有检测到KHV的特异性抗体，与免疫重组质粒组相比抗体水平差异显著(p＜0.05)；三组免疫剂量梯度实验，1μg/尾的免疫剂量便可获得较好的抗体水平，10μg/尾和50μg/尾免疫剂量可稍提高抗体水平，但三者差异不显著(p＞0.05)； 
表1 鲤鱼血清ELISA抗体水平检测(OD450) 
2.中和实验检测抗体效价 
采用固定病毒稀释血清方法，测定重组质粒免疫后各试验组鲤鱼血清中抗KHV中和效价。在鲤鱼初免前及初免和加强免疫期间每周心脏采血，共采血7次，在MFC细胞上进行血清中和试验，实验结果如表2所示，肌肉注射PBS、空载体和空白对照组鲤鱼没有产生中和抗体，重组质粒免疫组鲤鱼均产生了相应的中和抗体。 
表2 中和试验检测鲤鱼血清KHV抗体结果 
  组别   PBS   PIRES   空白组   pIRES ORF25
  免疫前   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2
  一免后一周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:4
  一免后两周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:8
  两免后一周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:32
  两免后两周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:32
  三免后一周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:64
  三免后两周   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:2   ＜1:128
3.攻毒实验检测抗体保护效果 
(1)统计保护率 
三免疫后两周用100TCID50的KHV对各组鲤鱼胸腔攻毒，用加热棒将水族箱内温度调至25℃左右， 
三免疫后两周用100TCID50的KHV对各组鲤鱼胸腔攻毒，将水族箱内温度调至25℃左右，每日观察并记录鲤鱼死亡条数，计算保护率。由表3可以看出，注射PBS、pIRES和空白实验组鲤鱼分别死亡40尾、38尾和39尾，保护率分别为0%、5%和2.5%；而注射pIRES-25实验组40条鲤鱼死亡6条，保护率为85%。说明构建的核酸疫苗pIRES-25具有较好的KHV保护效果。 
表3 攻毒后保护率统计结果 
  组别   PBS   pIRES   空白组   pIRES-ORF25
  鲤鱼数(尾)   40   40   40   40
  死亡数(尾)   40   38   39   6
  保护率(%)   0   5   2.5   85
(2)制备病理切片 
接种病毒后，待前三组对照组有鱼开始死亡时，在每组中随机选择三条鲤鱼处死后选取鳃、肾脏、肝脏和脾脏组织用0.4%的中性甲醛固定，制作石蜡切片，经H.E染色后，在显微镜下100倍观察组织的病理变化。 
研究对照组鲤鱼和免疫鲤鱼在攻毒后腮组织病理情况，结果如图5所示，注射PBS组、注射pIRES-neo空载组以及空白组的鲤鱼鳃组织结构几乎消失，而注射pIRES-ORF25的免疫组鲤鱼的鳃薄片稍微减少； 
研究对照鲤鱼和免疫鲤鱼在攻毒后肾脏组织病理情况，如图6所示，注射PBS组、注射pIRES组以及空白组的鲤鱼肾脏出现出现间质性炎症，而注射pIRES-ORF25的免疫组鲤鱼的肾脏无明显症状； 
研究对照鲤鱼和免疫鲤鱼在攻毒后脾脏组织病理情况，如图7所示，注射PBS组、注射pIRES组以及空白组的鲤鱼脾脏细胞发生水泡变性，有轻度出血，而注射pIRES-ORF25的免疫组鲤鱼的脾脏无明显症状； 
研究对照鲤鱼和免疫鲤鱼在攻毒后肝脏组织病理情况，如图8所示，注射PBS组、注射pIRES组以及空白组的鲤鱼肝脏细胞发生水泡变性，而注射pIRES-ORF25的免疫组鲤鱼的肝脏细胞无明显症状。 
Figure IDA00002463477600011
Figure IDA00002463477600021
Figure IDA00002463477600031

Claims (3)

1.一种锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，其特征在于，是将ORF25基因克隆到真核表达载体pIRES-neo中得到pIRES-ORF25重组质粒。
2.根据权利要求1所述的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，其特征在于，所述ORF25基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的锦鲤疱疹病毒ORF25核酸疫苗，其特征在于，所述ORF25基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
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