CN113365655A

CN113365655A - 包含糖基化ag85a蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物及其制备方法

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Publication number: CN113365655A
Application number: CN202080011317.9A
Authority: CN
Inventors: 李勇直; 孙恩珠; 慎城宰; 金洪敏; 赵宽九; 吴明烈
Original assignee: Quratis Inc; Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Bioapplications Inc
Current assignee: Quratis Inc; Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University; Bioapplications Inc
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2021-09-07
Also published as: KR102317403B1; WO2020159169A3; KR20200093723A; EP3919075A2; US20220088167A1; EP3919075A4; WO2020159169A2; JP2022518807A; JP7233662B2

Abstract

本发明涉及一种包含糖基化Ag85A蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物、用于制备该蛋白质的载体、使用该载体的转化子以及通过使用该转化子生产糖基化Ag85A蛋白的方法。包含本发明的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物具有诱导多功能T细胞增加的作用，该多功能T细胞同时分泌在抗结核病的保护作用方面很重要的IFN‑γ、TNF‑α和IL‑2，因此可以有效地用作预防结核病的疫苗。此外，糖基化Ag85A蛋白可以通过优化用于蛋白质生产的载体在植物中有效表达和高产率分离，从而可以低成本大规模生产。

Description

包含糖基化AG85A蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种包含糖基化Ag85A蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物、用于制备该蛋白质的载体、使用该载体的转化子以及通过使用该转化子生产糖基化Ag85A蛋白的方法。

本申请要求于2019年1月28日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2019-0010431的优先权和权益，并且该申请的说明书和附图中公开的所有内容均并入本申请中。

背景技术

结核病是世界卫生组织(WHO)管理的三大传染病之一，由微生物学家罗伯特·科赫(Robert Koch)于1882年发现，是一种由结核分枝杆菌引起的致命疾病，发病率和死亡率都很高。全世界约有6000万患者感染了活动性结核，估计每年约有5000万至1亿新感染结核病，每年至少有900万新发结核病病例，已知每年有150万人死于结核病。结核病发病率为每10万人中146人发病，结核病死亡率为每10万人中49人死亡，是单一传染病中最常见的死因，表明结核病仍然是世界范围内严重的健康问题。

同时，关于制备预防如上所述的结核病的疫苗，医疗行业对动物蛋白质的大规模生产的需求是开发用于生产各种复杂蛋白质或肽的混合表达系统。宿主生物包括从细菌到真核生物(例如酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞)的所有生物。然而，细菌可以产生相对大量的蛋白质，但在很多情况下会形成不溶性包涵体，并且在翻译后修饰过程中存在局限性。相比之下，真核细胞表达系统也可能由于不同的翻译后过程而产生与最初预期的蛋白质不同的蛋白质，但该系统可以会将糖与蛋白质结合，并可以进行翻译后过程。植物生产系统目前在商业上用于合成外源蛋白质，植物细胞的翻译后修饰与在动物细胞中进行的非常相似，可以准确地生产多亚基蛋白质。对于植物来源的动物蛋白质，氨基酸残基以与原始蛋白质相同的方式糖基化。然而，尽管植物细胞分泌途径中的N-连接糖基化过程显示出比动物表达系统中产生的糖基化形式更多样，但在许多情况下仍保持糖蛋白活性。

对于目前尝试使用植物开发的疫苗，在致病性疾病的情况下，执行细菌和病毒粘膜感染所必需的粘附功能的蛋白质、显示细菌毒性的毒素蛋白质以及构成病毒结构的蛋白质通常用作抗原，在非致病性疾病的情况下，产生引起疾病的物质和成因物质的主要酶用作抗原。根据迄今为止进行的研究结果，由于有报道称植物来源的重组抗原蛋白具有与动物来源的疫苗相同的功能，因此需要对该重组抗原蛋白进行各种深入的研究。

发明内容

技术问题

作为通过用糖基化Ag85A抗原蛋白和非糖基化Ag85A抗原蛋白对小鼠进行免疫的免疫反应、对抗结核病的保护功效等进行的实验的结果，本发明人实验证实了在植物细胞中表达并被糖基化Ag85A，比非糖基化Ag85A具有更好的抗结核病的保护作用，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防结核病的疫苗组合物，其包含糖基化Ag85A蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。

技术方案

为实现上述本发明的目的，本发明提供了一种用于预防结核病的疫苗组合物，其包含糖基化Ag85A蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

作为本发明的一个示例性实施方式，糖基化Ag85A蛋白可以诱导对被结核分枝杆菌感染的肺组织的损伤的抑制。

作为本发明的另一个示例性实施方式，糖基化Ag85A蛋白可以诱导肺中结核分枝杆菌数量的减少。

作为本发明的另一个示例性实施方式，糖基化Ag85A蛋白可以诱导CD4⁺CD44⁺T细胞的增加，该CD4⁺CD44⁺T细胞同时分泌两种或更多种选自由IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和IL-2(白介素-2)组成的组中的细胞因子。

作为本发明的又一个示例性实施方式，糖基化Ag85A蛋白可以诱导CD8⁺CD44⁺T细胞增加，该CD8⁺CD44⁺T细胞同时分泌两种或更多种选自由IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和IL-2(白介素-2)组成的组中的细胞因子。

进一步地，本发明提供了一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；以及编码纤维素结合模块3(以下简称CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO:2的碱基序列。

此外，本发明提供了一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，包含SEQ ID NO：2的碱基序列；和编码BiP信号肽的基因，其包含SEQ ID NO:3的碱基序列。

此外，本发明提供了一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列；以及编码HDEL肽的基因，其包含SEQ ID NO:4的碱基序列。

作为本发明的一个示例性实施方式，载体还可以包括被肠激酶识别和切割的序列，其包含SEQ ID NO：5的碱基序列。

作为本发明的另一个示例性实施方式，载体还可以包括编码连接肽的基因，其包含SEQ ID:6的碱基序列。

此外，本发明提供了一种用于制备预防结核病疫苗的转化子，该转化子用载体转化。

作为本发明的示例性实施方式，转化子可以是植物。

作为本发明的另一个示例性实施方式，植物可以是一种或多种选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃、梨、草莓、西瓜、韩国香瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜组成的组中的双子叶植物；或一种或多种选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱组成的组中的单子叶植物。

此外，本发明提供了一种生产用于预防结核病的疫苗组合物的方法，该方法包括：(a)培养转化子；和

(b)从转化子或培养液中分离和纯化糖基化Ag85A蛋白。

此外，本发明提供了一种预防结核病的方法，该方法包括：向个体施用包含糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物，该蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

此外，本发明提供了包含糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物用于预防结核病的用途，该蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

此外，本发明提供了包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白在制备用于预防结核病的疫苗中的用途。

有益效果

包含本发明的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物具有诱导多功能T细胞增加的作用，该多功能T细胞同时分泌对抗结核保护作用重要的IFN-γ、TNF-α和IL-2，因此可以可用作预防结核病的疫苗。此外，糖基化Ag85A蛋白可以通过优化用于蛋白质生产的载体在植物中有效表达和高产分离，从而可以低成本大规模生产。

附图说明

图1说明了根据本发明示例性实施方式的用于表达糖基化Ag85A蛋白的基因的排列。

图2说明了进行蛋白质印迹以确认植物表达的Ag85A蛋白的糖基化的结果。

图3说明了在用结核分枝杆菌感染小鼠后比较IFN-γ的分泌以探索糖基化Ag85A蛋白作为疫苗抗原的可能性的结果。

图4示意性地说明了设计用于糖基化Ag85A蛋白的免疫学研究的实验方法。

图5A至5C是在最终免疫4周后比较T细胞的比例的结果，该T细胞通过抗原刺激(例如Ag85A蛋白)在小鼠中分泌一种或多种细胞因子。

图6A说明了用结核分枝杆菌感染免疫小鼠后肺组织的肉眼检查和苏木精-伊红(H&E)染色的结果。

图6B说明了用结核分枝杆菌感染免疫小鼠后4和12周测量肺和脾中的集落形成单位(CFU)的结果。

图7A至7C说明了在用结核分枝杆菌感染免疫小鼠4周后，比较分泌一种或多种细胞因子的T细胞的比例的结果。

图8说明了使用本发明中使用的SEQ ID NO：1的氨基酸序列预测糖基化可能性的程序的运行结果。

具体实施方式

作为通过用糖基化Ag85A抗原蛋白和非糖基化Ag85A抗原蛋白对小鼠进行免疫的免疫反应、对抗结核病的保护功效等进行的实验，本发明人实验证实在植物细胞中表达并被的糖基化Ag85A，比非糖基化Ag85A具有更好的抗结核保护作用，从而完成了本发明。

在本发明的示例性实施方式中，证实通过分离和纯化使用在植物中被表达的Ag85A表达载体所产生的蛋白质，证实可以在植物中产生糖基化Ag85A(参见实施例1)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，进行蛋白质印迹以确认植物中产生的Ag85A蛋白是否被糖基化，结果，通过确认聚糖裂解来确认植物表达的Ag85A蛋白是否被糖基化(参见实施例2)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，作为使用感染结核分枝杆菌的小鼠测量肺细胞中IFN-γ分泌的结果，通过确认IFN-γ的持续分泌来探索糖基化Ag85A作为疫苗抗原的可能性。(参见实施例3)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，作为检查糖基化Ag85A蛋白的免疫原性的结果，证实在用糖基化Ag85A蛋白免疫的小鼠的情况下，同时分泌IFN-γ，TNF-α和IL-2的T细胞的比例增加了(参见实施例4)。

以下，将详细描述本发明。

本发明提供了一种糖基化Ag85A蛋白，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

如本文所用，术语“Ag85A”是已被广泛研究的抗原之一，并且已知不仅作为蛋白质而且作为DNA疫苗显示出有效作用。

如本文所用，作为细胞(真核生物)的蛋白质翻译后过程，术语“糖基化”分为N-糖基化和O-糖基化，这根据要连接的官能团而变化，以及糖(例如乳糖)附加在细胞中产生的蛋白质上的过程统称为“糖基化”。当糖链通过糖基化过程与蛋白质连接时，蛋白质会经历“折叠”过程，形成三维结构，从而赋予稳定性，使蛋白质可以长时间保持而不会折叠。此外，附加在蛋白质上的糖链可以转移到细胞膜上成为细胞膜蛋白质，从而表现出抗原样作用。如上所述的糖基化蛋白质称为糖蛋白，代表性的糖蛋白的实施例包括在免疫反应中起重要作用的抗体等。作为使用本发明中使用的SEQ ID NO：1的氨基酸序列(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)运行用于预测糖基化可能性的程序的结果，预测在天冬酰胺(N)203处会发生N-糖基化(参见实施例8)，但不限于此，可以在具有与本发明相同作用的范围内进行修饰。

作为本发明的另一方面，本发明提供了一种用于预防结核病的疫苗组合物，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白。

如本文所用，“抗原”一般是指在体内引起免疫反应的所有物质，优选为病毒、化学品、细菌、花粉、癌细胞、虾等或部分肽或其蛋白质，但不限于此，只要它是可在体内引起免疫反应的物质即可。

如本文所用，术语“疫苗”是包含在生物体中引起免疫反应的抗原的生物制剂，并且是指通过注射或口服给药至人或动物在生物体中诱导免疫以预防传染病的免疫原。动物为人或非人动物，非人动物是指猪、牛、马、狗、山羊、绵羊等，但不限于此。

如本文所用，术语“疫苗组合物”可根据典型方法通过配制成口服制剂(例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、混悬液、乳剂、糖浆和气雾剂)以及无菌注射液的形式使用。当制备组合物时，可以使用常用的稀释剂或赋形剂制备组合物，例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。用于口服制剂的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊等，固体制剂可以通过将至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等与卵磷脂样乳化剂混合来制备。此外，除了简单的赋形剂之外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服制剂的液体制剂可以为混悬液、内服液、乳剂、糖浆等，除了作为简单的常用稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。肠胃外给药制剂的实施例包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬液、乳剂和冻干制剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等注射用酯等。此外，可以进一步包括常规已知的“免疫抗原佐剂”。只要是本领域已知的佐剂，可以没有限制地使用，但是例如，可以通过进一步包括弗氏完全佐剂或不完全佐剂来增强免疫原性。

本发明的疫苗组合物或药物组合物，根据典型方法可以配制成口服制剂(例如粉末、颗粒、片剂、胶囊、混悬液、乳剂、糖浆、气雾剂等)，以及外用制剂、栓剂或无菌注射液使用。

根据本发明的疫苗组合物的给药途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠途径。优选口服或肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明的疫苗组合物也可以以栓剂的形式用于直肠给药。

根据个体的年龄、体重、性别、身体状况等选择根据本发明的疫苗组合物或药物组合物的剂量。在个体中诱导免疫保护反应而没有特定副作用所需的量根据用作免疫原的重组蛋白和随机赋形剂的存在可能会有所不同。一般而言，每个剂量含有0.1至1000微克，优选0.1至100微克蛋白质每毫升本发明重组蛋白质的无菌溶液。在疫苗组合物的情况下，如果需要，可以进行初始剂量，然后任选地重复抗原刺激。

如本文所用，“免疫抗原佐剂”通常是指增加对抗原的体液和/或细胞介导的免疫应答的任何材料。

如本文所用，“预防”是指通过施用根据本发明的糖基化Ag85A蛋白来抑制结核病或延迟结核病发作的所有行动。

在本发明中，“结核病”包括眼结核、皮肤结核、肾上腺结核、肾结核、附睾结核、淋巴腺结核、喉结核、结核性中耳炎、肠结核、耐多药结核、肺结核、胆道结核、骨结核、咽喉结核、淋巴结核、肺虚证、乳腺结核、脊椎结核，但不限于此。

在本发明中，“抑制”是指通过施用本发明的糖基化Ag85A蛋白来预先预防、减轻或治疗结核病。

作为本发明的另一方面，本发明提供了一种预防结核的方法，该方法包括：向个体施用包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物。

作为本发明的又一方面，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物用于预防结核病的用途。

作为本发明的又一示例性实施方式，本发明提供了包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白在制备用于预防结核病的疫苗中的用途。

如本文所用，“个体”是指可以施用本发明的糖基化Ag85A蛋白的受试者，并且受试者不受限制。

如本文所用，“施用”是指通过任何合适的方法向个体提供本发明的预定疫苗组合物。

在本发明中，糖基化Ag85A蛋白可以诱导抑制结核分枝杆菌感染引起的肺组织损伤。

在本发明中，糖基化Ag85A蛋白可以诱导肺中结核分枝杆菌数量的减少。

在本发明中，糖基化Ag85A蛋白可以诱导多功能T细胞的增加，该多功能T细胞同时分泌两种或多种选自由IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和IL-2(白细胞介素-2)组成的组中的细胞因子，T细胞可以是CD4⁺CD44⁺T细胞，也可以是CD8⁺CD44⁺T细胞，但不限于此。

作为本发明的又一方面，本发明提供了一种表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；和编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列。

如本文所用，“表达载体”是指能够表达插入该载体的外源核酸编码的肽或蛋白质的载体，优选制备成表达糖基化Ag85A蛋白的载体。“载体”是指用于在体外、离体或体内将碱基引入和/或转移到宿主细胞中的任何介质，并且可以是结合另一个DNA片段以引起结合片段复制的复制子，以及“复制子”是指在体内充当DNA复制的自主单位的任何遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒等)，即，它能够在自己的控制下进行复制。本发明的重组表达载体可以优选地包括启动子，该启动子是RNA聚合酶结合的转录起始因子，任何用于调节转录的操纵序列，编码合适mRNA核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列、终止子等，更优选地还可以包括M17的5'UTR位点基因，用于增加蛋白质的合成量，启动子可以包括，如pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、源自花椰菜花叶病毒的35S启动子、源自花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子等，终止子的示例是胭脂氨酸合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmy1 A终止子、菜豆碱终止子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱(optopine)基因终止子、大肠杆菌的rrnB1/B2终止子等，以上示例仅是示例性的不限于此。

此外，本发明提供了一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列；和编码BiP信号肽的基因，其包含SEQ ID NO:3的碱基序列。

此外，本发明提供了一种用于表达预防结核病疫苗的载体，其包含：编码包含SEQID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列；以及编码HDEL肽的基因，其包含SEQ ID NO:4的碱基序列。

在本发明中，载体还可以包括被肠激酶识别和切割的序列，包括SEQ ID NO：5的碱基序列。

在本发明中，载体还可以包含编码连接肽的基因，其包含SEQ ID:6的碱基序列。

在本发明中，载体是通过依次连接编码CBM3的基因、编码连接肽的基因、肠激酶切割位点和编码Ag85A蛋白的基因来构建的，编码能够在植物中靶向靶蛋白至内质网的BiP信号肽的基因与CBM3的3'末端相连，编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)基因允许将载体保留在内质网中的基因，可以与编码靶蛋白的基因的羧基末端相连，但不限于此。

作为本发明的又一方面，本发明提供了一种用于制备预防结核病疫苗的转化子，该转化子被糖基化Ag85A蛋白表达载体转化。

如本文所用，“转化”统指通过注入DNA改变活生物体的遗传特性，“转基因生物体”是通过分子遗传学方法注入外部基因制备的生物体，优选被本发明的重组表达载体转化的生物体，对生物体没有限制，只要是活生物体即可，例如微生物、真核细胞、昆虫、动物、植物等，优选大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、马、牛、根癌农杆菌、植物等，但不限于此。转化子可以通过转化、转染、农杆菌介导的转化、粒子枪轰击、超声处理、电穿孔和聚乙二醇(PEG)介导的转化等方法制备，但没有限制，只要是能够注射本发明的载体即可。

在本发明中，转化子优选为植物。从植物中生产有用材料有很多好处，其优势在于1)生产单价可以显著降低，2)可以从传统的流行方法(在动物细胞和微生物中合成以分离和纯化蛋白质)产生的各种污染源(病毒、致癌基因、肠毒素等)可以从根本上消除，并且3)与动物细胞或微生物不同，即使在商业化阶段，也可以管理种子储备。此外，还有一个优势是4)可以在最短的时间内根据增加的需求供应相应的材料，因为与现有的动物细胞系统相比，在安装技术和当对材料的需求迅速增加用于批量生产所需成本方面具有绝对的优势。如上所述通过转化植物来生产有用材料的方法受到关注的背景在于植物的蛋白质合成途径。由于翻译后修饰过程对哺乳动物蛋白质合成至关重要，由于植物具有真核蛋白质合成途径，因此有可能产生与哺乳动物中表达的蛋白质几乎相似的蛋白质。

在本发明中，所述植物可以是一种或多种选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃、梨、草莓、西瓜、韩国香瓜、黄瓜、胡萝卜和芹菜组成的组中的双子叶植物；或一种或多种选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱组成的组中的单子叶植物，但不限于此。

作为本发明的又一方面，本发明提供了一种生产用于预防结核病的疫苗组合物的方法，该方法包括：(a)培养转化子；和

(b)从转化子或培养液中分离和纯化糖基化Ag85A蛋白。

同时，下面的表1总结了本发明中使用的序列。

[表1]

以下，将给出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

[实施例]

实施例1.植物表达Ag85A表达载体的构建及蛋白质的分离纯化

1-1.CBM3融合Ag85A植物表达载体的构建

构建重组植物表达载体以在植物中表达CBM3融合Ag85A。更具体地说，BiP信号肽用于允许靶蛋白被移动到内质网，从而CBM3融合Ag85A蛋白可以被移动到内质网，并且His-Asp-Glu-Leu(HDEL)与羧基末端结合，使得融合蛋白可以积累并储存在内质网中。分离融合蛋白所需的CBM3，编码连接肽的序列和被肠激酶识别并切割的序列结合在编码Ag85A的基因前，然后插入植物表达载体pCAMBIA 1300，从而构建重组载体(参见图1)。

1-2.植物表达载体的瞬时表达

将实施例1-1中制备的植物表达载体通过电击法电穿孔转化农杆菌LBA4404菌株。转化后的农杆菌在5mL YEP液体培养基(酵母抽提物10g、蛋白胨10g、NaCl 5g、卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L)中28℃的条件下振荡培养16小时后，1mL原代培养基接种于50mL新鲜YEP培养基中，在28℃的条件下振荡培养6小时。

通过离心(7,000rpm，4℃，5分钟)收集如上所述培养的农杆菌，然后以600nm的波长下O.D.1.0的浓度再次悬浮在渗透缓冲液(10mM MES(pH 5.7)、10mM MgCl₂和200μM乙酰丁香酮)中。农杆菌渗入是通过使用已取下注射针的注射器将农杆菌悬浮液注射到本氏烟草叶背面的方法进行的。

1-3Ag85A的分离纯化

将50mL蛋白质提取缓冲液(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl、0.1％Triton X-100和1X蛋白酶抑制剂)加入10g实施例1-2中制备的本氏烟草中，用搅拌器粉碎组织，然后在13,000rpm和4℃下离心20分钟以回收蛋白质提取物。在蛋白质提取物中加入10g水合微晶纤维素后，将所得混合物在4℃下充分混合1小时，使CBM3融合Ag85A蛋白与微晶纤维素结合。通过在13,000rpm和4℃下离心10分钟收集结合了CBM3融合Ag85A蛋白的微晶纤维素，然后用50mL洗涤缓冲液(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl)洗涤两次并再次悬浮在10mL的肠激酶反应溶液(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl和1mM CaCl₂)中。向悬浮液中加入多达20个单位的肠激酶，所得混合物在28℃下反应4小时，然后通过离心(14,000rpm，4℃，10分钟)从纤维素中分离包含肠激酶和Ag85A的反应溶液。然后，为了移除反应液中的肠激酶，在反应溶液中加入STI-Sepharose，4℃反应1小时，然后通过离心(14,000rpm、4℃和10分钟)得到分离和纯化的未与STI-Sepharose结合的Ag85A。

实施例2.植物表达的Ag85A蛋白的糖基化的确认

Endo-H(NEB，目录号P0702S)和PNGase F(NEB，目录号P0704S)用于确认Ag85A是否被糖基化。对于Endo-H处理，将1μg分离纯化的Ag85A蛋白与1μL 10X(多重)糖蛋白变性缓冲液(5％SDS，400mM DTT)混合并填充蒸馏水以制备具有最终体积为10μL的反应溶液。将反应溶液置于沸水中10分钟变性，然后置于冰上稍稍冷却，然后分别加入2μL的10XGlycobuffer 3(500mM醋酸钠，pH 6)、1μL Endo-H酶和7μL蒸馏水到反应溶液中并在37℃下反应1小时。PNGase F的处理与Endo-H变性过程中的处理方式相同，通过加入2μL 10XGlycobuffer 2(500mM磷酸钠，pH 7.5)、2μL 10％NP-40、1μL PNGase F酶和5μL蒸馏水制备终体积为20μL的反应溶液，在37℃反应1小时。将完全反应的蛋白质和未处理的蛋白质同时进行蛋白质印迹，此时使用Ag85A抗体(Abcam，目录号ab193499)作为抗体。

结果，如图2所示，证实在同时使用Endo-H酶和PNGase F酶的情况下，进行蛋白质印迹时出现去糖基化带，表明聚糖被切割。

实施例3.G-Ag85A作为结核病抗原的潜力的验证

使用感染结核分枝杆菌的小鼠肺细胞研究了IFN-γ分泌的程度，以了解在实际感染结核分枝杆菌过程中相应抗原是否充当抗原，以及是否可以用作疫苗候选材料。首先，小鼠通过气溶胶途径感染了北京株HN878结核分枝杆菌的200个集落形成单位(CFU)，通过分别处死6只小鼠和未感染的对照，分别在4周或12周后分离肺细胞(5x10⁵个细胞)，将大肠杆菌中产生的非糖基化Ag85A(以下简称NG-Ag85A)和植物中产生的糖基化Ag85A(以下简称G-Ag85A)分别以5μg/ml的浓度，在37℃反应12小时，然后用ELISA试剂盒测定反应溶液上清中分泌的干扰素-γ。

结果，如图3所示，证实植物表达的Ag85A(G-Ag85A)在感染结核分枝杆菌后4周或12周后作用于小鼠肺细胞，持续分泌IFN-γ，其量增加至与大肠杆菌表达的Ag85A(NG-Ag85A)相比的显著水平。这意味着Ag85A是对结核分枝杆菌感染具有免疫原性的抗原，并且探索了G-Ag85A与NG-Ag85A一起作为疫苗抗原的可能性。

实施例4.G-Ag85A的免疫原性研究

4-1免疫原性实验设计

为了研究植物表达的糖基化结核病抗原G-Ag85A的免疫原性，以2周的间隔用BCG、NG-Ag85A和G-Ag85A对小鼠进行3次免疫。通过在最终免疫后4周(结核分枝杆菌的挑战接种前2周)和挑战接种后4周和12周分别处死小鼠来研究免疫应答和保护效果(参见图4)。

4-2免疫后抗原特异性多功能T细胞诱导

多功能T细胞已知是抵御结核分枝杆菌的重要宿主成分之一，是分泌所有IFN-γ、TNF-α和IL-2的T细胞。在这方面，通过在最终免疫后4周处死每组的6只小鼠来分离肺细胞(5x10⁵个细胞)，并与NG-Ag85A或G-Ag85A抗原蛋白在5μg/ml的浓度下，在37℃反应12小时。反应后，通过细胞计数分析分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的CD4⁺CD62L^-和CD8⁺CD62L^-T细胞，在这种情况下，CD4⁺和CD8⁺的门控结果得到证实。

结果，如图5A至5C所示，证实在用G-Ag85A免疫的情况下，与NG-Ag85A组相比，CD4⁺CD44⁺T细胞的多细胞因子分泌比例增加至显著水平。

4-3植物表达抗原G-Ag85A抗结核病的保护效果

最终免疫后4周，小鼠用200CFU的HN878结核分枝杆菌感染，4周和12周后通过处死小鼠肉眼检查肺组织病变，并检查肺和脾细胞中的集落形成单位(CFU)。

结果，如图6A所示，证实即使通过肉眼观察，与BCG或NG-Ag85A组相比，G-Ag85A组的肺组织的损伤程度较小，证实即使通过苏木精-伊红(H&E)染色法观察，与BCG或NG-Ag85A组相比，G-Ag85A组的组织损伤程度轻微，尤其证实感染后12周时，表现出的作用差异足以用肉眼确认保护效果。

进一步，将肺、脾组织粉碎培养，计数时按log10CFU计算细菌数，用于统计分析。

结果，如图6B所示，证实感染4周后，与未接种组相比，BCG、NG-Ag85A、G-Ag85A的肺中CFU均显著降低，并且证实与未接种组相比，在脾中三类接种组均显示CFU也有所下降。在感染后12周的肺中，G-Ag85A接种组的CFU最低，因此证实G-Ag85A接种组具有最高的保护作用，并证实在脾中，G-Ag85A接种组也显示出比NG-Ag85A组更好的作用。

4-4感染后4周诱导抗原特异性多功能T细胞

当用于抑制感染的T细胞应答在感染结核分枝杆菌的小鼠的肺组织中建立时，通过在感染后4周处死每组的6只小鼠来分离肺细胞(5x10⁵个细胞)并与NG-Ag85A或G-Ag85A抗原蛋白，在5μg/ml浓度下，在37℃反应12小时。反应后，通过细胞计数分析分泌IFN-γ、TNF-α和/或IL-2的CD4⁺CD62L^-和CD8⁺CD62L^-T细胞，在这种情况下，CD4⁺和CD8⁺的门控结果得到证实。

结果，如图7A到7C所示，证实在用G-Ag85A免疫的情况下，与NG-Ag85A组相比，CD4⁺CD44⁺T细胞的多细胞因子分泌比例增加到显著水平，特别是，证实同时分泌对抗结核病保护作用重要的IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD4⁺CD44⁺多功能T细胞增加到显著水平。

提供本发明的上述描述是为了说明的目的，本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明技术精神或基本特征的情况下，本发明可以容易地修改为其他具体形式。因此，应当理解，上述实施方式在各方面仅是示例性的，而不是限制性的。

工业实用性

根据本发明的糖基化Ag85A蛋白可以有效地用作预防结核病的疫苗。此外，糖基化Ag85A蛋白可以通过优化用于蛋白质生产的载体在植物中有效表达和高产率分离，从而可以低成本大规模生产。

<110> 巴伊沃爱普有限公司

延世大学校产学协力团

丘拉提斯股份有限公司

<120> 包含糖基化AG85A蛋白的用于预防结核病的疫苗组合物及其制备方法

<130> MPO21-068CN

<150> KR 10-2019-0010431

<151> 2019-01-28

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 301

<212> PRT

<213> Ag85A

<400> 1

Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro

1 5 10 15

Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn

20 25 30

Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe

35 40 45

Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser

50 55 60

Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys

85 90 95

Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn

100 105 110

Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala

115 120 125

Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val

130 135 140

Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly

145 150 155 160

Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala

165 170 175

Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp

180 185 190

Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp

195 200 205

Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu

210 215 220

Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe

225 230 235 240

Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe

245 250 255

Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn

260 265 270

Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr

275 280 285

Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser

290 295 300

<210> 2

<211> 477

<212> DNA

<213> CBM3

<400> 2

gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60

ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120

accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180

gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240

ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300

gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360

tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420

tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477

<210> 3

<211> 272

<212> DNA

<213> BiP

<400> 3

atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60

tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120

ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180

ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240

tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> HDEL

<400> 4

cacgatgagc tc 12

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 肠激酶识别和切割的核酸序列

<400> 5

gatgacgacg ataaa 15

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 连接肽

<400> 6

gaggcagccg ctaaggaagc tgcagcgaaa gcc 33

<210> 7

<211> 903

<212> DNA

<213> Ag85A

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ggcctgcggg ctcaggatga ttttagcggc tgggacatca acacccctgc ttttgaatgg 180

tacgatcaga gcggcctgag cgtcgtgatg cctgtgggcg ggcagagcag cttctacagc 240

gattggtatc agcctgcttg cggcaaagct ggctgccaga cctacaagtg ggaaaccttt 300

ctgaccagcg aactgcctgg ctggctgcag gctaatcggc acgtgaaacc taccggcagc 360

gccgtggtgg gcctgagcat ggctgctagc tccgctctga ccctggctat ctaccaccct 420

cagcagtttg tgtacgctgg cgctatgagc ggcctgctcg atccctccca ggctatgggc 480

cctaccctga tcgggctcgc tatgggggat gctggggggt acaaagctag cgatatgtgg 540

ggccctaaag aagatcctgc ttggcagcgg aatgatcctc tgctcaacgt gggcaaactg 600

atcgctaata atacccgagt gtgggtgtac tgcggcaatg gcaaacctag cgatctgggc 660

gggaacaatc tgcctgctaa atttctggaa ggcttcgtgc ggaccagcaa catcaagttt 720

caggatgctt acaatgctgg cgggggccac aatggcgtat ttgattttcc tgatagcggc 780

acccacagct gggaatactg gggcgctcag ctgaatgcta tgaaacctga tctgcagcgg 840

gctctgggcg ctacccctaa taccggccct gctcctcagg gcgctggctc cggatctggt 900

agt 903

<210> 8

<211> 159

<212> PRT

<213> CBM3

<400> 8

Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser

20 25 30

Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val

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Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile

50 55 60

Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr

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Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu

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Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile

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Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn

115 120 125

Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val

130 135 140

Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly

145 150 155

Claims

1. 一种用于预防结核病的疫苗组合物，其包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中糖基化Ag85A蛋白诱导对结核分枝杆菌感染的肺组织的损伤的抑制。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中糖基化Ag85A蛋白诱导肺中结核分枝杆菌数量的减少。

4. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中糖基化Ag85A蛋白诱导CD4⁺CD44⁺T细胞的增加，所述CD4⁺CD44⁺T细胞同时分泌两种或更多种选自由IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子- α) 和 IL-2（白介素-2）组成的组中的细胞因子。

5. 根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中糖基化Ag85A蛋白诱导CD8⁺CD44⁺T细胞的增加，所述CD8⁺CD44⁺T细胞同时分泌两种或更多种选自由IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子- α) 和 IL-2（白介素-2）组成的组中的细胞因子。

6. 一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；和编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列。

7. 一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列；和编码BiP信号肽的基因，其包含SEQ ID NO: 3的碱基序列。

8. 一种用于表达预防结核病疫苗的载体，包括：编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的基因；编码纤维素结合模块3(CBM3)的基因，其包含SEQ ID NO：2的碱基序列；以及编码HDEL肽的基因，其包含SEQ ID NO: 4的碱基序列。

9. 根据权利要求6所述的载体，其中所述载体还包括被肠激酶识别和切割的序列，其包含SEQ ID NO：5的碱基序列。

10. 根据权利要求6所述的载体，其中所述载体还包括编码连接肽的基因，其包含SEQID:6的碱基序列。

11.一种用于制备预防结核病疫苗的转化子，所述转化子由权利要求6至10中任一项所述的载体转化。

12.根据权利要求11所述的转化子，其中所述转化子是植物。

13.根据权利要求12所述的转化子，其中所述植物为一种或多种选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、马铃薯、番茄、大白菜、萝卜、卷心菜、生菜、桃、梨、草莓、西瓜、韩国香瓜、黄瓜、胡萝卜、芹菜组成的组中的双子叶植物；或一种或多种选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦和洋葱组成的组中的单子叶植物。

14.一种生产用于预防结核病的疫苗组合物的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求11所述的转化子；(b)从转化子或培养液中分离和纯化糖基化Ag85A蛋白。

15. 一种预防结核病的方法，所述方法包括：向个体施用包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物。

16. 包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白的疫苗组合物用于预防结核病的用途。

17. 包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的糖基化Ag85A蛋白在制备用于预防结核病的疫苗中的用途。