CN106608917A

CN106608917A - 日本血吸虫重组多表位抗原及其应用

Info

Publication number: CN106608917A
Application number: CN201510706078.XA
Authority: CN
Inventors: 林矫矫; 吕超; 傅志强; 洪炀; 陆珂; 韩倩; 曹晓丹; 王涛; 贾秉光; 张祖航; 宰金丽; 窦雪峰; 沈元曦
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN106608917B

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫重组多表位抗原，该重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4四个表位多肽中任意两个以上表位多肽以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。本发明还公开了上述日本血吸虫重组多表位抗原在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。本发明的日本血吸虫重组多表位抗原，作为诊断抗原诊断羊血吸虫病的敏感性可高达97.8％，特异性为100％，具有较高的应用价值。

Description

日本血吸虫重组多表位抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫重组多表位抗原及其应用。

背景技术

日本血吸虫病是我国一种重要的人畜共患寄生虫病。经过半个多世纪的努力，我国血防工作取得举世瞩目的成就，但血防工作仍然面临严峻的考验。2014年初，全国仍有血吸虫病人近20万例，钉螺面积365468hm²。流行病学调查显示，患病牛羊等大家畜是我国血吸虫病的主要传染源，在一些血吸虫病流行区域，羊群数量大，羊感染率往往高于其他动物，且其喜好活动在青草茂盛地点，也是钉螺适宜滋生地带，羊群活动范围大，粪便分散且不易清除，整个群体对血吸虫抵抗力低，在血吸虫病传播中扮演非常重要的角色。随着以控制传染源为主的综合防治策略的深入展开，人、牛作为传染源在血吸虫病传播中的作用将日益下降，但其他家畜(尤其羊)由于难以实施查治病、粪便管理等防治措施，在血吸虫病传播中的作用将日益凸显，极有可能成为未消灭钉螺地区疫情回升的重要隐患。

诊断是血防工作的中心环节，疫情分析、防控措施制定等都需要准确诊断家畜血吸虫病。现有的诊断方法基本分为三类：病原学检测，血清学检测，分子生物学方面检测。病原学检测是确诊血吸虫病的“金标准”，随着大规模化疗的开展，病原学检测方法的检出率越来越低，且费工费时，操作繁琐。血清学检测提高了检测的敏感性，但其特异性，重复性等都不稳定，不能用于疗效考核。分子生物学检测，因其代价相对昂贵，应用于人血吸虫病诊断较多，家畜相对较少。

日本血吸虫病血清学检测方法中最重要的试剂是检测用抗原，血防工作者一直致力于开发能制备简便、质量稳定的重组抗原以代替虫卵抗原。目前已经有上百个日本血吸虫基因重组抗原应用于血吸虫病的诊断，但效果均没有达到期望的效果。由于单个基因重组抗原敏感性差，所以混合抗原和多表位抗原是诊断用血吸虫重组抗原的研究方向。

发明内容

本发明要解决目前缺乏用于诊断血吸虫病的多表位抗原的技术问题，提供一种日本血吸虫重组多表位抗原，该重组多表位抗原可应用于血吸虫病的诊断，诊断效果良好，具有较高的敏感性和特异性。

此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组多表位抗原的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫重组多表位抗原，该重组多表位抗原包含：下述四个表位多肽中任意两个以上表位多肽以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列，

(1)SEQ ID NO.1所示的SjRAD23表位多肽；(2)SEQ ID NO.2所示的SjRAD23表位多肽；

(3)SEQ ID NO.3所示的SjPGM表位多肽；(4)SEQ ID NO.4所示的Sj23表位多肽。

优选的，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。更优选的，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。

优选的，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽、SEQ ID NO.1所示SjRAD23表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。更优选的，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列。

优选的，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.2所示SjRAD23表位多肽、SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。更优选的，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了上述日本血吸虫重组多表位抗原在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种诊断血吸虫病的试剂盒，包含上述日本血吸虫重组多表位抗原。

优选的，所述日本血吸虫重组多表位抗原包含SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、或SEQ IDNO.25所示氨基酸序列。

本发明的日本血吸虫重组多表位抗原，作为诊断抗原诊断羊血吸虫病的敏感性可高达97.8％，特异性为100％，适于制备诊断血吸虫病的产品试剂。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1重组原核表达质粒rBSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)的构建示意图；

图2是本发明实施例1重组原核表达质粒rBSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)双酶切鉴定结果图；

图3是本发明实施例1重组原核表达质粒rBSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)PCR鉴定结果图；

图4是本发明实施例1 SDS-PAGE分析IPTG诱导重组原核质粒rBSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)的表达及纯化结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本发明应用生物信息学方法预测和筛选了日本血吸虫辐射敏感蛋白(SjRAD23)、磷酸甘油酸酯变位酶(SjPGM)的抗原表位多肽，共筛选到三个表位多肽，其中SjRAD23两个，SjPGM一个，应用PCR技术扩增筛选出的表位多肽对应的核酸序列，同时扩增日本血吸虫23KDa表膜蛋白大亲水区(LHD-Sj23),运用基因工程重组技术将该核苷酸扩增片段组合并重组到载体pET-28a(+)，构建重组多表位原核表达质粒。将重组原核表达质粒BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)和BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达并且纯化到重组蛋白。纯化得到的重组多表位抗原rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23和rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23在羊血吸虫病的诊断中显示了良好的效果，获得较高敏感性和特异性，表明该重组多表位抗原具有较高的应用价值。

实施例1日本血吸虫重组多表位抗原的表达和纯化

1材料

1.1质粒和菌株：pET-28a(+)原核表达质粒为本实验室留存，大肠杆菌DH5a,BL21(DE3)等购自北京全式金生物技术公司。

1.2酶类及其它相关试剂:卡那霉素、IPTG、X-gal、谷胱甘肽、尿素等购自上海生工生物工程公司。DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、标准蛋白Marker等购自天为时代生物公司，Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、BamHI购自TaKaRa公司。考马斯亮兰R250为Fluka进口分装。氯仿、异丙醇等生化试剂购自中国医药集团化学试剂公司。

2方法

2.1抗原表位的预测与筛选

2.1.1 SjRAD23表位的筛选

根据日本血吸虫辐射敏感蛋白SjRAD23(GenBank accession number:GI:226470141)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，综合表位分析软件BepiPred 1.0，TEPITOPE，PROPRED，同时参考网站IEDB Analysis Resource的结果，筛选到SjRAD23两个表位多肽分别为46-123、166-230，相对应其ORF的136-369、496-690核酸序列，筛选出的该两个表位所对应的编码核苷酸序列分别简称为BSjRAD23-1、BSjRAD23-2。

2.1.2 SjPGM表位的筛选

参考SjRAD23表位预测方法，日本血吸虫磷酸甘油酸酯变位酶SjPGM(GenBank accessionnumber:FN315872)筛选到1段表位多肽为85-166，对应其ORF的253-498核酸序列，筛选出的该表位对应的编码核苷酸序列简称BSjPGM。

2.1.3 Sj23抗原表位

选取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)(简称BSj23,其对应的编码核苷酸序列共192bp)，研究表明该肽段列含有丰富的B、T细胞表位。

2.2重组原核表达质粒BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)的构建

根据筛选到的表位，确定克隆策略(图1所示)，分别设计引物，以日本血吸虫成虫cDNA为模板PCR扩增目的片段，然后进行酶切，连接等基因重组步骤，将各个片段重组到pET-28a(+)载体，构建重组原核表达载体BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)。

根据日本血吸虫辐射敏感蛋白(SjRAD23)46-123、166-230的氨基酸对应的编码核苷酸序列136-369、496-690分别设计两对特异性引物，在BSjRAD23-1(136-369)上游引物BSjRAD23-1(up)5’端加上限制性内切酶EcoRI，在BSjRAD23-1(136-369)下游引物BSjRAD23-1(down)5’端加上限制性内切酶HindIII；在BSjRAD23-2(496-690)上游引物BSjRAD23-2(up)5’端加上限制性内切酶BamHI，在BSjRAD23-2(496-690)下游引物BSjRAD23-2(down)5’端加上限制性内切酶SacI。

具体如下：

BSjRAD23-1(up)5’-CGCGAATTCATACATTCAGGCAAGG-3’(SEQ ID NO.9)；

BSjRAD23-1(down)5’-CGCGGGTAGGCTAGGCT-3’(SEQ ID NO.10)；

BSjRAD23-2(up)5’-CGCGGATCCGTCATACGAGCAATG-3’(SEQ ID NO.11)；

BSjRAD23-2(down)5’-CGCTGCGATTGGGTCTTCTGA-3’(SEQ ID NO.12)。

根据日本血吸虫磷酸甘油酸酯变位酶(SjPGM)85-166的氨基酸对应的编码核苷酸序列设计两对引物(两对引物扩增的片段相同，只是添加的限制性内切酶位点不同)，在BSjPGM(1)上游引物BSjPGM(1)(up)5’端加上限制性内切酶BamHI，在BSjPGM(1)(down)5’端加上限制性内切酶EcoRI；在BSjPGM(2)上游引物BSjPGM(2)(up)5’端加上限制性内切酶SacI，在BSjPGM(2)(down)5’端加上限制性内切酶HindIII。具体如下：

BSjPGM(1)(up)5’-CGGGGATCCTGGCGTCTAAATGAAAG-3’(SEQ ID NO.13)；

BSjPGM(1)(down)5’-CGCAAACCAGAATGGTAGT-3’(SEQ ID NO.14)；

BSjPGM(2)(up)5’-CGGGAGCTCTGGCGTCTAAATGAAAG-3’(SEQ ID NO.15)；

BSjPGM(2)(down)5’-CGCAAACCAGAATGGTAGT-3’(SEQ ID NO.16)。

根据日本血吸虫Sj23大亲水区编码核苷酸序列分别设计两对引物,在LHD-Sj23(1)上游引物BSj23(1)(up)5’端加上限制性酶切位点EcoRI，在BSj23(1)下游引物BSj23(1)(down)的5’端加上限制性酶切位点HindIII，在LHD-Sj23(2)上游引物BSj23(2)(up)5’端加上限制性酶切位点HindIII，在BSj23(2)下游引物BSj23(2)(down)的5’端加上限制性酶切位点XhoI和终止密码子CTA，具体如下；

BSj23(1)(up)5’-CGCATGACTGGTGCTCTGGA-3’(SEQ ID NO.17)；

BSj23(1)(down)5’-CGCAAGCTTGTTGCGTTTTAAG-3’(SEQ ID NO.18)；

BSj23(2)(up)5’-CGCATGACTGGTGCTCTGGA-3’(SEQ ID NO.19)；

BSj23(2)(down)5’-CGCCTCGAG GTTGCGTTTTAAG-3’(SEQ ID NO.20)。

所有引物的5’端添上3个保护性碱基，由上海桑尼生物公司合成。

根据下列PCR反应体系(表1)和条件进行PCR。

表1 PCR反应体系

PCR扩增条件如下：预变性，94℃5分钟；按94℃变性60秒,BSjRAD23-1 57.5℃、BSjRAD23-2 59℃、BSjPGM 57℃、BSj23 55℃各复性60秒；72℃延长反应1分，共扩增30个循环,再于72℃延长反应10分钟,最后将PCR产物保存于4℃，进行琼脂糖水平电泳观察PCR产物。按康宁生命科学公司PCR产物纯化回收试剂盒进行产物回收。

利用上述PCR引物两侧和pET-28a(+)载体中的限制性内切酶位点，用特异限制性内切酶BamHI、SacI、EcoRI、HindIII、XhoI将上述表位的DNA片断克隆进pET-28a(+)载体，构建BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)和BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)重组原核表达质粒。

首先用BamHI、EcoRI将BSjPGM表位DNA片断和pET-28a(+)载体酶切，用T₄ DNA ligase将两者重组连接，制备BSjPGM/pET-28a(+)重组质粒。然后用EcoRI、HindIII将BSjRAD23-1表位DNA片断和BSjPGM/pET-28a(+)重组质粒酶切，用T₄ DNA ligase将两者重组连接，制备BSjPGM-BSjRAD23-1/pET-28a(+)重组质粒；最后用HindIII、XhoI将BSj23表位DNA片断和BSjPGM-BSjRAD23-1/pET-28a(+)重组质粒酶切，用T₄ DNA ligase将两者重组连接，制成终产物BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)重组原核表达质粒。同理制备BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)和BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)重组原核表达质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21。最后将重组质粒用酶切鉴定，并将阳性克隆送上海桑尼生物公司测序。

2.3重组多表位原核表达质粒BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)和BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)的诱导表达。

将测序正确的菌液5ml转接入500ml LB液体培养基，按照0.1％的比例加入卡那霉素，37℃培养1.5小时左右，测得其OD值为0.6-0.8之间时，按0.1％的比例加入1mM IPTG，继续37℃培养8小时，12000rpm离心15min收集菌体，菌体用20ml PBS重悬，取少量重悬液，加入等量2XLoading Buffer,在混匀器上超声裂解后于沸水中煮3到5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，用考马氏亮蓝对SDS-PAGE电泳胶进行染色，室温摇动染色4小时以上。脱色后，对凝胶进行扫描，分析其分子量和表达状况。

2.4重组多表位抗原BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)和BSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23/pET-28a(+)的纯化

将上述收集的菌体重悬液，反复冻融三次，用超声细胞破碎仪进行菌体破碎，超声2s，停9s，超声20min。12000rpm离心20min，收集上清和沉淀，沉淀用8M尿素溶解，SDS-PAGE分析重组蛋白的溶解性。

使用镍亲和层析的方法纯化重组蛋白，镍柱由生物公司提供，具体操作步骤参照其说明书，纯化后的重组蛋白用PBS透析去除小分子，经SDA-PAGE分析和蛋白含量测定后，用PBS稀释至一定浓度，于-20℃保存备用。

3结果

3.1抗原表位分析结果

3.1.1 SjRAD23的抗原表位分析结果

根据日本血吸虫SjRAD23(GenBank accession number:GI:226470141)的编码基因序列及相应的氨基酸序列，采用多个表位预测软件进行筛选，BepiPred 1.0预测线性B细胞表位，从中选择出评分最高的肽段；TEPITOPE，PROPRED预测线性T细胞表位，综合两种预测方法选择出评分较高的肽段，从选择出的肽段综合分析SjRAD23的(136-369),(496-690)两端肽段富含B细胞表位和T细胞表位，因此优先选择该两段肽段作为研究的表位之一。

具体序列分别如下：

BSjRAD23-1氨基酸序列：

IHSGKVMEDSKSLKDYKVTDSGFVVVMSVSKPAKEGSASAPGNPAGEGRPTTDKKIPDVDVTESPSSKPDANSQPSLP(见序列表SEQ ID NO.1)；

BSjRAD23-2氨基酸序列：

VIRAMRAGFNNPDRAFEYLSSGNIPNIDIVDQPSQREGSESVSPEAPGDADTPGSESAGSEDPIA(SEQ IDNO.2)。

其对应的核苷酸序列为：

BSjRAD23-1(136-369)核苷酸序列：

atacattcaggcaaggtaatggaggatagtaagtcattaaaagattacaaggtgacggattcgggttttgtcgtagtaatgtctgtctcaaagccagccaaagagggaagtgcttcagccccaggtaaccctgcaggtgaaggaaggccaacaacagataaaaagattcctgatgttgacgtaactgagtctccgagtagtaaaccagatgcaaattctcagcctagcctaccc(SEQ ID NO.5)；

BSjRAD23-2(496-690)核苷酸序列：

gtcatacgagcaatgcgagcgggcttcaacaatccggatagagcatttgaatacctctcatcaggaaacattccgaatattgatattgtcgaccagccatcgcaaagagaaggaagtgagagtgtatcaccagaagcacctggggatgctgatactccaggatctgaatcggctggttcagaagacccaatcgca(SEQ ID NO.6)。

3.1.2 SjPGM的抗原表位分析结果

参照预测SjRAD23预测抗原表位的方法预测SjPGM的抗原表位，发现(85-166)肽段为抗原表位富集区，其对应的氨基酸序列如下：

WRLNERMYGALQGLNKSETAAEHGEAQVKIWRRAYDIPPPPVDISDPRFPGNEAKYALLDSSCIPRTECLKDTVQRVLPFWF(SEQ ID NO.3)；

其对应的核苷酸序列(253-498)：

tggcgtctaaatgaaagaatgtacggtgctctccagggacttaataagtctgaaactgctgctgaacatggtgaggcacaagttaagatatggagacgtgcatatgatatacctcctcctcctgttgatatttcagaccctcgctttcctggtaatgaagctaagtatgctttacttgactcttcttgcataccacgtactgaatgcttaaaggacactgtacaacgtgtactaccattctggttt(SEQ ID NO.7)。

3.1.3 BSj23的抗原表位分析及序列

截取日本血吸虫23KD抗原(Sj23)的大亲水区(LHD-SJ23)作为BSj23序列，其氨基酸序列如下：

MTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRN(SEQ IDNO.4)；

对应的核苷酸序列为：

atgactggtgctctggaaaatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac(SEQ ID NO.8)。

3.2多表位重组质粒的构建

rBSjPGM-BSj23的蛋白质序列如SEQ ID NO.21所示，rBSjPGM-BSj23的核酸序列如SEQ ID NO.22所示。

rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23的蛋白质序列如SEQ ID NO.23所示，rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23的核酸序列如SEQ ID NO.24所示。

rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23的蛋白质序列如SEQ ID NO.25所示，rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23的核酸序列如SEQ ID NO.26所示。

重组质粒经酶切后,分别出现了约500bp、700bp、650bp左右大小的DNA条带,表明为正确重组质粒。重组质粒经测序鉴定为重组正确(见图2、3)。

3.2重组蛋白rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23诱导表达及纯化结果

将含重组质粒的大肠杆菌加入IPTG诱导8小时后，收集菌体，SDS-PAGE分析，相比对照组，分别有预期大小的蛋白出现，且重组蛋白质均以包涵体的形式表达，如图4所示，经过镍亲和层析方法得到了纯度较高的重组蛋白质。

实施例2应用日本血吸虫重组多表位抗原诊断羊血吸虫病

1材料

1.1血清：羊血吸虫病阳性血清共91份为本实验室保存，均是采集粪便孵化法检测为阳性的羊的血清；阴性血清共44份，均为剖杀后肝门静脉冲虫阴性羊的血清。随机取20份阴性血清等量混合作为标准阴性血清。

1.2相关试剂:TMB购自天根生物技术公司。辣根过氧化物酶标记驴抗羊IgG由本实验室保存。

2方法

2.1 ELISA法检测羊日本血吸虫阳、阴性血清

应用实施例1制备的重组多表位抗原rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23作为检测抗原(15μg/ml)，以间接ELISA法检测羊血清。主要步骤如下：

2.1.1抗原(20μg/ml)用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板，抗原稀释度按预试验结果进行，每孔加100μl，4℃过夜。用PBST洗二次，每次5min。

2.1.2用1％明胶37℃封闭1hr，每孔加150μl。结束后用PBST洗三次，每次5min。

2.1.3加1：100稀释的待检血清，每份血清加二孔，每孔100μl，37℃作用1hr，每次试验都设标准阴性对照孔。结束后用PBS洗四次，每次5min。

2.1.4加HRP标记的驴抗羊IgG，每孔100μl，37℃作用60min。结束后用PBST洗四次，每次5min。

2.1.5加TMB/柠檬酸缓冲液显色，每孔100μl，37℃作用5min左右。每孔加50μl 2M硫酸终止反应。

2.1.6于450nM测OD值，计算平均OD值。

2.1.7结果判断：把标准参照血清平均值的2.1倍作为阈值,小于阈值的判断为阴性，其余判断为阳性。

3结果

3.1重组多表位抗原诊断羊血吸虫病

以重组多表位抗原rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23、rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23作为诊断抗原，应用间接ELISA法检测91份羊血吸虫病阳性血清，44份血吸虫病阴性血清，虫卵可溶性蛋白(SEA)作为参照，结果此重组多表位抗原检测羊血吸虫病，敏感性分别为93、4％、97.8％、89％，特异性均为100％；SEA敏感性为93.4％，特异性为75％(见表2)。

表2重组多表位抗原诊断羊血吸虫病的结果

从以上结果看出，以此多表位重组抗原rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23和rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23作为诊断抗原，对阳性羊的检出率和对健康羊的阴性符合率都很高，可以看出rBSjPGM-BSj23、rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23和rBSjRAD23-2-BSjPGM-BSj23有潜力发展成为新的、特异、敏感的羊血吸虫病诊断抗原。同时由于基因重组抗原可以大量生产制备，易于产品的标准化和诊断技术的规范化。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，该重组多表位抗原包含：下述四个表位多肽中任意两个以上表位多肽以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列，

2.根据权利要求1所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。

3.根据权利要求1所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽、SEQ ID NO.1所示SjRAD23表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。

4.根据权利要求1所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原包含：SEQ ID NO.2所示SjRAD23表位多肽、SEQ ID NO.3所示SjPGM表位多肽和SEQ ID NO.4所示Sj23表位多肽相串联形成的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。

5.根据权利要求2所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求3所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的日本血吸虫重组多表位抗原，其特征在于，所述重组多表位抗原的基因序列包含SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。

8.权利要求1至7任一项所述日本血吸虫重组多表位抗原在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。

9.一种诊断血吸虫病的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的日本血吸虫重组多表位抗原。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述日本血吸虫重组多表位抗原包含SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、或SEQ ID NO.25所示氨基酸序列。