CN101302524A - 弓形虫多表位基因与霍乱毒素ctxa2/b亚基的融合基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种弓形虫多表位基因及其与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，同时还公布了所述基因在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。利用本发明所述融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合基因，尤其涉及一种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因(该基因是编码弓形虫多表位肽和霍乱毒素CTXA2/B亚基的核苷酸序列)，及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
背景技术
弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生原虫，其能引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫是单细胞生物，但其生活史的复杂性，形态的多样性，入侵宿主的广泛性，造成其不同性质抗原的免疫性以及致病分子的机制均不相同。目前，弓形虫病的治疗并无特效药物，研制廉价、安全、有效的弓形虫疫苗无疑是预防和控制弓形虫病的最好途径。
动物和人体实验均表明，单一抗原成分为基础的疫苗，往往因为其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体(MHC)限制性比较大，对形态多变、抗原成分复杂的虫体，难以形成有力攻击。选取某些强保护性抗原中含T淋巴细胞和(或)B淋巴细胞表位构成的多表位疫苗，是新近发展起来的的疫苗研制趋势。
表位是组成蛋白质的抗原决定簇，是抗原分子表面决定该抗原特异性的特殊化学基团，即抗原分子表面被抗体或T、B淋巴细胞特异性结和的部位。一个抗原可以含有多个表位，而能够引起免疫应答的只是其中部分表位。而且表位与表位之间的刺激能力并不相同。凡能够诱发强的免疫反应的表位叫做优势决定簇。如果把不同抗原的多个优势决定簇组合到一起，能够对免疫机体形成多层次、多特异性免疫保护，远大于单个抗原的保护力。
多表位基因在对抗原基因成分选择上具有广泛性，并且在具体操作上也因各种先进的分子生物学手段和完善的基因工程技术而成为可能，因此，选取弓形虫多表位基因作为诱导宿主免疫应答的主要靶点，具有高度的免疫原性和免疫保护性，此为制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗奠定了基础。但经检索，关于弓形虫多表位基因以及与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，及其它们在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用目前还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因及其制备方法，以及其在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
本发明所述弓形虫多表位基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息为：
(a)序列特征：
*长度：225碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：弓形虫(Toxoplasma gondii)
(f)序列描述：SEQ ID NO.1
atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60
gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attgaggagc tgttcaatcg tataccggaa 120
acaagcgtag gtaacgttgg ttcaactgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagactcg 180
tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcag 225
本发明所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，它具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；其所示信息为：
(a)序列特征：
*长度：740碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：弓形虫(Toxoplasma gondii)与霍乱毒素(Cholera toxin)
(f)序列描述：SEQ ID NO.2
atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60
gacgaggaca agggtcctgg agacgtcgtc attgaggagc tgttcaatcg tataccggaa 120
acaagcgtag gtaacgttgg ttcaactgaa gatagtgggc ttacaggcgt caaagaccgt 180
tcatccaagg gtattttgcc aaaattaact gagaacccgt ggcagggtac cagtaatact 240
tgcgatgaaa aaacccaaag tctaggtgta aaattccttg acgaatacca atctaaagtt 300
aaaagacaat atttttcagg ctatcaatct gatattgata cacataatag aattaaggat 360
gaattatgat taaattaaaa tttggtgttt tttttacagt tttactatct tcagcatatg 420
cacatggaac acctcaaaat attactgatt tgtgtgcaga ataccacaac acacaaatat 480
atacgctaaa tataagatat tttcgtatac agaatctcta gctggaaaaa gagagatggc 540
tatcattact tttaagaatg gtgcaatttt tcaagtagaa gtaccaggta gtcaacatat 600
agattcacaa aaaaaagcga ttgaaaggat gaaggatacc ctgaggattg catatcttac 660
tgaagctaaa gtcgaaaagt tatgtgtatg gaataataaa acgcctcatg cgattgccgc 720
aattagtatg gcaaattaa 740
本发明设计的弓形虫多表位基因所选取的基因片段为弓形虫速殖子、缓殖子的T、B细胞表位，作为诱导宿主免疫应答的主要靶点，具有高度的免疫原性和免疫保护性。
具体地讲是从弓形虫基因组中优选了5个高度保守的HLA识别多肽，并在各表位间用甘氨酸和脯氨酸分割以保证各表位基本独立。本发明设计的弓形虫多表位基因不但包含了具有T、B细胞刺激功能的保护性表位，还加入了CpG岛基序，有助于细胞免疫功能的发挥和T、B细胞间的协同作用。经过生物信息学分析，此多表位基因具有高度的抗原性，为诱导高效的免疫应答打下了良好的基础。
本发明所述的弓形虫多表位基因由invitrogen公司一次性合成。
本发明所述的弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因是通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得的：
首先，根据弓形虫多表位基因(MEG)与霍乱毒素基因(CTXA2/B)设计两对引物为：
MEG： P1：5’-CG GGATCC AAGCTT ATG ACC TGC CC-3’
P2：5’-GGTACC CTG CCA CGG GT-3’
CTXA2/B： P3：5’-GGTACC AGT AAT ACT TGC GA-3’
P4：5’-AC GAA TTC TTA ATT TGC CAT AC-3’
分别扩增弓形虫多表位基因MEG与霍乱毒素CTXA2/B基因片段。再以这两个基因为模板，以P1和P4为引物进行第二次PCR反应得到MEG-CTXA2/B融合基因。
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃，60s；55℃，30s，72℃60s，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增完毕，产物经1％琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观察结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的基因片断。
取上述纯化产物克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板培养；提取并纯化质粒，扩增质粒并测序。
本发明所述弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因在制备具有免疫原性的融合蛋白中的应用，进一步地在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
通过基因重组技术使所述融合基因在Hela细胞中进行表达，即获得具有免疫原性的重组蛋白。
如：将获得的弓形虫多表位与霍乱毒素A2/B亚基融合基因克隆到pVAX1(Novagen公司)表达载体，脂质体CellfectamineTM 2000介导重组真核表达质粒pVAX1-MEG转染Hela细胞。表达蛋白的SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析结果表明：pVAX1-MEG-CTXA2/B质粒瞬时转染的细胞在约40KDa处有一反应带，可以被鼠抗弓形虫血清抗体识别，而其他各组和未经转染的Hela细胞则无条带显色，从而证实了表达重组蛋白的抗原特异性。
由于表位多肽分子小，免疫原性较弱，且为直链结构，三维空间结构与完整蛋白不同；在体内半衰期短，难以刺激机体产生有效的免疫应答。研究证实，霍乱毒素(CT)经基因融合技术与不相关抗原形成偶联蛋白或融合蛋白时的免疫佐剂作用大大增强。本发明采用弓形虫多表位基因与A1毒性亚基缺失的霍乱毒素(CT)基因联合构建一种融合基因的方案，不仅能有效增强多表位基因的免疫原性，还能尽量减轻霍乱毒素(CT)的毒副作用，从而增强机体的免疫作用。
利用本发明的融合基因通过现有基因工程方法可以构建弓形虫核酸疫苗，用于弓形虫的预防和治疗。
实验证实：利用本发明的融合基因通过现有基因工程方法构建的重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B实验组小鼠特异性IgG、IgA抗体水平及脾细胞增殖活性和NK细胞活性均有显著提高，与BRD509、BRD509/pVAX1对照组及无CTXA2/B基因佐剂实验组相比均有显著提高(P＜0.05)，提示该重组融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗口服免疫后可激发小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫反应。免疫鼠抗攻击感染实验显示对照组的小鼠包括BRD509和BRD509/pVAX1口服免疫组小鼠都于攻击感染后6天内死亡。实验组中携带CTXA2/B基因佐剂的BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B口服免疫组较BRD509/pVAX1-MEG口服免疫组的生存时间大大延长(p＜0.05)，而且到16天仍有40％的生存率。表明本发明的融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。
附图说明
图1.融合基因重组质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B的构建及鉴定
其中：M1.核酸(DNA)分子量标准(Marker)
1.融合基因重组质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B EcoRI单酶切产物
2.融合基因重组质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B HindIII/EcoRI双酶切产物
3.MEG的PCR产物
4.CTXA2/B的PCR产物
M2.核酸(DNA)分子量标准(Marker)。
图2.融合基因真核表达产物的Western-blotting分析
其中：M.蛋白分子量标准(Marker)
1.融合基因在Hela细胞中的表达
2.无转染Hela细胞。
图3.免疫鼠血清IgG抗体测定。
图4.免疫鼠血清IgA抗体测定。
图5.MTT法免疫鼠脾淋巴细胞增殖活性的测定。
图6.免疫鼠NK细胞杀伤活性的测定。
图7.免疫鼠抗弓形虫感染的生存曲线。
具体实施方式：
实施例1弓形虫多表位抗原基因片段的获得
1.弓形虫多表位抗原基因选择和设计
从弓形虫速殖子期特异性抗原SAG1及速殖子缓殖子两期共有抗原ROP2、GRA1及GRA4中选取含T和(或)B细胞表位的共5个抗原片段，分别是相当于弓形虫速殖子表面抗原SAG1的59-67位氨基酸的肽片段和246-256位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫棒状体ROP2的199-216位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫致密颗粒蛋白GRA1的176-186位氨基酸的肽片段；相当于弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的235-245位氨基酸的肽片段；此外为了进一步提高本研究中复合多肽的免疫原活性，加入了CpG基序。借助甘氨酸和脯氨酸接头将表位肽连在一起。多基因序列命名为MEG。
弓形虫多表位基因的来源见下表：
2.弓形虫多表位抗原基因的生物信息学分析
用DNAstar软件对弓形虫多表位基因所编码氨基酸蛋白的二级结构、结构域、跨膜区域、亲水性及蛋白质骨架区的柔韧性进行预测分析。
3.弓形虫多表位抗原基因的合成
由invitrogen生物技术有限公司一次性合成，其序列如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
实施例2MEG-CTXA2/B融合基因的获得
引物设计与合成
MEG： P1：5’-CG GGATCC AAGCTT ATG ACC TGC CC-3’
P2：5’-GGTACC CTG CCA CGG GT-3’
CTXA2/B：P3：5’-GGTACC AGT AAT ACT TGC GA-3’
P4：5’-AC GAA TTC TTA ATT TGC CAT AC-3’
由invitrogen生物技术有限公司合成。
1)以P1和P2，P3和P4为引物，MEG和CTX基因序列为模板，扩增MEG和CTXA2/B基因。PCR扩增体系为：10×不含Mg2+buffer扩增缓冲液5μl，MgCl2(25mM)4μl，dNTPs(10mM)1μl，上下游引物各1μl，上述MEG和CTXA2/B基因各1μl，TaqDNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加灭菌水至50μl。
反应条件：94℃预变性5min，94℃，60s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后72℃延伸10min。扩增完毕，产物经1％琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观察结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的基因片断。
2)以回收的MEG和CTXA2/B为模板，以P1和P4为引物进行PCR反应
PCR扩增体系为：10×不含Mg2+buffer扩增缓冲液5μl，MgCl2(25mM)4μl，dNTPs(10mM)1μl，上下游引物各1μl，上述MEG和CTXA2/B基因各2μl，TaqDNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加灭菌水至50μl。
反应条件：94℃预变性5min，94℃，60s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后72℃延伸10min。扩增完毕，产物经1％琼脂糖电泳、EB染色后，紫外透射仪上观察结果。用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的片断。
3)PCR产物的克隆和序列分析
采用TA克隆方法克隆PCR产物，并将克隆转化菌株送公司进行测序。
实施例3重组融合基因表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达
1.重组质粒的构建
将融合基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用HindIII/EcoRI双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将含目的基因的pMD-18T载体及表达载体pVAX1(购自Invitrogen公司)双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，用Omega公司质粒提取试剂盒提取重组质粒，进行酶切、PCR鉴定和测序分析，见图1。
2.脂质体CellfectamineTM 2000介导重组真核表达质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B转染Hela细胞
(1)转染前一天，胰酶消化生长状态良好的Hela细胞，显微镜下计数，按1～3×105细胞/孔传至24孔板，以使次日转染时，细胞达到90～95％丰度。每孔加入0.5ml完全培养基。
(2)转染在无血清无抗生素的1640培养基中进行，反应体系如下：
A1液：取pVAX1-MEG-CTXA2/B质粒DNA 5μl(0.8～1.0μg)，与50μl无血清无抗生素的1640培养基混合(实验组)；
A2液：取pVAX1(-)质粒DNA 5μl(0.8～1.0μg)，与50μl无血清无抗生素的1640培养基混合(对照组)；
B液：取CellfectamineTM 20002μl与50μl无血清无抗生素的DMEM培养基混合，室温孵育5分钟；
将A液与B液轻轻混合，轻弹管壁混匀，室温下放置不超过5分钟，以形成DNA-脂质体复合物。
(3)同时，用无血清无抗生素的1640培养基洗细胞3次，每孔再加入100μl的无血清无抗生素的1640培养基。
(4)复合物形成后，将其加入孔内，注意不要直接加到细胞面上，将培养板前后轻轻晃动使分布均匀。37℃孵育4～6小时，期间每隔半小时轻晃24孔板，让cellfectamine均匀分布。
(5)将转染液移去，用无血清无抗生素的1640培养基洗细胞1次，换为1640完全培养基2ml，37℃，5％CO2培养48小时。
(6)瞬时转染
转染48小时后，分别收集实验组(重组质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B的Hela细胞)和对照组(pVAX1空质粒转染的Hela细胞)，即为瞬时转染的细胞。首先吸去培养上清，用灭菌PBS漂洗细胞2次，用胰酶消化细胞，加入4mlPBS，每两孔收集到一个无菌10ml离心管中，800rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用400μl PBS重悬，移至灭菌EP管中，加100μl 2×SDS-凝胶加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10分钟，裂解细胞，-70℃冻存样品，备用。
(7)上样行SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜，进行Western-Blotting分析。一抗采用鼠抗弓形虫血清抗体对表达蛋白进行抗原性测定。见图2
实施例4重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗的构建
将1μl待转化质粒pVAX1-MEG-CTXA2/B加至100μl减毒鼠伤寒沙门氏菌S.BRD509感受态，温和混匀后，将混合物移至预冷的无菌电转化杯中，电转化条件：电压2500V，电容25μF，放电时间5ms。向转化混合物中加入600μl LB培养基，37℃温和振荡培养30分钟，取100μl涂板，37℃培养过夜。
挑取转化克隆，提取质粒，酶切和PCR鉴定。取阳性菌落分别接种到2ml LK培养基中，过夜振荡培养，次日按1∶100比例加入到100mlLA培养基中，继续震荡培养到OD600为0.8，然后用NS洗涤和沉淀菌体，调整浓度为1-5×109cfu。
pVAX1和pVAX1-MEG质粒同时转化减毒鼠伤寒沙门氏菌S.BRD509感受态，作为对照。
实施例5动物实验
将SPF级BALB/c鼠随机分成4组，每组10只，分别为BRD509对照组、BRD509/pVAX1和BRD509/pVAX1-MEG和BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B免疫组。免疫前4h小鼠禁水禁食，在口服100μl 10％NaHCO330min后，将在LA培养基中过夜培养到A600为0.8的重组沙门氏菌菌液离心并重悬于NS中，每只小鼠经胃灌入200μl 109cfu的菌液。每2周免疫1次，共3次。分别于每次免疫前和免疫后2周、4周尾静脉或眼底取血分离血清，用梯度稀释ELISA法测定免疫鼠血清IgG及IgA抗体水平。免疫后4周取鼠脾脏分离脾细胞，MTT法进行脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性测定。免疫后6周，每只免疫小鼠经腹腔注射0.1ml103/ml弓形虫RH株速殖子，每组5只，观察小鼠抗攻击感染的存活时间。
检测结果如图3-6所示。
重组融合基因减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B实验组小鼠特异性IgG、IgA抗体水平及脾细胞增殖活性和NK细胞活性均有显著提高，与BRD509、BRD509/pVAX1对照组及无CTXA2/B基因佐剂实验组相比均有显著提高(P＜0.05)，提示该重组融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗口服免疫后可激发小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫反应。
免疫鼠抗攻击感染实验显示对照组的小鼠包括BRD509和BRD509/pVAX1口服免疫组小鼠都于攻击感染后6天内死亡。实验组中携带CTXA2/B基因佐剂的BRD509/pVAX1-MEG-CTXA2/B口服免疫组较BRD509/pVAX1-MEG口服免疫组的生存时间大大延长(p＜0.05)，而且到16天仍有40％的生存率。以上结果表明该弓形虫融合基因构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗可有效地保护小鼠抵抗弓形虫速殖子的攻击，是一种理想的弓形虫口服疫苗。
序列表
<110>山东大学
<120>弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因及应用
<141>2008-4-30
<160>2
<210>1
<211>225
<212>cDNA
<213>弓形虫(Toxoplasma gondii)
<221>弓形虫多表位基因
<222>(1)…(225)
<400>1
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<211>740
<212>cDNA
<221>弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因
<222>(1)…(740)
<400>2
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Claims (3)
1.一种弓形虫多表位基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其序列是：
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2.一种弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因，它具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；其序列是：
atgacctgcc cagataaaaa atcgacagcc ggtccggata ctatgaaaag catgcagagg 60
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3.权利要求2所述弓形虫多表位基因与霍乱毒素CTXA2/B亚基的融合基因在制备预防和治疗弓形虫病核酸疫苗中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100157534A CN101302524A (zh) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | 弓形虫多表位基因与霍乱毒素ctxa2/b亚基的融合基因及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008100157534A CN101302524A (zh) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | 弓形虫多表位基因与霍乱毒素ctxa2/b亚基的融合基因及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101302524A true CN101302524A (zh) | 2008-11-12 |
Family
ID=40112627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008100157534A Pending CN101302524A (zh) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | 弓形虫多表位基因与霍乱毒素ctxa2/b亚基的融合基因及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101302524A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101948911A (zh) * | 2010-08-27 | 2011-01-19 | 宁波基内生物技术有限公司 | 用于检测弓形虫的引物、试剂盒及方法 |
| CN102827292A (zh) * | 2012-09-19 | 2012-12-19 | 南京医科大学第二附属医院 | 一种融合蛋白TgMEP及其制备方法和应用 |
| CN104117072A (zh) * | 2014-07-18 | 2014-10-29 | 山东大学 | 一种用于预防弓形虫病的多价腺病毒疫苗 |
-
2008
- 2008-04-30 CN CNA2008100157534A patent/CN101302524A/zh active Pending
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081112 |