KR102613962B1 - 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질은 생체 내 반감기가 매우 향상되며, 수용체 결합 도메인만을 포함하는 면역원성 조성물보다 현저히 뛰어난 효능을 갖는 다가 백신 조성물로의 활용 가능성이 높다. 특히 본 발명의 융합단백질은 코로나바이러스 특이적 항체 형성 역가와 T 세포 면역반응을 크게 향상시킬 수 있으며, 따라서 SARS-CoV-2를 비롯한 코로나바이러스의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{Fusion Protein comprising a Receptor Binding Domain Derived From Coronavirus and Nucleocapsid Protein, and Uses Thereof}
본 발명은 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상기 융합단백질의 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
코로나바이러스(coronavirus)는 RNA 바이러스의 한 종류로 유전정보가 리보핵산(RNA)으로 이뤄진 바이러스이다. 사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로, 점막전염, 비말전파 등으로 쉽게 감염되며, 사람은 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키지만 드물게 치명적인 감염을 일으키기도 한다.
중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)는 중국 우한에서 출현하여 전세계로 빠르게 확산되었으며 WHO는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. SARS-CoV-2의 감염이 확산되면서 WHO는 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 코로나19 확진자가 전 세계에서 속출하자 WHO는 3월 11일 홍콩독감(1968), 신종플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 코로나19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포했다.
전세계적으로 약 1억명의 환자가 발생하고, 약 200만명이 사망했으며, 매일 수만에서 수십만명의 확진환자가 추가되어, 지속적으로 감염환자가 증가하는 추세에 있다. (2021년 1월 18일 기준, COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU)). 한국에서도, 약 7만명의 환자가 확진되었으며, 지역사회를 통한 감염으로 확산되어 매일 수백명의 확진자가 추가되고 있으며, 총 1264명의 사망자가 보고되었다(2021년 1월 18일 기준, 대한민국 중앙재난안전대책본부).
SARS-CoV-2에 감염되면, 발열(83~99%), 기침(59~82%), 식욕 부진(40~84%), 피로(44~70%), 호흡곤란(31~40%), 가래 및 기침(28~33%), 및 근육통 및 기타 통증(11~35%)등의 증상이 나타나는 것으로 알려져 있으며(U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 6 April 2020.), 2~14일 이내의 잠복기를 거친 후 상기한 증상들이 발현되는 것으로 보고되었다.
SARS-CoV-2는 전염력이 매우 높으며, 일반적으로, 직/간접적인 접촉, 감염자로부터 배출된 에어로졸 형태의 물방울 등을 통해 전파되는 것으로 알려져 있으며, 일부 경우에서는 무증상자로부터 전염도 가능한 것으로 보고된다(European Centre for Disease Prevention and Control. Retrieved 30 April 2020.). 또한 완치된 후에도 후유증을 앓거나 재감염되는 사례가 속속들이 보고되고 있다. 따라서, SARS-CoV-2 감염 예방이 특히 강조되고 있으며, 이를 위해, 개인적/사회적 차원에서, 마스크 착용, 손 씻기, 사회적 거리두기 등을 적극적으로 수행하고 있으나, 교회를 비롯한 다양한 지역에서 감염되는 사례가 발생하고 있고, 그 경로가 불명확하여, SARS-CoV-2 백신의 개발이 시급한 상황이다. 현재 다양한 기관에서 백신 후보물질을 개발 및 연구 중에 있으며, 재조합 백신, 비활성 바이러스 백신, mRNA 백신 등 다양한 형태의 백신이 임상시험 중에 있으며, 최근 화이자, 모더나, 아스트로제네카 등의 제약사에서 개발한 소수의 백신이 긴급 승인되어 접종되고 있으나, 수요에 비해 생산 및 공급이 극히 부족한 상황이며, 여러 변종 코로나바이러스가 속속 등장하여, 새로운 백신 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
한편, Angiotensin-converting enzyme 2(ACE2)는 전염증성 물질인 안지오텐신 II를 분해하여, 염증으로부터 신장, 폐, 심장을 보호하는 것으로 알려져 있다. 상기 ACE2는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스 계열의 세포진입과정에서, 바이러스의 수용체로 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 SARS-CoV-2는 ACE 2와 스파이크 단백질(S protein)의 결합을 중심으로, 내세포 작용 및 TMPRSS2와의 공동작용으로인한 직접 융합의 두 가지 메커니즘을 통해 작용하는 것으로 보고되었다(Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5224; 10.1016/j.cell.2020.02.052 등). 따라서, 현재 연구되는 많은 치료제 및 백신의 개발전략은 스파이크 단백질을 표적으로 하고 있으며, 특히 대부분의 백신의 경우 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 대한 중화항체의 형성을 목적으로 한다.
병원체의 유전자 정보를 이용하여 병원체의 항원결정부위만을 따로 생산하여 이를 주입하는 재조합 백신의 경우, 대부분 스파이크 단백질 또는 이의 단편, 특히 ACE2에 결합하는 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)을 항원으로 주입하여, 스파이크 단백질 또는 RBD에 대한 중화항체의 형성을 통한 항체 매개 바이러스 중화 효과를 약리기전으로 한다.
특히, 상기 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(S 단백질)에 포함된 수용체인 ACE2와 결합하는 특정 서열의 아미노산으로서, 이의 야생형 아미노산 서열(서열번호 1)이 보고되었으며 이의 결합 구조에 대한 연구결과가 지속적으로 보고되고 있다(Nature. 30 March; Science. 3 April; Cell. 9 April).
이러한 배경기술 아래에서, COVID-19를 비롯한 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 백신을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 유래 S 단백질의 수용체 결합 도메인, 뉴클레오캡시드 단백질의 RNA 결합 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질을 제조하였으며, 상기 융합단백질을 사용하여 동물모델에 백신접종을 하는 경우, 수용체 결합 도메인만을 포함하는 융합단백질보다 현저히 높은 수용체 결합 도메인 특이적 중화항체 형성 역가 및 T세포 면역반응의 활성화를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 코로나바이러스 특이적 면역원성을 나타내는 융합단백질 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 백신접종 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 또는 재조합 벡터가 도입된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 융합단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain), 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein) 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질의 코로나바이러스 감염증 예방용 백신 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 및/또는 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 감염증에 대한 백신접종(vaccination) 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질의 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 및/또는 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질의 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용도를 제공한다
본 발명은 또한, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 또는 재조합 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 상기 융합단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 융합단백질은 생체 내 반감기가 매우 향상되며, 수용체 결합 도메인만을 포함하는 면역원성 조성물보다 현저히 뛰어난 효능을 갖는 다가 백신 조성물로의 활용 가능성이 높다. 특히 본 발명의 융합단백질은 코로나바이러스 특이적 항체 형성 역가와 T 세포 면역반응을 크게 향상시킬 수 있으며, 따라서 SARS-CoV-2를 비롯한 코로나바이러스의 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인(RBD)과 ACE2의 결합 구조를 나타낸 것이다(Nature. 30 March)
도 2는 야생형 RBD의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 음영은 수용체 결합 모티프(RBM)를 나타내며, 파란색 박스는 MHC I 및 II에 대한 에피토프를 나타낸다.
도 3은 실시예에서 제조한 융합단백질을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 IgG1 Fc의 모식도(좌측) 및 제조산물의 SDS-PAGE 결과(우측)이다.
도 5는 Fc-RBDwt의 모식도(좌측) 및 제조산물의 SDS-PAGE 결과(우측)이다.
도 6은 RBDwt-Fc의 모식도(좌측) 및 제조산물의 SDS-PAGE 결과(우측)이다.
도 7은 N-Fc의 모식도(좌측) 및 제조산물의 SDS-PAGE 결과(우측)이다.
도 8은 GIC-1114의 모식도(좌측) 및 제조산물의 SDS-PAGE 결과(우측)이다.
도 9는 GIC-1114N의 모식도이다.
도 10은 마우스 동물모델을 대상으로 본 발명의 융합단백질을 사용한 백신 접종을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11는 IgG Fc, GIC-1114 및 Fc-RBDwt 융합단백질을 단독 또는 어쥬번트와 함께 마우스 동물모델에 백신접종한 경우, RBD 특이적 중화항체 형성 역가를 확인한 것이다.
도 12는 각각의 지시된 항원으로 자극하는 경우, GIC-1114, Fc-RBDwt, 및 N-Fc 융합단백질로 백신접종한 마우스 비장의 T세포의 IFN-γ수준을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 상세한 설명은 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
달리 지시되지 않는 한, 핵산 및 아미노산은 좌측에서 우측으로 각각 5'에서 3' 및 N-말단에서 C-말단 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
2019년 12월에 중국에서 최초로 발견된 SARS-CoV-2는 현재 전세계적으로 수천만명의 확진자와 수십만의 사망자를 발생시키며 대유행하고 있다. 이러한 상황 속에서도 아직 효능이 완벽하게 입증된 치료제 및 백신이 거의 없으며, 많은 연구자 및 기업이 치료제와 백신에 개발에 많은 노력을 기울이고 있다.
현재 개발되고 있는 SARS-CoV-2 백신은 대부분 SARS-CoV-2의 감염(세포 진입) 및 증상 발현 메커니즘에 가장 큰 역할을 차지하는 것으로 보고되는 스파이크 단백질 또는 이의 단편을 면역원으로 하여, 중화항체를 생성하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 SARS-CoV-2 유래 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인뿐만 아니라, 뉴클레오캡시드 단백질을 Fc 도메인과 융합하여, 융합단백질을 제조하였다. Fc 도메인을 포함하는 융합단백질은 생물학적 활성 손실이 최소화되면서도, 반감기의 증가, 발현 수준의 증가 등의 생물학적 특성의 향상을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 수용체 결합 도메인, 뉴클레오캡시드 단백질 및 Fc 도메인을 함유하는 융합단백질을 이용하여 마우스 동물모델에 백신접종을 수행한 결과, 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하지 않는 융합단백질보다 현저히 높은 SARS-CoV-2의 수용체 결합 단백질 특이적 중화항체 형성 역가를 나타내는 것을 확인하였으며, 상기 융합단백질이 접종된 마우스 비장 유래 T세포를 뉴클레오캡시드 단백질(N-Fc)로 자극 시 높은 IFN-γ 수준을 나타내어 T세포 면역반응을 활성화할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain), 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein) 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.
상기 “수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)”은 코로나바이러스의 스파이크 단백질에서 수용체인 ACE2와 결합하는 특정 아미노산 서열을 의미하며, 수용체 결합 모티프(RBM)를 포함한다. 바람직하게는 상기 수용체 결합 도메인은 SARS-CoV-2 유래의 스파이크 단백질의 도메인일 수 있으며, 일 예로서, SARS-CoV-2 유래 수용체 결합 도메인의 야생형 아미노산 서열(서열번호 1)이 보고된 바 있다(Nature. 30 March).
본 발명의 용어, “수용체 결합 모티프(Receptor Binding Motif, RBM)”는 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain, RBD)에 포함된 아미노산 서열로, 수용체인 ACE2와 접촉하는 부위를 포함하며, 일 예로서, SARS-CoV-2 유래 수용체 결합 모티프의 야생형 아미노산 서열(서열번호 1의 120~188 아미노산)이 보고된 바 있다(Nature. 30 March).
코로나바이러스의 스파이크 단백질은 코로나바이러스의 세포 감염에 가장 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 바이러스의 재조립 및 릴리즈에도 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히, 수용체 결합 도메인은 스파이크 단백질의 수용체인 ACE2와의 결합 및 상호작용에 직접적으로 관여하는 도메인으로 코로나바이러스의 종 간에 고도로 그 서열이 보존되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 또는 수용체 결합 모티프는 현재 보고된 코로나바이러스의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 또는 모티프뿐만 아니라, 유전자에 변이를 포함하는 변종 코로나바이러스의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 또는 모티프 서열일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인은 SARS-CoV-2 유래인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 수용체 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이와 높은 상동성을 나타내는 서열, 예를 들어, 서열번호 1과 80% 이상, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열일 수 있다.
본 발명의 용어, 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스의 유전물질, 코로나바이러스의 경우 RNA를 둘러싸는 캡시드 단백질을 의미한다. 뉴클레오캡시드 단백질은 코로나바이러스에 감염된 세포에서 매우 높은 수준으로 발현이 향상되는 것으로 보고되었으며, 특히 뉴클레오캡시드 단백질의 RNA 결합 도메인은 고도로 보존되는 서열이다. 본 발명에서, 뉴클레오캡시드 단백질은 “N 단백질”과 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 뉴클레오캡시드 단백질 전체뿐만 아니라, 뉴클레오캡시드 단백질의 특정 도메인 또는 절편을 포함하는 의미로 사용되며, 바람직하게는 뉴클레오캡시드 단백질의 RNA 결합 도메인, 또는 이를 포함하는 절편이 이에 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 N 단백질은 서열번호 3의 서열로 표시되거나, 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 N 단백질의 RNA 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 결합 도메인은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “Fc 도메인”은 면역글로불린(immunoglobulin)에서 세포 표면의 수용체 및 보체 시스템의 단백질 등과 상호작용하는 항체의 꼬리영역으로, 중쇄 불변 도메인, CH2 및 CH3를 포함하며, 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 및 이의 변이체를 모두 포함하는 개념으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 포유 동물의 면역글로불린의 Fc 도메인일 수 있으며, 바람직하게는, 마우스, 토끼 또는 인간의 면역글로불린의 Fc 도메인, 더욱 바람직하게는 인간 면역글로불린의 Fc 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG의 Fc 도메인, 이의 단편 혹은 이들의 변형일 수 있고, 바람직하게는 상기 Fc 도메인은 IgG의 Fc 도메인(예, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 도메인)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인일 수 있다. 보다 구체적으로는 각 생물체 유래의 IgG isotype인 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 등에서 유래한 Fc 도메인일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되거나, 이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 Fc 도메인은 당쇄를 포함할 수 있으며, 야생형에 비해 증가 또는 감소된 당쇄를 포함하거나 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 도메인의 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 도메인에서 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는 특징을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질, 및 Fc 도메인을 포함하는 단백질을 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질, 및 Fc 도메인을 포함하는 단백질의 이량체(dimer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이량체는 각 Fc 도메인의 하나 이상의 시스테인 잔기의 이황화 결합을 통해 형성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인, 뉴클레오캡시드 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 단백질의 이종이량체(heterodimer) 또는 동종이량체(homodimer)일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 동종이량체 형태로 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명 명세서에서 언급되는 수용체 결합 도메인, 뉴클레오캡시드 단백질, 및 Fc 도메인 등의 아미노산 서열은, 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체 또는 이의 절편들도 포함하는 의미로 해석된다.
본 명세서에서 “보존적 치환”이란 1개 이상의 아미노산을 해당 단백질의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 변형을 의미한다.
“보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로의 치환을 의미한다. 예를 들어, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
본 발명에서, 상기 수용체 결합 도메인은 수용체 결합 모티프를 중심으로 ACE2와 결합된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 수용체 결합 도메인 모티프 외의 아미노산 서열에 보존적 치환이 발생하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 융합단백질에 포함되는 수용체 결합 도메인, Fc 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질과 같은 각각의 구성은 공유결합 등을 통해 직접적으로 연결될 수 있으며, 다른 분자, 예를 들어 링커를 통해 간접적으로 연결될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인, 뉴클레오캡시드 단백질 및 Fc 도메인은 바람직하게는 글리신-세린 링커(Glycine-Serine Linker, GS 링커), 더욱 바람직하게는 G4S 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 서열번호 5 및/또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 5) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)로 표시되는 링커를 사용하여 Fc 도메인의 C-말단 및/또는 N-말단에, 수용체 결합 도메인(또는 이의 변이체) 또는 SARS-CoV-2 유래의 N 단백질을 연결함으로써, 융합단백질을 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인과 코로나바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질이 Fc 도메인에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 C-말단에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인이 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나의 말단에 연결되고, Fc 도메인의 다른 말단에 뉴클레오캡시드 단백질(N protein)이 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 수용체 결합 도메인이 Fc 도메인의 C-말단에 연결되고, 상기 뉴클레오캡시드 단백질은 Fc 도메인의 N-말단에 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인이 Fc 도메인의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나의 말단에 연결되고, Fc 도메인의 다른 말단에 뉴클레오캡시드 단백질의 RNA 결합 도메인이 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인-Fc 도메인-뉴클레오캡시드 단백질 또는 뉴클레오캡시드 단백질-Fc 도메인-수용체 결합 도메인의 순서로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되거나, 이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 수용체 결합 도메인 및 상기 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)이 연결된 Fc 도메인의 이량체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 '수용체 결합 도메인-Fc 도메인-뉴클레오캡시드 단백질' 및/또는 '뉴클레오캡시드 단백질-Fc 도메인-수용체 결합 도메인' 이 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 '수용체 결합 도메인-Fc 도메인-뉴클레오캡시드 단백질' 및 '뉴클레오캡시드 단백질-Fc 도메인-수용체 결합 도메인'은 각 구성(수용체 결합 도메인, Fc 도메인 및 뉴클레오캡시드 단백질)이 C-말단에서 N-말단으로 순차적으로 연결된 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되거나, 이를 포함하는 단백질의 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 가장 바람직하게는 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 단백질의 동종이량체(homodimer)형태인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용체 결합 도메인과 및 뉴클레오캡시드 단백질은 공유결합을 통해 Fc 도메인에 직접적으로 연결될 수 있으며, 링커, 단백질, 다당체 등의 연결기를 통해 간접적으로 연결될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질을 사용하여 백신 접종하는 경우, 마우스 중화항체 형성 역가 및 T 세포 면역반응의 현저한 향상을 유도할 수 있으며, 바이러스의 감염을 예방하고, 증식을 억제 및 사멸시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스는 코로나바이러스아과(Coronavirinae) 속에 속하는 RNA 바이러스를 의미한다(Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier, Oxford. 806-828쪽). 상기 코로나바이러스아과에는 알파/베타/감마/델타 코로나바이러스의 4개의 속으로 구분될 수 있으며, 예를 들어, 인간에게 감염이 가능한 인간 코로나바이러스로는 SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, HCoV-229E, HCoV-OC43, HKU1, HCoV-NL63 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 SARS-CoV-2 유래의 수용체 결합 도메인 및 RNA 결합 도메인을 융합한 단백질을 제조하였으나, 코로나바이러스는 공통적으로 스파이크 단백질을 보유하고, 이의 숙주세포 내 수용체인 ACE2의 결합으로 숙주의 세포 내로 진입 및 증식하는 것을 특징으로 한다. 특히, 각 종의 S1 서브유닛에 포함된 수용체 결합 도메인은 고도로 보존되어 있는 바, 본 발명의 융합단백질은 SARS-CoV-2 유래의 분자를 포함하는 것으로 한정되지 않음은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질은 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인, 뉴클레오시드 단백질 및 Fc 도메인 외에 다른 분자를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 코로나바이러스 유래 분자(바람직하게는, SARS-CoV-2 유래 분자), 링커, 어쥬번트(adjuvant), 항원, 항체 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 유래 물질은 코로나바이러스 유래의 단백질, 핵산(바람직하게는, RNA), 다당체 등의 코로나바이러스로부터 유래하는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 유래 물질은 코로나바이러스로부터 분리된 단백질, 핵산, 다당체 등 코로나바이러스가 생산 또는 함유하는 모든 물질을 의미한다. 예를 들어, N 단백질, M 단백질, ORF 단백질 등이 있으며, 예를 들어, 본 발명의 융합단백질에 M 단백질이 추가로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 코로나바이러스 유래 물질은 코로나바이러스 유래 단백질 또는 이의 절편일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Fc 도메인의 일 말단(N-말단 또는 C-말단)에 수용체 결합 도메인, 다른 말단에 뉴클레오캡시드 단백질의 RNA 결합 도메인을 연결하여 제조한 융합단백질이 높은 중화항체 형성 역가 및 T 세포 면역반응 유도능을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 융합단백질은 면역원성을 나타내며, 따라서, 중화항체의 형성 유도, 세포독성 T 림프구의 분화 자극, Th 세포의 분화자극 등 체내에서 다양한 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 융합단백질은 수용체 결합 도메인 및 Fc-도메인으로 구성된 융합단백질보다 현저히 높은 중화항체 형성 역가 및 T 세포 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어, “백신 조성물”은 in vivo 또는 in vitro에서 항원 또는 면역원으로 작용하여, 면역반응을 이끌어 낼 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 의미하며, 본 발명에서, “백신” 또는 “면역원성 조성물”과 동일한 의미에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응 및 적응 면역 반응, 예를 들어, 보체 매개 면역 반응, 세포 매개된 (T 세포) 면역 반응 및/또는 항체 (B 세포) 반응을 모두 포함하는 최광의의 개념이다.
본 발명의 백신 조성물은 투여 대상에서 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도 또는 증가시킬 수 있으며, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화항체의 형성, 세포독성 림프구의 분화 등을 유도 및/또는 증가시킬 수 있고, 대상이 SARS-CoV-2에 감염된 환자인 경우, 바이러스의 재활성화 가능성을 예방, 완화, 제거 또는 감소; 및/또는 상기 바이러스의 재활성화와 관련된 다른 질환 또는 합병증을 발생할 가능성을 예방 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “어쥬번트(adjuvant)”는 Alexander Glenny에 의해 aluminum salt가 면역반응을 증가시킨다는 것이 발견되면서 생겨난 개념으로 백신 조성물 또는 백신을 투여하는 대상에서 더 강력한 면역반응을 유도하기 위해 넣는 보조 성분을 의미한다. 예를 들어, 상기 어쥬번트는, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드와 같은 알루미늄 염, MF59 또는 이의 유사체(MF59 like), AS03 또는 이의 유사체(AS03 like), AF03 또는 이의 유사체(AF03 like), SE 또는 이의 유사체(SE like)와 같은 스쿠알렌(squalene) 함유 에멀젼(Emulsion), 칼슘 염, dsRNA 유사체, 지방다당질(Lipopolysaccharide), Lipid A 유사체 (MPL-A, GLA 등), 플라젤린(Flagellin), 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), CpG ODN, 미네랄 오일(mineral oil), 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)의 길항제(agonist), C-형 렉틴 리간드, CD1d 리간드(α-galactosylceramide 등), 계면 활성제(detergent), 리포좀(liposome), QS21과 같은 사포닌(Saponin), 사이토카인(cytokine), 펩타이드 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 어쥬번트로, AddaVax(MF59 like), MPLA, 및 Alum 등을 단독 또는 조합하여 사용하였으며, 모두에서 면역반응이 부스팅되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 어쥬번트는 바람직하게는 MF59, Alum, MPLA, 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것, 보다 바람직하게는 MF59 단독, MPLA 단독, 또는 Alum 및 MPLA 병용으로 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물의 최적의 투여량은 피검체에서 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신화 후, 피검체는 적당한 간격을 두고 1회 또는 수 차례의 부스터 면역화 처리될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 마우스 동물 모델을 대상으로 최초 백신접종 후 2주 후, 추가 백신 접종을 수행하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 “약제학적으로 유효한 양”은 면역반응을 유도 또는 증가시킬 수 있을 정도로 충분하면서도 부작용이나 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있다. "약제학적으로 유효한 양" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed.,Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은, 코로나바이러스 치료제 또는 대증 치료제 등과 동시에 투여될 수 있으며, 다른 백신, 바이러스 치료제, 면역 보조제, 증상 완화제 등과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때의 제형은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, EastonPA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 호흡기 내, 정맥 내, 피하, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 복강 내, 장관, 설하, 구강 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질의 백신 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질의 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질 및/또는 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 감염증에 대한 백신접종(vaccination) 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서, SARS-CoV-2 유래의 수용체 결합 도메인을 사용하였으나, SARS-CoV-1과 같은 바이러스도 보존된 서열(RBM)을 갖는 스파이크 단백질과 ACE2의 결합을 통해 유사한 메커니즘으로 세포에 진입하고, 병증을 나타내기 때문에, 코로나바이러스 감염증 전체의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학 조성물은 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여 시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염증은 SARS-CoV-2 감염증 (COVID-19)인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 다른 코로나바이러스 감염증의 치료용 조성물 또는 치료 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질의 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질, 백신 조성물, 및/또는 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질, 백신 조성물, 및/또는 약학 조성물의 코로나 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산의 단백질 발현을 유도할 수 있는 벡터라면 당업자가 당업계에 공지된 벡터를 적절히 선택하여 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주로 사용할 경우 T7계열 (T7A1, T7A2, T7A3 등), lac, lacUV5, 온도의존형 (λphoA, phoB, rmB, tac, trc, trp 또는 1PL 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있고, 효모를 숙주로 사용할 경우 ADH1, AOX1, GAL1, GAL10, PGK 또는 TDH3 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있으며, 바실러스의 경우 P2 프로모터를 포함하는 벡터를 사용할 수 있으나, 이는 일부 실시 양태를 나열한 것으로, 상기 프로모터를 포함하는 벡터 이외에도 본 발명에 따른 융합단백질의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함하는 벡터로써 숙주에 적합한 것이라면 제한없이, 당업계에 공지된 다양한 벡터를 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 대장균에서 사용되는 단백질 발현 벡터로는 Novagen (미국) 사의 pET 계열; Invitrogen (미국)의 pBAD 계열; Takara (일본)의 pHCE 나 pCOLD; 제노포커스 (대한민국)의 pACE 계열; 등을 사용할 수 있다. 고초균에서는 게놈의 특정부분에 목적 유전자를 삽입하여 단백질 발현을 구현하거나, MoBiTech (독일)의 pHT 계열의 벡터, 등을 사용할 수 있다. 곰팡이나 효모에서도 게놈 삽입이나 자가복제 벡터들 이용하여 단백질 발현이 가능하다. Agrobacterium tumefaciens나 Agrobacterium rhizogenes 등의 T-DNA 시스템을 이용하여 식물용 단백질 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen) 등을 기초로 한다.
"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 상기 기술한 프로모터 이외에도, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ은 E. coli에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(접합)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산; 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 단백질 등을 생산하기 위해, 유전자 또는 재조합 벡터 등이 도입된 발현용 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 본 발명의 융합단백질을 발현할 수 있는 세포라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 진핵세포, 더욱 바람직하게는 효모, 곤충세포, 동물세포, 가장 바람직하게는 동물세포일 수 있다. 예를 들어 융합단백질의 발현에 주로 사용되는 CHO 세포주 또는 HEK 세포주 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 융합단백질을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 사이토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λ과 λNM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
상기 재조합 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝 법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
상기 유전자 및 재조합 벡터는 종래에 공지된 다양한 방법을 통해, 숙주세포에 도입될 수 있다. 본 발명의 융합단백질을 코딩하는 핵산를 코딩하는 유전자가 직접적으로 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.
상기 융합단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우, 융합단백질이 숙주세포에서 발현되기에 충분한 기간 동안, 또는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 융합단백질이 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
경우에 따라서, 발현된 융합단백질은 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제하여 수득될 수 있다. 상기 융합단백질의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피에서 선택된 하나 이상의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서는 특정 아미노산 서열 및 염기 서열을 기재하였으나, 본 발명에서 실시하고자 하는 효소와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기 서열이 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 실질적으로 동일하다는 것은, 아미노산 또는 염기서열의 상동성이 매우 높은 경우를 포함하고, 그 밖에도 서열의 상동성과는 무관하게 구조적 특징을 공유하거나 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵심을 구성하는 서열을 제외한 다른 서열이 일부 결실된 단백질 또는 이를 코딩하는 염기서열의 단편도 본 발명에 포함될 수 있으며, 따라서 본 발명은 단편의 길이와는 무관하게 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 아미노산 또는 염기 서열을 모두 포함한다.
실시예
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 융합단백질 제조
수용체 결합 도메인(RBD), 뉴클레오캡시드 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질의 ACE2 결합능력 및 면역원성을 평가하기 위해, 도 3과 같이 대조군 및 실험군을 설정하여, 융합단백질을 제작하였다(도 4 내지 도 9). 상기 융합단백질을 생산하기 위하여, 하기 표 1의 야생형 RBD 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질(N 단백질)의 RNA결합 도메인, IgG1 Fc 도메인, 링커 및 신호서열을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 Integrated DNA Technologies 사의 gBlock gene fragments 서비스를 통해 합성하여 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.
각 구성의 아미노산 서열
구분 아미노산 서열 서열 번호
야생형 RBD RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK 1
IgG1 Fc 도메인 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 2
N 단백질
(전장 서열)		 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA 3
N 단백질
(RNA 결합 도메인)		 RSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSR 4
Linker1 GGGGSGGGGSGGGGS 5
Linker2 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 6
신호펩타이드 MKWVTFISLLFLFSSAYS 7
각 구성의 DNA 서열
구분 DNA 서열 서열 번호
야생형 RBD agagttcagcctaccgagtccatcgtgcggttccccaacatcaccaacctgtgtcctttcggcgaggtgttcaacgctaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcaggggcgacgaagttcggcagatcgctcctggacagaccggcaagatcgccgactacaattacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggctggcagcaccccttgcaatggcgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctaccagccttatagagtggtggtgctgtccttcgagctgctgcatgctcctgctaccgtgtgcggccctaagaaatctaccaacctggtcaagaacaag 8
IgG1 Fc 도메인 gaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggc 9
N 단백질
(전장 서열)		 atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaagccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaa 10
N 단백질
(RNA 결합 도메인)		 cggtctaagcagagaaggcctcagggcctgcctaacaataccgcctcctggtttaccgctctgacccagcacggcaaagaggacctgaagttccctagaggacagggcgtgcccatcaacaccaactctagccctgacgaccagatcggctactacagacgggccaccagaagaatcagaggcggcgacggcaagatgaaggacctgtctcctcggtggtacttctactacctcggcaccggaccagaggctggattgccttatggcgccaacaaggacggcatcatctgggttgcaacagagggcgctctgaacacccctaaggaccacatcggcacccggaatcctgccaacaatgctgccattgtgctgcagctgccacagggcacaacactgcctaagggcttttacgccgagggctctagaggcggctctcaggcctcttccagatcctccagtagatcacgt 11
Linker1 ggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttct 12
Linker2 ggtggcggcggttcaggcggcggtggaagtggcggtggcggatctggcggaggtggtagt 13
신호펩타이드 atgaaatgggtcacctttatctccctgctgttcctgttctcctccgcctactct 14
상기 제작한 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 각각의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 5%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다.
Mabselect Xtra resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 각각의 융합단백질을 정제하였다. Thermo 사의 Protein A binding buffer를 이용하여 평형을 수행하였다. 이후 0.22 μm필터로 여과한 상등액을 컬럼에 로딩하고 resin 볼륨의 10배에 해당하는 Protein A binding buffer를 이용하여 컬럼을 세척하였다. 이후 Thermo 사의 IgG elution buffer를 넣어 용출하였다. pH 9의 1M Tris-HCl이 20%가 되도록 수거용 튜브에 넣은 후 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질은 투석을 통하여 PBS 버퍼로 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하고 214 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루로 염색하여 생성을 확인하였다.
제조된 융합단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 다음 표 3 및 표 4와 같다.
구분 아미노산 서열 서열 번호
IgG1 Fc GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 15
RBDwt-Fc RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKGGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16
Fc-RBDwt GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK 17
N-Fc RSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 18
GIC-1114 RSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK 19
GIC-1114N RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKGGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSR 20
구분 DNA 서열 서열 번호
IgG1 Fc ggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggc 21
RBDwt-Fc agagttcagcctaccgagtccatcgtgcggttccccaacatcaccaacctgtgtcctttcggcgaggtgttcaacgctaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcaggggcgacgaagttcggcagatcgctcctggacagaccggcaagatcgccgactacaattacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggctggcagcaccccttgcaatggcgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctaccagccttatagagtggtggtgctgtccttcgagctgctgcatgctcctgctaccgtgtgcggccctaagaaatctaccaacctggtcaagaacaagggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggc 22
Fc-RBDwt ggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggcggtggcggcggttcaggcggcggtggaagtggcggtggcggatctggcggaggtggtagtagagttcagcctaccgagtccatcgtgcggttccccaacatcaccaacctgtgtcctttcggcgaggtgttcaacgctaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcaggggcgacgaagttcggcagatcgctcctggacagaccggcaagatcgccgactacaattacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggctggcagcaccccttgcaatggcgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctaccagccttatagagtggtggtgctgtccttcgagctgctgcatgctcctgctaccgtgtgcggccctaagaaatctaccaacctggtcaagaacaag 23
N-Fc cggtctaagcagagaaggcctcagggcctgcctaacaataccgcctcctggtttaccgctctgacccagcacggcaaagaggacctgaagttccctagaggacagggcgtgcccatcaacaccaactctagccctgacgaccagatcggctactacagacgggccaccagaagaatcagaggcggcgacggcaagatgaaggacctgtctcctcggtggtacttctactacctcggcaccggaccagaggctggattgccttatggcgccaacaaggacggcatcatctgggttgcaacagagggcgctctgaacacccctaaggaccacatcggcacccggaatcctgccaacaatgctgccattgtgctgcagctgccacagggcacaacactgcctaagggcttttacgccgagggctctagaggcggctctcaggcctcttccagatcctccagtagatcacgtggcggcggaggatccggtggtggtggatctggtggcggaggctctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggc 24
GIC-1114 cggtctaagcagagaaggcctcagggcctgcctaacaataccgcctcctggtttaccgctctgacccagcacggcaaagaggacctgaagttccctagaggacagggcgtgcccatcaacaccaactctagccctgacgaccagatcggctactacagacgggccaccagaagaatcagaggcggcgacggcaagatgaaggacctgtctcctcggtggtacttctactacctcggcaccggaccagaggctggattgccttatggcgccaacaaggacggcatcatctgggttgcaacagagggcgctctgaacacccctaaggaccacatcggcacccggaatcctgccaacaatgctgccattgtgctgcagctgccacagggcacaacactgcctaagggcttttacgccgagggctctagaggcggctctcaggcctcttccagatcctccagtagatcacgtggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggcggtggcggtggaagcggaggtggcggatctggtggcggaggtagtggcggaggcggatctagagttcagcctaccgagtccatcgtgcggttccccaacatcaccaacctgtgtcctttcggcgaggtgttcaacgctaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcaggggcgacgaagttcggcagatcgctcctggacagaccggcaagatcgccgactacaattacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggctggcagcaccccttgcaatggcgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctaccagccttatagagtggtggtgctgtccttcgagctgctgcatgctcctgctaccgtgtgcggccctaagaaatctaccaacctggtcaagaacaag 25
GIC-1114N agagttcagcctaccgagtccatcgtgcggttccccaacatcaccaacctgtgtcctttcggcgaggtgttcaacgctaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatctctaactgcgtggccgactactccgtgctgtacaactctgcctccttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactccttcgtgatcaggggcgacgaagttcggcagatcgctcctggacagaccggcaagatcgccgactacaattacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcttggaactccaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcctttcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggctggcagcaccccttgcaatggcgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctaccagccttatagagtggtggtgctgtccttcgagctgctgcatgctcctgctaccgtgtgcggccctaagaaatctaccaacctggtcaagaacaagggcggcggaggatccggcggtggtggttccggcggaggcggttctgaacctaagtcctccgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgtttctgttcccacctaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccatctcgggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtatagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgttctgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagtctgtccttgagcccgggcggtggcggtggaagcggaggtggcggatctggtggcggaggtagtggcggaggcggatctcggtctaagcagagaaggcctcagggcctgcctaacaataccgcctcctggtttaccgctctgacccagcacggcaaagaggacctgaagttccctagaggacagggcgtgcccatcaacaccaactctagccctgacgaccagatcggctactacagacgggccaccagaagaatcagaggcggcgacggcaagatgaaggacctgtctcctcggtggtacttctactacctcggcaccggaccagaggctggattgccttatggcgccaacaaggacggcatcatctgggttgcaacagagggcgctctgaacacccctaaggaccacatcggcacccggaatcctgccaacaatgctgccattgtgctgcagctgccacagggcacaacactgcctaagggcttttacgccgagggctctagaggcggctctcaggcctcttccagatcctccagtagatcacgt 26
실시예 2: 마우스에서, 본 발명의 융합단백질을 이용한 백신 접종 시 면역 반응 확인
실시예 4-1: 마우스의 준비 및 백신접종(vaccination)
실시예 1에서 제조한 융합단백질의 면역원성을 평가하기 위한 동물실험에 사용된 마우스 및 사용된 융합단백질은 아래 표 5와 같다.
각 융합단백질의 분자량을 고려하여 동일한 몰수를 갖도록 투여량을 고려하였다(IgG1 Fc: 54kDa, GIC-1114(N-Fc-RBDwt): 140kDa, Fc-RBDwt: 105.5kDa, N-Fc: 87.7 kDa). 대퇴근을 통한 근육 내 투여(Intramuscular injection)경로로 투여하였으며, 1차 접종 2주 뒤 융합단백질을 추가 접종(2차 접종)하였다. 투여 4주차에 각 개체의 복대정맥을 통해 채혈하여 혈청을 분리하고 초저온 냉동고에 보관하였다. 또한, 4주차에 각 개체의 비장을 적출하고 RPMI1640 medium + 10% FBS로 혼합하여 15mL conical 튜브에 넣어 ice cold 상태로 준비하였다.
실시예 4-2: 중화항체 형성 확인
실시예 4-1에서 채취한 혈청의 마우스 중화항체 형성 역가를 확인하기 위해, ELISA를 수행하였다. 구체적으로, 1X PBS(10X PBS(Welgene, ML 008-02) 1:10 희석)에 SARS-CoV-2(COVID-19) S protein RBD(ACRO biosystem, SPD-C53H3) 또는 Human recombinant IgG1 protein(Sinobiologics, 10702-HNAH)를 희석하여 96 웰 플레이트(Biolegend, 423501)에 100μl (500ng/well)씩 넣은 뒤, 접착 필름(adhesive plastic)으로 덮고 4℃에서 오버나잇(overnight) 배양하였다.
1X ELISA Assay diluent(5X ELISA Assay diluent(Biolegend, 421203), 1X PBS 희석)을 각 플레이트의 웰에 100μL씩 첨가하고 100rpm 속도로 쉐이킹(shaking)하면서 상온에서 2시간 동안 정치하였다. 각 플레이트의 상층액을 제거하고, 세척 버퍼 (0.05% of Tween20(Sigma, P7949) in 1X PBS)를 200μL씩 첨가하여 각 웰을 2회 세척하였다. 각 마우스로부터 채취한 혈청 2μL에 1X ELISA Assay diluent 254μL를 넣어 1차 희석한 후(1:128), 이를 1:2 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 비율로 추가로 연속 희석(serial dilution)하여 각 웰당 100μL 첨가한 뒤, 100rpm 속도로 쉐이킹(shaking) 하면서 상온에서 2시간동안 정치하였다. 희석한 검체를 제거하고 200μL의 세척버퍼로 3회 세척하였다. Goat anti-mouse IgG (H+L) Ab (Invitrogen, 31430) 희석액(1X ELISA Assay diluent, 1:10000)을 각 웰에 100μL 첨가하고 차광된 상태로 100rpm 속도로 쉐이킹(shaking)하면서 상온에서 1시간 30분동안 배양하였다. 상층액을 제거한 뒤, 200μL의 세척버퍼로 5회 세척하였다. TMB solution(Biolegend, 421101)을 각 웰당 100μL씩 넣은 후, 상온에서 1분간 반응시키고 Stop solution(Biolegend, 77316)을 각 웰당 100μL씩 넣어 반응을 정지시켰다. 각 시료를 ELISA reader(Molecular device, SpectraMax iD3)를 사용해 450 nm에서 OD 값을 측정하여 중화항체 형성 역가를 확인하였다.
도 11에 도시한 바와 같이, 어쥬번트가 첨가되지 않은 융합단백질로 백신접종을 실시한 경우, 야생형 RBD, 뉴클레오캡시드 및 Fc 단백질을 포함하는 융합단백질(GIC-1114)를 투여하는 경우에만 높은 항체 RBD 특이적 IgG 역가(titer)를 나타내는 것을 확인하였다. IgG1 Fc 단독 또는 Fc-RBDwt 융합단백질을 어쥬번트 없이 접종한 경우에는 유의미한 수준의 중화 항체가 생성되지 않았다.
또한, 어쥬번트를 병용 투여하여 면역반응을 부스팅하는 경우에 각 중화항체 형성 역가가 향상되었다. 어쥬번트를 병용 투여하는 경우에는 Fc-RBDwt 융합단백질에서 RBD에 대한 중화항체가 형성되었으나, GIC-1114 융합단백질을 처리하는 경우에, 현저하게 높은 중화항체 형성 역가를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과는, 본 발명의 RBD, N 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질(GIC-1114)이 RBD와 Fc 도메인의 융합단백질보다 현저하게 높은 수준의 면역원성을 나타낼 수 있음을 의미한다.
실시예 4-3: T 세포 면역반응 유도효과 확인
셀 스트레이너(Cell strainer)를 50mL 코니칼 튜브에 위치시키고 1X PBS(Welgene, ML 008-02) 5mL을 부어 충분히 적셔주었다. 마우스에서 얻은 비장을 셀 스트레이너 안에 넣고 5mL 실린지 밀대(Piston)의 고무패킹 부분을 이용하여 비장의 덩어리가 없어질 때까지 으깬 후, 1X PBS 20mL을 천천히 부어 셀 스트레이너에 남은 세포를 모두 수확하였다. 50mL 코니칼 튜브에 수확된 세포를 1500rpm, 4℃ 조건으로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 세포를 가볍게 탭핑(Tapping)하여 뭉쳐있는 세포를 풀어 ACK lysing buffer(Lonza, Cat# 10-548E)를 1mL 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 반응물을 1X PBS를 4mL 넣어주고 1500rpm, 4℃ 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고, R10 media(RPMI 1640(Welgene, Cat# LM011-01) with 10% FBS(Hyclone, Cat# SY30208.02)와 1% Antibiotics(Corning, Cat# 30-004-CI), IL-2(Novatis, proleukin) 10 IU)를 6mL넣어 세포를 현탁시킨 후, ADAM cell counter(Cat# ADAM-MC2)로 세포 수를 측정하였다. 96-웰 플레이트(96-well-plate)에 각 웰(Well)당 1 x 106 세포 수가 되도록 R10 media에 현탁하여 분주하고, T 세포 자극 항원 (Fc, N-Fc)를 각 웰 당 100nM/mL이 되도록 분주하여 각 웰의 최종 볼륨(Volume)이 200μL가 되도록 하였다. 세포를 인큐베이터에 37℃, 5% CO2 조건에서 72시간동안 배양한 뒤, 1500rpm, 4℃ 조건으로 5분간 원심분리하고 상층액을 수확하여 -80℃ 이하에 보관하였다.
Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD, Cat# 560485)의 Mouse Th1/Th2/Th17 사이토카인 캡쳐(Capture) 비드(Bead)를 3내지 5초 동안 볼텍싱하였다. 필요한 샘플수를 계산하고, 각 well에 20μL가 분주될 수 있도록, Mouse Th1/Th2/Th17 사이토카인 캡쳐(Capture) 비드(Bead) 7종을 혼합하였다. 혼합된 캡처 비드를 볼텍싱하고, 96-웰 플레이트의 모든 분석 웰에 20μL씩 분주하였다. 스탠다드 희석액(Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD, Cat# 560485), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256) 및 음성 대조군 용액을 96-웰 플레이트에 20μL씩 각각 분주하고, 상기 -80℃ 이하에 보관되어 있던 마우스에서 채취한 비장 세포 상층액 샘플을 각 웰에 20μL씩 분주하였다. Th1/Th2/Th17 PE Detection Reagent를 20μL 첨가하고 차광된 상태로 2시간 상온에서 반응시켰다. 2시간이 경과한 후, 세척액(Wash buffer)을 각 웰에 200μL씩 분주하고, 1500rpm, 4℃ 조건으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세척 버퍼 100μL로 비드 펠렛을 현탁하여 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 사이토카인 분비능을 확인하였다.
도 12에 도시한 바와 같이, GIC-1114으로 백신 접종한 마우스 비장의 T 세포는 SARS-CoV-2 유래의 N 단백질(N-Fc)로 자극 시, 높은 IFN-γ 수준을 나타내며, 특히, 어쥬번트를 사용한 경우에는 면역 부스팅 효과가 다른 융합단백질(Fc-RBD 또는 N-Fc)을 처리한 경우보다 IFN-γ 수준이 현저히 향상되었다. 이는 본 발명의 RBD, Fc 및 N 단백질을 포함하는 융합단백질이 코로나바이러스 특이적 세포독성 T 세포의 활성화를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GI Cell, Inc. <120> Fusion Protein comprising a Receptor Binding Domain Derived From Coronavirus and Nucleocapsid Protein, and Uses Thereof <130> P21-B020 <150> KR 2020-0113989 <151> 2020-09-07 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type RBD <400> 1 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 210 215 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc domain <400> 2 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 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gttcccacct aagccaaagg acaccctgat gatcagcaga 120 acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtctcacg aggaccccga agtgaagttc 180 aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 240 tacaactcca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 300 ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgctcctat cgaaaagacc 360 atctccaagg ccaagggcca gcctagggaa ccccaggttt acacactgcc tccatctcgg 420 gacgagctga ccaagaatca ggtgtccctg acctgtctgg tcaagggctt ctacccttcc 480 gatatcgccg tggaatggga gagcaatggc cagcctgaga acaactacaa gacaacccct 540 cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtatagca agctgacagt ggacaagtcc 600 cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660 tacacccaga agagtctgtc cttgagcccg ggc 693 <210> 10 <211> 1260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N protein_Full DNA sequence <400> 10 atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60 tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120 cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180 aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300 atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360 cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420 acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660 ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780 aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840 caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900 tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960 ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020 gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140 gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200 gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260 1260 <210> 11 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N protein_RNA binding domain_DNA sequence <400> 11 cggtctaagc agagaaggcc tcagggcctg cctaacaata ccgcctcctg gtttaccgct 60 ctgacccagc acggcaaaga ggacctgaag ttccctagag gacagggcgt gcccatcaac 120 accaactcta gccctgacga ccagatcggc tactacagac gggccaccag aagaatcaga 180 ggcggcgacg gcaagatgaa ggacctgtct cctcggtggt acttctacta cctcggcacc 240 ggaccagagg ctggattgcc ttatggcgcc aacaaggacg gcatcatctg ggttgcaaca 300 gagggcgctc tgaacacccc taaggaccac atcggcaccc ggaatcctgc caacaatgct 360 gccattgtgc tgcagctgcc acagggcaca acactgccta agggctttta cgccgagggc 420 tctagaggcg gctctcaggc ctcttccaga tcctccagta gatcacgt 468 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker1_DNA sequence <400> 12 ggcggcggag gatccggcgg tggtggttcc ggcggaggcg gttct 45 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker2_DNA sequence <400> 13 ggtggcggcg gttcaggcgg cggtggaagt ggcggtggcg gatctggcgg aggtggtagt 60 60 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide_DNA sequence <400> 14 atgaaatggg tcacctttat ctccctgctg ttcctgttct cctccgccta ctct 54 <210> 15 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein_IgG1 Fc <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25 30 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 85 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cggtctaagc agagaaggcc tcagggcctg cctaacaata ccgcctcctg gtttaccgct 60 ctgacccagc acggcaaaga ggacctgaag ttccctagag gacagggcgt gcccatcaac 120 accaactcta gccctgacga ccagatcggc tactacagac gggccaccag aagaatcaga 180 ggcggcgacg gcaagatgaa ggacctgtct cctcggtggt acttctacta cctcggcacc 240 ggaccagagg ctggattgcc ttatggcgcc aacaaggacg gcatcatctg ggttgcaaca 300 gagggcgctc tgaacacccc taaggaccac atcggcaccc ggaatcctgc caacaatgct 360 gccattgtgc tgcagctgcc acagggcaca acactgccta agggctttta cgccgagggc 420 tctagaggcg gctctcaggc ctcttccaga tcctccagta gatcacgtgg cggcggagga 480 tccggcggtg gtggttccgg cggaggcggt tctgaaccta agtcctccga caagacccac 540 acctgtcctc catgtcctgc tccagaactg ctcggcggac cttccgtgtt tctgttccca 600 cctaagccaa aggacaccct gatgatcagc agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg 660 gatgtgtctc acgaggaccc cgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 720 cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa cagtacaact ccacctacag agtggtgtcc 780 gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 840 aacaaggccc tgcctgctcc tatcgaaaag accatctcca aggccaaggg ccagcctagg 900 gaaccccagg tttacacact gcctccatct cgggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc 960 ctgacctgtc tggtcaaggg cttctaccct tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat 1020 ggccagcctg agaacaacta caagacaacc cctcctgtgc tggactccga cggctcattc 1080 ttcctgtata gcaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1140 tgttctgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagtct gtccttgagc 1200 ccgggcggtg gcggtggaag cggaggtggc ggatctggtg gcggaggtag tggcggaggc 1260 ggatctagag ttcagcctac cgagtccatc gtgcggttcc ccaacatcac caacctgtgt 1320 cctttcggcg aggtgttcaa cgctaccaga ttcgcctctg tgtacgcctg gaaccggaag 1380 cggatctcta actgcgtggc cgactactcc gtgctgtaca actctgcctc cttcagcacc 1440 ttcaagtgct acggcgtgtc ccctaccaag ctgaacgacc tgtgcttcac caacgtgtac 1500 gccgactcct tcgtgatcag gggcgacgaa gttcggcaga tcgctcctgg acagaccggc 1560 aagatcgccg actacaatta caagctgccc gacgacttca ccggctgcgt gatcgcttgg 1620 aactccaaca acctggactc caaagtcggc ggcaactaca actacctgta ccggctgttc 1680 cggaagtcca acctgaagcc 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1380 tccttgagcc cgggcggtgg cggtggaagc ggaggtggcg gatctggtgg cggaggtagt 1440 ggcggaggcg gatctcggtc taagcagaga aggcctcagg gcctgcctaa caataccgcc 1500 tcctggttta ccgctctgac ccagcacggc aaagaggacc tgaagttccc tagaggacag 1560 ggcgtgccca tcaacaccaa ctctagccct gacgaccaga tcggctacta cagacgggcc 1620 accagaagaa tcagaggcgg cgacggcaag atgaaggacc tgtctcctcg gtggtacttc 1680 tactacctcg gcaccggacc agaggctgga ttgccttatg gcgccaacaa ggacggcatc 1740 atctgggttg caacagaggg cgctctgaac acccctaagg accacatcgg cacccggaat 1800 cctgccaaca atgctgccat tgtgctgcag ctgccacagg gcacaacact gcctaagggc 1860 ttttacgccg agggctctag aggcggctct caggcctctt ccagatcctc cagtagatca 1920 cgt 1923

Claims (18)

  1. SARS-CoV-2 유래 수용체 결합 도메인(Receptor Binding Domain), 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein) 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질로,
    상기 수용체 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 서열로 구성되고,
    상기 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 4로 표시되는 서열로 구성되며,
    상기 Fc 도메인은 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이고,
    상기 융합 단백질은 이량체이며,
    상기 수용체 결합 도메인은 Fc 도메인의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나에 연결되고, 다른 하나의 말단에 뉴클레오캡시드 단백질이 연결된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 2로 표시되는 서열로 구성되는것을 특징으로 하는 융합단백질.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 또는 제5항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 COVID-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 어쥬번트(adjuvants)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 어쥬번트(adjuvants)는 알루미늄 염, 스쿠알렌(squalene) 함유 에멀젼(Emulsion), 칼슘 염, dsRNA 유사체, 지방다당질(Lipopolysaccharide), Lipid A 유사체, 플라젤린(Flagellin), 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), CpG ODN, 미네랄 오일(mineral oil), 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)의 길항제(agonist), C-형 렉틴 리간드, CD1d 리간드, 계면 활성제(detergent), 리포좀(liposome), 사포닌(Saponin), 사이토카인(cytokine), 및 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 제1항 또는 제5항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
  16. 제15항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  17. 제1항 또는 제5항의 융합단백질을 코딩하는 핵산; 또는
    상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 도입된 단리된 숙주세포.
  18. 제17항의 단리된 숙주세포를 배양하여 융합단백질을 생산하는 단계; 및
    상기 생산된 융합단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법.
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