CN111474350B

CN111474350B - 一种检测冠状病毒s1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法

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Publication number: CN111474350B
Application number: CN202010326421.9A
Authority: CN
Inventors: 国鹏; 张建国; 王兆山
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: CN111474350A

Abstract

本发明提供了一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法，属于抗原检测技术领域。检测冠状病毒S1抗原的试剂盒，包括ACE2蛋白、血管紧张素Ⅱ、丙酮和三氟乙酸。本发明基于冠状病毒的S1蛋白结合ACE2后，在一定配比范围内ACE2水解血管紧张素Ⅱ的活性会升高，但配比极限，ACE2水解血管紧张素Ⅱ的活性会降低的原理制备所述试剂盒。所述试剂盒在非诊断目的的检测冠状病毒S1抗原中的应用，具有高效快速、检测灵敏度高的特点。

Description

一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法

技术领域

本发明属于抗原检测技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法。

背景技术

ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)是表达在人体细胞膜表面的血管紧张素转换酶，也是冠状病毒S蛋白的重要受体。ACE2通过与S蛋白结合来诱导其构象改变，从而暴露穿膜的有效结构域，介导病毒与宿主细胞发生膜融合。

现有的冠状病毒检测方法主要是针对核酸和抗体，其检测灵敏度和时长并不是很理想。而抗原的检测方案也非常少，极少数面世的试剂盒也仅仅是利用单克隆抗体进行ELISA检测，时间较长，灵敏度也受限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法，具有检测速度快、检测灵敏度高的特点。

本发明提供了一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒，包括以下试剂：ACE2蛋白、血管紧张素Ⅱ、丙酮和三氟乙酸。

优选的，ACE2蛋白水溶液的工作浓度为0.02～0.03pmol/L。

优选的，血管紧张素Ⅱ水溶液的工作浓度为10mg/ml。

优选的，丙酮的纯度大于99％。

优选的，三氟乙酸水溶液的工作体积百分含量为0.2％。

本发明提供了所述试剂盒在非诊断目的的检测冠状病毒S1抗原中的应用。

优选的，所述冠状病毒包括2019-nCoV、SARS-CoV和MERS-CoV。

优选的，所述试剂盒检测2019-nCoV病毒中S1抗原的灵敏度为0.06fmol/L；

所述试剂盒检测SARS-CoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度为0.6fmol/L；

所述试剂盒检测MERS-CoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度为0.6fmol/L。

优选的，待检测冠状病毒S1抗原时，检测浓度为6fmol/L～0.06fmol/L。

本发明提供了所述试剂盒非诊断目的的检测冠状病毒S1抗原的方法，包括以下步骤：

1)分别取10μl 0.02～0.03pmol/L的ACE2蛋白水溶液加入离心管A1、A2、A3和A4中；

2)取10μl S1蛋白阴性样品加入离心管A1中；取10μl待检测样品加入离心管A2中；将待检测样品经10倍稀释后，取10μl加入离心管A3中；将待检测样品100倍稀释后，取10μl加入离心管A4中；

3)分别取10μl 10mg/ml血管紧张素Ⅱ水溶液加入离心管A1、A2、A3、A4中，混合5min后，各加入500μl丙酮终止反应；

4)将离心管A1、A2、A3、A4离心，去除上清液；

5)分别取50μl体积百分含量0.2％三氟乙酸水溶液加入离心管A1、A2、A3和A4中混合，离心，将离心管A1中的上清转移到离心管B1中，离心管A2中的上清转移到离心管B2中，离心管A3中的上清转移到离心管B3中，离心管A4中的上清转移到离心管B4中；

6)分别将离心管B1、B2、B3、B4中的上清液进行分光光度测定，在波长257nm下记录光吸收值；

7)将对照样品和3个待检测样品在257nm处的光吸收值进行Unpaired t检验，若测试样品B2的光吸收值比B1样品低，且有显著性差异，而测试样品B3和/或B4的光吸收值比B1样品高，且有显著性差异，则说明待检测样本中含有冠状病毒S1抗原。

优选的，步骤2)中在离心管A2加入待检测样品前或向离心管A3和A4加入稀释检测样品前，还包括对待检测样品进行10～10¹⁵倍稀释。

本发明提供的检测冠状病毒S1抗原的试剂盒，包括ACE2蛋白、血管紧张素Ⅱ、丙酮和三氟乙酸四种试剂。所述试剂盒的检测原理是根据冠状病毒S1蛋白结合ACE2后，ACE2的活性发生变化，在一定分子比范围之内(ACE2：S1在1:40到1:400之间)ACE2水解血管紧张素Ⅱ的活性会升高，但超过此极限(小于1：400)ACE2水解血管紧张素Ⅱ的活性会降低。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有以下特点：(1)抗原检测灵敏度达到核酸检测水平，现有的冠状病毒核酸检测技术的灵敏度是200copies/ml；冠状病毒抗体、抗原检测技术的灵敏度是通常不如核酸检测；而本方法和试剂盒检测2019-nCoV冠状病毒的灵敏度可达到0.06fmol/L，换算成病毒颗粒约180copies/ml，达到核酸检测的灵敏度；

(2)检测效率高，现有的冠状病毒核酸检测技术、抗体检测技术的检测时长最快约15min；抗原检测技术的检测时长最快约60min；而试剂盒检测冠状病毒的时长在10min左右，因此所述试剂盒能有效提高检测效率；

(3)检测范围广，现有的冠状病毒核酸检测技术、抗体检测技术、抗原检测技术只是针对特定的冠状病毒，一旦病毒发生变异或者出现新的冠状病毒，这些技术不能适用，都需要去更新改进；而本发明提供的试剂盒检测冠状病毒的种类没有局限性，只要冠状病毒是通过其S1蛋白与ACE2结合，该检测试剂盒即能实现检测。

附图说明

图1为重组ACE2蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2为含N-S1的重组质粒的PCR产物的电泳图；

图3为纯化的N-S1蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图4为不同浓度N-S1蛋白的检测结果柱状图；

图5为包含SA-S1的重组质粒PCR产物的电泳图；

图6为纯化的SA-S1蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图7为不同浓度的SA-S1蛋白的检测结果柱状图；

图8为不同浓度ME-S1蛋白的检测结果柱状图。

具体实施方式

在本发明中，所述试剂盒包括ACE2蛋白。所述ACE2蛋白的作用是与待检测样品中冠状病毒S1抗原结合。在所述试剂盒中，所述ACE2蛋白以溶液的形式存在。当稀释ACE2蛋白溶液时，用稀释液(1.2mmol/L DDM，2mmol/LZnCl₂，1％Glycerol)稀释至工作浓度使用。所述工作浓度依赖ACE2蛋白的纯度而发生变化。所述ACE2蛋白来源于人。所述ACE2蛋白通过体外重组表达得到，所述ACE2蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，载体的序列如SEQ ID No.3所示。本发明涉及的ACE2蛋白，其制备方法参见专利名称为LRR受体激酶-PXY的纯化方法、申请号为201810525064.1的专利。当重组ACE2蛋白的纯度为3％，ACE2蛋白水溶液的工作浓度优选为0.02～0.03pmol/L，更优选为0.23pmol/L。本发明涉及的ACE2蛋白是大肠杆菌表达的完整形式的水溶性膜蛋白；而商业化ACE2蛋白通常是真核生物表达的没有跨膜区、只有胞外区的可溶性蛋白。最近文章报道，ACE2膜蛋白是以二聚体形式存在，一个是张开状态，另一个是关闭状态；而商业化ACE2蛋白是单体状态。它们在冠状病毒S1抗原结合后的活性会有明显差异。本发明涉及的ACE2蛋白结合冠状病毒S1抗原结后，聚集状态可能会变化，活性会变化；而商业化ACE2蛋白结合冠状病毒S1抗原结后，没有聚集状态的变化和活性变化(有些文章报道体外纯化的没有跨膜区、只有胞外区的ACE2蛋白没有活性)。

在本发明中，所述试剂盒包括血管紧张素Ⅱ。所述血管紧张素Ⅱ的作用是体系中ACE2蛋白与冠状病毒S1抗原结合后，作为ACE2蛋白的水解底物存在。通过水解血管紧张素Ⅱ后，测定体系中剩余血管紧张素Ⅱ的光吸收值。血管紧张素Ⅱ水溶液的工作浓度优选为10mg/ml。本发明对所述血管紧张素Ⅱ的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的血管紧张素Ⅱ即可。在本发明实施例中，所述血管紧张素Ⅱ购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

在本发明中，所述试剂盒包括丙酮。丙酮的作用是沉淀所有蛋白和多肽的同时，溶解ACE2蛋白水解血管紧张素Ⅱ时切下来的苯丙氨酸。丙酮的工作浓度优选为大于99％。本发明对所述丙酮的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的丙酮即可。在本发明实施例中，所述丙酮购自北京化工厂有限责任公司。丙酮不可替换为其他有机溶剂实现终止反应。

在本发明中，所述试剂盒包括三氟乙酸。三氟乙酸的作用是溶解已经沉淀的血管紧张素Ⅱ。三氟乙酸水溶液的工作体积百分含量优选为0.2％。本发明对所述三氟乙酸的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的三氟乙酸即可。在本发明实施例中，所述三氟乙酸购自上海麦克林生化科技有限公司。

在本发明中，所述冠状病毒优选包括2019-nCoV、SARS-CoV和MERS-CoV。所述试剂盒检测2019-nCoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度优选为0.06fmol/L，换算成病毒颗粒约180copies/ml；所述试剂盒检测SARS-CoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度优选为0.6fmol/L，换算成病毒颗粒约1800copies/ml；所述试剂盒检测MERS-CoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度优选为0.6fmol/L，换算成病毒颗粒约1800copies/ml。

在本发明中，待检测冠状病毒S1抗原的浓度优选为6fmol/L～0.06fmol/L。所述应用，包括在实验室条件下以科研目的开展的检测冠状病毒S1抗原。

3)分别取10μl 10mg/ml血管紧张素Ⅱ水溶液加入离心管A1、A2、A3、A4中，混合5min后，各加入500μl丙酮来终止反应；

4)将离心管A1、A2、A3、A4离心，去除上清液；

在本发明中，所述S1蛋白阴性样品为不含S1蛋白的样本，包括健康人的体液。待检测样品包括疑似冠状病毒感染者的体液。所述体液包括咽拭子溶液、唾液、眼泪等。

在本发明中，在离心管A2加入待检测样品前或向离心管A3和A4加入稀释检测样品前，优选还包括对待检测样品进行10～10¹⁵倍稀释，所述稀释的具体倍数没有限制，以实现步骤7)中检测结果为准。

在本发明中，每个离心管B1、B2、B3、B4中的上清液进行分光光度测定的次数优选为3次，求3次测定结果的平均值。

在本发明中，步骤4)中离心的转速优选为14000rpm，离心的时间为1min。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

ACE2蛋白的制备和试剂的配制。

1.重组ACE2蛋白的生产和纯化

重组ACE2蛋白的纯化方法参照专利《LRR受体激酶-PXY的纯化方法》(申请号：201810525064.1)。将pHUE空载体去除His-Ubiquitin标签蛋白对应的核苷酸序列，构建对应的含去掉ACE2信号肽的CDS表达载体。pHUE空载体去除His-Ubiquitin标签蛋白后对应的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。ACE2蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。将构建的重组载体转入大肠杆菌感受态中，涂布卡那选择培养基平板。挑选阳性克隆摇菌进行重组表达ACE2，得到ACE2溶液。

2.ACE2蛋白的定量

a.氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

b.分子量：90876.19。

c.吸光值：1.878(g/L)。

d.用分光光度计测280nm处的吸光值，测量值为1.18mg/ml。

e.换算：ACE2浓度＝1.18/1.878＝0.63mg/ml；ACE2摩尔浓度＝0.63/90876.19＝6.9μmol/L。

将得到的ACE2蛋白经SDS-PAGE电泳，电泳结果见图1。由于ACE2原始溶液杂质含量较高，纯度约为3％，所以ACE2原始溶液摩尔浓度真实值为0.23μmol/L。

f.重组ACE2蛋白质谱(Thermo Orbitrap)分析(委托北京青莲百奥生物科技有限公司)，结果见表1。

表1重组ACE2蛋白质谱分析结果

g.重组ACE2蛋白稀释：取974μl超纯水加入6μl 200mmol/L DDM，10μl 200mmol/LZnCl₂，10μl Glycerol混匀制成ACE2稀释液。取90μl的ACE2稀释液，加入10μl原始ACE2溶液(0.23μmol/L)，混匀。如此不断十倍稀释，直至ACE2溶液摩尔浓度到达0.023pmol/L(23fmol/L)。

实施例2

以2019-nCoV病毒S1的RBD(Receptorbinding domain)作为抗原。

(1)构建N-S1(2019-nCoV病毒S1的RBD)C端带His标签表达载体。

a.人工合成N-S1的核苷酸序列，配制成200ng/μl溶液。N-S1对应核苷酸序列(5’端和3’端分别含有Nde I和Hind III酶切位点，经过大肠杆菌密码子优化)如SEQ ID No.4所示。

b.用Nde I和Hind III限制性内切酶酶切表达载体pET41b，回收骨架片段(浓度约400ng/μl)。附骨架片段序列如SEQ ID No.5所示。

c.将N-S1对应核苷酸序列和骨架序列进行同源重组，然后转化BL21大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那选择培养基平板。

d.挑选阳性克隆摇菌并进行质粒PCR鉴定。含N-S1的重组质粒PCR鉴定结果见图2。

e.取含N-S1 No.1质粒的BL21菌株保存并诱导蛋白重组表达，得到N-S1溶液。

(2)纯化N-S1

按常规的纯化C端带His标签重组蛋白的方法纯化N-S1。

纯化的N-S1进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图3。

(3)定量N-S1

a.氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

b.分子量：27023.57。

c.吸光值：1.253(g/L)。

d.用分光光度计测280nm处的吸光值，测量值为0.6mg/ml。

e.换算：N-S1真实浓度＝0.6/1.253＝0.48mg/ml；真实摩尔浓度＝0.48/27023.57＝17.7μmol/L。

f.将重组N-S1蛋白进行质谱(Thermo Orbitrap)分析(委托北京青莲百奥生物科技有限公司)，分析结果见表2。

表2重组N-S1蛋白的质谱分析结果

(4)用透析液十倍稀释N-S1，其中透析液成分如下：20mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，20mmol/LNaCl，10mmol/LMgCl₂，0.5mmol/LKCl。

a.1×反应液：290μl透析液，加入10μlN-S1原始溶液混匀(终浓度：0.59μmol/L)；

b.10×反应液：90μl透析液，加入10μl 1×反应液混匀(终浓度：59nmol/L)；

c.100×反应液：90μl透析液，加入10μl 10×反应液混匀(终浓度：5.9nmol/L)；

d.1000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100×反应液混匀(终浓度：0.59nmol/L)；

e.10000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000×反应液混匀(终浓度：59pmol/L)；

f.100000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000×反应液混匀(终浓度：5.9pmol/L)；

g.1000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000×反应液混匀(终浓度：0.59pmol/L)；

h.10000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000×反应液混匀(终浓度：59fmol/L)；

i.100000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000×反应液混匀(终浓度：5.9fmol/L)；

j.1000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000000×反应液混匀(终浓度：0.59fmol/L)；

k.10000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000000×反应液混匀(终浓度：0.059fmol/L)；

l.100000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000000×反应液混匀(终浓度：0.0059fmol/L)；

(5)重组S1蛋白的检测方法

(1)准备好分光光度计，在257nm用超纯水做Blank校正。准备12个1.5ml离心管A0、A1、A2、A3、A4、A5、B0、B1、B2、B3、B4和B5。

(2)分别取10μl实施例1制备的0.023pmol/LACE2溶液加入离心管A0、A1、A2、A3、A4和A5。

(3)取10μl透析液加入离心管A0混匀；取10μl 59fmol/L重组S1蛋白溶液样品加入离心管A1混匀，取10μl 5.9fmol/L重组S1蛋白溶液样品加入离心管A2混匀；取10μl0.59fmol/L重组S1蛋白溶液样品加入离心管A3混匀；取10μl 0.059fmol/L重组S1蛋白溶液样品加入离心管A4混匀，取10μl 0.0059fmol/L重组S1蛋白溶液样品加入离心管A5混匀。

(4)分别取10μl 10mg/mlAngiotensin II加入1.5ml离心管A0、A1、A2、A3、A4和A5混匀并计时。5min后，各加入500μl丙酮来终止反应。

(5)14000rpm，离心1min，倒掉液体。

(6)将离心管A0、A1，A2，A3，A4、A5重新在14000rpm，离心1min，用移液器吸净残余液体。

(7)分别取50μl 0.2％TFA(Trifluoroacetic acid，三氟乙酸)加入离心管A0、A1、A2、A3、A4、A5，用涡旋混匀仪混匀并在14000rpm，离心1min。用移液器吸取49μl离心管A0中的上清转移到离心管B0，用移液器吸取49μl离心管A1中的上清转移到离心管B1；吸取49μl离心管A2中的上清转移到离心管B2；吸取49μl离心管A3中的上清转移到离心管B3；吸取49μl离心管A4中的上清转移到离心管B4，用移液器吸取49μl离心管A5中的上清转移到离心管B5。

(8)取2μl离心管B0、B1、B2、B3、B4、B5中的样品加入分光光度计，测量3次257nm光吸收值A。

(9)将对照和测试样品在257nm处的光吸收值A进行Unpaired t-test；测试样品B3和B4的光吸收值比B0样品低，而测试样品B5的光吸收值比B0样品高，且有显著性差异。

(6)不同浓度N-S1蛋白检测结果见图4，其中，Monk组添加试剂为稀释液+透析液+Angiotensin II；H₂O组添加试剂为ACE2+透析液+Angiotensin II；Unrelated Protein添加试剂为ACE2+WOX14(杂蛋白)+Angiotensin II。

Unpaired t-test结果显示：0.59fmol/L组、0.059fmol/L组反应和对照相比吸光值降低且有显著性差异，p值<0.01；0.0059fmol/L组反应和对照相比吸光值升高且有显著性差异，p值<0.01。

实施例3

以SARS-CoV病毒S1的RBD(Receptorbinding domain)作为抗原。

(1)构建SA-S1(SARS-CoV病毒S1的RBD)C端带His标签表达载体。

a.合成SA-S1对应核苷酸序列，配制成200ng/μl溶液。

SA-S1对应核苷酸序列(5’端和3’端分别含有Nde I和Hind III酶切位点，经过大肠杆菌密码子优化)如SEQ ID No.7所示。

b.用Nde I和Hind III限制性内切酶酶切表达载体pET41b，回收骨架片段(浓度约400ng/μl)。骨架片段序列如SEQ ID No.5所示。

c.将SA-S1对应核苷酸序列和骨架序列进行同源重组，然后转化BL21大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那选择培养基平板。

d.挑选阳性克隆摇菌并进行质粒PCR鉴定，包含SA-S1的质粒PCR产物的电泳结果见图5。

e.取含SA-S1 No.1质粒的BL21菌株保菌。

(2)纯化SA-S1。

按正常的纯化C端带His标签重组蛋白的方法纯化SA-S1。

将纯化后的SA-S1蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图6。

(3)定量SA-S1。

a.氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

b.分子量：26936.59。

c.吸光值：1.516(g/L)。

d.用分光光度计测280nm处的吸光值，测量值为0.65mg/ml。

e.换算：SA-S1真实浓度＝0.65/1.516＝0.43mg/ml；真实摩尔浓度＝0.43/26936.59＝15.9μmol/L。

f.重组SA-S1蛋白进行质谱(Thermo Orbitrap)分析(委托北京青莲百奥生物科技有限公司)，分析结果见表3。

表3重组SA-S1蛋白的质谱分析数据

(4)用透析液十倍稀释SA-S1，其中透析液成分如下：20mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，20mmol/LNaCl，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/L KCl。

a.1×反应液：290μl透析液，加入10μl SA-S1原始溶液混匀(终浓度：0.53μmol/L)；

b.10×反应液：90μl透析液，加入10μl 1×反应液混匀(终浓度：53nmol/L)；

c.100×反应液：90μl透析液，加入10μl 10×反应液混匀(终浓度：5.3nmol/L)；

d.1000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100×反应液混匀(终浓度：0.53nmol/L)；

e.10000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000×反应液混匀(终浓度：53pmol/L)；

f.100000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000×反应液混匀(终浓度：5.3pmol/L)；

g.1000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000×反应液混匀(终浓度：0.53pmol/L)；

h.10000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000×反应液混匀(终浓度：53fmol/L)；

i.100000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000×反应液混匀(终浓度：5.3fmol/L)；

j.1000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000000×反应液混匀(终浓度：0.53fmol/L)；

k.10000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000000×反应液混匀(终浓度：0.053fmol/L)；

l.100000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000000×反应液混匀(终浓度：0.0053fmol/L)。

(5)按实施例2中步骤5)的方法进行吸光值测量和比较。

只将10000000×反应液(终浓度：53fmol/L)；100000000×反应液(终浓度：5.3fmol/L)；1000000000×反应液(终浓度：0.53fmol/L)；10000000000×反应液(终浓度：0.053fmol/L)；100000000000×反应液(终浓度：0.0053fmol/L)进行吸光值测量。

注：对照反应的样品为透析液。

(6)不同浓度的SA-S1蛋白检测结果见图7，其中Monk组添加试剂为稀释液+透析液+Angiotensin II；H₂O组添加试剂为ACE2+透析液+Angiotensin II；Unrelated Protein添加试剂为ACE2+WOX14(杂蛋白)+Angiotensin II。

Unpaired t-test结果显示：0.53fmol/L组和对照相比吸光值降低且有显著性差异，p值<0.01；0.053fmol/L组、0.0053fmol/L组和对照相比吸光值升高且有显著性差异，p值<0.01。

实施例4

以MERS-CoV病毒S1的RBD(Receptor binding domain)作为抗原。

(1)购买ME-S1(MERS-CoV病毒S1的RBD的C端带His标签)，定量ME-S1。

a.向北京义翘神州科技有限公司订购ME-S1，货号：40071-V08B1。

b.质量：5μg。

c.分子量：27.7kD。

d.配制ME-S1溶液：用300μl透析液溶解5μgME-S1。

ME-S1摩尔浓度＝5×10-6g/27700g/(300×10^-6L)＝0.6μmol/L。

(2)倍稀ME-S1。

a.1×反应液：原始ME-S1溶液(终浓度：0.6μmol/L)；

b.10×反应液：90μl透析液，加入10μl 1×反应液混匀(终浓度：60nmol/L)；

c.100×反应液：90μl透析液，加入10μl 10×反应液混匀(终浓度：6nmol/L)；

d.1000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100×反应液混匀(终浓度：0.6nmol/L)；

e.10000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000×反应液混匀(终浓度：60pmol/L)；

f.100000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000×反应液混匀(终浓度：6pmol/L)；

g.1000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000×反应液混匀(终浓度：0.6pmol/L)；

h.10000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000×反应液混匀(终浓度：60fmol/L)；

i.100000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000×反应液混匀(终浓度：6fmol/L)；

j.1000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 100000000×反应液混匀(终浓度：0.6fmol/L)；

k.10000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 1000000000×反应液混匀(终浓度：0.06fmol/L)；

l.100000000000×反应液：90μl透析液，加入10μl 10000000000×反应液混匀(终浓度：0.006fmol/L)。

(5)按实施例2步骤5)的方法进行吸光值测量和比较。

只将10000000×反应液(终浓度：60fmol/L)；100000000×反应液(终浓度：6fmol/L)；1000000000×反应液(终浓度：0.6fmol/L)；10000000000×反应液(终浓度：0.06fmol/L)；100000000000×反应液(终浓度：0.006fmol/L)进行吸光值测量。对照组反应的样品为透析液。

(6)不同浓度ME-SA蛋白的检测结果见图8，其中Monk组添加试剂为稀释液+透析液+Angiotensin II；H₂O组添加试剂为ACE2+透析液+Angiotensin II；Unrelated Protein添加试剂为ACE2+WOX14(杂蛋白)+Angiotensin II。

Unpaired t-test结果显示：0.6fmol/L组反应与对照相比吸光值降低且有显著性差异，p值<0.01；0.06fmol/L组、0.006fmol/L组反应与对照相比吸光值升高且有显著性差异，p值<0.01。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> 一种检测冠状病毒S1抗原的试剂盒及其非诊断目的的检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaaggagat ataccatgca gtccaccatt gaggaacagg ccaagacatt tttggacaag 60

tttaaccacg aagccgaaga cctgttctat caaagttcac ttgcttcttg gaattataac 120

accaatatta ctgaagagaa tgtccaaaac atgaataatg ctggggacaa atggtctgcc 180

tttttaaagg aacagtccac acttgcccaa atgtatccac tacaagaaat tcagaatctc 240

acagtcaagc ttcagctgca ggctcttcag caaaatgggt cttcagtgct ctcagaagac 300

aagagcaaac ggttgaacac aattctaaat acaatgagca ccatctacag tactggaaaa 360

gtttgtaacc cagataatcc acaagaatgc ttattacttg aaccaggttt gaatgaaata 420

atggcaaaca gtttagacta caatgagagg ctctgggctt gggaaagctg gagatctgag 480

gtcggcaagc agctgaggcc attatatgaa gagtatgtgg tcttgaaaaa tgagatggca 540

agagcaaatc attatgagga ctatggggat tattggagag gagactatga agtaaatggg 600

gtagatggct atgactacag ccgcggccag ttgattgaag atgtggaaca tacctttgaa 660

gagattaaac cattatatga acatcttcat gcctatgtga gggcaaagtt gatgaatgcc 720

tatccttcct atatcagtcc aattggatgc ctccctgctc atttgcttgg tgatatgtgg 780

ggtagatttt ggacaaatct gtactctttg acagttccct ttggacagaa accaaacata 840

gatgttactg atgcaatggt ggaccaggcc tgggatgcac agagaatatt caaggaggcc 900

gagaagttct ttgtatctgt tggtcttcct aatatgactc aaggattctg ggaaaattcc 960

atgctaacgg acccaggaaa tgttcagaaa gcagtctgcc atcccacagc ttgggacctg 1020

gggaagggcg acttcaggat ccttatgtgc acaaaggtga caatggacga cttcctgaca 1080

gctcatcatg agatggggca tatccagtat gatatggcat atgctgcaca accttttctg 1140

ctaagaaatg gagctaatga aggattccat gaagctgttg gggaaatcat gtcactttct 1200

gcagccacac ctaagcattt aaaatccatt ggtcttctgt cacccgattt tcaagaagac 1260

aatgaaacag aaataaactt cctgctcaaa caagcactca cgattgttgg gactctgcca 1320

tttacttaca tgttagagaa gtggaggtgg atggtcttta aaggggaaat tcccaaagac 1380

cagtggatga aaaagtggtg ggagatgaag cgagagatag ttggggtggt ggaacctgtg 1440

ccccatgatg aaacatactg tgaccccgca tctctgttcc atgtttctaa tgattactca 1500

ttcattcgat attacacaag gaccctttac caattccagt ttcaagaagc actttgtcaa 1560

gcagctaaac atgaaggccc tctgcacaaa tgtgacatct caaactctac agaagctgga 1620

cagaaactgt tcaatatgct gaggcttgga aaatcagaac cctggaccct agcattggaa 1680

aatgttgtag gagcaaagaa catgaatgta aggccactgc tcaactactt tgagccctta 1740

tttacctggc tgaaagacca gaacaagaat tcttttgtgg gatggagtac cgactggagt 1800

ccatatgcag accaaagcat caaagtgagg ataagcctaa aatcagctct tggagataaa 1860

gcatatgaat ggaacgacaa tgaaatgtac ctgttccgat catctgttgc atatgctatg 1920

aggcagtact ttttaaaagt aaaaaatcag atgattcttt ttggggagga ggatgtgcga 1980

gtggctaatt tgaaaccaag aatctccttt aatttctttg tcactgcacc taaaaatgtg 2040

tctgatatca ttcctagaac tgaagttgaa aaggccatca ggatgtcccg gagccgtatc 2100

aatgatgctt tccgtctgaa tgacaacagc ctagagtttc tggggataca gccaacactt 2160

ggacctccta accagccccc tgtttccata tggctgattg tttttggagt tgtgatggga 2220

gtgatagtgg ttggcattgt catcctgatc ttcactggga tcagagatcg gaagaagaaa 2280

aataaagcaa gaagtggaga aaatccttat gcctccatcg atattagcaa aggagaaaat 2340

aatccaggat tccaaaacac tgatgatgtt cagacctcct tttaactagc ataacccctt 2400

<210> 2

<211> 789

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

1 5 10 15

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

20 25 30

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

35 40 45

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

50 55 60

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

85 90 95

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

100 105 110

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

115 120 125

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

130 135 140

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

145 150 155 160

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

165 170 175

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

180 185 190

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

195 200 205

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

210 215 220

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

225 230 235 240

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

245 250 255

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

260 265 270

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

275 280 285

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

290 295 300

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

305 310 315 320

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

325 330 335

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

340 345 350

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

355 360 365

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

370 375 380

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

385 390 395 400

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

405 410 415

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

420 425 430

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

435 440 445

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

450 455 460

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

465 470 475 480

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

485 490 495

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

500 505 510

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

515 520 525

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

530 535 540

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

545 550 555 560

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

565 570 575

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

580 585 590

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

595 600 605

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

610 615 620

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

625 630 635 640

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

645 650 655

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

660 665 670

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

675 680 685

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

690 695 700

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

705 710 715 720

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

725 730 735

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

740 745 750

Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

755 760 765

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

770 775 780

Val Gln Thr Ser Phe

785

<210> 3

<211> 5555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 60

ggaactatat ccggatatcc cgcaagaggc ccggcagtac cggcataacc aagcctatgc 120

ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga tgacgatgag cgcattgtta gatttcatac 180

acggtgcctg actgcgttag caatttaact gtgataaact accgcattaa agctaattct 240

tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 300

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 360

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 420

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 480

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 540

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 600

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 660

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 720

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 780

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 840

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 900

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 960

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 1020

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 1080

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 1140

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 1200

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 1260

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 1320

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 1380

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 1440

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 1500

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 1560

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 1620

gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 1680

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 1740

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 1800

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 1860

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 1920

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 1980

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 2040

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 2100

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 2160

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 2220

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg 2280

tgcggtattt cacaccgcat atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 2340

agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca 2400

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 2460

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 2520

acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg tgaagcgatt cacagatgtc 2580

tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga agcgttaatg tctggcttct 2640

gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg gtcactgatg cctccgtgta 2700

agggggattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat 2760

acgggttact gatgatgaac atgcccggtt actggaacgt tgtgagggta aacaactggc 2820

ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa 2880

tacagatgta ggtgttccac agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat 2940

aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac 3000

cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc 3060

gcgtatcggt gattcattct gctaaccagt aaggcaaccc cgccagccta gccgggtcct 3120

caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg tggccaggac ccaacgctgc ccgagatgcg 3180

ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gatggatatg ttctgccaag ggttggtttg 3240

cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt cttggagtgg tgaatccgtt 3300

agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc ggctccatgc accgcgacgc 3360

aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa tccatgccaa cccgttccat 3420

gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat cgaagttagg 3480

ctggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc tacctgcctg 3540

gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg aagcgagaag aatcataatg 3600

gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga cgtagcccag cgcgtcggcc 3660

gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg 3720

aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc 3780

gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct 3840

acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc 3900

caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc 3960

taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 4020

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 4080

attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 4140

caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 4200

aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc 4260

gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 4320

tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 4380

cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 4440

tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 4500

cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 4560

atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 4620

ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 4680

ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 4740

attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 4800

gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 4860

cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 4920

tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 4980

tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 5040

ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact 5100

ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg 5160

gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga 5220

ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc 5280

ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt 5340

ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg 5400

tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag gatcgagatc tcgatcccgc 5460

gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat 5520

aattttgttt aactttaaga aggagatata ccatg 5555

<210> 4

<211> 701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggagatata catatgcgtg ttcagccgac cgaaagcatc gttcgtttcc cgaacatcac 60

caacctgtgc ccgttcggtg aagttttcaa cgcgacccgt ttcgcgagcg tttacgcgtg 120

gaaccgtaaa cgtatctcta actgcgttgc ggattacagc gttctgtaca acagcgcgag 180

cttcagcacc ttcaaatgct acggcgttag cccgaccaaa ctgaacgatc tgtgcttcac 240

caacgtttac gcggattctt tcgttatccg tggcgatgaa gttcgtcaga tcgcgccggg 300

ccagaccggc aaaatcgcgg attacaacta caaactgccg gatgatttca ccggctgcgt 360

tatcgcgtgg aacagcaaca acctggattc taaagttggc ggcaactaca actacctgta 420

ccgtctgttc cgtaaatcta acctgaaacc gttcgaacgt gatatcagca ccgaaatcta 480

ccaggcgggt agcaccccgt gcaacggcgt tgaaggcttc aactgctact tcccgctgca 540

gagctacggc ttccagccga ccaacggtgt tggctaccag ccgtaccgtg ttgttgttct 600

gagcttcgaa ctgctgcacg cgccggcgac cgtttgcggt ccgaaaaaat ctaccaacct 660

ggttaaaaac aaatgcgtta acttcaagct tgcggccgca c 701

<210> 5

<211> 5032

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct 60

cacaattccc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgggat cgagatcgat ctcgatcctc 120

tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat 180

atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt 240

ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg 300

catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc 360

ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgagatcccg gacaccatcg aatggcgcaa 420

aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt 480

gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc 540

ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc 600

gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc 660

gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc 720

ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg 780

aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg 840

gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac 900

taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt 960

ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca 1020

aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg 1080

gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag 1140

tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc 1200

gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg 1260

gctgcgcgtt ggtgcggaca tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg 1320

ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt 1380

ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt 1440

ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 1500

gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg 1560

agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc accgggatct cgaccgatgc 1620

ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actagcatga 1680

tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 1740

atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct 1800

gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt 1860

cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg 1920

gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt 1980

cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 2040

catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca 2100

tgaacagaaa tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta 2160

acatggcccg ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg 2220

acgcggatga acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc 2280

gcagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 2340

agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 2400

cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 2460

tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatatg 2520

cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 2580

tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 2640

tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 2700

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 2760

aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 2820

ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 2880

gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 2940

ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 3000

ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 3060

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 3120

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 3180

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 3240

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 3300

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 3360

tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaac 3420

aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg 3480

ggaaacgtct tgctctaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta 3540

taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa 3600

gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac 3660

agatgagatg gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca 3720

ttttatccgt actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc 3780

attccaggta ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt 3840

gttcctgcgc cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt 3900

atttcgtctc gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt 3960

tgatgacgag cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt 4020

gccattctca ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt 4080

tgacgagggg aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata 4140

ccaggatctt gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg 4200

gctttttcaa aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat 4260

gctcgatgag tttttctaag aattaattca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 4320

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa 4380

acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc 4440

aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga 4500

gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag 4560

ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt 4620

ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 4680

gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 4740

cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 4800

cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccaat ccggatatag ttcctccttt 4860

cagcaaaaaa cccctcaaga cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc 4920

agcggtggca gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg tttagcagcc taggtattaa 4980

tcaattagtg gtggtggtgg tggtggtggt gctcgagtgc ggccgcaagc tt 5032

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

1 5 10 15

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

20 25 30

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

35 40 45

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

50 55 60

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

85 90 95

Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

100 105 110

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

115 120 125

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

130 135 140

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

145 150 155 160

Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

165 170 175

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

180 185 190

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys

195 200 205

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His His His

225 230 235

<210> 7

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggagatata catatgcgag ttgttccgag cggtgatgtt gttcgtttcc cgaacatcac 60

caacctgtgc ccgttcggcg aagttttcaa cgcgaccaaa ttcccgtctg tttacgcgtg 120

ggaacgtaag aaaatcagca actgcgttgc ggattactct gttctgtaca acagcacctt 180

cttcagcacc ttcaaatgct acggcgttag cgcgaccaaa ctgaacgatc tgtgcttcag 240

caacgtttac gcggatagct tcgttgttaa aggcgatgat gttcgtcaga tcgcgccggg 300

tcagaccggc gttatcgcgg attacaacta caaactgccg gatgatttca tgggttgcgt 360

tctggcgtgg aacacccgta acatcgatgc gacctctacc ggcaactaca actacaaata 420

ccgttacctg cgtcacggca aactgcgtcc gttcgaacgt gatatcagca acgttccgtt 480

cagcccggat ggtaaaccgt gcaccccgcc ggcgctgaac tgctactggc cgctgaacga 540

ttacggtttc tacaccacca ccggtatcgg ctaccagccg taccgtgttg ttgttctgag 600

cttcgaactg ctgaacgcgc cggcgaccgt ttgcggtccg aaactgagca ccgatctgat 660

caaaaaccag tgcgttaact tcaagcttgc ggccgcac 698

<210> 8

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

1 5 10 15

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser

20 25 30

Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

35 40 45

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

50 55 60

Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

85 90 95

Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

100 105 110

Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser

115 120 125

Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu

130 135 140

Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly

145 150 155 160

Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp

165 170 175

Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Lys

210 215 220

Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His His His

225 230 235

Claims

1.一种基于检测冠状病毒S1抗原的试剂盒非诊断目的的检测冠状病毒S1抗原的方法，其特征在于，所述试剂盒由以下试剂组成：ACE2蛋白、血管紧张素Ⅱ、丙酮和三氟乙酸；

包括以下步骤：

1)分别取10μl0.02～0.03pmol/L的ACE2蛋白水溶液加入离心管A1、A2、A3和A4中；

2)取10μlS1蛋白阴性样品加入离心管A1中；取10μl待检测样品或稀释后的待测样品加入离心管A2中；将待检测样品经10倍稀释后，取10μl加入离心管A3中；将待检测样品100倍稀释后，取10μl加入离心管A4中；

在离心管A2加入待检测样品前或向离心管A3和A4加入稀释检测样品前，还包括对待检测样品进行10～10¹⁵倍稀释；

3)分别取10μl10mg/ml血管紧张素Ⅱ水溶液加入离心管A1、A2、A3、A4中，混合5min后，各加入500μl丙酮终止反应；

4)将离心管A1、A2、A3、A4离心，去除上清液；

7)将对照样品和3个待检测样品在257nm处的光吸收值进行Unpairedt检验，若测试样品B2的光吸收值比B1样品低，且有显著性差异，而测试样品B3和/或B4的光吸收值比B1样品高，且有显著性差异，则说明待检测样本中含有冠状病毒S1抗原；

待检测样品或稀释后的待测样品中待检测冠状病毒S1抗原的浓度为6fmol/L～0.06fmol/L。

2.根据权利要求1所述检测冠状病毒S1抗原的方法，其特征在于，所述冠状病毒包括2019-nCoV、SARS-CoV和MERS-CoV。

3.根据权利要求2所述检测冠状病毒S1抗原的方法，其特征在于，所述试剂盒检测2019-nCoV病毒中S1抗原时，检测灵敏度为0.06fmol/L；