CN107810271A - 用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法 - Google Patents

用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了改变植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式的方法。该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内，由此改变所述的植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。

Description

用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合 物和方法
本发明的技术领域和背景技术
在一些实施方案中，本发明涉及用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法。
植物作为用于生产哺乳动物治疗蛋白质(包括酶)、生长因子、结构蛋白质(例如胶原蛋白)、嵌合蛋白质(例如Enbrel)和多聚体蛋白质(例如抗体)的宿主，具有很大的潜力。
使用用于生产重组药物的植物的优点包括大规模生产、降低生产成本、保持和传递以及消除所得的包含可能的有害污染物(例如对人类和其他哺乳动物是致病性的病毒或朊病毒)的产物的风险。植物，类似于其他的异源表达系统(包括哺乳动物细胞、细菌、酵母菌和昆虫)，展现出糖基化的差异。
在植物中，如同在其他的真核细胞中，在多聚核糖体(与内质网(ER)有关)上合成的大部分可溶性和膜结合的蛋白质为糖蛋白，包括后来被输送至高尔基复合体、溶酶体、细胞质膜或细胞外基质的那些蛋白质。附着在糖蛋白上的多糖包含大量以线性或支化结构连接的糖残基，其中所述的结构可以呈现许多不同的构造。这些多糖在促进正确的蛋白质折叠和组织、并由此增加蛋白质稳定性中起到基本的作用。它们还可以包含靶向信息，或者可以直接与蛋白质识别有关。3种主要的蛋白质翻译后修饰(与碳水化合物有关)为N-和O-连接的糖基化，以及糖基磷脂酰肌醇锚定物的插入。
在进化过程中，哺乳动物和植物系统中的N-连接的糖基化机制是保守的。但是，在高尔基复合体中，在寡糖修整和多糖修饰的最终步骤中，观察到差异。与细菌(不具有N-连接的多糖)和酵母(具有聚甘露糖多糖)相反，植物生产具有复杂的N-连接的多糖的糖蛋白多聚体，其具有被2个N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基取代的核心。在哺乳动物中也观察到这些糖蛋白多聚体。例如参见Kornfeld and Kornfeld,Ann.Rev.Biochem.54:631(1985)。植物和动物糖多肽多聚体包含不同的末端碳水化合物，其与存在的寡糖的外部分支直接连接。动物糖多肽多聚体(包括哺乳动物糖多肽多聚体)具有作为末端碳水化合物残基存在的唾液酸，而植物糖多糖多聚体不具有该唾液酸。如同哺乳动物中发生的那样，末端核心被β1,2-连接的木糖(Xyl)和α1,3-连接的核心岩澡糖(Fuc)、而非α1,6-连接的核心岩澡糖取代。此外，植物糖蛋白缺乏在动物中发现的特征性含有半乳糖(Gal)-和唾液酸的复合N-多糖(N-乙酰基神经氨酸-α-2-6/3Galβ1-4)。
植物衍生的重组蛋白质由于外来糖残基(即，α-1,3岩澡糖和β-1,2木糖残基)的存在，而具有严重的免疫原性的风险。为了降低免疫原性，已经研发了大量的平台技术，一些技术在Naoko Yamane-Ohnuki and Mitsuo Satoh MAbs.2009May-Jun；1(3):230-236,Strasser et al.,Plant Biotechnology Journal(2008)6,pp.392-402；Matsuo et al.,Journal of Bioscience and Bioengineering(2014)118,4,pp.448-454；Matsuo PlantBiotechnol.J.,9,264-281(2011),以及在US 20030159178,US 20120079627,20070089201和WO 01/29242中有述。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了在植物或植物细胞中改变所关注多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于植物或植物细胞的亚细胞分隔区中，由此修改植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了生产所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于植物或植物细胞的亚细胞分隔区中；以及随后
(b)分离所述的所关注的多肽。
根据本发明的一些实施方案，经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的在至少一种糖基转移酶，其中所述的物种表达野生型水平或展现出野生型活性的至少一种糖基转移酶。
根据本发明的一些实施方案，糖基转移酶包括β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。
根据本发明的一些实施方案，经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含编码融合多肽的核酸序列，其包含在翻译中与亲和部分融合的细胞壁结合肽，所述的亲和部分用于结合所关注的多肽。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了分离的多肽，其包含在翻译中与异源亲和部分融合的细胞壁结合肽。
根据本发明的一些实施方案，细胞壁结合肽为纤维素结合结构域(CBD)。
根据本发明的一些实施方案，亲和部分用于结合抗体。
根据本发明的一些实施方案，亲和部分用于结合酶生长因子或结构蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，用于结合抗体的亲和部分包含蛋白质A/G/L。
根据本发明的一些实施方案，分离的多肽如SEQ ID NO:10中所列。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码所述的多肽的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，分离的多核苷酸如SEQ ID NO:9中所列。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体，其包含分离的多核苷酸以及用于指导多肽在植物细胞中表达的顺式作用调节元件。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体包含编码至少一种糖苷酶的额外的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了转基因植物或植物细胞，其包含本文所述的核酸构建体的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方案，转基因植物或植物细胞经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶。
根据本发明的一些实施方案，植物细胞的转基因植物包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的在至少一种糖基转移酶，其中所述的物种表达野生型水平或展现出野生型活性的至少一种糖基转移酶。
根据本发明的一些实施方案，糖基转移酶包括β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在植物或植物细胞中表达至少2种糖苷酶，使得至少2种糖苷酶共同定位于植物细胞或植物细胞的亚细胞分隔区内。
根据本发明的一些实施方案，表达至少2种糖苷酶包括：
(a)在第一植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第一糖苷酶；
(b)在第二植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第二糖苷酶；以及
(c)使第一植物和第二植物杂交。
根据本发明的一些实施方案，表达至少2种糖苷酶包括：
(i)向植物或植物细胞中引入核酸构建体，该构建体包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列，其中至少2种糖苷酶的一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合；或者
(ii)向植物或植物细胞中引入核酸构建体系统，该系统包含：
第一核酸构建体，其包含编码第一糖苷酶的核酸序列；
第二核酸构建体，其包含编码第二糖苷酶的核酸序列，
其中第一糖苷酶和第二糖苷酶的各种酶在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内在翻译中与用于共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在植物或植物细胞中表达至少一种糖苷酶以及所关注的多肽的亲和部分，其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码所管多肽的亲和部分的核酸序列，其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。
根据本发明的一些实施方案，表达编码所关注的多肽的核酸序列包括使以下物质杂交：
(i)第一转基因植物，其经转化而表达至少一种糖苷酶；以及
(ii)第二转基因植物，其经转化而表达所关注的多肽。
根据本发明的一些方面，第一植物经转化而表达在翻译中与细胞壁结合肽融合的亲和部分，其中所述的亲和部分用于结合所关注的多肽。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列，其中所述的至少2种糖苷酶的每一种均在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第一糖苷酶的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第二糖苷酶的核酸序列。
其中所述的第一糖苷酶和第二糖苷酶的每一种均在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案，信号肽为空泡信号肽或离质体信号肽。
根据本发明的一些实施方案，信号肽为在第一糖苷酶和第二糖苷酶的N-末端融合的空泡信号肽或离质体信号肽。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了转基因植物或植物细胞，其经转化而在亚细胞隔离区内以共同定位的方式表达至少2种糖苷酶。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体，其包含编码所关注的多肽和至少一种糖苷酶的核酸序列，其中所关注的多肽和至少一种糖苷酶的每一种均在翻译中在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内与用于共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码所关注的多肽的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的核酸序列，
其中至少一种糖苷酶的每一种在翻译中在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内与用于共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了核酸构建体，其包含编码糖苷酶的核酸序列，所述的糖苷酶在所关注的亚细胞分隔区内与用于定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了分离的多肽，其包含编码蛋白质A/G/L的氨基酸序列，所述的蛋白质A/G/L在翻译中与异源跨膜结构域融合。
根据本发明的一些实施方案，翻译中的融合是通过连接体进行的。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码多肽的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了包含本文所述的核酸构建体的转基因植物或植物细胞。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括向植物或植物细胞中引入本文所述的核酸构建体或核酸构建体系统，由此改变植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了生产所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)向植物或植物细胞中引入本文所述的核酸构建体或核酸构建体系统；以及随后
(b)分离所关注的多肽。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了转基因植物或植物细胞，其重组表达：
(i)所关注的多肽；以及
(ii)至少一种糖苷酶。
其中所关注的多肽和至少一种糖苷酶的每一种均在翻译中在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内与用于共同定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了转基因植物或植物细胞，其包含本文所述的核酸构建体或核酸构建体系统。
根据本发明的一些实施方案，至少2种糖苷酶包括岩藻糖苷酶和木糖苷酶。
根据本发明的一些实施方案，至少一种糖苷酶选自岩藻糖苷酶和木糖苷酶。
根据本发明的一些实施方案，亚细胞分隔区选自空泡、离质体、内质网和高尔基体。
根据本发明的一些实施方案，亚细胞分隔区为空泡。
根据本发明的一些实施方案，植物或植物细胞为烟草植物或植物细胞。
根据本发明的一些实施方案，植物细胞为根细胞。
根据本发明的一些实施方案，信号肽选自空泡靶向信号肽、内质网靶向信号、离质体靶向信号、线粒体靶向信号和质粒靶向信号。
根据本发明的一些实施方案，经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步转化而在亚细胞分隔区内表达其他的糖苷酶。
根据本发明的一些实施方案，信号肽在翻译中与所关注的多肽或糖苷酶的C-末端融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了根据本文所述的方法生产的分离的多肽。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了包含核酸序列的核酸构建体，其中所述的核酸序列编码糖苷酶，该糖苷酶在翻译中在所关注的亚细胞分隔区内与用于定位的信号肽融合。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了包含本文所述的核酸构建体的转基因植物或植物细胞。
根据本发明的一些实施方案，所关注的多肽为人类多肽。
根据本发明的一些实施方案，所关注的多肽为药物。
根据本发明的一些实施方案，所关注的多肽选自抗体、疫苗、酶、生长因子、激素和结构蛋白质。
根据本发明的一些实施方案，所关注的多肽为抗体或抗体片段。
根据本发明的一些实施方案，抗体为贝伐单抗或阿达木单抗。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供了本文所述的转基因植物的种子。
根据本发明的一些实施方案，所述的种子为杂交种子。除非另作说明，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属技术领域任一普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等价于本文所述那些的方法和材料可以用于本发明的一些实施方案的实践或检验，但是示例性的方法和/或材料如下文所述。在矛盾的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是示意性的，并且无意于必要的限定。
附图简述
本发明的一些实施方案通过参照附图，仅以实例的方式在本文中描述。现在具体详细地参照附图，重点在于所示的详细情况为实例，目的在于示意性地讨论本发明的实施方案。就此而言，采用附图进行描述对于本领域那些技术人员而言，如何实施本发明的实施方案是显而易见的。
在以下附图中：
图1A-B为在pUC18载体中在Rubisco-vac盒中显示Avastin和Humira的轻链和重链的克隆的示意图。图1A-编码mAb的重链和轻链的DNA片段(SEQ ID NO:1,3,5和7)、以及携带Rubisco-vac表达盒的pUC18质粒受到Muni和NotI限制。图1B-创建4种不同的pUC18质粒：pUC18 Rb-Humira重链,pUC18 Rb-Humira轻链,pUC18 Rb-Avastin重链和pUC18 Rb-Avastin轻链。
图2A-C为在单一质粒上编码轻链和重链的pBINPLUS-Humira的克隆的示意图。图2A-具有Humira轻链的Rubisco-vac盒被克隆至具有HindIII限制性酶的pBINPLUS载体中。图2B-具有Humira重链的Rubisco-vac盒被克隆至具有EcoRI和SacI酶的pBINPLUS Rb-Humira轻链载体中。图2C-pBINPLUS Humira的最终构建体。
图3A-C为在单一质粒上编码轻链和重链的pBINPLUS–Avastin的克隆的示意图。图3A-具有Avastin重链的Rubisco-vac盒被克隆至具有Hindlll限制酶的pBINPLUS载体中。图3B-具有Avastin轻链的Rubisco-vac盒被克隆至具有EcoRI和SacI酶的pBINPLUS Rb-Avasin重链载体中。图3C-pBINPLUS Avastin的最终构建体。
图4A-B为显示在pUC18中Humira双盒的构建的示意图。包含Rubisco终止子,空泡SP1(SEQ ID NO:18),Humira重链(SEQ ID NO:15),Rubisco启动子,空泡SP2(SEQ ID NO:19),Humira轻链(SEQ ID NO:16)的合成DNA片段(SEQ ID NO:25)通过Ncol,Notl克隆至pUC18中的Rubisco盒中，从而创建具有2个mAb链的双盒。
图5A-C为显示将CBD-PrtA(SEQ ID NO:9)克隆至pBINPLUS质粒中的示意图。图5A-包含35S启动子,空泡信号的编码区,CBD和蛋白质A及Nos终止子的DNA被克隆至pUC18质粒中。图5B-具有CBD-PrtA的35S盒通过EcoRI克隆至pBINPLUS质粒中，并创建pBINPLUS CBD-PrtA(图5C)。
图6A-C为显示将木糖苷酶和岩藻糖苷酶克隆至pBINPLUS质粒中的示意图。图6A-编码木糖苷酶(2344bp,SEQ ID NO:11)或岩藻糖苷酶(1564bp,SEQ ID NO:13)的DNA受到Muni和NotI限制，并且在CBD-PrtA被相同的酶切除后，将所述的DNA克隆至35S盒中。图6B-使用Sdal和Sacl限制性酶在pBINPLUS载体中克隆35S盒中的木糖苷酶或岩藻糖苷酶。图6C-构建2个质粒：pBINPLUS木糖苷酶(15496bp)和pBINPLUS岩藻糖苷酶(14716bp)。
图7A-B为在烟草植物中表达CBD-PrtA(SEQ ID NO:10)的Western印迹图像。图7A显示使用抗CBD抗体通过Western印迹筛选重组烟草。图7B-显示Slot印迹：将所示量的市售Humira加入至得自100mg WT和表达CBD-PrtA的烟草组织的小球中。在小球被温育并多次洗涤后，通过弱酸洗脱抗体，并加载至硝酸纤维素膜上。通过抗人类IgG-AP检测mAb。
图8为显示在表达岩藻糖苷酶(左侧)和木糖苷酶(右侧)的烟草植物中测量的糖苷酶活性的柱状图。在pH10下测量酶反应产物(4-甲基伞形酮)。使用激发波长355nm、放射波长460nm，测量释放的4-甲基伞形酮。
图9为显示在烟草植物的离质体中表达的阿达木单抗的稳定表达和纯化的图像。
图10为显示通过阿达木单抗的TNF结合的图，其中所述的阿达木单抗是在烟草植物的离质体中表达的，并且是其纯化形式，通过ELISA测试来检验。
图11A-B为显示表达盒的构建的示意图，其中所述的表达盒编码具有细胞离质体信号肽的所示抗体的轻链和重链。mAb(Avastin/Humira)链被插入到包含Rubisco启动子,Cell信号肽和Rubisco终止子的表达盒中。所得的构建体为：pBINPLUS Rubisco Cellhumira重链,pBINPLUS Rubisco Cell humira轻链,pBINPLUS Rubisco Cell avastin重链,pBINPLUS Rubisco Cell avastin轻链。具有同一mAb的重链和轻链的盒被共转化至烟草植物中，从而使得完整mAb在离质体中表达。
图12A-D为使用扩莫结合的蛋白质A的示意和纯化结果，其中所述的蛋白质A在表达本发明的一些实施方案的所关注的多肽的细胞的细胞膜上表达。
图13示出植物衍生的阿达木单抗的木糖和岩澡糖的切割。缩写：2h,3h和4h-以小时计的加工长度(分别为2、3和4小时)；N-未加工的阿达木单抗；C-市售Humira。3组不同的抗体：抗木糖、抗岩澡糖和抗人类IgG用于检测。
图14显示使用抗人类IgG进行的Western印迹，其显示在大约55KDa处相当于adalymumab重链的条带和在大约25KDa处相当于adalymumab轻链的条带。
图15显示ELISA测试的结果，其用于在TNF-α预涂敷的ELISA板上实施的植物衍生的阿达木单抗(PDA)的体外生物活性测试，其中所述的平板与得自3种(1-3)不同转基因烟草植物系的植物衍生的阿达木单抗温育。然后，通过使用抗人IgG-HRP来检测mAb与靶物的结合。PDA平均浓度示于ng(mAb)/mg(新鲜叶子)中。
图16示出与市售Humira(以圆圈显示检验参照物)相比，使用PDA的TNFα的中和，以及在L929细胞系中检验rhTNF-α中和的植物衍生的阿达木单抗(以正方形件事检验项目)的生物活性。
图17A-C显示SDS-PAGE Western印迹的结果。图17A-抗蛋白质A染色；图17B-小球的抗人IgG染色；图17C-可溶性级份的抗人IgG染色。Com-市售Humira对照；PDA-植物衍生的阿达木单抗。在2种不同的缓冲剂中制备样品制备物：结合缓冲剂和研磨缓冲剂。
图18A-D显示GMD RNAi在pUC18质粒中的克隆。图18A-pUC18质粒，其包含35S启动子、Cell信号肽、基因插入物(其将被编码GMD RNAi的DNA替换)和Nos终止子；图18B-步骤1：编码GMD反义的DNA(423bp)被插入Notl和BamHI的限制；图18C-步骤2：编码β-木糖转移酶(XylT)内含子的DNA(242bp)被插入BamHI和Mfel的限制；图18D-步骤3：编码GMD正义的DNA(442bp)被插入Mfel和Ncol的限制。
图19A-B显示GMD RNAi的克隆。图19A.pBINPLUS载体；使用Hindll和Sacl限制酶克隆35S GMD RNAi盒(1747bp)，从而形成图19B.pBIN 35S GMD RNAi质粒(14094bp)。
图20A-D显示XylT在pBINPLUS质粒中的克隆。图20A.pUC18质粒RUB IS CO启动子,Cell信号肽,编码阿达木单抗重链的DNA和RUBISCO终止子；图20B.使用XylT(617bp)通过Ncol和Notl限制酶替代编码阿达木单抗重链的DNA(1362bp)；图20C.pBINPLUS质粒；图20D.使用Hindll限制酶在pBINPLUS载体中克隆RUBISCO XylT盒(2569bp)，从而形成pBINPLUSRUBISCO XylT质粒(14965bp)。
发明详述
在本发明的一些实施方案中，本发明涉及用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是本发明无需将其应用局限于下文中列出的或者通过实施例举例说明的详细情况。本发明能够具有其他的实施方案，或者能够以多种方式实施或执行。
植物通过避免动物衍生的病毒感染的风险以及生物制药生产的成本有效性而成为用于生产重组药物的引人注目的宿主。与哺乳动物相比，植物具有更高相似性的N-糖基化途径，并且主要生成复合型多糖，其中α-1,3岩澡糖残基附着于最内部的GlcNAc，β-1,2木糖残基附着于三甘露糖基核心的相邻甘露糖上，这二者均未在人类中发现。非人糖基化(α-1,3岩澡糖基作用和β-1,2木糖基作用)的免疫原性是管理机构所关心的。
因此，工业可用的蛋白质生产工艺(其提供了具有固定品质的完全非岩澡糖基化和/或非木糖基化蛋白质治疗的一致的产率)成为在下一代治疗试剂成功研发中的重要目标。
本发明人目前提供了用于在植物细胞中进行蛋白质生产的新型平台，其中所关注的重组多肽被表达，使得其与至少一种糖苷酶共同定位于植物细胞的亚细胞分隔区内。由此生产的多肽在N-多糖上不携带α-1,3岩澡糖和β-1,2木糖。所述的工艺是简单且成本有效的，这是因为其无需通过将表达的多肽暴露于体外酶处理的生产后处理。该工艺的另一个优点在于其直接的本性，即，植物的糖基化机器未受影响，因此，植物能力精力或活力未受损害。
如下文和以下的实施例部分所示，本发明人利用该平台用于生产2种FDA批准的单克隆抗体(贝伐单抗)和(阿达木单抗)。本发明人在烟草的空泡或离质体中共同表达这些抗体，从而与重组表达的木糖苷酶和岩藻糖苷酶共同定位，并且在这些植物中显示升高水平的糖苷酶活性。
具体而言，如通过ELISA测试的那样，靶向离质体的阿达木单抗(在本文中还称为特异性构造的植物衍生阿达木单抗(PDA))的定量显示得到4.9mg PDA/kg叶子。通过Western印迹(WB)检测重链和轻链抗体亚单元，并且在正确的比例下。植物为转化植物的F1代，并且预计产率通过同型接合而大幅提高。
由表达2种蛋白质的双转基因植物得到的植物衍生阿达木单抗的CBD-蛋白质A基纯化经证明是可行的。发现合适的反应条件，其中CBD接合纤维素，而蛋白质A结合抗体Fc区。因此，抗体在植物组织研磨阶段后片刻，高效地保持在包含纤维素的不溶性级份中。所述的结合足够强，从而可以洗涤结合蛋白质的不溶性级份，而未产生损失。
重组岩藻糖苷酶和木糖苷酶的表达成功地除去了重组抗体的木糖和岩澡糖残基，例如阿达木单抗。当木糖苷酶和岩藻糖苷酶一起使用时，观察到Fuc和Xy1的还原浓度增加。
总之，在检验(阿达木单抗)和参照(Humira)抗体之间未检测到显著的差异。阿达木单抗活性测试显示至多达到62.5ng/ml的浓度，受到Humira保护的细胞比使用PCD保护的细胞更有活力(不明显)。当浓度进一步升高至125以及此后升高至250ng/ml时，植物阿达木单抗显示得到更好的结果。
因此，根据本发明的方面，提供了在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在待转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内，由此改变植物或植物细胞中所关注的多肽的糖基化模式。
如本文所用，术语“改变”是指当在植物细胞中表达时，与野生型糖基化途径相比，改变多肽的天然翻译后(体内)糖基化作用，其中所述的植物细胞包含野生型糖基化途径。
根据具体的实施方案，改变是指减少或完全消除至少一种糖苷物质，例如P-l,2-连接的木糖(Xyl)或α-1,3-连接的核心岩澡糖(Fuc)。减少的糖苷物质是指在本文所述的体内表达后，由所关注的多肽得到的糖苷物质的至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或者甚至100％(仅，完全消除)。
如本文所用，术语“糖苷”是指可以通过水解切割而转化成糖和非糖成分的任何化合物，包含碳水化合物分子(糖)，特别是植物中的任何此类的天然产物。
根据具体的实施方案，改变糖基化模式得到缺乏Fuc或Xyl的多肽，其还分别称为非岩澡糖基化的或非木糖基化的多肽。
根据另一个具体的实施方案，改变糖基化模式得到缺乏Fuc和Xyl的多肽，其还分别称为非岩澡糖基化的和非木糖基化的多肽。
根据另一个实施方案，改变还可以包括多肽的翻译后加工，从而包含植物缺乏的糖苷物质，例如特征性包含半乳糖(Gal)-和包含唾液酸的复合N-多糖(N-乙酰基神经氨酸-α-2-6/3Galβ1-4)。
“糖基化模式”是指单一的(例如Fuc)或大量的糖苷物质(例如Fuc、Xyl和可任选的唾液酸或半乳糖)以及它们在多肽或其制备物上的相对丰度。
如本文所用，术语“植物”涵盖整个植物、植物或植物部分的祖先和后代，包括种子、嫩芽、茎、根(包括块茎和根茎)，以及植物细胞、组织和器官。植物可以为任何形式，包括悬液培养物、胚芽、分生区、细胞组织、叶子、配子体、孢子体、花粉和小孢子。特别用于本发明的方法中的植物包括属于超科Viridiplantee的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下列表的草料或豆科牧草,观赏植物,粮食作物,树或者灌木：金合欢属的物种,槭属的物种,猕猴桃属的物种,七叶树属的物种,南方贝壳杉(Agathis australis),合欢阿马拉(Albizia amara),三色桫移(Alsophila tricolor),须芒草属的物种,花生属的物种,槟榔(Areca catechu),Astelia fragrans,鹰嘴紫云英(Astragalus cicer),非洲红苏木(Baikiaea plurijuga),桦木属的物种,芸苔属的物种,木榄(Bruguieragymnorrhiza),Burkea africana,紫铆树花(Butea frondosa),Cadaba farinosa,朱缨花属的物种,野茶树(Camellia sinensis),美人蕉(Canna indica),辣椒属的物种,决明属的物种,距瓣豆(Centroema pubescens),木瓜属的物种,肉桂(Cinnamomum cassia),小果咖啡(Coffea arabica),Colophospermum mopane,绣球小冠花(Coronillia varia),栒子花(Cotoneaster serotina),山楂属的物种,黄瓜属的物种,柏木属的物种,Cyatheadealbata,榅桲(Cydonia oblonga),日本柳杉(Cryptomeria japonica),香茅属的物种,Cynthea dealbata,榅桲(Cydonia oblonga),Dalbergia monetaria,大叶骨碎补(Davallia divaricata),山蚂蝗属的物种,粗糙蛘壳蕨(Dicksonia squarosa),Dibeteropogon amplectens,Dioclea的物种,扁豆属的物种,Dorycnium rectum,稗新疆杨(Echinochloa pyramidalis),Ehraffia的物种,穇子(Eleusine coracana),Eragrestis的物种,刺桐属的物种,桉树属的物种,乌木属假虎刺(Euclea schimperi),Eulaliavi/losa,荞麦属的物种,Feijoa sellowlana,草莓属的物种,千斤拔属的物种,Freycinetiabanksli,童氏老鹳草(Geranium thunbergii),银杏(GinAgo biloba),Glycine javanica,Gliricidia的物种,陆地棉(Gossypium hirsutum),银桦属的物种,东非花梨木(Guibourtia coleosperma),岩黄芪属的物种,Hemaffhia altissima,Heteropogoncontoffus,大麦芽(Hordeum vulgare),Hyparrhenia rufa,小连翘(Hypericum erectum),Hypeffhelia dissolute,Indigo incamata,鸢尾属的物种,Leptarrhena pyrolifolia,胡枝子属的物种,莴苣属的物种,银合欢(Leucaena leucocephala),Loudetia simplex,Lotonus bainesli,Lotus的物种,Macrotyloma axillare,苹果属的物种,木薯(Manihotesculenta),紫花苜蓿(Medicago saliva),水杉(Metasequoiaglyptostroboides),芭蕉(Musa sapientum),Nicotianum的物种,红豆草属的物种,料豆属的物种,稻属的物种,Peltophorum africanum,狼尾草属的物种,鳄梨(Persea gratissima),牵牛花属的物种,菜豆属的物种,凤凰黄花(Phoenix canadensis),Phormium cookianum,石楠属的物种,灰绿云杉(Picea glauca),松属的物种,豌豆苜蓿(Pisum sativam),罗汉松(Podocarpustotara),Pogonarthria fleckii,Pogonaffhria squarrosa,科杨属的物种,牧豆树(Prosopis cineraria),花旗松(Pseudotsuga menziesii),Pterolobium stellatum,西洋梨(Pyrus communis),栎属的物种,厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbellata),Rhopalostylis sapida,漆树纳塔尔(Rhus natalensis),欧洲醋栗(Ribes grossularia),酷栗属的物种,刺槐(Robinia pseudoacacia),蔷薇属的物种,悬钩子属的物种,柳属的物种,Schyzachyrium sanguineum,金松(Sciadopitys vefficillata),北美红杉(Sequoiasempervirens),巨杉(Sequoiadendron giganteum),高粱(Sorghum bicolor),菠菜属的物种,Sporobolus fimbriatus,Stiburus alopecuroides,矮柱花草(Stylosanthoshumilis),葫芦茶属的物种,美国水松(Taxodium distichum),阿拉伯黄背草(Themedatriandra),车轴草属的物种,小麦属的物种,异叶铁杉(Tsuga heterophylla),越橘属的物种,野豌豆属的物种,葡萄(Vitis vinifera),沃森花菜(Watsonia pyramidata),马蹄莲(Zantedeschia aethiopica),玉米,苋属植物,洋蓟,芦笋，西兰花,球芽甘蓝,甘蓝,加拿大油菜,胡萝卜,菜花,芹菜,羽衣甘蓝,亚麻,无头甘蓝,小扁豆,油菜,黄秋葵,洋葱,马铃薯,大米,大豆,稻草,糖用甜菜,甘蔗,向日葵,番茄,南瓜茶,树。备选地，藻类和其他非绿色植物可以用于本发明的一些实施方案的方法中。
根据具体的实施方案，植物或植物细胞为烟草植物或植物细胞(例如N.tabacumand N.benthemiana)。
根据具体的实施方案，植物细胞为根细胞，例如毛根农杆菌(Agrobacteriumrihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
根据具体的实施方案，植物或植物细胞为浮萍植物或植物细胞(例如浮萍属)。
根据其他具体的实施方案，植物或植物细胞为玉米、苜蓿、拟南芥、西红柿、羽衣甘蓝、莴苣、烟草、大豆、大米和马铃薯。
如本文所用，术语“糖苷酶”是指切割O、S或N-连接的糖基化合物的酶，例如E.C.3.2.1，如甘露糖苷酶,岩藻糖苷酶和木糖苷酶。
酶可以是天然形成的(例如植物、细菌或真菌)或者是合成的。
如本文所用，术语“岩藻糖苷酶”是指EC 3.2.1.111 1,3-α-L-岩藻糖苷酶。
根据具体的实施方案，α-1,3/4-岩藻糖苷酶[链霉菌属的物种]为序列ID:gblAAD10477.II(SEQ ID NO:13,14)。
如本文所用，术语“木糖苷酶”是指β(1-2)木糖苷酶(-D-木糖苷酶,EC 3.2.1.37)切割木糖连接的β(1-2)。根据具体的实施方案，所述的酶为exo-l,4-β-木糖苷酶xlnD[黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88]序列ID:reflXP_001389416.1l(SEQ ID NO:11,12)。
根据具体的实施方案，植物细胞被至少一种糖苷酶转化(即，至少2种糖苷酶，即，非一致性的，其中各种糖苷酶针对不同的糖基化合物，例如α-1,3Fuc和β-1,2Xyl)。
因此，根据本发明的方面，提供了生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在植物或植物细胞中，在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶或者至少2种糖苷酶，在表达至少2种糖苷酶的情况下，该至少2种糖苷酶共同定位于植物或植物细胞的亚细胞分隔区内。
如本文所用，术语“植物细胞的亚细胞分隔区”是指细胞的任何划分的区域，其中所关注的多肽可以累积，例如作为最终的产物。根据具体的实施方案，亚细胞分隔区为内膜系统。亚细胞分隔区的实例包括但不限于空泡，离质体，内质网(ER)，高尔基体，由ER和空泡衍生的蛋白质体，以及油体。根据具体的实施方案，蛋白质在翻译后加工(即，糖基化作用)之后在亚细胞器内累积(例如离质体、油体)，或者与翻译后加工同时累积(例如ER、高尔基体和空泡)。
值得注意的是，亚细胞分隔区的选择将更多地取决于多肽的类型或最终产物的活性。
比如植物细胞中人类胶原蛋白的生产需要人类的酶在脯氨酸上羟基化，从而确保最终产物的活性。WO2006/035442教导了胶原蛋白和脯氨酰-4-羟化酶(P4H)在亚细胞分隔区(例如空泡或离质体)内的共同表达。在这种情况下，糖苷酶(例如岩藻糖苷酶和/或木糖苷酶)也在空泡或离质体中表达，以确保与表达的胶原蛋白共同定位。
在备选的实例中，认为甘露糖封端的多糖是空泡糖蛋白的主要复合多糖，并且认为其与溶酶体蛋白质的活性有关，从而有利于给予患者的蛋白质的改善的吸收和溶酶体传递(例如参见WO2004/096978)。在这种情况下，糖苷酶(例如岩藻糖苷酶和/或木糖苷酶)也在空泡中表达，从而确保与表达的多肽共同定位(例如高甘露糖蛋白质，例如溶酶体蛋白质)。
根据具体的实施方案，糖苷酶(以及所关注的多肽，在下文中称为“蛋白质”)在亚细胞分隔区内的累积可以通过包含信号序列而取得，其中所述的信号序列用于使表达的蛋白质靶向亚细胞分隔区，例如空泡、内质网、高尔基体、线粒体和离质体。
信号肽、信号序列、定位序列或分类序列(所有这几个术语均可以交换使用)为核苷酸序列，经翻译得到氨基酸序列，这些序列被细胞所用，从而指导所关注的蛋白质或多肽定位于真核细胞部内或外部的特定位点处。许多信号序列是本领域已知的，例如参见Becker et al.,Plant Mol.Biol.20:49(1992),Close,P.S.,Master's Thesis,IowaState University(1993),Knox,C,et al.,"Structure and Organization of TwoDivergent Alpha-Amylase Genes from Barley",Plant Mol.Biol.9:3-17(1987),Lerneret al.,Plant Physiol.91:124-129(1989),Fontes et al.,Plant Cell 3:483-496(1991),Matsuoka et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:834(1991),Gould et al.,J.Cell.Biol.108:1657(1989),Creissen et al.,Plant J.2:129(1991),Kalderon,etal.,A short amino acid sequence able to specify nuclear location,Cell 39:499-509(1984),Steifel,et al.,Expression of a maize cell wall hydroxyproline-richglycoprotein gene in early leaf and root vascular differentiation,Plant Cell2:785-793(1990)。
根据具体的实施方案，信号序列对于蛋白质而言是异源的。
如本文所用，“翻译融合”是指编码靶向序列的核酸序列(多条)与编码蛋白质(例如糖苷酶或所关注的多肽)的核酸序列的框内融合，使得单一的多肽得以表达，所述的多肽包含所述的靶向序列(多条)以及所述的蛋白质。框内融合可以是直接融合或通过连接体融合(即，编码氨基酸连接体的核酸序列)。连接体和/或信号肽可以是可切割的。
根据具体的实施方案，蛋白质(例如糖苷酶(多种)和所关注的多肽)在内膜系统中表达，该内膜系统包括内质网(ER)、空泡、由ER或空泡衍生的蛋白质体。
就在内膜系统中的表达而言，所述的蛋白质包含(通过翻译融合)N-末端信号肽(其对于分泌蛋白质的进入是重要的)，和所有腔内蛋白质(其随后被交换至多个内膜分隔区内)。N-末端信号肽通常是可交换的。该信号并非定义的序列，而是一种模式或基元，其在N-末端通常包含一个或多个正电荷的氨基酸残基，其后为6-12个疏水性氨基酸的分支和可切割位点。该信号肽通常为20-30个氨基酸长。信号肽预测工具和数据库是共用的www(dot)cbs(dot)dtu(dot)dk/services/SignalP/；链接为www(dot)signalpeptide(dot)de/index.php？m＝links，从而识别推定的信号肽和信号肽切割位点。
对于异源蛋白质的表达而言，在这种情况(例如所关注的多肽和糖苷酶)下，通常使用植物特异性的信号肽(SP)。通常的植物信号序列包括得自烟草延伸蛋白、PR-S、渗透蛋白、大麦α-淀粉酶SP和马铃薯块茎SP的信号肽。
在许多情况下，得自异源蛋白质(例如所关注的人类多肽)的信号肽高效地使其蛋白质靶向植物ER，并且被植物信号肽酶识别，从而创建在其天然有机体中可见的成熟产物的精确N-末端，例如人类IL-2、干扰素-β,和β-酪蛋白；真菌肌醇六磷酸酶；以及木聚糖酶。而且，通过使用植物信号肽而增强在所关注的亚细胞定位处的表达是可行的。
在ER内的累积
通常需要特定的蛋白质基元以使蛋白质保持在ER内。示例性的序列包括最广泛使用的基元、KDEL、SEKDEL或HDEL，所有均为ER保留基元。具有C-末端KDEL或HDEL的蛋白质与KDEL受体相互作用，所述的KDEL受体为主要在ER和高尔基体之间交换的空泡中发挥作用的跨膜蛋白质。
在ER衍生的蛋白质体(PB)内的累积
定向于ER的蛋白质可以保留在ER中或者分离出来进入分离的细胞器。储存在ER衍生的PB中与空泡衍生的PB中的蛋白质在它们的多糖组成上是不同的(通过高尔基体途径有利于高甘露糖N-多糖加工成复杂多糖)。
用于ER衍生的PB的示例性信号包括γ-玉米蛋白(玉米储存蛋白质)的富含脯氨酸的N-末端结构域，其包含高度重复的序列(VHLPPP)n，该序列形成了两性聚脯氨酸螺旋，并且对于玉米蛋白在ER膜处的聚集是重要的(Kogan et al.,2001,J.Mol.Biol.312:907-913)。Mainieri et al.(2004)Plant Physiol.136:3447-3456证明γ-玉米蛋白的89个氨基酸残基的融合足以介导靶蛋白组装成PB。由(PPPVHL)8构成的合成序列作为靶向标签(称为)研发，从而有利于重组蛋白质的组装和回收(Torrent et al.,2009BMC Biology7,5)。
在空泡或空泡衍生的蛋白质体(PB)中的累积
靶向空泡的由细胞核基因编码的蛋白质需要双重靶向信号。首先，需要ER信号序列(如上文所述)进入内膜系统。在蛋白质通过ER和高尔基体网加工后，第二信号是活性的，其中所述的蛋白质在小泡中被携带至空泡。用于这些序列的受体可以结合并传递至细胞器。靶向空泡的信号与N-末端ER信号肽相比，是较少紧密地定义的，并且在“成熟”蛋白质的C-末端(C-末端前肽,CTPP；例如大麦凝集素、菜豆蛋白、烟草几丁质酶)和N-末端区域(N-末端前肽,NTPP，位于ER信号序列的紧邻的上游，例如贮藏蛋白、液泡巯基蛋白酶)、以及直接靶向空泡的内部结构域(例如植物血球凝集素、豆球蛋白、篦麻蛋白)识别。NTPP和CTPP通常被空泡内的蛋白酶除去。在一些情况(例如A-B植物毒素，例如篦麻蛋白和红豆因)下，靶向空泡的内部序列还作为蛋白质加工的部分在空泡内被除去。所有3种类型的靶向空泡的信号(C、N和内部)均显示必须并足以将模型蛋白质分类，而免于进入空泡的默认的分泌途径。
在离质体内的累积
分泌是植物内膜系统的默认途径，并且未加入用于分类或保留的特定信号，蛋白质(例如至少一种糖苷酶和所关注的蛋白质)被分泌至细胞外空间，并通常在离质体与细胞质膜和细胞壁之间的区域内累积。由于通过细胞基质的扩散是大小限定的，所以当所关注的多肽不足以大得扩散至细胞壁的外部时，使用上述策略。备选地或此外，所关注的多肽和葡萄糖苷酶(可任选地)固定于离质体中，或者通过在植物细胞中表达的异源多肽固定于细胞壁，所述的植物细胞包含结合肽的细胞壁，所述的肽在翻译中与异源亲和部分融合。
在细胞壁内的累积
为了在细胞壁内累积，所关注的多肽和至少一种糖苷酶的每一种均可以在纤维素结合结构域pfam00942:CBM_3中以翻译融合形式表达。
在油体内的累积
油体是在单层磷脂膜内包含油(例如甘油三酸酯)的细胞器，其中所述的单层磷脂膜包含高度的疏水性蛋白质油质蛋白。异源蛋白质以油质蛋白融合体的形式表达。油质蛋白是一种低分子质量的多肽(Mr 16-24kDa)，其由疏水性结构域组成，该结构域的侧翼为2个亲水性结构域。油质蛋白最初靶向ER膜，但是C-和N-末端保留在细胞溶质内，并且蛋白质随后被转移至油体中。因此，所关注的融合的多肽和糖苷酶基本包覆了油体，并且定位于胞浆面上。为了可以进行翻译后修饰，靶向所关注的蛋白质和糖苷酶通过内膜系统实施，例如在ER回收结构域内，然后通过与抗油质蛋白单链抗体(scFv)将所述的蛋白质回收至油体表面上。因此，产物被交换并累积在用于翻译后加工的内膜系统中，但是在细胞破裂时与油体结合，从而提供油体基浮式离心的益处，由此将2个系统的优点结合。
可以根据本发明的教导使用的分类方法的具体实施方案概括于下表1中。
表1
根据具体的实施方案，对于细胞壁的表达而言，使用大麦α-淀粉酶信号序列(Rogers,J.C.1985.Two barley alpha-amylase gene families are regulateddifferently in aleurone cells.J.Biol.Chem.260:3731-3738)。
根据具体的实施方案，用于离质体分泌的信号肽为cel-1信号肽(SEQ ID NO:21,22)。
使酶靶向空泡是另一个实施方案。实现该靶向的信号序列是公知的。例如Raikhel的美国专利No.5,360,726显示空泡信号序列，Warren等人在美国专利No.5,889,174中也显示该序列。靶向空泡的信号可以存在于氨基-末端部分(Holwerda et al.,The PlantCell,4:307-318(1992),Nakamura et al.,Plant Physiol.,101:1-5(1993))，羧基-末端部分，或者在靶向蛋白质的中间序列中(Tague et al.,The Plant Cell,4:307-318(1992),Saalbach et al.The Plant Cell,3:695-708(1991))。此外，氨基-末端序列与羧基-末端序列协同负责基因产物靶向空泡(Shinshi et al.Plant Molec.Biol.14:357-368(1990))。
根据具体的实施方案，用于空泡累积的信号肽为SP(SEQ ID NO:17),SP1(SEQ IDNO:18)或SP2(SEQ ID NO:19)编码的SP，如Wei et al.(2004)Plant Biotechnol.JFluorescent Screening of Transgenic Arabidopsis Seeds without GerminationPlant Physiol.Jun 2004；135(2):709-714所述。THE文章提及了Cell信号肽。
为了优化产物的产率，检验多个SP用于初始评估生产方案。就药物应用而言，通常需要信号肽(无论得自动物、真菌还是植物来源)的精确切割，并且通常通过最终纯化的产物的N-末端测序来证明。
如本文所用，术语“所关注的多肽”是指至少一种(例如2,3,4,更多)重组多肽，其改变的糖基化作用是有价值的。此类多肽可以广泛地用于研究和工业背景中，例如用于生产治疗剂、疫苗、诊断剂(统称为药物)和许多所关注的其他应用中。
根据具体的实施方案，所关注的多肽为多聚体蛋白质，例如胶原蛋白或抗体(即，重链和轻链)。
根据具体的实施方案，所关注的多肽为人类多肽。
根据具体的实施方案，所关注的蛋白质为天然形成的多肽。
根据具体的实施方案，所关注的蛋白质为合成多肽。
根据具体的实施方案，所关注的蛋白质为嵌合多肽。
所关注的多肽可以是植物细胞内源的或外来的。
所述的多肽可以是细胞内多肽(例如细胞溶质蛋白质)、跨膜多肽或分泌的多肽。
可以通过使用题述组合物和方法生产的示例性治疗蛋白质包括但不限于人体激素(例如胰岛素,生长激素,胰岛素样生长因子1,促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素),造血蛋白质(例如红细胞生成素,C-CSF,GM-CSF和IL-11),血栓与止血蛋白质(例如组织纤维蛋白溶酶原激活剂和活化蛋白C),免疫蛋白(例如白细胞介素),抗体和其他的酶(例如脱氧核糖核酸酶I)。可以通过题述组合物和方法生产的示例性疫苗包括但不限于针对多种流感病毒(例如A,B和C型以及用于各种类型的多种血清型例如H5N2,HlNl,H3N2，用于A型流感病毒),HIV,肝炎病毒(例如甲、乙、丙、丁型肝炎),莱姆病和人乳头状瘤病毒(HPV)的疫苗。异源生产的蛋白质诊断剂的实例包括但不限于分泌素,促甲状腺激素(TSH),HIV抗原和丙型肝炎抗原。
根据其他的实施方案，所关注的多肽的实例包括但不限于细胞因子,趋化因子,淋巴因子,配体,受体,激素,酶,结构蛋白质,抗体和抗体片段,以及生长因子。受体的非限定性实例包括TNF I型受体,IL-1II型受体,IL-1受体拮抗剂,IL-4受体以及任何化学或遗传修饰的可溶性受体。酶的实例包括乙酰胆碱酯酶,乳糖酶,活化蛋白C,因子VII,胶原酶(例如由Advance Biofactures Corporation出售的商品名Santyl)；半乳糖苷酶-β(例如由Genzyme出售的商品名Fabrazyme)；脱氧核糖核酸酶-α(例如由Genenteche出售的商品名Pulmozyme)；阿替普酶(例如由Genentech出售的商品名Activase)；聚乙二醇化的天冬酰胺酶(例如由Enzon出售的商品名Oncaspar)；天冬酰胺酶(例如由Merck出售的商品名Elspar)；以及伊米苷酶(例如由Genzyme出售的商品名Ceredase)。具体的多肽或蛋白质的实例包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子(G-CSF),巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),集落刺激因子(CSF),干扰素β(IFN-β),干扰素γ(IFNγ),干扰素γ诱导因子I(IGIF),转化生长因子β(IGF-β),RANTES(在活化时受到调节,所表达的并且推测被分泌的正常的T细胞),巨噬细胞炎症蛋白(例如MIP-1-α和MIP-1-β),Leishmnania延长起始因子r(LEIF),血小板衍生的生长因子(PDGF),肿瘤坏死因子(TNF),生长因子(例如表皮生长因子(EGF),血管内皮生长因子(VEGF),成纤细胞生长因子,(FGF),神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF),神经营养因子-2(NT-2),神经营养因子-3(NT-3),神经营养因子-4(NT-4),神经营养因子-5(NT-5),胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),睫状节神经细胞营养因子(CNTF)),TNFαII型受体,红细胞生成素(EPO),胰岛素和可溶性糖蛋白，例如gpl20和gpl60糖蛋白。gpl20糖蛋白是人类免疫缺陷型病毒(WIV)包膜蛋白，而gpl60糖蛋白是gpl20糖蛋白的已知的前体。其他实例包括分泌素,奈西立肽(人类B型利钠肽(hBNP))and GYP-I。
其他产物可以包括GPCR，包括但不限于A类类视紫质受体，例如毒蕈碱(Muse.)胰腺胆碱脊椎动物1型,Muse,胰腺胆碱脊椎动物2型,Muse,胰腺胆碱脊椎动物3型,Muse.胰腺胆碱脊椎动物4型；肾上腺素受体(α肾上腺素受体1型,α肾上腺素受体2型,β肾上腺素受体1型,β肾上腺素受体2型,β肾上腺素受体3型,多巴胺脊椎动物1型,多巴胺脊椎动物2型,多巴胺脊椎动物3型,多巴胺脊椎动物4型,组胺1型,组胺2型,组胺3型,组胺4型,5-羟色胺1型,5-羟色胺2型,5-羟色胺3型,5-羟色胺4型,5-羟色胺5型,5-羟色胺6型,5-羟色胺7型,5-羟色胺8型,其他类型的5-羟色胺,痕量胺,血管紧缩素1型,血管紧缩素2型,铃蟾肽,缓激肽,C5a过敏毒素,Finet-leu-phe,APJ样物质,白细胞介素-8A型,白细胞介素-8B型,白细胞介素-8型等,C-C趋化因子1型(II型至其他类型),C-X-C趋化因子(2型到6型等),C-X3-C趋化因子,胆囊收缩素CCK,CCK A型,CCK B型,CCK等,内皮缩血管肽,黑皮质素(黑素细胞刺激激素,促肾上腺皮质激素,黑皮质素激素),达菲抗原,催乳素释放肽(GPR10),神经肽Y(1型至7),神经肽Y,神经肽Y等,神经降压素,类鸦片(D,K,M,X型),生长激素抑制素(1型至5),速激肽(物质P(NK1),物质K(NK2),神经介素K(NK3),速激肽样1,速激肽样2,抗利尿激素/催产加压素(1型至2),催产加压素,后叶催产素/中催产素,Conopressin,甘丙肽样,蛋白酶激活样,阿立新&神经肽FF,QRFP,趋化因子受体样,神经介素U样(神经介素U,PRXamide),激素蛋白(促卵泡生成素,促黄体素-绒毛膜促性腺激素,促甲状腺素,促性腺激素I型,促性腺激素II型),(Rhod)视蛋白,视紫质脊椎动物(1-5型),视紫质脊椎动物5型,视紫质节肢动物,视紫质节肢动物1型,视紫质节肢动物2型,视紫质节肢动物3型,视紫质软体动物,视紫质,嗅觉(嗅觉11fam 1至13),前列腺素(前列腺素E2亚型EP 1,前列腺素E2/D2亚型EP2,前列腺素E2亚型EP3,前列腺素E2亚型EP4,前列腺素F2-α,环前列腺素,凝血噁烷,腺苷1型至3,嘌呤受体,嘌呤受体P2RY1-4,6,11 GPR91,嘌呤受体P2RY5,8,9,10GPR35,92,174,嘌呤受体P2RY12-14GPR87(JDP-Glucose),大麻成分,血小板活化因子,促性腺激素释放激素,促性腺激素释放激素I型,促性腺激素释放激素II型,脂肪动员激素激素样,Corazonin,促甲状腺素释放激素&促分泌素,促甲状腺素释放激素,生长激素促分泌素,生长激素促分泌素样,Ecdy sis-引发激素(ETHR),褪黑激素,溶血鞘脂&LPA(EDG),鞘氨醇1-磷酸酯Edg-1,溶血磷脂酸Edg-2,鞘氨醇1-磷酸酯Edg-3,溶血磷脂酸Edg4,鞘氨醇1-磷酸酯Edg-5,鞘氨醇1-磷酸酯Edg-6,溶血磷脂酸Edg-7,鞘氨醇1-磷酸酯Edg-8,Edg其他白细胞三烯B4受体,白细胞三烯B4受体BLTl,白细胞三烯B4受体BLT2,A类罕见病/等,推定的神经传递素,SREB,Mas促癌基因&Mas相关物质(MRG),GPR45样,半胱氨酰白三烯,G蛋白偶联胆汁酸受体,游离脂肪酸受体(GP40,GP41,GP43),B类分泌素样,降血钙素,促肾上腺皮质激素释放因子,抑胃肽,胰高血糖素,生长激素释放激素,副甲状腺激素,PACAP,分泌素,肠血管活性肠多肽,Latrophilin,Latrophilin 1型,Latrophilin 2型,Latrophilin 3型,ETL受体,脑特异性血管生成抑制剂(BAI),Methuselah样蛋白质(MTH),钙粘蛋白EGF LAG(CELSR),极大G蛋白偶联受体,C类亲代谢性谷氨酸酯/信息素,亲代谢性谷氨酸酯I至III类,钙敏感样,细胞外钙敏感物质,信息素,钙敏感样等,推定的信息素受体,GABA-B,GABA-B 1亚型,GABA-B 2亚型,GABA-B样,Orphan GPRC5,Orphan GPCR6,sevenless蛋白的配体(BOSS),味觉受体(TiR),D类真菌信息素,真菌信息素A因子样(STE2,STE3),真菌信息素B样(BAR,BBR,RCB,PRA),E类cAMP受体,眼白化病蛋白s,Frizzled/Smoothened家族,frizzled A类(Fz1&2&4&5&7-9),frizzled B类(Fz 3&6),frizzled C类(等),犁鼻受体,线虫类化学受体,昆虫气味受体,和Z类古细菌/细菌/真菌视蛋白。
还可以生产生物活性肽。其实例包括：BOTOX,Myobloc,Neurobloc,Dysport(或肉毒神经毒素的其他血清型),阿葡糖苷酶α,达托霉素,YH-16,绒毛膜促性腺激素α,非格司亭,西曲瑞克,白细胞介素-2,阿地白介素,teceleulin,地尼白介素-毒素连接物,干扰素α-n3(注射),干扰素α-nl,DL-8234,干扰素,Suntory(γ-la),干扰素γ,胸腺肽α1,他索纳明,DigiFab,ViperaTAb,EchiTAb,CroFab,奈西立肽,阿巴西普,alefacept,Rebif,eptoterminalfa,特立帕肽(骨质疏松症),可注射降血钙素(骨病),降血钙素(鼻,骨质疏松症),依那西普,谷他血红蛋白250(牛),Drotrecoginα,胶原酶,卡培立肽,重组人类表皮生长因子(局部凝胶,伤口愈合),DWP401,达贝泊汀α,依泊汀ω,依泊汀β,依泊汀α,地西卢定,重组水蛭素,比伐卢定,诺那凝血素α,凝血因子IX粉针剂,依他凝血素α(活化的),重组因子VIII+VWF,重组物,重组因子VIII,因子VIII(重组),Alphnmate,辛凝血素α,因子VIII,帕利夫明,Indikinase,替奈普酶,阿替普酶,帕米普酶,瑞替普酶,那替普酶,孟替普酶,促滤泡素α,rFSH,hpFSH,micafungin,培非格司亭,来诺拉提,那托司亭,舍莫瑞林,胰高血糖素,艾塞那肽,普兰林肽,iniglucerase,加硫酶,Leucotropin,molgramostirn,曲普瑞林,组氨瑞林(皮下植入,Hydron),地洛瑞林,组氨瑞林,那法瑞林,醋酸亮丙瑞林缓释库(ATRIGEL),醋酸亮丙瑞林植入(DUROS),戈舍瑞林,促生长激素,尤得盼,KP-102过程,促生长激素,促生长激素,美卡舍明(生长不足),enlfavirtide,Org-33408,甘精胰岛素,赖谷胰岛素,胰岛素(吸入式),赖脯胰岛素,地特胰岛素,胰岛素(口腔,RapidMist),美卡舍明-林菲培,阿那白滞素,西莫白介素,99mTc-apcitide注射用,myelopid,Betaseron,醋酸格拉替雷,Gepon,沙莫司亭,奥普瑞白介素,人类白细胞衍生的α干扰素,Bilive,胰岛素(重组),重组人类胰岛素,门冬胰岛素,mecasenin,Roferon-A,干扰素-α2,Alfaferone,干扰素alfacon-1,干扰素α,Avonex重组人类黄体化激素,脱氧核糖核酸酶α,曲弗明,齐考诺肽,他替瑞林,diboterminα,阿托西班,贝卡普勒明,依替巴肽,Zemaira,CTC-111,Shanvac-B,HPV疫苗(四价),奥曲肽,兰乐肽,ancestirn,半乳糖苷酶β,半乳糖苷酶α,艾杜糖醛酸酶,醋肽铜(局部凝胶),拉布立酶,兰尼单抗,Actimmune,PEG-内含子,Tricomin,重组屋尘螨变应原脱敏注射剂,重组人类副甲状腺激素(PTH)1-84(sc,骨质疏松症),依泊汀δ,转基因抗凝血酶III,Granditropin,Vitrase,重组胰岛素,干扰素-α(口服含片),GEM-21S,伐普肽,艾度硫酸酯酶,奥马曲拉,重组血清白蛋白,妥珠单抗,羧肽酶,人类重组CI酯酶抑制因子(血管性水肿),拉诺替普酶,重组人类生长激素,恩夫韦肽(无针注射,Biojector 2000),VGV-1,干扰素(α),lucinactant,阿肽地尔(吸入的,肺病),艾替班特,ecallantide,奥米加南,Aurograb,醋酸培西加南,ADI-PEG-20,LDI-200,地加瑞克,贝辛白介素,Favld,MDX-1379,ISAtx-247,利拉鲁肽,特立帕肽(骨质疏松症),替法可近,AA4500,T4N5脂质体乳液,卡妥索单抗,DWP413,ART-123,Chrysalin,去氨普酶,安地普酶,默沙东促排卯药,TH-9507,替度鲁肽,Diamyd,DWP-412,生长激素(持释注射),重组G-CSF,胰岛素(吸入式,AIR),胰岛素(吸入式,Techno sphere),胰岛素(吸入式,AERx),RGN-303,DiaPep277,干扰素β(丙肝病毒感染(HCV)),干扰素α-n3(口服),贝拉西普,经皮胰岛素贴剂,AMG-531,MBP-8298,Xerecept,奥培巴坎,AIDSVAX,GV-1001,LymphoScan,豹蛙酶,Lipoxysan,芦舒普肽,MP52(β-磷酸钙载体,骨再生),黑素瘤疫苗,sipuleucel-T,CTP-37,Insegia,维特斯朋,人类凝血酶(冷冻,手术出血),凝血酶,TransMID,alfimeprase,普瑞凯希,特利加压素(静脉内,肝肾综合征),EUR-1008M,重组FGF-I(可注射,血管疾病),BDM-E,rotigaptide,ETC-216,P-113,MBI-594AN,耐久霉素(吸入式,囊性纤维化),SCV-07,OPI-45,内皮他丁,血管增生抑制素,ABT-510,Bowman-Birk抑制剂浓缩物,XMP-629,99mTc-Hynic-膜联蛋白V,kahalalide F,CTCE-9908,替维瑞克(延释),ozarelix,罗咪酯肽,BAY-504798,白细胞介素4,PRX-321,肽扫描,iboctadekin,rhlactoferrin,TRU-015,IL-21,ATN-161,西仑吉肽,Albuferon,Biphasix,IRX-2,ω干扰素,PCK-3145,CAP-232,帕瑞肽,huN901-DMI,卵巢癌的免疫治疗疫苗,SB-249553,Oncovax-CL,OncoVax-P,BLP-25,CerVax-16,多抗原表位肽黑素瘤疫苗(MART-1,gp100,酪氨酸酶),奈米非肽,rAAT(吸入式),rAAT(皮肤),CGRP(吸入式,哮喘),pegsunercept,胸腺肽β4,plitidepsin,GTP-200,雷莫拉宁,GRASPA,OBI-1,AC-100,鲑降血钙素(口服,eligen),降血钙素(口服,骨质疏松症),艾沙瑞林,卡普瑞林,Cardeva,velafermin,131I-TM-601,KK-220,T-10,乌拉立肽,depelestat,hematide,Chrysalin(局部),rNAPc2,重组因子VI11(聚乙二醇化脂质体),bFGF,聚乙二醇化重组葡萄球菌激酶变体,V-10153,SonoLysis Prolyse,NeuroVax,CZEN-002,胰岛细胞再生疗法,rGLP-1,BEVI-51077,LY-548806,艾塞那肽(控释,Medisorb),AVE-0010,GA-GCB,阿伏瑞林,AOD-9604,linaclotid eacetate,CETi-1,Hemospan,VAL(可注射),快速起效胰岛素(可注射,Viadel),鼻内胰岛素,胰岛素(吸入式),胰岛素(口服,eligen),重组甲硫氨酰人类瘦蛋白,pitrakinra皮下注射剂,湿疹),pitrakinra(吸入式干粉,哮喘),Multikine,RG-1068,MM-093,NBI-6024,AT-001,PI-0824,Org-39141,CpnlO(自体免疫疾病/炎症),人乳铁传递蛋白(局部),rEV-131(眼科),rEV-131(呼吸道疾病),口服重组人类胰岛素(糖尿病),RPI-78M,奥普瑞白介素(口服),CYT-99007CTLA4-Ig,DTY-001,valategrast,干扰素α-n3(局部),IRX-3,RDP-58,Tauferon,胆盐刺激脂酶,Merispase,碱性磷酸酶,EP-2104R,Melanotan-II,布雷默浪丹,ATL-104,重组人类微纤溶酶,AX-200,SEMAX,ACV-1,Xen-2174,CJC-1008,强啡肽A,SI-6603,LAB GHRH,AER-002,BGC-728,疟疾疫苗(病毒颗粒,PeviPRO),ALTU-135,细小病毒B 19疫苗,流感疫苗(重组神经氨糖酸苷酶),疟疾/HBV疫苗,炭疽疫苗,Vacc-5q,Vacc-4x,HIV疫苗(口服),HPV疫苗,Tat Toxoid,YSPSL,CHS-13340,PTH(l-34)脂质体乳膏(Novasome),Ostabolin-C,PTH类似物(局部,牛皮癣),MBRI-93.02,MTB72F疫苗(肺结核),MVA-Ag85A疫苗(肺结核),FARA04,BA-210,重组瘟疫F1V疫苗,AG-702,OxSODrol,rBetVl,Der-pl/Der-p2/Der-p7变应原靶向疫苗(尘瞒过敏症),PR1肽抗原(白血病),突变ras疫苗,HPV-16E7脂肽疫苗,labyrinthin疫苗(腺癌),CML疫苗,WT1-肽疫苗(癌症),IDD-5,CDX-110,Pentrys,Norelin,CytoFab,P-9808,VT-111,icrocaptide,telbermin(皮肤,糖尿病足溃疡),芦平曲韦,reticulose,rGRF,P1A,α-半乳糖苷酶A,ACE-011,ALTU-140,CGX-1160,血管紧缩素治疗疫苗,D-4F,ETC-642,APP-018,rhMBL,SCV-07(口服,肺结核),DRF-7295,ABT-828,ErbB2-特异性免疫毒素(抗癌症),DT3SSIL-3,TST-10088,PRO-1762,Combotox,胆囊收缩素-B/促胃液素-受体结合肽,111In-hEGF,AE-37,曲妥单抗-DMl,拮抗剂G,IL-12(重组),PM-02734,IMP-321,rhIGF-BP3,BLX-883,CUV-1647(局部),L-19基放射性免疫治疗剂(癌症),Re-188-P-2045,AMG-386,DC/1540/KLH疫苗(癌症),VX-001,AVE-9633,AC-9301,NY-ESO-1疫苗(肽),NA17.A2肽,黑素瘤疫苗(脉冲抗原治疗),前列腺癌症疫苗,CBP-501,重组人类乳铁传递蛋白(干眼症),FX-06,AP-214,WAP-8294A(可注射),ACP-HIP,SUN-11031,肽YY[3-36](肥胖症,鼻内),FGLL,阿塞西普,BR3-Fc,BN-003,BA-058,人类副甲状腺激素1-34(鼻,骨质疏松症),F-18-CCR1,AT-1100(乳糜泻/糖尿病),JPD-003,PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome),耐久霉素(眼科,干眼症),CAB-2,CTCE-0214,糖基化聚二乙醇化红细胞生成素,EPO-Fc,CNTO-528,AMG-114,JR-013,因子XIII,氨基康定,PN-951,716155,SUN-E7001,TH-0318,BAY-73-7977,替维瑞克(立即释放),EP-51216,hGH(控释,Biosphere),OGP-I,西夫韦肽,TV4710,ALG-889,Org-41259,rhCCIO,F-991,胸腺五肽(肺病),r(m)CRP,hepatoselective胰岛素,subalin,L19-IL-2融合蛋白质,弹性蛋白酶抑制剂,NMK-150,ALTU-139,EN-122004,rhTPO,促血小板生成素受体激动剂(血小板减少症),AL-108,AL-208,神经生长因子拮抗剂(疼痛),SLV-317,CGX-1007,INNO-105,口服特立帕肽(eligen),GEM-OS 1,AC-162352,PRX-302,LFn-p24融合物疫苗(Therapore),EP-1043,S小儿肺炎疫苗,疟疾疫苗,脑膜炎奈瑟氏球菌B组疫苗,新生儿B组链球菌疫苗,炭疽疫苗,HCV疫苗(gpEl+gpE2+MF-59),中耳炎的治疗,HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX),hPTH(l-34)(经皮,ViaDerm),768974,SYN-101,PGN-0052,aviscumnine,BIM-23190,结核疫苗,多抗原表位酪氨酸酶肽,癌症疫苗,enkastim,APC-8024,GI-5005,ACC-001,TTS-CD3,靶向血管的TNF(实体肿瘤),去氨加压素(颊控释),奥那西普和TP-9201。
在某些实施方案中，异源生产的蛋白质为酶或其生物活性片段。合适的酶包括但不限于：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。在某些实施方案中，异源生产的蛋白质为酶学委员会(EC)1类的酶，例如得自EC 1.1至1.21,或1.97的任意一种的酶。所述的酶还可以为得自EC 2,3,4,5或6类的酶。例如酶可以选自EC 2.1至2.9,EC 3.1至3.13,EC 4.1至4.6,EC 4.99,EC 5.1至5.11,EC 5.99,或者EC 6.1-6.6的任意一种。根据具体的实施方案，酶为高甘露糖酶，例如溶酶体蛋白质，例如葡糖脑苷脂酶和α半乳糖苷酶。
如本文所用，术语“抗体”是指基本完整的抗体分子。该术语是指单特异性抗体以及双和三特异性抗体。
如本文所用，短语“抗体片段”是指能够与抗原的抗原表位结合的抗体的功能片段(例如Fab,F(ab')2,Fv或单结构域分子，例如VH和VL)。
在本发明的细胞中生产的示例性抗体包括但不限于阿昔单抗(ReoProRTM),阿达木单抗(HumiraRTM),阿仑单抗(CampathRTM),巴利昔单抗(SimulectRTM),贝伐单抗(AvastinRTM),西妥昔单抗(ErbituxRTM),达克珠单抗(ZenapaxRTM),dacetuzumab,eculizumab(SolirisRTM),依法利珠单抗(RaptivaRTM),依决可单抗(PanorexRTM),依帕珠单抗,替伊莫单抗(ZevalinRTM),伊莫单抗,英夫利昔单抗(RemicadeRTM),莫罗单抗-CD3(OKT3),那他珠单抗(TysabriRTM),奥马珠单抗(XolairRTM),帕利珠单抗(SynagisRTM),帕尼单抗(VectibixRTM),兰尼单抗(LucentisRTM),单抗奥佐米星(MylotargRTM),oregovomab(OvaRexRTM),利妥昔单抗(RituxanRTM),托西莫单抗(BexxarRTM),曲妥单抗(HerceptinRTM),MetMAb,ocrelizumab,帕妥株单抗,RaptivaRTM(依法利珠单抗),hu M195Mab,MDX-210,BEC2,抗-Aβ,抗-CD4,抗-IL-13,抗-oxLDL,曲妥单抗-DMl,apomab,rhuMAbβ7,rhuMAb IFNα,GA101,抗-OX40L,易普利姆玛,Valortim,ustekinumab,戈利木单抗,ofatumumab,扎鲁木单抗,西木单抗,motavizumab,米妥莫单抗,ecromeximab,ABX-EGF,MDXOIO,XTL 002,Hl lSCFV,4B5,XTLOOl,MDX-070,TNX-901,IDEC-114,和对抗原具有特异性的任何抗体片段，包括但不限于补体C5,CBL,CD147,gp 120,VLA4,CDl la,CD18,VEGF,CD40L,抗-Id,ICAM1,CD2,EGFR,TGF-β2,TNF-α,TNF受体,E-选择蛋白,Factll,Her2/neu,F gp,CDl l/18,CD14,CD80,ICAM3,CD4,CD23,β.2-整合素,alpha4beta7,CD52,CD22,OX40L,IL-5受体,GM-CSF受体,GM-CSF,HLA-DR,oxLDL,CD64(FcR),TCRαβ,CD3,Hep B,CD 125,DR5,EpCAM,gpllbllla,IgE,β7整合素,CD20,β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-9,IL10,IL13,IL-12/IL-23,IL-15,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,VEGFR-1,血小板衍生的生长因子受体.α.(PDGFRα),血管粘附蛋白1(VAP1),结缔组织生长因子(CTGF),Apo2/TRAIL,CD25,CD33,HLA,F gp,IgE,CTLA-4,IP-10,抗-C.艰难梭菌毒素A和毒素B,B.炭疽PA,呼吸道合胞体病毒(RSV),甘露糖受体/hCG.β,整合素受体,PDl,PDL-1,CD 19,CD70和VNR整合素。
可以根据本发明的教导生产的示例性结构蛋白质包括但不限于胶原蛋白、原骨胶原、白蛋白、纤维蛋白原或它们的衍生物。
多聚体蛋白质的生产需要在单一核酸构建体上表达所有亚单元，以确保化学计量的生产。而且，还可以取得在单一植物细胞或多个细胞中由大量核酸构建体(构建体系统)的表达。
本文所述的蛋白质由植物细胞中用于重组表达的分离的多核苷酸(多种)编码。编码所述的蛋白质(例如所关注的多肽和至少一种糖苷酶)的开放阅读框的每一个都在翻译中与诸如上文所述的信号肽融合。尽管所述的两种蛋白质靶向相同的亚细胞分隔区，但是信号不必相同。
短语“分离的多核苷酸”是指单链或双链核酸序列，其以RNA序列(即，包含核糖核苷酸)、互补性多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列(即，包含脱氧核糖核苷酸)和/或复合多核苷酸序列(例如上述的组合)的形式分离和提供。
如本文所用，短语“互补性多核苷酸序列”是指这样的序列，其是使用逆转录酶或任何其他的RNA依赖的DNA聚合酶由信使RNA的逆转录得到的。该序列随后可以使用DNA依赖的DNA聚合酶在体内或体外扩增。
如本文所用，短语“基因组多核苷酸序列”是指由染色体衍生(分离)的序列，因此，其代表了染色体相邻的部分。
如本文所用，短语“复合多核苷酸序列”是指这样的序列，其至少部分是互补性的，并且至少部分是基因组的。复合序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及设置在其中间的一些内含子序列。内含子序列可以是任何来源的，包括其他的基因，并且通常包括保守的拼接信号序列。此类内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调节元件。
编码本发明的蛋白质的示例性核酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2,4,6,8,10,12,14,20,30。
就异源表达而言，编码上文提及的多肽(以及其他多肽，例如下文进一步描述的那些)的每一种的核酸序列与核酸构建体或构建体系统连接。
如本文所用，当涉及本发明的蛋白质时，合格的“异源的”表明所述的蛋白质由核酸序列(多条)编码，该核酸序列对于表达细胞而言是外来的(在所述的细胞内是非天然形成的)。
根据本发明的实施方案，提供和核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列，其中至少2种糖苷酶的每一种在翻译中都与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的其他的或备选的实施方案，提供了包含以下部分的核酸构建体：
(i)第一核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第一糖苷酶的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第二糖苷酶的核酸序列，
其中第一糖苷酶和第二糖苷酶的每一种在翻译中都与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的其他的或备选的实施方案，提供了核酸构建体，其包含编码所关注的多肽和至少一种糖苷酶的核酸序列，其中所关注的多肽和至少一种糖苷酶的每一种在翻译中均与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的其他的或备选的实施方案，提供了核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码编码所关注的多肽的核酸序列(至少一个亚单元或更多，例如2,3)；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的核酸序列，
其中至少一种糖苷酶的每一种在翻译中都与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
根据本发明的其他的或备选的实施方案，提供了核酸构建体，其包含编码糖苷酶的核酸序列，所述的糖苷酶在翻译中与用于在所关注的亚细胞分隔区内定位的信号肽融合。
根据具体的实施方案，上文提及的核酸构建体或核酸构建体系统的每一种均可以包含其他的核酸序列或构建体，例如编码其他的糖苷酶或翻译后修饰酶的那些，其包括但不限于脯氨酰4-羟化酶或其亚单元,赖氨酰氧化酶,赖氨酰羟化酶,C-蛋白酶,N-蛋白酶,PACE,γ-谷氨酰基羧化酶,N-乙酰基氨基葡萄糖转移酶,N-乙酰基氨基半乳糖转移酶,N-乙酰基氨基半乳糖转移酶,唾液酸-转移酶,岩澡糖基转移酶,半乳糖基转移酶,甘露糖基转移酶,磺基转移酶,糖苷酶,乙酰基转移酶和甘露糖苷酶,如在WO/2001/029242中所教导。
改善岩澡糖基化作用和木糖基化作用所备选地或额外地，例如与相同物种的植物或植物细胞相比，植物或植物细胞可以包含降低水平或活性的至少一种糖基转移酶，其中所述的相同物种的植物或植物细胞表达野生型水平或展现野生型活性的所述的至少一种糖基转移酶。
根据具体的实施方案，糖基转移酶包括β-(1-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。
减少糖基转移酶的表达或活性的方法在WO/2001/029242中详细描述。抑制植物中的基因表达的一般方法是本领域公知的，包括但不限于siRNA,dsRNA,反义,hnRNA和嵌合核酶，例如包含核酸内切酶DNA结合结构域的DNA结合结构域，亮氨酸拉链DNA结合结构域，转录激活因子样(TAL)DNA结合结构域，重组酶，CRISPR-Cas9和锌指蛋白质DNA结合结构域。
根据具体的实施方案，用于沉默的靶物为GDP-D-甘露糖6,6-脱水酶基因(多种)。
根据具体的实施方案，用于沉默的靶物为木糖转移酶(XylT)。
用于使与蛋白质岩澡糖基化作用/木糖基化作用有关的基因沉默的其他教导可以在Matsuo et al.2014J.Bioscience and Bioengineering9:264-281中找到。
备选地或此外，使用多核苷酸转化植物，所述的多核苷酸赋予培养或农业有效的特征，例如昆虫抗性，疾病抗性，除草剂抗体，增加的产率，对环境应激增加的耐受性，增加的或减少的淀粉、油或蛋白质含量。
备选地或此外，使用多核苷酸转化植物，所述的多核苷酸简化了所关注的多肽的分离。根据实施方案，植物由此表达编码融合多肽的核酸序列，其中所述的融合多肽包含细胞壁结合结构域(例如CBD)，其在翻译中与用于结合所关注的多肽的亲和部分(例如异源的，嵌合蛋白质)融合。
可以根据本发明的教导使用的纤维素结合结构域的实例为在实施例部分以及由以下蛋白质来源提供的那些(还可以参见WO2009/069123)：
β-葡聚糖酶(微晶纤维素酶,CMCase,纤维糊精酶)
exoglucanse或纤维二糖水解酶
纤维素结合蛋白质
木聚糖酶
混合的木聚糖酶/葡聚糖酶
酯酶
几丁质酶
β-l,3-葡聚糖酶
β-1,3-(β-1,4)-葡聚糖酶
(β-)甘露聚糖酶
β-葡萄糖苷酶/半乳糖苷酶
纤维素合成酶
然而，备选地或此外，可以使用核酸构建体转化植物或植物细胞，所述的核酸构建体包含编码多肽的核酸序列，其中所述的多肽包含对所关注的多肽(例如在抗体、蛋白质A/G/L的情况)具有亲和性的核酸序列，其中所述的多肽在翻译中与异源跨膜结构域融合。因此，在均化作用后，所关注的多肽可以与膜结合的亲和部分结合。
亲和部分与跨膜结构域融合的融合可以是直接的或者通过连接体进行(例如SEQID NO:31)。
因此，在培养过程(例如当所关注的多肽和糖苷酶定向于离质体时)中，或者在细胞培养和裂解之后，所关注的多肽与亲和部分结合，并固定在不溶性级份中。
亲和部分可以为任何氨基酸序列，其对所关注的多肽具有特异性的亲和性(但是对植物细胞蛋白质不具有特异性的亲和性)，例如大约10～4M或10～6M。根据示例性的实施方案，亲和部分为蛋白质A、G或L。根据具体的实施方案，亲和部分为蛋白质A。
这些表达产物可以与所关注的多肽共同定位，或者不与该多肽共同定位。
可以使用本领域任一技术人员公知的重组DNA技术构建在根据本发明的一些实施方案中使用的构建体。核酸构建体可以是专有的或市售可得的，其适用于转化至适用于在转化细胞中表达蛋白质的植物中。基因构建体可以是表达载体，其中所述的核酸序列可操作地与一个或多个调节序列连接，从而可以在植物细胞中表达。
在本发明的一些实施方案的特定实施方案中，调节序列为可在植物中表达的启动子。
如本文所用，短语“可在植物中表达”是指启动子序列(包含加入其中的或者其中所包含的任何其他的调节元件)为能够诱导、赋予、激活或增强植物细胞、组织或器官(优选为单子叶植物细胞或双子叶植物细胞)中的表达的至少一种序列。用于本发明的一些实施方案的方法中的优选启动子的实例示于表2,3,4和5中。
表2.用于实施本发明的一些实施方案的示例性构成性启动子
表3.用于实施本发明的一些实施方案的示例性种子优选的启动子
表4.用于实施本发明的示例性花朵特异性启动子
表5.用于实施本发明的备选大米启动子
可以针对植物的表达来优化本发明的一些实施方案的多肽(例如糖苷酶和所关注的多肽)的核酸序列。此类序列修饰的实例包括但不限于改变的G/C含量，使其更密切地接近于在所关注的植物物种中通常发现的含量，以及除去在植物物种中非典型的发现的密码子(通常称为密码子优化)。
短语“密码子优化”是指选择在结构基因或其片段中使用的合适的DNA核苷酸(其接近于所关注的植物中的密码子的使用)。因此，优化的基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然的或自然形成的基因的核苷酸序列经修饰，从而使用在植物中统计学优化的或统计学有利的密码子。通常在DNA水平和编码区(在植物物种中使用任何合适的过程测定的针对表达而优化的)检测核苷酸序列，例如Sardana等人所述(1996,Plant Cell Reports 15:677-681)。
因此，本发明的一些实施方案涵盖了上文所述的核酸序列，其片段，可与其杂交的序列；与其同源的序列，与其直系同源的序列，使用不同的密码子编码相似多肽的序列，通过突变(例如删除、插入或取代一个或多个核苷酸)表征的改变的序列(天然形成的或人类诱导的，随机的或靶向的方式)。
使用本发明的一些实施方案的核酸构建体稳定地或瞬时地转化植物细胞。
可以使用编码至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)的核酸序列(构建体或构建体系统)转化植物细胞，然后使用编码所关注的多肽的核酸构建体转化该植物细胞。备选地，可以使用编码至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)和所关注的多肽的核酸序列(构建体或构建体系统)转化植物细胞。备选地，使用编码所关注的多肽的核酸构建体转化植物细胞，然后使用编码至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)的核酸序列(构建体或构建体系统转化植物细胞)转化该植物细胞。
在稳定的转化中，本发明的一些实施方案的核酸分子整合至植物基因组中，这样其代表了稳定的且遗传特征。在瞬时转化中，核酸分子由转化的细胞表达，但是其未整合至基因组中，因此其代表了瞬时特征。
由多种方法用于将外来基因引入至单子叶植物和双子叶植物中，在本文中统称为转化、引入、感染(Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225；Shimamoto et al.,Nature(1989)338:274-276)。
能够使外来DNA(即，异源的)稳定地整合至植物基因组DNA中的原则性方法包括2种主要的方法：
(i)土壤杆菌属介导的基因转移：Klee et al.(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486；Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Geneticsof Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,andVasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25；Gatenby,in PlantBiotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。
(ii)直接DNA吸收：Paszkowski et al.,in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68；包括将DNA直接吸收至原生质体中的方法,Toriyama,K.et al.(1988)Bio/Technology 6:1072-1074。通过植物细胞短暂的电冲击诱导DNA吸收：Zhang et al.Plant Cell Rep.(1988)7:379-384.Fromm et al.Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将DNA注射至植物细胞中,Klein et al.Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe et al.Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量吸管系统：Neuhauset al.,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus and Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217；细胞培养物、胚芽或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须,美国专利No.5,464,765或者通过DNA与萌发的花粉直接温育,DeWet et al.in ExperimentalManipulation of Ovule Tissue,eds.Chapman,G.P.and Mantell,S.H.and Daniels,W.Longman,London,(1985)p.197-209；and Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。
土壤杆菌属系统包括质粒载体的使用，所述的质粒载体包含整合至植物基因组DNA中的定义DNA链段。植物组织的接种方法根据植物的物种和土壤杆菌属的传递系统而改变。广泛使用的方法为叶盘过程，其可以使用任何组织移植体来实施，所述的组织移植体提供了引入整个植物分化的良好的来源。Horsch et al.in Plant Molecular BiologyManual A5,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht(1988)p.1-9。补充方法使用了土壤杆菌属传递系统，并结合真空渗透。土壤杆菌属系统在转基因双子叶植物的创建中是特别可行的。
具有多种将DNA直接转移至植物细胞中的方法。在电穿孔中，原生质体短暂地暴露于强电场中。在微注射中，使用极小的微量吸管将DNA以机械方式直接注射至细胞中。在微粒子轰击中，DNA吸附在微弹(例如硫酸镁晶体或钨颗粒)上，并且微弹以物理方式加速进入细胞或植物组织中。
在稳定转化后，植物的繁殖开始执行。最普通的植物繁殖方法是通过种子。但是，通过种子繁殖的再生具有缺陷，由于杂合性，农作物中缺乏均匀性，这是因为种子是根据Mendelian法则控制的遗传方差由植物产生的。基础而言，每个种子都具有遗传差异，并且每个种子都将以其自身特异性的特征而生长。因此，优选的是生产转化的植物，使得再生的植物具有亲代转基因植物的一致的特性和特征。因此，优选的是通过微繁殖使转化的植物再生，所述的微繁殖提供了转化植物的快速且一致的再生产。
微繁殖是由单个组织生长新一代植物的工艺，所述的组织由所选的亲代植物或栽培品种切下。该工艺允许植物大量再生产，其中所述的植物具有表达融合蛋白质的优选的组织。生产的新一代植物在遗传学上与原始植物一致，并且具有原始植物所有的特性。微繁殖可以在短期内大量生产有品质的植物材料，并在保留原始转基因或转化植物的特性的情况下提供所选栽培品种的快速成倍增加。克隆植物的优点为植物成倍增加的速度以及所生产的植物的品质和均匀性。
微繁殖是多个阶段的过程，其需要改变各阶段之间的培养介质或生长条件。因此，微繁殖工艺涉及4个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养物成倍增加；阶段三，分化和植物形成；以及阶段四，温室培养和强化。在阶段一中，建立组织培养物，并且证明无污染物。在阶段二中，初始组织培养物成倍增加，直至生产足以满足生产目的的足量的组织样品。在阶段三中，在阶段二中生长的组织样品分开，并生长成单个的植物苗。在阶段四时，转化的植物苗被转移至温室中用于强化，其中植物对光的耐受性逐渐增强，使得其可以在自然环境中生长。
尽管稳定的转化目前是优选的，但是通过本发明的一些实施方案，还可以展望叶细胞、分生组织细胞或整个植物的瞬时转化。
可以通过上文所述的直接DNA转移方法或者通过使用修饰的植物病毒的病毒感染的任意一种方法来进行瞬间转化。
已经显示用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒对植物进行转化在美国专利No.4,855,237(BGV),EP-A 67,553(TMV),Japanese PublishedApplication No.63-14693(TMV),EPA 194,809(BV),EPA 278,667(BV)；and Gluzman,Y.etal.,Communications in Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring HarborLaboratory,New York,pp.172-189(1988)中描述。用于在许多宿主(包括植物)中表达外来DNA的假病毒颗粒在WO 87/06261中描述。
用于在植物中引入和表达非病毒外来核酸序列的植物RNA病毒的构建通过上文的参考文献以及Dawson,W.O.et al.,Virology(1989)172:285-292；Takamatsu et al.EMBOJ.(1987)6:307-311；French et al.Science(1986)231:1294-1297；and Takamatsu etal.FEBS Letters(1990)269:73-76来证明。
当病毒为DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当的修饰。备选地，可以首先将病毒克隆至细菌质粒中，以便于构建具有外来DNA的所需的病毒载体。然后，可以将病毒由质粒上切下。如果病毒为DNA病毒，细菌的复制起点可以附着在病毒DNA上，然后通过细菌复制。该DNA的转录和翻译可以产生衣壳蛋白质，其将包裹病毒DNA。如果病毒为RNA病毒，则病毒通常作为cDNA克隆，并被插入至质粒中。该质粒随后用于进行所有的构建。通过转录质粒的病毒序列以及病毒基因的翻译可以生产RNA病毒，从而生产包裹病毒RNA的衣壳蛋白质(多种)。
通过上文的参考文献以及美国专利No.5,316,931证明用于在非病毒植物中引入和表达外源核酸序列的植物RNA病毒的构建，其中所述的序列例如为在本发明的一些实施方案的构建体中所包含的那些。
在一个实施方案中，提供了植物病毒核酸，其中由病毒核酸中删除编码天然衣壳蛋白质的序列，插入了编码非天然植物病毒衣壳蛋白质的序列和非天然的启动子，优选的是编码非天然衣壳蛋白质的亚基因组启动子的编码序列，这些序列能够在宿主细胞中表达，包装重组的植物病毒核酸，并确保宿主被重组的植物病毒核酸系统性地感染。备选地，衣壳蛋白质基因可以通过在其中插入非天然核酸序列而失活，这样所述的蛋白质得以生产。重组植物病毒核酸可以包含一个或多个其他的非天然亚基因组启动子。各个非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因或核酸序列，并且不能彼此以及与天然亚基因组启动子重组。如果包含多于一个的核酸序列，则非天然(外来)核酸序列可以插入与天然植物病毒亚基因组启动子、或者天然的和非天然的植物病毒亚基因组启动子相邻的位置。非天然的核酸序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制之下转录或表达，从而生产所述的产物。
在第二个实施方案中，提供与第一个实施方案中相同的重组植物病毒核酸，不同之处在于编码天然衣壳蛋白质的序列与非天然衣壳蛋白质亚基因组启动子之一相邻设置，而非替代编码非天然衣壳蛋白质的序列。
在第三个实施方案中，提供了重组植物病毒核酸，其中天然衣壳蛋白质基因与其亚基因组启动子相邻，并且将一个或多个非天然亚基因组启动子插入到病毒核酸中。所插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因，并且不能彼此以及与天然的亚基因组启动子重组。可以与非天然亚基因组植物病毒启动子相邻插入非天然核酸序列，使得所述的序列在宿主中在亚基因组启动子的控制之下转录或表达，从而生产所述的产物。
在第四个实施方案中，提供与第三个实施方案相同的重组植物病毒核酸，不同之处在于编码天然衣壳蛋白质的序列被编码非天然衣壳蛋白质的序列替换。
病毒载体被重组植物病毒核酸编码的衣壳蛋白质包裹，从而生产重组植物病毒。重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染合适的宿主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中复制，在宿主中系统性扩散，并且外来基因(多种)(分离的核酸)在宿主中转录或表达从而生产所述的蛋白质。
除了上文所述，本发明的一些实施方案的核酸分子还可以被引入至叶绿体基因组中，由此能够使叶绿体表达。
用于将外源核酸序列引入叶绿体基因组中的技术是已知的。该技术涉及以下过程。首先，对植物细胞进行化学处理，从而将每个细胞的叶绿体的数量减少至大约1个。然后，为了将至少一个外源核酸分子引入至叶绿体中，通过离子轰击将外源核酸引入至细胞中。选择外源核酸，使得其通过同源重组而整合至叶绿体基因组中，其中所述的重组可以通过叶绿体固有的酶容易地实施。至此，外源核酸除了包括所关注的基因以外，还包括至少一个由叶绿体基因组衍生的核酸分支。此外，外源核酸包括选择性标记，其通过相继的选择过程而起作用，从而确定所有的或基本所有拷贝的叶绿体基因组在如此选择后，都将包含外源核酸。与该技术有关的其他细节在美国专利No.4,945,050和5,693,507中可以找到，这些文献以引用方式并入本文。因此，可以通过叶绿体的蛋白质表达系统来生产多肽，并且该多肽将整合至叶绿体的内膜中。
因此，根据具体的实施方案，表达至少2种糖苷酶包括向植物或植物细胞中引入核酸构建体，该构建体包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列，其中至少2种糖苷酶的每一种均在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位信号肽融合。可以使用所关注的多肽进一步转化植物或植物细胞。备选地或此外，可以使用所关注的多肽和糖苷酶转化植物细胞。
因此，如本文所述，使用核酸构建体或构建体系统来转化单一的植物(与是否为转基因无关)。
然而，如本发明的教导，关于大量转基因的表达，可以通过使均表达单个转基因(或更多的)的植物杂交而生成转基因植物或植物细胞，从而获得包含大量转基因的杂交产物。
因此，根据具体的实施方案，通过杂交和选择技术来表达转基因(例如2种糖苷酶，糖苷酶和所关注的多肽，或者2种糖苷酶和所关注的多肽)。
因此，表达至少2种糖苷酶包括：
(a)在第一植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第一糖苷酶；
(b)在第二植物的亚细胞分隔区内表达至少2种糖苷酶的第二糖苷酶；以及
(c)是第一植物与第二植物杂交。
备选地，在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)的第一植物与表达所关注的多肽的第二植物杂交。
备选地，第一植物与表达所关注的多肽的第二植物杂交，其中所述的第一植物表达包含细胞壁结合肽的多肽融合物，所述的细胞壁结合肽在翻译中在亚细胞分隔区内与异源亲和部分、和可任选的至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)融合。
这些植物的每一种可以进一步包含用于在植物细胞中下调节岩澡糖基转移酶或木糖基转移酶的核酸序列。
可以通过本领域已知的用于繁育植物的任何手段来完成杂交和繁育，例如上文所述的第一和第二植物的异花授粉，以及由随后的几代选择表达第一酶和第二酶的植物。本文所用的植物繁育方法是本领域任一技术人员公知的。关于植物繁育技术的讨论，参见Poehlman(1987)Breeding Field Crops.AVI Publication Co.,Westport Conn。用于本发明的许多农作物植物通过利用植物的授粉及方法的技术来繁育。
根据具体的实施方案，在转化后，针对所关注的多肽的最高表达水平以及糖苷酶(多种)的水平/活性来选择植物或植物细胞，并由此可以用于确定在转化的植物细胞、转基因植物和组织特异性表达中的表达水平。
一种此类的方法用于测量以总可溶性蛋白质的百分率表示的所关注的多肽的表达。一种标准的测试为本领域的那些技术人员公知的Bradford测试(Bradford,M.1976.Anal.Biochem.72:248)。还应该测量重组蛋白质的生物化学活性，并将其与野生型标准比较。可以通过本领域公知的方法测定多糖降解酶(即，糖苷酶)的活性，例如分别用于检验岩藻糖苷酶和木糖苷酶活性的Fuc-Mu(4-甲基伞形酮α-L-岩藻吡喃糖苷酶)and Xyl-Mu(4-甲基伞形酮-β-D-木吡喃糖苷酶)。
用于糖苷活性的其他测试是本领域已知的，并且可以用于在由愈合组织、叶子、果实和种子制备的提取物种检测酶活性。参见Coughlan et al.((1988)J.Biol.Chem.263:16631-16636)and Freer((1993)J.Biol.Chem.268:9337-9342)。此外，Western分析和ELISA可以用于评估蛋白质的整合性和表达水平。
因此，本发明的教导提供了转基因植物或植物细胞，例如经转化而在亚细胞分隔区内以共同定位的方式表达至少2种糖苷酶的转基因植物或植物细胞，或者经转化而在亚细胞分隔区内以共同定位的方式表达至少一种糖苷酶(例如至少2种糖苷酶)和所关注的多肽的转基因植物或植物细胞。
备选地或此外，提供了包含本文所述的核酸构建体或核酸构建体系统的转基因植物或植物细胞。
如本文所用，转基因植物或植物细胞是指包含异源核酸序列的植物或植物细胞，其中所述的异源核酸序列翻译成至少一种糖苷酶和所关注的多肽。
一旦转化，便在一定的条件下培养植物细胞或者使植物生长，所述的条件适用于转基因的表达，从而生产所关注的多肽。
因此，根据本发明的方面，提供了生产所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内；以及随后
(b)分离所述的所关注的多肽。
备选地或此外，提供了生产所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)将本文所述的核酸构建体引入植物或植物细胞中；以及随后
(b)分离所述的所关注的多肽。
因此，植物细胞可以为培养的细胞，在培养的组织或培养的器官中的细胞，或者在植物中的细胞。在一些实施方案中，植物细胞为培养的细胞，或者在培养的组织或培养的器官中的细胞。在其他的实施方案中，植物细胞为用于基因转移的任何类型的植物。所述的植物细胞可以作为整个植物的一部分生长，或者备选地在植物细胞培养物中生长。
根据本发明的一些方面，植物细胞在植物细胞悬浮培养物中生长。如本文所用，术语“悬浮培养物”是指由有机体分离的细胞的生长。悬浮培养物可以通过使用液体介质(“悬浮介质”)而促进。悬浮培养物可以指细胞液体营养介质中在三维培养物中的生长，例如但不限于在生物反应器中的悬浮培养物中生长。适用于本发明的植物细胞在植物细胞悬浮培养物中生长的方法和装置在例如PCT WO2008/135991,美国专利No.6,391,683,美国专利申请No.10/784,295；国际专利公开PCT No.WO2004/091475,WO2005/080544和WO 2006/040761中详细描述，这些文献全部以引用方式并入本文，如同它们完全在本文中列出那样。在一些实施方案中，还考虑了在生物反应器的悬浮培养物中生长的毛状根培养物。
因此，本发明涵盖了表达核酸序列从而生产所关注的重组多肽的植物或植物培养物。一旦在植物细胞或整个植物中表达，则可以通过本领域公知的方法来测定由核酸序列编码的所关注的多肽的水平，例如上文所述的或本领域公知的那些。
然后，由植物或植物细胞分离所关注的多肽。分离程度取决于亚细胞分隔区以及预期用途。
通常，生产包含所关注的多肽的细胞提取物。该提取物通常经历净化从而除去宿主细胞污染物和培养物残余物。
在净化后，可以对净化的提取物进一步加工、原样使用、或者储存用于未来使用。根据本发明的一些方面的一些实施方案，在提取和提取物净化后，可以进一步分离所关注的多肽，其还称为纯化。纯化可以通过色谱(例如离子交换色谱、尺寸过滤色谱、HPLC或超滤)、对流透析、亲和纯化、免疫纯化等来实施。因此，在一些实施方案中，所关注的多肽为纯化的多肽，其表征为纯度为至少85％,至少87％,至少90％,至少91％,至少91.5％,至少92％,至少92.5％,至少93％,至少93.1％,至少93.2％,至少93.3％,至少93.4％,至少93.5％,至少93.6％,至少93.7％,至少93.8％,至少93.9％,至少94％,至少94.5％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,至少99.1％,至少99.2％,至少99.3％,至少99.4％,至少99.5％,至少99.6％,至少99.7％,至少99.8％,至少99.9％,范围为至少92.0-99.8％,至少95-99％,至少97-99％,至少98-99.5或100％纯度。在一些实施方案中，通过HPLC测量所关注的多肽的纯度。
植物表达的所关注的多肽的纯度可以表示为总量的重量百分率，或者表示为杂质的重量百分率。在多个实施方案中，除了在本发明的方法中使用的组合物中的所关注蛋白质以外，所有蛋白质的累积重量百分率为低于10％，5％，低于1％，在一些实施方案中，低于0.5％,0.4％,0.3％,0.2％，甚至在一些实施方案中，低于0.1％。在特定的实施方案中，所述的组合物完全缺少除了所关注的蛋白质以外的宿主细胞蛋白质。因此，以蛋白质的重量百分率计，在本发明的方法中给予的组合物通常包含至少90％,91％,92％,93％,94％,至少95％,96％,97％,98％,99％，在一些实施方案中，包含至少99.5％的所关注的蛋白质或其活性部分。
在一些实施方案中，植物表达的所关注的多肽组合物包含由植物宿主细胞衍生的杂质，例如但不限于核酸、多核苷酸、氨基酸、寡肽、多肽、多糖、其他碳水化合物、脂质等。在一些实施方案中，宿主细胞衍生的杂质包括生物活性分子，例如酶。宿主细胞蛋白质可以通过例如HPLC使用宿主细胞蛋白质特异性抗体、以及本领域已知的其他测试来监测，其中所述的抗体是针对由不含所关注的多肽的植物细胞(其在相似的条件下培养)得到的植物细胞级份而产生的。
所述的多肽表征为，与在具有野生型糖基化系统的植物系统中生产的该蛋白质相比，在人类受试对象中具有降低的免疫原性。
可以原样使用如此生产的多肽，或者在组合物中使用该多肽，在组合物中时，所述的多肽与合适的载体或赋形剂混合。
备选地，所述的多肽可以包装于试剂盒中，或者包装于用于研究、化妆或临床应用的制造制品中。
预计在由本申请成熟的专利时效期间，将研发许多相关的所关注的多肽以及糖苷酶，并且这些术语的范围将包括所有这些先验的新的技术。
术语动词性的“包含”、分词性的“包含”、动词性的“包括”、分词性的“包括”、“具有”以及它们的变化形式是指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本由……组成”是指所述的组合物、方法或结构可以包括其他的组分、步骤和/或部分，但是仅仅是在其他的组分、步骤和/或部分未实质性地改变本要求专利权的组合物、方法或结构的基本和新特征的情况下。
如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参照物，除非内容中另外作出清楚的指示。例如术语“a compound”或“at ont compound”可以包括大量的化合物，包括其混合物。
在正整个申请书中，本发明的多种实施方案可以以一定范围的形式提供。应该理解的是，一定范围形式的描述仅是为了方便和简洁，不应该解释为固定地限定本发明的范围。因此，范围的描述应该理解为具有具体公开的所有可能的子范围，以及该范围内的单一数值。例如诸如1至6的范围的描述应该理解为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单一数值，例如1,2,3,4,5和6。无论范围的广度如何，都适用。
无论本文中何时指示数字范围，都是包括该指示范围内的任何所述的数字(级份或积分)。短语“在第一指示的数字和第二指示的数字之间的范围/多个范围”，以及“由第一指示的数字至第二指示的数字的范围/多个范围”在本文中可交换使用，并且包括第一和第二指示的数字，以及该范围内的所有级份和积分数字。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学技术的从业者已知的、或者容易由这些从业者已知的方式、手段、技术和过程研发得到的那些方式、手段、技术和过程。
如本文所用，术语“处理”包括取消、大幅抑制、减慢或逆转状况的进程，大幅减弱状况的临床或美学症状，或者大幅抑制状况的临床或美学症状的外观。
当参照特定的序列列表时，应该理解此类参照还涵盖了基本相当于其互补序列而包含最少的序列变化的序列，其中所述的序列变化由例如测序错误、克隆错误或其他改变(导致碱基取代、碱基删除或碱基加入)导致，前提条件是此类变化的频率低于50个核苷酸1个变化，备选地低于100个核苷酸1个变化，备选地低于200个核苷酸1个变化，备选地低于500个核苷酸1个变化，备选地低于1000个核苷酸1个变化，备选地低于5000个核苷酸1个变化，备选地低于10000个核苷酸1个变化。
应该理解的是，本发明的某些特性(为了清楚起见，在分开的实施方案的内容中描述)还可以与单一的实施方案组合提供。相反，本发明的多个特性(为了简洁起见，在单个实施方案的内容中描述)还可以分开提供，或者在任何合适的亚组合中提供，或者作为本发明的任何其他所述的实施方案适当地提供。在多个实施方案的内容中所述的某些特性不应该理解为是这些实施方案的基本特性，除非该实施方案不具有这些要素是不可操作的。
上文概括的以及以下权利要求书部分要求的本发明的多个实施方案和方法在以下的实施例部分可以找到试验支持。
实施例
现在参照以下实施例以及上文所述，以非限定性的方式说明本发明。
通常，在本文中使用的系统命名法以及本发明中使用的试验过程包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中具有完整的解释。例如参见"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth in U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and5,272,057；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III ColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"SelectedMethods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可利用的免疫测试在专利和科学文献中具有广泛的描述，例如参见美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purificationand Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些文献均以引用方式并入本文，如同它们完全在本文中列出那样。在本文件中提供了其他的一般参照文献。据信，本文所述的过程是本领域公知的，并且为了读者方便而提供。本文所包含的所有信息均以引用方式并入本文。
实施例1
将Avastin(贝伐单抗)和Humira(阿达木单抗)克隆至双元pBINPLUS载体中用于土壤杆菌属介导的烟草转化
限制性酶购自Thermo Scientific。
为了在空泡中表达，使用Rubisco-vac盒，其包含Rubisco启动子(SEQ ID NO:26),空泡信号肽(SEQ ID NO:17和20)和Rubisco终止子(SEQ ID NO:27)。
I.首先，通过Muni和NotI酶，限制携带合成基因的市售质粒(pUC57，得自Genscript)，从而创建4种DNA插入物，其编码：Humira重链(SEQ ID NO:1和2),Humira轻链(SEQ ID NO:3和4),Avastin重链(SEQ ID NO:5和6)和Avastin轻链(SEQ ID NO:7和8)。然后，将插入物连接至包含Rubisco-vac盒的pUC18质粒中，其中所述的Rubisco-vac盒也是由Muni和NotI限制的(图1A-B)，从而创建4种不同的构建体：pUC18Rb-Humira重链,pUC18Rb-Humira轻链,pUC18Rb-Avastin重链和pUC18Rb-Avastin轻链，其中空泡靶向信号定位于编码序列的N-末端(SEQ ID NO:17)。
II.在下一步骤中，构建双元载体pBINPLUS，其具有重链和轻链，以及每个mAb的Rubisco启动子和终止子：pBINPLUS-Humira(图2A-C)和pBINPLUS-Avastin(图3A-C)。
为了创建pBINPLUS-Humira，实施两步连接。在第一步中，通过Hindlll限制pUC18Rb-Humira轻链，并将其克隆至受到Hindlll限制的pBINPLUS载体中，从而创建pBINPLUS Rb-Humira轻链质粒。在第二步中，通过EcoRI和Sacl限制性酶限制pUC18Rb-Humira重链，并使用相同的酶将其克隆至pBINPLUS Rb-Humira轻链中，从而创建具有两条链的pBINPLUS Humira(图2C)。
与pBINPLUS-Humira相似来实施pBINPLUS-Avastin的构建(图3A-C)。首先，通过Hindlll将Rb-Avastin重链克隆至pBINPLUS载体中，从而创建pBINPLUS Rb-Avasin重链(图3B)。然后，通过EcoRI和Sacl限制将Rb-Avastin轻链克隆至pBINPLUS Rb-Avastin重链中(图3C)。
如图2C和3C所示，编码序列的每一个(重链和轻链)在翻译中在N-末端与Rubisco-衍生的空泡信号肽融合。
III.具有Humira(Entelechon优化的密码子)-Rubisco启动子,空泡信号肽(SEQID NO:18,19和20)和Rubisco终止子的Rubisco-vac盒
通过Leto优化软件(由Entelechon提供)优化Humira重链和轻链的DNA序列，并将基因(SEQ ID NO:15和16)克隆至具有Leto优化空泡信号(SEQ ID NO:18和19)的Rubisco盒中。使用Ncol和Notl酶，将包含空泡SP1(序列18,20),Humira重链(SEQ ID NO 15,2),Rubisco终止子,Rubisco启动子,空泡信号SP2(seq.19,20),Humira轻链(序列16,2)的合成DNA片段插入Rubisco表达盒中，由此在具有两条Humira链的pUC18中创建表达盒(SEQ IDNO:25)(图4A-B)。将双重盒克隆至pB INPLUS中。
IV.35S-vac盒—CaMV 35S启动子,空泡信号肽(SEQ ID NO.17和20)以及NOS(胆脂碱合成酶)终止子(SEQ ID NO:28)
将编码Humira重链(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ ID NO:3)的基因克隆至35S-vac盒中，其中它们在框内与通过35S启动子调节的空泡信号肽融合。在pUC18中构建表达盒，然后转化至双元质粒pBINPLUS中(SEQ ID NO:1和3)。创建构建体pUC18 35S-vac-Humira重链,pUC1835S-vac-Humira轻链,pBIN 35S-vac-Humira重链,pBIN 35S-vac-Humira轻链。
V.对于离质体表达，使用包含Rubisco启动子,短的Cell信号肽(SEQ ID NQ:21和22)以及Rubisco终止子的Rubisco-Cell盒
在包含Rubisco核的mAb中，空泡信号肽(图11A-B)通过Ncol/Munl限制被Cell信号肽替换，并进一步连接，从而创建在离质体中表达mAb链的构建体。在pUC18中构建表达盒，然后转化至双元质粒pBINPLUS中。创建构建体pUC18RBc-Cell-Humira重链,pUC18RBc-Cell-Humira轻链,pBIN RBc-Cell-Humira重链,pBIN RBc-Cell-Humira轻链(SEQ ID NO:1和3)。
VI.35S-Cell盒—CaMV 35S启动子、Cell信号肽(SEQ ID NQ:23和24)以及NQS(胆脂碱合成酶)终止子(SEQ ID NO:28)
将编码Humira重链和轻链的基因克隆至35S-Cell盒中，其中它们在框内与Cell信号肽融合并处于35S启动子的下游。在pUC18中构建表达盒，然后将其转化至双元质粒pBINPLUS中。设计构建体pUC1835S-Cell-Humira重链,pUC18 35S-Cell-Humira轻链,pBIN35S-Cell-Humira重链,pBIN 35S-Cell-Humira轻链(SEQ ID NO:1和3)。
实施例2
将CBD-PrtA,β-木糖苷酶,α-岩藻糖苷酶克隆至双元pBINPLUS载体中用于土壤杆菌属介导的烟草转化
I.对于空泡的表达：35S-Vac盒—CaMV 35S启动子,空泡信号肽(SEQ ID NQ:17和20)以及NQS(胆脂碱合成酶)终止子(SEQ ID NO:28)
具有CBD-PrtA表达盒的pUC57(SEQ ID NO:9和10)。
编码CBD的结构域(SEQ ID NO:29)以及编码蛋白质A的结构域(SEQ ID NO:30)(处于35S启动子、空泡信号肽和Nos终止子之下)的基因融合物由Pstl,Sacl限制，并被克隆至pUC18质粒中(图5A-B)。pUC18的表达盒由EcoRI限制，并被克隆至pBINPLUS中(图5B-C)。由Muni和NotI限制的编码木糖苷酶(XlnD，得自黑曲霉(A.niger)SEQ ID NO:11,12)和岩藻糖苷酶(α-l,3/4-岩藻糖苷酶，得自链霉菌属的物种SEQ ID NOs:13,14)的基因被克隆至表达盒中，而非CBD-PrtA中(图6A-C)。制备pUC18 35S-木糖苷酶和pUC18 35S-岩藻糖苷酶的构建体。将表达盒通过Sdal和Sad限制克隆至pBINPLUS双元质粒中，从而创建pBINPLUS 35S-木糖苷酶和pBINPLUS 35S-岩藻糖苷酶质粒(每个质粒均通过Vac SP定向于空泡)。
II.对于离质体的表达：35S-Cell盒—CaMV 35S启动子,Cell信号肽(SEQ ID NO:23和24)以及NOS(胆脂碱合成酶)终止子(SEQ ID NO:28)
构建用于木糖苷酶和岩藻糖苷酶的离质体表达的2个构建体。使用Ncol,Muni限制性位点通过Cell信号肽替换空泡信号肽，从而构建pUC1835S-Cell-木糖苷酶,pUC18 35S-Cell-岩藻糖苷酶,pBINPLUS 35S-Cell-木糖苷酶,pBINPLUS-35S-Cell-岩藻糖苷酶。
III.转化至E.Coli中
采用热休克进行转化。将50μl DH5α感受态细胞用于转化，并将100μl DH5α感受态细胞用于连接。将50ng环状DNA加入E.coli细胞中，然后将其在冰上解冻20分钟。在42℃热休克1分钟，并返回至冰上5分钟。加入1ml LB，并在37℃下温育1小时。在LB平板上培养细菌细胞(加入适量的抗生素，例如氨苄青霉素或卡那霉素，这取决于构建体上的限制性基因)，并且100μl用于转化，而1000μl用于连接。将细胞过夜温育。
IV.土壤杆菌属的转化
使用感受态根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，菌株LB A4404)，在电极杯中在1mm间距下实施电穿孔。将电穿孔的条件设定为25μΡ,2.5kV,200Ω。将土壤杆菌属的细胞在冰上解冻。将1μl最少预制备的DNA短暂地与80μl细菌混合，并转移至预冷的电极杯中。在电穿孔后，加入1ml无菌LB培养基，并将其转移至试管中。将细菌在28℃下在滚棒(roller drum)上温育3至4小时。此后，将细菌平铺于选择性LB氨苄青霉素或卡那霉素的培养基上。
V.转基因烟草植物的生产
使烟草植物在无菌条件下生长大约4-5周。在25ml LB培养基中制备土壤杆菌属起始物，所述的培养基中加入50mg/ml卡那霉素。使细胞在28℃下在振荡培养箱中温育48h直至稳定期。然后，将起始物在室温下在5500rpm下离心10min。除去上层培养基，使小球再次悬浮于无菌液体MS培养基(4.4g/L Murashige&Skoog(MS)培养基，其包含得自Duchefa的维生素(编号#M0222.0050)，得自J.T.Baker的30g/L蔗糖(编号#4072-05),pH＝5.8)中，至最终浊度为O.D.600 0.5。将包含细菌的大约10ml MS放置于无菌petri培养皿上。使用无菌镊子和手术刀切割烟草植物的绿叶，并与土壤杆菌属在MS悬液中温育5min。然后，将叶子转移至包含固体MS培养基(液体培养基，其具有得自Duchefa的0.7％植物琼脂(编号#P1001.1000))的petri培养皿上，所述的培养基包含0.8ml/L IAA和2ml/L激动素。将平板在28℃下在黑暗中温育48小时。在2天后，将叶子转移至包含选择MS培养基(0.8ml/L IAA和2ml/L激动素+400mg/L羧苄青霉素和100mg/L卡那霉素)的petri培养皿中。将平板在光照房间中放置3周，并且每10天更换培养基。在该时期内，由叶子形成嫩芽。将嫩芽转移至相同光照条件的包含MS培养基(100mg/L卡那霉素和400mg/L羧苄青霉素)的petri培养皿中。将产生根的嫩芽转移至土壤中，使用尼龙覆盖2天。然后，将植物转移至罐中，并研磨，用于进一步的分析。
实施例3
烟草中CBD-PrtA的表达和活性
通过Western印迹以及抗CBD抗体来评估烟草中CBD-PrtA的表达。
SDS-PAGE Western印迹
使用“迷你蛋白质凝胶系统”(Hercules,CA,USA)进行SDS-PAGE分析。如上文所述进行Western印迹分析(Ausubel et al 1987)。将蛋白质样品加载至12.5％SDS PAGE系统上。在电泳后，使用“迷你转印细胞”(Hercules,CA,USA)使用具有10％乙醇的冷的缓冲剂和150V恒定电流在2小时内将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences,England)上。转以后，使用4％的脱脂乳在R.T下将所述的膜封闭0.5小时。在RT下将所述的膜过夜暴露于一级抗体，此后使用TBST洗涤3次。暴露于二级抗体(碱性磷酸酶(AP)缀合的)2个小时，然后再洗涤3次。最后，洗涤膜，并使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和硝基四氮唑蓝(NBT)底物(Sigma)显色。通过将33ml 50mg/ml BCIP原液和66μl 50mg/ml NBT原液加入10ml基底缓冲剂(100mM Tris,100mM氯化钠,和5mM MgC12,pH 9.5,使用HCl调节)中制备BCIP/NBT基底溶液。
具体而言，对于图7A，将100mg植物组织在SAB中均化(重量/体积比为1:1)，通过离心将小球与汤液(soup)分离，并将30μl汤液和小球加载至SDS PAGE上，然后我们进行使用抗CBD抗体的Western印迹分析过程。对于图7B，将表达CBD-PrtA的100mg烟草植物组织在100μl缓冲剂1中均化(100mM Tris-HCl pH 7.4,250mM NaCl,10mM EDTA,Complete蛋白酶抑制剂)，所述的缓冲剂具有5ng和10ng阿达木单抗。将植物小球与汤液分离并洗涤。将小球提取物施加至硝酸纤维素膜上，并通过抗人类IgG-HRP检测mAb。
因此，如所示，在植物组织的小球上检测蛋白质，并且其大小为大约55kDa，这相当于CBD-PrtA融合蛋白质的大小(图7A)。图7B示出在烟草中表达的并结合人类IgG的CBD-PrtA(图7B)。
实施例4
木糖苷酶和岩澡糖苷酶表达并且在烟草植物中是活性的
I.岩藻糖苷酶和木糖苷酶活性扫描
在黑色96孔板(Nunc)中检验岩藻糖苷酶和木糖苷酶的活性。对于各反应，取得0.5mm新鲜的烟叶组织，并立即在200μl 50mM醋酸钠缓冲剂pH＝5.0中温育。加入10μl0.15mM底物，并将样品在65℃下温育1小时。使用4-甲基伞形酮β-D-岩藻吡喃糖苷(Mu-Fuc)(Sigma Aldrich M5510)and 4-甲基伞形酮-b-D-木吡喃糖苷(MU-Xyl)(Sigma AldrichM7008)分别作为岩藻糖苷酶and木糖苷酶的底物。通过加入21μl NaOH(f.c.100mM)终止反应。在360nm激发波长、460nm发射波长下测量荧光值。
II.酶活性的定量
通过在液氮(具有醋酸盐缓冲剂(50mM醋酸盐,15mM焦亚硫酸钾,Complete(SigmaAldrich)蛋白酶抑制剂混合(1片/100ml))中研磨叶子提取由表达岩藻糖苷酶和木糖苷酶的转基因植物系得到的植物组织。将提取物在RT下温育1小时，在4℃下在11,300g下离心10min，将可溶性级份与小球分离，并通过0.2μm PVDF过滤器过滤。将可溶性级份在50mM醋酸钠缓冲剂pH＝5.0中稀释木糖苷酶浓度为0-5.5μl/孔、岩藻糖苷酶浓度为0-70μl/孔。检验酶水解10μl Mu-Fuc(岩藻糖苷酶)和10μl MU-Xyl(木糖苷酶)的能力，并使用4-甲基伞形酮校正曲线计算活性。4-甲基伞形酮校正曲线是由市售可得的4-甲基伞形酮制成的，其中所述的市售可得的4-甲基伞形酮稀释成最终浓度为0.01-10μg/ml。获得趋势线方程，并计算荧光单位(FU)/4-甲基伞形酮质量。
使用以下方程计算每1g植物组织的酶的计算：
结果
在重组烟草植物中测量木糖苷酶和岩藻糖苷酶的活性。检测具有大量重组木糖苷酶和岩藻糖苷酶表达的烟草植物的数量(图8)。
通过使用1.5ml表达β-木糖苷酶和α-岩藻糖苷酶的植物提取物处理4.8μg植物衍生的阿达木单抗(PDA)抗体来测定木糖和岩澡糖残余物减少的条件。反应在RT下在15mMPBS缓冲剂pH 7.5下实施2、3和4小时。形成不同的处理类型：单独的β-木糖苷酶和α-岩藻糖苷酶(数据未示出)，以及结合在一起的β-木糖苷酶和α-岩藻糖苷酶(图13)。使用3组不同的抗体分析各处理：抗木糖、抗岩澡糖和抗人类IgG。
观察到使用β-木糖苷酶或α-岩藻糖苷酶的单独处理比使用2种酶的结合处理更低效(未示出)。在结合处理中，在2个小时温育(图13,2h)后获得最佳的结果。几乎所有的木糖和岩澡糖残余物都被清除，同时PDA的降解最低(图13，使用抗人类IgG)。阳性对照-未处理的PDA(N)显示具有抗木糖和抗岩澡糖的清楚的条带。使用抗人类IgG检测显示所有处理中PDA存在的证据。
实施例5
阿达木单抗表达并且在烟草植物中是活性的
I.阿达木单抗活性检验
由Harlan Biotech Ltd.Israel进行阿达木单抗活性测试。简言之，在L929成纤维细胞系中通过TNF-α介导的细胞毒性的抗体中和来检验活性。使用密度为3.5x105细胞/ml的100μl L929细胞悬液充满2个96孔组织培养板，并在37℃、5％CO2下在湿化的培养箱中过夜温育。在12hr温育后，加入rhTNF-α和放射菌素D，得到1ng/ml rhTNF-α和1μg/ml放射菌素D的最终浓度，然后在37℃、5％CO2下在湿化的培养箱中再温育2小时。接着，将第一平板(试验平板)与植物衍生的浓度为0-2000ng/ml的阿达木单抗(PDA)温育，并将第二平板(对照平板)与市售的最终浓度为0-2000ng/ml的Humira温育。将MTT溶液加入各孔中，最终浓度为0.5mg/ml。在37℃下标记4小时。在温育后，除去MTT溶液，并将100μl异丙醇加入各孔中，不低于30分钟。在微板分光光度计( FC；Thermo Scientific)中，在570-650nm波长过滤器下测量吸光率信号。
阿达木单抗ELISA
如下进行植物样品的制备：通过使用1.5ml Eppendorf盖夹在植物叶子上而将6个叶盘直接取样于包含研磨缓冲剂(100mM Tris-HCl pH 8,25mM NaCl,1mM PMSF,10mMEDTA,1mM PMBS)的预称重Eppendorf管中。小心地由底部、中部和上部植物部分取样叶子。然后将样品称重，并使用塑性灰浆在500RPM下研磨30秒。通过在4℃下在11000RPM下离心15min提取可溶性级份。将样品稀释500倍，然后施加于Elisa平板上。由市售的Humira制成校正曲线。将阿达木单抗进行系列稀释，从而得到最终浓度0-100ng/ml。
ELISA：使用100μl 100ng/ml rhTNF-α溶液涂敷未处理的96孔板，此后充分洗涤。一次两份加载用于校正曲线的样品和检验样品，并在37℃下温育1h。使用TBST洗涤溶液将平板洗涤4次，然后加载1:50,000缀合的山羊抗人IgG HRP，并在37℃下温育1h。在使用TBST洗涤4次后，加入100μl TMB底物溶液。在20分钟后，使用100μl H2SO4 0.5N终止反应。在微板读取器上在450nm波长下测量吸光率信号。
结果
在Protein A柱上，由40g均化的烟叶纯化表达阿达木单抗的离质体。泳道2-5：通过SDS PAGE分析30μl洗脱级份，在图9的泳道3和4中可见相当于抗体重链(55kDa)和轻链(25kDa)的2个条带(RUBISCO启动子和终止子，以及Cell信号肽(RbCell))。
图10：植物衍生的阿达木单抗显示类似于市售的治疗剂的体外活性。将TNF-α预涂敷的ELISA平板与市售的治疗剂(灰色)和植物衍生的阿达木单抗(红色)温育，通过使用抗人IgG-HRP检测mAb与靶物的结合。
在分开的试验中，检测离质体表达的阿达木单抗用于产率定量。由具有PDA稳定表达的3种不同的转基因烟草植物系纯化植物衍生的阿达木单抗(PDA)，并通过SDS-PAGEWestern印迹和ELISA分析。Western印迹(图14)显示大约55和25kDa的条带，分别相当于阿达木单抗重链和轻链。ELISA定量(图15)显示植物1、2和3分别产生4.88,2.21和3.56mgPDA/kg叶子。WB和ELISA结果是一致的，并且SDS-PAGE条带在长度上相当于ELISA定量。
在L929细胞系中，与市售可得的阿达木单抗(Humira)生物活性相比，检测rhTNF-α中和的PDA生物活性。PDA显示与市售的Humira几乎相同的结果(图16)。在PDA中观察到下降的趋势。
实施例6
通过具有跨膜结构域(TMD)或纤维素结合结构域(CBD)的蛋白质A融合物进行植物衍生的mAb的原位纯化
蛋白质A–TMD
本发明人还使用了具有膜锚定结构域的蛋白质A融合物，以便使mAb附着在植物细胞的质膜上作为纯化过程的第一步。mAb与蛋白质A结合，所述的蛋白质A通过TMD锚定于质膜。因此，在收获植物并将小球与汤液分离后，在小球部分发现了mAb。-DON'T YOU HAVE TORUPTURE THE CELLS？WHAT SP WILL THE AB HAVE？不，所述的过程与CBD-蛋白质A相同，但是我们使用TMD替代CBD，通过pH改变使得mAb分离。SP为用于靶向离质体的细胞。
构建体示于图12A中。
构建体的示意图示于图12A-C中。跨膜结构域通过连接体附着在蛋白质A(SEQ IDNo:30-36)上。针对植物细胞中蛋白质的表达而优化的所得序列列于SEQ ID NO:35-36中。
首先使用Muni和Sacl限制性位点，将PrtA-TMD构建体引入pUC18的35S表达盒中。然后，将完整的盒转移至pBINPLUS双元质粒中。
蛋白质A-CBD
为了获得双重转基因植物(表达阿达木单抗和CBD-蛋白质A)，使用CBD-蛋白质A构建体瞬时转染表达稳定的阿达木单抗的转基因(表达的离质体)。瞬时表达如Li等人,2008Plant Physiol.147(4):1675-1689所述实施。简言之，将土壤杆菌属的一个单一的集落接种于具有100μg/ml卡那霉素的5ml LB中，并在27℃过夜生长。1ml过夜培养物用于接种25ml LB(具有100μg/ml可那霉素和20μΜ乙酰丁香酮)。使接种物在28℃下过夜生长，至最终A600＝0.4。使用5ml注射器进行渗透。
用于体外结合测试的植物组织制备：将植物组织在具有50mg纤维素的结合缓冲剂(20mM磷酸钠pH 7.5)或研磨缓冲剂(100mM Tris-HC1pH7.5,25mM NaCl,1mM PMSF,10mMEDTA,1mM PMBS)w/v中研磨。将提取物在4℃下温育1h用于更好的结合。通过在10000RPM下离心30min进行小球与可溶性级份的分离。弃去可溶性级份并保持用于进一步分析。使用1体积的结合缓冲剂洗涤小球，然后在10000RPM下离心15min。小球和可溶性级份再次悬浮于样品应用缓冲剂中，在100℃下加热10min并通过Western印迹分析(如上文所述)。
结果
PrtA-TMD
融合PrtA-TMD蛋白质在表达mAb的烟叶中瞬时表达。在第6天，将植物组织均化，将汤液(通过s表示)与小球(p)分离，并通过Western印迹使用抗人IgG Ab和抗蛋白质A Ab对二者进行分析。如图左侧可见(图12D)，在样品的小球部分中发现大部分的mAb，其中发现蛋白质A融合物(图的右侧)。
PrtA-CBD
在其中使用Prt-CBD的分开的试验中，由植物叶子提取并纯化mAb，并通过Western印迹分别使用抗蛋白质A和抗人IgG分析。作为阳性对照，在相同的条件下利用5μg市售Humira与表达CBD-蛋白质A的植物提取物的尖峰。显示当使用结合缓冲剂进行提取时，可溶性级份几乎是澄清的，而当使用研磨缓冲液时，在丸剂mAb(图17B)和CBD蛋白A(图17B)中都检测到商业Humira对照(Com)和植物衍生的阿达木单抗(PDA)样品(图17C)中对应于重链和轻链的条带(Com)和PDA样品中也检测到(图17A)，表明mAb与蛋白质A结合，CBD与纤维素结合，并且结合缓冲剂是最有效的一种缓冲剂。
实施例7
木糖和岩澡糖糖基化受到RNAi(GMD)的抑制以及RNA的抑制(XylT)
根据Matsuo等人,2014进行木糖和岩澡糖糖基化的抑制。简言之，选择SGDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)RNAi沉默技术通过抑制GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶基因删除植物N-多糖中的植物特异性糖残基。RNAi GMD通过干扰α-l,4-岩澡糖转移酶和α-l,3-岩澡糖转移酶途径而破坏α-l,4-岩澡糖和α-l,3-岩澡糖残基。
I.将GMD RNAi克隆至pBINPLUS双元载体中用于土壤杆菌属介导的烟草转化
在3个步骤中插入编码GMD RNAi片段的基因，从而克隆至pUC18质粒(包含并处于35S启动子控制之下)中(图18A)。步骤1：通过Notl和BamHI的限制插入GMD反义编码DNA(图18B)，从而形成销(pin)结构。步骤2：通过BamHI和Mfel的限制插入得自拟南芥的编码β-木糖转移酶(XylT)内含子的DNA(图18C)，从而形成环结构。步骤3：通过Mfel和Ncol的限制插入GMD正义编码DNA(图18D)，从而完成双链RNA的销结构。然后，通过Hindlll和Sacl的限制性酶将表达盒克隆至pBINPLUS双元质粒中，从而生成pBINPLUS GMD RNAi质粒(图19A-B)。
然后，将质粒转化至土壤杆菌属菌株LB4404或EHA105、以及烟草植物中。
II.将XylT RNA抑制构建体克隆至pBINPLUS双元载体中用于土壤杆菌属介导的烟草转化
编码木糖基转移酶RNA抑制片段的DNA得自用于推定的P-(l,2)-木糖基转移酶,外显子3(序列ID:emblAJ627183.1)的烤烟(Nicotiana tabacum)XylT基因。
对于RNA的抑制，通过PCR扩增得自XylT基因外显子3的617bp DNA片段，并将Ncol和Notl限制性位点分别加入5'和3'末端。将该片段克隆至pUC18质粒中，处于RUBISCO启动子之下(图20A)。通过Ncol和Notl限制而除去阿达木单抗重链(1362bp)，并使用XylT片段替代(图20B)。然后，使用Hindlll限制性酶将表达盒克隆至pBINPLUS双元质粒中，从而生成pBINPLUS XylT质粒(图20C-D)。接着，将质粒转化至土壤杆菌属菌株LB4404或EHA105中，然后转化至烟草植物中。
RNA沉默和用于在烟草中GMD和XylT沉默表达的RNAi序列(SEQ ID NO:37-40)。
尽管结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但是明显的是许多备选方案、修改和改变对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。因此，应该涵盖落入所附权利要求书的精神和范围内的所有这些备选方案、修改和改变。
本说明书中提及所有公开、专利和专利申请均以参照的方式全文引入本说明书中，如同每一份单独的公开、专利或专利申请均特意地且单独地表明以引用方式并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或认同均不应该解释为承认该参考文献作为本发明的现有技术进行利用。就使用的个部分标题而言，它们不应该解释为必要的限定。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿达木单抗重链核苷酸序列
<400> 1
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<211> 451
<212> PRT
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<220>
<223> 阿达木单抗重链蛋白序列
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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420 425 430
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<220>
<223> 阿达木单抗轻链核苷酸序列
<400> 3
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cctagggaag ctaaagttca gtggaaggtg gataatgcat tacaatccgg aaactctcag 480
gaatcagtta ctgagcagga tagtaaagat tccacatact ctcttagttc cactcttaca 540
ttgtctaagg ctgattatga gaagcataaa gtgtacgcat gtgaggtgac acatcaggga 600
ttatcaagtc cagtgacaaa gagtttcaat agaggagaat gctga 645
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿达木单抗轻链蛋白序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Avastin重链核苷酸序列
<400> 5
gaagttcagt tagtggaaag tggtggagga ttagttcagc caggtggtag tttgaggtta 60
agttgtgcag catcaggtta tacatttact aattatggta tgaattgggt gagacaagct 120
ccaggaaagg gtttggaatg ggttggatgg ataaatactt atacaggaga gcctacttat 180
gctgctgatt ttaagagaag gtttacattc tcacttgata cttcaaaaag tacagcttat 240
cttcagatga actctttgag ggctgaagat actgctgttt actactgtgc aaagtaccca 300
cattactacg gttcttcaca ctggtacttt gatgtttggg gacagggtac tcttgtgaca 360
gttagttccg cttccacaaa gggaccttct gttttcccac ttgcaccttc ttcaaaatcc 420
acttctggag gtacagctgc attaggttgc ctcgttaagg attattttcc agagcctgtg 480
actgtttcct ggaactctgg tgctcttact tcaggtgtgc atacattccc agcagttttg 540
caaagttccg gactttattc tttgtcttca gttgtgactg tgcctagttc ctctcttggt 600
actcagacat acatctgtaa tgttaaccat aagccatcta acacaaaagt ggataagaaa 660
gttgaaccta agtcatgcga taaaactcac acatgtccac cttgcccagc tcctgagctt 720
ttgggaggtc catcagtttt tcttttccca cctaagccta aagatacact catgattagt 780
agaactccag aagtgacatg tgttgtggtt gatgtttctc atgaagatcc tgaggtgaag 840
tttaattggt atgttgatgg agtggaggtt cacaacgcta agactaaacc aagagaagag 900
caatataatt caacttacag ggtggttagt gtgttaacag ttctccacca ggattggctc 960
aatggtaaag aatacaagtg taaagtttca aacaaggctt tgccagcacc tattgaaaag 1020
actatctcta aggctaaagg tcaaccaaga gagcctcagg tttatacact tccaccttcc 1080
agggaagaga tgactaagaa tcaagtgagt cttacatgct tggttaaagg attttaccca 1140
tcagatattg cagttgaatg ggagagtaac ggtcagcctg agaataacta taagactaca 1200
ccacctgtgt tggattcaga tggatctttc tttctttact ccaagctcac tgttgataaa 1260
tctaggtggc aacagggtaa tgtgttctca tgcagtgtta tgcacgaggc actccataat 1320
cactacactc agaaatctct ctctctctcc ccaggtaaat aa 1362
<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avastin重链蛋白序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 7
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Avastin轻链核苷酸序列
<400> 7
gatattcaga tgacacagtc ccctagttcc ctcagtgctt ccgttggaga tagagttact 60
attacttgtt ccgcttccca ggatatttca aattatctta attggtacca acagaagcct 120
ggtaaagctc ctaaggttct catctatttc acttcttcac tccattccgg agtgccatct 180
agattttctg gatccggttc tggaactgat ttcactctta caataagttc cttgcaacca 240
gaagattttg caacatatta ctgtcaacag tactctactg ttccttggac attcggtcag 300
ggaactaaag tggaaattaa gagaacagtt gctgcaccat ccgtgtttat attcccacct 360
agtgatgagc aacttaaatc aggtacagct agtgttgtgt gccttttgaa taacttctat 420
cctagggaag ctaaagttca gtggaaggtg gataatgcac ttcaatcagg aaacagtcag 480
gaatccgtta ctgagcagga ttctaaggat tcaacataca gtttgtcttc aactttaaca 540
ctctcaaagg ctgattatga gaagcacaaa gtttacgcat gtgaggttac acatcagggt 600
ttatcatcac cagttactaa gtccttcaac aggggagagt gctag 645
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avastin轻链蛋白序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CBD-PrtA核苷酸序列
<400> 9
aatcttaagg tggaatttta caactccaac ccatctgata ctacaaattc cataaaccct 60
caattcaagg ttactaatac aggatcttca gctatcgatc tttcaaaact cactcttaga 120
tactactaca cagtggatgg tcaaaaggat cagacttttt ggtgtgatca tgctgcaatt 180
ataggatcaa atggtagtta caacggaata acttcaaacg ttaagggtac attcgtgaaa 240
atgagttcct ctactaataa cgctgataca tatctcgaaa tttcttttac tggaggtaca 300
cttgagccag gtgctcatgt tcaaatacag ggaaggttcg caaaaaatga ttggtcaaac 360
tacactcaat ccaacgatta ctcttttaag tcagctagtc aattcgttga atgggatcag 420
gtgacagcat atttgaatgg tgttttagtg tggggtaaag agcctggagg ttcagttgtg 480
ccaagtactc aacctgttac tacaccacct gctactacaa agccacctgc aactacaatc 540
ccacctacta tggaacaaag aataacattg aaggaggctt gggatcaaag gaatggtttt 600
attcagtctt taaaggatga tccatcccaa tctgctaatg tgctcggtga agcacaaaaa 660
cttaacgata gtcaggctcc taaagctgat gcacaacaaa ataactttaa taaggatcaa 720
cagtctgctt tctacgaaat cctcaatatg ccaaatctta acgaggcaca aagaaatggt 780
tttattcagt cattgaagga tgatccttca caaagtacaa acgttttggg tgaagctaag 840
aaattaaacg agagtcaggc tccaaaggca gataataact tcaataagga acaacagaac 900
gcattctacg agatcttgaa catgccaaat cttaacgaag agcagcgtaa tggttttatt 960
cagtcattga aagatgatcc ttcccaatct gctaatcttt tgtccgaagc aaagaaactt 1020
aacgagtctc aggctcctaa ggcagataat aagtttaaca aagaacaaca gaatgctttc 1080
tacgagcatc tccctaatct taacgaagaa caaaggaacg gtttcattca gtctttgaaa 1140
gatgatccat ctcaaagtgc aaatcttctc gctgaggcaa agaaacttaa cgatgctcag 1200
gcaccaaagg ctgacaataa gtttaacaaa gagcagcaaa acgcattcta cgagatattg 1260
cacttaccta acctcactga agagcagagg aatggtttta tccagagtct caaagatgat 1320
ccaggtaata gttaa 1335
<210> 10
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CBD-PrtA蛋白序列
<400> 10
Met Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala
1 5 10 15
Thr Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn
20 25 30
Pro Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu
35 40 45
Gln Leu Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr
50 55 60
Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser
65 70 75 80
Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp
85 90 95
Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile Gly
100 105 110
Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe
115 120 125
Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile
130 135 140
Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile Gln
145 150 155 160
Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp
165 170 175
Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val Thr
180 185 190
Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser
195 200 205
Val Val Pro Ser Thr Gln Pro Val Thr Thr Pro Pro Ala Thr Thr Lys
210 215 220
Pro Pro Ala Thr Thr Ile Pro Pro Thr Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu
225 230 235 240
Lys Glu Ala Trp Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
245 250 255
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn
260 265 270
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys
275 280 285
Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
290 295 300
Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
305 310 315 320
Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln
325 330 335
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe
340 345 350
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
355 360 365
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu
370 375 380
Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn
385 390 395 400
Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu His Leu Pro Asn
405 410 415
Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp
420 425 430
Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp
435 440 445
Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn
450 455 460
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg
465 470 475 480
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser
485 490
<210> 11
<211> 2337
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<400> 11
caagcaaaca catcctacgt tgattacaac atcgaggcaa accctgatct ttatccactc 60
tgcattgaga ctattccact ttcctttcct gattgtcaaa atggtccatt gagatcacat 120
cttatttgtg atgaaacagc tactccttat gatagggctg caagtctcat atcccttttt 180
acattggatg agttaatcgc taacacagga aacactggtc ttggagtgtc tagacttggt 240
ttgccagctt accaagtttg gtcagaagca ctccacggac ttgatagggc taatttttct 300
gattcaggtg cttataactg ggcaacttct ttcccacagc ctattttgac tacagctgca 360
ctcaacagaa cacttatcca tcaaatcgct tctattatat caactcaggg aagagctttt 420
aataacgcag gaagatacgg attggatgtg tatgctccta atattaacac attcagacac 480
ccagtttggg gtaggggaca agaaactcct ggagaggatg tgtcacttgc tgctgtttat 540
gcttacgaat atatcacagg tattcaggga ccagatcctg agtctaatct taagctcgct 600
gcaactgcta agcattacgc aggatacgat atagaaaatt ggcataacca cagtagattg 660
ggtaatgata tgaacataac acaacaggat ctttccgagt attacactcc tcaattccac 720
gttgctgcaa gggatgctaa ggtgcagagt gttatgtgtg cttacaatgc agtgaacgga 780
gttccagctt gcgcagattc ttattttctt caaacacttt tgagagatac ttttggtttc 840
gtggatcatg gatacgtttc ttcagattgt gatgctgcat acaatatcta taaccctcac 900
ggttatgcta gttcccaagc tgctgctgct gctgaagcta tccttgcagg aactgatatt 960
gattgcggta ctacatatca gtggcatctc aatgagtcta ttgcagctgg agatctttca 1020
agagatgata ttgagcaagg tgtgataagg ttgtacacta cattagttca ggcaggttac 1080
ttcgattcaa acactacaaa ggctaataac ccatacaggg atttgagttg gtccgatgtt 1140
ctcgaaacag atgcttggaa catctcttat caagcagcta ctcagggaat agtgttactc 1200
aagaactcaa ataacgttct tcctttgact gagaaagcat atccacctag taatactaca 1260
gttgctttga ttggtccatg ggctaacgca actacacaac ttttgggtaa ttattacgga 1320
aacgctcctt acatgatctc tccaagagca gcttttgaag aggcaggata taaggttaat 1380
ttcgctgaag gtacaggaat atcttcaaca tctacttcag gttttgcagc tgcacttagt 1440
gctgcacagt ccgctgatgt tattatatat gcaggaggta tagataacac tctcgaagct 1500
gaggcacttg atagggagtc tatcgcatgg cctggaaacc aattagatct cattcagaaa 1560
cttgcttctg ctgctggaaa gaagccattg attgtgttac aaatgggagg tggacaggtt 1620
gatagttcct ctttgaagaa taacacaaac gttagtgctt tactctgggg tggatatcct 1680
ggacaatccg gtggatttgc acttagagat atcatcactg gaaagaaaaa tccagctggt 1740
aggcttgtta ctacacagta ccctgcttct tatgctgaag agttcccagc tactgatatg 1800
aatcttagac ctgaaggaga taacccagga caaacataca agtggtatac tggtgaagca 1860
gtttacgagt ttggtcatgg attgttttat actacattcg ctgaatcaag ttccaatact 1920
acaactaagg aggtgaaact caacatacaa gatatcctta gtcagacaca cgaagatttg 1980
gcatccataa ctcaactccc agttcttaac ttcacagcta acatcaggaa cactggaaaa 2040
cttgagtctg attacacagc tatggtgttc gcaaacactt cagatgctgg tccagcacct 2100
tatccaaaga aatggttggt tggttgggat agattaggag aggttaaagt gggtgaaaca 2160
agagagctta gggttcctgt ggaagttgga tcttttgcaa gggtgaatga ggatggagat 2220
tgggttgtgt ttccaggtac tttcgaactt gctttgaact tagagagaaa agttagggtg 2280
aaggttgtgc ttgaaggtga agaggaagtg gtgttgaaat ggcctggaaa agagtga 2337
<210> 12
<211> 778
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 12
Gln Ala Asn Thr Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Asn Pro Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Pro Leu Cys Ile Glu Thr Ile Pro Leu Ser Phe Pro Asp Cys
20 25 30
Gln Asn Gly Pro Leu Arg Ser His Leu Ile Cys Asp Glu Thr Ala Thr
35 40 45
Pro Tyr Asp Arg Ala Ala Ser Leu Ile Ser Leu Phe Thr Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Ile Ala Asn Thr Gly Asn Thr Gly Leu Gly Val Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Leu Pro Ala Tyr Gln Val Trp Ser Glu Ala Leu His Gly Leu Asp Arg
85 90 95
Ala Asn Phe Ser Asp Ser Gly Ala Tyr Asn Trp Ala Thr Ser Phe Pro
100 105 110
Gln Pro Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ile His Gln
115 120 125
Ile Ala Ser Ile Ile Ser Thr Gln Gly Arg Ala Phe Asn Asn Ala Gly
130 135 140
Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His
145 150 155 160
Pro Val Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Val Ser Leu
165 170 175
Ala Ala Val Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Ile Gln Gly Pro Asp
180 185 190
Pro Glu Ser Asn Leu Lys Leu Ala Ala Thr Ala Lys His Tyr Ala Gly
195 200 205
Tyr Asp Ile Glu Asn Trp His Asn His Ser Arg Leu Gly Asn Asp Met
210 215 220
Asn Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr Thr Pro Gln Phe His
225 230 235 240
Val Ala Ala Arg Asp Ala Lys Val Gln Ser Val Met Cys Ala Tyr Asn
245 250 255
Ala Val Asn Gly Val Pro Ala Cys Ala Asp Ser Tyr Phe Leu Gln Thr
260 265 270
Leu Leu Arg Asp Thr Phe Gly Phe Val Asp His Gly Tyr Val Ser Ser
275 280 285
Asp Cys Asp Ala Ala Tyr Asn Ile Tyr Asn Pro His Gly Tyr Ala Ser
290 295 300
Ser Gln Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ile Leu Ala Gly Thr Asp Ile
305 310 315 320
Asp Cys Gly Thr Thr Tyr Gln Trp His Leu Asn Glu Ser Ile Ala Ala
325 330 335
Gly Asp Leu Ser Arg Asp Asp Ile Glu Gln Gly Val Ile Arg Leu Tyr
340 345 350
Thr Thr Leu Val Gln Ala Gly Tyr Phe Asp Ser Asn Thr Thr Lys Ala
355 360 365
Asn Asn Pro Tyr Arg Asp Leu Ser Trp Ser Asp Val Leu Glu Thr Asp
370 375 380
Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Gln Ala Ala Thr Gln Gly Ile Val Leu Leu
385 390 395 400
Lys Asn Ser Asn Asn Val Leu Pro Leu Thr Glu Lys Ala Tyr Pro Pro
405 410 415
Ser Asn Thr Thr Val Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr
420 425 430
Gln Leu Leu Gly Asn Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Tyr Met Ile Ser Pro
435 440 445
Arg Ala Ala Phe Glu Glu Ala Gly Tyr Lys Val Asn Phe Ala Glu Gly
450 455 460
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465 470 475 480
Ala Ala Gln Ser Ala Asp Val Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn
485 490 495
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
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755 760 765
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770 775
<210> 13
<211> 1557
<212> DNA
<213> Streptomyces sp.
<400> 13
ggtacacctt gtgctgctcc tgtgaaacct gcatcccaaa tggctgttga atcttgcgat 60
agtcctgaga gaatcataga aaaagctgct aatattgtgc caacttctgg acaacttgct 120
tggcaacaga gagaggttac tgcttttact catttcggta tgaatacttt tacaggaagg 180
gaatggggaa gtggtacaga agatgagaaa cttttcgctc caaagtccat agatgttgat 240
cagtggatga gagcttataa ggctgctgga gcagagcagg ttatgctcac tgctaagcat 300
cacgatggtt ttgtgcttta tcctagtaga tacacagatc actccgttga actttctcca 360
ggatcacctg atgttgtggg tgcttatgtt aaggctgcaa ggaaagcagg attgaaagtg 420
ggtctctacc tttctccttc agatggagct gaattaccac atgcatggca cgctcaatgg 480
gttgaatcta tcagaaagaa acaggctgag ggaaaaccat tgtcattacc tgaacaaatg 540
gcattggagg atggagatag agcaccagct ggagaaggaa ggtttggaaa tggttcagct 600
gtgactgaga ggacaattcc aactcttgtt cctggagatg atagagctgc tgctgttaag 660
aggcataaac ttcctacttt tacagttatg gctgatgatt atgatgcata ctacctcaac 720
caactttacg agatattcac tcagtacgga ccaatcgaag aactttggct tgatggtgct 780
aatccttgga gtggatccgg tattactcaa aaatacaacg tgaagcagtg gtttgatatg 840
gttaaggctc ttagtcctaa tacagttgtg ttccaaggac cacagggtgt gagatgggtt 900
ggaaacgaag gaggtacagc tagggaaact gagtggtcag ttacacctca tgcaactgat 960
ccatggacag gattgggttc tttaccaaat gattcaactg atgctgatat cggtagtaga 1020
gcaaggattt tggatcctac tacaaagtat cttcaatggt acccagcaga agctgatgtt 1080
tccattagac ctggatggtt ttatcaccca gagcaacagc ctaaaactgc tccacagctc 1140
atgaaccttt acgaaaagtc tgttggtagg aatgcagctc ttttgttaaa cgtgccacct 1200
ggaagagatg gtaggatagc agatgctgat gttgcatctc ttacagcttt cggaaaagca 1260
gtgagatcta cttatggaac tgatgttaga aggactcaag ctccaggtcc ttacacattt 1320
gatagagttg cagtgaggga ggatatcaga catggacaaa gggtggaaaa gttcgcagtt 1380
gaggctagaa ttgatggttc atggcagagg atagctgaag gaactactat tggaaacaga 1440
aggatattga gtttagcatc ccctgttact gcaacagctg ttagagtgaa ggttcttgaa 1500
tcaagggcaa ctccacattt gggtgctact acactccatt tgtcatctac aggataa 1557
<210> 14
<211> 518
<212> PRT
<213> Streptomyces sp.
<400> 14
Gly Thr Pro Cys Ala Ala Pro Val Lys Pro Ala Ser Gln Met Ala Val
1 5 10 15
Glu Ser Cys Asp Ser Pro Glu Arg Ile Ile Glu Lys Ala Ala Asn Ile
20 25 30
Val Pro Thr Ser Gly Gln Leu Ala Trp Gln Gln Arg Glu Val Thr Ala
35 40 45
Phe Thr His Phe Gly Met Asn Thr Phe Thr Gly Arg Glu Trp Gly Ser
50 55 60
Gly Thr Glu Asp Glu Lys Leu Phe Ala Pro Lys Ser Ile Asp Val Asp
65 70 75 80
Gln Trp Met Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Gly Ala Glu Gln Val Met Leu
85 90 95
Thr Ala Lys His His Asp Gly Phe Val Leu Tyr Pro Ser Arg Tyr Thr
100 105 110
Asp His Ser Val Glu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Asp Val Val Gly Ala
115 120 125
Tyr Val Lys Ala Ala Arg Lys Ala Gly Leu Lys Val Gly Leu Tyr Leu
130 135 140
Ser Pro Ser Asp Gly Ala Glu Leu Pro His Ala Trp His Ala Gln Trp
145 150 155 160
Val Glu Ser Ile Arg Lys Lys Gln Ala Glu Gly Lys Pro Leu Ser Leu
165 170 175
Pro Glu Gln Met Ala Leu Glu Asp Gly Asp Arg Ala Pro Ala Gly Glu
180 185 190
Gly Arg Phe Gly Asn Gly Ser Ala Val Thr Glu Arg Thr Ile Pro Thr
195 200 205
Leu Val Pro Gly Asp Asp Arg Ala Ala Ala Val Lys Arg His Lys Leu
210 215 220
Pro Thr Phe Thr Val Met Ala Asp Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr Leu Asn
225 230 235 240
Gln Leu Tyr Glu Ile Phe Thr Gln Tyr Gly Pro Ile Glu Glu Leu Trp
245 250 255
Leu Asp Gly Ala Asn Pro Trp Ser Gly Ser Gly Ile Thr Gln Lys Tyr
260 265 270
Asn Val Lys Gln Trp Phe Asp Met Val Lys Ala Leu Ser Pro Asn Thr
275 280 285
Val Val Phe Gln Gly Pro Gln Gly Val Arg Trp Val Gly Asn Glu Gly
290 295 300
Gly Thr Ala Arg Glu Thr Glu Trp Ser Val Thr Pro His Ala Thr Asp
305 310 315 320
Pro Trp Thr Gly Leu Gly Ser Leu Pro Asn Asp Ser Thr Asp Ala Asp
325 330 335
Ile Gly Ser Arg Ala Arg Ile Leu Asp Pro Thr Thr Lys Tyr Leu Gln
340 345 350
Trp Tyr Pro Ala Glu Ala Asp Val Ser Ile Arg Pro Gly Trp Phe Tyr
355 360 365
His Pro Glu Gln Gln Pro Lys Thr Ala Pro Gln Leu Met Asn Leu Tyr
370 375 380
Glu Lys Ser Val Gly Arg Asn Ala Ala Leu Leu Leu Asn Val Pro Pro
385 390 395 400
Gly Arg Asp Gly Arg Ile Ala Asp Ala Asp Val Ala Ser Leu Thr Ala
405 410 415
Phe Gly Lys Ala Val Arg Ser Thr Tyr Gly Thr Asp Val Arg Arg Thr
420 425 430
Gln Ala Pro Gly Pro Tyr Thr Phe Asp Arg Val Ala Val Arg Glu Asp
435 440 445
Ile Arg His Gly Gln Arg Val Glu Lys Phe Ala Val Glu Ala Arg Ile
450 455 460
Asp Gly Ser Trp Gln Arg Ile Ala Glu Gly Thr Thr Ile Gly Asn Arg
465 470 475 480
Arg Ile Leu Ser Leu Ala Ser Pro Val Thr Ala Thr Ala Val Arg Val
485 490 495
Lys Val Leu Glu Ser Arg Ala Thr Pro His Leu Gly Ala Thr Thr Leu
500 505 510
His Leu Ser Ser Thr Gly
515
<210> 15
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码阿达木单抗重链的核苷酸序列
<400> 15
gcgcagcttg aagtgcaatt ggttgaatca ggaggaggac tcgtgcaacc gggaaggagt 60
ttacgattat cttgtgctgc ctctggattc acctttgacg actatgcaat gcattgggtc 120
cgtcaagcac caggaaaagg tttagagtgg gtttcagcaa tcacttggaa ctccggacat 180
attgactatg ccgatagtgt tgagggtcga ttcacaatct cacgagataa cgcgaagaat 240
agtctatacc tacagatgaa tagcctaaga gctgaggata ctgccgttta ttactgtgca 300
aaggtttcct atctttctac tgcatctagt cttgattact ggggacaagg aacacttgtc 360
acagtttcct ctgctagcac aaaaggacct agcgttttcc ctctggcacc atcaagtaag 420
agcaccagtg gcgggacagc agcactgggt tgtcttgtga aagactattt cccagaaccc 480
gttaccgtta gttggaactc aggcgcactt acttcgggag ttcatacttt tcctgctgtc 540
ttacaatctt ccggtctcta ttcactaagc tcagttgtca ctgtaccttc ctcaagcctt 600
gggacacaaa cctacatttg taacgtcaat cataaaccga gcaatacgaa ggtagataag 660
aaagtcgagc caaagagttg tgataaaaca cacacttgcc caccttgccc agctcctgaa 720
ctcttaggtg gaccaagcgt tttcctcttt cctccaaagc cgaaagatac acttatgata 780
tcacgcacac ccgaagttac ttgtgtggtt gtagacgttt ctcatgaaga tcccgaagtg 840
aagtttaatt ggtacgtcga tggtgttgaa gttcacaatg ctaagactaa gccaagagaa 900
gagcaataca actcaaccta tagagttgtt tccgtcttaa ccgtactgca tcaagattgg 960
ttgaacggca aggagtataa atgcaaggtt agcaataaag cactacctgc accgattgag 1020
aagacaatta gcaaagcaaa aggacaacca agggaaccac aagtctatac acttccacct 1080
tcaagggatg agctgactaa gaatcaagta tccttgacct gtttagtcaa ggggttttac 1140
ccttctgaca ttgccgtaga atgggaatct aatgggcagc ctgagaataa ctataagaca 1200
actccacccg tactcgattc tgacggctct tttttcctat actccaagct aaccgtggat 1260
aaatcacgtt ggcaacaagg aaacgttttc tcttgttctg tgatgcacga ggctttgcat 1320
aatcactaca cacaaaagag cttaagtctt agccctggga aatag 1365
<210> 16
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码阿达木单抗轻链的核苷酸序列
<400> 16
gacatacaaa tgactcaatc tccaagttca ctatctgctt cagtcggcga tagggtcact 60
ataacttgta gagcctctca gggcataaga aactatttgg catggtacca acagaaacct 120
ggaaaagctc ctaagctgct aatatatgct gcttctacac ttcagagtgg agtaccttca 180
agattcagtg gatctggttc tgggactgat ttcactttga ctatctcatc cctccaacca 240
gaagacgttg ctacatacta ttgccagcgc tataataggg ctccttatac ctttggacaa 300
ggcacaaaag tcgagattaa gagaactgtt gctgcaccat cagtgtttat tttccctcca 360
agtgacgaac agcttaaatc tggaactgca agcgttgtat gccttctcaa caatttctac 420
cctagagaag cgaaagtcca atggaaagta gataacgcac ttcagtctgg gaactcacaa 480
gagagtgtca ctgaacaaga ttcgaaagac tctacctatt cactctcatc gactcttact 540
ctgtcaaaag ctgattacga gaagcacaaa gtgtatgctt gcgaagttac acaccaagga 600
cttagctcac cagtaaccaa gagcttcaat aggggagaat gctga 645
<210> 17
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码液泡SP信号肽的核苷酸序列
<400> 17
atggctcacg ctagagtttt attactcgct ctcgcagttc tcgctacagc agcagtggct 60
gtggcttcaa gttcttcatt cgctgattca aatccaatta gacctgttac tgatagggct 120
gcaagtacat tggctcaact t 141
<210> 18
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码液泡SP1信号肽的核苷酸序列
<400> 18
atggcccatg cacgagtctt gcttctcgct ttagctgtgc tagcaactgc agccgttgct 60
gtggcctcct cttcttcatt tgcggattca aatccaattc gtcccgtcac tgatagagct 120
gcttctacac ta 132
<210> 19
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码液泡SP2信号肽的核苷酸序列
<400> 19
atggcacacg ctcgagttct gttactagct ctagcagtgc tagctactgc tgccgttgca 60
gtcgcctcct cttcttcctt tgctgattca aatccaatcc gtcccgtcac agatagagct 120
gcctcaacac tagctcagct t 141
<210> 20
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 液泡SP信号肽序列
<400> 20
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro
20 25 30
Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu
35 40 45
<210> 21
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码短cel-1信号肽的核苷酸序列
<400> 21
atggccgcaa gaaagtccct catattccct gtgatactcc tcgcagtttt gttgtttagt 60
ccaccaatct actcc 75
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 22
Met Ala Ala Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser
20 25
<210> 23
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码cel-1信号肽的核苷酸序列
<400> 23
atggctagga agtctttgat tttcccagtg attcttcttg ctgtgcttct tttctctcca 60
cctatttact ctgctggaca cgattatagg gatgctctta ggaagtcatc tatggct 117
<210> 24
<211> 39
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 24
Met Ala Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu
1 5 10 15
Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala
20 25 30
Leu Arg Lys Ser Ser Met Ala
35
<210> 25
<211> 4231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码通过Leto优化用于烟草的液泡SP和阿达木单抗链的核苷酸序列
<400> 25
ccatggccca tgcacgagtc ttgcttctcg ctttagctgt gctagcaact gcagccgttg 60
ctgtggcctc ctcttcttca tttgcggatt caaatccaat tcgtcccgtc actgatagag 120
ctgcttctac actagcgcag cttgaagtgc aattggttga atcaggagga ggactcgtgc 180
aaccgggaag gagtttacga ttatcttgtg ctgcctctgg attcaccttt gacgactatg 240
caatgcattg ggtccgtcaa gcaccaggaa aaggtttaga gtgggtttca gcaatcactt 300
ggaactccgg acatattgac tatgccgata gtgttgaggg tcgattcaca atctcacgag 360
ataacgcgaa gaatagtcta tacctacaga tgaatagcct aagagctgag gatactgccg 420
tttattactg tgcaaaggtt tcctatcttt ctactgcatc tagtcttgat tactggggac 480
aaggaacact tgtcacagtt tcctctgcta gcacaaaagg acctagcgtt ttccctctgg 540
caccatcaag taagagcacc agtggcggga cagcagcact gggttgtctt gtgaaagact 600
atttcccaga acccgttacc gttagttgga actcaggcgc acttacttcg ggagttcata 660
cttttcctgc tgtcttacaa tcttccggtc tctattcact aagctcagtt gtcactgtac 720
cttcctcaag ccttgggaca caaacctaca tttgtaacgt caatcataaa ccgagcaata 780
cgaaggtaga taagaaagtc gagccaaaga gttgtgataa aacacacact tgcccacctt 840
gcccagctcc tgaactctta ggtggaccaa gcgttttcct ctttcctcca aagccgaaag 900
atacacttat gatatcacgc acacccgaag ttacttgtgt ggttgtagac gtttctcatg 960
aagatcccga agtgaagttt aattggtacg tcgatggtgt tgaagttcac aatgctaaga 1020
ctaagccaag agaagagcaa tacaactcaa cctatagagt tgtttccgtc ttaaccgtac 1080
tgcatcaaga ttggttgaac ggcaaggagt ataaatgcaa ggttagcaat aaagcactac 1140
ctgcaccgat tgagaagaca attagcaaag caaaaggaca accaagggaa ccacaagtct 1200
atacacttcc accttcaagg gatgagctga ctaagaatca agtatccttg acctgtttag 1260
tcaaggggtt ttacccttct gacattgccg tagaatggga atctaatggg cagcctgaga 1320
ataactataa gacaactcca cccgtactcg attctgacgg ctcttttttc ctatactcca 1380
agctaaccgt ggataaatca cgttggcaac aaggaaacgt tttctcttgt tctgtgatgc 1440
acgaggcttt gcataatcac tacacacaaa agagcttaag tcttagccct gggaaataga 1500
taagttttac tatttaccaa gacttttgaa tattaacctt cttgtaacga gtcggttaaa 1560
tttgattgtt tagggttttg tattattttt ttttggtctt ttaattcatc actttaattc 1620
cctaattgtc tgttcatttc gttgtttgtt tccggatcga taatgaaatg taagagatat 1680
catatataaa taataaattg tcgtttcata tttgcaatct ttttttacaa acctttaatt 1740
aattgtatgt atgacatttt cttcttgtta tattaggggg aaataatgtt aaataaaagt 1800
acaaaataaa ctacagtaca tcgtactgaa taaattacct agccaaaaag tacacctttc 1860
catatacttc ctacatgaag gcattttcaa cattttcaaa taaggaatgc tacaaccgca 1920
taataacatc cacaaatttt tttataaaat aacatgtcag acagtgattg aaagatttta 1980
ttatagtttc gttatcttct tttctcatta agcgaatcac tacctaacac gtcattttgt 2040
gaaatatttt ttgaatgttt ttatatagtt gtagcattcc tcttttcaaa ttagggtttg 2100
tttgagatag catttcagcc ggttcataca acttaaaagc atactctaat gctggaaaaa 2160
agactaaaaa atcttgtaag ttagcgcaga atattgaccc aaattatata cacacatgac 2220
cccatataga gactaattac acttttaacc actaataatt attactgtat tataacatct 2280
actaattaaa cttgtgagtt tttgctagaa ttattatcat atatactaaa aggcaggaac 2340
gcaaacattg ccccggtact gtagcaacta cggtagacgc attaattgtc tatagtggac 2400
gcattaatta accaaaaccg cctctttccc cttcttcttg acgcgttaga caaacacccc 2460
ttgttataca aagaatttcg ctttacaaaa tcaaattcga gaaaataata tatgcactaa 2520
ataagatcat tcggatccaa tctaaccaat tacgatacgc tttgggtaca cttgattttt 2580
gtttcagtag ttacatatat cttgttttat atgctatctt taaggatctt cactcaaaga 2640
ctatttgttg atgttcttga tggggctcgg aagatttgat atgatacact ctaatcttta 2700
ggagatacca gccaggatta tattcagtaa gacaatcaaa ttttacgtgt tcaaactcgt 2760
tatcttttca tttaatggat gagccagaat ctctatagaa tgattgcaat cgagaatatg 2820
ttcggccgat atccctttgt tggcttcaat attctacata tcacacaaga atcgaccgta 2880
ttgtaccctc tttccataaa ggaacacaca gtatgcagat gcttttttcc cacatgcagt 2940
aacataggta ttcaaaaatg gctaaaagaa gttggataac aaattgacaa ctatttccat 3000
ttctgttata taaatttcac aacacacaaa agcccgtaat caagagtctg cccatgtacg 3060
aaataacttc tattatttgg tattgggcct aagcccagct cagagtacgt gggggtacca 3120
catataggaa ggtaacaaaa tactgcaaga tagccccata acgtaccagc ctctccttac 3180
cacgaagaga taagatataa gacccaccct gccacgtgtc acatcgtcat ggtggttaat 3240
gataagggat tacatccttc tatgtttgtg gacatgatgc atgtaatgtc atgagccaca 3300
tgatccaatg gccacaggaa cgtaagaatg tagatagatt tgattttgtc cgttagatag 3360
caaacaacat tataaaaggt gtgtatcaat acgaactaat tcactcattg gattcataga 3420
agtccattcc tcctaagtat ctaaacaatg gcacactgtt actagctcta gcagtgctag 3480
ctactgctgc cgttgcagtc gcctcctctt cttcctttgc tgattcaaat ccaatccgtc 3540
ccgtcacaga tagagctgcc tcaacactag ctcagcttga catacaaatg actcaatctc 3600
caagttcact atctgcttca gtcggcgata gggtcactat aacttgtaga gcctctcagg 3660
gcataagaaa ctatttggca tggtaccaac agaaacctgg aaaagctcct aagctgctaa 3720
tatatgctgc ttctacactt cagagtggag taccttcaag attcagtgga tctggttctg 3780
ggactgattt cactttgact atctcatccc tccaaccaga agacgttgct acatactatt 3840
gccagcgcta taatagggct ccttatacct ttggacaagg cacaaaagtc gagattaaga 3900
gaactgttgc tgcaccatca gtgtttattt tccctccaag tgacgaacag cttaaatctg 3960
gaactgcaag cgttgtatgc cttctcaaca atttctaccc tagagaagcg aaagtccaat 4020
ggaaagtaga taacgcactt cagtctggga actcacaaga gagtgtcact gaacaagatt 4080
cgaaagactc tacctattca ctctcatcga ctcttactct gtcaaaagct gattacgaga 4140
agcacaaagt gtatgcttgc gaagttacac accaaggact tagctcacca gtaaccaaga 4200
gcttcaatag gggagaatgc tgagcggccg c 4231
<210> 26
<211> 1016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Rubisco启动子的核苷酸序列
<400> 26
aattcgatat caagcttaga caaacacccc ttgttataca aagaatttcg ctttacaaaa 60
tcaaattcga gaaaataata tatgcactaa ataagatcat tcggatccaa tctaaccaat 120
tacgatacgc tttgggtaca cttgattttt gtttcagtag ttacatatat cttgttttat 180
atgctatctt taaggatctt cactcaaaga ctatttgttg atgttcttga tggggctcgg 240
aagatttgat atgatacact ctaatcttta ggagatacca gccaggatta tattcagtaa 300
gacaatcaaa ttttacgtgt tcaaactcgt tatcttttca tttaatggat gagccagaat 360
ctctatagaa tgattgcaat cgagaatatg ttcggccgat atccctttgt tggcttcaat 420
attctacata tcacacaaga atcgaccgta ttgtaccctc tttccataaa ggaacacaca 480
gtatgcagat gcttttttcc cacatgcagt aacataggta ttcaaaaatg gctaaaagaa 540
gttggataac aaattgacaa ctatttccat ttctgttata taaatttcac aacacacaaa 600
agcccgtaat caagagtctg cccatgtacg aaataacttc tattatttgg tattgggcct 660
aagcccagct cagagtacgt gggggtacca catataggaa ggtaacaaaa tactgcaaga 720
tagccccata acgtaccagc ctctccttac cacgaagaga taagatataa gacccaccct 780
gccacgtgtc acatcgtcat ggtggttaat gataagggat tacatccttc tatgtttgtg 840
gacatgatgc atgtaatgtc atgagccaca tgatccaatg gccacaggaa cgtaagaatg 900
tagatagatt tgattttgtc cgttagatag caaacaacat tataaaaggt gtgtatcaat 960
acgaactaat tcactcattg gattcataga agtccattcc tcctaagtat ctaaac 1016
<210> 27
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码Rubisco终止子的核苷酸序列
<400> 27
ggccgcataa gttttactat ttaccaagac ttttgaatat taaccttctt gtaacgagtc 60
ggttaaattt gattgtttag ggttttgtat tatttttttt tggtctttta attcatcact 120
ttaattccct aattgtctgt tcatttcgtt gtttgtttcc ggatcgataa tgaaatgtaa 180
gagatatcat atataaataa taaattgtcg tttcatattt gcaatctttt tttacaaacc 240
tttaattaat tgtatgtatg acattttctt cttgttatat tagggggaaa taatgttaaa 300
taaaagtaca aaataaacta cagtacatcg tactgaataa attacctagc caaaaagtac 360
acctttccat atacttccta catgaaggca ttttcaacat tttcaaataa ggaatgctac 420
aaccgcataa taacatccac aaattttttt ataaaataac atgtcagaca gtgattgaaa 480
gattttatta tagtttcgtt atcttctttt ctcattaagc gaatcactac ctaacacgtc 540
attttgtgaa atattttttg aatgttttta tatagttgta gcattcctct tttcaaatta 600
gggtttgttt gagatagcat ttcagccggt tcatacaact taaaagcata ctctaatgct 660
ggaaaaaaga ctaaaaaatc ttgtaagtta gcgcagaata ttgacccaaa ttatatacac 720
acatgacccc atatagagac taattacact tttaaccact aataattatt actgtattat 780
aacatctact aattaaactt gtgagttttt gctagaatta ttatcatata tactaaaagg 840
caggaacgca aacattgccc cggtactgta gcaactacgg tagacgcatt aattgtctat 900
agtggacgca ttaattaacc aaaaccgcct ctttcccctt cttcttgaag cttgagctcg 960
<210> 28
<211> 232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NOS终止子的核苷酸序列
<400> 28
ggccgctgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 60
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaaaca 120
tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg gtttttatga ttaagagtcc ccgcaattat 180
acattttaat acgcgataga aaaacaaaat atagcgccca aactagagct cg 232
<210> 29
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CBD编码域的基因融合的核苷酸序列
<400> 29
caattgaatc ttaaggtgga attttacaac tccaacccat ctgatactac aaattccata 60
aaccctcaat tcaaggttac taatacagga tcttcagcta tcgatctttc aaaactcact 120
cttagatact actacacagt ggatggtcaa aaggatcaga ctttttggtg tgatcatgct 180
gcaattatag gatcaaatgg tagttacaac ggaataactt caaacgttaa gggtacattc 240
gtgaaaatga gttcctctac taataacgct gatacatatc tcgaaatttc ttttactgga 300
ggtacacttg agccaggtgc tcatgttcaa atacagggaa ggttcgcaaa aaatgattgg 360
tcaaactaca ctcaatccaa cgattactct tttaagtcag ctagtcaatt cgttgaatgg 420
gatcaggtga cagcatattt gaatggtgtt ttagtgtggg gtaaagagcc tggaggttca 480
gttgtgccaa gtactcaacc tgttactaca ccacctgcta ctacaaagcc acctgcaact 540
acaatcccac ctact 555
<210> 30
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码蛋白A的核苷酸序列
<400> 30
atggaacaaa gaataacatt gaaggaggct tgggatcaaa ggaatggttt tattcagtct 60
ttaaaggatg atccatccca atctgctaat gtgctcggtg aagcacaaaa acttaacgat 120
agtcaggctc ctaaagctga tgcacaacaa aataacttta ataaggatca acagtctgct 180
ttctacgaaa tcctcaatat gccaaatctt aacgaggcac aaagaaatgg ttttattcag 240
tcattgaagg atgatccttc acaaagtaca aacgttttgg gtgaagctaa gaaattaaac 300
gagagtcagg ctccaaaggc agataataac ttcaataagg aacaacagaa cgcattctac 360
gagatcttga acatgccaaa tcttaacgaa gagcagcgta atggttttat tcagtcattg 420
aaagatgatc cttcccaatc tgctaatctt ttgtccgaag caaagaaact taacgagtct 480
caggctccta aggcagataa taagtttaac aaagaacaac agaatgcttt ctacgagcat 540
ctccctaatc ttaacgaaga acaaaggaac ggtttcattc agtctttgaa agatgatcca 600
tctcaaagtg caaatcttct cgctgaggca aagaaactta acgatgctca ggcaccaaag 660
gctgacaata agtttaacaa agagcagcaa aacgcattct acgagatatt gcacttacct 720
aacctcactg aagagcagag gaatggtttt atccagagtc tcaaagatga tccaggtaat 780
agt 783
<210> 31
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白A AA序列
<400> 31
Met Glu Gln Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ala Trp Asp Gln Arg Asn Gly
1 5 10 15
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu
20 25 30
Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala
35 40 45
Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
50 55 60
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala
85 90 95
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn
100 105 110
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu
115 120 125
Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser
145 150 155 160
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
165 170 175
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
180 185 190
Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu
195 200 205
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
210 215 220
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
225 230 235 240
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
245 250 255
Lys Asp Asp Pro Gly Asn Ser
260
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头序列
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TMD23 (人溶酶体蛋白LAMP1的23 AA跨膜域)的氨基酸序列
<400> 33
Ser Thr Ala Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser
20 25 30
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TMD17 (人溶酶体蛋白LAMP1的17 AA跨膜域)的氨基酸序列
<400> 34
Ser Thr Ala Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser
20 25
<210> 35
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码优化至烟草PrtA-TMD17的核苷酸序列
<400> 35
caattgatgg agcaaagaat tacacttaag gaagcatggg atcaaaggaa tggttttata 60
caaagcttaa aggatgatcc tagtcagagc gcgaatgtgc ttggagaagc tcagaaattg 120
aatgattccc aagcaccaaa agccgatgct cagcaaaaca atttcaataa ggatcaacag 180
tccgcattct acgaaattct gaatatgccc aatctcaacg aggctcaaag gaacgggttt 240
atccagtctt tgaaagatga cccgtcacaa tctacaaatg ttttaggcga agcaaagaag 300
ctaaatgagt cacaagcccc aaaagcagat aacaacttta acaaggagca gcagaacgct 360
ttttacgaga ttctcaatat gcctaatctt aatgaggagc aacgaaacgg ttttatccaa 420
tcccttaaag acgaccctag tcaatcggcc aatttgctta gcgaagctaa aaagcttaac 480
gagtctcaag cacctaaagc ggataacaaa ttcaacaagg aacagcagaa tgcattttat 540
gaaatcctgc atctacctaa tctcaatgaa gaacagcgga atgggttcat tcaatcttta 600
aaggacgacc catcacaatc agcaaacttg ctggctgaag ctaagaaact taatgacgca 660
caagctccca aggccgataa caagtttaac aaagaacagc aaaacgcatt ctatgaaatt 720
cttcacttgc caaatttgac tgaggaacag cgcaatggtt tcatacagtc actcaaagat 780
gatccaggaa atagtggtgg tggaggagct gggggtggcg gggctggcgg aggaggttct 840
agtaccgcct tgataccaat tgctgtcgga ggtgctctag ctggattagc ctatcttgtt 900
ggccgtaaaa gatcttaaga gctc 924
<210> 36
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码优化至烟草PrtA-TMD23的核苷酸序列
<400> 36
caattgatgg agcaaagaat tacacttaag gaagcatggg atcaaaggaa tggttttata 60
caaagcttaa aggatgatcc tagtcagagc gcgaatgtgc ttggagaagc tcagaaattg 120
aatgattccc aagcaccaaa agccgatgct cagcaaaaca atttcaataa ggatcaacag 180
tccgcattct acgaaattct gaatatgccc aatctcaacg aggctcaaag gaacgggttt 240
atccagtctt tgaaagatga cccgtcacaa tctacaaatg ttttaggcga agcaaagaag 300
ctaaatgagt cacaagcccc aaaagcagat aacaacttta acaaggagca gcagaacgct 360
ttttacgaga ttctcaatat gcctaatctt aatgaggagc aacgaaacgg ttttatccaa 420
tcccttaaag acgaccctag tcaatcggcc aatttgctta gcgaagctaa aaagcttaac 480
gagtctcaag cacctaaagc ggataacaaa ttcaacaagg aacagcagaa tgcattttat 540
gaaatcctgc atctacctaa tctcaatgaa gaacagcgga atgggttcat tcaatcttta 600
aaggacgacc catcacaatc agcaaacttg ctggctgaag ctaagaaact taatgacgca 660
caagctccca aggccgataa caagtttaac aaagaacagc aaaacgcatt ctatgaaatt 720
cttcacttgc caaatttgac tgaggaacag cgcaatggtt tcatacagtc actcaaagat 780
gatccaggaa atagtggtgg tggaggagct gggggtggcg gggctggcgg aggaggttct 840
agtaccgcct tgataccaat tgctgtcgga ggtgctctag ctggattagt gctgatcgta 900
ttgattgcct atcttgttgg ccgtaaaaga tcttaagagc tc 942
<210> 37
<211> 437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆到pUC18质粒中的GMD RNAi寡核苷酸序列
<400> 37
gcggccgcaa tcatgaatcc cctaggcggg gcgagaactt cgtgacccgg aagatcactc 60
gggctgtggg tcggatcaaa atcgggctac aaagcaagct gttcctgggt aatttgcagg 120
catccaggga ctggggtttt gccggggatt acgtggaagc aatgtggatg atgctgcagc 180
aagagaagcc ggatgactat gtggtggcaa cggaggagtc acacacggtg gaggagttct 240
tggaggtggc gttcggatac gtaggattga attggaagga tcatgtggtg attgataaga 300
ggtactttag gcccacagaa gtggataatc taaagggaga ctcgagcaag gcgaggaatg 360
ttttgggttg gaagcccaga gtggggttcg agcaattagt gaagatgagg atgttgagtt 420
agctaaaagg gggatcc 437
<210> 38
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆到pUC18质粒中的GMD RNAi寡核苷酸序列
<400> 38
atcgatccat gggcggccgc aatcatgaat cccctaggcg gggcgagaac ttcgtgaccc 60
ggaagatcac tcgggctgtg ggtcggatca aaatcgggct acaaagcaag ctgttcctgg 120
gtaatttgca ggcatccagg gactggggtt ttgccgggga ttacgtggaa gcaatgtgga 180
tgatgctgca gcaagagaag ccggatgact atgtggtggc aacggaggag tcacacacgg 240
tggaggagtt cttggaggtg gcgttcggat acgtaggatt gaattggaag gatcatgtgg 300
tgattgataa gaggtacttt aggcccacag aagtggataa tctaaaggga gactcgagca 360
aggcgaggaa tgttttgggt tggaagccca gagtggggtt cgagcaatta gtgaagatga 420
ggatgttgag ttagctaaaa gggggatccc aattgaatgc t 461
<210> 39
<211> 266
<212> DNA
<213> Arabidopsis
<220>
<221> misc_feature
<223> 用于GMD RNAi的XylT基因内区
<400> 39
tagttaggat ccgaggtttg tgcattttac tcattgatct ggtggatttg aagattgtgt 60
tttggtgaaa agattgcata attggagact tttcattcaa catatgcagc aatgaatcac 120
tgattttgag ctttacattg ttcatattaa ttaggttgtg gttgtgtgag attcttggaa 180
gactatgtag ttatgtgtgg tggttatatc ttgttggttt gatgtttggt ttgctttttg 240
tttggctgca gtggcaattg taacta 266
<210> 40
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码XylT Exon3的核苷酸序列
<400> 40
ctggcaggac catggatgct aagaacttta gtggcccagt ttgtttccgt catgccgccc 60
tctcgccttt gggatatgaa actgccctgt ttaagggact gtcagaaact atagattgta 120
atggagcttc tgcccatgat ttgtggcaaa atcctgatga taagaaaact gcacggttgt 180
ccgagtttgg ggagatgatt agggcagcct ttagatttcc tgtggataga cagaacatcc 240
caaggacagt cacaggccct aatgtcctct ttgttagacg tgaggattat ttagctcacc 300
cacgtcatgg tggaaaggta cagtctaggc ttagcaatga agagcaagta tttgattcca 360
taaagagctg ggccttgaac cactcggagt gcaaattaaa tgtaattaac ggattgtttg 420
cccacatgtc catgaaagag caagttcgag caatccaaga tgcttctgtc atagttggtg 480
ctcatggagc aggtctaact cacatagttt ctgcagcacc aaaagctgta atactagaaa 540
ttataagcag cgaatatagg cgcccccatt ttgctctgat tgcacaatgg aaaggattgg 600
agtaccatcc catatatttg gaggggcggc cgcaagtgcg gc 642

Claims (60)

1.一种在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的所述的亚细胞分隔区内，由此改变所述的植物或植物细胞中所述的所关注的多肽的糖基化模式。
2.一种生产所述的所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)在经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞中，表达编码所关注的多肽的核酸序列，使得所述的至少一种糖苷酶和所述的所关注的多肽共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区中；以及随后
(b)分离所述的所关注的多肽。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的经转化而在所述的亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞与相同物种的植物或植物细胞相比，进一步包含降低水平或活性的至少一种糖基转移酶，其中所述的相同的物种表达野生水平的或者展现野生活性的所述的至少一种糖基转移酶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的糖基转移酶包含β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。
5.权利要求1-4的任意一项所述的方法，其中所述的经转化而在所述的亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞进一步包含编码融合多肽的核酸序列，所述的融合多肽包含细胞壁结合肽，其在翻译中与用于结合所述的所关注的多肽的亲和部分融合。
6.一种分离的多肽，其包含在翻译中与异源亲和部分融合的细胞壁结合肽。
7.权利要求5所述的方法或权利要求6所述的分离的多肽，其中所述的细胞壁结合肽为纤维素结合结构域(CBD)。
8.权利要求5所述的方法或权利要求6-7的任意一项所述的分离的多肽，其中所述的亲和部分用于结合抗体。
9.所述的方法或权利要求6-7的任意一项所述的分离的多肽，其中用于结合使得抗体的所述的亲和部分包含蛋白质A/G/L。
10.权利要求9所述的在SEQ ID NO:10中列出的分离的多肽。
11.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求6-10的任意一项所述的多肽的核酸序列。
12.权利要求11所述的在SEQ ID NO:9中列出的分离的多肽。
13.一种核酸构建体，其包含权利要求11-12的任意一项所述的分离的多核苷酸，以及用于指导所述的多肽在植物细胞中表达的顺式作用元件。
14.权利要求13所述的核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的其他的核酸序列。
15.一种转基因植物或植物细胞，其包含权利要求11-13的任意一项所述的核酸构建体的多核苷酸。
16.权利要求15所述的转基因植物或植物细胞经转化而在亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶。
17.权利要求15-16的任意一项所述的转基因植物或植物细胞，其包含与相同物种的植物或植物细胞相比，降低水平或活性的至少一种糖基转移酶，其中所述的相同的物种表达野生水平的或者展现野生活性的所述的至少一种糖基转移酶。
18.权利要求15-17的任意一项所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的糖基转移酶包含β-(l-2)-木糖基转移酶和/或α-(1,3)-岩澡糖基转移酶。
19.一种生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在所述的植物或植物细胞中表达至少2种糖苷酶，使得所述的至少2种糖苷酶共同定位于所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的表达至少2种糖苷酶包括：
(a)在第一植物的所述的亚细胞分隔区内表达所述的至少2种糖苷酶的第一糖苷酶；
(b)在第二植物的所述的亚细胞分隔区内表达所述的至少2种糖苷酶的第二糖苷酶；以及
(c)使所述的第一植物和所述的第二植物杂交。
21.权利要求19所述的方法，其中所述的表达至少2种糖苷酶包括：
(i)向所述的植物或植物细胞中引入核酸构建体，该构建体包含编码所述的至少2种糖苷酶的核酸序列，其中所述的至少2种糖苷酶的一种在翻译中与用于在所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合；或者
(ii)向所述的植物或植物细胞中引入核酸构建体系统，该系统包含：
第一核酸构建体，其包含编码第一糖苷酶的核酸序列；
第二核酸构建体，其包含编码第二糖苷酶的核酸序列，
其中所述的第一糖苷酶和所述的第二糖苷酶的各种酶在所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内在翻译中与用于共同定位的信号肽融合。
22.一种生产转基因植物或植物细胞的方法，该方法包括在所述的植物或植物细胞中表达至少一种糖苷酶，以及所述的所关注的多肽的亲和部分，其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。
23.一种核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码至少一种糖苷酶的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码所述的所关注的多肽的亲和部分的核酸序列，
其中所述的亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合。
24.权利要求1或2所述的方法，其中所述的表达所述的核酸序列包括：
(i)经转化而表达所述的至少一种糖苷酶的第一转基因植物；以及
(ii)经转化而表达所述的所关注的多肽的第二转基因植物，
其中所述的核酸序列编码所述的所关注的多肽。
25.权利要求24所述的方法，其中所述的第一植物经转化而表达亲和部分，该亲和部分在翻译中与细胞壁结合肽融合，其中所述的亲和部分用于结合所述的所关注的多肽。
26.一种包含编码至少2种糖苷酶的核酸序列的核酸构建体，其中所述的至少2种糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
27.一种核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码至少2种糖苷酶的第一糖苷酶的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码所述的至少2种糖苷酶的第二糖苷酶的核酸序列，
其中所述的第一糖苷酶和所述的第二糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
28.权利要求26或27所述的核酸构建体或构建体系统，其中所述的信号肽为空泡信号肽或离质体信号肽。
29.权利要求26或27所述的核酸构建体或构建体系统，其中所述的信号肽为在所述的第一糖苷酶和所述的第二糖苷酶的N-末端融合的空泡信号肽或离质体信号肽。
30.一种转基因植物或植物细胞，其经转化而在亚细胞分隔区内以共同定位的方式表达至少2种糖苷酶。
31.一种核酸构建体，其包含编码所关注的多肽和至少一种糖苷酶的核酸序列，其中所述的所关注的多肽和所述的至少一种糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
32.一种核酸构建体系统，其包含：
(i)第一核酸构建体，其包含编码所关注的多肽的亲和部分的核酸序列；
(ii)第二核酸构建体，其包含编码所述的至少一种糖苷酶的核酸序列，
其中所述的至少一种糖苷酶的每一种在翻译中与用于在植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
33.一种核酸构建体，其包含在翻译中与用于在所关注的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
34.一种包含权利要求33所述的核酸构建体的转基因植物或植物细胞。
35.一种在植物或植物细胞中改变所关注的多肽的糖基化模式的方法，该方法包括将权利要求31所述的核酸构建体或权利要求32所述的核酸构建体系统引入植物或植物细胞中，由此改变在所述的植物或植物细胞中所述的所关注的多肽的糖基化模式。
36.一种生产所关注的多肽的方法，该方法包括：
(a)将所述的权利要求31所述的核酸构建体或权利要求34所述的核酸构建体系统引入植物或植物细胞中；以及随后
(b)分离所述的所关注的多肽。
37.一种转基因植物或植物细胞，其重组表达：
(i)所关注的多肽；以及
(ii)至少一种糖苷酶，
其中所述的所关注的多肽和所述的至少一种糖苷酶的每一种在翻译中与用于在所述的植物或植物细胞的亚细胞分隔区内共同定位的信号肽融合。
38.一种转基因植物或植物细胞，其包含权利要求26,27,31和32的任意一项所述的核酸构建体或核酸构建体系统。
39.权利要求19,20,21的任意一项所述的方法，或者权利要求26和27的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求34所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的至少2种糖苷酶包含岩藻糖苷酶和木糖苷酶。
40.权利要求1,2,35和36的任意一项所述的方法，或者权利要求31-34的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求37和38的任意一项所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的至少一种糖苷酶选自岩藻糖苷酶和木糖苷酶。
41.权利要求1-40的任意一项所述的方法、核酸构建体、核酸构建体系统或转基因植物或植物细胞，其中所述的亚细胞分隔区选自空泡、离质体、内质网和高尔基体。
42.权利要求1-40的任意一项所述的方法、核酸构建体、核酸构建体系统或转基因植物或植物细胞，其中所述的亚细胞分隔区为空泡。
43.权利要求1-42的任意一项所述的方法、核酸构建体、核酸构建体系统或转基因植物或植物细胞，其中所述的植物或植物细胞为烟草植物或植物细胞。
44.权利要求1-42的任意一项所述的方法、核酸构建体、核酸构建体系统或转基因植物或植物细胞，其中所述的植物细胞为根细胞。
45.权利要求21所述的方法、权利要求26和31的任意一项所述的核酸构建体、权利要求27和33的任意一项所述的核酸构建体系统、或者权利要求34或37所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的信号肽选自空泡靶向信号、内质网靶向信号、离质体靶向信号、线粒体靶向信号和质体靶向信号。
46.权利要求1所述的方法，其中所述的经转化而在所述的亚细胞分隔区内表达至少一种糖苷酶的植物或植物细胞经过进一步转化而在所述的亚细胞分隔区内表达其他的糖苷酶。
47.权利要求21所述的方法、权利要求26和31的任意一项所述的核酸构建体、权利要求27和33的任意一项所述的核酸构建体系统、或者权利要求34或37所述的转基因植物或植物细胞，其中所述的信号肽在翻译中与所述的所关注的多肽或所述的糖苷酶的C-末端融合。
48.一种根据权利要求2和36的任意一项所述的方法生产的分离的多肽。
49.一种包含核酸序列的核酸构建体，其中所述的核酸序列编码糖苷酶，其在翻译中与用于在所关注的亚细胞分隔区内定位的信号肽融合。
50.一种转基因植物或植物细胞，其包含权利要求49所述的核酸构建体。
51.权利要求1,2,35和36的任意一项所述的方法，权利要求31-33和49的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求37所述的转基因植物，其中所述的所关注的多肽为人类多肽。
52.权利要求1,2,35和36的任意一项所述的方法，权利要求31-33和49的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求37所述的转基因植物，其中所述的所关注的多肽为药物。
53.权利要求1,2,35和36的任意一项所述的方法，权利要求31-33和49的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求37所述的转基因植物，其中所述的所关注的多肽选自抗体、疫苗、酶、生长因子、激素和结构蛋白质。
54.权利要求1,2,35和36的任意一项所述的方法，权利要求31-33和49的任意一项所述的核酸构建体或构建体系统，或者权利要求37所述的转基因植物，其中所述的所关注的多肽为抗体或抗体片段。
55.权利要求54所述的方法、核酸构建体或构建体系统或转基因植物，其中所述的抗体为贝伐单抗或阿达木单抗。
56.一种权利要求15,16,17,18,30,34,37,38和50的任意一项所述的转基因植物的种子。
57.权利要求56所述的种子为杂交种子。
58.一种分离的多肽，其包含在翻译中与异源跨膜结构域融合的蛋白质A/G/L的氨基酸序列。
59.权利要求58所述的分离的多肽，其中所述的翻译中融合是通过连接体进行的。
60.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求58或59所述的多肽的核酸序列。
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