CN102532324B

CN102532324B - 布氏杆菌基因工程亚单位疫苗的制备及其应用

Info

Publication number: CN102532324B
Application number: CN201010613052.8A
Authority: CN
Inventors: 李殿明; 蒲勤; 李毅; 赵明; 田春辉; 齐春梅; 顾富香
Original assignee: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGDAO MINGQIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: CN102532324A

Abstract

本发明属于涉及一种用于预防布氏杆菌(Brucella)感染的融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体而言，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含布氏杆菌L7/L12蛋白ORF、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签，本发明还涉及该融合蛋白的制备方法和药学应用。

Description

布氏杆菌基因工程亚单位疫苗的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及用于免疫的融合蛋白，用于预防牛布氏杆菌的感染，其由布氏杆菌L7/L12蛋白ORF、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位、T细胞抗原表位及纯化标签序列组成，及其制备方法及应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患的传染变态反应性疾病。1886年英国军医Bruce在马尔他岛，从死于马尔他热的士兵脾脏中分离培养到该细菌，当时称为马尔他微球菌(Micrococcuss melitensis)。布鲁氏菌属细菌大多数种型对人畜是有致病性的，布氏菌可通过皮肤、呼吸道和消化道进入体内而感染。进入体内后，首先侵犯局部淋巴结，并在其内寄生繁殖，形成原发病灶，继而细胞破裂进入血流，造成血行播散，出现一时性菌血症和毒血症，血流中的细菌留存于淋巴结、肝、脾和骨髓等处。在细胞内繁殖，出现多发性转移病灶，释放内毒素，造成发热，并累及多个器官的损伤。在羊、牛、猪中，主要侵犯生殖器和乳腺组织，造成流产或早产。此病在世界170多个国家和地区存在人畜间布病流行，约占世界1/5～1/6的人受布病威胁，全世界布病患者约有500～600万人，每年造成的经济损失高达数十亿美元。而且此病还对人类健康造成严重威胁。年新发病人数为50万。

布鲁氏菌分布不仅地区广，而且寄生的宿主也相当广泛。它们既可感染人和多种家畜，又可感染和寄生于60多种野生动物，布氏菌属细菌有6个种19个生物型组成。目前已检测出几十株布鲁氏菌噬菌体，依其对布鲁氏菌作用的特点，可分为6群：1群有Tb、A422；2群有Fi；三群有Wb、D、M51等；4群有BK；5群有R、Ro、Rc等；6群有Iz。其中特异性最高的为Tb和R群。它们在布氏菌分类中有重要意义。

布鲁氏菌疫苗的应用现状

1.1羊种布氏杆菌Rev.1疫苗Rev.1被认为是一种毒力减弱株，属于光滑型。对牛、羊布氏杆菌均具有免疫保护力。此菌株作为疫苗仍具有一定的毒力，并且在适当的条件下，毒力可以完全恢复。大量的动物试验结果显示，由Rev.1引起的流产率比$19(S19低于1)略高，而对于某些毒力变异株，其致流产率可能更高。

1.2牛种布氏杆菌19(B.abortus strain 19。S19)疫苗该疫苗制造用菌株是1923年从牛奶中分离获得的，并在实验室培养过程中致弱。菌株中含有0链的脂多糖(LPS)能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，历史上最广泛应用的布氏杆菌疫苗为$19，属于牛种布氏杆菌的一种。1923年在牛奶中以有毒株发现，但在实验室培养过程中却成为减毒株。菌体中含有0链的LPS能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但该菌株能传染人，并会引起怀孕母畜的流产，在公畜中也限制使用。

1.3牛种布氏杆菌45/20(B abortus strain 45/20，45/20)疫苗该疫苗制造用菌株是1922年从病牛体中分离，后经豚鼠20次传代后获得粗糙型的减毒株。其优点是LPS结构中无0链，因此免疫动物以后，在其体内检测不到0链的抗体，从而可以避免干扰诊断。该菌株作为疫苗的免疫机制仍不清楚，有人推断LPS中残留的小量0链在起作用，也有人认为菌体的一些其它有效蛋白刺激了机体的细胞免疫，但这些猜测都缺乏直接有效的证据。粗糙型的45/20疫苗株最严重的问题是该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，使其毒力恢复为强毒，因此其作为疫苗的安全性仍有争议。

1.4粗糙型牛种布氏杆菌株51(Rough strain B.abortus51，RBS1)疫苗粗糙型菌株45/20对牛种布氏杆菌感染动物具有明显的保护力这一事实说明：粗糙型布氏杆菌体组织可作为引起机体免疫保护的有效抗原，关键是如何找到一株稳定性良好的粗糙型突变菌株。多年的实该疫苗株最初由光滑型牛布氏杆菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得。具有利福平抗性的RBS1是当前应用最为广泛的疫苗。多年的实践证明其免疫力和保护力均优于S19，并克服了以往疫苗的一些弱点。

1.5猪种布氏杆菌S2疫苗(B.suis strain 2。S2)该疫苗是用中国分离株制造的，其毒力比S19和Rev.1弱，对猪、牛和羊均能产生良好的免疫。由于其毒力较弱，可以通过口服或肌注的方式进行免疫，并且不会导致怀孕母畜的流产，因此在我国被广泛使用。虽然有研究认为，S2的保护率较S19和Rev.1低约10～20，但大量的动物试验表明，S2能够提供令人满意的保护率，对超强毒的马尔他型(B.meliten-sis)布氏杆菌的攻击能提供40～60的保护。VTRM1(羊种布氏杆菌突变株Rough mutant B.melitensis 16M)、VTRS1(猪布氏杆菌突变株Roughmutant B.suis)RB51让人们意识到，或许羊种布氏杆菌及猪种布氏杆菌粗糙型作为疫苗都有良好的保护性，利用wboA基因断裂将R1构建成VTRM1，因其在机体中可以长期存在并可引起强烈的CMI，故对机体的保护力大于RB51。对于VTRM1和VTRS1的进一步研究仍在进行中。

近年兴起的基因工程亚单位免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。Blanco的研究发现，含有T细胞表位的多肽能增强Th细胞的活性，并协同诱导机体产生抗病毒抗体(Blanco E，J Virol.2001；75(7)：3164-74)。目前，尚没有见到针对布氏杆菌基因工程亚单位免疫疫苗，为了有效预防布氏杆菌，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防布氏杆菌。本发明提供了提供了一种新的能用于融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防布氏杆菌的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的能用于免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防布氏杆菌的感染。本发明还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此外，本发明还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸以及制备该融合蛋白的方法等。

在第一个方面，本发明提供了一种用于免疫的融合蛋白，其含有布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位和T细胞抗原表位。其中，所述布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位指的是具有免疫原性的布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位中的主要多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位SEQ ID No.8。所述的布氏杆菌BLS蛋白的亚单位或其具有基本相同功能的功能等价物，优选是如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的T细胞抗原表位指的是能够能增强Th细胞活性的抗原表位，优选是如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或其功能等价物。

本文中所用的术语“融合蛋白”是指多个蛋白质或多肽分子连接到一起所形成的新的蛋白质或多肽或其药学上可接受的盐。连接可以通过公知的遗传工程或化学合成方法来进行，优选通过遗传工程方法，即通过重组DNA技术来实现多个蛋白质或多肽分子的融合。本发明的融合蛋白中亦可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它们可以延长融合蛋白的体内代谢时间，加速生物体对融合蛋白的吸收，增强融合蛋白的稳定性等。当用基因工程手段表达本发明的融合蛋白时，根据生产中所使用的宿主细胞的不同，如原核(细菌细胞)或真核(酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物乳腺反应器)，本发明的融合蛋白可以是糖基化的、也可以是非糖基化的。“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。

本文中所用的术语“功能等价物”指的是与原有多肽或蛋白质的活性基本相同的变异体多肽。该变异体多肽是在原有多肽或蛋白质序列中变异一个或几个氨基酸残基而获得的多肽，优选是变异一个至五个氨基酸残基而获得的多肽，更优选是变异一个至三个氨基酸残基而获得的多肽。变异可以通过缺失、插入和/或用其他氨基酸取代序列上的原氨基酸残基来实施。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在变异的氨基酸残基中，优选变异为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。

本文中所用的术语“基本相同”指的是功能等价物的活性相对于与原有多肽或蛋白质的活性基本不减弱，优选活性可降低不到30％，更优选可降低不到10％，最优选不减弱。目前已经存在大量检验诸如免疫原性、佐剂功能或增强Th细胞活性能力的实验方法，必要时也可根据本发明实施例所述的具体方法，通过诸如基因工程手段将原有多肽或蛋白质部分替换为相应的功能等价物，由此来选出合适的功能等价物。

优选在本发明第一方面的融合蛋白中，所述的布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位的氨基酸序列选自SEQ ID No.8，其中所述的布氏杆菌BLS蛋白的亚单位的氨基酸序列为SEQ ID No.12；其中所述的T细胞抗原表位的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

更优选，本发明第一方面的融合蛋白进一步含有纯化标签和/或接头肽。纯化标签(Tag)通常为特定的蛋白质或连续的几个氨基酸序列，其可以与相应结合物质产生特异性结合。因而当融合蛋白中含有纯化标签时，可以较容易地利用其结合性质来对融合蛋白进行纯化和鉴定。目前已经有很多纯化标签可以使用，有些已经商品化了，如His标签、FLAG标签、Myc标签、-半乳糖苷酶标签、蛋白A标签、GST(谷胱甘肽硫转移酶)标签等。本发明的纯化标签优选是His标签，更优选是氨基酸序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。接头肽(也称“连接子”)是起连接融合蛋白中各活性成分的不超过20个氨基酸残基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。优选接头肽不超过10个氨基酸残基大小。本发明可使用接头肽连接在本发明中的布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位、布氏杆菌BLS蛋白的亚单位和纯化标签之间，也可以不使用连接肽而让上述活性成分直接。例如，本领域的技术人员所公知的接头肽的序列有：

(1)、Ala_n，n＝2-10

(2)、Gly_n，n＝2-10；

(3)、Gly_n-Ser，n＝2-10

(4)、(Gly_n-Ser)_m，m＝2-3；n＝2-10

(5)、Gly_n-Ser-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(6)、Gly_n-Pro-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(7)、(Ala-Gly)n，n＝1～10；

(8)、(Gly-Ala)n，n＝1～10；

(9)、Gly_n-Ala-Gly_m，m＝0-10；n＝0-10

(10)、Ala_n-Gly-Ala_m，m＝0-10；n＝0-10

(11)、上述序列的任意组合形式。

本发明第一方面的融合蛋白优选含有一个布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位、一个T细胞抗原表位、1个布氏杆菌BLS蛋白的亚单位和1个纯化标签，其中纯化标签连接在布氏杆菌BLS蛋白的亚单位的C端。本发明的融合蛋白优选含有布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位和一个T细胞抗原表位，本发明的融合蛋白含有布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的亚单位的一个具有广泛代表性的亚单位分子和一个T细胞抗原表位。融合蛋白中各活性成分的排列次序(其中，ORF代表布氏杆菌布氏杆菌L7/L12蛋白的抗原亚单位，T代表T细胞抗原表位，Tag代表纯化标签)可以是如下次序：T-ORF-T-BLS-Tag

另外优选，本发明第一方面的融合蛋白的氨基酸序列

a)如SEQ ID No.2所示；

或b)是对SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、缺失或插入了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。

在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的融合蛋白。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞已用本发明第三个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种用于免疫的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，能预防布氏杆菌的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。这些组合物包含不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其它物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、CpG序列等。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防布氏杆菌的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第五个方面所述的药物组合物在制备预防布氏杆菌的药物中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量给药，有效地保护了实验动物。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pPICBMDORFBLS的示意图。

图2显示了重组表达载体pPICBMDORFBLS用EcoRI+XbaI酶切后的电泳结果，其中左边为酶切产物，右边为DNA分子量标准(从下到上依次对应：200bp、400bp、750bp、1kb、1.5kb、2kb)。

图3显示了融合蛋白编码基因的表达产物的纯化和分析鉴定结果，其中左边第1道为蛋白分子量标准，第2道为发酵培养液上清，第3道为用60％饱和度硫酸铵沉淀纯化后的样品，第4道为用金属鏊合层析纯化后的样品；右边第1道为用金属鏊合层析纯化后的样品的Western印迹的结果，右边第2道为配制成制剂后的样品的Western印迹的结果。

图4A为肌肉注射免疫后血清中IgG抗体水平；该图用于显示活性测定/动物实验分析的结果。

图4B分肌肉注射免疫后血清中IgA抗体水平；，该图用于显示活性测定/动物实验分析的结果。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一融合蛋白基因的来源

整个融合蛋白的编码基因按大肠杆菌偏好的密码子人工设计，并命名为ORF-BLS片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第1-969位的核苷酸序列交由上海英俊生物技术公司合成，SEQ ID No.1中970-1035位的核苷酸序列是由Invitrogen公司的载体pPICZalpha A的1277-1340位的核苷酸序列提供的。ORF-BLS片段两端分别设计了EcoRI(5’端)和XbaI(3’端)限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把这个片段合成好后克隆到pMD18T载体上，转化大肠杆菌，分别提取测序正确后，把这个命名为pMD18T-ORF-PBLS重组质粒的大肠杆菌寄给本公司。

实施例二融合蛋白酵母表达载体的构建

将含有命名为pMD18T-ORF-PBLS重组质粒的大肠杆菌菌株，接种到含氨苄青霉素50mg/L的10mlLB培养基中，将含有毕赤酵母分泌表达载体pPICZalphaA(购自Invitrogen公司)的大肠杆菌菌株，接种到含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按照Qiagen公司质粒提取试剂盒使用手册，分别提取质粒。含融合片段编码基因的重组质粒分别用片段两端对应的限制性内切酶进行处理，毕赤酵母分泌表达载体pPICZalpha A用EcoRI和XbaI处理，具体处理条件：10l反应体系，体系内加入2l质粒，各限制性内切酶分别使用5个活性单位(New England biolabs)，加入10×缓冲液1l，用去离子水补齐，37℃酶切2小时。酶切结束后，加1l 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。在紫外灯下，分别切下电泳凝胶中载体pPICZalpha A对应的约3.6kb条带和pMD18T-ORF-PBLS片段各自对应的约800bp条带，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体和片段1∶1～3的比例将片段和表达载体混合，反应体系15l，由T4DNA连接酶进行连接，4℃或16℃连接过夜。按照常规方法(氯化钙法)转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，铺于含Zeocin 25mg/L的低盐LB平板，37℃倒置过夜。

低盐LB的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌；

低盐LB平板的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，琼脂15g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入Zeocin至终浓度25mg/L，铺平板，保存于4℃备用；

挑取平板上的单克隆，接种于低盐LB培养基中，过夜培养，按照常规方法提取质粒，EcoR I和Xba I进行双酶切鉴定。酶切鉴定阳性的克隆(鉴定结果见图2)，留存甘油菌种，储存于超低温冰箱中。同时进行序列测定，以确保克隆正确无误。筛选得到的酵母分泌表达载体命名为：pPICBMDORFBLS(见图1)。

实施例三融合蛋白表达菌株的构建与筛选

接种上述阳性克隆至50ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，8-12小时后，转接于500-1000ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，过夜培养，大量提取质粒，备用。

线性化DNA的制备：在100l反应体系中，加入20g上述提取的DNA，加入Pme I 20∪(New England biolabs)，去离子水补齐。37℃酶切3小时。取2l酶切产物，1％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切是否完全。确认线性化完全后，将余下的酶切产物加入2l 200mM EDTA，终止反应。

线性化DNA的纯化：在上述酶切体系中，加入100l去离子水，加入等体积酚/氯仿，剧烈振荡混匀，13000rpm高速离心10分钟，将上层转入新管，加入1/10体积3M醋酸钠，再加入2.5倍体积无水乙醇，混匀，-70℃冰箱中放置1小时，4℃离心，13000rpm，15分钟，弃液体，以80％乙醇洗涤一次，空气中晾干，重新溶解在10l去离子水中，准备电融合。

酵母菌感受态细胞的准备：在5ml YPD培养基中接种Pichia pastoris宿主菌(购自Invitrogen公司)KM71H、GS115和X-33，30℃振荡培养过夜，次日转接入500ml新的YPD培养基中，转接量约0.1～0.5ml(根据酵母菌生长状态)，30℃继续培养，直至OD₆₀₀达到1.3～1.5为止。离心收菌，4℃条件下，1500rpm，离心8分钟，弃上清，以预冷的500ml无菌去离子水，重新悬浮，再次离心，条件同上，以250ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，再以20ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，最后重新用1ml预冷的1M山梨醇悬浮，置冰上，待用。

酵母菌的电融合：将80l上述感受态细胞与5l(约10g)线性化DNA混合均匀，转入预冷的0.2cm电融合杯中，冰上放置5分钟。电融合条件如下：1500V，25F，20Ω。电击后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇，混合，再转入一个15ml培养管中，30℃孵育2小时。取200l分别铺于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上(含Zeocin 200g/ml，500g/ml，1000g/ml)，倒置，30℃培养2天。

培养基和平板准备：

YPD培养基：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，储存于4℃。

YPDS平板(含Zeocin 100g/ml为例)：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，182.2g山梨醇，20g琼脂，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，加入1ml 100mg/ml的Zeocin，铺平板，储存于4℃。

克隆筛选：挑取各高浓度Zeocin平板上的克隆10个，接种于100ml BMGY培养基中，30℃振荡培养16～18小时，当OD₆₀₀达到2～6之间时，离心收菌，3000g， 8分钟，弃上清，用20ml BMGY培养基重新悬浮，继续培养，并加入100％甲醇0.1ml至终浓度0.5％，每隔24小时补加一次，每次0.1ml。在加入甲醇后的48小时、72小时和144小时，分别取样2ml，离心，取上清50l，与等量的SDS-PAGE 2x载样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟，13000rpm，离心10分钟，取15l，行10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，观察结果。挑取高表达克隆进行表型鉴定。用布氏杆菌阳性血清进行Western鉴定。最后筛选得到高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌，命名为：pPICBMDORFBLS/GS115。

实施例四工程菌的发酵

对高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌pPICBMDORFBLS/GS115的生长表达条件进行了优化，确定了有利于工程菌生长和表达的培养基、补料培养基、碳源(0.5％甘油)、培养基和补料培养基的碳氮比、pH(4～7，较佳的为5.0)、诱导剂甲醇的最适浓度范围(0.5％)等。成功的建立了工程菌pPICBMDORFBLS/GS115的溶氧反馈高密度发酵工艺，使疫苗的理论分泌表答水平达到0.8～1.5克/升发酵液。

实施例五融合蛋白的纯化

发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用30～75％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用10～50mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用金属鏊合亲和层析进行进一步纯化，分离介质一般选用Co²⁺、Zn²⁺或Gu²⁺金属鏊合亲和分离介质，可以采用pH梯度洗脱和咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱或透析处理进行脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用，或真空冷冻干燥后储藏备用。

具体实施中的纯化工艺为：发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用60％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用20mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用Zn²⁺金属鏊合亲和分离介质，采用咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用(纯化结果见图3)。经过该工艺处理后的重组疫苗蛋白，蛋白纯度大于95％，终产率在0.6～0.9克/升发酵液，终产品达到无菌无热源，而且稳定性良好。后又通过用布氏杆菌阳性血清进行Western鉴定跟踪检测，确定的疫苗冻干和稳定保护剂，建立了冻干工艺。

实施例六重组疫苗免疫对牛的免疫效力研究

将25周龄牛随机分为组，10只/组，第一组经颈部肌肉注射接种2000微克(1mL，2mg/mL)重组疫苗，第2组为对照组，注射1mL PBS溶液。2周后，同等剂量同样方法加强免疫一次，再过2周，同等剂量再加强免疫一次。最后一次免疫7 天后，采用肌肉注射和皮下注射，每只牛分别用100倍的半数致死剂量的布氏杆菌进行攻毒。观察四肢是否出现症状，连续观察14天。

将4周龄SPF级Balb/c雌性小鼠随机分为组，20只/组，采用肌肉注射免疫途径。对于肌肉免疫，每只小鼠免疫2微克(100μL，0.02mg/mL)重组疫苗。2周和4周后，同等剂量分别加强免疫一次。每次免疫后，隔14天采用眼睛或者心脏采血，分离血清。取上清-70℃保存备用。

利用ELISA检测小鼠血清中的抗ORF-BLS IgG和IgA抗体。用纯化的ORF-GST(终浓度1μg/mL)，利用原核表达载体pGEX-6P-1表达)包被酶标板(Nunc，Denmark)；用2.5％Casein封闭后，加倍比稀释的血清。加羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物每)(sigma)二抗检测IgG抗体，加羊抗鼠IgA-HRP(sigma)二抗检测IgA抗体。用OPD作为底物显色。2M H₂SO₄终止反应，酶标仪490nm判读。IgG和IgA终点的判断采用文献(O’Dowd et al.1999)报道的方法进行，即血清中IgG抗体终点＝免疫血清的最大稀释度≥2(没有免疫的正常小鼠血清)；鼻或者肺冲洗物中IgG抗体终点＝冲洗物最大稀释度≥2(没有免疫的正常小鼠鼻或者肺冲洗物)。

保护率＝[(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×i00％]。

实验结果显示：

血清中的抗ORF-BLS IgG抗体如图4A所示。

血清中的抗ORF-BLS的IgA抗体如图4B所示。

采用肌肉注射免疫途径分别免疫3次后，用100倍的半数致死剂量的布氏杆菌进行攻毒，保护率如表1所示。肌肉注射免疫效果很好，保护率即可达到90％。对照组用PBS免疫，攻毒后全部发病。

表1.重组VP1-LTB融合蛋白免疫后对受试动物(猪)的保护效应

免疫途径	保护率(n＝10)
		肌肉注射	(9/10)100％

Claims

1.一种用于免疫的融合蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种核酸分子，核酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码权利要求1所述蛋白的氨基酸序列。

3.一种用于预防布氏杆菌病的药物组合物，包括权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

4.权利要求3所述的药物组合物，其为注射剂型、喷雾型或作为饲料添加剂的剂型。

5.权利要求1所述的融合蛋白在制备布氏杆菌基因工程亚单位疫苗中的应用。