CN101624422A - 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用 - Google Patents

日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101624422A
CN101624422A CN200810040382A CN200810040382A CN101624422A CN 101624422 A CN101624422 A CN 101624422A CN 200810040382 A CN200810040382 A CN 200810040382A CN 200810040382 A CN200810040382 A CN 200810040382A CN 101624422 A CN101624422 A CN 101624422A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bsjgcp
bsj23
leu
gly
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200810040382A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101624422B (zh
Inventor
林矫矫
傅志强
章登吉
周伟芳
陆珂
石耀军
刘金明
李�浩
朱传刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Original Assignee
Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Veterinary Research Institute CAAS filed Critical Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority to CN 200810040382 priority Critical patent/CN101624422B/zh
Publication of CN101624422A publication Critical patent/CN101624422A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101624422B publication Critical patent/CN101624422B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了日本血吸虫重组多表位抗原BSjGCP－BSj23和BSjGCP－BSj23－BSj28的基因序列和表达、纯化方法及在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。重组多表位核酸疫苗pCMV－BSjGCP－BSj23和pCMV－BSjGCP－BSj23－BSj28在昆明系小鼠中分别获得了14.76％、64.95％的减虫率。重组多表位抗原pGEX－BSjGCP－BSj23和pGEX－BSjGCP－BSj23－BSj28免疫BalB/c小鼠获得了15.7％、57.99％的减虫率，作为诊断抗原分别获得了91.0％、89.9％的敏感性和97.8％、93.4％的特异性。

Description

日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用
技术领域
本发明涉及生物基因，具体涉及日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。
背景技术
日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病。由于中间宿主钉螺难以消灭及血吸虫重复感染现象严重，单靠药物治疗不能控制血吸虫病流行和最终消灭血吸虫病，因此抗血吸虫病疫苗研究已经成为血防科研工作的重点之一。至今已有上百个血吸虫抗原基因被克隆和鉴定，不少于30种血吸虫基因重组抗原疫苗和核酸疫苗用于动物免疫保护试验，一些基因工程苗也取得了一定的保护效果。但由于血吸虫虫体大，抗原性复杂，单一抗原诱导的保护效果不够理想。
表位(epitope)又称抗原决定簇，是指决定某抗原物质抗原特异性的化学基团。T细胞和B细胞表面均存在特异性抗原受体，能识别相应的抗原表位，根据表位设计疫苗，包括合成肽疫苗、多价基因工程疫苗及表位核酸疫苗，是疫苗设计的一种新途径。抗原的加工就是天然蛋白质抗原在细胞内经过蛋白酶水解，转变成和组织相容性复合物(MHC)分子相结合的肽段的过程，加工后的抗原被转送至细胞表面以抗原肽-MHC相结合的形式进入三元体被免疫细胞识别，被称为抗原呈递。依照抗原加工呈递原理可以人工预测、筛选抗原表位，而且研究人员已经根据此原理设计了计算机应用程序和数据库来预测抗原加工呈递过程并进行抗原表位筛选，构建多表位基因工程抗原疫苗或核酸疫苗，期望其可增强单一抗原的免疫原性，并诱导更高的免疫保护效果。表位是疫苗设计和免疫识别的基础，因此，加强日本血吸虫抗原表位研究，利用重组多表位抗原进行联合免疫或设计含多个表位的基因工程重组抗原疫苗或核酸疫苗，是一条值得探索的提高疫苗保护力的途径。
日本血吸虫病诊断方法主要有病原诊断和免疫诊断两种。牛、羊等大家畜的病原诊断方法目前应用较多的是尼龙筛淘洗集卵结合粪便毛蚴孵化法，该法结果可靠，但检出率低、花费的时间较长。现有的家畜血吸虫病血清学诊断方法的应用提高了诊断方法的敏感性，但特异性、重复性等还不够稳定。应用现代生物技术，寻找更为理想的诊断抗原，对提高血清学诊断方法的敏感性、特异性将有很大的帮助。
本发明应用生物信息学方法和基因工程技术研制的重组多价核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28在小鼠免疫实验中获得了较好的免疫保护效果，重组多表位抗原在牛日本血吸虫病诊断中具有较高的敏感性和特异性，表明该种多表位重组抗原和核酸疫苗的研制方法及其产物具有较高的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化以及在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗和诊断试剂中的应用。
本发明提供了一种日本血吸虫重组多表位抗原。
所述日本血吸虫重组多表位抗原编码核苷酸片段具有如下核酸序列和相应的蛋白序列：
1)BSjGCP-BSj23核酸序列：(见序列表SEQ ID 4)
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caac          354
BSjGCP-BSj23蛋白序列：(见序列表SEQ ID 9)
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                  80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Lys Leu
        115                 120
2)BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列：(见序列表SEQ ID 5)
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caacgaattc    360
aagccaccag aagaaaaaga gaaaatctcc aaggagatat tgaacggtaa agttcccatt    420
cttctccaag caatttgtga aaccttaaaa gagtctacag gtaatctgac tgtcgga       477
BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序列：(见序列表SEQ ID 10)
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                  80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Glu Phe Lys Pro Pro Glu Glu Lys
        115                 120                 125
Glu Lys Ile Ser Lys Glu Ile Leu Asn Gly Lys Val Pro Ile Leu Leu
    130                 135                 140
Gln Ala Ile Cys Glu Thr Leu Lys Glu Ser Thr Gly Asn Leu Thr Val
145                 150                 155                 160
Gly Lys Leu                                                     。
本发明另一目的提供了日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化方法。
本发明应用生物信息学方法预测和筛选了日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)的抗原表位，应用PCR技术扩增了日本血吸虫23KDa表膜蛋白(Sj23)，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28 GST)和日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)的各一段富含表位的肽段所对应的编码核苷酸片段，运用基因工程重组技术将此三种核苷酸片段重组到载体pCMV-script和pGEX-2T中，构建了pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28多表位真核表达质粒及pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28原核表达质粒。将真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28纯化后直接以肌肉注射的方法免疫昆明系小鼠，分别获得了14.76％、64.95％减虫率。将重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28转化大肠杆菌BL21后进行了诱导表达并且纯化到重组蛋白。
本发明提供的日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化方法包括以下步骤：
(1)利用生物信息学在线分析程序RANKPEP筛选到日本血吸虫抱雌沟蛋白SjGCP的第539～590位肽段的表位集中区为BSjGCP表位，截取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)作为表位BSj23，选取和曼氏血吸虫Sm28Kd GST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位，将三种抗原表位重组成BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；
(2)根据上述表位的核酸序列分别设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增各表位编码核酸片断，再利用特异限制性内切酶BamH I、Xba I、EcoR I、Hind III依次将编码BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表达载体pCMV的多克隆位点区，构建重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28，并在大肠杆菌DH5α中大量培养，肌肉注射免疫小鼠。
(3)将重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的编码BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特异限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind III定向克隆至原核表达载体pGEX-2T多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23及pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28；将上述两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化GST融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫多表位重组蛋白，应用重组蛋白制备成疫苗进行血吸虫病免疫预防试验并将重组蛋白作为诊断试剂进行牛血吸虫病诊断试验。
本发明又一目的提供了日本血吸虫重组多表位抗原在制备预防日本血吸虫的免疫预防疫苗和诊断日本血吸虫的试剂中的应用。
经动物试验结果显示，本发明提供的多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分别获得了14.76％、64.95％的减虫率。重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠获得了15.7％、57.99％的减虫率，作为诊断抗原分别获得了91.0％、89.9％的敏感性和97.8％、93.4％的特异性，可以用于制备诊断血吸虫的试剂。
附图说明
图1：重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建
图2：重组真核表达质粒的酶切鉴定
M：DL2000 Marker，1：BamHI和HindIII酶切后空质粒pCMV，2：BamHI和HindIII酶切后的pCMV-BSj23-BSj28，3：BamHI和HindIII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23，4：BamHI和HindIII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28
图3：重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建
图4：重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23的双酶切鉴定和PCR鉴定分析
1、2、5、6：BamHI和EcoRI双酶切空载pGEX，M：DNA Marker，3：BamHI和EcoRI双酶切pGEX-BSjGCP-BSj23，4：pGEX-BSjGCP-BSj23PCR鉴定
图5：重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的双酶切鉴定
1、2、3、4：BamHI和HindIII双酶切pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28 M：DNA marker
图6：SDS-PAGE分析IPTG诱导pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21的表达
1：IPTG诱导了6小时的pGEX/BL21，2：IPTG诱导了6小时的空宿主菌BL21，3-8：分别为诱导了0h、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21，M：低分子量蛋白标准
图7：融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28时相表达的电泳分析
1：IPTG诱导了6小时的空宿主菌BL21；2：IPTG诱导了6小时的pGEX/BL21；3-8：分别为诱导了0h、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21，M：低分子量蛋白标准
图8：SDS-PAGE分析纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23与pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28
1：纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，2：纯化的pGEX-BSjGCP-BSj23，M：低分子量蛋白标准
具体实施方式
实施例1、日本血吸虫多表位重组核酸疫苗构建与免疫保护实验
1、材料
1、1质粒与菌株：真核表达载体pCMV-script，大肠杆菌DH5α等购自上海申能博彩生物技术公司。
1、2实验动物：雄性昆明系小鼠，体重25g，购自上海实验动物中心。
1、3日本血吸虫中国大陆株尾蚴：中国农科院上海兽医研究所钉螺室提供。
1、5主要试剂：氨苄青霉素、卡那霉素、Agarose、Tryptone、酵母提取物、NaCl等购自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker DL2000、dNTP Mixture、MgCl2、TaqTMDNA Ployrose、限制性内切酶EcoRI、HindIII、BamHI、Xba I、T4DNA ligase连接酶等为大连宝生物技术有限公司产品。DNA Agarose Gel Purification Kit纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自天为时代生物有限公司。
2、方法
2、1抗原表位的预测与筛选
2、1、1 SjGCP表位筛选
根据日本血吸虫SjGCP(GenBank accession number：AF519183)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，在http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/网站上分析预测其线性T细胞抗原表位，筛选出的表位所对应的编码核苷酸序列简称为BSjGCP。
2、1、2 Sj23抗原表位
选取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)(简称BSj23，其对应的编码核苷酸序列共192bp)构建重组的多价疫苗，抗原表位预测表明，该肽段含有多个T细胞和B细胞抗原表位。
2、1、3 Sj28GST表位
参照曼氏血吸虫Sm28Kd GST表位分析与鉴定结果选取，Sm28GST抗原的115-131，140-153肽段为其两个重要的T细胞表位，blast比较发现Sj28GST与Sm28GST的具有很高的同源性，其115-153肽段与曼氏血吸虫的对应肽段极为相似(相似率为76％)，故本研究中选择了这一肽段。将所对应的其编码核苷酸序列简称为BSj28(共117bp)。
2、2重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建：
根据表位分析筛选结果，确定克隆策略(如图1所示)，分别设计引物，以日本血吸虫成虫cDNA为模板PCR扩增目的片段BSjGCP、BSj23和BSj28，并进行酶切、连接等基因重组，将各表位片段重组到pCMV-script载体中，构建pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组真核表达质粒。
根据日本血吸虫抱雌沟蛋白(GCP)539～590位氨基酸的编码核苷酸序列设计两对引物，在BSjGCP的上游引物BSjGCP(up)5’端加上限制性内切酶BamH I和启动密码子ATG，在BSjGCP下游引物BSjGCP(down)5’端加上限制性酶切位点Xba I，具体如下：
BSjGCP(up)    5’-AATA
Figure S2008100403825D00081
ATGCGAATTGGATATG-3’，
BSjGCP(down)  5’-GCGC
Figure S2008100403825D00082
ATAATAATCAACATCTTCAG-3’；
根据日本血吸虫Sj23大亲水区编码核苷酸序列分别设计两对引物，在LHD-SJ23上游引物BSj23(up)5’端加上限制性酶切位点Xba I，在BSj23下游引物BSj23(down)的5’端加上限制性酶切位点EcoR I，具体如下；
BSj23(up)    5’-AATA
Figure S2008100403825D00083
ATGACTGGTGCTCTGGA-3’，
BSj23(down)  5’-CGCGGTTGCGTTTTAAG-3’
根据日本血吸虫Sj28GST的115～153区段氨基酸的编码核苷酸序列分别设计两对引物，在BSj28上游引物BSj28(up)5’端加上限制性酶切位点EcoR I，在BSj28下游引物BSj28(down)5’端加上限制性酶切位点Hind III及终止密码子，具体如下：
BSj28(up)    5’-CGGCAAGCCACCAGAAGAA-3’，
BSj28(down)  5’-ATTA
Figure S2008100403825D00086
CTATCCGACAGTCAGATTA-3’。
所有引物的5’端添上四个保护性碱基，由基康生物公司合成。
根据下列PCR反应体系和条件进行PCR。
PCR反应体系：Template(日本血吸虫成虫cDNA)1μl，10×PCR Buffer 5μl，MgCl23μl，dNTP(2.5mM)4μl，PCR primer(20pmol/μl)各0.5μl，TaKaRa TaqTMpolyrase(5u/μl)0.5μl，灭菌去离子水35.5μl加至总体积50μl。
PCR扩增条件如下：预变性，94℃5分钟；按94℃变性45秒，BSjGCP 55℃、BSj2353℃、BSj28 57℃各复性45秒；72℃延长反应1分，共扩增30个循环，再于72℃延长反应10分钟，最后将PCR产物保存于4℃，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按天为时代生物有限公司DNA Agarose Gel Purification Kit纯化、回收试剂盒的操作手册进行PCR产物回收纯化。最后将DNA溶解于30μl TE或水。
利用上述PCR引物两侧和pCMV-script载体中的限制性内切酶位点，用特异限制性内切酶BamH I、Xba I、EcoR I、Hind III将上述表位的DNA片断依次克隆进pCMV-script载体，构建pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组真核表达质粒。
首先用BamH I、Xba I将BSjGCP表位DNA片断和pCMV-script载体酶切，用T4 DNAligase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP重组质粒。然后用Xba I、EcoR I将BSj23表位DNA片断和pCMV-BSjGCP重组质粒酶切，用T4DNA ligase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP-BSj23重组质粒。最后用EcoR I、Hind III将BSj28表位DNA片断和pCMV-BSjGCP-BSj23重组质粒酶切，用T4DNA ligase将两者重组连接，制备pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组质粒，转入大肠杆菌DH5α。最后将重组质粒用酶切鉴定，并将阳性克隆送上海基康生物公司测序。
2、3动物免疫保护实验
2、3、1大量制备重组质粒和空载体
大量培养含pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组质粒和空载体pCMV-script的大肠杆菌，按照上海天为时代生物有限公司的质粒抽提试剂盒方法，大量制备重组质粒pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和pCMV-script载体，紫外分光光度计分别测量两种质粒的A260和A280，并计算出纯度和含量，-20℃保存。
2、3、2免疫和攻击感染：
30只昆明系小鼠分三个组，每组10只，每只小鼠在后腿肌肉部位分别多点注射pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重组质粒或pCMV-script空载体各50μg，每隔两周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后第三周，试验鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条。
2、3、3计算减虫率：
攻击感染日本血吸虫尾蚴42天后，剖杀小鼠，冲虫计数，按照公式：减虫率＝(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)÷对照组平均检获成虫数×100％，计算减虫率。
3、结果
3、1抗原表位分析结果
3、1、1 SjGCP的抗原表位分析结果
根据日本血吸虫SjGCP(GenBank accession number：AF519183)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，在http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/网站上分析预测其线性T细胞抗原表位，以不同大小的TAP肽段作为条件选择参数，分析结果表明在该蛋白的C端集中着对人类HLA-ALL具有较好结合效率的抗原肽。进一步进行MHCI类分子结合的普适性分析和结合特异性分析，结果显示该蛋白的539～548位，578～590位的肽段具有较好的参与抗原呈递的特性，适合作为表位，另外在这两个肽段之间被筛选出来的肽段也较多，并且分值较高，如553～562位的肽段。结果表明在SjGCP的539～590位的肽段(其编码核苷酸序列共156bp)是一个潜在的表位集中区。因此优先选择了该肽段作为研究的表位之一。具体序列(见序列表SEQ ID 6)如下：
MRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYY
对应的核苷酸序列(见序列表SEQ ID 1)为：
atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaatctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaactttgcccattacttgctgaagatgttgattattat
3、1、2 BSj23的抗原表位分析及序列
截取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)作为BSj23序列：
(见序列表SEQ ID 7)
MTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRN
对应的核苷酸序列为：(见序列表SEQ ID 2)
atgactggtgctctggaaaatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac
3、1、3 BSj28的抗原表位分析及序列
截取和曼氏血吸虫Sm28Kd GST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位序列(见序列表SEQ ID 8)：
KPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVG
对应的核苷酸序列(见序列表SEQ ID 3)为：
Aagccaccagaagaaaaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccattcttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga
3、2多表位重组质粒的构建
将BSjGCP和BSj23表位的核苷酸序列用限制性内切酶连接，序列如下：(见序列表SEQ ID 4)
GGATCCATGCGAATTGGATATGAGGGTCTACCACGTGATCAATGGCCAAAAGTGATTCATTGGAATCTACATGCACGTGACGGTATTATCTGGGTATTAGATGGTCTATTGAAATGTCCGGAAAAACTTTGCCCATTACTTGCTGAAGATGTTGATTATTATTCTAGAATGACTGGTGCTCTGGAAAATCCAAACGAGGAAATAACGGCAACCATGGATAAGATACAAACGTCATTCCATTGTTGTGGAGTCAAAGGTCCAGACGATTATAAAGGGAATGTGCCAGCATCATGTAAAGAAGGGCAAGAAGTTTATGTTCAGGGTTGTCTATCTGTCTTTAGTGCATTCTTGAAACGCAACAAGCTT
相应的氨基酸序列为：(见序列表SEQ ID 9)
GSMRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYYSRMTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNKL
将BSjGCP、BSj23和BSj28表位的核苷酸序列用限制性内切酶连接，序列如下：
(见序列表SEQ ID 5)
GGATCCATGCGAATTGGATATGAGGGTCTACCACGTGATCAATGGCCAAAAGTGATTCATTGGAATCTACATGCACGTGACGGTATTATCTGGGTATTAGATGGTCTATTGAAATGTCCGGAAAAACTTTGCCCATTACTTGCTGAAGATGTTGATTATTATTCTAGAATGACTGGTGCTCTGGAAAATCCAAACGAGGAAATAACGGCAACCATGGATAAGATACAAACGTCATTCCATTGTTGTGGAGTCAAAGGTCCAGACGATTATAAAGGGAATGTGCCAGCATCATGTAAAGAAGGGCAAGAAGTTTATGTTCAGGGTTGTCTATCTGTCTTTAGTGCATTCTTGAAACGCAACGAATTCAAGCCACCAGAAGAAAAAGAGAAAATCTCCAAGGAGATATTGAACGGTAAAGTTCCCATTCTTCTCCAAGCAATTTGTGAAACCTTAAAAGAGTCTACAGGTA ATCTGACTGT CGGAAAGCTT
对应的氨基酸序列为：(见序列表SEQ ID 10)
GSMRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYYSRMTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNEFKPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVGKL
三种重组质粒经酶切后，分别出现了约300bp，340bp，500bp左右大小的DNA条带，表明为正确重组质粒。重组质粒经测序鉴定为重组正确(见图2)。
3、4动物免疫保护实验结果
试验小鼠于攻击感染42天后剖杀、冲虫计数，pCMV空载体对照组平均虫荷数为17.75，pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28试验组平均虫荷数分别为15.13、6.25，和对照组相比其减虫率分别为14.76％、64.95％。其中三价重组质粒试验组的虫荷数明显低于对照组，统计结果显示差异非常显著(P＜0.01)(见表1)。
表1：动物免疫保护实验结果
 组别 平均虫荷数(x±s) 减虫率(％) P值
 pCMV空载体  17.75+6.59
 pCMV-BSjGCP-BSj23  15.13+6.24  14.76％ ＞0.05
 pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28  6.25+3.11  64.95％ ＜0.01
实施例2、日本血吸虫多表位重组抗原的表达、纯化与免疫预防实验
1、材料
1、1质粒与菌株：原核表达载体pGEX-2T，大肠杆菌DH5a，BL21等购自上海申能博彩生物技术公司。
1、2实验动物：BALB/c系小鼠：雄性，6周龄，购自上海实验动物中心。
1、3日本血吸虫尾蚴由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。
1、4酶类及其它相关试剂：氨苄青霉素、IPTG、X-gal、谷胱甘肽、尿素等购自上海生工生物工程公司。DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、标准蛋白Marker等购自天为时代生物公司，蛋白重折叠试剂盒购自普飞生物公司。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I、Xba I、HindIII、BamHI购自TaKaRa公司。考马斯亮兰R250为Fluka进口分装。氯仿、异丙醇等生化试剂购自中国医药集团化学试剂公司。
2、方法
2、1重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的构建
分别以前述BSjGCP(up)和BSj23(down)或BSjGCP(up)和BSj28(down)为引物，以质粒pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28为模板，应用PCR扩增目的DNA片断BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28。(如图3所示)
DNA片断BSjGCP-BSj23的引物：
BSjGCP(up)：  5’-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3’，
BSj23(down)   5’-CGCG
Figure S2008100403825D00121
GTTGCGTTTTAAG-3’
DNA片断BSjGCP-BSj23-BSj28的引物：
BSjGCP(up)：  5’-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3’，
BSj28(down)： 5’-ATTAAAGCTTTCCGACAGTCAGATTA-3’；
PCR反应体系同前，94℃预变性5分钟；按94℃变性45秒，56℃复性45秒，72℃延长反应1分，共扩增30个循环，再于72℃延长反应10分钟，最后将PCR产物保存于4℃，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按天为时代生物有限公司DNA Agarose GelPurification Kit纯化回收试剂盒的操作手册进行PCR产物回收纯化。最后将DNA溶解于30μl TE或水。
用BamH I、EcoR I将表位BSjGCP-BSj23的DNA片断和pGEX-2T载体酶切，用T4DNAligase重组连接，构建pGEX-BSjGCP-BSj23重组质粒。用BamH I、Hind III将表位BSjGCP-BSj23-BSj28的DNA片断和pGEX-2T载体酶切，用T4DNA ligase将两者重组连接，构建pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组组质粒(如图3所示)，将质粒转入大肠杆菌DH5α。然后将重组质粒用酶切、PCR鉴定，并将阳性克隆送上海基康生物公司测序。2、2重组多表位质粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的诱导表达
将阳性重组多表位质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28分别转化BL21感受态细胞。将含重组质粒的阳性菌按1.0％接种入一定量的含50μg/ml氨卞青霉素的2YT培养液中，37℃剧烈振摇4小时，加入IPTG至终浓度1mmol/ml，37℃诱导表达0、2、4、6、8、10小时，各取出1ml细菌培养物于Eppendorf管；10000rpm离心1min，去掉LB上清培养液。在离心沉淀的菌体中加入2×上样缓冲液50μl，ddH2O50μl，在混匀器上超声裂解后于沸水中煮3到5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，用考马氏亮蓝对SDS-PAGE电泳胶进行染色，室温摇动染色4小时以上。脱色后，对凝胶进行扫描，分析其分子量和表达状况。
2、3重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的纯化
将前述鉴定的菌株过夜培养，第二天按1％的量加入200ml液体LB培养基中扩大培养3h后，加入IPTG诱导6h。4℃，1000r/min离心收集菌体。将收集的菌体在-70℃冰箱和室温反复冻融5次。超声裂解破碎细胞10次(10sec/次)，4℃ 5000g离心15min，分别取离心后的沉淀和上清样品，以SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的溶解性。
根据novagen蛋白重折叠试剂盒预处理包涵体蛋白，进行复性处理，并进一步按Amersham公司提供的Glutathione Sepharose 4B亲和层析方法进行pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组蛋白的纯化。纯化后的重组蛋白用PBS透析去除小分子，经SDA-PAGE分析和蛋白含量测定后，用PBS稀释至一定浓度，于-20℃保存备用。
2、4动物免疫实验
2、4、1免疫：将6-7周龄BALB/c系小鼠分成4组，每组6只。其中三个试验组分别应用重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28与福氏佐剂结合进行免疫(每只鼠每次注射抗原50μg)，每两周免疫一次，共免疫三次。试验设两个对照组分别为空白对照组和佐剂对照组，分别注射福氏佐剂和PBS。
2、4、2攻击感染：
第三次免疫后二周试验组及对照组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40条。感染42天后，剖杀小鼠，冲虫计数，按照公式减虫率＝(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)÷对照组平均检获成虫数×100％计算减虫率。
3、结果
3、1多表位重组表达质粒构建
利用PCR和限制性内切酶位点BamH I、EcoR I、Hind III，将BSjGCP-BSj23、BSjGCP-BSj23-BSj28表位目的核苷酸片段亚克隆入载体pGEX-2T中，PCR、酶切鉴定重组的原核表达质粒均出现了与预期大小一致的DNA片段(见图4、5)。对阳性克隆的菌落小量液体培养后，将菌液样本送上海基康生物公司测序，结果证实含多表位的核苷酸序列编码阅读框正确。
3、2融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28诱导表达结果
将含重组质粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的BL21大肠杆菌于含50μg/ml氨卞青霉素的2YT培养液中振摇培养，加入IPTG诱导表达0、2、4、6、8、10小时，分别取细菌培养物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明，和pGEX/BL21或BL21空宿主菌相比，pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21经IPTG诱导后不同时相的菌液均有预期大小的特异目的蛋白(约39KDa)条带出现，在诱导6小时后其表达量达到最高水平(见图6)。SDS-PAGE电泳分析诱导后pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21不同时间的菌液样品表明也有预期大小的目的蛋白(接近45KDa)条带出现，在诱导6小时后重组蛋白的表达量达到最高水平，8小时后表达量开始下降(见图7)。
3、3融合蛋白纯化结果
分别大量培养菌株BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23、BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，IPTG诱导后，离心收集菌体，反复冻融、超声裂解破碎细菌，SDS-PAGE电泳分析发现pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重组蛋白均以包涵体表达。按novagen蛋白重折叠试剂盒预进行复性处理，并进一步用亲和层析方法纯化。如图8所示，经过纯化得到了纯度较高的重组蛋白。
3、4动物免疫实验结果
试验小鼠于攻击感染42天后剖杀、冲虫计数，空白对照组、佐剂对照组、pGEX-BSjGCP-BSj23免疫组、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫组的平均虫荷数分别为21.83、19、18.4和9.17，和对照组相比两个试验组的减虫率分别为15.7％(P＞0.05)和57.99％(P＜0.01)(见表2)。
表2动物免疫保护试验结果
组别(group) 平均虫荷数(x±s) 减虫率 P值
空白对照组 21.83±2.34
佐剂组 19±3.14  12.9％ ＞0.05
 pGEX-BSjGCP-BSj23+佐剂 18.4±3.77  15.7％ ＞0.05
 pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28+佐剂  9.17±2.47  57.99％ ＜0.01
实施例3、重组多表位抗原用于诊断牛血吸虫病研究试验
1、材料
1、1抗原：重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，根据前述的方法制备。-20℃保存备用。
1、2血清：水牛血吸虫病阳性血清采自云南省日本血吸虫病疫区放牧水牛。采集前由当地兽医对目标水牛的粪便根据国标法进行粪便毛蚴孵化法检查以诊断水牛日本血吸虫病，将粪检阳性水牛的血清作为日本血吸虫病阳性血清，共有189份，92份阴性血清采自血吸虫病非疫区河南的健康牛血清，分离血清保存于-20℃备用。取健康水牛血清50份混合后作水牛标准阴性血清。
1、3明胶、TMB等购自天为时代生物公司，兔抗牛IgG购自普飞生物公司，其它生化试剂购自中国医药集团上海化学试剂公司。
2、方法
2、1 ELISA法检测水牛日本血吸虫病阴、阳性血清
分别应用重组多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作为抗原(15μg/ml)以间接ELISA法检测水牛血清。主要步骤如下：
2、2抗原(15μg/ml)用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板，抗原稀释度按预试验结果进行，每孔加100μl，4℃过夜。用PBST洗二次，每次5min。
2、3用3％明胶37℃封闭3hr，每孔加150μl。结束后用PBST洗三次，每次5min。
2、4加1∶100稀释的待检血清，每份血清加二孔，每孔100μl，37℃作用1hr，每次试验都设标准阴性对照孔。结束后用PBS洗四次，每次5min。
2、5加HRP标记的兔抗牛IgG，每孔100μl，37℃作用45min。结束后用PBST洗四次，每次5min。
2、6加TMB/柠檬酸缓冲液显色，每孔75μl，37℃作用10min左右。每孔加20μl 2M硫酸终止反应。
2、7于450nM测OD值，计算平均OD值。
2、8结果判断：把待检血清的平均OD值大于和等于标准阴性血清的平均OD值+2倍标准差的，判断为阳性，小于的判断为阴性。
3、结果
以重组表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作为诊断抗原，应用间接ELISA法检测疫区189份水牛血清和92份健康牛血清，结果pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28三价表位抗原的敏感性和特异性分别为89.9％、93.4％，pGEX-BSjGCP-BSj23二价表位抗原的敏感性和特异性比三价稍高，分别为91.0％、97.8％(见表3)。
表3重组表位抗原检测水牛血吸虫病结果
从以上结果看出，以二价表位重组抗原pGEX-BSjGCP-BSj23作为诊断抗原，获得的平均OD值、对阳性牛的检出率和对健康牛的阴性符合率都最高，可以看出pGEX-BSjGCP-BSj23有潜力发展成为一种新的、特异、敏感的血吸虫病诊断抗原。同时由于基因重组抗原可以大量生产制备，易于产品的标准化和诊断技术的规范化。
序列表：
本发明所述日本血吸虫重组多表位疫苗具有下列核苷酸序列及相应的蛋白序列：
SEQ ID 1：日本血吸虫抱雌沟蛋白表位核酸序列
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattat                              156
SEQ ID 2：日本血吸虫23KD抗原表位核酸序列
atgactggtg ctctggaaaa tccaaacgag gaaataacgg caaccatgga taagatacaa     60
acgtcattcc attgttgtgg agtcaaaggt ccagacgatt ataaagggaa tgtgccagca    120
tcatgtaaag aagggcaaga agtttatgtt cagggttgtc tatctgtctt tagtgcattc    180
ttgaaacgca ac                                                        192
SEQ ID 3：日本血吸虫28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原表位核酸序列
aagccaccag aagaaaaaga gaaaatctcc aaggagatat tgaacggtaa agttcccatt     60
cttctccaag caatttgtga aaccttaaaa gagtctacag gtaatctgac tgtcgga       117
SEQ ID 4：日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原重组表位核酸序列
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caac          354
SEQ ID 5：日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原重组表位核酸序列
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caacgaattc    360
aagccaccag aagaaaaaga gaaaatctcc aaggagatat tgaacggtaa agttcccatt    420
cttctccaag caatttgtga aaccttaaaa gagtctacag gtaatctgac tgtcgga       477
SEQ ID 6：日本血吸虫抱雌沟蛋白表位蛋白序列
Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro Lys Val
1               5                   10                  15
Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val Leu Asp
            20                  25                  30
Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala Glu Asp
        35                  40                  45
Val Asp Tyr Tyr
    50
SEQ ID 7：日本血吸虫23KD抗原表位蛋白序列
Met Thr Gly Ala Leu Glu Ash Pro Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp
            20                  25                  30
Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val
        35                  40                  45
Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn
    50                  55                  60
SEQ ID 8：日本血吸虫28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原表位蛋白序列
Lys Pro Pro Glu Glu Lys Glu Lys Ile Ser Lys Glu Ile Leu Asn Gly
1               5                   10                  15
Lys Val Pro Ile Leu Leu Gln Ala Ile Cys Glu Thr Leu Lys Glu Ser
            20                  25                  30
Thr Gly Asn Leu Thr Val Gly
        35
SEQ ID 9：日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原重组表位蛋白序列
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                  80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Lys Leu
        115                 120
SEQ ID 10：日本血吸虫抱雌沟蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-转移酶抗原重组表位蛋白序列
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                   80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Glu Phe Lys Pro Pro Glu Glu Lys
        115                 120                 125
Glu Lys Ile Ser Lys Glu Ile Leu Asn Gly Lys Val Pro Ile Leu Leu
    130                 135                 140
Gln Ala Ile Cys Glu Thr Leu Lys Glu Ser Thr Gly Asn Leu Thr Val
145                 150                 155                 160
Gly Lys Leu
                                                              。

Claims (9)

1、一种日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于所述多表位表原为BSjGCP-BSj23，它由日本血吸虫23KD抗原表位和日本血吸虫抱雌沟蛋白抗原表位重组组成，具有如下核酸序列和相应的蛋白序列：
BSjGCP-BSj23核酸序列：
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caac          354
BSjGCP-BSj23蛋白序列：
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                  80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Lys Leu
     115                 120。
2、一种日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于所述多表位抗原为BSjGCP-BSj23-BSj28，它由日本血吸虫23KD抗原表位、日本血吸虫抱雌沟蛋白抗原表位和日本血吸虫28KD谷胱甘肽-S-转移酶抗原表位重组组成，具有如下核酸序列和相应的蛋白序列：
BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列：
atgcgaattg gatatgaggg tctaccacgt gatcaatggc caaaagtgat tcattggaat     60
ctacatgcac gtgacggtat tatctgggta ttagatggtc tattgaaatg tccggaaaaa    120
ctttgcccat tacttgctga agatgttgat tattattcta gaatgactgg tgctctggaa    180
aatccaaacg aggaaataac ggcaaccatg gataagatac aaacgtcatt ccattgttgt    240
ggagtcaaag gtccagacga ttataaaggg aatgtgccag catcatgtaa agaagggcaa    300
gaagtttatg ttcagggttg tctatctgtc tttagtgcat tcttgaaacg caacgaattc    360
aagccaccag aagaaaaaga gaaaatctcc aaggagatat tgaacggtaa agttcccatt    420
cttctccaag caatttgtga aaccttaaaa gagtctacag gtaatctgac tgtcgga       477
BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序列：
Gly Ser Met Arg Ile Gly Tyr Glu Gly Leu Pro Arg Asp Gln Trp Pro
1               5                   10                  15
Lys Val Ile His Trp Asn Leu His Ala Arg Asp Gly Ile Ile Trp Val
            20                  25                  30
Leu Asp Gly Leu Leu Lys Cys Pro Glu Lys Leu Cys Pro Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Val Asp Tyr Tyr Ser Arg Met Thr Gly Ala Leu Glu Asn Pro
    50                  55                  60
Asn Glu Glu Ile Thr Ala Thr Met Asp Lys Ile Gln Thr Ser Phe His
65                  70                  75                  80
Cys Cys Gly Val Lys Gly Pro Asp Asp Tyr Lys Gly Asn Val Pro Ala
                85                  90                  95
Ser Cys Lys Glu Gly Gln Glu Val Tyr Val Gln Gly Cys Leu Ser Val
           100                 105                 110
Phe Ser Ala Phe Leu Lys Arg Asn Glu Phe Lys Pro Pro Glu Glu Lys
        115                 120                 125
Glu Lys Ile Ser Lys Glu Ile Leu Asn Gly Lys Val Pro Ile Leu Leu
    130                 135                 140
Gln Ala Ile Cys Glu Thr Leu Lys Glu Ser Thr Gly Asn Leu Thr Val
145                 150                 155                 160
Gly Lys Leu。
3、一种权利要求1或2所述日本血吸虫重组多表位抗原的表达、纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)利用生物信息学在线分析程序RANKPEP筛选到日本血吸虫抱雌沟蛋白SjGCP的第539～590位肽段的表位集中区为BSjGCP表位，截取日本血吸虫23KD抗原Sj23的大亲水区LHD-SJ23作为表位BSj23，选取和曼氏血吸虫Sm28Kd GST抗原的第115-153氨基酸肽段对应的Sj28GST肽段为BSj28表位，将三种抗原表位重组成BSjGCP-BSj23或BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；
(2)根据上述表位的核酸序列分别设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位点，PCR扩增各表位编码核酸片断，再利用特异限制性内切酶BamH I、XbaI、EcoR I、Hind III依次将编码BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表达载体pCMV的多克隆位点区，构建重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23或pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28；
(3)将重组真核表达质粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的编码BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特异限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind III定向克隆至原核表达载体pGEX-2T多克隆位点区，构建重组原核表达质粒pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28；将上述两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，并用亲和层析纯化GST融合蛋白的方法纯化到日本血吸虫多表位重组蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28。
4、一种如权利要求1或2所述的日本血吸虫重组多表位抗原在制备日本血吸虫病免疫预防疫苗中的应用。
5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述制备免疫预防疫苗时，使用的重组蛋白是带有GST标签的融合蛋白。
6、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述制备的免疫预防疫苗为日本血吸虫重组多表位抗原的DNA疫苗。
7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于制备所述免疫预防疫苗时，使用的宿主菌为大肠杆菌DH5α，真核表达质粒为pCMV-script。
8、一种如权利要求1或2所述的日本血吸虫重组多表位抗原在制备诊断日本血吸虫病的试剂中的应用。
9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于制备所述诊断试剂时，使用的重组蛋白为带有GST标签的融合蛋白。
CN 200810040382 2008-07-09 2008-07-09 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用 Expired - Fee Related CN101624422B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200810040382 CN101624422B (zh) 2008-07-09 2008-07-09 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200810040382 CN101624422B (zh) 2008-07-09 2008-07-09 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101624422A true CN101624422A (zh) 2010-01-13
CN101624422B CN101624422B (zh) 2012-04-18

Family

ID=41520431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200810040382 Expired - Fee Related CN101624422B (zh) 2008-07-09 2008-07-09 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101624422B (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921325A (zh) * 2010-03-25 2010-12-22 南京医科大学 一种增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抗原及其应用
CN103059117A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 同济大学 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用
CN104399069A (zh) * 2014-11-05 2015-03-11 南通大学 周期型马来丝虫m29表位基因蛋白疫苗的制备方法
CN106608917A (zh) * 2015-10-27 2017-05-03 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组多表位抗原及其应用
CN107778363A (zh) * 2016-08-25 2018-03-09 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组抗原rSjMRP1及其应用
CN110357951A (zh) * 2019-08-16 2019-10-22 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用
CN111420041A (zh) * 2020-03-09 2020-07-17 华东理工大学 水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用
CN112194709A (zh) * 2020-12-07 2021-01-08 北京纳百生物科技有限公司 一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用
CN113045671A (zh) * 2021-01-29 2021-06-29 长春万成生物电子工程有限公司 一种用于检测日本血吸虫的重组抗原、其制备方法和应用
CN114805524A (zh) * 2022-03-30 2022-07-29 中国医学科学院病原生物学研究所 日本血吸虫抗原蛋白rSjScP92及其应用

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101921325B (zh) * 2010-03-25 2012-06-27 南京医科大学 一种增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抗原及其应用
CN101921325A (zh) * 2010-03-25 2010-12-22 南京医科大学 一种增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抗原及其应用
CN103059117A (zh) * 2011-10-21 2013-04-24 同济大学 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用
CN103059117B (zh) * 2011-10-21 2016-09-21 同济大学 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用
CN106399346B (zh) * 2014-11-05 2019-10-18 南通大学 周期型马来丝虫m29表位基因蛋白疫苗的用途
CN104399069A (zh) * 2014-11-05 2015-03-11 南通大学 周期型马来丝虫m29表位基因蛋白疫苗的制备方法
CN106399346A (zh) * 2014-11-05 2017-02-15 南通大学 周期型马来丝虫m29表位基因蛋白疫苗的用途
CN106399345A (zh) * 2014-11-05 2017-02-15 南通大学 效果好的周期型马来丝虫m29表位基因蛋白疫苗制备方法
CN106608917B (zh) * 2015-10-27 2020-09-11 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组多表位抗原及其应用
CN106608917A (zh) * 2015-10-27 2017-05-03 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组多表位抗原及其应用
CN107778363A (zh) * 2016-08-25 2018-03-09 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组抗原rSjMRP1及其应用
CN107778363B (zh) * 2016-08-25 2021-05-07 中国农业科学院上海兽医研究所 日本血吸虫重组抗原rSjMRP1及其应用
CN110357951A (zh) * 2019-08-16 2019-10-22 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用
CN110357951B (zh) * 2019-08-16 2022-03-25 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种日本血吸虫免疫表位重组蛋白及其应用
CN111420041A (zh) * 2020-03-09 2020-07-17 华东理工大学 水产病原菌糖酵解途径中持家酶的广谱组合型疫苗及其应用
CN112194709A (zh) * 2020-12-07 2021-01-08 北京纳百生物科技有限公司 一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用
CN113045671A (zh) * 2021-01-29 2021-06-29 长春万成生物电子工程有限公司 一种用于检测日本血吸虫的重组抗原、其制备方法和应用
CN114805524A (zh) * 2022-03-30 2022-07-29 中国医学科学院病原生物学研究所 日本血吸虫抗原蛋白rSjScP92及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101624422B (zh) 2012-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101624422B (zh) 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用
CN103172749B (zh) 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备
CN108159409A (zh) 一种猪圆环病毒3型Cap蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN106220716B (zh) 鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法
CN101955545B (zh) 一种多靶点重组基因及其蛋白在防治幽门螺旋杆菌感染中的应用
CN107033250B (zh) 牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用
CN105169381B (zh) 一种幽门螺旋杆菌多价表位疫苗及其制备方法
CN106146640B (zh) 尘螨变应原及其应用
CN101451145B (zh) 基于t细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用
CN107793473A (zh) 一种副鸡禽杆菌的抗原蛋白及其应用
CN109456393A (zh) 肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用
Luo et al. Protein typing of major outer membrane lipoproteins from Chinese pathogenic Leptospira spp. and characterization of their immunogenicity
CN110133284A (zh) 蛋白抗原及其编码基因和它们在鉴别猪肺炎支原体灭活疫苗抗体和自然感染抗体中的应用
CN114874995A (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
CN101921325B (zh) 一种增加CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的抗原及其应用
CN114736290A (zh) 一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用
CN107510841A (zh) 源头阻断包虫病病原细粒棘球绦虫传播的疫苗
CN105906717A (zh) 布鲁氏菌多表位融合蛋白疫苗的制备及应用
CN103725697A (zh) 化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用
CN109053896A (zh) 一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN101880328B (zh) 微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用
CN105085638A (zh) KSHV病毒vIRF4 DNA结合域、其多克隆抗体及制备方法
CN105524148B (zh) 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用
CN106267179A (zh) 一种大肠杆菌外膜蛋白疫苗的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120418

Termination date: 20140709

EXPY Termination of patent right or utility model